CN104922068B - 一种Decoy核酸阳离子脂质体载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，它包括如下步骤：(1)将二油酰磷脂酰乙醇胺和(2，3‑二油酰基‑丙基)‑三甲胺按质量比4∶1～1∶4混合，加入有机溶剂溶解得到混合溶液；(2)将步骤(1)得到的混合溶液完全蒸干有机溶剂，使用HEPES缓冲液溶解剩余的固体部分，先水合30～60min，再超声30～60min；(3)将步骤(2)处理后得到的混合体系先过0.4～0.8μm的膜，再过0.03～0.2μm的膜，制备粒径小、分布均匀的空白脂质体；(4)将空白脂质体与鱼精蛋白、Decoy核酸按照质量比(50～120)∶(10～20)∶1混合，2℃～8℃孵育12～24小时形成完整的Decoy核酸阳离子脂质体载体。本发明的Decoy核酸阳离子脂质体载体具有较高的入膜率高和入核率，同时不具有细胞毒性。

Description

一种Decoy核酸阳离子脂质体载体及其制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种Decoy核酸阳离子脂质体载体及其制备方法。
背景技术
脂质体是由磷脂双分子定向排列而成的直径几纳米至几微米的超细粒子，双分子层内外分别包封脂溶性和水溶性药物。脂质体具有能使药物具有靶向性、提高和延长疗效、缓和毒性、避免耐药性和改变给药途径等特点。自20世纪60年代Rahman等人首次将脂质体作为药物载体应用以来，关于脂质体的制备工艺，作用机制，体内分布，药理毒理等特性研究不断深入。
脂质体按照所带电荷特性可分为中性脂质体、正电性脂质体和负电性脂质体。由于脂质体具有类似生物膜的结构，安全性高，而且可以长时间吸附在靶细胞周围，促进药物的渗透与吸收，并可能经融合作用进入细胞内后再释放药物，同时可以较为容易的连接特异性配体而获得主动靶向性效果，因此脂质体作为药物载体在恶性肿瘤的靶向给药治疗方面极具潜力，具有能增加与癌细胞的亲和力，克服耐药性，增加癌细胞对药物的摄取量，减少用药剂量，提高疗效，较少毒副作用的特点。现有的针对脂质体的研究主要停留在如何利用脂质体将目标物运输到细胞内，在提高脂质体稳定性和包封率的同时，降低细胞毒性。
入核困难是长期以来困扰Decoy核酸药物的技术问题。Decoy核酸药物能够以转录因子为靶点从转录水平上调控基因表达，是一种靶向性强的新型药物，其主要存在问题是由于decoy药物所作用的靶位点转录因子多存在于细胞核内，因此需要药物输送系统携带药物穿透细胞膜与细胞核。现有技术中关于协助药物进入细胞核的脂质体还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种Decoy核酸阳离子脂质体载体，以提高转染细胞时的入膜率和入核率。
本发明还要提供上述Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，它包括如下步骤：
(1)将DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)和DOTAP((2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺)按质量比4∶1～1∶4混合，加入有机溶剂溶解得到混合溶液；
(2)将步骤(1)得到的混合溶液完全蒸干有机溶剂，使用HEPES缓冲液溶解剩余的固体部分，水合30～60min，水合结束后超声30～60min；
(3)将步骤(2)处理后得到的混合体系先过0.4～0.8μm的膜，再过0.03～0.2μm的膜，制备粒径小分布均匀的空白脂质体；
(4)将空白脂质体与鱼精蛋白、Decoy核酸按照质量比(50～120)∶(10～20)∶1混合，2℃～8℃孵育12～24h形成完整的Decoy核酸阳离子脂质体载体。
步骤(1)中，所述的有机溶剂为三氯甲烷。
步骤(1)中，每毫克二油酰磷脂酰乙醇胺和(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺的混合物中加入10ml有机溶剂。
