JP2013517297A - ナノ粒子を介するがん細胞標的化送達のための方法および組成物 - Google Patents

ナノ粒子を介するがん細胞標的化送達のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、活性薬剤を所持するナノ粒子を腫瘍細胞に選択的かつ直接的に送達するための方法および組成物を提供する。該活性薬剤は、腫瘍細胞によって内部移行され、治療用途の場合は抗腫瘍効果をもたらし、かつ／または診断用途の場合は検出可能なマーカーを堆積する。本発明は、さらに、がんの治療および腫瘍の大きさの縮小における治療薬としてのｐ５３突然変異体のドミナントネガティブ活性を回避するｐ５３キメラを提供する。

Description

［優先権に関する記載］
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる２０１０年１月１８日出願の米国特許仮出願第６１／２９５，８９８号の米国特許法第１１９条第（ｅ）項に基づく利益を主張する。
［発明の分野］
本発明は、ナノ粒子を介して活性薬剤をがん細胞に選択的に送達するための組成物および方法に関する。
抗がん治療の有効性は、健常組織を損傷することなしにがん細胞を縮小および除去する能力に依拠する。したがって、がん細胞を優先的に標的にする戦略は、がん治療の成功において最も重要である。がん細胞への治療薬剤の送達を高めるために、ナノ粒子をベースにした系が探索されてきた。新たな進展は薬物送達効率を改善してきたが、がん細胞に特異的な送達を達成することは、相変わらず巨大な難題のままである。
ワールブルグ効果として知られるがん細胞の現象は、悪性腫瘍に特徴的な抑制の効かない代謝活性に燃料を供給するためにグルコースを細胞中にしきりに引き入れる、がん細胞の十分に特徴付けられた傾向を規定する。ワールブルグ効果の最もよく知られた利用法は、放射性核種をグルコース分子に結び付け、それを患者に投与する、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）においてである。悪性の細胞は、より多くのグルコース−放射性核種の媒体を取り込み、該媒体は細胞中に内部移行されるか、あるいは少なくとも腫瘍細胞に付着させる。放射性核種によって放射される放射線は、腫瘍部位での光子の放出をもたらし、次いで、この光子をＰＥＴ（光子）検出装置で検出する。したがって、ＰＥＴ走査は、極めて正確かつ特異的ながんの検出方法である。
本発明は、ワールブルグ効果を活用して、ナノ粒子を介して活性成分をがん細胞に直接かつ選択的に導き、治療薬剤（例えば、薬物、核酸、タンパク質／ペプチド）を送達すること、および／または診断のための検出可能なマーカーを配置することによって、当技術分野における従来の欠点を克服する。
さらなる態様において、腫瘍抑制因子ｐ５３は、遺伝子宿主のプロモーター内のｐ５３応答配列にテトラマーとして初めは結合する転写因子であり、その産生物は、ゲノム安定性および恒常性の維持にとって決定的に重要である増殖停止、アポトーシス、老化、分化、およびＤＮＡ修復−細胞事象の調節に関連している［１、２］。ｐ５３は、がん遺伝子活性化およびＤＮＡ損傷を含む種々のストレスシグナルによって活性化され、翻訳後修飾がｐ５３活性化の主要な機構であり、その活性化はｐ５３タンパク質の存在量および転写活性の増加をもたらすことが示されている［１、２］。
ｐ５３タンパク質の安定性の調節により主として成立している正常な生理学的条件下では、野生型ｐ５３のレベルは、その増殖抑制活性のため、低く保たれているのが通常である。いくつかの制御因子が関連すると報告されているが、ＭＤＭ２が、ｐ５３の代謝回転の調節における主要プレーヤーである。ＭＤＭ２は、ユビキチン化およびそれに続く分解のためにｐ５３を標的にするＥ３ユビキチンリガーゼであるが、同時に、ｐ５３の転写標的であり、それによって、負の制御ループを創出する。種々のストレスシグナルは、すべて、この制御ループに影響を与えてｐ５３の活性化に影響を与える［１、２］。野生型ｐ５３と対照的に、突然変異ｐ５３タンパク質は、通常、がん細胞中に高いレベルで蓄積し、このことは、突然変異ｐ５３がＭＤＭ２の発現を誘導する能力がないためであると考えられている。実際、突然変異ｐ５３ノックインマウスを使用する遺伝子研究は、突然変異ｐ５３タンパク質レベルが主としてＭＤＭ２によって制御されることを立証した［３］。
腫瘍抑制因子としてのｐ５３の決定的に重要な役割は、ｐ５３遺伝子座へ直接的に影響を及ぼす突然変異、またはその正常な制御からの逸脱のどちらかよる、がん細胞中でのその普遍的な不活性化によって支持される［１、２］。ｐ５３の突然変異は、ほとんどすべての種類のヒトのがんにおいて、約１０％（例えば、造血系悪性腫瘍［４］）から５０〜７０％（例えば、卵巣［５］、結腸直腸［６］および頭頸部［７］がん）までの種々の頻度で確認されている。豊富な証拠は、野生型ｐ５３は、がん細胞に化学療法および放射線療法に対する感受性を付与するが、がん細胞中の突然変異ｐ５３は、療法への抵抗性および劣悪な予後の原因である。突然変異ｐ５３の発現とがん療法への抵抗性との間の相関は、広範に報告されている。例えば、シスプラチンに対する抵抗性が、卵巣がん患者において観察されている［８］。結腸直腸がんも、突然変異ｐ５３の存在下で化学感受性がより低いことが立証された［９］。同様に、ｐ５３の不活性化は、血液系悪性腫瘍に抗悪性腫瘍薬に対する抵抗性を付与した［１０］。
ｐ５３の突然変異は、ｐ５３変化の大部分が、完全長タンパク質の合成をもたらすミスセンス突然変異であることにおいて独特である［１１］。ほとんどのｐ５３突然変異は、配列に特異的なＤＮＡ結合活性の喪失をもたらすコアＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）内に見出されるが、高度の構造的、生化学的、および生物学的異質性が存在する。ほとんどのｐ５３突然変異は、ｐ５３タンパク質の熱力学的安定性に対するそれらの効果により、一般的に「ＤＮＡ−接触」および「立体配座」突然変異と呼ばれる２つの主要部類に類別することができる［１２］。ＤＮＡ−接触基は、Ｒ２４８ＱおよびＲ２７３ＨのようにＤＮＡ結合に直接的に関与する残基における突然変異を含む。この基は、立体配座モノクロナール抗体によって探索されるような野生型立体配座を有し、シャペロンｈｓｐ７０に結合しない［１３、１４］。立体配座基は、ｈｓｐ７０への強力な結合を伴うタンパク質をもたらす、局所的（Ｒ２９４ＳおよびＧ２４５Ｓなど）および全体的（Ｒ１７５ＨおよびＲ２８２Ｗなど）な立体配座の歪を引き起こす突然変異を含む。立体配座の突然変異は、インビトロでＤＮＡ接触突然変異に比べてより厳しい表現型と関連している［１３］。ｐ５３の突然変異の異質性は、また、生じる残基の性質に反映されることもある。突然変異Ｒ２７３Ｈは、野生型立体配座を有するが、一方、突然変異Ｒ２７３Ｐは変性されている［１３］。
腫瘍抑制因子の機能を喪失することに加え、突然変異ｐ５３は、テトラマー内の突然変異ｐ５３のわずか１つの分子がＤＮＡ結合を有意に危うくするのでｐ５３不活性化の極めて有効な機構である突然変異体と野生型ｐ５３との間のヘテロ−オリゴマー化を介して野生型ｐ５３に関してドミナントネガティブ活性を獲得する［１、２］。さらに、諸研究は、突然変異ｐ５３が野生型ｐ５３から独立して新たな発がん活性を獲得できることを示した［１５〜１７］。ｐ５３の機能獲得型特性の根底にある統一的機構は解明にいたっていないが、いくつかのモデルが提案されている。突然変異ｐ５３は、ｐ６３およびｐ７３とそれらのＤＮＡ結合ドメインを介して相互に作用することが示されている。この相互作用は、ｐ７３およびｐ６３の機能の不活性化につながる［１８〜２１］。一般的な突然変異ｐ５３（Ｒ２４８ＷおよびＲ２７３Ｈ）を発現するノックインマウスを用いた遺伝子研究は、突然変異体が、ＤＮＡ損傷応答にとって決定的に重要なプロテインキナーゼであるＡＴＭの不活性化によって発がん特性を獲得することを示した［２２］。まとめると、利用可能な情報は、突然変異ｐ５３が、機能欠失型、ドミナントネガティブ型および機能獲得型活性の組合せを介する腫瘍形成および療法抵抗性の一因となることを指摘している。突然変異ｐ５３を再活性化する能力のある小分子を開発するために多くの努力がなされてきた。しかし、がん細胞における２０００を超える異なる種類の突然変異ｐ５３タンパク質によって反映されるような突然変異ｐ５３の構造的異質性［２３］は、融通性のあるｐ５３再活性化剤の開発に対してかなりの難問を課す。代わりの取組みは、遺伝子療法を介して腫瘍細胞に野生型ｐ５３を再導入ことである。複製欠損ウイルスをベースにしたベクターは、頭頸部がんにおいて若干の治療効果を立証してきたが、腫瘍細胞中の高レベルの突然変異ｐ５３タンパク質は、機能性ｐ５３を復元させる上での大きな障害である。本発明は、当技術分野における以前の欠点を、突然変異ｐ５３に結合せず、そのため、高レベルの突然変異ｐ５３の存在下でｐ５３の機能を効果的に回復することのできるｐ５３誘導体を提供することによって克服する。
一態様において、本発明は、
Ａ）ａ）ポリカチオン／ポリアルキレングリコール／グルコース接合体と、
ｂ）活性薬剤と
を含むナノ粒子、
Ｂ）ａ）活性薬剤を含むコアと、
ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ポリアルキレングリコール接合体と
を含むナノ粒子、
Ｃ）ａ）ポリカチオンおよび活性薬剤を含むコアと、
ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ポリアルキレングリコール接合体と
を含むナノ粒子、
Ｄ）ａ）ポリカチオン／アルギネート／グルコース接合体と、
ｂ）活性薬剤と
を含むナノ粒子、
Ｅ）ａ）活性薬剤を含むコアと、
ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／アルギネート接合体と
を含むナノ粒子、
Ｆ）ａ）ポリカチオンおよび活性薬剤を含むコアと、
ｂ）（ａ）を取り囲むグルコース／アルギネート接合体と
を含むナノ粒子、ならびに
Ｇ）ａ）上記（Ａ）〜（Ｆ）のナノ粒子の任意の組合せ
からなる群から選択されるナノ粒子を提供する。
本発明のナノ粒子において、活性薬剤は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、化学療法薬、細胞障害性薬剤、放射性核種、検出可能なマーカー、造影剤、およびこれらの任意の組合せであってもよい。
本発明の特定の実施形態では、ａ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびｐ５３をコードするポリヌクレオチドを含むコアと、ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）接合体とを含むナノ粒子が提供される。
さらなる実施形態において、本発明は、ａ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラ（例えば，ｐ５３／ｐ７３ＯＤ）をコードするポリヌクレオチドを含むコアと、ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）接合体とを含むナノ粒子を提供する。さらに、本明細書では、ｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラを薬学的に許容される担体中に含む組成物が提供される。
さらに、本発明は、ナノ粒子を細胞に送達する方法であって、細胞を本発明のナノ粒子と、ナノ粒子が細胞表面のグルコース輸送体に結合し細胞によって内部移送される条件下で接触させることを含む方法を提供し、この細胞はインビボであってもインビトロであってもよい。
さらに、本明細書では、対象（例えば、それを必要とする対象）において活性薬剤を腫瘍細胞に送達する方法であって、本発明のナノ粒子を対象に送達し、それによってナノ粒子が細胞表面のグルコース輸送体に結合し、腫瘍細胞によって内部化され、それによって活性薬剤を腫瘍細胞に送達することを含む方法が提供される。
よりさらなる実施形態において、本発明は、対象（例えば、それを必要とする対象）における腫瘍の大きさを縮小する方法であって、有効量の本発明のナノ粒子を対象に送達し、それによってナノ粒子が腫瘍細胞の表面のグルコース輸送体に結合し、細胞によって内部移行され、それによって対象における腫瘍の大きさを縮小することを含む方法を提供する。
本発明は、さらに、対象（例えば、それを必要とする対象）におけるがんを治療する方法であって、有効量の本発明のナノ粒子を対象に送達し、それによって対象におけるがんを治療することを含む方法を提供する。
さらに、本発明は、ｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラを細胞（例えば、がん細胞または腫瘍細胞）に送達する方法であって、細胞を本発明のｐ５３キメラと、ｐ５３キメラが細胞によって内部移行される条件下で接触させるステップを含む方法を提供し、この細胞はインビボであってもインビトロであってもよい。
よりさらなる実施形態において、本発明は、対象（例えば、それを必要とする対象）における腫瘍の大きさを縮小する方法であって、有効量の本発明のｐ５３キメラを対象に送達し、それによってキメラが腫瘍細胞によって内部移行され、それによって対象における腫瘍の大きさを縮小することを含む方法を提供する。
本発明は、さらに、対象（例えば、それを必要とする対象）におけるがんを治療する方法であって、有効量の本発明のｐ５３キメラを対象に送達し、それによって対象におけるがんを治療することを含む方法を提供する。
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における腫瘍の退縮を誘導する方法であって、有効量の本発明のｐ５３キメラを対象に送達し、それによって対象における腫瘍の退縮を誘導することを含む方法を包含する。
本明細書に記載の方法は、対象にプロテインキナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、メチルトランスフェラーゼ阻害剤、およびこれらの任意の組合せを投与するステップをさらに含むことができる。
上記の方法は、対象に化学療法剤、血管新生抑制剤、放射線処置、外科処置、またはこれらの任意の組合せを施すステップを含むこともできる。このさらなるステップは、対象へのナノ粒子および／またｐ５３キメラの送達の前、後および／または送達と同時に実施することができる。
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容される担体中に本発明のナノ粒子を含む組成物、および本発明のナノ粒子および／または本発明の組成物を含むキットを包含する。
本明細書では、また、対象におけるがんをインビトロで診断する方法であって、ａ）検出可能なマーカーを含む本発明のナノ粒子を対象からの細胞と接触させること；ｂ）対象の細胞中へのナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または特異性を測定すること、ならびにｃ）対象の細胞中へのナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または特異性を、対照対象の細胞および／または診断されている対象の対照細胞中へのナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または特異性と比較することを含み、それによって対照対象の細胞および／または対照細胞と比較した場合の、対象の細胞中へのナノ粒子の内部移行の量および／または割合および／または特異性の増加または変化が、対象におけるがんの診断指標となる、方法が提供される。
さらに、本発明は、対象におけるがんをインビボで診断する方法であって、ａ）造影剤を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のナノ粒子を対象に送達すること；ｂ）対象において造影剤からのシグナルを検出すること；ならびにｃ）対象において造影剤からのシグナルを対照対象および／または診断されている対象からの対照組織／細胞における同一造影剤からのシグナルと比較することを含み、それによって対照対象および／または対照組織／細胞からのシグナルと比較した場合の対象からのシグナルの変化が、対象におけるがんの診断指標となる、方法を提供する。
ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩプラスミド複合体の合成を示す図である。 ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩプラスミド複合体の合成を示す図である。 ２種の細胞株、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および非形質転換ヒト乳腺上皮細胞株ＭＣＦ−１０Ａにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドの発現差異を示す図である。 非形質転換前立腺上皮細胞株ＲＷＰＥに比較した場合の前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるナノ粒子の選択的標識指向化を示す図である。 ２種のがん細胞株および２種の非形質転換細胞株におけるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）をコードするプラスミドの発現差異を示す図である。 ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ介在性核酸送達がグルコース輸送体依存性であることを立証する競合アッセイを示す図である。 ナノ粒子−核酸複合体がエンドサイトーシス介在性内部移行を介して細胞に侵入することを示す図である。 Ａは、腫瘍所持マウス（腫瘍体積はほぼ１００ｍｍ３）に腫瘍抑制遺伝子（ＰＴＥＮ、２０または４０μｇ）プラスミドをナノ粒子と複合して（全体積５０μＬ）静脈内で注入し、マウスを１４日後に屠殺し、腫瘍を集めた図である。Ｂは、腫瘍組織切片を増殖マーカーＫｉ−６７で染色した図である。Ｋｉ−６７染色の代表的画像および腫瘍の大きさを示す。ＰＴＥＮホスファターゼおよびテンシン相同体に関する配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＮＭ０００３１４．４．で提供される（Ｌｉら、「ＰＴＥＮ，ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ，ｂｒｅａｓｔ、ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５（５３０８）：１９４３〜１９４７（１９９７））。 Ａは、ｐ５３／７３ＯＤが、野生型ｐ５３と異なり、突然変異ｐ５３を発現する細胞の増殖を抑制することを示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、対照ベクター（１．０μｇ）、野生型ｐ５３（１．０μｇ）、ｐ５３／ｐ７３ＯＤ（０．５μｇ）またはｐ５３（Ｒ１７５Ｈ）／ｐ７３ＯＤ（１．０μｇ）をコードするｐＣＮＤＡ３ベクターをトランスフェクトした。ピューロマイシンでの選択の後、細胞をコロニー形成アッセイに供した。データは、３つの独立した実験から得られる平均±ＳＥである。Ｂは、選択の４８時間後に採取された細胞を用いてウェスタン分析を実施し、指定の抗体を使用して探索した図である。抗Ｍｙｃブロットは外来性ｐ５３のレベルを示し、抗ｐ５３ブロットは、外来性突然変異ｐ５３と外来性ｐ５３とをあわせたレベルを反映している。 ＭＣＦ−１０Ａ細胞が、中位レベルのｐ５３／ｐ７３ＯＤ発現に対する感受性がより低いことを示す図である。対照としてのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と共にＭＣＦ−１０Ａ細胞に、指定のベクター（０．５μｇ）をトランスフェクトし、図５におけるようなコロニー形成アッセイに供した。並行してウェスタンブロットを実施し、ｐ５３／ｐ７３ＯＤ発現のレベルを測定した。 Ａは、ｐ５３／ｐ７３ＯＤの発現が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において異なる応答をもたらしたことを示す図である。図６におけるように細胞を、指定の抗体を使用するウェスタン分析に供した。ｐ５３／ｐ７３ＯＤを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＣＦ−１０Ａ細胞を、照射しないか、あるいは４Ｇｙで照射した。Ｂでは、照射の６時間後にウェスタン分析のため、またはＣでは、２４時間の時点でＦＡＣＳ分析のため、細胞を採取した。結果は３つの独立実験から得られる平均±ＳＥである。 Ｇｌｕ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子は、遺伝子送達に関して悪性腫瘍細胞を特異的に標的とすることを示す図である。Ａでは、ＭＣＦ−１０Ａ／ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、またはＢで、ＲＷＰＥ／ＰＣ３細胞をＧｌｕ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ｌａｃＺ ＤＮＡ複合体と共にインキュベートした。２４時間後に細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌ（登録商標）試薬で染色した。Ｃでは、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ−β−ｇａｌの取込みと競合させるため培養培地中に５０ｍＭグルコースを含めた。代表的画像を示す。 ＧＬＵ−ＡＬＧが、ＰＥＩの細胞障害性を低減することを示す図である。増加するＰＥＩ濃度（０、０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．５または５．０μｇ／ｍＬ）のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（５００万個の細胞）の生存率に対する効果を、図５に記載のような方法を使用するコロニー生き残りアッセイによって評価した。ＧＬＵ−ＡＬＧの効果を、１μｇ／ｍＬのＰＥＩを０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．５または５．０μｇ／ｍＬのＧＬＵ−ＡＬＧと混合することによって調べた。 ＧＬＵ−ＡＬＧ−ＰＥＩが介在するＬａｃＺ発現プラスミドの腫瘍特異的送達を示す図である。乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（５００万細胞）をヌードマウス（４〜６週齢）の側腹領域に移植し、２週間腫瘍を発育させた。腫瘍の大きさがほぼ２００ｍｍ３に達したら、マウスを一夜飢えさせた。翌朝、ＬａｃＺ発現プラスミドを、ＰＥＩと、続いてグルコース−アルギン酸と混合し、静脈内で注入した。注入の４８時間後にマウスを屠殺した。心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓および腫瘍サンプルを含め、種々の組織サンプルを採取した。組織切片を調製し、β−ｇａｌで記載のように染色した。各組織からの代表的画像を示す。 ｐ５３／ｐ７３ＯＤの発現によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でのＰｇ１３−ＧＦＰの誘導を示す図である。ｐｇ１３−ＧＦＰを安定的に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＷＴｐ５３またはｐ５３／ｐ７３ＯＤと共にインキュベートした［ｐ５３介在性細胞死を回避するために低レベルのプラスミド（０．２μｇＤＮＡ／６０ｍｍ皿）を使用した］。２４時間後に、２％ホルマリンを使用して細胞を固定し、ＤＡＰＩ色素で染色した。上のパネルはＧＦＰの発現を示す。下のパネルはＤＡＰＩ染色によって検出される細胞核を示す。 ｐ５３、ｐ７３βおよびｐ５３キメラの概略を示す図である。ｐ５３キメラは、ｐ７３βのオリゴマー化ドメイン（ＯＤ）を含み、ここで、ｐ５３タンパク質の３９３個のアミノ酸配列は、アミノ酸３１８〜３６４の位置がｐ７３βタンパク質のアミノ酸３４６〜３９０で置き換えられている。ＴＡＤ：トランス活性化ドメイン、ＰＲＤ：プロリンに富むドメイン、ＤＢＤ：ＤＮＡ結合ドメイン、Ｏｌｉｇｏ：オリゴマー化ドメイン。
