JP2002535290A - ターゲッティングした遺伝子移入のためのリガンド−ｐｅｇポストコート安定化したリポプレックスおよびポリプレックス - Google Patents

ターゲッティングした遺伝子移入のためのリガンド−ｐｅｇポストコート安定化したリポプレックスおよびポリプレックス

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、全身的、組織特異的、非ウイルス的遺伝子移入に関する。本発明は、ターゲッティングされた遺伝子治療のための遺伝子移入システムとしての、リガンド指揮、ＰＥＧ安定化した複合体を調製する新規な方法を提供する。ＰＥＧの存在のために、これらの新規な複合体は、通常のリガンド−リポソーム複合体より長い循環時間を有する。さらに、ＰＥＧを有する複合体におけるリガンドの存在のために、これらの複合体は組織ターゲッティングである。さらに、これらの小サイズのために、インビボの使用に非常に望ましい。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (発明の分野) 本発明は、インビボのターゲッティングした遺伝子移入のためのリガンド−Ｐ
ＥＧポストコート安定化したリポソーム−ＤＮＡ複合体(リポプレックス)(Lipop
lex)またはポリマー−ＤＮＡ複合体(ポリプレックス)(Polyplex)の調製方法に関
する。ＤＮＡと複合体化した後、リガンド−ＰＥＧポストコートにより調製した
複合体は、一定サイズの外側のリガンド−ＰＥＧコートを有し、全身的投与によ
るターゲッティングした遺伝子移入の能力を有する。
【０００２】 (発明の背景) 遺伝学の急速な進歩のため、遺伝子治療は癌および他の疾患の処置のための将
来有望な方法となってきている(１−３)。現在の遺伝子治療アプローチは、ウイ
ルスまたは非ウイルスベクター系のいずれかを用いている(４、５)。ウイルスア
プローチの限界は、そのターゲティングの欠如および、免疫原性、細胞変性また
は組換え誘発性(recombinogenic)であり得る残渣ウイルスエレメントに関する(
５)。非ウイルス性遺伝子移入ベクターは、ウイルスベクターの使用に関する問
題のいくつかの回避となる。インビボのヒト治療のための遺伝子の非ウイルス性
の医薬製剤、特にカチオン性リポソーム介在遺伝子移入システムの開発に向かっ
て進歩している(４−８)。 カチオン性リポソームは、正に荷電した脂質二重層からなり、脂質およびＤＮ
Ａの簡単な混合によって負に荷電した裸のＤＮＡと複合することができ、得られ
た複合体は、正味の正の電荷を有する。
【０００３】 リポソーム−ＤＮＡ複合体(リポプレックス)は、容易に結合し、細胞によって
取り込まれ、比較的高トランスフェクション効率を有する(８)。ＤＮＡ移入のた
めの多用途で魅力的なカチオン性リポソームの特徴は：調製が容易なこと；多量
のＤＮＡと複合体化することができること；任意のタイプおよびサイズのＤＮＡ
またはＲＮＡとの使用において多用途であること；非分裂細胞を含む多くの様々
なタイプの細胞をトランスフェクトできること；および免疫原性または生物有害
活性のないことを含む(４、９において総説)。リポソーム−ＤＮＡ複合体による
ｗｔｐ５３の導入は、ヌードマウスにおける乳房(１０)または悪性型神経膠星状
細胞腫(１１)腫瘍を部分的に阻害したことが注目される。ヒト癌治療の眺望から
より重要なことに、カチオン性リポソームは、インビボ遺伝子移入について安全
かつ効率的であるとわかった(８、１２)。２０より多い臨床的試行が、遺伝子移
入のためにカチオン性リポソームを使用して現在進行中であり、小分子治療物質
(例えば、化学療法剤および抗真菌剤)の移入のためのリポソームがすでに市場に
ある(２)。
【０００４】 Ａ．腫瘍ターゲッティンしたリポソーム移入 カチオン性リポソームの不利な点は、腫瘍特異性がなく、ウイルスベクターと比
較して比較的低トランスフェクション効率を有することである。しかし、これは
、リポソームが細胞表面レセプターによって認識されるリガンドを有するとき、
劇的に増大することができる。レセプター介在エンドサイトーシスは、真核細胞
における高効率内在化経路である(１３−１５)。リポソーム上のリガンドの存在
は、ＤＮＡの細胞への進入を、最初にリガンドが細胞表面上のそのレセプターに
結合し、次に結合複合体が内在化することを通して容易化する。
【０００５】 一度内在化すると、十分なＤＮＡがエンドサイトーシス経路から離脱し、細胞
核において発現する。様々なリガンドが、そのリポソームターゲッティング能に
ついて試験され、葉酸、ＤＮＡ合成に必要なビタミンを含む(１３、１６)。葉酸
塩(エステル)レセプターレベルは、乳癌(１７−２２)を含む様々なタイプの癌に
おいて上昇し、最も有意義には、葉酸塩(エステル)が、癌細胞のような急速に分
裂している細胞において、葉酸塩(エステル)の内在化中に再循環していることが
見出されている(２３)。葉酸塩(エステル)結合巨大分子およびリポソームが、レ
セプターを有する腫瘍細胞によってインビトロで特異的に取り込まれることも示
された(２４、２５)。よって、葉酸塩(エステル)レセプターは、癌について前兆
腫瘍マーカーとして、および悪性の細胞成長の治療における薬物移入にとって有
能なターゲットとして有用であると考えられる(１６、２２、２４、２６)。
【０００６】 最近、我々は、ＳＣＣＨＮの全身的ｗｔｐ５３遺伝子治療のための葉酸塩(エ
ステル)−リポソーム−ＤＮＡシステムを開発し、インビトロおよびインビボの
放射に対するＳＣＣＨＮを感作するその能力を試験した(２７)。これらの実験は
、この全身的に移入されたリポソーム複合体の腫瘍選択性および高インビボトラ
ンスフェクション効率、並びに静脈内葉酸塩(エステル)−リポソーム−ｐ５３お
よび放射の組み合わせが、発生したＳＣＣＨＮ異種移植腫瘍の再発を長期間排除
し予防することができることを立証した。この葉酸塩(エステル)−ＤＮＡシステ
ムはヒト乳癌にインビトロまたはインビボでターゲッティングすることができる
ことも興味深い(２７)。
【０００７】 我々の生み出した、前記リガンド−リポソーム−ＤＮＡ複合体またはリガンド
−リポプレックスの限界は、低安定性(使用前に新しく調製せねばならない)であ
り、高インビボクリアランス(低血清半減期)である。よって、限られた量の静脈
内注射のリポプレックスしか実際には腫瘍に到達しない。これらの２点は、葉酸
塩(エステル)リポプレックスの薬学的な継続的な発達によって改善されなければ
ならない。これらの限界に打ち勝つ１つの方法は、リポプレックスを不活性なポ
リマーでコートし、立体的に反発するシールドを築き、血漿タンパク質による非
特異的オプソニン作用から複合体を保護し、それによって網内系システム(ＲＥ
Ｓ)のマクロファージによるリポソーム認識および循環からのクリアランスを防
止することである(２８、２９)。
【０００８】 Ｂ．原子立体的に安定化されたリポソーム ＲＥＳによる取り込みの低速度および程度の結果として、ポリエチレングリコ
ール(ＰＥＧ)等のポリマーによるリガンド化されないリポソームの修飾が、血液
循環時間の長さを延長することの多くの研究が報告された(２８において総説)。
これらのリポソームは「原子立体的に安定化された」リポソームまたは「Stealth(
商標)」リポソームとして特徴つけられ、その高インビボ安定性および血漿タンパ
ク質に対する低反応性に基づく(２８)。Hong K et al.(３０)は、組成中に少量
のＰＥＧ−リン脂質結合を含むことによって安定的なカチオン性リポソーム−Ｄ
ＮＡ複合体を製造した。その調製物は、４℃で数ヶ月間安定的であり、マウスの
肺において静脈内注射後、高トランスフェクション活性を再現できたと報告され
た。最近、Cullisグループ(３１、３２)は、ＰＥＧ−リポプレックスを調製する
中性洗剤透析法が、プラスミドＤＮＡを脂質エンベロープ内にカプセル化するこ
とを可能としたと記載した。ここで得られた粒子は、存在するＰＥＧコートによ
って安定化される。
【０００９】 しかし、このＰＥＧ−リポプレックスのトランスフェクション活性は、ＰＥＧ
コートの解離に依存し、それによって複合体が安定的な粒子からトランスフェク
ション能のあるものに転換する。この段階はインビトロでは起きるが、ＰＥＧコ
ート解離を要することは、インビボで遺伝子を全身的に移入する能力を非常に制
限する。粒子を静脈内注射し、血流中を循環し、血管壁を通して通過し、ターゲ
ット部位に到達したの後の、ＰＥＧコート解離のタイミングを制御することは難
しい。リガンド−ターゲッティングされたリポソーム−ＤＮＡ複合体に関し、Ｐ
ＥＧ安定化に関する文献中のデータは少ない。我々は、Dr. Lowのグループ(２４
、３３)によって報告された方法の修飾を使用し、カチオン性葉酸塩(エステル)
−ＰＥＧ−リポソームを調製し、ＤＮＡを複合化した。これらの方法を使用する
とき、我々は、調製したカチオン性ＰＥＧ−リポソームが、ＰＥＧコート層をそ
の外側表面上に有しており、次のＤＮＡの複合体化およびコンデンスすること(
リポプレックスを形成するときのキーステップ)を妨げるという問題に直面した
。
【００１０】 したがって、高脂質／ＤＮＡ率を要する。結果として、複合体化することが効
率的でも完全でもなく、複合体のサイズは可能なインビボの全身的遺伝子移入に
は大きすぎる(３００−１０００ｎｍ)。Zalipsky et al.(７２)による報告は、
