IT201900003639A1

IT201900003639A1 - Composizioni di vescicole extracellulari (EV) derivate da piante e loro usi

Info

Publication number: IT201900003639A1
Application number: IT102019000003639A
Authority: IT
Inventors: Giovanni Camussi; Chiara Gai; Margherita Alba Carlotta Pomatto
Original assignee: Evobiotech S R L
Priority date: 2019-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2020-09-13
Also published as: AU2020235247A1; JP2025020285A; KR20210137523A; EP3937962A1; JP2022525131A; WO2020182938A1; US20220142938A1; CA3133375A1; IL286260B1; CN113825523A; IL286260A

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: "Composizioni di vescicole extracellulari (EV) derivate da piante e loro usi"

DESCRIZIONE

Descrizione tecnica

La presente invenzione riguarda le composizioni di vescicole extracellulari di origine vegetale (EV) e i loro usi in applicazioni rigenerative.

Contesto

Le vescicole extracellulari (EV) sono una popolazione eterogenea di particelle rilasciate virtualmente da tutte le cellule viventi. Sono state purificate da quasi tutti i tipi di cellule di mammiferi e fluidi corporei, così come da eucarioti inferiori, procarioti e piante. Esse includono principalmente le microvescicole, rilasciate attraverso per gemmazione della membrana plasmatica, e gli esosomi, derivati dal compartimento endosomiale. Le vescicole extracellulari sono state denominate "particelle", "microparticelle", "nanovescicole", "microvescicole" ed "esosomi".

Le EV contengono un carico complesso e variabile di proteine citoplasmatiche, recettori di superficie, alcune proteine che interagiscono con i lipidi, molecole di DNA e RNA. Trasferendo il loro carico, svolgono un ruolo chiave come mediatori della comunicazione intercellulare.

Nella loro forma nativa, le EV di origine vegetale derivate da piante commestibili sono note per essere efficaci nel trattamento della leucemia [WO2016166716A1] e della colite [Ju S, et al. Grape exosome-like nanoparticles induce intestinal stem cells and protect mice from DSS-induced colitis. Mol Ther. 2013 Jul;21(7):1345-57. doi: 10.1038/mt.2013.64.] quando somministrate per via orale.

Le vescicole derivate da uva, pompelmo, zenzero e carote hanno mostrato effetti antinfiammatori nella malattia infiammatoria cronica intestinale [Zhang M, et al. Edible ginger-derived nanoparticles: A novel therapeutic approach for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease and colitisassociated cancer. Biomaterials. 2016 Sep;101:321-40. doi:10.1016/j.biomaterials.2016.06.018; Ju S, et al.

Grape exosome-like nanoparticles induce intestinal stem cells and protect mice from DSS-induced colitis. Mol Ther. 2013 Jul;21(7):1345-57. doi: 10.1038/mt.2013.64].

WO2017/052267 descrive l'uso di EV di origine vegetale derivate da piante commestibili somministrate per via topica per promuovere il miglioramento della pelle in termini di formazione delle rughe, idratazione, sbiancamento, proliferazione delle cellule epiteliali e deposizione di collagene.

Secondo le conoscenze degli inventori, la ricerca d’anteriorità non riporta EV di origine vegetale efficaci sull'angiogenesi, l'infiammazione, la fibrosi e la vitalità batterica quando somministrate per via topica su ferite e lesioni cutanee caratterizzate da ischemia e alterata angiogenesi, infiammazione o aumento dello stress ossidativo, o aumento dell'esposizione all'infezione batterica. Poiché le EV naturalmente proteggono e trasferiscono il loro contenuto alle cellule bersaglio, esse rappresentano un'alternativa utile alle particelle sintetiche ed esogene, come liposomi, nanoparticelle cationiche, nanovescicole mimetiche e vescicole basate su polipeptidi per veicolare agenti terapeutici. Le EV possono sfruttare il loro naturale meccanismo d'azione e superare alcune delle limitazioni delle particelle assemblate, tra cui l'immunogenicità, la tossicità, la somministrazione di particelle esogene, l'assorbimento cellulare limitato e l'assemblaggio chimico delle particelle. Negli ultimi anni, numerose tecniche sono state studiate per trasferire diverse molecole (RNA, DNA, farmaci) mediante le EV. Gli acidi nucleici associati alle EV sono protetti dagli enzimi degradanti presenti nel microambiente e potrebbero essere così trasferiti alle cellule bersaglio. I metodi finalizzati all'introduzione di molecole nelle EV includono l’elettroporazione, la sonicazione, la trasfezione, l’incubazione, l’estrusione di cellule, la permeabilizzazione mediante saponina, e il congelamento-scongelamento. WO2017/004526A1 descrive l'uso di microvescicole derivate da uva, pompelmo come vettori per miR18a e miR17 da utilizzare come farmaci antitumorali, o per traccianti da utilizzare a scopi diagnostici.

Per superare i limiti e gli inconvenienti delle tecniche descritte nella ricerca d’anteriorità, la presente invenzione fornisce una composizione comprendente una sotto-popolazione di vescicole extracellulari (EV) di origine vegetale nonché un metodo per caricare una o più molecole biologicamente attive in questa sottopopolazione di EV di origine vegetale, come definito nelle allegate rivendicazioni indipendenti. Le rivendicazioni dipendenti identificano ulteriori caratteristiche vantaggiose della composizione e del metodo rivendicati. L'oggetto delle rivendicazioni allegate costituisce parte integrante della presente descrizione.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

La presente invenzione riguarda una composizione comprendente una sottopopolazione di vescicole extracellulari di origine vegetale (EV), in cui le vescicole extracellulari (EV) di origine vegetale in detta sottopopolazione sono racchiuse da una membrana a doppio strato lipidico e sono caratterizzate dall’avere un diametro incluso tra 10 e 500 nm e in quanto mostrano attività proangiogenica, anti-infiammatoria, anti-ossidante, anti-batterica e / o anti-fibrotica, per l'uso in un metodo di terapia pro-rigenerativa.

Come qui usato, il termine "vescicole extracellulari" o "EV" si riferisce a nanoparticelle derivate da cellule, che sono delimitate o incapsulate da un doppio strato fosfolipidico e che trasportano lipidi, proteine, acidi nucleici e altre molecole derivate dalla cellula di origine. Convenzionalmente, le vescicole extracellulari hanno un diametro in un intervallo di 10-1000 nm.

La presente invenzione utilizza una sottopopolazione selezionata di vescicole extracellulari (EV) di origine vegetale che hanno un diametro nell'intervallo da 10 a 500 nm, preferibilmente nell'intervallo da 20 a 400 nm, ancora più preferibilmente nell’intervallo da 25 a 350 nm.

In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, il contenuto proteico della sottopopolazione di EV è nell'intervallo da 1 a 55 ng/10<9 >EV.

In un'altra forma di realizzazione preferita, il contenuto di RNA delle EV è nell'intervallo da 10 a 60 ng/10<10 >EV.

Le espressioni "contenuto di proteine" e "contenuto di RNA" comprendono sia il contenuto interno che il contenuto di membrana delle EV usate nella presente invenzione.

Esempi di lipidi nelle EV usate nella presente invenzione comprendono, ma non sono limitati a, 24-Propilidene colesterolo, Beta sitosterolo, Campesterolo, Dipalmitina, Eicosanolo e / o Glicidolo stearato.

In una ancora preferita forma di realizzazione dell'invenzione, la sottopopolazione di EV di origine vegetale è derivata da piante selezionate dal gruppo costituito da: la famiglia delle Rutacee, come il genere Citrus; la famiglia delle Rosaceae, come il Malus pumila; la famiglia delle Vitaceae, come la Vitis vinifera; la famiglia delle Brassicaceae, come l’Anastatica hierochuntica; la famiglia delle Selaginellaceae, come la Selaginella lepidophylla; la famiglia delle Asteraceae, come la Calendula officinalis; la famiglia Oleaceae, come Olea europaea; la famiglia Xanthorrhoeaceae, come l'Aloe vera; la famiglia Nelumbonaceae, come Nelumbo; la famiglia Araliaceae, come il sottogenere Panax; la famiglia Lamiaceae, come la Lavandula; la famiglia Hypericaceae, come Hypericum perforatum; la famiglia Pedaliaceae, come Harpagophytum procumbens; la famiglia Ginkgoaceae, come il Ginkgo biloba; la famiglia Piperaceae, come Piper kadsura o Piper fu-tokadsura; la famiglia delle Rubiacee, come Hedyotis diffusa. Esempi non limitativi di piante del genere Citrus sono limone, arancia, mandarino, clementine, bergamotto, pompelmo, pomello.

Lo scopo dell'invenzione include composizioni contenenti EV derivate da una singola specie di pianta sia composizioni contenenti EV derivate da una pluralità di specie di pianta.

Le EV usate nella presente invenzione sono caratterizzate dal fatto che esse mostrano un’attività pro-angiogenica, anti-infiammatoria, anti-ossidante, anti-batterica e / o anti-fibrotica. Nell'ambito della presente descrizione, l'espressione "effetto pro-angiogenico" è intesa come la promozione della proliferazione delle cellule endoteliali o della formazione dei vasi da parte delle cellule endoteliali e del rilascio di mediatori pro-angiogenici in vitro o in vivo. L'angiogenesi è un processo biologico fondamentale e il suo deficit è coinvolto nella patogenesi di diverse malattie, tra cui ulcere ischemiche, quali ulcere da pressione, ulcere arteriose, ulcere venose, ulcere diabetiche, ulcere essudative, ulcere dismetaboliche, ustioni, fistole. Di conseguenza, le EV usate nella presente invenzione sono particolarmente utili nel trattamento di tali malattie. Le vescicole extracellulari di origine vegetale e con effetto pro-angiogenico utilizzate nella presente invenzione sono preferibilmente di origine vegetale Citrus: limone, arancio, mandarino, clementina, bergamotto, pompelmo, pompia; dalla famiglia delle Rutaceae, come Citrus; dalla famiglia delle Rosaceae, come Malus pumila; dalla famiglia delle Vitacee, come la Vitis vinifera; dalla famiglia delle Brassicaceae, come Anastatica hierochuntica; da Selaginella lepidophylla; dalla famiglia delle Asteraceae, come la Calendula officinalis; dalla famiglia delle Oleaceae, come Olea europaea; dalla famiglia delle Xanthorrhoeaceae, come l'Aloe vera, dalla famiglia Nelumbonaceae, come Nelumbo; dalla famiglia Araliaceae, come il sottogenere Panax; dalla famiglia delle Lamiaceae, come la Lavandula; dalla famiglia delle Hypericaceae, come Hypericum perforatum; dalla famiglia delle Pedaliaceae, come Harpagophytum procumbens; dalla famiglia delle Ginkgoaceae, come il Ginkgo biloba; dalla famiglia delle Piperaceae, come Piper kadsura o Piper futokadsura; dalla famiglia delle Rubiacee, come Hedyotis diffusa.