步骤(2)中，蒸干有机溶剂的方法是使用旋转蒸发器蒸干。
优选地，步骤(2)中，所述的HEPES缓冲液为3～5mol/L pH 7.4的HEPES缓冲液。
优选地，步骤(2)中，水合温度为20℃～30℃，超声功率为100～200W。
步骤(3)中，所述的膜为聚碳酸酯膜，混合体系先过0.4～0.8μm的膜10～20次，再过0.03～0.2μm的膜10～20次。
上述制备方法制备得到Decoy核酸阳离子脂质体载体也在本发明的保护范围之内。
上述Decoy核酸阳离子脂质体载体在作为携带药物穿透细胞膜和细胞核的药物输送系统中的应用也在本发明的保护范围之内。
有益效果：本发明与目前市面上最常用的转染试剂lipo2000相比，在使用hek293作为转染细胞时，入膜率提高了30％，入核率提高了90％；与市面转染效率最好的lipo3000相比转染效果基本持平，同时不具有细胞毒性。
附图说明
图1：A为DOPE结构，B为DOTAP结构示意图。
图2：核酸：LMWP：脂质体复合物示意图，其中，A为脂质体层，B为DNA，C为LMWP；dDNA为两DNA分子轴间距，δw为脂质层厚度，δm为DNA分子厚度；
图3A为实施例1阳离子脂质体平均粒径检测图；
图3B为实施例1阳离子脂质体zeta电位的检测结果图；
图4A为lipo2000转染效果图；
图4B为lipo3000转染效果图；
图4C为含250ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体转染效果图；
图4D为含500ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体转染效果图；
图4E为含1000ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体转染效果图；
图5A为lipo2000入核效果图；
图5B为lipo3000入核效果图；
图5C为含250ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体入核效果图；
图5D为含500ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体入核效果图；
图5E为含1000ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体入核效果图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 制备Decoy核酸阳离子脂质体。
(1)取DOPE、DOTAP各3mg，溶于20ml三氯甲烷中制成脂质溶液；
(2)将上述脂质溶液加入圆底烧瓶中，在20℃恒温水浴中旋转减压蒸发，注意转速与温度的调节避免产生气泡，去除有机溶剂，形成脂膜，取3ml 4mM pH 7.4 HEPES加入上述圆底烧瓶中，20℃水合30min，水合后再超声30min，超声功率为100W，制成粗脂质体溶液；将粗脂质体溶液经过0.4μm膜10次，然后经过0.2μm膜10次制成2mg/ml脂质体溶液。
(3)取鱼精蛋白2mg，Decoy核酸1mg，分别溶于1ml 4mM pH 7.4 HEPES缓冲液中制成鱼精蛋白和Decoy核酸溶液。
(4)取1.5ml eppendorf试管，在其中按顺序加入670μl 4mM pH7.4 HEPES缓冲液，275μl脂质体溶液，50μl LMWP溶液，5μl Decoy核酸溶液形成质量比110∶20∶1Decoy核酸阳离子脂质体混合溶液，4℃冰箱中静止孵育12h，得到Decoy核酸阳离子脂质体。
制备的Decoy核酸阳离子脂质体经粒度分析仪检测和Zeta电位仪检测，检测结果如图3A和图3B所示，平均粒径为200nm，zeta电位为38.45mV。
实施例2 制备Decoy核酸阳离子脂质体。
(1)取DOPE、DOTAP各3mg，溶于20ml三氯甲烷中制成脂质溶液；