ここで記載のものと異なる化学および異なる方法論を使用し、リガンド−ＰＥＧ
−脂質の結合をリポソームに結合した。これらの方法論は、脂質錨(ＤＳＰＥ)を
使用し、リガンドをリポソーム小胞へＰＥＧ結合部分経由で結合する。
【００１１】 Ｃ．ポリエチレンイミン−遺伝子移入のための多用途のカチオン性ポリマー ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)は、最高のカチオン荷電密度能を有する有機巨大
分子で、インビトロおよびインビボの遺伝子およびオリゴヌクレオチド移入のた
めの多用途のベクターであると、Boussif et al.によって最初に報告された(６
６)。それ以来、このポリカチオンおよびその遺伝子治療における役割を目的と
した調査の波瀾があった(７３)。細胞結合リガンドをポリカチオンに導入し、１
)特異的な細胞タイプをターゲッティングし、２)ターゲット細胞に結合の後、細
胞内取り込みを増強することができる(１３)。Erbacher et al.(６７)は、イン
テグリン結合ペプチド９量体ＲＧＤをジスルフィド架橋経由で結合し、全身的遺
伝子移入についての所望の身体的特性を示した。Ogris et al.(６８)は、トラン
スフェリンをＰＥＩ８００ｋＤａに結合し、ＰＥＧ化(PEGylation)(すなわちＰ
ＥＧの共有結合)の前および後の、ＤＮＡ／トランスフェリン−ＰＥＩ複合体の
インビトロおよびインビボのトランスフェクション活性を比較した。複合体のＰ
ＥＧ化は、血漿タンパク質の結合および赤血球集合を強力に減少させ、サイズは
安定化し、表面荷電は減少した。
【００１２】 ＰＥＧ化は、静脈内注射の後の血液中の複合体の循環を延長した。全身的適用
の後の皮下で成長中の腫瘍へのターゲッティングされた遺伝子移入は、このＰＥ
Ｇ化の原子立体的に安定化されたＤＮＡ／トランスフェリン−ＰＥＩ複合体を使
用して達成された。一方、非ＰＥＧ化複合体は、かなりの毒性と肺における卓越
した遺伝子発現を与えた(６９)。この方法は、ＰＥＧポストコート法と、ＰＥＧ
の添加に先だってリガンドトランスフェリンがすでにＰＥＩに結合しているとい
う点で異なる。この結果は肯定的であったが、この方法のおもな欠点は、リガン
ドトランスフェリンがＰＥＧシールド内にあり、それによってターゲット細胞上
のその対応するレセプターへのアクセス可能性を制限することである。もう１つ
の欠点は、ＤＮＡ／トランスフェリン−ＰＥＩが、ＰＥＧプロピオン酸(Ｍ−Ｐ
ＥＧ−ＳＰＡ)のスクシニミジル誘導体でＰＥＧ化されている点である。それは
ＰＥＩおよびトランスフェリン分子の両方の上に存在する最初のアミノ基とラン
ダムに反応する(６９)。よって、リガンドトランスフェリンそれ自体が、そのレ
セプターへの結合を妨げまたはブロックするＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡによって反応し
得、またはそのリガンドを完全に不活性化する。 前記の問題を、本発明に記載した「リガンド−ＰＥＧポストコート」法によって
避けることができ、一方、ＰＥＧ化のすべての利点を有する。
【００１３】 発明の要約 本発明は、リガンド−ＰＥＧ−リポソーム−ＤＮＡまたはリガンド−ＰＥＧ−
ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体を調製するための新規方法を記載する。これはリガンド−
ＰＥＧポストコート法に関する。この方法によれば、リポソーム(またはＰＥＩ)
内部にＤＮＡをコンデンスした後に、リガンド−ＰＥＧを結合する。ＰＥＧ層は
ＤＮＡ−リポソーム複合体(リポプレックス)またはＤＢＡ−ＰＥＩ複合体(ポリ
プレックス)の外側のみをコートするので、複合体の内部構造に干渉しない。よ
って、該複合体は、コンデンスされたＤＮＡ−カチオン性脂質またはＰＥＩ構造
を内部に、ＰＥＧコートを外部に有し、コートＰＥＧの遠位の末端にリガンドを
有する。我々は、この方法を「リガンド−ＰＥＧポストコート」法と命名し、先の
方法(２４、２９、３３、６８、７２)と区別する。
【００１４】 リガンド−ＰＥＧポストコート法は、「原子立体的に安定化された」リポソーム
または「Stealth(商標)」リポソームのような報告されたＰＥＧ-リポソームの保護
的および長い循環特性の利点を有し、一方、リガンド−カチオン性リポソーム−
ＤＮＡ複合体の独特の性質を保持する。リガンド−ＰＥＧポストコートしたリポ
プレックスは、低細胞毒および全身的投与の後のＳＣＣＮＨ腫瘍ターゲッティン
グした遺伝子移入能力を有する。この方法は、全身的遺伝子治療のためのターゲ
ッティングした遺伝子移入システムを設計および開発するために非常に有用で有
望な方法である。
【００１５】 図面の簡単な説明 図１は、「ポストコート法」による葉酸塩(エステル)−リポソーム−ＤＮＡ複合
体の調製のための概要を示す。葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨの前の、実線は
ＳＰＤＰ法を示し、点線は２−イミノチオラン法を示すことに注意されたい。 図２は、ＪＳＱ−３細胞の葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−リポソーム介在トラン
スフェクションおよび血清のそれらのトランスフェクションに及ぼす影響を示す
。プラスミドｐＳＶｂＤＮＡ(２７)と複合化されたＬｉｐＡ−ＰＥＧ−Ｆを、「
ポストコート法」によって調製した。ＬｉｐＡは等量モルのＤＯＴＡＰおよびＤ
ＯＰＥプラス５％モルのＤＯＰＥ−ＭＢからなる。ｐＳＶｂと複合化されたＬｉ
ｐＡ−ＰＥＧを同様に葉酸塩(エステル)を欠くポストコートＰＥＧによって調製
した。９６ウェルプレートにおけるＪＳＱ−３細胞を(１×１０４細胞／ウェル)
、１０％胎児ウシ血清と共にまたはそれなしに１μｇＤＮＡ／ウェルのＬｉｐＡ
−ＰＥＧ−Ｆ(ｐＳＶｂ)またはＬｉｐＡ−ＰＥＧ(ｐＳＶｂ)によってトランスフ
ェクトした。２日後、細胞を溶解させ、βガラクトシダーゼ発現をカラリメトリ
ックアッセイによって測定した。２反復の平均をプロットした。 図３は、ＪＳＱ−３細胞の葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−リポソーム介在遺伝子
トランスフェクションの特異性を示す。ＬｉｐＡ−ＰＥＧ１−ＦおよびＬｉｐＡ
−ＰＥＧ２−Ｆを、それぞれ「ポストコート法」、ＳＰＤＰ法および２−イミノチ
オラン法によって調製した。９６ウェルプレートにおけるＪＳＱ−３細胞を(１
×１０４細胞／ウェル)、０．３２μｇＤＮＡ／ウェルから始まる一連希釈のＬ
ｉｐＡ−ＰＥＧ１−Ｆ(ｐＳＶｂ)またはＬｉｐＡ−ＰＥＧ２−Ｆ(ｐＳＶｂ)でラ
ンスフェクトした。リガンド競合のために、遊離葉酸(ＦＡ)を最終濃度１ｍＭま
でトランスフェクションの直前に添加した。２日後に、細胞を溶解し、カラリメ
トリックアッセイによってβガラクトシダーゼの発現を測定した。２反復の平均
をプロットした。 図４Ａ−Ｉは、インビボにおける「ポストコート」した葉酸塩(エステル)−ＰＥ
Ｇ−リポソーム介在全身的遺伝子トランスフェクションの結果を示す。ＬｉｐＡ
−ＰＥＧ１−ＦをＳＰＤＰ法によって調製し、ＬｉｐＡ−ＰＥＧ２−Ｆを２−イ
ミノチオラン法によって調製した。 図５Ａ−Ｄは、２００ｎｍないし７００ｎｍのBeckman ＤＵ６４０スペクトロ
フォトメーターを使用した、ＤＴＴ添加の前および後の精製Ｆ−ＰＥＧ−ＰＤＰ
およびＧａｌ−ＰＥＧ−ＰＤＰのスペクトロフォトグラムを示す。
【００１６】 発明の詳細な記載 リガンド−ＰＥＧポストコート法は、「原子立体的に安定な」リポソームまたは
「Stealth(商標)」リポソームのような報告されたＰＥＧ−リポソームの保護的お
よび長い循環特性の利点を有する。一方、リガンド−カチオン性リポシーム−Ｄ
ＮＡ複合体の独特な性質を有する。リガンド−ＰＥＧポストコートしたリポプレ
ックスは、低細胞毒性および全身的投与の後のＳＣＣＮＨ腫瘍ターゲッティング
した遺伝子移入の能力を有する。この方法は全身的遺伝子治療のためのターゲッ
ティングした遺伝子移入システムの設計および開発に非常に有用で有望な方法で
ある。
【００１７】 ここで記載の方法論は、脂質錨を使用せず、ＰＥＧを「連結部分」として使用し
ないことを注意することが重要である。さらに、Zalipsky et al.(７２)によっ
て使用されたリポソームは空の小胞であり、ＤＮＡを包んでいないことを注意す
べきである。Zalipsky et al.(７２)によって記載の結合は、示した小サイズお
よび示した効率を有する我々の方法によって生産されたＤＮＡ−リポソーム複合
体を移入するように作用しないことが非常に意義深い。ＤＳＰＥ−脂質錨をこの
リポソーム−ＤＮＡ複合体へ結合することは、実際にはその構造および遺伝子治
療のための移入システムとしての能力を破壊する。
【００１８】 葉酸塩(エステル)を、リポプレックス形成のためのリガンドの例として使用し
、図１に葉酸塩(エステル)−ＰＥＧリポソーム−ＤＮＡ複合体の調製のための概
略図を記載する。最初にＤＮＡを、１−１０％、好ましくは５％モルのＤＯＰＥ
−マレイミドフェニルブチレート(ＤＯＰＥ−ＭＰＢ)または任意の他のスルフヒ
ドリル反応性分子−脂質結合を含むカチオン性リポソームで、その形成中に複合
体化しコンデンスする。スルフヒドリル基は、次の結合に必要である。ジチオピ
リジン(ＰＤＰ)基を、最初にＰＥＧ−ビス−アミンの１端に導入し、次に葉酸塩