All'interno della presente descrizione, il termine "infiammazione" indica una complessa risposta biologica dei tessuti corporei a stimoli dannosi, come patogeni, cellule danneggiate o sostanze irritanti. L'infiammazione è una risposta protettiva che coinvolge le cellule immunitarie, i vasi sanguigni e mediatori molecolari. Di conseguenza, l'espressione "effetto antiinfiammatorio" comprende qualsiasi effetto volto a ridurre l'infiammazione riducendo lo stress ossidativo, la vasodilatazione e l’aumento di permeabilità vascolare, la risposta del sistema immunitario, il rilascio di mediatori proinfiammatori in vitro o in vivo. L'infiammazione è un processo biologico fondamentale e la sua compromissione è coinvolta nella patogenesi di diverse patologie, incluse psoriasi, cheratosi, cheratiti, ustioni, fistole, ragadi, lesioni della mucosa (come lesioni traumatiche dovute a protesi e tali, diabete, boccali, da decubito, lesioni della mucosa genitale), lesioni infette (come infezioni da virus, infezioni da herpes, infezioni batteriche), ulcere (incluse diabetica, arteriosa, venosa, dismetabolica, essudativa, ischemica, da pressione), danni corneali/ malattie degli occhi (incluse ulcere, lesioni traumatiche, lesioni da degenerazione, abrasioni, lesioni chimiche, problemi da lenti a contatto, lesioni ultraviolette, cheratiti), secchezza oculare, congiuntiviti, dermatite (compresa acne, eczema, dermatite seborroica, dermatite atopica, dermatite da contatto, eczema disidrotico, neurodermatite, dermatite erpetiforme), ferite chirurgiche, alopecia androgenetica, prurito, danno cellulare indotto da farmaci pro-apoptotici volti a trattare lesioni precancerose (ad es. cheratosi attinica). Di conseguenza, le EV usate nella presente invenzione sono particolarmente utili nel trattamento di tali malattie. Le vescicole extracellulari di origine vegetale con effetto anti-infiammatorio e antiossidante utilizzate nella presente invenzione sono preferibilmente derivate da piante Citrus: limone, arancio, mandarino, clementina, bergamotto, pompia; dalla famiglia delle Rutaceae, come Citrus; dalla famiglia delle Rosaceae, come Malus pumila; dalla famiglia delle Brassicaceae, come Anastatica hierochuntica; da Selaginella lepidophylla; dalla famiglia delle Asteraceae, come la Calendula officinalis; dalla famiglia delle Oleaceae, come Olea europaea; dalla famiglia delle Xanthorrhoeaceae, come l'Aloe vera, dalla famiglia Nelumbonaceae, come Nelumbo; dalla famiglia Araliaceae, come il sottogenere Panax; dalla famiglia delle Lamiaceae, come la Lavandula; dalla famiglia delle Hypericaceae, come Hypericum perforatum; dalla famiglia delle Pedaliaceae, come Harpagophytum procumbens; dalla famiglia delle Ginkgoaceae, come il Ginkgo biloba; dalla famiglia delle Piperaceae, come Piper kadsura o Piper futokadsura; dalla famiglia delle Rubiacee, come Hedyotis diffusa.All'interno della presente descrizione, l'espressione "effetto antimicrobico" è intesa per indicare qualsiasi effetto in grado di uccidere i microbi, effetto microbicida, o in grado di inibire la crescita batterica, batterio-statica. Le infezioni batteriche sono comuni e causano patologie e complicanzioni della ferita, incluse le lesioni della mucosa (come lesioni traumatiche dovute a protesi e tali, diabetiche, boccali, da decubito, lesioni della mucosa genitale), lesioni infette (come infezioni da virus, infezioni da herpes, infezioni batteriche), ulcere (incluse diabetica, arteriosa, venosa, dismetabolica, essudativa, ischemica, da pressione), ustioni, fistole, danni corneali/ malattie degli occhi (incluse ulcere, lesioni traumatiche, lesioni da degenerazione, abrasioni, lesioni chimiche, problemi da lenti a contatto, lesioni ultraviolette, cheratiti), secchezza oculare, congiuntiviti, dermatite (compresa acne, eczema, dermatite seborroica, dermatite atopica, dermatite da contatto, eczema disidrotico, neurodermatite, dermatite erpetiforme), ferite chirurgiche, danno cellulare indotto da farmaci pro-apoptotici volti a trattare lesioni precancerose (ad es. cheratosi attinica). Di conseguenza, le EV usate nella presente invenzione sono particolarmente utili nel trattamento di tali malattie. Le vescicole extracellulari di origine vegetale con effetto antimicrobico utilizzate nella presente invenzione sono preferibilmente derivate da piante Citrus: limone, arancio, mandarino, clementina, bergamotto, pompelmo, pompia; dalla famiglia delle Rutaceae, come Citrus; dalla famiglia delle Rosaceae, come Malus pumila; dalla famiglia delle Vitacee, come la Vitis vinifera; dalla famiglia delle Brassicaceae, come Anastatica hierochuntica; da Selaginella lepidophylla; dalla famiglia delle Asteraceae, come la Calendula officinalis; dalla famiglia delle Oleaceae, come Olea europaea; dalla famiglia delle Xanthorrhoeaceae, come l'Aloe vera, dalla famiglia Nelumbonaceae, come Nelumbo; dalla famiglia Araliaceae, come il sottogenere Panax; dalla famiglia delle Lamiaceae, come la Lavandula; dalla famiglia delle Hypericaceae, come Hypericum perforatum; dalla famiglia delle Pedaliaceae, come Harpagophytum procumbens; dalla famiglia delle Ginkgoaceae, come il Ginkgo biloba; dalla famiglia delle Piperaceae, come Piper kadsura o Piper futokadsura; dalla famiglia delle Rubiacee, come Hedyotis diffusa.

Nella presente descrizione, il termine "fibrosi" è inteso come la formazione di tessuto connettivo fibroso in eccesso in un organo o tessuto in un processo riparativo o reattivo. Questo processo altera il normale processo rigenerativo delle ferite. La fibrosi è simile al processo di cicatrizzazione e coinvolge fibroblasti stimolati che depositano il tessuto connettivo, inclusi collagene e glicosamminoglicani. Il processo inizia quando le cellule immunitarie, come i macrofagi, rilasciano fattori solubili che stimolano i fibroblasti. I mediatori pro-fibrotici includono TGF beta, CTGF, fattore di crescita derivato dalle piastrine (platelet-derived growth factor) (PDGF) e Interleuchina 4 (IL-4). Di conseguenza, l'espressione "effetto anti-fibrotico" comprende qualsiasi processo che possa ridurre la formazione di fibrosi, il rilascio di mediatori pro-fibrotici e / o l’attivazione e proliferazione di fibroblasti in vitro e in vivo. L'eccessiva attivazione di processi pro-fibrotici è importante nell’alterata riparazione delle ferite traumatiche e delle ferite chirurgiche. Di conseguenza, le EV usate nella presente invenzione sono particolarmente utili nel trattamento di tali condizioni. Le vescicole extracellulari di origine vegetale con effetto antifibrotico utilizzate nella presente invenzione sono preferibilmente derivate da piante Citrus: limone, arancio, mandarino, clementina, bergamotto, pompelmo, pompia; dalla famiglia delle Rutaceae, come Citrus; dalla famiglia delle Rosaceae, come Malus pumila; dalla famiglia delle Vitacee, come la Vitis vinifera; dalla famiglia delle Brassicaceae, come Anastatica hierochuntica; da Selaginella lepidophylla; dalla famiglia delle Asteraceae, come la Calendula officinalis; dalla famiglia delle Oleaceae, come Olea europaea; dalla famiglia delle Xanthorrhoeaceae, come l'Aloe vera, dalla famiglia Nelumbonaceae, come Nelumbo; dalla famiglia Araliaceae, come il sottogenere Panax; dalla famiglia delle Lamiaceae, come la Lavandula; dalla famiglia delle Hypericaceae, come Hypericum perforatum; dalla famiglia delle Pedaliaceae, come Harpagophytum procumbens; dalla famiglia delle Ginkgoaceae, come il Ginkgo biloba; dalla famiglia delle Piperaceae, come Piper kadsura o Piper futokadsura; dalla famiglia delle Rubiacee, come Hedyotis diffusa.

Come menzionato sopra, lo scopo dell'invenzione include anche un metodo per caricare una o più molecole biologicamente attive cariche negativamente in una sottopopolazione di vescicole extracellulari (EV) di origine vegetale come sopra definito. Le EV risultanti, caricate con una o più molecole biologicamente attive con carica elettrica negativa, saranno riferite qui di seguito come "EV caricate". Il metodo dell'invenzione si basa sulla formazione di ponti per mezzo di una sostanza policationica tra le EV cariche negativamente e le molecole biologicamente attive cariche negativamente. L'espressione "molecole biologicamente attive cariche negativamente" include, ma non è limitata a, farmaci, molecole di acido nucleico, e molecole liposolubili come le vitamine liposolubili. Le molecole di acido nucleico includono, ma non sono limitate a, molecole di DNA e RNA, incluse per es. miRNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, RNA regolante, RNA non codificante e codificante, frammenti di DNA, DNA plasmidico. Le EV caricate, derivanti dal metodo dell'invenzione, sono in grado di proteggere le molecole biologicamente attive caricate dalla degradazione e di trasferirle alle cellule bersaglio. Le molecole biologicamente attive caricate hanno preferibilmente un potenziale terapeutico.

Il metodo dell'invenzione comprende il mettere a contatto la sottopopolazione di vescicole extracellulari (EV) di origine vegetale come sopra definito con una sostanza policationica e la molecola biologicamente attiva carica negativamente e la loro co-incubazione. Dopo la co-incubazione, le EV vengono purificate dalla sostanza policationica e dalle molecole attive cariche negativamente rimaste libere.

In una prima forma di realizzazione, le EV vengonoprima messe in contatto e co-incubate con la sostanza policationica per consentire il legame della sostanza policationica alla superficie delle EV e quindi la miscela di EV e di sostanza policationica è messa in contatto e co-incubata con le molecole attive cariche negativamente.

In una seconda forma di realizzazione, la sostanza policationica e le molecole attive negativamente cariche sono mescolate insieme e quindi aggiunte alle EV.

Secondo una forma di realizzazione preferita, la sostanza policationica è scelta dal gruppo costituito da protamina, polilisina, destrani cationici, loro sali e loro combinazioni. Un sale di protamina preferito è la protamina idrocloruro.

Come menzionato in precedenza, dopo il caricamento le EV vengono purificate. Le tecniche di purificazione adeguate includono, ma non si limitano a, ultracentrifugazione su gradiente, ultrafiltrazione, diafiltrazione, filtrazione con flusso tangenziale, metodi basati sulla precipitazione, metodi basati sulla cromatografia, concentrazione, tecniche basate sulla cattura per immuno-affinità e tecniche di isolamento basate su microfluidica.

Come verrà illustrato nella seguente sezione esperimentale, gli inventori caricarono le EV con molecole di miRNA sintetico, quindi verificarono mediante l'analisi qRT-PCR che le molecole di miRNA siano state incorporate nelle EV. Con l'analisi qRT-PCR e la microscopia confocale, gli inventori hanno anche verificato che le EV caricate con miRNA sono in grado di trasferire efficientemente il loro contenuto alle cellule bersaglio. L'uso di miRNA di mammiferi non presente nei vegetali consente una valutazione efficiente del caricamento. Inoltre, i miRNA trasferiti alle cellule bersaglio hanno mostrato di essere biologicamente attivi e di influenzare l'espressione degli mRNA bersaglio nelle cellule.

Come menzionato sopra, le EV caricate risultanti dal metodo della presente invenzione possono essere usate per veicolare diverse molecole biologicamente attive con carica elettrica negativa. Per esempio, i miRNA sono coinvolti in diversi percorsi chiave importanti sia nei processi fisiologici che patologici. Alcuni miRNA sono per es. riportati nella letteratura scientifica essere coinvolti nell'angiogenesi tumorale e nei processi rigenerativi e nella guarigione delle ferite. Come dimostrazione dell'efficacia del metodo, le EV sono state caricate efficacemente con miRNA prorigenerativi, come miR-21 e miR-126, e con miRNA anti-angiogenici e anti-tumorali o inibitori di miRNA. Le EV caricate hanno mostrato un’aumentata efficacia rispetto alle EV native.

Di conseguenza, il metodo della presente invenzione può essere utilizzato per produrre EV caricate con aumentati effetti pro-rigenerativi, incluso l’effetto pro-angiogenico, anti-infiammatorio, anti-ossidante, anti-batterico e/o l’effetto antifibrotico, o per aggiungere nuove attività terapeutiche a EV native per scopi pro-rigenerativi, che includono, ma non sono limitati a, effetti antiangiogenici.

In alternativa, il metodo della presente invenzione può essere utilizzato per produrre EV caricate con ridotti effetti biologici, se l'applicazione terapeutica richiede alcuni ma non altri effetti rigenerativi propri delle EV native, ad esempio se si vogliono conservare le proprietà antiinfiammatorie e anti-ossidanti, ma non altre proprietà, come ad esempio la proprietà proangiogenica.

Il metodo della presente invenzione può anche essere usato per modulare l'effetto biologico intrinseco delle EV al fine di ottenere EV caricate con un’attività biologica selezionata e specificamente richiesta su misura.

Il metodo della presente invenzione può essere usato per produrre EV caricate che contengono una o più molecole esogene o EV caricate arricchite con composti endogeni biologicamente attivi. Facoltativamente, il metodo della presente invenzione può essere usato per migliorare l'efficacia del caricamento delle EV usando qualsiasi protocollo volto a introdurre molecole all'interno delle EV, incluse l’elettroporazione, la sonicazione, la trasfezione, l’incubazione, l’estrusione di cellule, la permeabilizzazione mediante saponina, e cicli congelamentoscongelamento. Ad esempio, gli inventori hanno dimostrato che il caricamento delle EV basato sulla protamina associato all'elettroporazione è in grado di aumentare il caricamento.

Il metodo della presente invenzione può anche essere usato in combinazione con il caricamento di EV di origine vegetale caricate con molecole liposolubili. Di conseguenza, la presente invenzione comprende il caricamento di EV di origine vegetale per potenziare il loro effetto nativo sulla rigenerazione cellulare. L'effetto benefico delle EV di origine vegetale può essere migliorato caricando molecole liposolubili, come le vitamine antiossidanti. Le molecole liposolubili, nella loro forma nativa o modificata, sono efficacemente incorporate nelle EV. Pertanto, le EV di origine vegetale possono essere caricate con molecole antiossidanti, come le vitamine A ed E, per aumentare i loro effetti benefici.