(2)将上述脂质溶液加入圆底烧瓶中，在20℃恒温水浴中旋转减压蒸发，注意转速与温度的调节避免产生气泡，去除有机溶剂，形成脂膜，取3ml 4mM pH 7.4 HEPES加入上述圆底烧瓶中，20℃水合30min，水合后再超声30min，超声功率为100W，制成粗脂质体溶液；将粗脂质体溶液经过0.4μm膜10次，然后经过0.2μm膜10次制成2mg/ml脂质体溶液。
(3)取鱼精蛋白2mg，Decoy核酸1mg，分别溶于1ml 4mM pH 7.4 HEPES缓冲液中制成鱼精蛋白和Decoy核酸溶液。
(4)取1.5ml eppendorf试管，在其中按顺序加入845μl 4mM pH7.4 HEPES缓冲液，125μl脂质体溶液，25μl LMWP溶液，5μl Decoy核酸溶液形成质量比50∶10∶1Decoy核酸阳离子脂质体混合溶液，4℃冰箱中静止孵育12h，得到Decoy核酸阳离子脂质体。
制备的Decoy核酸阳离子脂质体经粒度分析仪检测和Zeta电位仪检测，平均粒径为157.7nm，zeta电位为29.15mV。
实施例3 制备Decoy核酸阳离子脂质体。
(1)取DOPE 3mg，DOTAP 12mg，溶于20ml三氯甲烷中制成脂质溶液；
(2)将上述脂质溶液加入圆底烧瓶中，在20℃恒温水浴中旋转减压蒸发，注意转速与温度的调节避免产生气泡，去除有机溶剂，形成脂膜，取3ml 4mM pH 7.4 HEPES加入上述圆底烧瓶中，20℃水合30min，水合后再超声30min，超声功率为100W，制成粗脂质体溶液；将粗脂质体溶液经过0.4μm膜10次，然后经过0.2μm膜10次制成2mg/ml脂质体溶液。
(3)取鱼精蛋白2mg，Decoy核酸1mg，分别溶于1ml 4mM pH 7.4 HEPES缓冲液中制成鱼精蛋白和Decoy核酸溶液。
(4)取1.5ml eppendorf试管，在其中按顺序加入670μl 4mM pH7.4 HEPES缓冲液，300μl脂质体溶液，25μl LMWP溶液，5μl Decoy核酸溶液形成质量比120∶10∶1Decoy核酸阳离子脂质体混合溶液，4℃冰箱中静止孵育12h，得到Decoy核酸阳离子脂质体。
制备的Decoy核酸阳离子脂质体经粒度分析仪检测和Zeta电位仪检测，平均粒径为188.9nm，zeta电位为27.14mV。
实施例4 制备Decoy核酸阳离子脂质体。
(1)取DOPE：12mg，DOTAP 3mg，溶于20ml三氯甲烷中制成脂质溶液；
(2)将上述脂质溶液加入圆底烧瓶中，在20℃恒温水浴中旋转减压蒸发，注意转速与温度的调节避免产生气泡，去除有机溶剂，形成脂膜，取3ml 4mM pH 7.4 HEPES加入上述圆底烧瓶中，20℃水合30min，水合后再超声30min，超声功率为100W，制成粗脂质体溶液；将粗脂质体溶液经过0.4μm膜10次，然后经过0.2μm膜10次制成2mg/ml脂质体溶液。
(3)取鱼精蛋白2mg，Decoy核酸1mg，分别溶于1ml 4mM pH 7.4 HEPES缓冲液中制成鱼精蛋白和Decoy核酸溶液。
(4)取1.5ml eppendorf试管，在其中按顺序加入820μl 4mM pH7.4 HEPES缓冲液，125μl脂质体溶液，50μl LMWP溶液，5μl Decoy核酸溶液形成质量比50∶20∶1Decoy核酸阳离子脂质体混合溶液，4℃冰箱中静止孵育12h，得到Decoy核酸阳离子脂质体。
制备的Decoy核酸阳离子脂质体经粒度分析仪检测和Zeta电位仪检测，平均粒径为210.1nm，zeta电位为20.14mV。
实施例5：Decoy核酸阳离子脂质体转染与入核能力与lipo2000、lipo3000的转染与入核能力对比。
DOPE-DOTAP脂质体、LMWP(鱼精蛋白)、DNASTAT3 Decoy ODN按照质量比110∶20∶1的比例按照实施例1给出的方法制备，其中DNA事先进行5’端cy3标记。HEK293细胞接种到事先由多聚精氨酸固定过的6孔培养板，待细胞生产到50％饱和度，进行转染操作。转染试剂用不同量的无血清无双抗Opti-MEM培养基稀释.