(エステル)を他の末端に導入する。次に、葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＰＤＰを
ジチオスレイトール(ＤＴＴ)または任意の他の還元剤によって還元し、遊離スル
フヒドリル基、葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨを生じる。次にこの複合体を、
ＤＮＡ−リポソーム上のＭＰＢのマレイミド基または任意の他のスルフヒドリル
反応性分子と反応させ、葉酸塩(エステル)−ＰＥＧをＤＮＡ−リポソームに結合
させる(図１、実線フローチャート)。
【００１９】 この方法は、ＳＰＤＰ法と呼ばれるが、他のアミン反応性クロスリンカーも使
用できる。該方法の別の方法を図１に点線でに示し、ここで、葉酸塩(エステル)
を最初にＰＥＧ−ビス−アミンの１の末端にそれを葉酸塩(エステル)−ＮＨＳと
反応させることによって結合する。次に、遊離スルフヒドリル(−ＳＨ)基を、直
接的に他の端へそれを２−イミノチオランと反応させることによって導入する。
次に得られた葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨをＤＮＡ−リポソーム上にポスト
コートする。この方法を２−イミノチオラン法と呼ぶが、他のチオール導入試薬
も使用できる。２−イミノチオラン法の長所は、全段階を水性相で実施できるこ
とである。特に有機相、例えばペプチドまたはタンパク質リガンド、例えばＲＧ
Ｄ、Ｆａｓ−リガンド、ＥＧＦ、ＦＧＦ、抗体またはそのフラグメント等におい
て非安定的なリガンドにとって好適である。
【００２０】 カチオン性ポリマー、例えば、ポリリジン、プロタミンまたはポリエチレンイ
ミン等を使用してカチオン性リポソームを置き換えることができる。ＰＥＩをリ
ポソームのものと類似の例として使用する。ＭＢのマレイミド基または他のスル
フヒドリル反応性分子を、ＰＥＩ分子中のアミンの０．１−２５％修飾の範囲で
ＰＥＩに導入する。ＤＮＡを最初にＰＥＩ−ＭＢと１−５０、好ましくは５−１
５のＮ／Ｐ率(ＰＥＩのアミン窒素ｖｓＤＮＡのフォスフェート、モル率)で、記
載のように(６６、６７)複合体化しコンデンスする。ＨＥＰＥＳバッファーを１
０−２０ｍＭの最終濃度まで添加してｐＨを７．４−８．０に調節した後、新し
く還元したリガンド−ＰＥＧ−ＳＨをポリプレックスに添加し、室温で２−６時
間または４℃で終夜反応させる。ポストコートしたポリプレックスを直接的にま
たはSepharose ＣＬ−４Ｂクロマトグラフィーによって精製し非結合リガンド−
ＰＥＧを除去して使用できる。
【００２１】 前記記載のように、そして詳細は後記の実施例８のように調製したガラクトー
ス−ＰＥＧ−ＳＨポストコートしたＰＥＩ−ＤＮＡ複合体は、増強した安定性、
血清への高度な抵抗性、およびインビトロおよびインビボの両方での低毒性を示
した。ガラクトース−ＰＥＧポストコートしたポリプレックスの静脈内注射によ
って、マウス肝臓内での有意に増強されたレポーター遺伝子の発現、およびマウ
ス肺での非常に減少した発現という結果となり、一方、非ＰＥＧ化のポリプレッ
クスは、マウス肺における卓越した遺伝子発現を得たがかなりの毒性があった。
【００２２】 他の結合方法もＰＥＧの１の末端でリガンドを結合し、活性基、例えばチオー
ル基(−ＳＨ)等を他の末端で次の「ポストコート」のために結合するために使用で
きる。または最初に活性基(保護を有する)を、次に他の末端でリガンドを結合す
ることができる。脱保護の後(ＳＰＤＰ法における還元段階のように)、遊離活性
基を「ポストコート」のために用意できる。別の方法は、リガンド−ＰＥＧ−スク
シニミジル(活性)エステルを作成し、次にこれをリポプレックスにおける最初の
アミノ基(ＤＯＰＥ由来)またはポリプレックス(ＰＥＩ由来)とポストコートのた
めに反応させる。この場合、反応性基(例えば、ＭＢのマレイミド基)を導入する
ための脂質またはＰＥＩの予備修飾は必要ない。本発明に関する化学的または生
化学的手法は、当業者にとってなじみのある一般的な方法である。
【００２３】 リガンド−ＰＥＧは、ＤＮＡがリポソーム内部でコンデンスした後に結合する
ので、ＰＥＧ層はＤＮＡ−リポソーム複合体の外側をコートし、ＤＮＡ−リポソ
ーム複合体の内部構造に干渉しない。よって該複合体は、内部にコンデンスした
ＤＮＡ−カチオン性脂質構造または中心のないタマネギ様のコア構造(後記の実
施例６、詳細電子顕微鏡分析参照) 、およびＰＥＧの遠位の末端に葉酸塩(エス
テル)を有する外部のＰＥＧコートを有する。
【００２４】 リガンド−ＰＥＧ「ポストコート」法は、報告されたＰＥＧ−リポソーム、例え
ば、「原子立体的に安定化された」リポソームまたは「Stealth(商標)」リポソーム
等の保護的で長い循環特性という利点を有し、一方、リガンド−カチオン性リポ
ソーム−ＤＮＡ複合体の特有の性質を保持する。リガンド−ＰＥＧ−ポストコー
トされたリポソームは、全身的投与の後、腫瘍ターゲッティングした遺伝子移入
の能力を有し、インビボの全身的遺伝子治療に適当である。
【００２５】 本発明は、ある特定のターゲッティングリガンドの使用に限定されない。葉酸
塩(エステル)を、ターゲッティングリガンドの例として使用する。他のリガンド
を本発明で小変更をして容易に使用することができる。リガンドは、ターゲット
細胞でそのレセプターが特異的に発現される任意のリガンドであってよい。例は
他のビタミン、ＥＧＦ、インシュリン、ＦＧＦ、Heregulin、RGDペプチドまたは
インテグリンレセプター、抗体またはそのフラグメントに反応性の他のポリペプ
チドを含む。好ましい実施態様において、リガンドは葉酸塩(エステル)である。
有機相で不安定なリガンド、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質リガンド、
例えばＥＧＦ、ＦＧＦ、抗体、または他のフラグメント等について、リガンド−
ＰＥＧ−ＳＨを作るための反応は、当業者にとってなじみのある小変更と共に水
性相で実施することができる。
【００２６】 本発明は、「ポストコート」について、ある特定のコートポリマーの使用に限定
されない。コートポリマーは、ポリマー鎖内部に不活性な化学的活性を有し、２
個の末端に結合について活性のある基を有する任意のポリマーであることができ
る。Zalipsky et al.、米国特許番号5,395,619(74)は、ＰＥＧの他の、長く循環
するリポソームを形成することのできる一連のポリマーを記載している。好まし
い実施態様において、該ポリマーは、最初のアミン基を２つの末端に活性基とし
て有するＰＥＧである。
【００２７】 本発明は、ある特定のタイプのＤＮＡの移入に限定されない。カチオン性リポ
ソームまたはポリマーによって複合体化できる任意のポリヌクレオチドが、本発
明に使用できる。ポリヌクレオチドの例は：プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡフラグメ
ント、オリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、キメラＲＮＡ／ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、リボザイム等を含むがこれらに限定されない。
アニオン性ペプチド、ポリマー、合成または天然分子も、カチオン性リポソーム
またはポリマーによって複合体化できる限り、本発明に使用できる。リガンド−
ＰＥＧポストコートされたカチオン性リポソームを通じて移入できる分子の他の
例は、遺伝子、高分子量ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレ
オチド、ペプチド核酸、化学的物質(化学療法剤分子またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ウ
イルス粒子、成長因子、サイトカイン、免疫調節物質、および抗原の存在で発現
されたときに免疫系を刺激または抑制するタンパク質を含む他のタンパク質を含
むがこれらに限定されない任意の大分子等)を含む。
【００２８】 後記実施例は、本発明の好ましい実施態様を含み、示す。後記の実施例に記載
の技術は、発明者によって本発明の実際においてよく機能すると発見された技術
を示し、よって実際の好ましいモードを構成すると考えることができるというこ
とが、当業者によって理解されるべきである。しかし、本発明の記載に照らして
、当業者は、記載され、類似または同様の結果をなお取得する特定の実施態様に
おいて多くの変更を本記載の精神および範囲から離れることなく実施することが
できることを理解すべきである。
【００２９】 実施例１ ＳＰＤＰ法によるポストコートのためのリガンド−ＰＥＧ−ＳＨの調製 本実施例は、ポストコートのためのリガンド−ＰＥＧ−ＳＨの調製のためのＳ
ＰＤＰ反応手法を記載する。これは図１に実線フローチャートとして示す。 Ａ．ＰＤＰ−ＰＥＧ−ＮＨ２の調製 ２ｍｌの乾燥クロロホルム中の３０μモルのポリオキシエチレンビス(アミン)
(ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２)(M.W.3350,Sigma)を、室温で撹拌し、１ｍｌの乾燥ク
ロロホルム中の３０μモルのＮ−スクシンイミド−３−(２−ピリジルジルジチ