Le EV native e quelle caricate sono somministrabili in diversi modi a seconda del sito di destinazione. Per la riparazione della mucosa cutanea ed esterna, le EV possono essere somministrate per via topica, mentre la somministrazione orale è preferibile per raggiungere l'apparato digerente e la mucosa gastrointestinale.

Di conseguenza, la composizione della presente invenzione, che comprende la sottopopolazione di EV di origine vegetale come definito sopra, in cui gli EV sia native o caricate con molecole biologicamente attive cariche negativamente esogene o endogene, può essere fornita come una composizione farmaceutica formulata per es. per applicazione topica, iniezione locale o somministrazione orale, o può essere fornita come preparazione di integratori alimentari. La composizione dell'invenzione può inoltre comprendere matrici idonee per indurre un rilascio controllato delle EV al tessuto danneggiato o delle malattie, stabilizzare le EV e/o migliorare il loro effetto rigenerativo.

Matrici adatte da utilizzare nella presente invenzione sono in grado di incapsulare le EV e rilasciarle in modo controllato, sia in caso di iniezione o applicazione cutanea, o sono in grado di agire come un vettore inerte di molecole bioattive. Matrici adatte includono, ma non sono limitate a, scaffold, film, idrogel, idrocolloidi, membrane, nanofibre, gel e spugne. Per facilitare l’applicazione delle matrici contenenti le EV, la formulazione può essere combinata con dispositivi medici, come cerotti, fili chirurgici, garze.

In generale, le composizioni della presente invenzione formulate per applicazione topica o iniezione locale sono particolarmente utili per promuovere la riparazione dei tessuti, in cui il tessuto è affetto da un’alterata angiogenesi, infiammazione, processi fibrotici aberranti o è esposto a infezione batterica. L'invenzione fornisce l'applicabilità di vescicole extracellulari di origine vegetale come trattamento terapeutico topico che promuove un effetto di rigenerazione su tessuti danneggiati e riparazione cellulare, per es. quando i tessuti danneggiati mostrano alterazioni dell'angiogenesi, infiammazione, fibrosi o sono esposti a infezioni microbiche.

Composizioni secondo la presente invenzione, comprendenti EV di origine vegetale sia native sia caricate, in cui le EV hanno attività proangiogeniche, sono particolarmente utili per il trattamento terapeutico delle ulcere ischemiche, come ulcere da pressione, ulcere arteriose, ulcere venose, ulcere diabetiche.

Composizioni secondo la presente invenzione, comprendenti EV di origine vegetale sia native sia caricate, in cui le EV hanno attività antiinfiammatorie, sono particolarmente utili per il trattamento di patologie cutanee con una componente infiammatoria consistente, come la psoriasi, dermatite (compresa acne, eczema, dermatite seborroica, dermatite atopica, dermatite da contatto, eczema disidrotico, neurodermatite, dermatite erpetiforme), cheratosi, cheratite, danni corneali/ malattie degli occhi (incluse ulcere, lesioni traumatiche, lesioni da degenerazione, abrasioni, lesioni chimiche, problemi da lenti a contatto, lesioni ultraviolette, cheratiti), secchezza oculare, congiuntiviti, alopecia androgenica, prurito.

Composizioni secondo la presente invenzione, comprendenti EV di origine vegetale sia native sia caricate, in cui le EV hanno attività proangiogeniche e anti-infiammatorie, sono particolarmente utili per il trattamento di lesioni caratterizzate da ischemia e infiammazione, come ulcere essudative, ulcere dismetaboliche, ustioni, fistole, ragadi.

Composizioni secondo la presente invenzione, comprendenti EV di origine vegetale sia native sia caricate, in cui le EV hanno attività antiinfiammatoria e anti-batterica, sono particolarmente utili per il trattamento delle lesioni della mucosa (come lesioni traumatiche dovute a protesi e tali, diabetiche, boccali, da decubito, lesioni della mucosa genitale), lesioni infette (come infezioni da virus, infezioni da herpes, infezioni batteriche), ulcere (incluse diabetica, arteriosa, venosa, dismetabolica, essudativa, ischemica, da pressione), ustioni, fistole, ragadi, danni corneali/ malattie degli occhi (incluse ulcere, lesioni traumatiche, lesioni da degenerazione, abrasioni, lesioni chimiche, problemi da lenti a contatto, lesioni ultraviolette, cheratiti), secchezza oculare, congiuntiviti, dermatite (compresa acne, eczema, dermatite seborroica, dermatite atopica, dermatite da contatto, eczema disidrotico, neurodermatite, dermatite erpetiforme), ferite chirurgiche, danno cellulare indotto da farmaci pro-apoptotici volti a trattare lesioni precancerose (ad es. cheratosi attinica).

Le composizioni secondo la presente invenzione, comprendenti EV di origine vegetale sia native sia caricate, in cui le EV hanno attività antifibrotica, sono particolarmente utili per il trattamento di ferite traumatiche e ferite chirurgiche.

La dose della composizione farmaceutica della presente invenzione può variare in base a vari fattori, inclusa l'attività di un composto particolare usato, l'età del paziente, il peso corporeo, la salute generale, il sesso, la dieta, il tempo di somministrazione, la via di somministrazione, il tasso di escrezione, la combinazione di farmaci, e la gravità di una particolare malattia da prevenire o curare, e può essere determinata opportunamente da una persona competente nel settore a seconda delle condizioni del paziente, del peso corporeo, della gravità della malattia, la forma del farmaco, la via di somministrazione e il periodo di somministrazione. Una composizione farmaceutica secondo la presente invenzione può essere formulata come pillole, compresse rivestite di zucchero, capsule, liquidi, gel, sciroppi, fanghi o sospensioni.

Le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione formulate per l’applicazione locale sono efficaci per migliorare la rigenerazione dei tessuti e la riparazione cellulare. Questo sistema di applicazione garantisce un rilascio delle EV localmente efficiente e controllato nel sito della lesione. Inoltre, il sistema di applicazione può anche garantire la stabilizzazione e la conservazione della preparazione di EV. Tali composizioni farmaceutiche per l’applicazione locale di EV native o caricate possono contenere matrici idrocolloidali/idrogel idonee per il sito e il tipo di lesione da trattare. La formulazione ha lo scopo di migliorare la ricostituzione cellulare e / o tissutale. Le composizioni contenenti matrice possono essere aggiustate per soddisfare i requisiti della lesione di interesse (presenza di essudato, ustione, ferita secca, ulcera mucosa, sutura). La stessa matrice può anche supportare l'effetto rigenerativo delle EV e proteggere e migliorare la stabilità delle EV. Le matrici possono essere solide / gelatinose o liquide a temperatura ambiente e preferibilmente includono matrici idrocolloidali / idrogel. Le matrici possono essere create con diversi composti (o le loro modificazioni chimiche) e / o la loro combinazione, e comprendono, ma non sono limitati a chitosano, gelatina, idrossiapatite, collagene, cellulosa, acido ialuronico, fibrina, alginato, ciclodestrina, amido, destrano, agarosio, condroitina solfato, pullulano, protamina, pectina, glicerofosfato ed polimeri sintetici eparinici come poli(etilenglicole) (PEG), poli(acido glicolico) (PGA), poli (alcool vinilico) (PVA), policaprolactone (PCL), poli(D, acido L-lattico) (PDLLA), poli(N-isopropilacrilammide) (PNIPAAm) e copolimeri come poli(D, acido L-lattico-coglicolico) (PDLLGA). Queste molecole possono essere utilizzate nella loro forma nativa o modificata chimicamente. Tali componenti possono essere utilizzati individualmente o in combinazione.

Inoltre, le composizioni farmaceutiche dell'invenzione formulate per l’applicazione locale delle EV native o modificate possono contenere appropriati eccipienti, conservanti, solventi o diluenti secondo il metodo convenzionale. Eccipienti, conservanti, solventi o diluenti includono, ma non sono limitati a, lattosio, agar, destrosio, saccarosio, glicole, sorbitolo, triclosano, alcool benzilico, mannitolo, glicole propilenico, xilitolo, eritritolo, maltitolo, amido, parabeni, gomma arabica, alginato, gelatina, calcio fosfato, silicato di calcio, cellulosa, metilcellulosa, acido salicilico, cellulosa microcristallina, acido sorbico, creolina, polivinilpirrolidone, ammonio quaternario, acido citrico, acido acetico, acido ascorbico, acido borico, acido algenico, metilidrossibenzoato, glicerolo, propilidrossibenzoato, zinco piritìone, talco, solfiti, magnesio stearato, acido benzoico, oli minerali, acido propionico, clorobutanolo, riempitivi, estensori, leganti, agenti bagnanti, disintegranti, tensioattivi, glicole propilenico, glicole polietilenico, oli vegetali come olio d'oliva, etil oleato, witepsol, Macrogol, Tween, burro di cacao, grasso laurino, glicerogelatina, acqua purificata, oli, cere, acidi grassi, alcoli grassi, acidi grassi esterificati, umettanti, addensanti, antiossidanti, stabilizzatori di viscosità, agenti chelanti, tamponi, alcoli inferiori, vitamine, agenti anti-UV, fragranze, coloranti, antibiotici, agenti antibatterici, o agenti antifungini, e simili. Queste molecole possono essere utilizzate nella loro forma nativa o con modifiche chimiche. Tali componenti possono essere utilizzati individualmente o in combinazione. La sottopopolazione originaria o caricata di EV, combinata o meno con le matrici, può anche essere usata come composto attivo in una preparazione cosmetica adatta per l’applicazione topica.

Le EV nella preparazione cosmetica preferibilmente derivano dalla famiglia delle Brassicaceae, come Anastatica hierochuntica; da Selaginella lepidophylla; dalla famiglia delle Asteraceae, come la Calendula officinalis; dalla famiglia delle Oleaceae, come Olea europaea; dalla famiglia delle Xanthorrhoeaceae, come l'Aloe vera, dalla famiglia Nelumbonaceae, come Nelumbo; dalla famiglia Araliaceae, come il sottogenere Panax; dalla famiglia delle Lamiaceae, come la Lavandula; dalla famiglia delle Hypericaceae, come Hypericum perforatum; dalla famiglia delle Pedaliaceae, come Harpagophytum procumbens; dalla famiglia delle Ginkgoaceae, come il Ginkgo biloba; dalla famiglia delle Piperaceae, come Piper kadsura o Piper futokadsura; dalla famiglia delle Rubiacee, come Hedyotis diffusa.

Le proprietà antiossidanti delle EV possono sostenere il rinnovamento cellulare della pelle e promuovere l'effetto anti-età.

Le proprietà antiossidanti delle EV possono contrastare il danno cellulare e tissutale indotto dall'invecchiamento e dalla caduta dei capelli e migliorare le condizioni della pelle.

Inoltre, i preparati cosmetici della presente invenzione possono essere formulati come ammorbidenti della pelle, lozioni nutrienti, essenze nutrienti, creme per massaggi, additivi per acqua da bagno cosmetici, lozioni per il corpo, latte per il corpo, oli da bagno, oli per bambini, polveri per bambini, gel per doccia , creme per la doccia, creme solari, creme abbronzanti, lozioni per la pelle, creme per la pelle, cosmetici anti UV, latti detergenti, agenti per la rimozione dei capelli (per scopi cosmetici), lozioni per viso e corpo, creme per il viso e per il corpo, creme sbiancanti, lozioni per le mani, lozioni per capelli, creme cosmetiche, oli al gelsomino, saponi da bagno, saponi liquidi, saponi cosmetici, shampoo, detergenti per le mani, saponi medicinali (per scopi non medici), saponi crema, lavaggi per il viso, detergenti sistemici, detergenti per il cuoio capelluto, risciacqui per i capelli, saponi da toletta, gel per sbiancamento dei denti, dentifrici e simili. A tal fine, le composizioni cosmetiche della presente invenzione possono inoltre contenere sia un solvente che è convenzionalmente usato nella preparazione di composizioni cosmetiche, sia un trasportatore, eccipiente o diluente adatto.