本説明は、本発明を実行することのできるすべての様々な方法、または本発明に付加することのできるすべての特徴の詳細な列挙であることを意図しない。例えば、ある実施形態に関して例示された特徴を、他の実施形態中に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例示した特長を、その実施形態から削除することができる。加えて、本明細書中で提案される種々の実施形態に対する、本発明から逸脱しない多くの変形形態および付加形態は、本開示に照らして当業者にとって明白であろう。それゆえ、以下の説明は、本発明の一部の特定の実施形態を例示することを意図し、そのすべての並び替え形態、組合せ形態、および変形形態を網羅的に特定することを意図するものではない。
そうでないことを規定しない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同様の意味を有する。本明細書中で本発明を説明するのに使用される術語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、本発明を限定することを意図しない。本明細書中で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
本明細書中で使用する場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」は、１つまたはそれ以上を意味することができる。例えば、「１つの（ａ）」細胞は、１つの細胞または複数の細胞を意味することができる。
また、本明細書中で使用する場合、「および／または」は、１つまたは複数の列挙した関連項目のいずれかおよびすべての可能な組合せを、ならびに代替と判断される場合（「または」）には組合せの欠如を包含することを指す。
さらに、本明細書中で使用する場合、本発明の生体分子または薬剤の量、投与量、時間、温度などの測定可能な値に対して言及する場合の用語「約」は、指定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには０．１±％の変動を包含することを意味する。
一態様において、本発明は、対象中の腫瘍細胞を選択的かつ直接的に標的にするように操作された本発明のナノ粒子を対象（例えば、がんを有する対象）に投与することによる、がん治療の新たな戦略を提供する。ナノ粒子は、活性薬剤を腫瘍細胞中に送達し、細胞を死滅させ、かつ／または細胞を腫瘍細胞と同定するための検出可能なマーカーを堆積する。
したがって、一実施形態において、本発明は、ａ）ポリカチオン／ポリアルキレングリコール／グルコース接合体、およびｂ）活性薬剤を含む、それらから実質的になる、またはそれらからなるナノ粒子を提供する。別の実施形態において、本発明は、ａ）活性薬剤を含むコア、およびｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ポリアルキレングリコール接合体を含む、それらから実質的になる、またはそれらからなるナノ粒子を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、ａ）活性薬剤を含むコア、ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ポリアルキレングリコール接合体、およびｃ）ポリカチオンを含む、それらから実質的になる、またはそれらからなるナノ粒子を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、グルコース／活性薬剤複合体を含む、それらから実質的になる、またはそれらからなるナノ粒子を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、ａ）ポリカチオン／アルギネート／グルコース接合体、およびｂ）活性薬剤を含む、それらから実質的になる、またはそれらからなるナノ粒子、ならびにａ）活性薬剤を含むコア、およびｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／アルギネート接合体を含む、それらから実質的になる、またはそれらからなるナノ粒子を提供する。さらに、本明細書では、ａ）活性薬剤を含むコア、ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／アルギネート接合体、およびｃ）ポリカチオンを含む、それらから実質的になる、またはそれらからなるナノ粒子を提供する。
本発明のナノ粒子は、ナノ粒子の集団として存在することができ、したがって、本発明は、担体中にナノ粒子の集団を含む組成物を提供する。集団中のナノ粒子はすべて同一の種類からなることができ、あるいはナノ粒子の集団は、任意の組合せおよび任意の比率の本明細書に記載のような２種以上の異なる種類のナノ粒子から構成することができる。
本発明のナノ粒子は、約２０ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の大きさで存在する。したがって、ナノ粒子は、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ，１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ，２２５ｎｍ、２５０ｎｍ、２７５ｎｍ、３００ｎｍ、３２５ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍなど、またはこれらの任意の組合せであってもよい。当業者は、本発明のナノ粒子を含む組成物において、組成物中のナノ粒子は、大きさを異にすることができるが、一般には本明細書中に示す大きさの範囲に包含されることを認識するであろう。
本発明のナノ粒子において、接合体のグルコース部分は、グルコースとして、Ｆ−１８−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）として、放射能標識化グルコース（例えば、［１１Ｃ］グルコース、［１４Ｃ］グルコース）として、グルコース誘導体またはその任意の組合せとして存在することができる。用語「グルコース誘導体」は、生体適合性であり、かつ身体によって生化学的に処理することのできる（例えば、グルコース輸送体によって拘束された）修飾されたグルコースの化学構造を有するグルコース分子を包含する。グルコース誘導体の例には、限定はされないが、デキストラグルコース（Ｄ−グルコース）および２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）が含まれる。
「ポリアルキレングリコール」は、直鎖または分枝のポリアルキレングリコールポリマーを意味し、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリブチレングリコール（ＰＢＧ）、ならびにＰＥＧ、ＰＰＧおよびＰＢＧの任意の組合せのコポリマーを包含し、かつポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルを包含する。したがって、本発明の種々の実施形態において、本発明のナノ粒子中のポリアルキレングリコールは、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびこれらの任意の組合せであってもよい。
特定の実施形態において、ナノ粒子中のポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールまたは「ＰＥＧ」である。用語「ＰＥＧサブユニット」は、ただ１つのポリエチレングリコール単位、すなわち、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−を指す。
一部の実施形態において、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）は、非多分散性、単分散性、実質的に単分散性、純粋に単分散性、または実質的に純粋に単分散性であってもよい。
「単分散性」は、混合物中の化合物の約１００％が同様の分子量を有する、化合物の混合物を記述するのに使用される。
「実質的に単分散性」は、混合物中の化合物の少なくとも約９５％が同様の分子量を有する、化合物の混合物を記述するのに使用される。
「純粋に単分散性」は、混合物中の化合物の約１００％が同様の分子量を有し、かつ同様の分子構造を有する、化合物の混合物を記述するのに使用される。したがって、純粋に単分散性の混合物は、単分散性の混合物であるが、単分散性の混合物は、必ずしも純粋に単分散性の混合物であるとは限らない。
「実質的に純粋に単分散性」は、混合物中の化合物の少なくとも約９５％が同様の分子量を有し、かつ同様の分子構造を有する、化合物の混合物を記述するのに使用される。したがって、実質的に純粋に単分散性の混合物は、実質的に単分散性の混合物であるが、実質的に単分散性の混合物は、必ずしも実質的に純粋に単分散性の混合物であるとは限らない。
ナノ粒子が、ａ）ポリカチオン／アルギネート／グルコース接合体、およびｂ）活性薬剤を含む、それらから実質的になる、またはそれらからなる実施形態において、ポリカチオン、グルコースおよびアルギネートは、共有結合性相互作用を介して接合体中で互いに結び付くことができる。さらに、ポリカチオン／アルギネート／グルコース接合体は、静電力を介して活性薬剤に結び付くことができる。
ナノ粒子が、ａ）活性薬剤を含むコア、およびｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／アルギネート接合体を含む、それらから実質的になる、またはそれらからなる実施形態において、グルコースおよびアルギネートは、共有結合性相互作用を介して互いに結び付くことができる。さらに、グルコース／アルギネート接合体は、共有結合性相互作用を介して活性薬剤に結び付くことができる。
本発明のナノ粒子の一部の実施形態において、グルコース／ＰＡＧ接合体（例えば、グルコース／ＰＥＧ接合体）は、活性薬剤を含むコアを取り囲んで存在することができる。グルコース／ＰＡＧ接合体において、グルコースおよびＰＡＧは、例えば、化学的な共有結合（例えば、共有結合性相互作用）を介して結び付くことができる。グルコース／ＰＡＧ接合体のＰＡＧ部分は、共有結合性相互作用によってコアの活性薬剤に結び付くことができる。
さらに、本発明のナノ粒子の一部の実施形態において、活性成分に加えて、ポリカチオン／ＰＡＧ／グルコース接合体が存在することができる。この接合体において、グルコースとＰＡＧとは、上記のように互いに結び付くことができ、ポリカチオン（例えば、ＰＥＩ）は、グルコース／ＰＡ接合体のＰＡＧ（例えば、ＰＥＧ）に、例えば化学的共有結合を介して結び付くことができる。接合体のポリカチオンは、静電力によって活性薬剤に結び付くことができる。
コアを取り囲むグルコース／ＰＡＧ接合体に加えて、ポリカチオンおよび活性薬剤を含むコアが存在する本発明のナノ粒子において、該ポリカチオンは、静電力を介して活性薬剤に結び付くことができ、グルコース／ＰＡＧ接合体は、共有結合を介してコアのポリカチオンに結び付くことができる。
さらに、コアを取り囲むグルコース／アルギネート接合体に加えて、ポリカチオンおよび活性薬剤を含むコアが存在する本発明のナノ粒子において、該ポリカチオンは、静電力を介して活性薬剤に結び付くことができ、グルコース／アルギネート接合体は、共有結合を介してコアのポリカチオンに結び付くことができる。
ポリカチオンがナノ粒子中に存在する本発明の実施形態において、該ポリカチオンは、限定はされないが、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミン、ポリ（アリルアニオン塩酸塩、ＰＡＨ）、プトレシン、カダベリン、ポリリシン、ポリ−アルギニン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−β−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、カダベリン、ポリメタクリル酸（２−ジメチルアミノ）エチル、ポリ（ヒスチジン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、およびこれらの任意の組合せであってもよい。
本発明のナノ粒子の特定の実施形態において、ポリカチオンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。
本発明の種々の実施形態では、ポリカチオン（例えば、ＰＥＩ）を、本発明の活性薬剤（例えば、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アニオン性タンパク質、アニオン性薬物、ペプチドまたはタンパク質に共有結合されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにこれらの任意の組合せ）と、物理的静電力（例えば、ここで、活性薬剤（群）中の負電荷がポリカチオン中の正電荷と結合する）を介して複合させることができる。ポリカチオンをＧＬＵ−ＰＡＧまたはＧＬＵ−アルギネートに接合する前および／または後に、活性薬剤をポリカチオンと複合させることができる。
また、本発明のナノ粒子中の種々の成分を、架橋形成を介して、例えば、架橋性および／または触媒性薬剤［例えば、１−エチル−（３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ゲニピン、および任意の組合せの当技術分野で公知の任意のその他の架橋性および／または触媒性薬剤］を用いて互いに結び付けることができると考えられる。一部の実施形態では、光硬化性基を備えた成分をナノ粒子中の光硬化性成分と共架橋することのできる光架橋などの化学的架橋を採用することができる。
他の実施形態では、ナノ粒子中の成分を、連結分子を介して結び付けることができる。本発明の連結分子の例には、限定はされないが、ヘパリンおよび硫酸ヘパリンが含まれる。ヘパリンが連結分子として使用される実施形態では、静電力または特異的結合によってヘパリンに結合する活性薬剤を使用することができる。例えば、ヘパリンは、当技術分野で周知のようにＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、ＨＧＦ、ＦＧＦなどと特異的に結合する。さらに、ヘパリンは、負に帯電し、正に帯電したポリカチオンに静電力を介して結合することができる。本発明のさらなる連結分子としては、例えば、Ｆｒａｎｋら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（４４）：４３２２９〜４３２３５（２００３））中に記載のようなヘパリン類似体および修飾された多糖類が挙げられる。
本発明のナノ粒子中に存在する活性薬剤は、限定はされないが、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドのフラグメント、オリゴヌクレオチド、アンチセンス配列、リボザイム、リボザイムをコードするヌクレオチド配列、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＭＡ（ｍｉＲＮＡ）、タンパク質、タンパク質の生物学的に活性なフラグメント、ペプチド、化学療法薬もしくは薬剤、細胞障害性薬剤、放射性核種、検出可能なマーカー、造影剤、およびこれらの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、機能性タンパク質または治療効果を付与するその他の産生物をコードするプラスミドまたは核酸構築物であってもよい。本発明の核酸構築物によってコードされるタンパク質の非限定的例には、当技術分野で公知であるか、後に同定されるような、ｐ５３、ｐ５３／ｐ７３ＯＤキメラ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン２１−（ＩＬ−２１）、インターロイキン−２７（ＩＬ−２７）、セサリン、ＣＰＴ−１１、インターフェロン誘導性タンパク質−１０（ＩＰ−１０）、インターフェロンγによって誘導されるモノカイン（Ｍｉｇ；ＣＸＣＬ９）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド、ＰＴＥＮ、ＡＦＲ（ｐ１４）、Ｆａｓ、ＣＤＫ阻害タンパク質（ＣＩＰ）ｐ１５、ＣＩＰｐ２７、ＣＩＰｐ２１、β−カテニン、血管内皮増殖因子受容体２（ｍｓＦｌｋ１）、チミジンキナーゼ、血管新生抑制因子、アポトーシス誘導因子（例えば、ＢＩＫ、ＢＮＩＰ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＡＤ、ＢＡＸ、ＥＧＬ−１、ＣＥＤ１３）などが含まれる。
ナノ粒子が活性薬剤を含むコアを含む一部の実施形態において、該コアは、活性薬剤としてポリヌクレオチド／ポリカチオン（例えば、ＰＥＩ）複合体を含む、それから実質的になる、またはそれからなることができる。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｐ５３をコードするプラスミドまたは核酸構築物である。この実施形態において、本発明のナノ粒子は、ｐ５３をコードするプラスミドを腫瘍細胞に選択的かつ直接的に送達する。ｐ５３タンパク質が、トランスフェクトされた腫瘍細胞中で産生され、ここで、該タンパク質はその抗腫瘍効果を明らかにする。
本明細書中で使用する場合、「核酸」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡもしくはＲＮＡ、およびＲＮＡおよびＤＮＡのキメラを含めて、ＲＮＡとＤＮＡの双方を包含する。用語「ポリヌクレオシド」または「ヌクレオチド配列」は、鎖の長さに関係なく、ヌクレオチドの鎖を指す。核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖の場合、核酸は、センス鎖であってもよいアンチセンス鎖であってもよい。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を使用して合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基対形成能力を変更した、またはヌクレアーゼに対する抵抗性を高めた核酸を調製するのに使用することができる。本発明は、さらに、本発明の核酸またはヌクレオチド配列の補体（完全補体であってもよい部分補体であってもよい）である核酸を提供する。
「単離型ポリヌクレオチド」は、それが由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいて、直接的につながっているヌクレオチド配列と（１つは５’末端に、１つは３’末端に）直接的にはつながっていないヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。したがって、一実施形態において、単離型核酸は、コード配列に直接的につながっている５’非コード（例えば、プロモーター）配列の一部または全部を含む。したがって、該用語は、例えば、ベクター中に、自律的複製プラスミドもしくはウイルス中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれている、あるいは他の配列とは独立に別の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドムクレアーゼ処理によって産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを包含する。該用語は、また、さらなるポリペプチドまたはペプチド配列をコードするハイブリッド核酸の一部である組換えＤＮＡを包含する。遺伝子を含む単離型ポリヌクレオチドは、このような遺伝子を含む染色体のフラグメントではなく、むしろ遺伝子に付随するコード領域および制御領域を含み、染色体上で天然に見出されるさらなる遺伝子ではない。