オ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)(Sigma)を１０−１５分の時間にわたって滴状に添
加した。１０μｌのＴＥＡを溶液に添加しさらに１５−３０分撹拌した。この溶
液を精製し、記載のように(４８)、ＰＤＰ−ＰＥＧ−ＰＤＰまたは未反応ＮＨ２
−ＰＥＧ−ＮＨ２を除去した。産物を、Haselgrubler et al.(４８)によって記
載のように、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)によって確認した(クロロホルム
／メタノール／酢酸１００／３０／２)。
【００３０】 Ｂ．葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＰＤＰの調製 葉酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(葉酸塩(エステル)−ＮＨＳ)を
、０．９４ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ,Fluka)の存在下、３０
ｍｌの乾燥ジメチルスルホキシドおよび０．５ｍｌのトリエチルアミン(ＴＥＡ,
Sigma)中の１グラムの葉酸(F, Sigma)を０．５２ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド(NHS,Sigma)と室温で終夜反応させることによって調製した(７５)。該溶液
をLee RJおよびLow PS(７５)によって記載のようにろ過精製した。ＰＤＰ−ＰＥ
Ｇ−ＮＨ２を、乾燥クロロホルムと２モルのＴＥＡ中で２−５モルの過剰の葉酸
塩(エステル)−ＮＨＳと終夜室温で反応させた。ある容量のクロロホルム該溶液
に添加し、次に、ＰＢＳで４−６回洗浄し、各洗浄の間に１５分間１０００−２
０００ｒｐｍで遠心分離した。透明黄色クロロホルム溶液を蒸発乾燥させ、黄色
粉末産物、葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＰＤＰを得た。該産物をＴＬＣで確認し
た(クロロホルム／メタノール／酢酸１００／３０／２)。
【００３１】 Ｃ．葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨを得るためのＰＤＰの調製 葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＰＤＰを１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ
７．４に溶解した。新しく調製した水中の５００ｍＭのジチオスレイトール(Ｄ
ＴＴ,Sigma)を添加し、５０ｍＭの最終濃度にした。該溶液を室温で３０分間撹
拌し、次にカラムクロマトグラフィー(10DG,BioRad)によってまたはCentricon 3
限外ろ過によって脱塩し、還元葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨを得た。遊離―
ＳＨ基は安定ではないので容易に酸化する。よって、「ポストコート」の前に速や
かに還元をすべきであり、葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨを脱塩の後１−２時
間以内に使用すべきである。ＥＤＴＡを１ｍＭの最終濃度まで添加し、葉酸塩(
エステル)−ＰＥＧ−ＳＨの安定化を助け得る。後の使用のために、不活性ガス
の存在下、精製した葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨを−２０℃で凍結すること
ができる。遊離−ＳＨ基をＤＮＴＢ(５．５ジチオビス−(２−ニトロ安息香酸))
滴定(７６)によって確認した。葉酸塩(エステル)を、３６３ｎｍの吸光で測定し
た。精製した産物中の葉酸塩(エステル)／−ＳＨのモル率はおよそ０．９−１．
１であった。
【００３２】 実施例２ 直接的なチオレーション(thiolation)(２−イミノチオラン法)によるポストコー
トのためのリガンド−ＰＥＧ−ＳＨの調製 本実施例は、直接的なチオレーションによるポストコートのためのリガンド−
ＰＥＧ−ＳＨを調製する反応手法を記載する。これは図１に点線のフローチャー
トで示す。 葉酸塩(エステル)をまずＰＥＧ−ビス(アミン)の１つの末端に結合する。２ｍ
ｌの乾燥クロロホルム中の３０μモルのポリオキシエチレンビス(アミン)(ＮＨ
２−ＰＥＧ−ＮＨ２)を１ｍｌの乾燥クロロホルム中の葉酸(葉酸塩(エステル)−
ＮＨＳ)の３０μモルのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと混合した。１
０μｌのＴＥＡを反応溶液に添加し、０．５−２時間室温で混合物を撹拌した。
ある容量のクロロホルムを溶液に添加し、次にＰＢＳで４−６回洗浄し、各洗浄
の間に１５分間１０００−２０００ｒｐｍで遠心分離した。透明の黄色クロロホ
ルム溶液を蒸発乾燥した。記載のように(４８)、産物を精製し、葉酸塩(エステ
ル)−ＰＥＧ−葉酸塩(エステル)または未反応ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２を除去し
た。産物を薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)(クロロホルム／メタノール／酢酸
１００／３０／２)によってヨウ素染色で確認した。
【００３３】 遊離−ＳＨを、葉酸塩(エステル)−ＰＥＧの他の末端に、２−イミノチオラン
と反応することによって直接的に導入する。反応は、水性溶液中で行う。葉酸塩
(エステル)−ＰＥＧ−ＮＨ２を１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０中に溶解し
た。ＰＢＳ中の２−５モルの過剰の２−イミノチオランＨＣｌ(Sigma)を添加し
、０．５−２時間室温で撹拌した。得られた葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨを
カラムクロマトグラフィー(10DG, BioRad)によってまたはCentricon 3限外ろ過
によって脱塩し、還元された葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨを得た。遊離―Ｓ
Ｈ基をＤＴＮＢ滴定によって確認し、葉酸塩(エステル)を３６３ｎｍの吸光によ
って測定した。精製産物中の葉酸塩(エステル)／−ＳＨのモル率は、およそ０．
９−１．１の範囲であった。
【００３４】 実施例３ カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体(リポプレックス)の「ポストコート」 本実施例は、ＤＮＡ−リポソームへのリガンド−ＰＥＧ−ＳＨポストコートの
手法を記載する。 Ａ．カチオン性リポソームの調製 ＤＯＰＥ−ＭＰＢを、ＴＥＡの存在下、乾燥クロロホルム中のＤＯＰＥをスク
シンイミジル−４−(ｐ−マレイミドフェニル)ブチレート(ＳＭＰＢ,Sigma)と反
応させることによって調製した(６５)。ＭＰＢのマレイミド基は、スルフヒドリ
ル基と反応性であり、リポソーム表面上の結合分子として働く。他のチオール反
応性基、例えば他のマレイミド含有分子等もここで使用できる。ＤＯＰＥ−ＭＰ
ＢもAvanti Polar Lipids, Inc., Alabaster,ALから入手可能である。
【００３５】 カチオン性リポソームＬｉｐＡを以下のように調製した：５μモルのジオレオ
イルトリメチルアンモニウム−プロパン(ＤＯＴＡＰ)、５μモルのＤＯＰＥ(Ava
nti Polar Lipids, Inc., Alabasetr, AL)および０．１−１μモルのＤＯＰＥ−
ＭＰＢのクロロホルム溶液を共に丸底フラスコ中で混合し、クロロホルムを減圧
化で蒸発させた。１０ｍｌの純水をフラスコに添加し、脂質を懸濁し、次にバス
タイプ超音波処理機で４℃で１０分間超音波処理した。リポソームの最終濃度は
、１−２ｎモル／μｌ全脂質であった。他のカチオン性リポソームも同様の方法
で調製し、組成を後記に示す。
【００３６】 表１：ポストコートのためのカチオン性リポソームの組成
【表１】 ＬｉｐＤおよびＬｉｐＥは、４℃ではなく６５℃で超音波処理した。
【００３７】 他のリポソーム調製方法も使用してカチオン性リポソームを調製することができ
る。例えば、Campbell(８０)によって記載のものから修飾されたエタノールイン
ジェクション法を本発明に好結果に使用することができた。簡単には、すべての
脂質を、エタノール中に溶解し、混合し、５０−６０℃の強く撹拌中の純水にHa
miltonシリンジでインジェクトした。溶液をさらに１０−１５分間強く撹拌した
。最終濃度は、１−２μＭ全脂質であった。エタノールインジェクション法はよ
り早く容易で丈夫である。
【００３８】 我々は、マレイミド基がｐＨ＞７の水性溶液中で安定でないことがわかったの
で、リポソームは水(ｐＨ５−６．５)中で調製するべきである。ｐＨは「ポスト
コート」の前に１ＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５−８．０で調節し、ポ
ストコート反応を容易化することができる。
【００３９】 Ｂ．ＤＮＡ−リポソーム複合体の「ポストコート」 プラスミドＤＮＡを水または１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．０中