Le preparazioni cosmetiche della presente invenzione possono inoltre contenere adatti eccipienti, conservanti, solventi o diluenti che sono noti all'esperto del settore. Eccipienti, conservanti, solventi o diluenti includono, ma non sono limitati a, lattosio, agar, destrosio, saccarosio, glicole, sorbitolo, triclosano, alcool benzilico, mannitolo, glicole propilenico, xilitolo, eritritolo, maltitolo, amido, parabeni, gomma arabica, alginato, gelatina, calcio fosfato, silicato di calcio, cellulosa, metilcellulosa, acido salicilico, cellulosa microcristallina, acido sorbico, creolina, polivinilpirrolidone, ammonio quaternario, acido citrico, acido acetico, acido ascorbico, acido borico, acido algenico, metilidrossibenzoato, glicerolo, propilidrossibenzoato, zinco piritìone, talco, solfiti, magnesio stearato, acido benzoico, oli minerali, acido propionico, clorobutanolo, riempitivi, estensori, leganti, agenti bagnanti, disintegranti, tensioattivi, glicole propilenico, glicole polietilenico, oli vegetali come olio d'oliva, etil oleato, witepsol, Macrogol, Tween, burro di cacao, grasso laurino, glicerogelatina, acqua purificata, oli, cere, acidi grassi, alcoli grassi, acidi grassi esterificati, , umettanti, addensanti, antiossidanti, stabilizzatori di viscosità, agenti chelanti, tamponi, alcoli inferiori, vitamine, agenti anti-UV, fragranze, coloranti, antibiotici, agenti antibatterici, o agenti antifungini, e simili. Queste molecole possono essere utilizzate in forma nativa o con modifiche chimiche. Tali componenti possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione.

La sottopopolazione originaria o caricata di EV di origine vegetale, combinata o meno con matrici, può anche essere utilizzata come composto attivo in una preparazione alimentare complementare adatta come integratore alimentare commestibile. Le proprietà antiossidanti delle EV possono supportare il rinnovamento cellulare nel tratto gastrointestinale e proteggere dall'infiammazione.

Di conseguenza, l'invenzione comprende anche una preparazione commestibile contenente EV di origine vegetale native o ingegnerizzate, preferibilmente derivate dalla famiglia delle Brassicaceae, come Anastatica hierochuntica; da Selaginella lepidophylla; dalla famiglia delle Asteraceae, come la Calendula officinalis; dalla famiglia delle Oleaceae, come Olea europaea; dalla famiglia delle Xanthorrhoeaceae, come l'Aloe vera, dalla famiglia Nelumbonaceae, come Nelumbo; dalla famiglia Araliaceae, come il sottogenere Panax; dalla famiglia delle Lamiaceae, come la Lavandula; dalla famiglia delle Hypericaceae, come Hypericum perforatum; dalla famiglia delle Pedaliaceae, come Harpagophytum procumbens; dalla famiglia delle Ginkgoaceae, come il Ginkgo biloba; dalla famiglia delle Piperaceae, come Piper kadsura o Piper futokadsura; dalla famiglia delle Rubiacee, come Hedyotis diffusa.

Le proprietà antiossidanti delle EV possono migliorare diverse condizioni che coinvolgono lo stress ossidativo (come le malattie infiammatorie, la sindrome metabolica e il diabete).

La preparazione di integratori alimentari può essere formulata in diverse forme somministrabili per via orale, incluse polveri, granuli, compresse, capsule, sospensioni, emulsioni, sciroppi, aerosol. In aggiunta, l'integratore alimentare della presente invenzione può contenere vari nutrienti, vitamine, minerali (elettroliti), aromi come aromi sintetici e aromi naturali, coloranti, acido pectico e suo sale, acido alginico e il suo sale, acidi organici, addensanti protettivi colloidali, agenti regolatori del pH, stabilizzanti, conservanti, glicerina, alcool, agenti carbonizzanti usati nelle bevande gassate, ecc. Tali componenti possono essere usati individualmente o in combinazione.

La preparazione di integratori alimentari dell'invenzione può inoltre contenere eccipienti, conservanti, solventi o diluenti adatti noti all'esperto del ramo. Eccipienti, conservanti, solventi o diluenti includono, ma non sono limitati a, lattosio, agar, destrosio, saccarosio, glicole, sorbitolo, triclosano, alcool benzilico, mannitolo, glicole propilenico, xilitolo, eritritolo, maltitolo, amido, parabeni, gomma arabica, alginato, gelatina, calcio fosfato, silicato di calcio, cellulosa, metilcellulosa, acido salicilico, cellulosa microcristallina, acido sorbico, creolina, polivinilpirrolidone, ammonio quaternario, acido citrico, acido acetico, acido ascorbico, acido borico, acido algenico, metilidrossibenzoato, glicerolo, propilidrossibenzoato, zinco piritìone, talco, solfiti, magnesio stearato, acido benzoico, oli minerali, acido propionico, clorobutanolo, riempitivi, estensori, leganti, agenti bagnanti, disintegranti, tensioattivi, glicole propilenico, glicole polietilenico, oli vegetali come olio d'oliva, etil oleato, witepsol, Macrogol, Tween, burro di cacao, grasso laurino, glicerogelatina, acqua purificata, oli, cere, acidi grassi, alcoli grassi, acidi grassi esterificati, , umettanti, addensanti, antiossidanti, stabilizzatori di viscosità, agenti chelanti, tamponi, alcoli inferiori, vitamine, agenti anti-UV, fragranze, coloranti, antibiotici, agenti antibatterici, o agenti antifungini, e simili. Queste molecole possono essere utilizzate in forma nativa o con modifiche chimiche. Tali componenti possono essere usati singolarmente o in combinazione.

ESEMPI

La seguente sezione sperimentale è fornita a puro titolo illustrativo e non è intesa a limitare lo scopo dell'invenzione come definito nelle rivendicazioni allegate. Nella seguente sezione sperimentale, si fa riferimento alle figure allegate, in cui:

La figura 1 mostra la caratterizzazione di EV di origine vegetale nell'esempio sperimentale 1 per EV derivate da A) Limone, B) Arancio, C) Uva, D) Anastatica hierochuntica ed E) Selaginella lepidophylla. Immagine rappresentativa di un’analisi Nanosight e fotogrammi di microscopia elettronica a trasmissione di EV (ingrandimenti originali: x40.000 e x120.000) hanno mostrato una dimensione tipica di EV di origine vegetale.

La figura 2 mostra il contenuto proteico di EV di origine vegetale nell'esempio sperimentale 1 espresso come nanogrammi (ng) di proteine per 10<8 >EV isolate da mela, limone, arancia, uva, Anastatica hierochuntica e Selaginella lepidophylla.

La figura 3 mostra i risultati dell'attività antiossidante di EV di origine vegetale nell'esempio sperimentale 2. Gli inserti mostrano micrografie rappresentative di cellule endoteliali coltivate in normoglicemia e utilizzate come controllo (CTR) o coltivate in condizioni iperglicemiche costanti (HG), o intermittenti (INT HG) o trattate con EV (HG/INT HG EV). Le EV derivate dall'arancio sono state utilizzate alla dose di 50.000 EV/cellula. I nuclei delle cellule sono stati colorati con DAPI (blu) e le proteine ossidate con 2,4-DNPH immunomarcato (rosso). Le immagini sono state scattate da un microscopio confocale fluorescente Zeiss a 600x ingrandimenti. Il grafico mostra l'intensità media della fluorescenza normalizzata (CTCF ± SEM) espressa come variazione nei confronti di CTR. N = 4 esperimenti sono stati effettuati per ogni set di dati. Il significato statistico è stato calcolato confrontando HG/INT HG vs CTR ($) e HG/INT HG EV vs HG / INT HG (*). p: *, $ <0,05; **, $$ <0,01; ***, $$$ <0,005; ****, $$$$ <0,001.

La Figura 4 mostra i risultati della promozione della migrazione delle cellule endoteliali in vitro mediata da EV di origine vegetale nell'esempio sperimentale 3. Il grafico mostra la percentuale di chiusura della ferita (media ± SEM) rispetto alle cellule di controllo (CTR) misurate con il test del graffio (scratch test). Le cellule sono state trattate con tre diverse dosi di EV derivate dall'arancio: 10.000 EV / cellula (EV 10k), 50.000 EV / cellula (EV 50k), 100.000 EV / cellula (EV 100k). N = 4 esperimenti sono stati eseguiti per ciascun set di dati e il fattore di crescita endoteliale (EGF) alla dose di 10 μM è stato utilizzato come controllo positivo. La significatività statistica è stata calcolata confrontando ciascuna condizione con CTR. p: * <0,05; ** <0,01; *** <0,005; **** <0,001.

La figura 5 mostra i risultati della capacità delle EV di origine vegetale di promuovere l'angiogenesi nell'esempio sperimentale 3. Le cellule endoteliali sono state stimolate con EV derivate da limone, arancia, uva, Anastatica hierochuntica (AH) e Selaginella lepidophylla (SL) (100.000 EV / cellula) ed è stata eseguito un test di tubulogenesi. Sono stati eseguiti n = 4 esperimenti per ciascun set di dati e il Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) alla dose di 10 μM è stato utilizzato come controllo positivo. Il significato statistico è stato calcolato confrontando ciascuna condizione con CTR. p: * <0,05; ** <0,01; *** <0,005; **** <0,001.

La figura 6 mostra i risultati della promozione da parte di EV di origine vegetale della proliferazione cellulare testata su cellule endoteliali stimolate dall'ipossia nell'esempio esperienziale 3. Le cellule endoteliali sono state incubate in condizioni ipossiche per 24 ore e quindi trattate con tre diverse dosi di EV derivate da arancio (10.000 (10k) o 30.000 (30k) o 50.000 (50k) o 100.000 (100k) EV/cellule) per ulteriori 24 ore. La proliferazione è stata testata mediante incorporazione di BrdU e l'analisi è stata eseguita comparando rispetto le cellule di controllo (CTR).

EGF 10 μM è stato usato come controllo positivo (CTR ). Il significato statistico è stato calcolato confrontando ciascuna condizione con il CTR. p: * <0,05; ** <0,01; *** <0,005; **** <0,001.

La Figura 7 mostra i risultati della capacità delle EV di origine vegetale di promuovere la migrazione cellulare e la chiusura della ferita in vitro nell'esempio sperimentale 4. Il grafico mostra la percentuale di chiusura della ferita (media ± SEM) rispetto alle cellule di controllo (CTR). Le cellule sono state trattate con EV derivate da Limone, Arancia, Uva, Anastatica hierochuntica (AH) e Selaginella lepidophylla (SL) (100.000 EV / cellula). N = 4 esperimenti sono stati eseguiti per ciascun set di dati. La significatività statistica è stata calcolata confrontando ogni condizione con CTR. p: * <0,05; ** <0,01; *** <0,005; **** <0,001. La Figura 8 mostra i risultati di EV di origine vegetale nella regolazione negativa di geni profibrotici nei fibroblasti in un modello in vitro di fibrosi nell'esempio sperimentale 5. Le cellule epiteliali murine pretrattate con acido aristolochico 100 μM per 4 ore sono state cocoltivate con fibroblasti murini in presenza o assenza di EV di origine vegetale (50.000 EV / cellula) per 5 giorni a 37 ° C. Le analisi qRT-PCR hanno rivelato una regolazione positiva dei marcatori genici di fibrosi: (A) α-SMA, (B) TGFβ e (C) Col1agene 1 in fibroblasti messi in coltura con cellule epiteliali murine stimolate con acido aristolochico (CTR-). Il trattamento con EV di origine vegetale ha significativamente regolato negativamente tutti e tre i geni pro-fibrotici rispetto al controllo. Le cellule normali sono state utilizzate come controllo positivo (CTR ). p: * <0,05, ** <0,01, *** <0,005, **** <0,001.

La Figura 9 mostra i risultati degli effetti prorigenerativi in vivo di EV di origine vegetale nell'uomo nell'esempio sperimentale 6. Le EV derivate dall'arancio sono state usate per trattare un danno cutaneo indotto da Ingenolo mebutato (ingenolo-3-angelato, Picato) utilizzato per il trattamento topico di una lesione precancerosa, la cheratosi attinica. Sono mostrate immagini rappresentative delle lesioni tissutali: la lesione prima (Figura 9A) e dopo (Figura 9B) un trattamento di tre giorni con EV di origine vegetale in confronto a una lesione non trattata prima (Figura 9C) e dopo (Figura 9D) tre giorni.

La figura 10 mostra i risultati delle misurazioni di carica delle EV nell'esempio sperimentale 7. Il potentiale Z (mV), indice di carica delle particelle, è stato misurato in EV derivate dall'arancio (EV) e EV ingegnerizzate con protamina 1,0 μg / ml (EV protamina). Risultati derivati da tre esperimenti effettuati in triplicato. **** p <0,001.

La figura 11 illustra il metodo di modificazione delle EV nell'esempio sperimentale 7. L'invenzione consiste nell'utilizzare una molecola carica positivamente (come la protamina) come un ponte per il legame di molecole biologicamente attive con carica elettrica negativa (per esempio miRNA) per concentrare le molecole sulla superficie delle EV. La figura 12 mostra i risultati della presenza di miRNA in EV ingegnerizzate nell'esempio sperimentale 7. Grafico di amplificazione ottenuto mediante analisi qRT-PCR di EV derivate dall’arancio native (EV CTR), EV ingegnerizzate con protamina e miRNA umano sintetico, miR-145, miR-221 o miR-223 (EV PROT miR-145 / miR-221 / miR-223). L'espressione dei miRNA è rappresentata come ΔRn, la grandezza del segnale derivato dall'amplificazione del miRNA, rispetto al numero di cicli.