用語「単離型」は、細胞性材料、ウイルス性材料、および／または培養培地（組換えＤＮＡ技術で製造される場合）、または化学的前駆体もしくはその他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない、核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドを指すことができる。さらに、「単離型フラグメント」は、天然にはフラグメントとして存在せず、かつ天然の状態では見出されない、核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドのフラグメントである。「単離型」は、調製が、技術的に純粋（均一）であることを意味しないが、それは、十分に純粋であり、ポリペプチドまたは核酸を意図した目的のために使用できる形態で提供する。
単離型細胞は、その天然の状態で通常的に付随する他の成分から分離されている細胞を指す。例えば、単離型細胞は、培養培地中の細胞（例えば、インビトロ）、および／または本発明の薬学的に許容される担体中の細胞であってもよい。したがって、単離型細胞を、対象に送達および／または導入することができる。一部の実施形態において、単離型細胞は、対象から取り出された、および生体外で操作され、次いで対象に戻される細胞であってもよい。
用語「フラグメント」は、ポリヌクレオチドに適用する場合、参照の核酸またはヌクレオチド配列に比較して長さが短縮され、かつ参照の核酸またはヌクレオチド配列に同一またはほとんど同一（例えば、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一）であるつながったヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、その配列から実質的になる、および／またはその配列からなる、ヌクレオチド配列を意味すると解される。本発明によるこのような核酸フラグメントを、適切なら、その構成要素であるより大きなポリヌクレオチド中に含めることができる。一部の実施形態において、このようなフラグメントは、本発明による核酸またはヌクレオチド配列の少なくとも約８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００個、またはそれ以上の連続ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドを含む、それらのオリゴヌクレオチドから実質的になる、および／またはそれらのオリゴヌクレオチドからなることができる。
用語「フラグメント」は、ポリペプチドに適用する場合、参照のポリペプチドまたはアミノ酸配列に比較して長さが短縮され、かつ参照のポリペプチドまたはアミノ酸配列に同一またはほとんど同一（例えば、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一）であるつながったアミノ酸のアミノ酸配列を含む、ほとんどその配列からなる、および／またはその配列からなる、アミノ酸配列を意味すると解される。本発明によるこのようなポリペプチドフラグメントを、適切なら、その構成要素であるより大きなポリペプチド中に含めることができる。一部の実施形態において、このようなフラグメントは、本発明によるポリペプチドまたはアミノ酸配列の少なくとも約４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００個、またはそれ以上の連続したアミノ酸の長さを有するペプチドを含む、それらのペプチドから実質的になる、および／またはそれらのペプチドからなることができる。
本明細書中で使用する場合、「機能性」ポリペプチドまたは「機能性タンパク質」または「機能性フラグメント」またはポリペプチドの「生物学的に活性なフラグメント」は、そのポリペプチドに通常的に付随する少なくとも１種の生物学的活性（例えば、抗腫瘍活性、タンパク質結合、リガンドもしくは受容体結合）を実質的に維持しているものである。特定の実施形態において、「機能性」ポリペプチドまたはタンパク質または「機能性フラグメント」は、未改変タンパク質によって所持されるすべての活性を実質的に維持している。生物学的活性を「実質的に維持している」とは、ポリペプチドまたはタンパク質またはフラグメントが、本来のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を維持していること（さらには本来のポリペプチドよりも高いレベルの活性を有する場合もある）を意味する。「非機能性」ポリペプチドは、ポリペプチドに通常的に付随する検出可能な生物学的活性をほとんどまたは本質的に示さない（例えば、せいぜい、意味のない量、例えば、約１０％またはさらには５％未満の）ものである。タンパク質結合および抗腫瘍活性などの生物学的活性は、当技術分野で周知であり、かつ本明細書中で説明されるようなアッセイを使用して測定することができる。
コード配列を含む核酸に関する用語「発現する」、「発現すること」または「発現」とは、核酸が、転写され、任意選択的に翻訳されることを意味する。典型的には、本発明によれば、本発明のコード配列の発現は、本発明のポリペプチドまたはその他の産生物の産生をもたらす。すべての発現されたポリペプチドまたはフラグメントまたはその他の産生物も、精製なしに無傷の細胞中で機能することができる。
本発明の一部の実施形態において、活性薬剤は、アンチセンスヌクレオチド配列であってもまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。用語「アンチセンスヌクレオチド配列」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用する場合、特定の標的ヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を指す。同一物を発現するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび核酸は、通常的な技術により調製することができる。例えば、Ｔｕｌｌｉｓへの米国特許第５，０２３，２４３号、Ｐｅｄｅｒｓｏｎらへの米国特許第５，１４９，７９７号を参照されたい。アンチセンスヌクレオチド配列は、全標的ヌクレオチド配列、または少なくとも１０、２０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００または５００個のつながった塩基からなるその部分に対して相補的であることができ、標的ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質または産生物の産生レベルを低下させる。
当業者は、配列の類似度が、アンチセンスヌクレオチド配列がその標的にハイブリダイズし、かつコードされたポリペプチドまたは産生物の産生を低下させるのに十分である限り、アンチセンスヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列に対して完全に相補的であることを必ずしも要しないことを認識している。当技術分野で周知のように、一般には、より高度の配列類似性が、短いアンチセンスヌクレオチド配列に対して要求され、一方、より大きな度合いの不適正塩基が、より長いアンチセンスヌクレオチド配列によって許容される。
例えば、このようなアンチセンスヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、それらの標的ヌクレオチド配列に関して、低減されたストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、またはさらに高いストリンジェンシーの条件下（例えば、それぞれ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む３５〜４５％ホルムアミドからなる３７℃での洗浄ストリンジェンシーで代表される条件；５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む４０〜４５％ホルムアミドからなる４２℃での洗浄ストリンジェンシーで代表される条件；および／または５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む５０％ホルムアミドからなる４２℃での洗浄ストリンジェンシーで代表される条件）で実施できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９）を参照されたい。したがって、一部の実施形態において、本発明のアンチセンスヌクレオチド配列は、標的コード配列の補体と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％またはより高い配列類似性を有することができ、ポリペプチド産生のレベルを低下させる。
アンチセンスヌクレオチド配列の長さ（すなわち、その中のヌクレオチドの数）は、それが意図した位置に選択的に結合し、標的配列の転写および／または翻訳を低下させる限り、決定的に重大ではなく、定型的手順に従って決定することができる。一般に、アンチセンスヌクレオチド配列は、約８、１０または１２個のヌクレオチドの長さから約２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個、またはより長いヌクレオチドの長さまでである。
アンチセンスヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の手順による化学合成および酵素的連結反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンスヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を高めるように、またはアンチセンスとセンスヌクレオチド配列の間で形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された種々の修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンスヌクレオチド配列を作出するのに使用できる修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテン−イルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。別法として、アンチセンスヌクレオチド配列は、その中に核酸がアンチセンス配向でクローンされた発現ベクターを使用して産生させることができる。（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、注目の標的核酸に対してアンチセンス配向を有する）。
本発明のアンチセンスヌクレオチド配列は、さらに、ヌクレオチド間架橋形成ホスフェート残基の少なくとも１つまたはすべてが、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、およびホスホロアミデートなどの修飾ホスフェートであるヌクレオチド配列を包含する。例えば、ヌクレオチド間架橋形成ホスフェート残基を１つおきに記載のように修飾することができる。別の非限定的例において、アンチセンスヌクレオチド配列は、ヌクレオチドの１つまたはすべてが、２’低級アルキル部分（例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニル、およびイソプロピルなど、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分枝の、飽和または不飽和のアルキル）を含むヌクレオチド配列である。例えば、ヌクレオチドを１つおきに記載のように修飾することができる。また、修飾ヌクレオチド塩基を含むものを含め、アンチセンス分子の調製方法に関するそれらの教示について参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｆｕｒｄｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：９１９３（１９８９）；Ａｇｒａｗａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１４０１（１９９０）；Ｂａｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３５３７（１９９０）；Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：３３７３（１９８９）；ＷａｌｄｅｒおよびＷａｌｄｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５０１１（１９８８）を参照されたい。
本発明の種々の実施形態において、活性薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの干渉ＲＮＡであってもよい。これらの干渉ＲＮＡを腫瘍細胞内の標的ヌクレオチド配列に向けて、ヌクレオチド配列の発現の調節、およびそれに続く標的ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質または産生物の産生の調節をもたらすことができる。干渉ＲＮＡ法を使用して腫瘍細胞またはがん細胞中で標的とされる予定の核酸配列の非限定的例には、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ａｋｔ、ＨＩＦ−ａ、ＭＭＰ、ＲａｓおよびＭＤＭ２が含まれる。
ｓｉＲＮＡは、標的コード配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞または生物体中に導入され、対応するｍＲＮＡの分解をもたらす転写後遺伝子発現抑制の機構である。ｓｉＲＮＡが遺伝子発現抑制を達成する機構は、Ｓｈａｒｐら、Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．１５：４８５（２００１）；およびＨａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ ＲｅｖＧｅｎ．２：１１０（２００１）中で概説されている。ｓｉＲＮＡの効果は、遺伝子発現が回復される前の多様な細胞分裂の間持続する。ｓｉＲＮＡは、ヒト胚生期腎臓およびＨｅｌａ細胞を含むヒト細胞中で成功的であることが証明されている（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４（２００１）を参照されたい）。一実施形態において、発現抑制は、ＲＮＡヘアピン（ｓｈＲＮＡ）の内因性発現を強制することによって哺乳動物細胞中で誘導され得る（Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１４４３（２００２）を参照されたい）。別の実施形態において、小さな（２１〜２３ｎｔ）ｄｓＲＮＡのトランスフェクションは、核酸発現をとりわけ抑制する（Ｃａｐｌｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９（２００２）中で概説されている）。
ｓｉＲＮＡ技術は、標準的な分子生物学の方法を利用する。不活性化されるべき標的コード配列の全部または一部に対応するｄｓＲＮＡは、標準的な方法によって、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる鋳型ＤＮＡ（標的配列に対応する）の双方の鎖の同時転写によって作り出すことができる。ｓｉＲＮＡで使用するためのｄｓＲＮＡを産生させるキットは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｉｎｃから市販されている。ｄｓＲＮＡを調製するように操作されたｄｓＲＮＡまたはプラスミドのトランスフェクションの方法は、当技術分野で定型的である。
約２１〜２３個の長さのヌクレオチドからなる一本鎖ＲＮＡ分子であるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、ｓｉＲＮＡに対して類似の方式で使用して、遺伝子発現を調節することができる（米国特許第７，２１７，８０７号を参照されたい）。
ｓｉＲＮＡによって作り出されるものに類似の発現抑制効果は、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッド構築物のトランスフェクションを含む哺乳動物細胞で報告されており（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８１：６３９（２００１））、注目のコード配列を発現抑制するためのさらに別の戦略を提供する。
本発明の活性薬剤は、また、一部の実施形態において、リボザイム、およびリボザイムをコードする核酸であってもよい。リボザイムは、核酸を部位特異的方式で開裂するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を所持する特定の触媒ドメインを有する（Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８７８８（１９８７）；Ｇｅｒｌａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：８０２（１９８７）；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ ４９：２１１（１９８７））。例えば、多数のリボザイムは、ホスホエステル移動反応を高度の特異性で加速し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのホスホエステルの１つのみを開裂する（ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：５８５（１９９０）；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：１７３（１９９２））。この特異性は、基質が、化学反応に先立って、特定の塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部先導配列（「ＩＧＳ」）に結合するという要求に寄与している。
リボザイム触媒は、核酸を含む配列特異的開裂／連結反応の一部として主に観察される（Ｊｏｙｃｅ、Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２１７（１９８９））。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号には、特定のリボザイムが、既知のリボヌクレアーゼのそれを超え、ＤＮＡ制限酵素のそれに近い配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用することができると述べられている。したがって、遺伝子発現の配列特異的リボザイム介在性阻害は、治療的応用にとりわけ適している可能性がある（Ｓｃａｎｌｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５９１（１９９１）；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２（１９９０）；Ｓｉｏｕｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２３：８３１（１９９２））。
一部の実施形態において、本発明の活性薬剤は、化学療法薬または化学療法剤であってもよい。化学療法薬または化学療法剤の非限定的例には、１）ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）；２）エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；３）抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ）；４）酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）；５）生物学的応答調節剤（例えば、インターフェロン−α）；６）白金配位錯体（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；７）アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）；８）置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）；９）メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ））；１０）副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド）；１１）副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）；１２）プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール）；１３）エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）；１４）抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）；１５）アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）；１６）抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド）；および１７）ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（例えば、リュープロリド）が含まれる。本発明の化学療法剤のさらなる例には、メトトレキサート、エピルビシン、フルオロウラシル、ベラパミル、シクロホスファミド、シトシンアラビノシド、アミノプテリン、ブレオマイシン、デモコルシン、エトポシド、ミトラマイシン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、カンプトテシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤（例えば、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ、Ｔｒｏｃａｄｅ、ドキソサイクリン、ミノサイクリンおよび参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７２，１５２号に記載のようなもの、ならびにシタラビンが含まれる。