で記載のように(３４)、ＭＰＢ−リポソームと、ＤＮＡ／脂質率１／６−１／２
６(μｇ／ｎモル)、好ましくは１／１０−１／２０で複合体化した。「ポストコ
ート」の前に、１ＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５−８．０をＭＰＢ−リ
ポソーム−ＤＮＡ複合体に、最終濃度１０−２０ｍＭまで添加した。葉酸塩(エ
ステル)−ＰＥＧ−ＳＨをＭＰＢ−ＤＯＰＥに０．５−５モル過剰に、好ましく
は１−２モル過剰に添加し、室温暗黒で数時間から終夜撹拌した。得られた葉酸
塩(エステル)−ＰＥＧ−ＬｉｐＡ−ＤＮＡを、５％デキストロースと共に、レポ
ーター遺伝子としてｐＳＶｂでのインビボ遺伝子トランスフェクションに直接的
に使用する。インビボ実験のために、我々は、トランスフェクションのための葉
酸塩(エステル)−ＰＥＧ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ溶液をさらなる精製無しに、または結
合していない葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨを排除するSepharose CL-4Bクロ
マトグラフィーによる精製の後に試験した。Sepharose CL-4Bクロマトグラフィ
ーによって、５０％より多くのリガンド−ＰＥＧ−ＳＨがリポプレックスに結合
したことを確認した。
【００４０】 実勢例４「 ポストコート」した葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−Ｌｉｐ−ｐＳＶｂによるインビ
トロの遺伝子トランスフェクション 本実施例は、レポーター遺伝子を使用する「ポストコート」した葉酸塩(エステ
ル)−ＰＥＧ−リポソームのインビトロ遺伝子トランスフェクション効率を記載
する。 ここで使用した培地は、葉酸塩(エステル)フリー培地(RPMI-1640 Forate-free
, Gibco)であった。１×１０４個の細胞を９６ウェルのプレートの各ウェルにま
たは５×１０４個の細胞／ウェルを２４ウェルのプレートに移植した。２４時間
後、細胞を血清または抗生物質なしの培地で１回洗浄し、様々な量の葉酸塩(エ
ステル)−ＰＥＧ−Ｌｉｐ−ｐＳＶｂまたはＰＥＧ−Ｌｉｐ−ｐＳＶｂおよびｐ
ＳＶｂ単独を含む１００μｌのトランスフェクション溶液を各ウェルに添加した
。３７℃でのトランスフェクションの５時間後、２０％の胎児ウシ血清を含む等
量の培地を各ウェルに添加した。４８時間後、細胞を一度ＰＢＳで洗浄し、１×
レポーター溶解バッファー(Promega)中で溶解した。細胞溶解物を、１ｍＭのＭ
ｇＣｌ２および４５０ｍＭのβメルカプトエタノールを含む２０ｍＭのトリス(
ｐＨ７．５)中の１００μｌの１５０μＭのＯ−ニトロフェニル−β−ガラクト
ピラノシドで３７℃で０．５時間処理した。該反応を１５０μｌ／ウェルの１Ｍ
のＮａ２ＣＯ３の添加によって停止させた。４０５ｎｍの吸光を測定した。精製
したβガラクトシダーゼ(Boehringer)を標準として使用した。結果を、総タンパ
ク質のｍｇあたりのベータガラクトシダーゼ等価のミリユニットとして表した。
リガンド−リポソーム−ｐＣＭＶｂトランスフェクションの組織化学的研究のた
めに、２４ウェルのプレート中の融合性の細胞の６０％を前記記載のように５時
間トランスフェクトした。培養のさらなる２日間の後、細胞を固定しＸ−ｇａｌ
で染色した。トランスフェクション効率を青染色された細胞のパーセンテージと
して算出した。
【００４１】 図２は、ＪＳＱ−３細胞のインビトロの葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−リポソー
ム介在トランスフェクションおよび血清のトランスフェクション効率に及ぼす影
響を示す。ＰＥＧ「ポストコート」したリポソームは血清に対する抵抗性を示し、
葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＬｉｐＡは、葉酸塩(エステル)リガンドを欠くＬｉ
ｐＡ−ＰＥＧより２倍高いレポーター遺伝子の発現という結果であった。 図３は、葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−リポソームトランスフェクションの特異
性を示す。遊離ヨウ酸は、葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−リポソームのトランスフ
ェクション活性をＬｉｐＡ−ＰＥＧのレベルまでブロックすることができ、葉酸
塩(エステル)−ＰＥＧ−リポソームのトランスフェクションが、葉酸塩(エステ
ル)レセプターを通した葉酸塩(エステル)によって介在されていることを示して
いる。
【００４２】 実施例５「 ポストコート」した葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−Ｌｉｐ−ｐＳＶｂの静脈内注射
によるヌードマウス腫瘍モデルにおけるインビボの遺伝子トラスフェクション 本実施例は、「ポストコート」した葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−Ｌｉｐ−ｐＳＶ
ｂが全身的投与の後、インビボで腫瘍組織を選択的にターゲッティングする能力
を示す。 ヒトＨａ−Ｒａｓ遺伝子で形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、４−６週齢のメ
スのヌード(NCr nu-nu)マウスのわき腹の皮下に注射した。腫瘍を１００ｍｍ３
のサイズにまで発達させた。「ポストコート」した葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−Ｌ
ｉｐ−ｐＳＶｂを、実施例１−３に記載のように調製し、ここで、ＬｉｐＡ−Ｐ
ＥＧ−１−Ｆは、ＳＰＤＰ法(実施例１および３)によって調製した「ポストコー
ト」した葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−Ｌｉｐ−ｐＳＶｂを示し、ＬｉｐＡ−ＰＥ
Ｇ２−Ｆは、直接的チオレーション法(実施例２および３)によって調製したもの
を示す。ＬｉｐＡ−ＰＥＧ１−Ｆ、ＬｉｐＡ−ＰＥＧ２−ＦまたはｐＳＶｂプラ
スミド単独(５％のデキストロース中)を尾部静脈経由で静脈内に５０μｇのプラ
スミドＤＮＡ／３００μｌ／動物で注射した。
【００４３】 ＤＮＡの注射の３日および１０日後、腫瘍およびマウス器官を切除し１ｍｍの
切片にカットし、ＰＢＳで１回洗浄し、２％ホルムアルデヒド−０．２％グルタ
ールアルデヒドで４時間室温で固定した。固定した腫瘍切片を、４回各１時間洗
浄し、Ｘ−ｇａｌ溶液プラス０．１％のＮＰ−４０(ｐＨ８．５)で３７℃で終夜
、染色した。染色した腫瘍切片を包埋し、通常の組織学的手法を使用して切片化
し、ヌクレアーファーストレッド(nuclear fast red)で後染色した。腫瘍当たり
４個の切片を試験し、青染色細胞で示されたように、βガラクトシダーゼ遺伝子
の発現を評価した。
【００４４】 図４Ａ−Ｉは、インビボの「ポストコート」した葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−リ
ポソーム介在全身的遺伝子トランスフェクションを示す。図４Ａおよび４Ｂに示
すように、ｐＳＶｂと複合体化したＬｉｐＡ−ＰＥＧ−Ｆの静脈内注射の３日後
に、ヌードマウスの異種移植片中の３０−６０％の腫瘍細胞が青く染色し、腫瘍
の移入およびレポーター遺伝子βガラクトシダーゼの発現を示した。肺および肝
臓を含む、通常のマウス組織は、いくつかのマクロファージを除いて青く染色せ
ず(図４Ｇおよび４Ｈ)、ＰＥＧ「ポストコート」したリポソームが、複合体化した
遺伝子をインビボで腫瘍に選択的に移入できることを示した。ＰＥＧコートを欠
く葉酸塩(エステル)−リポソームは、３０−４０％の腫瘍細胞の青染色を示した
が(図４Ｃ)、遺伝子発現は６−１０日以内に消失した(図４Ｆ)。しかし、ＰＥＧ
「ポストコート」したリポソーム注射した群は、１０日後腫瘍中になおいくつか(
１０−４０％)の青染色を示し、リガンド−ＰＥＧ「ポストコート」したリポソー
ムが全身的注射の後長く持続し、腫瘍中に持続した遺伝子発現を与えることがで
きることを示した。プラスミドｐＳＶｂのみを注射した群は、青染色の腫瘍細胞
を示さなかった(図４Ｉ)。
【００４５】 リガンド−ＰＥＧ「ポストコート」したリポソームは、全身的投与の後、複合体
化した遺伝子をインビボで腫瘍に選択的に移入させ、腫瘍中で持続した遺伝子発
現を与えることができ、３０−６０％のインビボのトランスフェクション効率を
有する。よって、このシステムはインビボ遺伝子移入および遺伝子治療に大変有
用で有望である。
【００４６】 実施例６ リガンド−ＰＥＧ「ポストコート」したカチオン性リポソームの電子顕微鏡分析 リポソームは、電子顕微鏡(ＥＭ) 、ネガティブ染色の透過型電子顕微鏡(ＴＥ
Ｍ)または走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)によって観察することができる。ＥＭはリ
ポソームの構造およびサイズ分布を明らかにすることができる。ＥＭはリポソー
ム調製のクオリティーコントロールに使用することができる。我々は、ネガティ