La figura 13 mostra i risultati della protezione delle molecole ingegnerizzate (miRNA) dopo il trattamento con un enzima degradante l’RNA (RNAsi) nell'esempio sperimentale 7. Le EV derivate dall'arancio ingegnerizzate con il miRNA miR-221 sono state trattate con una concentrazione fisiologica di RNAsi (0,2 μg / ml) e l'espressione del miRNA è stata valutata mediante qRT-PCR nelle EV di controllo (EV), EV ingegnerizzate con protamina e miRNA (EV+PROT+miR-221) e miRNA libero (miR-221). I dati sono riportati come Ct grezzi(A) e come percentuale di inibizione nei confronti dei campioni non trattati (B). p: **** <0,001.

La figura 14 mostra l'incorporazione di EV in cellule bersaglio usando la microscopia confocale nell'esempio sperimentale 8. Le cellule endoteliali (TEC) sono state trattate per diversi tempi (30 min.

6 ore) con EV derivate dall’arancio ingegnerizzate marcate con fluorescenza (30.000 EV/cellule) ed analizzate mediante microscopia confocale per rilevare il loro ingresso nelle cellule bersaglio. Micrografia rappresentativa delle cellule trattate con EV marcate (EV CTR), o con EV marcate per 30 minuti e 6 ore. Le membrane delle EV, i miRNA, i nuclei delle cellule sono stati colorati rispettivamente con PKH26 rosso, FITC verde, DAPI blu. (Ingrandimento originale: x 630)

La figura 15 mostra il trasferimento diretto di miRNA ingegnerizzati nelle cellule bersaglio e la loro funzionalità nell'esempio sperimentale 8. Le cellule endoteliali (TEC) sono state coltivate con mezzo di coltura normale (CTR), EV native derivate dall'arancio (EV), EV derivate dall'arancio ingegnerizzate con protamina e miRNA miR-221 (EV+PROT+mimic-221) o “scramble” miRNA (EV+PROT+scramble) o antimiR-29a (EV+PROT+antimir-29a) (30.000 EV/cellula). A) Il trasferimento dei miRNA nelle cellule bersaglio è stato valutato mediante analisi qPT-PCR usando RNU6B come miRNA “house keeping” e le cellule coltivate senza stimoli come controllo. I dati sono presentati come valori RQ e confrontati con il CTR. B) Effetto sull’mRNA target Collagen4A3 dopo il trattamento con EV ingegnerizzate con il miRNA (antimir-29a). Valutazione dell'attività del miRNA sul suo mRNA target di collagen4 isoforma A3 dopo 72 ore. Le cellule sono state co-incubate con EV ingegnerizzate con l’antimiR-29a (EV+PROT+antimir-29a) (30.000 EV/cell) o medium normale (CTR) e l'espressione del Collagen4A3 è stata valutata mediante qRT-PCR. I dati sono presentati come valori RQ. I dati vengono presentati come valori RQ e confrontati con CTR. p: *** <0,005.

La figura 16 mostra l'analisi dimensionale delle EV ingegnerizzate con dosi decrescenti di protamina nell'esempio sperimentale 9. Analisi al NanoSight di EV di controllo derivate dall’arancio (EV CTR), EV modificate con protamina (dose iniziale, 1,0 μg/ml) e dosi inferiori: 1,0 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml. Dopo la co-incubazione con il miRNA (miR-221), l'analisi delle EV è stata valutata come media A) moda B) delle dimensioni delle EV modificate. I dati sono stati confrontati con EV CTR. p: * <0,05.

La figura 17 mostra i risultati dell'espressione del miRNA nelle EV dopo l'ingegnerizzazione e la sua incorporazione nelle cellule bersaglio utilizzando una dose inferiore di protamina nell'esempio sperimentale 9. A) Le EV derivate dall'arancio sono state ingegnerizzate con una dose inferiore di protamina (1,0 ng / ml) e il miRNA miR-221 e analizzate per il loro contenuto di miRNA esogeno. I dati, ottenuti con l'analisi qRT-PCR, sono espressi come valori RQ, usando RNU6B come gene “housekeeping” e normalizzati con EV native (EV CTR). p: ** <0,01. B) Le EV derivate da arancio sono state ingegnerizzate con protamina (1,0 ng/ml) e miRNA miR-221 o miRNA scramble, e co-incubati con cellule endoteliali (TEC) per 24 ore. La presenza di miRNA ingegnerizzato è stata misurata nelle cellule bersaglio mediante qRT-PCR e presentata come RQ in cellule coltivate con medium normale (CTR), EV normali (EV) o EV ingegnerizzate utilizzando protamina e miRNA scramble (EV+PROT+scramble) o miR-221 (EV+PROT+miR-221). p: * <0,05.

La figura 18 mostra il miglioramento dell'effetto pro-rigenerativo delle EV native di origine vegetale dopo l’ingegnerizzazione con miRNA pro-rigenerativi nell'esempio sperimentale 10. Il grafico illustra l’aumentata migrazione dei cheratinociti e mostra la percentuale di chiusura della ferita (media ± SEM) rispetto alle cellule di controllo (CTR). Le cellule sono state trattate con tre diverse dosi di EV native derivate da arancio: 10.000 EV/cellula (EV 10k), 50.000 EV/cellula (EV 50k), 100.000 EV/cellula (EV 100k) e una dose di 50.000 EV/cellula di EV più protamina (1,0 ng/ml) (EV P) ed EV più protamina e miR-21 (EV miR-21). EGF (10 μM) è stato usato come controllo positivo. N = 4 esperimenti sono stati eseguiti per ciascun set di dati. La significatività statistica è stata calcolata confrontando ciascuna condizione con CTR.

La figura 19 mostra l'acquisizione di nuove funzioni biologiche dopo l’ingegnerizzazione con miRNA nell'esempio sperimentale 11. Le EV derivate dall'arancio sono state ingegnerizzate con diversi miRNA anti-angiogenici e testati sulla formazione di vasi di cellule endoteliali (TEC) utilizzando il test della tubulogenesi. Le TEC sono state coltivate con terreno normale (CTR), EV native (EV), EV ingegnerizzate con protamina (EV+protamina) o EV ingegnerizzate con protamina (1,0 ng/ml) e un miRNA anti-angiogenico sintetico (antimiR per miRNA proangiogenici e miR per miRNA anti-angiogenici). Gli “scrambles” sono miRNA di controllo. Dopo 24 ore di trattamento, è stata misurata la lunghezza totale dei vasi e viene riportata la percentuale della lunghezza totale rispetto alle cellule normali (CTR). p: * <0,05, ** <0,01, *** <0,005, **** <0,001. La figura 20 mostra i risultati dell'attività biologica delle EV ingegnerizzate con due differenti dosi di protamina nell'esempio sperimentale 12. Le EV derivate dall'arancio sono state ingegnerizzate con due differenti dosi di protamina (1,0 μg/ml; 1,0 ng/ml) e diversi miRNA anti-angiogenici (antimiR-29a, miR-145, miR-221). Sono state usate EV modificate per trattare le cellule endoteliali (TEC) e la formazione di vasi è stata valutata rispetto alle cellule di controllo (CTR) e alle cellule coltivate con EV native (EV). La lunghezza totale è indicata come percentuale rispetto alle cellule di controllo p: * <0,05, *** <0,005, **** <0,001.

La figura 21 illustra l’aumento di internalizzazione di molecole usando il metodo di ingegnerizzazione delle EV descritto nel presente brevetto e l'aggiunta di un comune metodo di trasfezione nell'esempio sperimentale 13. Il legame di una molecola di carica negativa (come i miRNA) alle EV aumenta il numero di molecole sulla superficie delle EV e aumenta il loro caricamento dopo un protocollo di trasfezione, come l'elettroporazione. Infatti, il numero elevato di molecole sulla superficie delle EV consente un potenziamento del caricamento all'interno delle EV dopo il riarrangiamento della membrana che favorisce la rotazione del miRNA all'interno delle EV.

La figura 22 mostra i risultati del miglioramento dell'ingegnerizzazione delle EV utilizzando una combinazione del metodo di modifica descritto nel presente brevetto e l'aggiunta di un comune metodo di trasfezione nell'esempio sperimentale 13. Le cellule endoteliali (TEC) sono state stimolate per 24 ore e la formazione dei vasi è stata misurata utilizzando il test della tubulogenesi. Gli stimoli erano il medium di coltura normale (CTR), EV native derivate dall’arancio (EV), EV ingegnerizzate con protamina (1,0 ng/ml) e miRNA miR-221 (EV+PROT+miR-221), EV elettroporate con miR-221 (EV+miR-221 electroporated) ed EV elettroporate dopo incubazione con protamina (1,0 ng/ml) e miRNA miR-221 (EV+PROT+miR-221 elettroporate). La formazione dei vasi è stata valutata come percentuale della formazione di vasi rispetto alle cellule normali (CTR). p: * <0,05, ** <0,01.

Materiali e metodi

Isolamento di vescicole extracellulari

Le vescicole extracellulari sono state isolate dal succo di arancia. I frutti sono stati spremuti e il succo è stato filtrato sequenzialmente usando un ordine decrescente di pori per rimuovere le fibre. Le EV sono state quindi purificate con due metodi diversi: 1) l'ultracentrifugazione differenziale e 2) la filtrazione a flusso tangenziale. Per l'ultracentrifugazione differenziale il succo è stato prima centrifugato a 1500 g per 30 minuti per rimuovere i detriti e altri contaminanti. Quindi, le EV sono state purificate mediante una prima centrifugazione a 10.000 g seguita da un’ultracentrifugazione a 100.000 g per 1 ora a 4°C (Beckman Coulter Optima L-90K, Fullerton, CA, USA). Il pellet finale è stato risospeso con soluzione salina tamponata con fosfato addizionata con DMSO all'1% e filtrato con filtri da 0,22 micrometri per avere un prodotto sterile. Le vescicole extracellulari sono state utilizzate subito o conservate a -80 °C per lungo tempo. Per la filtrazione a flusso tangenziale, il succo è stato prima sottoposto ad una filtrazione preliminare per rimuovere particolati e fibre e quindi processati con colonne da 300 o 100 kDa di cutoff. Le EV purificate sono state caratterizzate mediante NTA (nanoparticle tracking analysis) e microscopia elettronica.

Nanoparticle tracking analysis (NTA) Nanoparticle tracking analysis (NTA) è stato utilizzato per definire la dimensione e il profilo delle EV utilizzando lo strumento NanoSight LM10 (NanoSight Ltd., Amesbury, Regno Unito), dotato di un laser a 405 nm e del software di analisi NTA 3.1. I movimenti browniani delle EV presenti nel campione sottoposto a una sorgente di luce laser sono stati registrati da una telecamera e convertiti in parametri di dimensione e concentrazione dall'NTA attraverso l'equazione di Stokes-Einstein. La sensibilità della telecamera era settata per tutte le acquisizioni a 16 e per ciascun campione sono stati registrati cinque video della durata di 30 secondi. In breve, le EV purificate e le EV ingegnerizzate sono state diluite (rispettivamente 1: 1000 e 1: 200) in 1 ml di soluzione salina priva di vescicole (Fresenius Kabi, Runcorn, Regno Unito). Le impostazioni di post-acquisizione NTA sono state ottimizzate e mantenute costanti per tutti i campioni, e ogni video registrato è stato quindi analizzato per misurare la media, la moda e la concentrazione di EV.

Microscopia elettronica a trasmissione

La microscopia elettronica a trasmissione delle EV è stata eseguita caricando un campione di EV su retini di carbonio rivestiti con nickel (200 mesh) (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA). Le EV sono state quindi fissate con una soluzione contenente gluteraldeide al 2,5% e saccarosio al 2% e dopo ripetuti lavaggi in acqua distillata, i campioni sono stati colorati negativamente con NanoVan (Nanoprobes, Yaphank, NK, USA) ed esaminati al microscopio elettronico a trasmissione (JEM 1010 Jeol, Tokio, Japan).