本発明のさらなる実施形態において、活性薬剤は、放射性核種であってもよい。本明細書に記載のような「放射性核種」は、腫瘍またはがん細胞に治療線量の放射線を送達するのに適した任意の放射性核種でよく、限定はされないが、２２７Ａｃ、２１１Ａｔ、１３１Ｂａ、７７Ｂｒ、１０９Ｃｄ、５１Ｃｒ、６７Ｃｕ、１６５Ｄｙ、１５５Ｅｕ、１５３Ｇｄ、１９８Ａｕ、１６６Ｈｏ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８９Ｉｒ、１９１Ｉｒ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、５２Ｆｅ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、１７７Ｌｕ、１０９Ｐｄ、３２Ｐ、２２６Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、４６Ｓｃ、４７Ｓｃ、７２Ｓｅ、７５Ｓｅ、１０５Ａｇ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、１７７Ｔａ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１６６Ｙｂ、１６９Ｙｂ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、１１９Ｓｂ、１９７Ｈｇ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、および２１２Ｐｂが挙げられる。
本発明のよりさらなる実施形態において、活性薬剤は、検出可能なマーカーまたは標識でよく、あるいはそれらを含むことができる。検出可能なマーカーまたは標識の非限定的例には、放射性核種（３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９Ｔｅ、６４Ｃｕなど）、酵素、蛍光剤、化学発光剤、および発光性薬剤、ならびに当技術分野で周知のような基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子などが含まれる。
本発明の活性薬剤は、また、細障害性薬剤であってもよい。「細胞障害性薬剤」には、本明細書中で使用する場合、限定はされないが、リシン（例えば、リシンＡ鎖）、アクラシノマイシン、ジフテリア毒素、モネンシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）、ベルカリン（Ｖｅｒｒｕｃａｒｉｎ）Ａ、アブリン（Ａｂｒｉｎ）、ビンカアルカロイド、トリコテセンおよびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａが含まれる。
さらに、本発明の活性薬剤は、造影剤であってもよい。例えば、フルオレセインイソチシアネート（ＦＩＴＣ）は、蛍光画像法のための造影剤であることができ、超常磁性酸化鉄は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のための造影剤であることができ、かつ／または放射性核種は、Ｘ線画像法のための造影剤であることができる。
本発明のナノ粒子の任意の要素は、前記のような本発明のナノ粒子の種々の実施形態中に存在することができ、任意のこのような要素は、存在しないか、本発明のナノ粒子から除外されていてもよく、このようなその排除または不在は、本発明の否定的限定（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）として規定され得る（例えば、否定的但し書きによって記載の実施形態から排除される）ことが理解されよう。
さらなる態様として、本発明は、本明細書に記載のように、治療効果を達成するための、かつ／または診断のための医薬製剤およびその投与方法を提供する。医薬製剤は、薬学的に許容される担体中に本明細書に記載の任意のナノ粒子を含むことができる。
「薬学的に許容される担体」は、（ｉ）組成物をその意図した目的に対して不適にすることなしに本発明の組成物と組み合わせることができるという意味で組成物中の他の成分と適合性があり、かつ（ｉｉ）過度の副作用（毒性、刺激、およびアレルギー反応）なしに本明細書中で示されるような対象で使用するのに適している、塩類、担体、賦形剤、または組成物の希釈剤などの成分である。副作用は、それらのリスクが組成物によって提供される利益にまさる場合に、「過度」である。
薬学的に許容される成分の非限定的例には、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、油／水型エマルジョンなどのエマルジョン、マイクロエマルジョン、および種々のタイプの湿潤化剤などの、任意の標準的な医薬担体が含まれるが、これらには限定されない。とりわけ、薬学的に許容される担体は、本発明の対象への投与または送達のために製剤化される無菌の担体であると解釈される。さらに、薬学的に許容される担体は、動物、より詳細にはヒトでの使用について、連邦または州政府の規制当局によって承認された、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認められた薬局方中に列挙された任意の担体分子である。このような担体は、溶液剤、懸濁液剤、乳剤、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、液体含有カプセル剤、粉剤、徐放性製剤、座剤、乳剤、エアロゾル剤、噴霧剤、懸濁液剤の形態、または使用するのに適した任意のその他の形態を取ることができる。適切な医薬担体の例は、当業者に周知である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」第２１版（２００５）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、ペンシルヴェニア州）を参照されたい）。
さらに、活性成分または成分群を組成物の製剤化に必須の成分との混合物中に含むこのような医薬組成物を調製する上で、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤化剤、乳化剤、滑沢剤、甘味剤、着色剤、風味剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤などを含む、その他の通常的な薬理学的に許容される添加物を組み込むことができる。添加物としては、例えば、デンプン、蔗糖、果糖、デキストロース、乳糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、沈降性炭酸カルシウム、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ゼラチン、アラビアゴム、ＥＤＴＡ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタ重亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
本発明の製剤は、薬用薬剤、医薬品、担体、補助剤、分散剤、希釈剤などを任意選択的に含むことができる。
本発明のナノ粒子は、公知の技術により医薬担体中で投与用に製剤化することができる。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」第２１版（２００５）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、ペンシルヴェニア州）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、化合物（その生理学的に許容される塩を含む）は、典型的には、とりわけ許容される担体と混合される。担体は、固体または液体、あるいはその双方でよく、化合物と、単位用量製剤、例えば、０．０１または０．５重量％〜９５または９９重量％の化合物を含むことのできる錠剤として好ましくは製剤化される。１種または複数の化合物を、製薬に関する任意の周知技術によって調製することのできる本発明の製剤中に組み込むことができる。
本発明のさらなる態様は、対象をインビボで治療する方法であって、薬学的に許容される担体中に本発明のナノ粒子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法であり、該医薬組成物は、治療上有効な量で投与される。それを必要とするヒト対象または動物への本発明の組成物の投与は、このような組成物の投与に関する当技術分野で公知の任意の手段によることができる。
本発明の製剤は、経口、直腸、局所、頬側（例えば、舌下）、膣、非経口（例えば、皮下、骨格筋、心筋、隔膜筋および平滑筋を含む筋内、皮内、静脈内、腹膜内）、局所（すなわち、皮膚および気道表面を含む粘膜表面の双方）、鼻腔内、眼内、内臓内、網膜内、経皮、関節内、髄腔内、および吸入投与、門脈内送達による肝臓への投与、ならびに直接臓器注入（例えば、肝臓中への、中枢神経系への送達のための脳中への、膵臓中への、または腫瘍もしくは腫瘍を取り囲む組織中への）に適したものを包含する。与えられた事例で最も適切な経路は、治療されている状態の性質および重症度、ならびに使用されている個々の化合物の性質に依存する。
注射の場合、担体は、典型的には、無菌のパイロジェンフリー水、パイロジェンフリーリン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水、またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ［Ｒ］（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）などの液体である。他の投与方法の場合、担体は、固体または液体のいずれであってもよい。
経口投与の場合、組成物は、カプセル剤、錠剤、粉剤などの固形剤形で、またはエレキシル剤、シロップ剤および懸濁液剤などの液体剤形で投与することができる。組成物を、ゲラチンカプセル中に、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、マンニトール、デンプン、セルロースもしくはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムなどの不活性成分および粉末性担体と一緒に封じ込めることができる。所望の色彩、風味、安定性、緩衝能、分散またはその他の既知の望ましい特徴を提供するために添加することのできるさらなる不活性成分の例が、ベンガラ、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどである。類似の希釈剤を使用して圧縮錠剤を作製することができる。錠剤およびカプセル剤は、双方とも、数時間にわたる薬剤の継続的放出を提供するための徐放性製品として製造することができる。圧縮錠剤を、なんらかの不快な風味を遮断し、かつ錠剤を雰囲気から保護するために糖で被覆、またはフィルムで被覆することができ、あるいは消化管中での選択的崩壊のために腸溶性被覆を施すことができる。経口投与用の液体剤形は、患者の受容性を高めるために着色剤および風味剤を含むことができる。
頬側（舌下）投与に適した製剤としては、風味基剤、通常的には蔗糖とアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に組成物を含むロゼンジ剤；ならびにゼラチン、グリセリンもしくは蔗糖、およびアラビアゴムなどの不活性基剤中に組成物を含むパステル剤が挙げられる。
非経口投与に適した本発明の製剤は、組成物の無菌水性および非水性注射溶液を含み、該調合物は、意図した受容者の血液と好ましくは等張である。これらの調合物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図した受容者の血液と等張にする溶質を含むことができる。水性および非水性無菌懸濁液剤は、懸濁化剤および増粘剤を含むことができる。製剤は、単位投与、または多回投与容器、例えば、密閉されたアンプルおよびバイアル瓶の状態で提供することができ、使用直前に無菌液状担体、例えば、生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）の状態で貯蔵することができる。
即席の注射用液剤および懸濁液剤は、前に説明した種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。例えば、本発明の一態様において、密閉容器中に本発明のナノ粒子を単位剤形の状態で含む注射可能で安定な無菌組成物が提供される。該組成物は、その対象への注射に適した液体組成物を形成するように、適切な薬学的に許容される担体を用いて再構成される能力のある、凍結乾燥体の形態で提供される。組成物が実質的に非水溶性である場合、薬学的に許容される十分な量の乳化剤を、組成物を水性担体中で乳化するのに十分な量で採用することができる。１つのこのような有用な乳化剤がホスファチジルコリンである。
直腸投与に適した製剤は、好ましくは、単位用量の座剤として提供される。これらは、組成物を１種または複数の通常的な固体担体、例えば、カカオバターと混合すること、次いで生じる混合物を成型することによって調製することができる。
皮膚への局所適用に適した製剤は、好ましくは、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ペースト剤、ゲル剤、噴霧剤、エアロゾル剤、または油剤の形態を取る。使用できる担体としては、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮吸収増強剤、およびこれらの２つ以上からなる組合せが挙げられる。
経皮投与に適した製剤は、受容者の上皮との長時間の完全接触を維持するように構成された分離型パッチとして提供することができる。経皮投与に適した製剤は、イオン注入によって送達することもでき（例えば、Ｔｙｌｅ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照されたい）、典型的には、組成物の任意選択的に緩衝化された水性溶液の形態を取る。適切な製剤は、クエン酸塩またはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含む。
化合物は、代わりに、経鼻投与用に製剤化すること、あるいは任意の適切な手段によって対象の肺へ投与すること、例えば、ナノ粒子を含む呼吸可能な粒子の対象が吸入するエアロゾル懸濁剤によって投与することができる。呼吸可能な粒子は、液体であっても固体であってもよい。用語「エアロゾル」は、細気管支または鼻通路中に吸入される能力のある、任意の気体によって運ばれる懸濁相を含む。具体的には、エアロゾルは、定用量吸入器もしくはネブライザー中で、またはミスト噴霧器中で生成させることができるような、気体で運ばれる小滴懸濁物を含む。エアロゾルは、また、例えば吸入装置から吹込みによって送達できる、空気またはその他の担体気体中に懸濁された乾燥粉末組成物を含む。ＧａｎｄｅｒｔｏｎおよびＪｏｎｅｓ、「Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ」Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ（１９８７）；Ｇｏｎｄａ（１９９０）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ６：２７３〜３１３；およびＲａｅｂｕｒｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２７：１４３（１９９２）を参照されたい。ナノ粒子を含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知であるように、圧力駆動式エアロゾルネブライザーまたは超音波ネブライザーを用いるなどの任意の適切な手段によって生成させることができる。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ナノ粒子を含む固体粒子のエアロゾルも、同様に、製薬の技術分野で公知の技術により、任意の固体粒子状薬剤のエアロゾル発生器を用いて生成させることができる。
別法として、本発明のナノ粒子を、全身ではなく局所的に（例えば、腫瘍中および／またはその近隣に直接的に）例えばデポ剤または徐放性製剤の状態で投与することができる。
本発明のナノ粒子は、任意選択的に他の治療剤および／または処置と共に送達することができる。さらなる治療剤および／または処置は、本発明のナノ粒子の前に、後に、および／またはナノ粒子と同時に送達することができる。本明細書中で使用する場合、単語「同時に」は、併用効果をもたらすように、時間が十分に近接していることを意味する（すなわち、同時とは、一緒でよく、あるいは互いに前または後の短時間内に２つ以上の事象が行われてもよい）。一実施形態において、本発明のナノ粒子は、抗がん剤（例えば、本明細書に記載のような化学療法薬または化学療法剤）および／または血管新生抑制剤と共に投与され、それらの非限定的例には、ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ））および血管新生のその他のプロモーター（例えば、ｂＦＧＦ、アンジオポイエチン−１）に対する抗体；α−ｖ／β−３血管インテグリンに対する抗体（例えば、ＶＩＴＡＸＩＮ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ダルテパリン、ＡＢＴ−５１０、ＣＮＧＲＣペプチドＴＮＦα接合体、シクロホスファミド、リン酸コンブレタスタチンＡ４、酢酸ジメチルキサンテノン、ドセタキセル、レナリドミド、エンザスタウリン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤、（Ａｂｒａｘａｎｅ）、大豆イソフラボン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、クエン酸タモキシフェン、サリドマイド、ＡＤＨ−１（ＥＸＨＥＲＩＮ）、ＡＧ−０１３７３６、ＡＭＧ−７０６、ＡＺＤ２１７１、トシル酸ソラフェニブ、ＢＭＳ−５８２６６４、ＣＨＩＲ−２６５、パゾパニブ、ＰＩ−８８、バタラニブ、エベロリムス、スラミン、リンゴ酸スニチニブ、ＸＬ１８４、ＺＤ６４７４、ＡＴＮ−１６１、シレンギチド、およびセレコキシブが含まれる。さらに、本発明の主題は、当技術分野で公知のように、ナノ粒子の送達と組み合わせて、放射線処置および／または外科処置を受け入れることができ、かつまた、化学療法薬、サイトカイン、ホルモンおよび／または血管新生抑制剤を受け入れることができる。
特定の実施形態において、ナノ粒子は、対象に治療有効量（この用語は本明細書中で定義される通りである）で投与される。薬学的に活性な化合物の投与量は、当技術分野で公知の方法によって決定することができ、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．イーストン、ペンシルヴェニア州）を参照されたい。任意の特定のナノ粒子組成物の治療有効量は、組成物によって、および対象によって若干相違し、対象の状態、個々のナノ粒子の組成、ならびに／あるいは送達の経路および／または頻度に依存する。
核酸を含むナノ粒子の投与／送達に関して、約１０９〜約１０１２ナノ粒子／ｃｍ２（例えば、１０９／ｃｍ２、１０１０／ｃｍ２、１０１１／ｃｍ２、１０１２／ｃｍ２のナノ粒子）の投与量範囲を採用できる。所定体積の担体または媒体（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）；ヒドロゲルなど）中のナノ粒子の数は、分光分析により、または粒子を定量するための当技術分野で公知の任意の他の方法により測定される。
治療薬を含むナノ粒子の投与／送達に関して、投与量範囲は、どの薬物が使用されるかに応じて、当技術分野で標準的な方法により決定されるような、約５ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２のナノ粒子、またはより詳細には約１０ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２のナノ粒子（例えば、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１１ｍｇ／ｍ２、１２ｍｇ／ｍ２、１３ｍｇ／ｍ２、１４ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、１６ｍｇ／ｍ２、１７ｍｇ／ｍ２、１８ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、１９ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、９５ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、１２５ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、１７５ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２のナノ粒子）であってもよい。