ヌ染色の透過型電子顕微鏡でリガンド−カチオン性リポソームを観察した。
【００４７】 FormvarおよびCarbonコーティングを有する銅グリッド(Electron Microscopy
Science, Fort Washington, PA)を研究に使用した。リガンド−ＰＥＧ「ポストコ
ート」したカチオン性リポソーム−ｐＳＶｂ複合体を実施例１−３に記載のよう
に調製した。リポソーム複合体の１滴をグリッドに添加した。５分後、ろ紙をグ
リッドの端に接触することによって過剰の液体を除去した。次に、４％のウラニ
ウムアセテートの１滴を、ネガティブ染色のためにグリッドに添加した。５分後
、ろ紙をグリッドの端に接触することによって過剰の液体を除去した。グリッド
をＴＥＭのサンプルチャンバー内に置く前に、室温で１５分間空気乾燥させた。
製造者の指示にしたがってＴＥＭ・JEOL-1200EXを研究に使用した。写真を１０
−５０ｋ、６０ｋＶｏｌｔのマグニチュードでとった。グリッド上でリポソーム
サンプルを調製し、新しく染色し、１時間以内に観察した。
【００４８】 多くの公開は、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体が多様な構造および１０
０ｎｍないし１０００ｎｍの範囲のサイズを有することを示している。我々の研
究において、我々は、本発明記載のリガンド−リポソーム−ＤＮＡ複合体が、非
常に小さいサイズで、非常により均一なサイズ分布を有することを意外にも観察
した。カチオン性リポソームＬｉｐＡそれ自体は２５−５０ｎｍ、平均３５ｎｍ
(直径)のサイズを有する。ＤＮＡをＬｉｐＡと複合体化したとき、興味深い「イ
レギュラーまたは風変わりなタマネギ様コア構造」が、ＬｉｐＡ−ＤＮＡ複合体
の核に観察され、３５−６５ｎｍの(平均５０ｎｍ)均一なサイズ分布を有してい
た。リガンド−ＰＥＧ「ポストコート」段階の後、リポソームのサイズは、わずか
にしか増加せず、３５−８０ｎｍ(６０ｎｍの平均)となり、葉酸塩(エステル)−
ＰＥＧの１０−１５ｎｍの厚さの層が、ＬｉｐＡ−ＤＮＡ複合体上の「ポストコ
ート」であった。
【００４９】 インビボでターゲットの腫瘍に到達するために、リポソームは、まず血清に抵
抗性で、次に、血管(毛細血管)壁を通過せねばならない。本発明記載のリガンド
−ＰＥＧ「ポストコート」したリポソームは、これらの２つの要求に合致すること
ができる。リガンド−ＰＥＧ−Ｌｉｐ−ＤＮＡは、実施例４に示すように血清に
非常に抵抗性である。蛍光ラベルおよび銀増強を有するコロイド金ラベルを使用
して、リポソームの静脈内注射でのいくつかの固形癌モデルにおいて(７７−７
９)、８０−１００ｎｍのサイズのＰＥＧ安定化したリポソームが、血管外、腫
瘍細胞の間の隙間の空間に進出し、全腫瘍領域中に散乱することができたことを
示した。よって、本発明記載の３５−８０ｎｍのサイズのリガンド−ＰＥＧ「ポ
ストコート」したリポソーム−ＤＮＡ複合体は、毛細血管壁を通過し、ターゲッ
トに到達することができた。実施例５に記載のインビボの遺伝子トランスフェク
ションのデータによって確認したとおりである。
【００５０】 実施例７ リガンド−ＰＥＧ「ポストコート」したリポソームの安定性アッセイ リポソームの製剤にとって安定性は重要な問題である。リポソーム溶液は、そ
の生物学的／薬学的活性の有意な喪失なく出荷および貯蔵でき、治療の物質とし
て有用であるために、調製の後、長時間安定であるべきである。本発明のリガン
ド−リポソーム−治療分子複合体の将来の臨床的使用の観点から、本実施例で、
我々はリガンド−リポソームおよびリガンド−リポソーム−ＤＮＡ複合体の安定
性を試験した。リガンド−ＰＥＧ「ポストコート」したリポソーム−ｐＳＶｂ複合
体を、暗黒中で４℃で窒素条件下、様々な期間、１２ヶ月まで貯蔵した。検定の
日に、貯蔵したリポソームおよび新しく調製したリポソームを使用して、実施例
４に記載のトランスフェクションアッセイを使用して、ＪＳＱ−３細胞をトラン
スフェクトした。 ＰＥＧコートを欠くＬｉｐＡ−ＤＮＡまたは葉酸塩(エステル)−ＬｉｐＡ−Ｄ
ＮＡ複合体は、そのトランスフェクション活性を１−３日中に喪失した。リガン
ド−ＰＥＧを「ポストコート」したとき、リポソームは安定化し、トランスフェク
ション活性を長時間保持した。１００％のその活性は１ヶ月間確かであり、５０
−６０％のトランスフェクション活性を６ヶ月の貯蔵の後なお保持していた。よ
って、本発明記載のリガンド−ＰＥＧ「ポストコート」したカチオン性リポソーム
は、より安定で長いシェルフタイムを有し、これは実際上の使用に対して重要な
ことである。
【００５１】 実施例８ ガラクトース−ＰＥＧポストコートしたポリエチレンイミン−ＤＮＡ複合体(ポ
リプレクス)の調製 本実施例は、ガラクトース−ＰＥＧポストコートしたＰＥＩ−ＤＮＡ複合体を
調製するための手法を記載する。ガラクトースまたはガラクトース化した(galac
tosylated)リガンドは、肝細胞およびヘパトーマ(１３)に高密度で存在するアシ
アログリコプロテインレセプターに対して高親和性を有する。ガラクトース−Ｐ
ＥＧポストコートしたＰＥＩ−ＤＮＡ複合体は、肝臓疾患の遺伝子治療のための
肝臓へのターゲティングされた遺伝子移入に有用である。
【００５２】 Ａ．ＰＥＩの修飾 ２５ｋＤａの平均分子量を有する分枝ＰＥＩ(Ｐ２５と命名した)を、Aldrich
から購入した。２５ｋＤａの平均分子量を有する直鎖状ＰＥＩ(ＬＰ２５と命名
した)をPolysciences, Incから購入した。両方のＰＥＩをマレイミド含有活性エ
ステルと反応させ、実施例３のＤＯＰＥ−ＭＢと同様に、マレイミド基を導入し
た。以下は使用可能なマレイミド含有活性エステルの例(これらに限定されない)
である：３−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢ
Ｓ)(Sigma M2786)、スクシニミジル４−(ｐ−マレイミドフェニル)ブチレート(
ＳＭＰＢ)(Sigma M6286)およびスクシニミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート(ＳＭＣＣ)(Sigma M5525)。３ｍｌの乾燥ク
ロロホルム中の０．１−０．２ｇのＰ２５(２ｍｌのクロロホルムおよび１ｍｌ
のＤＭＳＯ中のＬＰ２５)を、５０ｍｇのＭＢＳ／１ｍｌのＤＭＳＯおよび１０
０μｌトリエチルアミン(Sigma)に添加した。混合物を終夜室温で撹拌した。１
０ｍｌの純水を添加し、強く撹拌し、遠心分離した(５０００ｒｐｍ、１０分間)
。修飾したＰＥＩ、Ｐ２５−マレイミドベンゾイル(ＭＢ)を水性相中に可溶化し
、一方、ＬＰ２５−ＭＢは２相の間で白または明黄色固体であった。Ｐ２５−Ｍ
Ｂを１０−ＤＧ脱塩カラム(BioRad)によって精製し、水で平衡させた。固体のＬ
Ｐ２５−ＭＢを取り、水で２回洗浄し、乾燥し重量測定した。固体のＬＰ２５−
ＭＢを１ＮのＨＣｌを滴状に全部が透明になるまで添加することによって水に可
溶化した。
【００５３】 Ｂ．ガラクトース−ＰＥＧ−ＰＤＰの調製 この手法は、実施例１のＦ−ＰＥＧ−ＰＤＰのものと同様である。２ｍｌの乾
燥クロロホルム中の３０μモルのポリオキシエチレンビス(アミン)(ＮＨ２−Ｐ
ＥＧ−ＮＨ２)(M.W.3350, Sigma)を室温で撹拌した。１ｍｌの乾燥クロロホルム
中の３０μモルのＮ−スクシンイミド−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネー
ト(ＳＰＤＰ)(Sigma)の溶液を、１０−１５分の時間で滴状に添加した。１０μ
ｌのＴＥＡを溶液に添加し、さらに１５−３０分間撹拌した。次に、得られたＰ
ＤＰ−ＰＥＧ−ＮＨ２を、乾燥クロロホルムプラス２−６モルのＴＥＡ中の１−
３モルの過剰のＤ−ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアネート(Sigma)と
終夜室温で反応させた。ある容量のクロロホルムを溶液に添加し、次に、ＰＢＳ
で４−６回洗浄し、各洗浄の間に１０００−２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離
した。透明なクロロホルム溶液を蒸発乾燥させ、産物、ガラクトース−ＰＥＧ−
ＰＤＰ(Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＰＤＰ)を得た。産物をＴＬＣで確認した(クロロホル
ム／メタノール／酢酸１００／３０／２)。
【００５４】 Ｃ．ポリプレックスのポストコート 実施例３に記載のＦ−ＰＥＧ−ＰＤＰと同様にＧａｌ−ＰＥＧ−ＰＤＰをＤＴ
Ｔによって還元した。ＤＮＡを、記載のように(６６、６７)、１−５０、好まし
くは５−１５のＮ／Ｐ率(ＰＥＩのアミン窒素ｖｓ．ＤＮＡのフォスフェート、
モル率)で水または１０−１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＰ２５−ＭＢまたはＬＰ２
５−ＭＢ溶液に添加することによって、ポリプレックスを調製した。１ＭのＨＥ
ＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５−８．０を１０−２０ｍＭの最終濃度まで添加し
てｐＨ７．４−８．０に調節した後、新しく還元したリガンド−ＰＥＧ−ＳＨ(
Ｆ−ＰＥＧ−ＳＨまたはＧａｌ−ＰＥＧ−ＳＨ)をポリプレックスに添加し、室