其中：
lipo2000实验组：198μl OMEM培养基、1.5μl lipo2000试剂和0.5μl 1mg/ml DNA；
lipo3000实验组：197μl OMEM培养基、1μl P3000试剂、1.5μl lipo3000试剂、0.5μl1mg/ml DNA；
Decoy核酸阳离子脂质体实验组：按照实验例1制备的250ng、500ng、1000ng分别于不同量的OMEM培养基混合。
将各实验组加入到6孔板细胞中，37℃孵育16h，吸去细胞培养液，使用Dio试剂染色细胞膜，Hochest试剂染色细胞核，通过Micro高内涵成像系统拍照并计算转染率与入核率。结果如图4A～4E和图5A～5E所示。其中，图4A～4E分别为lipo2000、lipo3000、含250ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体、含500ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体、含1000ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体转染的效果图，其中，每个图从做到右分别为Dio试剂染色细胞膜效果图、5’cy3标记Decoy核酸分布图、将前两个图重叠后所得细胞转染效果图；图5A～5E分别为lipo2000、lipo3000、含250ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体、含500ngDNADecoy核酸阳离子脂质体、含1000ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体入核的效果图，其中，每幅图中从左到右分别为Hochest试剂染色细胞核效果图、5’cy3标记Decoy核酸分布图，将前两个图重叠后所得入核效果图。
结果表明，Lipo2000转染率为65.6％，入核率为28.8％，lipo3000转染率为89.8％，入核率为61.8％，含有250ngDNA的Decoy核酸阳离子脂质体转染率为66.3％，入核率为29.5％，含有500ngDNA的Decoy核酸阳离子脂质体转染率为85.5％，入核率为54.0％，含有1000ngDNA的Decoy核酸阳离子脂质体转染率为98.9％，入核率为76.9％。

Claims (10)

1.一种Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)将二油酰磷脂酰乙醇胺和(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺按质量比4∶1～1∶4混合，加入有机溶剂溶解得到混合溶液；
(2)将步骤(1)得到的混合溶液完全蒸干有机溶剂，使用HEPES缓冲液溶解剩余的固体部分，先水合30～60min，再超声30～60min；
(3)将步骤(2)处理后得到的混合体系先过0.4～0.8μm的膜，再过0.03～0.2μm的膜，制备粒径小、分布均匀的空白脂质体；
(4)将空白脂质体与鱼精蛋白、Decoy核酸按照质量比(50～120)∶(10～20)∶1混合，2℃～8℃孵育12～24小时形成完整的Decoy核酸阳离子脂质体载体。
2.根据权利要求1所述的Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的有机溶剂为三氯甲烷。
3.根据权利要求1或2所述的Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，每毫克二油酰磷脂酰乙醇胺和(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺的混合物中加入10ml有机溶剂。
4.根据权利要求1所述的Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，蒸干有机溶剂的方法是使用旋转蒸发器蒸干。
5.根据权利要求1所述的Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的HEPES缓冲液为3～5mol/L pH 7.4的HEPES缓冲液。
6.根据权利要求1所述的Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，水合温度为20℃～30℃；超声功率为100～200W。
7.根据权利要求1所述的Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的膜为聚碳酸酯膜，所述混合体系先过0.4～0.8μm的膜10～20次，再过0.03～0.1μm的膜10～20次。
8.权利要求1～7中任意一项所述的制备方法制备得到Decoy核酸阳离子脂质体载体。
9.权利要求8所述的Decoy核酸阳离子脂质体载体在制备作为携带药物穿透细胞膜和细胞核的药物输送系统中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物为Decoy核酸药物。
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