Colture cellulari

Le cellule endoteliali microvascolari umane (HMEC) sono state ottenute mediante immortalizzazione con simian virus 40 di cellule endoteliali microvascolari dermiche primarie umane. Come controllo (CTR) sono state utilizzate HMEC coltivate con terreno basale endoteliale a normale concentrazione di glucosio (EBM, Lonza, Basel, CH). La concentrazione di glucosio del terreno EBM era 5,6 mM. Terreni EBM con alte concentrazioni di glucosio e di mannitolo contenevano 28 mM di α-D-glucosio (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) o 28 mM di mannitolo (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Il modello iperglicemico costante (HG) è stato ottenuto coltivando le HMEC in EBM ad alta concentrazione di glucosio per 7 giorni. Il modello iperglicemico intermittente (INT HG) è stato ottenuto coltivando le HMEC con cicli alternati di 48 ore in EBM ad alta concentrazione di glucosio o in EBM ad alta concentrazione di mannitolo come controllo osmotico e in EBM a concentrazione normale di glucosio, per 7 giorni.

I cheratinociti umani immortalizzati (HaCat) sono stati coltivati con DMEM (Lonza, Basel, Switzerland) addizionato con 10% di siero bovino fetale (FBS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a 37 ° C con il 5% di CO2. Le cellule sono state seminate a densità 3,5x10<2 >cellule / cm<2>, utilizzando 1 ml di terreno/cm<2 >ed espanse quando la confluenza cellulare era del 70-80%. In breve, le fiasche sono state lavate con soluzione tampone HEPES, incubate con soluzione di tripsina per 6 minuti e poi la tripsina è stata neutralizzata con terreno contenente FBS al 10%. Se le cellule non erano completamente staccate entro 7 minuti, è stata ripetuta l'incubazione con tripsina.

Le cellule endoteliali derivate da carcinoma renale umano (TEC) sono state isolate da campioni di carcinomi renali di tipo a cellule chiare utilizzando anticorpi anti-CD105 legati a biglie magnetiche e usando un selezionatore di cellule magnetico con il sistema MACS (Miltenyi Bio-tec, Auburn, CA, USA). Le linee cellulari TEC sono state stabilite e mantenute in coltura nel terreno basale completo Endogro (Merck Millipore, Billerica, MA, USA). Le TEC erano state precedentemente caratterizzate come cellule endoteliali per morfologia, positività per il fattore di von Willebrand (vWF), il CD105, il CD146 e la caderina vascolare endoteliale e negatività per la citocheratina e la desmina.

Le cellule epiteliali murine sono state isolate da topi C57 femmine sane. La sospensione cellulare è stata seminata in una flasca T25 (Becton Dickinson) con DMEM addizionato di l-glutammina (5 mM), penicillina (50 UI /ml), streptomicina (50 μg /ml) e 10% FCS. Le cellule epiteliali murine sono state caratterizzate in base alla loro positività per citocheratina, actina, fosfatasi alcalina, aminopeptidasi A e megalina e per la negatività per vWF, CD45, nefrina e desmina.

I fibroblasti murini sono stati isolati da topi CD1 maschi sani. I fibroblasti erano positivi per i marcatori mesenchimali quali: vimentina e α-SMA, come per la proteina specifica dei fibroblasti 1 (FSP1). Inoltre l'espressione della pancitocheratina, marcatore delle cellule endoteliali/epiteliali è risultata negativa e l’espressione della desmina, marcatore di cellule muscolari lisce, è risultata minima, confermando l’assenza di contaminazione da parte di queste cellule.

Analisi delle proteine

Le proteine sono state estratte dalle EV mediante lisi con tampone RIPA (NaCl 150 nM, Tris-HCl 20 nM, dodecil solfato di sodio allo 0,1%, desossicolato all'1%, Triton X-100 all'1, pH 7,8) addizionato con un cocktail di inibitori delle proteasi e delle fosfatasi (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). La concentrazione proteica è stata quantificata con il kit BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) seguendo il protocollo della casa produttrice. In breve, 10 μl di campione sono stati dispensati nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti e la concentrazione totale di proteine è stata determinata utilizzando una curva lineare standard stabilita con albumina di siero bovino (BSA).

Analisi dello stress ossidativo

Dopo cinque giorni di coltura in condizione che mima l’iperglicemia (concentrazione di glucosio 28 mM), le cellule endoteliali (HMEC) sono state piastrate su vetrini con 8 pozzetti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a una densità di 10<4 >cellule/pozzetto con AF in terreno EBM (adattato o meno a 28 mM di glucosio) e lasciate aderire. Quindi il terreno è stato sostituito con DMEM (Euroclone, Pero, MI, IT) adattato o meno a 28 mM di glucosio e integrato con il 10% di FBS ultracentrifugato (Thermo Fisher Scientific, Wal-tham, MA, USA). Le cellule sono state trattate con EV alla dose di 10.000 EV/cellula. Al 7 ° giorno di condizionamento iperglicemico, le cellule sono state lavate con PBS, fissate con metanolo freddo e le proteine carbonili generate dallo stress ossidativo sono state marcate con 2,4-dinitrofenilidrazina (DNPH) dal kit OxyICC (Merck Millipore, Darmstadt, D), secondo le istruzioni del produttore. DNPH è stato rilevato da un anticorpo coniugato con perossidasi e la streptavidina è stata utilizzata come substrato. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Tutti i reagenti sono stati forniti dal kit OxyICC (Merck Millipore, Darmstadt, D). La localizzazione è stata eseguita con un microscopio confocale a fluorescenza (Zeiss, Oberkochen, D) con ingrandimento 60x. L'intensità della fluorescenza è stata misurata dal software ImageJ 1.49v (NIH) ed è stata calcolata la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF).

“Scratch Test” in vitro

I cheratinociti (HaCaT) e le cellule endoteliali (HMEC) sono stati seminati a una densità di ~ 50x10<3 >cellule/pozzetto in piastre da 24 pozzetti con DMEM addizionato di FCS al 10%. Quando le cellule hanno raggiunto la completa confluenza, il terreno è stato sostituito con un terreno senza FCS per tutta una notte. Il giorno seguente, con un puntale sterile sono state praticate delle incisioni o graffi sulla superficie della coltura. Prima della stimolazione (t=0), sono state riprese immagini della coltura nei pozzetti con un microscopio Leica (Leica, Wetzlar, Germania). Le cellule sono state quindi stimolate con DMEM con FBS o EGF al 10% come controlli positivi (CTR ) o con le EV (10.000 (10k) o 50.000 (50k) o 100.000 (100k) EV/cellula bersaglio). La “rimarginazione o chiusura della ferita" è stata monitorata per 48 ore utilizzando il microscopio Leica e le immagini sono state analizzate dal software ImageJ (Bethesda, MD, USA) osservando la diminuzione dell'area della ferita delle cellule stimolate con EV rispetto alle cellule non stimolate con le EV.

Saggio fibrotico in vitro

Al fine di studiare gli effetti delle EV di origine vegetale su un modello di fibrosi in vitro, le cellule epiteliali murine precedentemente trattate con acido aristolochico sono state co-coltivate con fibroblasti in transwell. In breve, 1,5 × 10<4 >cellule epiteliali murine in precedenza seminate in “transwell” da 24 pozzetti (poro 1,0 μm) (Thermo Fisher Scientific) sono state incubate con acido aristolochico 100 μM per 4 ore. Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate e co-coltivate con fibroblasti (2 × 10<4 >cellule pre-seminate 24 ore prima della co-coltura) per 5 giorni a 37 ° C. Per esperimenti selezionati, le EV di origine vegetale sono state addizionate ai fibroblasti in co-coltura con cellule epiteliali murine incubate con acido aristolochico a una concentrazione di 50.000 EV/cellula. Dopo 5 giorni di incubazione, i fibroblasti sono stati analizzati con qRT-PCR per valutare l’espressione di geni pro-fibrotici (quali α-Sma, Tgfb1, Col1a1). I fibroblasti co-coltivati con cellule epiteliali murine normali sono serviti come controlli positivi.

Saggio di angiogenesi in vitro

La formazione in vitro di strutture simili a capillari è stata studiata su Matrigel senza fattori di crescita (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA) in piastre da 24 pozzetti. Le TEC (25.000 cellule/pozzetto) sono state seminate in pozzetti rivestiti di Matrigel in terreno EndoGRO MV-VEGF contenente EV (30.000 EV/cellule bersaglio) in triplicato. L’organizzazione delle cellule in Matrigel è stata ripresa con una Nikon Eclipse TE200.

Dopo incubazione per 24 ore, le immagini a contrasto di fase (ingrandimento ×10) sono state registrate e la lunghezza totale delle strutture formanti un reticolo è stata misurata utilizzando il software ImageJ. La lunghezza totale per campo è stata calcolata in cinque campi casuali ed espressa in percentuale rispetto al corrispondente controllo. Misurazione della carica elettrica delle EV L'analisi è stata eseguita con lo strumento Zetasizer (Malvern Instruments, Malvern, UK). Tutti i campioni sono stati analizzati a 25°C in soluzione salina filtrata (cutoff = 200 nm). Il potenziale zeta (piano di slittamento) si genera a quella distanza dalla particella che indica il grado di repulsione elettrostatica tra particelle adiacenti e con carica simile in una dispersione. Il potenziale Zeta negativo indica un alto grado di dispersione delle particelle.

EV ingegnerizzate con protamina

Le EV sono state trattate con protamina (1,0 μg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e incubate a 37°C per 5-30 minuti per consentirne il legame sulla loro superficie. Sono state utilizzate varie dosi di protamina (1,0 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml). Successivamente, molecole di miRNA sintetico (100 pmol/ml) (miRNA mimic o antimiR, Qiagen, Hilden, Germania) con carica negativa sono state aggiunte alla miscela e co-incubate a 37°C per 3 ore. La miscela è stata diluita con soluzione salina e conservata a 4°C durante la notte. L’ultracentrifugazione a 100.000 g per 2 ore a 4 ° C (Beckman Coulter Optima L-90K, Fullerton, CA, USA) ha permesso l'eliminazione delle molecole in eccesso e libere di miRNA e di protamina, e il pellet ottenuto è stato risospeso con PBS addizionato con DMSO all'1% e filtrato con filtri da 0,22 micrometri per renderlo sterile.

Trattamento con RNAsi

Le EV sono state trattate con RNAsi A (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), utilizzando una concentrazione di 0,2 μg/ml, per 30 minuti a 37 ° C. L'inibitore dell’RNAsi (Thermo Fisher Scientific, Wal-tham, MA, USA) è stato utilizzato per arrestare la reazione come descritto dal protocollo del produttore e le EV sono state lavate con ultracentrifugazione a 100.000 g per 1 ora a 4 ° C (Beckman Coulter Optima L- 90K, Fullerton, CA, USA).

Microscopia confocale

Per dimostrare l'incorporazione delle EV nelle cellule, le EV sono state trattate con PKH26, un colorante fluorescente rosso che si intercala con i lipidi delle membrane (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e ingegnerizzate con un siRNA marcato con un fluoroforo verde (FITC) (Qiagen, Hilden, Germania). Le EV marcate sono state usate per trattare le TEC seminate in piastre da 24 pozzetti (30.000 cellule/pozzetto) per differenti tempi (30 min, 1h, 3h, 6h, 18h, 24h). L’incorporazione delle EV è stata analizzata mediante microscopia confocale (Zeiss LSM 5 Pascal, Carl Zeiss, Oberkochen, Germania).

Estrazione di RNA

L'RNA totale è stato isolato dalle EV e dalle cellule con il kit miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Germa-ny) secondo il protocollo del produttore. La concentrazione di RNA dei campioni è stata quantificata mediante spettrofotometro (mySPEC, VWR, Radnor, PA, USA).

Analisi di miRNA e di mRNA mediante qRT-PCR

Per l'analisi dei miRNA, è stato utilizzato miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germania). In breve, i campioni di RNA sono stati retrotrascritti utilizzando il kit miScript Reverse Transcription e il cDNA è stato quindi utilizzato per rilevare e quantificare i miRNA di interesse. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato utilizzando 3 ng di cDNA per ciascuna reazione come descritto dal protocollo del produttore (Qiagen). Per l'analisi di mRNA, il cDNA è stato ottenuto utilizzando il kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosys-tems). Sono stati aggiunti cinque nanogrammi di cDNA al SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems) e sono stati processati nel sistema PCSt Quantico 12K Flex Real-Time PCR (qRT-PCR) da 96 pozzetti (Thermo Fisher Scientific, Wal-tham, MA, USA). GAPDH è stato usato come un gene housekeeping. Il “fold change” (Rq) nell'espressione di miRNA tra tutti i campioni è stato calcolato come 2-ΔΔCt rispetto ai campioni di controllo.

Elettroporazione delle EV

L'elettroporazione è stata eseguita utilizzando il Neon Transfection System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) seguendo il protocollo del produttore. Per ogni elettroporazione, il volume del campione è stato fissato a 200 μL.