ナノ粒子の投与／送達に関する典型的な投与量範囲としては、ｍｇ／ｋｇで表現して、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子、および約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲のナノ粒子（例えば、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子）が挙げられる。
本発明のｐ５３キメラ（例えば、ｐ５３／ｐ７３ＯＤ）の投与／送達に関して、典型的な投与量範囲は、約１．０ｍｇＤＮＡ／ｋｇ〜約１０．０ｍｇＤＮＡ／ｋｇ（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４，５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０．０ｍｇＤＮＡ／ｋｇ）であってもよい。
本発明の特定の実施形態において、治療効果を達成するために、および／または診断の目的のために、１回を超える投与（例えば２、３、４またはそれ以上の投与）を、種々の時間間隔にわたって（例えば、毎時間、毎日、毎週、毎月、毎年など）採用することができる。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、本発明のナノ粒子を採用する種々の方法を提供する。とりわけ、本明細書中で提供されるのは、ナノ粒子を細胞に送達する方法であって、細胞を本発明のナノ粒子と、ナノ粒子が細胞表面のグルコース輸送体に結合し細胞によって内部移行される条件下で接触させることを含む方法である。該細胞は、インビボであってもよく（すなわち、対象中の細胞）、または該細胞は、インビトロまたは生体外であってもよい。さらに、本発明の細胞は、がん細胞、前がん細胞、または腫瘍細胞であってもよい。
本明細書でさらに提供されるのは、それを必要とする対象において活性薬剤を腫瘍細胞に送達する方法であって、本発明のナノ粒子を対象に送達し、それによってナノ粒子が腫瘍細胞表面のグルコース輸送体に結合し、腫瘍細胞によって内部移行され、それによって活性薬剤を腫瘍細胞に送達することを含む方法である。
さらに、本発明は、それを必要とする対象における腫瘍の大きさを縮小する方法であって、有効量の本発明のナノ粒子を対象に送達し、それによって対象における腫瘍の大きさを縮小することを含む方法を提供する。
また、本明細書で提供するのは、それを必要とする対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、有効量の本発明のナノ粒子を対象に送達し、それによって対象における腫瘍の退縮を誘導することを含む方法である。腫瘍退縮は、例えば、当技術分野で周知のように、白血病およびその他の「液状がん」などの固形腫瘍がんでないがんにおいて測定することができる。
本発明は、さらに、対象（例えば、それを必要とする対象）における過剰増殖性障害を治療する方法であって、有効量の本発明のナノ粒子を対象に送達し、それによって対象におけるがんを治療することを含む方法を提供する。本発明は、また、対象（例えば、それを必要とする対象）における過剰増殖性障害を治療する方法であって、有効量の本発明のナノ粒子を対象に送達し、それによって対象における過剰増殖性障害（例えば、過剰増殖性細胞が細胞表面のグルコース輸送体を過剰発現する）を治療することを含む方法を提供する。
用語「がん」は、本明細書中で使用する場合、細胞の任意の良性または悪性の異常増殖を指す。本発明のがんは、原発性がんおよび／または転移性がんであってもよい。例には、限定はされないが、乳がん、前立腺がん、リンパ腫、皮膚がん、膵臓がん、結腸がん、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣がん、脳がん、原発性脳癌、頭頸部がん、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸部癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸部肥厚、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、および網膜芽細胞腫であってもよい。本明細書でさらに提供されるのは、当技術分野で公知であるような、突然変異ｐ５３表現型に付随する任意のがんである。
用語「対象」は、本明細書中で使用する場合、本発明の方法を実施することのできる任意の対象を包含する。本発明の方法により本発明のナノ粒子を送達することのできる対象には、医療目的（例えば、治療および／または診断）でのヒト対象、ならびに獣医学および薬物のスクリーニングおよび開発の目的での動物対象の双方を包含する。一部の実施形態において、対象は、鳥類対象または哺乳動物対象（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、霊長類、ラット、マウス、ウサギ目、ウサギ、モルモット、ハムスターなど）でよく、特定の実施形態において、ヒト対象（男性および女性対象の双方を含み、かつ新生児、幼児、若年、青年、成人、および老齢対象を含み、さらに懐妊対象を含む）である。他の実施形態において、対象は、がん、腫瘍増殖、および／または他の過剰増殖性障害の動物モデルである。
「それを必要とする」対象には、限定はされないが、がんまたはその他の増殖性障害と診断された対象、がんを有すると疑われる対象、腫瘍を有する対象、腫瘍を有すると疑われる対象、がんまたはその他の増殖性障害を有するリスクの高い対象、がんを有する可能性が高い対象、腫瘍を有する可能性が高い対象などが含まれる。このような対象は、それゆえ、治療および／または診断の目的でそれらに本発明のナノ粒子を投与または送達することを必要とし、かつ／またはそれが有益であり、かつ／またはそれを望む対象である。
用語「治療有効量」または「有効量」は、本明細書中で使用する場合、当技術分野で周知のように、例えば、状態（例えば、障害、疾患、症候群、疾病、傷害、外傷性および／または外科性創傷）に苦しむ対象に、対象の状態（１種または複数の症状）の改善、状態の進行の遅延または低減、状態の開始の予防または遅延、および／または臨床パラメーター、疾患または疾病の状態または分類の変化を含む有益な効果であり得る、など調節効果を付与する本発明のナノ粒子、および／または本発明のナノ粒子を含む組成物の量を指す。
例えば、治療有効量または有効量は、対象において、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％まで状態を改善する（例えば、がんを治療するおよび／または腫瘍の大きさを縮小するおよび／または腫瘍の退縮を誘導する）本発明のナノ粒子または組成物の量を指す。
「治療する」、「治療すること」、「治療」または「治癒すること」は、状態（例えば、障害、疾患、症候群、疾病、外傷性または外科性創傷など）に苦しむ対象に、例えば有益な効果であり得る調節効果を付与する任意の部類の活動を指す。
用語「治療する」、「治療すること」、「治癒すること」または「〜の治療」（または文法的に等価な用語）とは、対象の状態の重症度が、低減されるまたは少なくとも好転または改善されること、および／または少なくとも１つの臨床症状の若干の緩和、軽減または減少が達成されること、および／または状態の進行の遅延および／または疾患もしくは障害の開始の遅延が存在することも意味する。
「予防する」、「予防すること」または「予防」とは、対象における病理学的状態および／または疾患状態もしくは現状の進行および／または顕在化を回避または排除することを意味する。
腫瘍の大きさが縮小される本発明の方法では、腫瘍の大きさを、本発明のナノ粒子および／または組成物での治療なしでの腫瘍の大きさに比較して縮小することができる（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％まで縮小される）。また、治療の有効性は、本発明のナノ粒子および／または組成物での治療なしでの腫瘍成長率に比較した場合の、腫瘍の成長率の低下または腫瘍退縮の誘導を監視することによって測定することできる（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％まで低下した成長率または誘導された退縮率）。有効性を判定するために測定することのできるその他のパラメーターは、本発明のナノ粒子および／または組成物での治療に応答した腫瘍細胞のアポトーシスの割合／程度、および／または老化である。
本発明のナノ粒子は、限定はされないが、経口送達、静脈内送達、皮下送達、注射、外科的移植、体腔中への送達、局所適用、およびこれらの任意の組合せを含む、種々の方法を介して対象に送達される。
本発明は、さらに、対象におけるがんを診断する方法を提供する。一実施形態において、対象におけるがんをインビトロで診断する方法であって、ａ）本発明のナノ粒子を対象からの細胞と接触させること；ｂ）対象の細胞中へのナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または選択性を測定すること；ならびにｃ）対象の細胞中へのナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または選択性を、対照対象の細胞中へのおよび／または診断されている対象の対照細胞中へのナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または選択性と比較することを含み、それによって対照対象の細胞および／または試験対象の対照細胞と比較した場合の対象の細胞中へのナノ粒子の内部移行の量および／または割合および／または示された選択性の増加が、対象におけるがんの診断指標となる、方法が提供される。細胞中への本発明のナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または選択性を測定する方法は、本明細書で示される実施例に記載の通りであり、当技術分野で周知の通りである。非限定的例には、マーカー（例えばＧＦＰ）の検出、および産生物（例えば、β−ガラクトシダーゼ）を産生するための、ナノ粒子によって運搬されるヌクレオチド配列の発現の測定が含まれる。
また、本明細書中で提供されるのは、対象におけるがんをインビボで診断する方法であって、ａ）造影剤を含む本発明のナノ粒子を対象に送達すること；ｂ）対象において造影剤からのシグナルを検出すること；およびｃ）対象において造影剤からのシグナルを、対照対象または診断されている対象の対照組織における同一造影剤からのシグナルと比較することを含み、それによって対照対象または対照組織からのシグナルと比較した場合の対象からのシグナルの変化（例えば、特定の臓器、細胞型、位置などへのシグナルの蓄積）が、対象におけるがんの診断指標となる、方法である。前記造影剤が対象内に存在する場合に本発明の造影剤からのシグナルを検出する方法は、当技術分野で周知である。
さらに、本発明の方法を採用して、腫瘍の動態（例えば、対象への本発明のナノ粒子の送達に続く、時間にともなう腫瘍の大きさの縮小）を監視し、効果的な治療を見つけることができると考えられる。本発明のナノ粒子を、治療効果を同時に付与し、このような監視方法のための検出可能なシグナルを提供するように操作することができる。
本発明の実施形態は、さらに、１種または複数の本明細書に記載のナノ粒子および／または組成物、ならびに任意選択で使用および／または投与のための説明書を含むキットを含む。当業者は、本発明のキットが、当技術分野で周知であるような適切な試薬およびキットを使用するための指示書に加えて、キットの試薬を保持するための１つまたは複数の容器および／または貯蔵場所を含むことができることを理解するであろう。キットのこれらの各成分は、同一容器中で一緒にされ、かつ／または別々の容器中に準備される。
さらなる態様において、本発明は、ｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラであるｐ５３の誘導体を提供する。また本明細書中で提供するのは、薬学的に許容される担体中に、ｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラを含む、それから実質的になる、またはそれからなる組成物である。
ｐ５３／ｐ７３ＯＤとしても知られる、ｐ７３オリゴマー化ドメイン（ＯＤ）を含むｐ５３キメラは、３９３個のアミノ酸を有するヒトｐ５３タンパク質であり、その中のアミノ酸３１８〜３６４は、ｐ７３のアミノ酸３４６〜３９０（オリゴマー化ドメイン）で置き換えられている［２８］。野生型ｐ５３（例えば、ＰｕｂＭｅｄ中の遺伝子ＩＤ７１５７）、野生型ｐ７３（例えばＰｕｂＭｅｄ中の遺伝子ＩＤ７１６１）、およびキメラｐ５３／ｐ７３ＯＤのそれぞれのアミノ酸配列を、置換された配列を太字で表して後に示す。これらの野生型およびキメラ（図でｐ５３（７３βａａ３４６−３９０）と記載）の概略を、種々のドメインを識別して図１２に示す。当業者は、ｐ５３キメラのアミノ酸配列に対する種々の置換を、本発明のｐ５３の機能を変えることなしに行うことができることを、容易に理解するであろう。このような変異アミノ酸配列の産生および生じる変異ｐ５３キメラの機能性に関する試験のためのアッセイは、十分に当業者の技術の範囲内である。したがって、本明細書で提供されるｐ５３キメラ配列のこのような変異は、本発明に包含される。
ｐ７３（４９９個のアミノ酸；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＣＡＡ７２２１９）、アミノ酸３４６〜３９０が太字である。
ｐ５３（３９３個のアミノ酸；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＮＰ ００５３７）、アミノ酸３１８〜３６４が太字である。
ｐ５３／ｐ７３ＯＤ。ｐ５３（３９３個のアミノ酸からなる配列）のアミノ酸３１８〜３６４が、ｐ７３（４９９個のアミノ酸からなる配列）のアミノ酸３４６〜３９０で置き換えられている。
本発明の特定の態様は、本発明のｐ５３キメラが、腫瘍細胞中の突然変異ｐ５３に結合せず、そのため高レベルの突然変異ｐ５３の存在下でｐ５３の機能を効果的に回復できるという予想外の発見に基づく。したがって、本発明のｐ５３キメラを治療薬として使用して、がんを治療しかつ／または腫瘍の大きさを縮小することができる。したがって一態様において、本発明は、ｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラ（例えば、ｐ５３／ｐ７３ＯＤ）を細胞に送達する方法であって、細胞をｐ５３キメラと、ｐ５３キメラが細胞によって内部移行される条件下で接触させることを含む方法を提供する。この方法の種々の実施形態において、細胞は、インビボで、インビトロで、またはその双方で存在することができる。本明細書中でさらに提供されるのは、それを必要とする対象における腫瘍の大きさを縮小する方法であって、ｐ７３ＯＤを含む有効量のｐ５３キメラを対象の腫瘍細胞中に導入し、それによって対象における腫瘍の大きさを縮小することを含む、そのことから実質的になる、またはそのことからなる方法である。
本発明は、さらに、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、ｐ７３ＯＤを含む有効量のｐ５３キメラを対象に送達し、それによって対象におけるがんを治療することを含む、そのことから実質的になる、またはそのことからなる方法を提供する。
本発明のｐ５３キメラは、前に記載のように、本発明のナノ粒子の一部として含めることができる。しかし、対象へのｐ５３キメラの送達は、本発明のナノ粒子の一部としての対象の細胞中への導入に限定されないと解される。具体的には、このような送達は、細胞中に核酸分子を導入するための公知の任意の媒体および／または機構によって、本発明の対象の細胞中に本発明のｐ５３キメラを導入することを含むことができる。核酸分子を対象中および対象の細胞中に送達するための多くのプロトコールは、当技術分野で周知であり、本発明の方法に包含される。非限定的例には、周知のように、プラスミド、発現ベクター、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）、アルファウイルス、ポックスウイルスなど）、リボソーム、裸の核酸分子などが含まれる。本発明の特定の実施形態では、ｐ５３キメラを、当技術分野で周知であるアデノウイルス介在性遺伝子移動システムを介して細胞中に導入することができる。
本発明のナノ粒子および／またはキメラを採用する本発明の方法において、このような方法は、さらに、当技術分野で周知のプロトコールにより、対象に化学療法剤、血管新生抑制剤、サイトカイン、ホルモン、放射線処置、外科的処置、またはこれらの組合せを施すことを含む、それから実質的になる、またはそれからなることができる。このようなさらなるステップは、対象へのｐ５３キメラの送達の前、後、および／または送達と同時に実施することができる。
さらに、ナノ粒子および／またはｐ５３キメラを採用する本発明の方法には、対象にプロテインキナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、メチルトランスフェラーゼ阻害剤、およびこれらの任意の組合せを投与することを含む、それから実質的になる、またはそれからなるさらなるステップが含まれ得る。本明細書中でさらに提供されるのは、薬学的に許容される担体中に本発明のキメラを含む組成物を含むキットである。
本発明は、以下の実施例中でより詳細に説明されるが、その多くの修正形態および変形形も当業者にとって明白であるので、該実施例は、単なる例示と解釈される。
［実施例１ がん細胞に特異的なナノ粒子送達システム］
本発明では、ワールブルグ効果、すなわち、がん細胞が健常細胞に比べてより多くのグルコースを取り込む現象を利用することによって、がん細胞を標的とする以前には記載されていない部類のナノ粒子を開発した。具体的には、グルコースに接合されたＰＥＧに連結されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）接合体（ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ）を合成した。細胞培養研究において、このシステムを使用してＥＧＦＰまたはβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）発現プラスミドを送達すると、非がん細胞株であるＲＷＰＥまたはＭＣＦ−１０Ａ細胞と比較して、がん細胞株であるＰＣ３またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１において相当により大きな送達効率が達成された。送達の特異性は、過剰量のグルコースの添加がＥＧＦＰまたはβ−Ｇａｌの発現を著しく抑制することの発見によって立証されるように、グルコース輸送体に特有のものである。さらなる分析は、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体が、ナノ粒子／グルコース輸送体複合体のエンドサイトーシス介在性内部移行により細胞に入ることを示した。まとめると、これらの結果は、がん療法における該送達システムの可能性に関する原理証明を提供する。
抗がん療法の有効性は、健常細胞を損傷することなしに、がん細胞を縮小または除去する能力に依拠する。したがって、がん細胞を優先的に標的とする戦略は、がん療法の成功において必須である。ナノテクノロジーをベースにした薬物送達システム内に治療薬剤を封じ込めることは、製剤化戦略に広範に適用されている。種々のリポソーム、ポリマー性ミセル、デンドリマー、タンパク質ナノ粒子、ウイルスナノ粒子、炭素ナノチューブ、およびカチオン性ポリマーを含め、がん細胞への治療薬の送達を高めるために現在探索されている種々のナノ粒子系が存在する［２４］。腫瘍組織中へのナノ粒子の蓄積は、腫瘍の微小血管系を通るナノ粒子の管外遊出および腫瘍組織中での治療薬品の蓄積を促進するための長い循環半減期に依存する受動的過程である。
循環時間を長くする１つの決定的な戦略は、組織のマクロファージによる取込みを回避すること、および網膜内皮系による除去に抵抗することである。この目的のため、ナノ粒子を不活性で生体適合性のあるポリマーで被覆し、ステルス表面を創出してきた。例えば、ナノ粒子表面へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはアルギネートなどの親水性ポリマーの組込みが、循環時間を増大させるために広範に使用されてきた［２５］。一旦ナノ粒子が脈管系から腫瘍組織中に管外遊出すると、腫瘍細胞によるそれらの取込みは、治療薬品のより高い細胞内濃度およびそれに続く高められた治療有効性をもたらすことのできる積極的標的指向化によって促進される。積極的標識指向化は、送達を高めるために外面に接合された標的指向性リガンドの使用を必要とする。細胞増殖マーカーは、多くのこれらのマーカーが特定のがん細胞上で高度に発現されるので、がん治療薬のための重要な標的の部類を代表する。積極的標的指向性ナノ粒子によって利用される最も確立されたがん細胞標的としては、ヒト上皮受容体に対する抗体、移行受容体、および葉酸受容体が挙げられる。抗体を標的とすることは、見込みのある戦略と考えられるが、それは、腫瘍内取込みおよび腫瘍中での均一分布の双方を制限し、そのため薬物動態特性に有害な影響を及ぼす大きな水力学的大きさを含む、いくつかの欠点を有する。標的指向化の新たな方法が最近開発されている。それらの中で、核酸リガンド（アプタマー）は、かなりの興味を得ている。アプタマーは、分子内相互作用を介して、標的抗原に高い親和性および特異性で結合する独特な三次構造に折りたためるＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。バイオマーカーの認識に現在利用可能なプローブと比較して、アプタマーは、高特異性、低分子量、容易で再現性のある産生、多様な応用性、および容易な操作性を所持する［２４］。アプタマーの使用は、標的指向化ナノ粒子の送達の重要な進歩を代表するが、がん細胞に特異的なアプタマーの同定は、相変わらず難題であり、このような取組みのボトルネックであった。