温で２−６時間または４℃で終夜反応させた。ポストコートしたポリプレックス
を直接的にまたはSepharose CL-4Bクロマトグラフィーによって精製して非結合
リガンド−ＰＥＧを取り除いて使用することができる。Sepharose CL-4Bクロマ
トグラフィーで、５０％より多いリガンド−ＰＥＧ−ＳＨがポリプレックスと結
合したことを確認した。５０％のデキストロースを静脈内投与のために最終濃度
の５％まで添加した。
【００５５】 実施例９ インビトロおよびインビボにおけるリガンド−ＰＥＧポストコート安定化したポ
リプレックス介在トランスフェクション 本実施例は、Ｆ−ＰＥＧおよびＧａｌ−ＰＥＧポストコート安定化ポリプレッ
クスのインビトロおよびインビボのトランスフェクション活性を示す。 ＣＭＶプロモーターのもとのホタルのルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド
ｐＬｕｃを研究に使用した(３５)。ポリプレックスＰ２５−ｐＬｕｃを、ｐ２５
−ＭＢ(水中の１０ｍＭのモノマー、ＨＣｌによってｐＨ７．４)をｐＬｕｃのＤ
ＮＡ溶液に強く撹拌しながらＮ／Ｐ率６−１２で添加し、さらに１分間強く撹拌
することによって調製した。Ｆ−ＰＥＧおよびＧａｌ−ＰＥＧを実施例８に記載
のようにポリプレックスにポストコートした。インビトロのトランスフェクショ
ンを、実施例４および引用文献２７および３５に記載のように、２４ウェルプレ
ートにおいて実施した。トランスフェクション試薬溶液を細胞、ＪＳＱ−３に、
１０％の血清の存在下、添加した。２４時間後、細胞を洗浄し、洗浄し、ルシフ
ェラーゼ活性およびタンパク質濃度を測定した(３５)。結果を溶解物中のμｇタ
ンパク質あたりの１０３相対光単位(ＲＬＵ)として表し、表２に示す。
【００５６】 表２：血清の存在下でのインビトロでのＪＳＱ−３細胞のリガンド−ＰＥＧポス
トコートしたポリプレックス介在トランスフェクション
【表２】
【００５７】 結果は、リガンド−ＰＥＧポストコートしたポリプレックスが、血清の存在下で
非常に高トランスフェクション活性を有し、非コートのポリプレックスより有意
に高いことを示す。リガンド−ＰＥＧポストコートしたポリプレックスは、タン
パク質アッセイおよび顕微鏡下での観察によって指摘されたように、非コートの
ポリプレックスＰ２５−ｐＬｕｃよりずっと細胞毒性の低いことが注目に値する
。 インビボの研究のために、Ｃ５７ＢＫ／６ブラックマウスをリガンド−ＰＥＧ
ポストコートしたポリプレックスおよび非コートのポリプレックスによって８０
−１００μｇのＤＮＡ／マウスで０．４−０．５ｍｌ／注射において尾部静脈経
由で静脈内注射した。２４時間後、器官を切除し、１×溶解バッファー(Promega
)中でホモジナイズした。ルシフェラーゼ活性およびタンパク質濃度を記載のよ
うに測定し(３５)、結果を１０３ＲＬＵ／ｍｇタンパク質として表し、表３に示
す。Ｇａｌ−ＬＰ２５およびＧａｌ−Ｐ２５は、Zenta et al.(７０)およびBand
yopadhyay et al.(７１)にしたがって調製したガラクトース化したＰＥＩであっ
た。すべてのポリプレックスを同じＮ／Ｐ＝１０で調製した。
【００５８】 表３：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるリガンド−ＰＥＧポストコートしたポリプ
レックスによる全身的遺伝子移入
【表３】
【００５９】 表３は、ＰＥＧコートを欠くポリプレックスが肺に卓越して遺伝子を移入し、
肝臓、脾臓または他の器官(データは示していない)にほとんど移入しないことを
示した。ＰＥＩをガラクトース化したとき、肝臓でのレポーター遺伝子の発現は
少し増加し、肺では減少したが、肝臓へターゲッティングした遺伝子移入のため
に使用するには不十分であった(肝臓／肺＝０．５または０．０３)。しかし、ポ
リプレックスをＧａｌ−ＰＥＧによってポストコートしたとき、肝臓で有意なレ
ポーター遺伝子の発現を観察し、肺中よりずっと大きかった(肝臓／肺＝６２４)
。該結果は、リガンド−ＰＥＧポストコートがインビボでポリプレックスを安定
化しシールドし、肺の最初のろ過効果に対して生存でき(他のＰＥＧ−コートし
たstealthベクターのように)、担持した遺伝子をターゲット組織に選択的に移入
できることを示した。このＧａｌ−ＰＥＧポストコート法によって調製した複合
体は、全身的投与の後、ＤＮＡを選択的に肝臓に移入することができ、肝臓ター
ゲッティングした遺伝子治療に有用である。
【００６０】 ８０−１００μｇ／マウスのＤＮＡ用量で、我々は、実験において静脈内注射
の後、ＰＥＩ−ＤＮＡポリプレックス、特にＰ２５が、マウスにとって非常に有
毒であることを観察した。Ｐ２５ポリプレックスによって注射したすべてのマウ
スが１２時間以内に死亡した。Ｆ−ＮＨＳ(Ｆ−Ｐ２５)またはガラクトース化し
た(Ｇａｌ−Ｐ２５)によって修飾したＰ２５さえも、同様の毒性を示した(１２
時間以内にそれぞれ２／２および３／４が死亡した)。Ｇａｌ−Ｐ２５群におけ
る生存したマウスのみが重度に病気であり、解剖によれば拡張した青白い肝臓を
示した。組織学的には、急性肝炎と類似の肝臓障害を示していた。Ｆ−ＰＥＧポ
ストコートしたポリプレックスによって注射したすべてのマウスが生存し、すべ
ての前記の毒性の兆候を示さなかった。Ｇａｌ−ＰＥＧポストコートしたポリプ
レックスは低毒性であり、解剖によれば肝臓障害の兆候は見られなかった。この
結果は、リガンド−ＰＥＧポストコートがポリプレックスの毒性を減少させるこ
とを示した。これはＰＥＩに基づく遺伝子移入システムの臨床的発展のために有
望である。
【００６１】 実施例１０ ポストコートについてのリガンド−ＰＥＧの特徴 本実施例は、ポストコートについてのＦ−ＰＥＧ−ＰＤＰおよびＧａｌ−ＰＥ
Ｇ−ＰＤＰの特徴の結果を示す。 Ａ．紫外線スペクトロフォトグラム 精製したＦ−ＰＥＧ−ＰＤＰおよびＧａｌ−ＰＥＧ−ＰＤＰをＤＴＴの添加前
および後に、Beckman DU640スペクトロフォトメーターによって２００ｎｍない
し７００ｎｍでスキャンした。図５Ａ−Ｄは、スキャンのスペクトロフォトグラ
ムを示す。図５Ａは、Ｆ−ＰＥＧ−ＰＤＰのスキャンを示す。葉酸塩(エステル)
の３６３ｎｍのピークおよびＰＥＧの２８０ｎｍのピークがある。ＤＴＴによる
還元の後(図５Ｂ)、新しいピークが３４２ｎｍに現れ、これはＰＤＰ基からの切
断した２−チオピリドンを表す。図５Ｃは、ガラクトースの２４０ｎｍのピーク
およびＰＥＧの２８０ｎｍのピークを示す。ＤＴＴによる還元の後(図５Ｄ)、３
４２ｎｍの２−チオピリドンのピークが現れた。この結果は、ＰＤＰおよびリガ
ンドの両方がＰＥＧに結合し、ＰＤＰが官能基であり還元され得ることを確認し
ている。
【００６２】 引用文献
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
【表６】
【００６５】
【表７】
【００６６】
【表８】
【００６７】
【表９】
【００６８】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、「ポストコート法」による葉酸塩(エステル)−リポソーム
−ＤＮＡ複合体の調製のための概要を示す。葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−ＳＨの
前の、実線はＳＰＤＰ法を示し、点線は２−イミノチオラン法を示すことに注意
されたい。
【図２】 図２は、ＪＳＱ−３細胞の葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−リポソー
ム介在トランスフェクションおよび血清のそれらのトランスフェクションに及ぼ
す影響を示す。プラスミドｐＳＶｂＤＮＡ(２７)と複合化されたＬｉｐＡ−ＰＥ
Ｇ−Ｆを、「ポストコート法」によって調製した。ＬｉｐＡは等量モルのＤＯＴＡ
ＰおよびＤＯＰＥプラス５％モルのＤＯＰＥ−ＭＢからなる。ｐＳＶｂと複合化
されたＬｉｐＡ−ＰＥＧを同様に葉酸塩(エステル)を欠くポストコートＰＥＧに
よって調製した。９６ウェルプレートにおけるＪＳＱ−３細胞を(１×１０４細
胞／ウェル)、１０％胎児ウシ血清と共にまたはそれなしに１μｇＤＮＡ／ウェ
ルのＬｉｐＡ−ＰＥＧ−Ｆ(ｐＳＶｂ)またはＬｉｐＡ−ＰＥＧ(ｐＳＶｂ)によっ
てトランスフェクトした。２日後、細胞を溶解させ、βガラクトシダーゼ発現を
カラリメトリックアッセイによって測定した。２反復の平均をプロットした。
【図３】 図３は、ＪＳＱ−３細胞の葉酸塩(エステル)−ＰＥＧ−リポソー
ム介在遺伝子トランスフェクションの特異性を示す。ＬｉｐＡ−ＰＥＧ１−Ｆお
よびＬｉｐＡ−ＰＥＧ２−Ｆを、それぞれ「ポストコート法」、ＳＰＤＰ法および
２−イミノチオラン法によって調製した。９６ウェルプレートにおけるＪＳＱ−
３細胞を(１×１０４細胞／ウェル)、０．３２μｇＤＮＡ／ウェルから始まる一
連希釈のＬｉｐＡ−ＰＥＧ１−Ｆ(ｐＳＶｂ)またはＬｉｐＡ−ＰＥＧ２−Ｆ(ｐ
ＳＶｂ)でトランスフェクトした。リガンド競合のために、遊離葉酸(ＦＡ)を最
終濃度１ｍＭまでトランスフェクションの直前に添加した。２日後に、細胞を溶
解し、カラリメトリックアッセイによってβガラクトシダーゼの発現を測定した
。２反復の平均をプロットした。
【図４】 図４Ａ−Ｉは、インビボにおける「ポストコート」した葉酸塩(エ
ステル)−ＰＥＧ−リポソーム介在全身的遺伝子トランスフェクションの結果を