Esperimenti in vivo

Ingenolo mebutato (ingenolo-3-angelato, Picato) è stato utilizzato per il trattamento topico di lesioni pre-cancerose indotte da cheratosi attinica. Il farmaco è stato applicato per 3 giorni sulle lesioni da cheratosi attinica rimuovendo la lesione pre-cancerosa ma determinando la formazione di lesioni apoptotiche dei tessuti. Dopo il trattamento, EV derivate dall'arancio sono state somministrate per via topica su una lesione tissutale, mentre una lesione non trattata sullo stesso paziente è stata utilizzata come controllo. L'effetto delle EV di origine vegetale è stato valutato dopo 3-7 giorni di trattamento.

Analisi statistica

L'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il software Graph Pad Demo versione 6.01. I risultati sono espressi come media ± errore standard (SEM). L'analisi della varianza a una via (ANOVA) è stata utilizzata per evidenziare le differenze statistiche tra i gruppi, mentre il test t di Student è stato utilizzato per il confronto tra due campioni. Abbiamo usato p <0,05 come livello minimo di significatività. p: * <0,05, ** <0,01, *** <0,005, **** <0,001.

Risultati / Esempi

Esempio 1

Per studiare la fattibilità del metodo della presente invenzione, gli inventori hanno usato EV purificate da diverse piante, tra cui limone, arancia, uva, Anastatica hierochuntica e Selaginella lepidophylla. Le EV sono state isolate mediante microfiltrazione e ultracentrifugazione differenziale o filtrazione del tangenziale (Tangential Flow Filtration) e hanno mostrato una dimensione nell'intervallo di 25-350 nm mediante l'analisi Nanosight (Figura 1). Inoltre, tutte le EV di origine vegetale hanno mostrato una morfologia circolare delimitata da una membrana elettrondensa, come dimostrato dall'analisi alla microscopia elettronica (Figura 1).

Per esaminare il contenuto delle vescicole extracellulari di origine vegetale, il contenuto proteico delle vescicole extracellulari isolate da mela, arancio, limone, uva, Anastatica hierochuntica e Selaginella lepidophylla è stato misurato utilizzando il saggio BCA. I risultati sono mostrati nella Figura 2 e dimostrano un contenuto proteico eterogeneo per le EV come illustrato nella Tabella 1.

Tabella 1. Contenuto Proteico delle EV.

Inoltre, analisi più approfondite hanno dimostrato che le EV di origine vegetale contengono proteine caratteristiche delle vescicole, come HSP70, HSP80, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (G3PD) e fruttosio-bisfosfato aldolasi 6 (FBA6); e proteine vegetali, come tipo Patellin-3 e la catena pesante della clatrina.

Inoltre, il contenuto lipidico delle EV di origine vegetale ha rivelato un contenuto di lipidi variabile in quantità a seconda della pianta, tra cui 24-Propilidene colesterolo, Beta sitosterolo, Glicidolo stearato, Dipalmitina, Campesterolo, Eicosanolo, Eicosano, Esadecano, Esadecanolo, Octadecanna, Octadecanol, Tetradecane, Tetradecene, Valencene e stearato.

Esempio 2

Inoltre, l'attività antiossidante delle EV native di origine vegetale è stata valutata su un modello in vitro di stress ossidativo indotto da elevato glucosio. Le cellule endoteliali coltivate in condizioni iperglicemiche costanti (HG) o intermittenti (INT HG) hanno mostrato un aumento significativo della percentuale di proteine ossidate rispetto al controllo normo-glicemico (CTR). Il trattamento 24 ore con EV derivate dall'arancio ha indotto una riduzione significativa della percentuale di proteine ossidate in entrambi i modelli. La Figura 3 mostra i risultati utilizzando EV derivate da arancio. In particolare, è stata misurata una riduzione dell'intensità della fluorescenza rilevata come proteina ossidata dopo il trattamento con EV in confronto a controlli in condizioni di iperglicemia costante (HG) o intermittente (INT HG). Inoltre, le proprietà antiossidanti delle EV sono state significativamente migliorate mischiando le EV con molecole antiossidanti liposolubili, come le vitamine A ed E. Esempio 3

È stata testata la capacità delle EV di origine vegetale di promuovere la migrazione delle cellule endoteliali e l'angiogenesi. Eseguendo un graffio su un monostrato di cellule endoteliali, i presenti inventori hanno osservato un tasso di migrazione significativamente più elevato di cellule endoteliali usando diverse dosi di EV di origine vegetale rispetto al controllo negativo (CTR) (Figura 4), dimostrando che le EV di origine vegetale possono promuovere la migrazione delle cellule endoteliali e sostenere l'angiogenesi.

Inoltre, la capacità delle EV di origine vegetale di promuovere la formazione dei vasi è stata valutata mediante un saggio di angiogenesi in vitro per verificare il loro effetto sulla formazione di strutture simil-vascolari (test di tubulogenesi). I risultati mostrati nella figura 5 hanno dimostrato che tutte le EV di origine vegetale testate hanno significativamente promosso la formazione di nuovi vasi stimolando le cellule endoteliali, promuovendo così l'angiogenesi.

Inoltre, la capacità delle EV di origine vegetale di promuovere la proliferazione delle cellule endoteliali è stata testata dopo il danno ipossico in vitro. Differenti dosi di EV derivate dall'arancio hanno promosso significativamente il tasso di proliferazione cellulare rispetto al controllo negativo (CTR), dimostrando l'effetto benefico delle EV sulle cellule endoteliali (Figura 6).

Esempio 4

Le EV di origine vegetale sono state analizzate per il loro effetto sulla chiusura delle ferite su colture di cheratinociti. La stimolazione delle cellule con EV di origine vegetale ha mostrato una significativa promozione della chiusura della ferita promuovendo la migrazione dei cheratinociti (Figura 7).

Esempio 5

Le EV di origine vegetale sono state analizzate per la loro attività anti-fibrotica e antimicrobica. Per l’effetto anti-fibrotico, le cellule epiteliali murine esposte all'acido aristolochico sono state coltivate con fibroblasti in un sistema “transwell” per indurre un danno fibrotico (CTR-). Le cellule sono state stimolate con EV di origine vegetale per verificare il loro effetto. L'espressione dei geni pro-fibrotici α-Sma, Tgfb1, Collagene 1 è stata valutata mediante esperimenti qRT-PCR per verificare l'induzione della fibrosi. È interessante notare che le EV di origine vegetale hanno ridotto l’aumento dell’espressione dei geni pro-fibrotici, dimostrando un effetto anti-fibrotico simile a quello delle cellule normali (CTR ) (Figura 8). Per l’effetto antimicrobico, la maggior parte dei batteri patogeni associati alle lesioni umane infette hanno bisogno di un valore di pH> 6 e la loro crescita è inibita da valori di pH più bassi. Le EV di origine vegetale mostrano un basso pH compreso tra 4 e 5. L'applicazione di EV di origine vegetale sulla superficie della lesione crea un ambiente acido sfavorevole per la crescita e la moltiplicazione dei batteri patogeni, come Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Citrobacter spp., S. epidermidis, S. pyogenes, streptococchi e enterococchi. L'applicazione delle EV di origine vegetale è efficace per eliminare i batteri patogeni da lesioni infette abbassando il pH. In effetti, il trattamento con EV di origine vegetale ha ripristinato il pH medio della superficie della pelle (che normalmente va da circa 4,2 a 5,6) restaurando l'attività antimicrobica naturale della pelle. Inoltre, è stato dimostrato che la diminuzione del pH aumenta l'attività antibatterica di altri farmaci contro i batteri gram-positivi e gram-negativi.

Esempio 6

Le EV di origine vegetale sono state analizzate per il loro effetto terapeutico in vivo. Le EV di origine vegetale sono state usate per trattare un danno alla pelle umana indotto da Ingenolo mebutato Ingenolo mebutato (ingenolo-3-angelato, Picato). Questa sostanza è un induttore della morte cellulare ed è stata utilizzata per il trattamento topico di una lesione precancerosa, la cheratosi attinica. I risultati illustrati nella Figura 9 mostrano la lesione prima (Figura 9A) e dopo (Figura 9B) un trattamento di tre giorni con EV di origine vegetale in confronto a una lesione simile ma non trattata prima (figura 9C) e dopo (figura 9D) i tre giorni. Le EV di origine vegetale hanno mostrato un effetto terapeutico in una lesione pro-apoptotica indotta da ingenolo mebutato, promuovendo la rigenerazione dei tessuti dopo tre giorni rispetto alla lesione non trattata.

Esempio 7

Al fine di modificare le EV di origine vegetale con un metodo basato sull'interazione di carica, le EV di origine vegetale sono state analizzate per la loro carica superficiale. L'analisi del potenziale Zeta è stata eseguita su preparazioni diverse che mostrano che le EV derivate dall’arancia hanno una carica negativa di -13,59 ± 1,83 mV (Figura 10). Le EV derivate da altre piante hanno mostrato una carica negativa simile. È interessante notare che le EV derivate da arancio, co-incubate con un “linker” con carica positiva come la protamina, e lavati con ultracentrifuga, hanno dimostrato un aumento significativo della loro carica, suggerendo una modifica della loro superficie (Figura 10).

Per studiare il metodo per arricchire molecole con carica negative sulla superficie delle EV usando un “linker” con carica positiva, le EV di origine vegetale così modificate utilizzando la protamina sono state mescolate con molecole di miRNA come illustrato nella Figura 11. Ad esempio, EV da arancio modificate in superfice usando protamina come “linker” sono state mescolate con differenti miRNA sintetici (miR-145, miR-221, miR-223) e l'analisi mediante qRT-PCR ha dimostrato un chiaro arricchimento di questi miRNA nelle EV rispetto al controllo (Figura 12), suggerendo un efficiente legame di queste molecole alle EV. Di interesse, i miRNA associati alle EV risultano essere protetti dalla degradazione da parte di concentrazioni fisiologiche di RNasi presenti nei fluidi biologici, conferendo così stabilità biologica. La figura 13A mostra la completa inattivazione del miRNA libero mediante il trattamento RNasi, mentre il miRNA associato alle EV rimane protetto dall'inattivazione, in confronto alle EV native che non esprimono il miRNA. La percentuale di inibizione di miRNA in tutti i campioni è mostrata nella Figura 13B.

Esempio 8

Al fine di capire se le molecole ingegnerizzate possono essere trasferite efficientemente alle cellule bersaglio, è stato analizzato il trasferimento di molecole ingegnerizzate alle cellule bersaglio mediate da EV di origine vegetale. In primo luogo, le EV derivate dall’arancio sono state marcate con PKH26 (colorante fluorescente rosso) e sono state ingegnerizzate con un siRNA sintetico fluorescente FITC (verde). Le EV ingegnerizzate sono state co-incubate per tempi diversi (30 min, 1h, 3h, 6h, 18h, 24h) con cellule endoteliali umane derivate da carcinoma renale (TEC). L'analisi mediante microscopia confocale ha rivelato che la presenza dei piccoli acidi nucleici sulla superficie delle EV non altera il loro assorbimento da parte delle cellule bersaglio. La Figura 14 mostra le cellule di controllo (CTR) colorate in blu per i nuclei e che il trattamento con le EV aumenta il segnale fluorescente nelle cellule bersaglio già dopo 30 minuti di coincubazione, con il maggiore assorbimento raggiunto a 6 ore (Figura 14). Inoltre, il trasferimento efficiente dei miRNA ingegnerizzati sulle EV è stato dimostrato anche dal loro assorbimento da parte dalle cellule bersaglio. A tale scopo, le cellule TEC sono state trattate con EV derivate dall'arancio modificate con il miRNA mimic-221 e analizzate mediante qRT-PCR dopo 24 ore (dose 30.000 EV/cellula). Come mostrato nella Figura 15A, i miRNA sono stati trasferiti efficientemente alle cellule bersaglio attraverso le EV. È stata anche testata la funzionalità della molecola ingegnerizzata nelle cellule bersaglio. A questo scopo, le cellule TEC sono state stimolate con EV derivate dall’arancio ingegnerizzate con anti-miR-29a e l'espressione dell'mRNA del gene bersaglio del miRNA miR-29a è stata misurata nelle cellule mediante esperimenti di qRT-PCR. I risultati hanno dimostrato che i miRNA trasferiti alle cellule bersaglio mediante EV erano anche funzionali e hanno indotto un aumento significativo del gene bersaglio Collagen4A3 (figura 15B).