本発明は、ワールブルグ効果を、すなわち、一般にがん細胞が健常細胞に比べてより多くのグルコースを取り込むことを利用することによってがん細胞を標的とするナノ粒子の新規な形態の開発に基づく。具体的には、本発明では、高度に過剰発現されたグルコース輸送体を利用して、がん細胞に優先的に入ることのできる、グルコースに接合されたＰＥＧ（ＧＬＵ−ＰＥＧ）に連結されたナノ粒子を合成した。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびｍｉＲＮＡなどの新たな部類の生物活性巨大分子の明らかになりつつある治療的潜在能力を認識し、これらのＧＬＵ−ＰＥＧナノ粒子の使用を、発現プラスミドの細胞内送達について解析した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、ＧＦＰを発現するまたはβ−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドを細胞中へ送達するためのＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩを合成した。
図１に示すように、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩプラスミド複合体を合成するための４ステップ反応を設計した。ＰＥＧに対するグルコースの比率は、２８５ｎｍでの分光法を使用して測定した。ＧＬＵ−ＰＥＧ／ＰＥＩ／ＤＮＡの最適組成は、３：１：１であると判定された。
ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子を調製したら、ＥＧＦＰ発現プラスミドを使用して、ＧＦＰ発現に関して、送達システムが非形質転換細胞に比較して形質転換細胞を優先的に標的とする能力を試験した。具体的には、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、非形質転換ヒト乳腺上皮細胞株であるＭＣＦ−１０Ａ細胞株と比較した。緑色蛍光シグナルの試験は、２種の細胞株中でのＧＦＰの明らかに異なる発現を明らかにした（図２Ａ）。平均して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中では５０％を超えるトランスフェクション効率が達成され、一方、同一条件下でＧＦＰ陽性であるＭＣＦ−１０Ａ細胞は５％未満であることが見出された。
ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩが介在する差別的な送達が細胞型に特異的であるかどうかを判定するため、１対のヒト前立腺上皮細胞株を並行して調べた。図２Ｂに示すように、非形質転換前立腺上皮細胞に比較した前立腺がん細胞の優先的標的化が、明らかである。前立腺癌細胞株であるＰＣ３は、ほぼ６０％のＧＦＰ陽性細胞を提示した。対照的に、非形質転換前立腺上皮細胞株であるＲＷＰＥは、５％未満のＧＦＰ発現細胞集団を有した。
結果をさらに検証するため、ＥＧＦＰプラスミドを、β−ガラクトシダーゼを発現するベクターで置き換えた。図２Ｃに示すように、ＧＦＰに類似の結果が観察され、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩはβ−ｇａｌ発現に関してがん細胞を標的とした。まとめると、これらのデータは、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩが、発現プラスミドを、非形質転換細胞に比較して癌細胞に優先的に送達する能力があることを立証した。
がん細胞は、高度に増加したグルコース取込みの原因である高レベルのグルコース輸送体を一般には発現することが、広く発表されている。ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩが、遺伝子送達のためにグルコース輸送体を利用したかどうかを判定するために、過剰量のグルコースを含めることによって競合実験を実施した。高濃度（５０ｍＭ）のグルコースの存在下での遺伝子発現の分析は、５ｍＭグルコースを含む培地で培養された細胞と比較した場合のＧＦＰ発現の著しい抑制によって証明されるように、グルコース輸送体依存性遺伝子送達を支持している（図３Ａ）。
グルコース競合研究は、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ介在性遺伝子送達がグルコース輸送体依存性であることを確証したが、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体がどのように細胞に入るかは不明なままであった。グルコースの大きさに比べてより大きいＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡの大きさを考慮すると、ナノ粒子／ＤＮＡ複合体は、グルコース輸送体で促進される拡散により形質膜を横切るグルコースとは異なる方式で細胞に入ると予想される。受容体−リガンド複合体のエンドサイトーシス介在性内部移行は、トランスフェリンおよび葉酸を含むリガンド接合型ナノ粒子のための主な細胞進入経路であることが示されている。エンドサイトーシスがＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体のための細胞進入機構でもあるかどうかを判定するための研究を実施した。これに取り組むために、エンドサイトーシスの活性を、初期エンドソームの活性を、そしてそれによってエンドサイトーシスの活性を制御する、恒常的に活性のあるまたはドミナントネガティブな突然変異Ｒａｂ５の発現を介して変化させた。エンドサイトーシス介在性取込みと矛盾せず、恒常的に活性なＲａｂ５｛Ｒａｂ５（Ｑ７９Ｌ）｝の発現は、対照と比較してより高レベルのβ−Ｇａｌ発現によって立証されるように、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩによる遺伝子送達の著しい増加と関連していた（図３Ｂ）。ドミナントネガティブな突然変異｛Ｒａｂ５（Ｓ３４Ｎ）｝を発現することによるエンドサイトーシスの活性の阻害が、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ介在性β−Ｇａｌ発現の抑制をもたらすという観察は、これらのデータと一致する（図３Ｂ）。
［実施例ＩＩ インビボでの研究］
組織への分布を研究するため、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩを含むナノ粒子を使用して、β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドをマウスに送達する。無胸腺の雄性および雌性ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ、４〜６週齢）は、Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入する。マウスを、病原体のない条件下に収容し、食物および水を制約なしに供給して、１２時間／１２時間の明暗サイクルで維持する。０．１ｍＬのＰＢＳ中の５×１０６個の腫瘍細胞（例えば、肺癌細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞など）の接種物をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）と４℃で混合し、次いでマウス脇腹の皮下（ｓ．ｃ．）区域に注入する。腫瘍の大きさが１ｃｍに達したら、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／β−Ｇａｌ（５０μＬのＰＢＳ中５０μｇ／ＤＮＡ）を尾部静脈注入により投与するか、あるいは０．５ｍＬのＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／β−ｇａｌ／ヒドロゲル（２０ｗｔ％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７ゲル）混合物を、腫瘍をもつマウスに皮下で投与する。２４または４８時間後に、マウスを頸部断頭によって屠殺する。肝臓、肺、脾臓、腎臓、心臓、および腫瘍を含め、種々の組織を集める。β−Ｇａｌ染色のため凍結組織切片を調製する。腫瘍細胞へのプラスミドの選択的送達を確実にするため、相対的遺伝子移動効率（腫瘍組織対正常組織中でのβ−Ｇａｌの発現）を評価し、最適化した。
［実施例ＩＩＩ ヒト対象へのナノ粒子の送達］
ポリヌクレオチドを含む本発明のナノ粒子を、ナノ粒子の組成および治療すべき個々の障害に応じて、本明細書に記載のような投与量で（例えば、経口および／または静脈内および／または皮下で）ヒト対象に送達する。治療の有効性を、当技術分野で周知のように、腫瘍の大きさおよび／または腫瘍増殖率の変化を測定すること、腫瘍細胞のアポトーシスおよび／または老化を測定すること、ナノ粒子によって運ばれる核酸でコードされる産生物の産生を分析すること、がん抗原（例えば、ＣＥＡ、ＰＳＡ）のレベルを測定すること、対象のがんに付随する兆候または症状の調節を評価することなどによって監視する。
［実施例ＩＶ 腫瘍抑制因子ＰＴＥＮをコードする核酸を送達するナノ粒子を使用する、腫瘍の大きさの用量依存性縮小］
図４Ｂは、対照ベクター、腫瘍抑制因子ＰＹＭをコードする２０μｇのベクター、または腫瘍抑制因子ＰＴＥＮをコードする４０μｇのベクターのどれかを与えられたマウスから単離された腫瘍の画像である。腫瘍の大きさの用量依存性縮小に一致して、Ｋｉ６７染色も、腫瘍抑制因子の遺伝子の用量依存的方式での発現による細胞増殖の阻害を示した（図４Ａ）。
［実施例Ｖ ｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラに関する研究］
腫瘍細胞は、ゲノムの不安定性および発がん遺伝子の活性化のせいで、持続性のｐ５３活性化シグナルを内部に含み、ｐ５３機能の回復をがん療法の魅力的な取組みとする。突然変異ｐ５３をその野生型相当物で置き換えるために、種々の方法が試みられてきた。しかし、腫瘍細胞中の高度に豊富な突然変異ｐ５３タンパク質のドミナントネガティブな活性のため、野生型ｐ５３は、機能性であるためには、正常組織に対して厳しい毒性をもたらす可能性のある極端に高いレベルで発現されなければならない。本発明では、ｐ７３のオリゴマー化ドメイン（ＯＤ）を含むｐ５３キメラ（ｐ５３／ｐ７３ＯＤ）が、提供される。ｐ５３ＯＤとｐ７３ＯＤとの間の相互作用の欠如のため、ｐ５３／ｐ７３ＯＤは、突然変異ｐ５３と会合せず、それゆえ突然変異ｐ５３の高いレベルにもかかわらず、ｐ５３の機能を効果的に回復する能力がある。重要なことであるが、ｐ５３／ｐ７３ＯＤの発現は、ＭＤＭ２の発現誘導による突然変異ｐ５３タンパク質レベルの著しい低下と関連している。結果として、このキメラの相当に低い発現レベルは、がん細胞の増殖を十分に抑制する。特定の実施形態において、本発明は、また、ｐ５３／ｐ７３ＯＤをがん細胞に優先的に送達するための、グルコースに接合されたＰＥＩ−ナノ粒子系を提供する。予備的データは、がん細胞に特異的な送達に関する原理証明を提供している。したがって、本発明では、臨床環境中への迅速な移行の目的で、ｐ５３をベースにした効果的な抗がん療法の開発のために、この新規な送達システムを利用することが考えられる。この取組みは、ｐ５３をベースにしたがん療法を革命的に変える潜在能力を有するのみならず、がん療法において広範な用途を有する、がん細胞に特異的な送達システムを提供する。
［予備研究］
マウス腫瘍モデルを用いた研究は、ｐ５３の発現を回復することが腫瘍の退縮をもたらすことを示し、確立された腫瘍がｐ５３に弱いことを示した［２６、２７］。しかし、過半数のヒトがんは、野生型ｐ５３をＯＤの介在する会合により効果的に不活性化する高レベルの突然変異ｐ５３タンパク質を発現し、腫瘍細胞におけるｐ５３機能の回復を極めて困難にする。本発明は、ｐ５３／ｐ７３キメラを利用して、突然変異ｐ５３によるこのＯＤ介在性不活性化を回避する。一連のｐ５３／ｐ７３キメラタンパク質を、ｐ５３およびｐ７３の対応するドメインを交換することによって作出した［２８］。これらのキメラタンパク質の研究は、ｐ５３／ｐ７３ＯＤがｐ５３に結合せず、むしろそれはｐ７３と会合し、ｐ５３およびｐ７３は、オリゴマー化ドメイン（ＯＤ）を介して互いに会合しないことを示した。結晶構造の研究は、この観察を裏付けた［２９］。機能的特徴づけは、ｐ５３／ｐ７３ＯＤが、試験されたｐ５３の機能をすべて保存していることを示した［２８］。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（高レベルの突然変異ｐ５３を発現する乳がん細胞株）中で発現される場合、ｐ５３／ｐ７３ＯＤは、野生型ｐ５３ではないが、細胞増殖を効果的に阻害した（図５Ａ）。ｐ５３／ｐ７３は、また、おそらくはＭＤＭ２発現の誘導に由来するのであろう、突然変異ｐ５３タンパク質レベルの有意な低下を誘導した（図５Ｂ、レーン３）。発癌機能の主な原因である突然変異ｐ５３のドミナントネガティブ型および機能獲得型活性を考慮すると、このことはとりわけ重要である。結果は、野生型ｐ５３と異なり、ｐ５３／ｐ７３ＯＤが、高レベルの突然変異ｐ５３の存在下で効率的な増殖抑制を誘導できることを立証しており、このキメラの発現が、突然変異ｐ５３を発現する腫瘍細胞中でｐ５３の機能を回復するための効果的な取組みとして役立つことができることを示している。
腫瘍細胞とは逆に、正常細胞は、ｐ５３活性化の固有のシグナルを通常的には内部に含まない。結果として、中位レベルのｐ５３／ｐ７３ＯＤ発現に対する正常細胞の応答は、がん細胞のそれとはおそらく異なる。このことは、同様のコロニー形成アッセイを使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＭＣＦ−１０Ａ細胞（非形質転換ヒト乳腺上皮細胞株）を比較することによって試験された。結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞増殖の著しい阻害を誘導するレベルで発現された場合、ｐ５３／ｐ７３ＯＤは、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の増殖に有意に影響を与えなかったことを示している（図６）。
がん細胞および非形質転換細胞のｐ５３／ｐ７３ＯＤ発現に対する異なる感受性の根底にある潜在的機構を理解するため、ｐ５３活性をさらに調べた。ｐ５３活性化の一般的に使用される代用マーカーである抗Ｓｐ１５ｐ５３抗体を用いたウェスタンブロットは、ｐ５３／ｐ７３ＯＤが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でリン酸化されるが、ＭＣＦ−１０Ａ細胞中ではされないことを示した（図７Ａ）。リン酸化と一致して、ｐ５３／ｐ７３ＯＤの発現は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１中でＰＵＭＡ、ＭＤＭ２、およびｐ２１の発現の活発な誘導をもたらしたが、ＭＣＦ−１０Ａ細胞中ではそうではなく（図７Ａ）、図６に示す異なる感受性と一致していた。結果は、がん細胞は、正常細胞と異なり、強力な固有のｐ５３活性化シグナルを内部に含むという概念に一致している。ＭＣＦ−１０Ａ細胞中でのｐ５３／ｐ７３ＯＤの低い活性は、キメラを放射線などの外来性刺激によって活性化することができるかどうかの疑問につながる。ＩＲで処理すると、ｐ５３／ｐ７３ＯＤのリン酸化が、ＭＣＦ−１０Ａ細胞、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中で著しく誘導され、双方の細胞型におけるＤＮＡ損傷によるキメラの活性化を示した（図７Ｂ）。フローサイトメトリー分析は、ＩＲ処理ＭＣＦ−１０Ａ細胞における有意なＧ１細胞周期の停止を明らかにした。対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、Ｇ１細胞周期の停止をほとんど示さず、むしろサブＧ１またはアポトーシス集団の著しい増加を示した（図７Ｃ）。この結果は、ＤＮＡ損傷で誘導されるｐ５３／ｐ７３ＯＤ活性化に対する形質転換細胞と非形質転換細胞とでの異なる応答を暗示している。
ｐ５３／ｐ７３ＯＤが、がん細胞中でｐ５３の機能を効果的に回復できることがわかり、遺伝子送達の戦略が探索されてきた。長年にわたり、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、およびウイルスベクターなどの種々の送達システムが導入されてきた。ウイルスベクターは、高効率の遺伝子移動を提供できるが、免疫原性および宿主ゲノム中での挿入型変異誘発の可能性が、大きな懸念として存在する。結果として、非ウイルス性送達システムがますます一般的になっている。本明細書に記載の研究では、カチオン性ポリマーを使用し、ワールブルグ効果、すなわち、がん細胞が健常細胞に比べてより多くのグルコースを取り込むことを利用することによって新規な形態のがん細胞標的化を開発した。具体的には、グルコースに接合されたＰＥＧに連結されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ）を合成した。図１に示すように、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩプラスミド複合体を合成するために４ステップ反応を設計した。グルコースのＰＥＧに対する比率は、２８５ｎｍでの分光法で測定した。ＧＬＵ−ＰＥＧ／ＰＥＩ／ＤＮＡの最適組成は、３：３：１であると判定された。β−ガラクトシダーゼの発現系（ｌａｃＺプラスミド）を使用して、送達システムがβ−ｇａｌ発現に関して非形質転換細胞に比較して形質転換細胞を優先的に標的とする能力を試験した。具体的には、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ＭＣＦ−１０Ａ細胞と比較した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ（登録商標））での染色は、２種の細胞株におけるβ−ｇａｌの明確に異なる発現を明らかにした（図８Ａ）。平均して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では６０％を超えるトランスフェクション効率が得られたが、同一条件下でβ−ｇａｌ陽性であることが見出されたＭＣＦ−１０Ａ細胞は５％未満であった。ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ介在性の異なる送達が、細胞型に特異的であるかどうかを判定するために、１対のヒト前立腺上皮細胞株を並行して試験した。図８Ｂに示すように、非形質転換前立腺上皮細胞に比較して優先的な前立腺がん細胞の標的化は、明らかである。前立腺癌細胞株であるＰＣ３は、ほぼ６０％のβ−ｇａｌ陽性細胞を提示した。対照的に、非形質転換前立腺上皮細胞株であるＲＷＰＥは、集団の５％未満がβ−ｇａｌを発現した。ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩが遺伝子送達のためにグルコース輸送体を利用したかどうかを判定するために、過剰量のグルコースを含めることによって、競合実験を実施した。高濃度（５０ｍＭ）のグルコースの存在下における遺伝子発現の分析は、５ｍＭのグルコースを含む培地を用いて培養された細胞と比較した場合のβ−ｇａｌ発現の著しい抑制によって証明されるように（図８Ｃ）、グルコース輸送体依存性の遺伝子送達を支持している。同時に、これらのデータは、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩが、発現プラスミドを非形質転換細胞に比較して癌細胞に優先的に送達する能力のあることを立証した。
ＰＥＩは優れたトランスフェクション効率を提供できるが、その使用は、高い細胞障害性によって阻止されることがある。実際、ＰＥＩは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存率に用量依存的方式で否定的影響を及ぼす（図９）。しかし、細胞障害性は、ＰＥＩをＧＬＵ−ＰＥＧまたはＧＬＵ−ＡＬＧと混合した場合に低減されることが見出された。この効果は、細胞障害性の用量依存性低下をもたらす、漸増する量のＧＬＵ−ＡＬＧを使用することによって確認された（図９）。
腫瘍異種移植片マウスモデルを使用して、ＧＬＵ−ＡＬＧ−ＰＥＩが腫瘍細胞にプラスミドをインビボで選択的に送達する能力を評価した。０．１ｍＬのＰＢＳ中の５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の接種物をマトリゲルと４℃で混合し、次いでマウス脇腹の皮下（ｓ．ｃ．）区域に注入した。腫瘍の大きさがほぼ２００ｍｍに達したらＰＢＳ中のＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ｌａｃＺを、腫瘍をもつマウスに尾部静脈注入により投与した。４８時間後に、マウスを頸部断頭によって屠殺した。肝臓、肺、脾臓、腎臓、心臓、および腫瘍を含め、種々の組織を集めた。β−Ｇａｌ染色のため凍結組織切片を調製した。驚くべきことに、β−Ｇａｌ陽性染色は、腫瘍組織においてのみ観察され、他の組織では観察されなかった（図１０）。ＡＬＧ−ＰＥＩが同一条件下でｌａｃＺを送達できないことは、グルコース依存性の腫瘍細胞標的化を示している。