示す。ＬｉｐＡ−ＰＥＧ１−ＦをＳＰＤＰ法によって調製し、ＬｉｐＡ−ＰＥＧ
２−Ｆを２−イミノチオラン法によって調製した。
【図５】 図５Ａ−Ｄは、２００ｎｍないし７００ｎｍのBeckman ＤＵ６４
０スペクトロフォトメーターを使用した、ＤＴＴ添加の前および後の精製Ｆ−Ｐ
ＥＧ−ＰＤＰおよびＧａｌ−ＰＥＧ−ＰＤＰのスペクトロフォトグラムを示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月３１日（２００１．１．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
【表１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エスター・エイチ・チャン アメリカ合衆国20815メリーランド州チェ ビー・チェイス、ベール・ストリート7508 番 Ｆターム(参考） 4C076 AA95 BB13 CC27 EE59 FF32 FF68 4C084 AA13 MA05 NA10 ZB26

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 治療分子のターゲッティングした移入のためのポストコー
    トしたカチオン性担体の調製方法であって (a)当該治療分子を当該カチオン性担体と複合体化し、カチオン性担体−治療分
    子複合体を形成させ； (b) ポリマーとターゲッティングリガンドを結合して、当該ポリマーが当該リガ
    ンドと結合しているポリマー−リガンド複合体を形成させ；そして (c) 当該予め形成したカチオン性担体−治療分子複合体と当該ポリマー−リガン
    ド複合体を結合させて、当該ポリマー−リガンド複合体が、当該予め形成したカ
    チオン性担体―治療分子複合体をコートし、それによって当該治療分子のターゲ
    ッティングした移入のための当該ポストコートしたカチオン性担体を形成させる
    段階を含む方法。
  2. 【請求項２】 当該カチオン性担体がカチオン性リポソーム、カチオン性ポ
    リマー、ポリリジン、プロタミンまたはポリエチレンイミンである、請求項１の
    方法。
  3. 【請求項３】 当該カチオン性担体が、i)ジオレオイルトリメチルアンモニ
    ウムプロパン(ＤＯＴＡＰ)、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン(
    ＤＯＰＥ)およびＤＯＰＥマレイミドフェニルブチレート(ＤＯＰＥ−ＭＰＢ)；i
    i)ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(ＤＤＡＢ)、ＤＯＰＥおよびＤ
    ＯＰＥ−ＭＰＢ；iii)ＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびＤＯＰＥ−ＭＰＢ；ま
    たはiv)ＤＤＡＢ、コレステロールおよびＤＯＰＥ−ＭＰＢを含む、請求項１の
    方法。
  4. 【請求項４】 当該カチオン性担体がコレステロールをさらに含む、請求項
    ３の方法。
  5. 【請求項５】 当該カチオン性担体が１−１０モルパーセントの反応性結合
    基を含む、請求項２の方法。
  6. 【請求項６】 当該反応性結合基がマレイミド基である、請求項５の方法。
  7. 【請求項７】 当該マレイミド基がマレイミドフェニルブチレートである、
    請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 当該ポリマー−リガンド複合体が反応性基を含む、請求項１
    の方法。
  9. 【請求項９】 当該反応性基がスルフヒドリルである、請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 当該リガンドが砂糖、ビタミン、タンパク質、抗体または
    成長因子である、請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】 当該リガンドが葉酸塩(エステル)、ガラクトース、ペプチ
    ド、ポリペプチドまたは抗体フラグメントである、請求項１０の方法。
  12. 【請求項１２】 当該リガンドが、葉酸塩(エステル)である、請求項１の方
    法。
  13. 【請求項１３】 当該ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピ
    ロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート
    、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリレー
    ト、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメチルオキサゾ
    リン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒド
    ロキシプロピルオキサゾリン、またはポリアスパルタミド(polyaspartamide)で
    ある、請求項１の方法。
  14. 【請求項１４】 当該ポリマーがポリエチレングリコールである請求項１の
    方法。
  15. 【請求項１５】 当該カチオン性担体がポリエチレンイミンであり、当該ポ
    リエチレンイミン中の０．１−２５％のアミンがスルフヒドリル反応性分子に結
    合している、請求項１の方法。
  16. 【請求項１６】 ＤＮＡおよびポリエチレンイミンが、１−５０のＮのＰに
    対する率である、請求項１５の方法。
  17. 【請求項１７】 当該ポストコートしたカチオン性担体が、８０ｎｍより小
    さい直径である、請求項１の方法。
  18. 【請求項１８】 当該ポストコートしたカチオン性担体が、３５−８０ｎｍ
    の範囲の直径である、請求項１の方法。
  19. 【請求項１９】 当該ポストコートしたカチオン性担体が、およそ６０ｎｍ
    の平均直径である、請求項１の方法。
  20. 【請求項２０】 当該リガンドが当該ポリマーに直接的に共有結合している
    、請求項１の方法。
  21. 【請求項２１】 当該治療分子が、遺伝子、高分子量ＤＮＡ、プラスミドＤ
    ＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、化学物質、ＤＮＡ、Ｒ
    ＮＡ、リボザイム、ＣｐＧ配列、ウイルス粒子、成長因子、サイトカイン、免疫
    調節物質、または免疫系を刺激または抑制するタンパク質である、請求項１の方
    法。
  22. 【請求項２２】 予め形成したカチオン性担体−治療分子複合体上の反応性
    基と共有結合することのできるリガンド−ポリマー複合体を調製し、当該カチオ
    ン性担体−治療複合体をポストコートする方法であって： a)各２個の末端に、官能基部分が同じであるかまたは異なることができる官能基
    部分を有する２個の末端を有するポリマーを選択し； b)段階(a)の当該ポリマーの第１の末端に反応性クロスリンカーに変換し得る部
    分を含む化合物を付加し； c)段階(a)の当該ポリマーの第２の末端に当該リガンドを付加し；そして d)当該第１の末端の当該部分を反応性部分に変換する； 段階を含む方法であって当該反応性部分が反応性基と共有結合を形成することの
    できる方法。
  23. 【請求項２３】 当該官能基部分がアミン、スルフヒドリル、カルボキシル
    およびヒドラジドからなる群から選択される、請求項２２の方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２２の方法であって、当該化合物がスルフヒドリル
    に変換し得る硫黄を含み d)当該部分を遊離スルフヒドリルを有する部分に変換する； 当該遊離スルフヒドリルが当該カチオン性担体上の反応性基と共有結合を形成し
    得る 方法。
  25. 【請求項２５】 当該化学的部分がジチオピリジンである、請求項２２の方
    法。
  26. 【請求項２６】 予め形成したカチオン性担体−治療分子複合体上の反応性
    基と共有結合できる、リガンド−ポリマー複合体を調製し、当該カチオン性担体
    −治療複合体をポストコートする方法であって： a)官能基部分が同じであるか異なることができる、各２個の末端に官能基部分を
    有する２個の末端を有するポリマーを選択し； b)当該ポリマーの第１の末端にリガンドを共有結合させ； c)反応性クロスリンカーを含む化合物を、段階(b)の当該ポリマーの第２の末端
    に付加する； 段階を含む方法であって、当該反応性クロスリンカーがカチオン性担体の反応性
    基と共有結合を形成することのできる方法。
  27. 【請求項２７】 当該リガンドが葉酸塩(エステル)である請求項２６の方法
    。
  28. 【請求項２８】 当該化合物が２−イミノチオランである請求項２６の方法
    。
  29. 【請求項２９】 請求項１−２１のいずれかの方法によって調製したカチオ
    ン性担体。
  30. 【請求項３０】 請求項２２−２８のいずれかの方法によって調製したポリ
    マーリガンド複合体。
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