Esempio 9

Per approfondire l'analisi dell'uso di un “linker” a carica positiva, sono state valutate diverse dosi di protamina per l'ingegnerizzazione delle EV di origine vegetale. Infatti, le molecole cariche positivamente, come la protamina, possono formare micelle attorno a molecole cariche negativamente, come i miRNA. Quindi, EV derivate dall'arancio sono state co-incubate con dosi decrescenti di protamina e con una molecola caricata negativamente rappresentativa, il miRNA miR-221-3p. L'analisi delle dimensioni delle EV eseguite da NanoSight ha misurato la dimensione media e la moda delle EV ingegnerizzate. I risultati hanno mostrato che la quantità iniziale di protamina (1,0 µg/ml) induce un aumento sia della dimensione media che della moda, con una differenza significativa nella media (Figura 16). Tuttavia, questa alterazione nella dimensione delle EV non era presente quando le EV erano coincubate con dosi più basse di protamina (1,0 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml). I risultati hanno suggerito che la quantità iniziale di protamina era una dose eccessiva, portando alla formazione di micelle con una dimensione maggiore rispetto alle EV normali presenti nella preparazione. Per verificare che le dosi più basse di “linker” fossero sufficienti a consentire un'associazione con molecole caricate negativamente, l'espressione delle molecole di miRNA ingegnerizzate è stata misurata nelle EV di origine vegetale e il loro trasferimento è stato valutato in cellule bersaglio. L'analisi qRT-PCR di EV derivate dall'arancio, ingegnerizzate con un miRNA rappresentativo (miR-221-3p) utilizzando una dose inferiore di protamina (1,0 ng/ml), ha dimostrato che il miRNA era efficacemente legato alle EV (Figura 17a). Inoltre, le EV derivate dall'arancio modificate con una dose inferiore di protamina (1,0 ng/ml) sono in grado di trasferire in modo efficiente i miRNA alle cellule bersaglio come dimostrato dall'analisi qRT-PCR delle cellule bersaglio trattate con EV ingegnerizzate(Figura 17b).

Esempio 10

Come esempio rappresentativo del metodo di modifica per migliorare ulteriormente l'attività nativa delle EV di origine vegetale, la modifica delle EV di origine vegetale è stata utilizzata per migliorare la loro attività naturale nel promuovere la chiusura della ferita dei cheratinociti. In questi esperimenti, le EV derivate da arancio sono state ingegnerizzate con il miRNA miR-21 usando la protamina come “linker” carico positivamente. I cheratinociti umani sono stati trattati con tre diverse dosi di EV native, EV incubate con protamina da sola (EV P) come controllo, ed EV con protamina e miR-21 (EV miR-21). EV P ed EV miR-21 sono stati usati alla dose intermedia (50k). La misurazione della chiusura della ferita in ciascuna condizione è stata utilizzata come parametro dell'attività EV. Il grafico nella figura 18 mostra che EV P promuove la chiusura della ferita così come le stesse dosi delle EV native, mentre EV miR-21 promuove un aumento statisticamente significativo della chiusura della ferita, paragonabile a una doppia dose di EV native (EV 100k). I risultati hanno dimostrato che il metodo di modifica può essere utilizzato per aumentare gli effetti terapeutici delle EV di origine vegetale. Esempio 11

Il metodo di modifica può anche essere utilizzato per cambiare l'attività biologica delle EV native di origine vegetale. Le EV di origine vegetale possono essere ingegnerizzate con molecole caricate negativamente che forniscono effetti biologici diversi o nuovi. Come esempio rappresentativo, le EV derivate da arancio sono state modificate con diversi miRNA anti-angiogenici e la loro capacità di inibire l'angiogenesi è stata valutata mediante saggio di tubulogenesi in vitro su cellule TEC. In particolare, le EV sono state ingegnerizzate con miRNA mimic anti-angiogenetici (miR-221, miR-223, miR-145) e con anti-miRNA diretti contro miRNA proangiogenici (miR-29, miR-126, miR-31) e il loro effetto sulla formazione di vasi da parte di cellule endoteliali è stato valutato dopo 24 ore di trattamento (Figura 19). I risultati hanno dimostrato che le EV derivate dell’arancio ingegnerizzate con molecole anti-angiogeniche erano in grado di inibire significativamente l'angiogenesi delle cellule endoteliali in vitro.

Esempio 12

L'effetto terapeutico delle EV di origine vegetale ingegnerizzate è stato valutato utilizzando diverse dosi di un “linker” con carica positiva. Come esempio rappresentativo, le EV derivate dall’arancio sono state ingegnerizzate con due diverse dosi di protamina (1 µg/ml, 1 ng/ml) e tre differenti miRNA anti-angiogenici (antimir-29, miR-145 e miR-221-3p). Le EV modificate sono state utilizzate per stimolare le cellule endoteliali (TEC) per 24 ore e la loro attività è stata valutata mediante saggio di tubulogenesi. I risultati mostrati nella Figura 20 dimostrano che l'attività delle EV ingegnerizzate con una dose inferiore di protamina sono ugualmente o più efficaci, dimostrando l’utilizzo di diverse dosi di un “linker” con carica positiva per modificare in modo efficiente le EV di origine vegetale.

Esempio 13

Il metodo di modifica delle EV di origine vegetale con molecole cariche negativamente può essere ulteriormente migliorato dai protocolli di trasfezione. In effetti, il legame di molecole cariche negativamente (ad esempio i miRNA) alla superficie delle EV attraverso un “linker” carico positivamente (ad esempio la protamina) può facilitare il loro ingresso all'interno delle EV. La vicinanza delle molecole cariche negativamente alle EV può aumentarne l’arricchimento con l’utilizzo di protocolli di trasfezione come l'elettroporazione, come illustrato nella Figura 21. Il “linker” di carica positiva, formando un ponte tra le EV cariche negativamente e le molecole caricate negativamente, determina la concentrazione di queste molecole sulla superfice delle EV e favorisce il “flip”, il rovesciamento, all'interno (Figura 21). È stato inoltre dimostrato che il riarrangiamento della membrana ottenuto con strategie diverse dall'elettroporazione, come la sonicazione, l'estrusione meccanica delle cellule, la permeabilizzazione mediata dalla saponina, e i cicli di congelamento-scongelamento, è in grado di migliorare l’arricchimento delle EV.

Per verificare questa ipotesi, le EV derivate dall’arancio sono state modificate usando la protamina e il miRNA miR-221-3p ed è stata valutata la loro capacità di inibire la formazione dei vasi. La Figura 22 mostra che l'uso di un protocollo di trasfezione, come l'elettroporatione, su EV modificate è in grado di aumentare il loro effetto e migliorare la loro attività inibitoria sulla formazione dei vasi da parte delle cellule endoteliali.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Una composizione comprendente una sottopopolazione di vescicole extracellulari (EV) di origine vegetale, in cui le vescicole extracellulari (EV) di origine vegetale in detta sottopopolazione sono delimitate da una membrana a doppio strato lipidico e sono caratterizzate dal fatto che hanno un diametro incluso tra 10 a 500 nm e mostrano attività pro-angiogenica, anti-infiammatoria, antiossidante, anti-batterica e / o anti-fibrotica, da utilizzare in un metodo terapeutico prorigenerativo.
2. La composizione secondo la rivendicazione 1, in cui le EV hanno un diametro nell'intervallo da 20 a 400 nm, preferibilmente nell'intervallo da 25 a 350 nm.
3. La composizione secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui la sottopopolazione di EV di origine vegetale è derivata da una o più piante selezionate dal gruppo costituito da: dalla famiglia delle Rutaceae, dalla famiglia delle Rosaceae, dalla famiglia delle Vitacee, dalla famiglia delle Brassicaceae, da Selaginella lepidophylla; dalla famiglia delle Asteraceae,; dalla famiglia delle Oleaceae, dalla famiglia delle Xanthorrhoeaceae, dalla famiglia Nelumbonaceae, dalla famiglia Araliaceae, dalla famiglia delle Lamiaceae, dalla famiglia delle Hypericaceae, dalla famiglia delle Pedaliaceae, dalla famiglia delle Ginkgoaceae, dalla famiglia delle Piperaceae, dalla famiglia delle Rubiacee.
4. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui il contenuto di proteine della sottopopolazione di EV è compresa nell'intervallo da 1 a 55 ng/10<9 >EV.
5. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui il contenuto di RNA della sottopopolazione di EV è nell'intervallo da 10 a 60 ng/10<10 >EV.
6. La composizione secondo la rivendicazione 5, in cui la sottopopolazione di EV di origine vegetale è derivata da una o più piante selezionate dal gruppo costituito da: il genere Citrus, tra cui limone, arancia, mandarino, clementina, bergamotto, pompelmo, pompia; Malus pumila; Vitis vinifera; Anastatica hierochuntica; Selaginella lepidophylla; Calendula officinalis; Olea europaea; Aloe vera; Nelumbo; the subgenus Panax; Lavandula; Hypericum perforatum; Harpagophytum procumbens; Ginkgo biloba; Piper kadsura, Piper futokadsura; and Hedyotis diffusa.
7. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui le EV sono caricate con una o più molecole con carica elettrica negativa biologicamente attive selezionate dal gruppo costituito da farmaci, molecole di acido nucleico e molecole lipofiliche, incluse vitamine lipofiliche, in cui le molecole di acido nucleico comprendono miRNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, RNA regolatori, RNA non codificanti e codificanti, frammenti di DNA e/o DNA plasmidico.
8. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui le EV hanno attività pro-angiogenetica, per l'uso nel trattamento terapeutico di una malattia o condizione selezionata dal gruppo che consiste in ulcere ischemiche, come le ulcere da pressione, le ulcere arteriose, le ulcere venose, le ulcere diabetiche, le ulcere essudative, le ulcere dismetaboliche, le ustioni, le fistole, le ragadi.
9. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui le EV hanno attività anti-infiammatoria, per l'uso nel trattamento terapeutico di una malattia o condizione selezionata dal gruppo costituito da psoriasi, dermatite, come acne, eczema, dermatite seborroica, dermatite atopica, dermatite da contatto, eczema disidrotico, neurodermatite, dermatite erpetiforme, cheratosi cheratite, danni corneali e malattie degli occhi incluse ulcere, lesioni traumatiche, lesioni da degenerazione, abrasioni, lesioni chimiche, problemi da lenti a contatto, lesioni ultraviolette e/o cheratiti, congiuntiviti, secchezza oculare, ustioni, fistole, ragadi, ferita chirurgiche, alopecia androgenica, prurito.
10. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui le EV hanno un'attività pro-angiogenica e anti-infiammatoria, per l'uso nel trattamento terapeutico di una malattia o condizione caratterizzata da ischemia e infiammazione, come ulcere essudative, ulcere dismetaboliche, ustioni, fistole, ragadi.
11. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui le EV hanno attività anti-infiammatoria e anti-batterica, per l'uso nel trattamento terapeutico di una malattia o condizione selezionata dal gruppo costituito da lesioni della mucosa incluse lesioni traumatiche dovute a protesi, diabetiche, boccali, da decubito e/o lesioni della mucosa genitale, lesioni infette incluse infezioni da virus, infezioni da herpes e/o infezioni batteriche, ulcere incluse ulcera diabetica, arteriosa, venosa, dismetabolica, essudativa, ischemica e/o da pressione), ustioni, fistole, ragadi, danni corneali e malattie degli occhi incluse ulcere, lesioni traumatiche, lesioni da degenerazione, abrasioni, lesioni chimiche, problemi da lenti a contatto, lesioni ultraviolette e/o cheratiti, congiuntiviti, secchezza oculare, dermatiti incluse acne, eczema, dermatite seborroica, dermatite atopica, dermatite da contatto, eczema disidrotico, neurodermatite, dermatite erpetiforme, ferite chirurgiche.
12. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui le EV hanno un effetto anti-fibrotico, per l'uso nel trattamento terapeutico di ferite traumatiche e/o ferite chirurgiche.
13. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, che è formulata come una composizione farmaceutica adatta per applicazione topica, per iniezione locale o somministrazione orale, oppure è formulata come preparazione di integratori alimentari.
14. Un metodo per caricare una o più molecole biologicamente attive cariche negativamente in una sotto-popolazione di vescicole extracellulari (EV) di origine vegetale, comprendente le seguenti fasi (i) messa in contatto e co-incubazione di una sottopopolazione di vescicole extracellulari (EV) di origine vegetale come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 con una sostanza policationica e una o più molecole biologicamente attive caricate negativamente; e (ii) purificare le EV caricate ottenute nella fase (i) dalla sostanza policationica e dalle molecole biologicamente attive rimaste libere.
15. Il metodo secondo la rivendicazione 14, in cui la sostanza policationica è scelta tra protamina, polilisina, destrani cationici e loro combinazioni.
16. Il metodo secondo la rivendicazione 14 o 15, in cui una o più molecole biologicamente attive cariche negativamente sono selezionate dal gruppo consistente di farmaci, molecole di acido nucleico e molecole lipofiliche, incluse vitamine lipofiliche, in cui le molecole di acido nucleico comprendono miRNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, RNA regolatorio, RNA non codificante e codificante, frammenti di DNA e / o plasmidi di DNA.