インサイチュでのｐ５３の活性化の検出を容易にするため、基準的なｐ５３応答要素の１３反復を、ＧＦＰタンパク質の発現を推進するようにクローン化したＰｇ１３−ＧＦＰ系を開発した。ｐ５３に関するＧＦＰ発現の絶対依存性を、ｐ５３欠損Ｈ１２９９細胞で検証した。Ｐｇ１３−ＧＦＰ構築物を安定的に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を作出し、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＷＴｐ５３またはｐ５３／ｐ７３ＯＤと共にインキュベートした。２４時間後に細胞を固定した。細胞核の検出を容易にするためＤＡＰＩ染色を実施し、ＧＦＰシグナルを蛍光顕微鏡下で調べた。ｐ５３／ｐ７３ＯＤは、ｐ５３ｗｔと異なり、ＧＦＰの発現によって証明されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でｐ５３転写活性の増加と関連していた（図１１）。結果は、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ粒子が、発現されるだけではなく機能性でもあるｐ５３／ｐ７３ＯＤを成功裏に送達したことを示している。ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ｐ５３／ｐ７３ＯＤのインビボでの研究のために、Ｐｇ１３−ｌａｃＺおよびＰｇ１３−ルシフェラーゼプラスミドを創出し、Ｐｇ１３−ＧＦＰと並行して使用する。
［実験モデル］
本明細書に記載の研究は、インビトロおよびインビボモデルの双方を使用する。細胞モデルとしては、ＮＣ１６０ヒトがん細胞株、および例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通して得られるその他の非形質転換細胞株またはがん細胞株が挙げられる。ヌードマウスを使用して、腫瘍異種移植片モデルを創出する。ヒトがんの遺伝子操作されたマウスモデルも使用される。
［ＮＣＩ６０ヒト腫瘍細胞株中のｐ５３／ｐ７３ＯＤをその細胞増殖を阻害する活性について試験するための研究］
ｐ５３／ｐ７３ＯＤの増殖阻害活性をより広範な基盤上で検証するため、肺、結腸、乳腺および前立腺などの一般的なヒト腫瘍から得られたＮＣＩ６０ヒトがん細胞株について研究を実施する。がん細胞株中のｐ５３／ｐ７３ＯＤの活性を、１）生化学的レベル−キメラタンパク質およびｐ５３標的遺伝子の発現で、および２）細胞レベル−ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）およびコロニー生き残りアッセイによるがん細胞増殖で評価する。ｐ５３は、細胞型に応じて細胞の老化またはアポトーシスのどちらかの誘導によって細胞増殖を阻害することが確認されている。これらの２種の細胞応答は、ｐ５３／ｐ７３ＯＤ介在性増殖阻害の根底にある機構を判定するための対応するマーカーを使用することによって調べられる。ｍｙｃタグを付けた野生型ｐ５３、ｐ５３／ｐ７３ＯＤ、またはｐ５３（Ｒ１７５Ｈ）／ｐ７３ＯＤをコードするレトロウイルスベクター（ｐＢＡＢＥ）を調製し、使用する。Ｍｙｃタグは、再導入されるタンパク質を外来性突然変異ｐ５３タンパク質から容易に区別することを可能にする。並行して野生型ｐ５３を試験して、がん細胞中の突然変異ｐ５３のドミナントネガティブ活性を評価する。最近の研究は、アポトーシスの誘導におけるｐ５３のための転写非依存的役割を示唆している［１、２］。このような可能性は、転写欠損型突然変異ｐ５３（Ｒ１７５Ｈ）／ｐ７３ＯＤを含めることによって調べられる。
レトロウイルス介在性遺伝子移動を、以前に説明されているように実施する［３０］。ｐ５３またはｐ５３／ｐ７３ＯＤの異なる発現レベルは、５μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下に１００ｍｍの皿につき２５００万個の受容者細胞を異なる量のウイルス原液（０．５、１、１．５、２、２．５、または３ｍＬ）で感染させ、３７℃でインキュベートすることによって得られる。いくつかの癌細胞株を用いた予備研究において実施されたｐＢＡＢＥ−ｌａｃＺウイルスでの対照感染は、平均で５０〜８０％の細胞が定型的に感染されたことを示している。感染の２４時間後に、非感染細胞を除去するために、細胞を、細胞型に応じて２〜５μｇ／ｍＬのヒューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む培地中で２日間選択する。細胞を、ピューロマイシン不含培地中で２４時間回収し、次いで、さらなる分析に供した。
製造業者のプロトコールに従ってＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを実施して、細胞生存率を測定する。タイムコース実験（０、１、３、５、７および９日間）を実施して、時間と共に細胞生存率を監視する。
コロニー形成アッセイでは、細胞を、ｐ６０−ｍｍ培養皿中に播種する（細胞数は、各細胞型のプレーティング効率に応じて異なる）。１２日後に、コロニーを固定し、クリスタルバイオレットで染色する。少なくとも５０細胞を含むコロニーのみを計数し、プレーティング効率（計数されたコロニー／播種した細胞）を計算する。
細胞老化は、老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）、ｐ１５−Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１６−Ｉｎｋ４ａ、ＤｃＲ２、およびＤｅｃ−１を含むいくつかの細胞マーカーを使用して測定される。細胞生存率の実験に類似のタイムコースを実施して、老化表現型の発生を調べる。アポトーシスは、アネキシン−５−陽性細胞のフローサイトメトリー分析よって測定され、ウェスタンブロットを、前記のように種々の時点での活性化カスパーゼ−３のために使用する。
抗Ｍｙｃ、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２、またはアクチンを使用する、タンパク質発現のウェスタン分析のために、細胞を採取する。遺伝子アレイ分析のために、ＲＮＡを単離する。具体的には、ｐ５３パスウェイに関連する１１３個の鍵遺伝子パネルの遺伝子発現をプロフィールするように設計されているｐ５３パスウェイアレイ（ＡＢ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を使用する。調節されたｐ５３標的遺伝子は、アポトーシス、細胞周期、細胞成長、増殖および分化、ならびにＤＮＡ修復に関与する機能性クラスターに分割される。アレイデータは、ＱＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタン分析によって確認される。
腫瘍細胞は、高い増殖率がアポトーシス促進性遺伝子の誘導としばしば関連しているので、正常細胞に比べて有意により高いアポトーシスストレスの下にあるのが通常である［３１］。腫瘍細胞が、ゲノムの不安定性および発癌遺伝子の活性化により、持続的なｐ５３活性化シグナルを内部に含むという事実と一緒に［３２］、ｐ５３／ｐ７３ＯＤは、予備研究で示されたように、がん細胞中で発現すると容易に活性化されると予想することができる。ｐ５３／ｐ７３ＯＤの発現は、ｐ５３の状態にかかわらずほとんどの腫瘍細胞株において増殖の有意な抑制をもたらすと予想されるが、一方、野生型ｐ５３は、ｐ５３発現の不十分ながん細胞株においてのみ活性である。突然変異ｐ５３タンパク質が腫瘍細胞中に極めて高レベルまで通常的には蓄積することを考慮すると、ｐ５３／ｐ７３ＯＤが突然変異ｐ５３による阻害を逃れる能力は、中位レベルの発現が、がん細胞の増殖を阻害するのに十分であり、それによって潜在的に好ましくない副作用を回避すると予想されるので、極めて好都合であることがわかる可能性がある。提案される、異なるレベルのｐ５３／ｐ７３ＯＤを発現する実験は、腫瘍細胞の成長を抑制するのに十分な最適発現レベルの決定を可能にするはずである。最近の遺伝子研究は、ＭＤＭ２が、予備研究中で確認される、がん細胞中の突然変異ｐ５３の分解の主たる原因であることを示した［３］。ＭＤＭ２発現の誘導のせいで、ｐ５３／ｐ７３Ｄの発現による腫瘍細胞中での突然変異ｐ５３タンパク質レベルの相当の低下が期待される。このことは、治療に対する抵抗性および不十分な患者の生き残りの原因であることが示されている、腫瘍細胞中での突然変異ｐ５３タンパク質の高い存在度のため、極めて重要である。したがって、腫瘍細胞中へのｐ５３／ｐ７３ＯＤの導入は、腫瘍抑制機能を回復するのみならず高度に発癌性の突然変異ｐ５３タンパク質を除去する。ｐ５３／ｐ７３ＯＤのこの一石二鳥の効果は、抗がん療法としてキメラを使用するための強力な根本的理由を提供する。
ｐ５３の腫瘍抑制因子としての機能が主としてその転写活性によって仲介されることは、広く記載されている。ｐ５３パスウェイに特異的な遺伝子アレイ分析を実施することによって、ｐ５３／ｐ７３ＯＤによるがん細胞中でのｐ５３標的遺伝子発現の誘導が検出されると予想される。がんの類型に応じて、遺伝子発現の大きさおよびパターンは、ｐ５３応答性遺伝子のスペクトルの相違および種々の腫瘍細胞におけるｐ５３共活性化因子の利用能のため、変化する可能性がある。遺伝子発現データおよびそのｐ５３／ｐ７３ＯＤ誘導性増殖阻害との相関は、それぞれのがん類型において分析される。このような情報は、所定の腫瘍型のｐ５３／ｐ７３ＯＤ発現への応答を評価するうえで有益であるはずである。
腫瘍マウスモデルを使用する研究は、ｐ５３の再活性化が、腫瘍類型に応じて、主として造血器悪性腫瘍でのアポトーシスおよびその他の腫瘍型での老化を伴う、老化またはアポトーシスの誘導による腫瘍退縮を引き起こすことを立証した［２６］。老化またはアポトーシスのマーカーを使用して概略を示す研究は、試験した各腫瘍細胞株におけるｐ５３／ｐ７３ＯＤ介在性増殖阻害の根底にある機構をあらわにすると予想される。タイムコース実験は、ｐ５３／ｐ７３ＯＤによって誘導される各表現型の誘導の動力学を測定することを可能にするはずである。
要約すると、提案されたこれらの研究は、ヒトがん細胞株の大きなパネルにおいてｐ５３／ｐ７３ＯＤがｐ５３の機能を回復する能力を評価する。ｐ５３／ｐ７３ＯＤで誘導される遺伝子発現および増殖阻害の根底にある機構が調べられる。概略的研究から得られる結果は、腫瘍細胞、とりわけ突然変異ｐ５３を発現する細胞の増殖を阻害するためのｐ５３／ｐ７３ＯＤの優れた活性を立証する強力な証拠を提供すると予想される。
［ｐ５３／ｐ７３ＯＤ発現の放射線または化学療法と併用した効果を調べるための研究］
放射線および化学療法薬は、ｐ５３を極めて強力に活性化するＤＮＡ損傷の誘導を主として介してがん細胞を死滅させる。予備研究からの結果は、ｐ５３／ｐ７３ＯＤは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＭＣＦ−１０Ａ細胞の双方において、放射線によって活性化されたが、それに続く細胞効果はまったく異なったことを示している。ｐ５３／ｐ７３ＯＤの活性化が主として細胞死をもたらしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と対照的に、ＭＣＦ−１０Ａ細胞において放射線で誘導されるｐ５３／ｐ７３ＯＤの活性化は、Ｇ１細胞周期の停止と主に関連していた。形質転換細胞と非形質転換細胞との間のこのような異なる応答は、がん細胞を区別して標的とする機会を提供することができる。このことは、ｐ５３／ｐ７３ＯＤの放射線および／または化学療法薬との併用を調べることによって検証される。低から中位の線量の放射線または用量の化学療法薬での前処置は、正常細胞において細胞周期の停止を誘導すると予想されるが、一方、がん細胞は、細胞周期のチェックポイントの欠落のため、増殖し続ける。結果として、増殖を停止した細胞は、後に続く処置によって誘導される損傷に対してより抵抗性であるのが通常なので、正常細胞は保護される。一方、がん細胞は、固有の発癌シグナルおよび外来性ＤＮＡ損傷シグナルによるｐ５３／ｐ７３ＯＤの相乗的活性化のため、増感される。このことは、細胞をベースにしたモデルおよび動物モデルの双方を使用して検証される。
ｐ５３／ｐ７３ＯＤまたはｐ５３のどちらかの異なる発現レベルは、ヒトの主ながん類型を代表する、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＣＦ−１０Ａ乳腺上皮細胞、ＰＣ３と正常前立腺上皮細胞、ＮＣＩ−Ｈ３５８と３Ｂ３肺上皮細胞、Ｏｖｃａｒ−３とＩＯＳＥ−２９卵巣上皮細胞、およびＨＴ−２９とＲＩＥ−１結腸上皮細胞を含む、いくつかの対をなす形質転換細胞および非形質転換細胞において、前記のようなレトロウイルス感染を介して達成される。照射または化学療法薬の用量コース実験を実施する。細胞周期の停止、細胞の生き残り、および老化を含む細胞応答を、対をなす細胞株で比較する。ウェスタン分析を並行して実施して、ｐ５３の応答を監視する。前処置のために、癌細胞における有意な細胞死を引き起こさないｐ５３／ｐ７３ＯＤの発現レベルを選択し、後に続く放射線または化学療法薬の処置に対する対をなす細胞の感受性に関する前治療の効果を調べる。
ｐ５３／ｐ７３ＯＤまたはｐ５３のどちらかを発現する癌細胞をヌードマウスに移植し、インビボでの放射線または化学療法薬との組合せに関する研究のための異種移植片モデルを作出する。細胞研究における本明細書に記載のものに類似の戦略を使用する。
照射または化学療法薬によって引き起こされるＤＮＡ損傷は、ｐ５３活性化の最も強力なシグナルである。発癌遺伝子の活性化およびその他のストレス表現型によるがん細胞に固有の持続的ｐ５３活性化シグナルと一緒に［３３］、ｐ５３／ｐ７３ＯＤの照射または化学療法薬との組合せに対するがん細胞の高められた感受性が期待される。発癌ストレスおよびＤＮＡ損傷は、がん細胞において相乗的活性化につながり、かつそれによってｐ５３／ｐ７３ＯＤの活性を増大させる可能性のある、部分的に重複はするが異なる機構を介してｐ５３を活性化する。このような効果は、臨床医が照射線量または化学療法薬の投与量を低減し、潜在的副作用を最小化することを可能にする。提案される研究は、ｐ５３／ｐ７３ＯＤの照射または化学療法薬との併用使用の有益な効果を試験することを可能にする。予備研究で示したように、正常細胞において放射線または化学療法薬で誘導されるｐ５３／ｐ７３ＯＤの活性化は、Ｇ１細胞周期の停止と関連しており、成長停止細胞は細胞障害性療法に対してより抵抗性であるのが通常なので、中位用量での前処置は、正常細胞に対して保護効果を提供すると予想される。非形質転換細胞をそれらの中でおよびがん細胞とｐ５３／ｐ７３ＯＤ発現の存在または不在下で比較することによって、正常細胞およびがん細胞の抗がん療法の処置に対する異なる感受性が期待される。提案されるマウス異種移植片モデルは、特に突然変異ｐ５３を発現する腫瘍においてｐ５３／ｐ７３ＯＤの優れた抗腫瘍活性を立証するための細胞をベースにした研究を補完すると予想される。ｐ５３活性化を腫瘍部位に限定し、正常組織に対する損傷をさらに最小化することのできる照射の局所化送達は、価値ある考え方である。
要約すると、これらの研究は、化学療法薬または放射線のｐ５３／ｐ７３ＯＤとの細胞生き残りに対する併用効果を調べる。ｐ５３／ｐ７３ＯＤの化学療法または放射線との併用使用の治療有効性を高めるために、非形質転換細胞において細胞周期の停止を誘導する低用量での前処置の戦略を探索する。
［マウス腫瘍モデルにおけるｐ５３／ｐ７３ＯＤの発現のための、腫瘍細胞を標的とするＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩの研究］
抗がん治療の有効性は、健常組織を損傷することなしにがん細胞を縮小および除去する能力によって判定される。したがって、がん細胞を優先的に標的とする戦略は、がん療法の成功において必須である。本発明は、ワールブルグ効果、すなわち、がん細胞が健常細胞に比べてより多くのグルコースを取り込むことを利用することよってがん細胞を標的とするナノ粒子をベースにした送達システムの新規な形態を提供する。予備研究は、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩが、それぞれＲＷＰＥまたはＭＣＦ−１０Ａ細胞中と比べてＰＣ３またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１中で相当により大きな効率でのｌａｃＺ発現プラスミドの送達を可能にすることを示した。マウス腫瘍モデルを使用して、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩのインビボでの有用性を試験する。
ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩは、組織分布研究のためにｌａｃＺ発現プラスミドを送達するのに使用される。すべての動物実験は、ＵＴＨＳＣＳＡの国際動物保護使用委員会の指針に従う。無胸腺の雄性および雌性ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ、４〜６週齢）はＨａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入する。マウスを、病原体のない条件下に収容し、食物および水を制約なしに供給して、１２時間／１２時間の明暗サイクルで維持する。ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡを、無菌生理食塩水溶液中に、沈殿を回避するために２００μｇ／ｍＬを超えないＤＮＡ濃度で懸濁する。最大許容用量を、尾部静脈を経由する２０、４０、６０、８０または１００μｇ用量のプラスミドＤＮＡに等価な量の静脈内注入によって判定し、マウスを毒性の任意の兆候について綿密に監視する。動物の体重を３日ごとに計量する。急性毒性の一般に使用される代用マーカーであるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、血清トランスアミナーゼ活性レベルを、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡナノ粒子の全身投与の１、３、６、９、１５および３０日後に集めた血液サンプルから測定した。肝臓、肺、脾臓および腎臓を、組織学的検査のために採取する。
腫瘍によるＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡナノ粒子の優先的取込みを評価するために、マウス異種移植片腫瘍モデルを作出する。０．１ｍＬのＰＢＳ中の３×１０６個の腫瘍細胞からなる接種物をマトリゲルと４℃で混合し、次いでマウス脇腹の皮下（ｓ．ｃ．）区域に注入する。腫瘍の大きさが０．２ｃｍに達したら、ＰＢＳ中のＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ｌａｃＺを、腫瘍をもつマウスに尾部静脈注入により投与する。２４または４８時間後に、マウスを頸部断頭によって屠殺する。肝臓、肺、脾臓、腎臓、心臓、および腫瘍を含め、種々の組織を集める。β−Ｇａｌ染色のため凍結組織切片を調製する。腫瘍細胞へのプラスミドの選択的送達を確実にするため、相対的遺伝子移動効率を評価し、最適化する。並行して、ナノ粒子を使用して、ＥＧＦＰまたはホタルルシフェラーゼのどちらかをコードするプラスミドを送達し、蛍光造影用低エネルギーレーザー走査、またはルミネセンス造影のためのホタルルシフェラーゼに対する基質である１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンの腹膜内注入を使用して分布を可視化する。さらに、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡを腫瘍内注入で投与し、ナノ粒子の分布を測定する。ナノ粒子の複数回投与が必要であるかどうかを決定するための重要な参考として役立つ遺伝子発現の持続期間を監視する。
送達条件を確立したら、対照として野生型ｐ５３またはｐ５３（Ｒ１７５Ｈ）／ｐ７３ＯＤを含めて、ｐ５３／ｐ７３ＯＤの活性を評価する。初期研究は、４種の癌細胞；それぞれ乳腺、前立腺、結腸直腸および卵巣がんの代表としてのＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３、ＨＴ−２９およびＯｖｃａｒ−３への移植からなる。これらのがん細胞株には、Ｐｇ１３−ｌａｃＺ、Ｐｇ１３−ＧＦＰ、またはＰｇ１３−Ｌｕｃが安定的にトランスフェクトされ、それらを異種移植片モデルの作出に使用する。腫瘍の大きさが１ｃｍに到達したら、ＰＢＳ中のＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を尾部静脈注入により投与する。腫瘍を持つマウスをさらに４〜８週間監視する。体重および腫瘍体積を３日ごとに測定する。腫瘍体積は、式（体積＝長さ×幅×深さ×０．５２３６ｍｍ３）を使用して計算される。蛍光またはルミネセンス造影を使用して、Ｐｇ１３−ＧＦＰまたはＰｇ１３−Ｌｕｃ発現がん細胞に由来する異種移植片腫瘍におけるｐ５３／ｐ７３ＯＤ介在性腫瘍抑制の動力学を監視する。ｐ５３／ｐ７３ＯＤの発現と腫瘍退縮の程度との間の相関に基づいて、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ｐ５３／ｐ７３ＯＤの更なる投与が必要かどうかを決定する。各実験の終末時点で、頸部断頭によってマウスを屠殺する。本明細書に記載のような遺伝子発現を分析するために腫瘍サンプルおよび選択組織を集め、アポトーシスおよび老化のマーカーを使用する組織学的検査を、やはり本明細書に記載のように実施する。
並行して、マウス異種移植片モデルを化学療法薬または放射線のどちらかで処理し、腫瘍増殖に対するＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ｐ５３／ｐ７３ＯＤの化学療法または放射線との併用効果を評価する。
異種移植片マウスモデルに由来する結果は、ｐ５３／ｐ７３ＯＤを、ヒトがんコンソーシアム（Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（http://mouse.ncifcrf.gov）のＮＩＨ／ＮＣＩマウスモデルからのヒトがんの遺伝子操作マウスモデルを用いて試験することによって検証される。
ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩは、異種移植片マウスモデルにおける送達に関して腫瘍細胞を優先的に標的にすると予想される。ＰＥＧ被覆は、ＰＥＩにインビボで有意に増加した循環時間を付与する。さらに、ＰＥＧは、医薬添加剤として使用され、非毒性かつ非免疫原性であることが知られている［３４］。ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡナノ粒子は、毒性をほとんど示さないと予想され、マウスによって十分に耐えられる。細胞をベースにした研究からの予備データは、がん細胞をグルコース輸送体に依存する方式で標的にするＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡナノ粒子に関する原理証明を立証した。異種移植片マウスモデルのこれらの研究は、腫瘍によるナノ粒子の優先的取込みを立証すると予想される。ＥＧＦＰまたはホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドの使用は、ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ介在性がん細胞送達を監視することを可能にするはずである。リアルタイムのルミネセンスおよび蛍光（４００〜９００ｎｍ）造影を使用して、生存マウス内のナノ粒子の分布を監視し、記録する。β−ｇａｌシグナルの提案される組織学的検査で補完すると、これらのインビボでの造影方法は、腫瘍細胞中での発現プラスミドの時間的および空間的分布の測定を可能にするはずである。ナノ粒子の正常組織への最低レベルの分布が期待され、ＥＧＦＰまたはルシフェラーゼの発現は、プラスミドが発現できる組織の検出および発現レベルの定量化を可能にするはずである。このような情報は、ｐ５３／ｐ７３ＯＤの使用を指導する上で助けになる。癌細胞を安定的に発現するＰｇ１３−ＥＧＦＰまたはＰｇ１３−Ｌｕｃの使用は、腫瘍退縮と相関する場合に最良の治療結果に最適なｐ５３／ｐ７３ＯＤの用量および発現の持続時間の決定を可能にするはずであるｐ５３／ｐ７３ＯＤのインビボでの活性を監視する上で好都合であることがわかる。化学および放射線療法と併用する場合、ｐ５３／ｐ７３ＯＤのがん細胞へのＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩ介在性送達は治療用量の低減さらに潜在的副作用の最小化を可能にするはずである化学療法または放射線の治療効果まで、腫瘍細胞を選択的に増感すると予想される。
同時的な造影および治療的応用のための二重機能性ナノ粒子も開発することができる。予備研究において、アルギン酸−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／ＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子が合成され、現在、これらの応用について研究中である。
要約すると、研究は、関連はするが相互に依存的でない２つの領域、すなわち、１）突然変異ｐ５３による不活性化に抵抗性であるｐ５３／ｐ７３ＯＤキメラの使用によって強調されるｐ５３をベースにした新規ながん療法を開発すること、２）ナノ粒子をベースにしたがん細胞ターゲティング送達システムを開発すること、に焦点を当てることによって実験的治療薬を探索するために実施される。予備データは、突然変異ｐ５３を発現するがん細胞中でｐ５３の機能を回復する上でのこのキメラの優れた活性を立証した。過半数のヒトがんが高レベルの突然変異ｐ５３を内部に含むことを考慮すると、ｐ５３／ｐ７３ＯＤの使用は、単独または化学療法または放射線との組合せのどちらかで、かなりの治療潜在能力を有すると予想される。予備研究からのデータは、がん細胞選択的送達方法としてのＧＬＵ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子に関する原理証明を提供した。一部の実施形態においてｐ５３／ｐ７３ＯＤの治療有効性を増強するように設計されるが、送達システムは、がん治療を改善するためのさらなる実施形態において広範な応用を有すると予想される。
ヌクレオチド配列に関するすべての刊行物、特許出願、特許、言及、アミノ酸配列に関する言及、および本明細書中で引用されるその他の言及は、該言及が提供される文および／または段落に関連する教示に関して参照によりその全体で組み込まれる。
これまでの説明は、本発明の例示であり、発明を限定するものと解釈すべきでない。本発明は、クレームの等価体もその中に含めて、後記のクレームによって定義される。
［参考文献］

Claims (30)

  1. Ａ）ａ）ポリカチオン／ポリアルキレングリコール／グルコース接合体と、
    ｂ）活性薬剤と
    を含むナノ粒子、
    Ｂ）ａ）活性薬剤を含むコアと、
    ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ポリアルキレングリコール接合体と
    を含むナノ粒子、
    Ｃ）ａ）ポリカチオンおよび活性薬剤を含むコアと、
    ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ポリアルキレングリコール接合体と
    を含むナノ粒子、
    Ｄ）ａ）ポリカチオン／アルギネート／グルコース接合体と、
    ｂ）活性薬剤と
    を含むナノ粒子、
    Ｅ）ａ）活性薬剤を含むコアと、
    ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／アルギネート接合体と
    を含むナノ粒子、
    Ｆ）ａ）ポリカチオンおよび活性薬剤を含むコアと、
    ｂ）（ａ）を取り囲むグルコース／アルギネート接合体と
    を含むナノ粒子、ならびに
    Ｇ）ａ）上記（Ａ）〜（Ｆ）のナノ粒子の任意の組合せ
    からなる群から選択されるナノ粒子。
  2. ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１に記載のナノ粒子。
  3. ポリカチオンがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項１または２に記載のナノ粒子。
  4. 活性薬剤が、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、化学療法薬、細胞障害性薬剤、放射性核種、検出可能なマーカー、造影剤、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１から３までのいずれかに記載のナノ粒子。
  5. ポリヌクレオチドが、ｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラをコードするプラスミドである、請求項４に記載のナノ粒子。
  6. ａ）ＰＥＩおよびｐ５３をコードするポリヌクレオチドを含むコアと、
    ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ＰＥＧ接合体と
    を含むナノ粒子。
  7. ａ）ＰＥＩおよびｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラをコードするポリヌクレオチドを含むコアと、
    ｂ）（ａ）のコアを取り囲むグルコース／ＰＥＧ接合体と
    を含むナノ粒子。
  8. ナノ粒子を細胞に送達する方法であって、細胞を請求項１から７までのいずれかに記載のナノ粒子と、該ナノ粒子が細胞表面のグルコース輸送体に結合し細胞によって内部移行される条件下で接触させることを含む方法。
  9. 細胞がインビボである、請求項８に記載の方法。
  10. 細胞がインビトロである、請求項８に記載の方法。
  11. それを必要とする対象において活性薬剤を腫瘍細胞に送達する方法であって、請求項１から７までのいずれかに記載のナノ粒子を対象に送達し、それによってナノ粒子が腫瘍細胞表面のグルコース輸送体に結合し、腫瘍細胞によって内部移行され、それによって活性薬剤を腫瘍細胞に送達することを含む方法。
  12. それを必要とする対象における腫瘍の大きさを縮小する方法であって、有効量の請求項１から７までのいずれかに記載のナノ粒子を対象に送達し、それによってナノ粒子が腫瘍細胞表面のグルコース輸送体に結合し、内部移行され、それによって対象における腫瘍の大きさを縮小することを含む方法。
  13. それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、有効量の請求項１から７までのいずれかに記載のナノ粒子を対象に送達し、それによって対象におけるがんを治療することを含む方法。
  14. 対象に化学療法剤、血管新生抑制剤、サイトカイン、ホルモン、放射線処置、外科処置、またはこれらの任意の組合せを施すステップをさらに含む、請求項１１から１３までのいずれかに記載の方法。
  15. さらなるステップが、対象へのナノ粒子の送達の前、後、および／または送達と同時に実施される、請求項１４に記載の方法。
  16. 薬学的に許容される担体中に請求項１から７までのいずれかに記載のナノ粒子を含む組成物。
  17. 請求項１から７までのいずれかに記載のナノ粒子または請求項１６に記載の組成物を含むキット。
  18. 対象におけるがんをインビトロで診断する方法であって、
    ａ）検出可能なマーカーを含む、請求項１から７までのいずれかに記載のナノ粒子を対象からの細胞と接触させるステップと、
    ｂ）対象の細胞中へのナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または特異性を測定するステップと、
    ｃ）対象の細胞中へのナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または特異性を、対照対象の細胞および／または診断されている対象からの対照細胞中へのナノ粒子の内部移行の割合および／または量および／または特異性と比較するステップと
    を含み、それによって対照対象の細胞および／または対照細胞と比較した場合の対象の細胞中へのナノ粒子の内部移行の量および／または割合および／または特異性の増加が、対象におけるがんの診断指標となる、方法。
  19. 対象におけるがんをインビボで診断する方法であって、
    ａ）造影剤を含む、請求項１から７までのいずれかに記載のナノ粒子を対象に送達するステップと、
    ｂ）対象において造影剤からのシグナルを検出するステップと、
    ｃ）対象において造影剤からのシグナルを、対照対象および／または診断されている対象の対照組織／細胞における同一造影剤からのシグナルと比較するステップと
    を含み、それによって対照対象および／または対照組織／細胞からのシグナルと比較した場合の対象からのシグナルの変化が、対象におけるがんの診断指標となる、方法。
  20. 薬学的に許容される担体中にｐ７３オリゴマー化ドメイン（ＯＤ）を含むｐ５３キメラを含む組成物。
  21. ｐ７３ＯＤを含むｐ５３キメラを細胞に送達する方法であって、細胞をｐ５３キメラと、ｐ５３キメラが細胞によって内部移行される条件下で接触させることを含む方法。
  22. 細胞がインビボである、請求項２１に記載の方法。
  23. 細胞がインビトロである、請求項２１に記載の方法。
  24. それを必要とする対象における腫瘍の大きさを縮小する方法であって、ｐ７３ＯＤを含む有効量のｐ５３キメラを対象の腫瘍細胞中に導入し、それによって対象における腫瘍の大きさを縮小することを含む方法。
  25. それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、ｐ７３ＯＤを含む有効量のｐ５３キメラを対象に送達し、それによって対象におけるがんを治療することを含む方法。
  26. それを必要とする対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、ｐ７３ＯＤを含む有効量のｐ５３キメラを対象に送達し、それによって対象における腫瘍退縮を誘導することを含む方法。
  27. 対象にプロテインキナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、メチルトランスフェラーゼ阻害剤、およびこれらの任意の組合せを投与するステップをさらに含む、請求項２１から２６までのいずれかに記載の方法。
  28. 対象に化学療法剤、血管新生抑制剤、サイトカイン、ホルモン、放射線処置、および外科処置、またはこれらの任意の組合せを施すステップをさらに含む、請求項２１から２７までのいずれかに記載の方法。
  29. さらなるステップが、対象へのｐ５３キメラの送達の前、後、および／または送達と同時に実施される、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 請求項２０に記載の組成物を含むキット。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5607810B1 (ja) * 2013-11-25 2014-10-15 隆彌 渡邊 癌に対する温熱治療増強のための方法及びインテレジェント材料医薬

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9486540B2 (en) 2012-03-09 2016-11-08 Northeastern University Methods for delivery to the central nervous system of nucleic acid nanoparticles to treat central nervous system disorders
US9730679B1 (en) * 2012-12-21 2017-08-15 University Of South Florida Device for sterile uterine sampling and drug delivery
WO2018089688A1 (en) * 2016-11-09 2018-05-17 Jinjun Shi Restoration of tumor suppression using mrna-based delivery system
CN106498072B (zh) * 2016-11-24 2019-09-10 青岛千卓分子生物科技有限公司 一种液态产品中外源dna内标物的保护方法及其应用
CN112912137B (zh) * 2018-11-01 2023-11-21 阿尔法陶医疗有限公司 肿瘤内α粒子-发射体辐射和针对细胞内病原体的细胞质传感器的激活
CN112007174B (zh) * 2020-09-14 2023-02-17 中国科学院上海高等研究院 一种肿瘤靶向探针及其制备方法以及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11508565A (ja) * 1995-07-05 1999-07-27 ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ サッカリドコンジュゲート
JP2000354488A (ja) * 1999-04-09 2000-12-26 Yoji Igawa ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子及びキメラタンパク
JP2002506441A (ja) * 1997-06-20 2002-02-26 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 核酸を高等真核生物細胞に輸送するための複合体
JP2002535290A (ja) * 1999-01-21 2002-10-22 ジョージタウン・ユニバーシティ ターゲッティングした遺伝子移入のためのリガンド−ｐｅｇポストコート安定化したリポプレックスおよびポリプレックス
JP2003519199A (ja) * 1999-12-30 2003-06-17 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 遺伝子治療のための新規なコロイド合成ベクター
WO2009123734A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 The Regents Of The University Of California Functionalized magnetic nanoparticles and methods of use thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6831155B2 (en) * 1999-12-08 2004-12-14 President And Fellows Of Harvard College Inhibition of p53 degradation
US6846809B2 (en) * 2000-09-25 2005-01-25 Board Of Regents, The University Of Texas System PEI: DNA vector formulations for in vitro and in vivo gene delivery
US6586524B2 (en) * 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
US20050053590A1 (en) * 2003-09-05 2005-03-10 The Texas A&M University System Endothelium-targeting nanoparticle for reversing endothelial dysfunction
EP1734991A4 (en) * 2004-04-14 2012-10-24 Avirid Inc COMPOSITIONS COMPRISING MODIFIED NUCLEASES DIRECTED AGAINST VIRAL NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF USE FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF VIRAL DISEASES
KR100825519B1 (ko) * 2007-01-05 2008-04-25 주식회사 바이오폴리메드 키토산 기재 고분자 접합체 및 그 제조방법
US20090042825A1 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 Majed Matar Composition, method of preparation & application of concentrated formulations of condensed nucleic acids with a cationic lipopolymer
CN101524548A (zh) * 2009-04-21 2009-09-09 中山大学 一种纳米载体组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11508565A (ja) * 1995-07-05 1999-07-27 ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ サッカリドコンジュゲート
JP2002506441A (ja) * 1997-06-20 2002-02-26 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 核酸を高等真核生物細胞に輸送するための複合体
JP2002535290A (ja) * 1999-01-21 2002-10-22 ジョージタウン・ユニバーシティ ターゲッティングした遺伝子移入のためのリガンド−ｐｅｇポストコート安定化したリポプレックスおよびポリプレックス
JP2000354488A (ja) * 1999-04-09 2000-12-26 Yoji Igawa ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子及びキメラタンパク
JP2003519199A (ja) * 1999-12-30 2003-06-17 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 遺伝子治療のための新規なコロイド合成ベクター
WO2009123734A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 The Regents Of The University Of California Functionalized magnetic nanoparticles and methods of use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6013006563; Ｇｅ　Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ: Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．１２, 2007, ｐ．６８４-６８９ *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5607810B1 (ja) * 2013-11-25 2014-10-15 隆彌 渡邊 癌に対する温熱治療増強のための方法及びインテレジェント材料医薬
WO2015075979A1 (ja) * 2013-11-25 2015-05-28 隆彌 渡邊 癌に対する温熱治療増強のための方法及びインテレジェント材料医薬

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