KR20130021793A

KR20130021793A - 지방 유래 성체줄기세포 배양액의 나노섬유 또는 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20130021793A
Application number: KR1020110084277A
Authority: KR
Inventors: 이준구; 김동명; 김덕훈; 최지은
Original assignee: 인타글리오주식회사; 김동명; 이준구
Priority date: 2011-08-24
Filing date: 2011-08-24
Publication date: 2013-03-06
Also published as: KR101336474B1

Abstract

본 발명은 화장료 조성물 및 그 제조방법에 대한 것으로서, 보다 구체적으로, 지방 유래 성체줄기세포 배양액의 나노섬유 또는 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

지방 유래 성체줄기세포 배양액의 나노섬유 또는 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법 {Cosmetic Composition Comprising Nano Capsule or Nanofiber Containing Cultured Medium of Adipose-derived Adult Stem Cells and Manufacturing Method Thereof}

줄기세포란 미분화 세포로서, 장기간 동안 분열을 하고 자기 갱신(self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원되는 조직에 따라 배아줄기세포와 성체줄기세포로 분류되는데, 잠재 능력은 배아줄기세포보다 한정적인 단점이 있으나 윤리적 문제가 없고 부작용이 없는 성체줄기세포를 대상으로 많은 치료제가 연구되고 있다.

구체적으로, 성인의 지방세포로부터 분리한 성체줄기세포는 지방조직 내에 존재하는 세포로부터 분리 및 정제과정을 거쳐서 획득이 가능하다. 지방조직의 획득에 대한 과정은 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입의 과정에서 폐기되었던 지방조직을 이용하는 것으로, 추가적인 시술이 필요 없기 때문에 그 유용성이 배가된다. 구체적으로 인간의 지방 조직을 국소마취 하에서 지방흡입으로 수득하고 지방조직의 세포외기질(extracellular matrix)을 콜라게나제(collagenase)로 처리한 후 원심 분리하고 단핵세포, 적혈구 및 여러 가지 세포파편을 분리하여 줄기세포를 얻을 수 있다. 지방흡입수술에서 얻은 흡인된 지방조직에서 얻어지는 지방줄기세포의 양은 300ml 당 1×10⁷개에서 6×10⁸개의 줄기세포가 분리되며, 90% 이상의 생존율을 보인다는 연구가 있으며, 또한 골수줄기세포에 비해 쉽게 배양되고 증식 속도도 빠르며, 세포노화 현상도 늦게 일어남이 보고되어 있다. 또한, 수득한 줄기세포를 다양한 조건에서 배양하여 특정한 배양액을 얻을 수 있다.

줄기세포를 배양하게 되면 줄기세포는 배양액 내로 다양한 물질들을 분비한다. 이 배양액은 여러 연구에서 상당한 생화학적 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 최근에는, 이와 같이 줄기세포를 배양하여 유효물질을 극대화시킨 배양액을 이용하여 기능성 화장품 소재로 이용하려는 시도가 늘어나고 있다.

화장품의 소재로 줄기세포 배양액을 원하는 양을 얻어내기 위해서는 충분한 양의 줄기세포 배양이 이루어져야 한다. 줄기세포는 정상세포로 불사의 세포가 아니기 때문에 계대배양이 지속될수록 유전적 불안정성이 증가하여 한 사람의 지방에서 분리한 줄기세포로 지속적으로 줄기세포 배양액을 생산하는 것은 불가능하다. 정상 줄기세포는 계대배양에 한계가 있고 세포치료제로 사용하는 줄기세포도 통상 5회 이내의 계대 배양된 세포만을 이용하도록 고려하고 있는 실정이다. 그렇기 때문에 출시되는 화장품에 사용되는 줄기세포가 각각 다른 사람 즉 연령과 성별이 다른 환경에서 얻은 지방유래 줄기세포가 사용될 수 있다.

또한, 일부 줄기 세포 화장품은 사람 유래의 동물성 세포나 그 부산물을 이용한다는 점에서 감염 우려와 함께 여러 가지 예측하기 어려운 문제 발생 가능성까지 제기돼 상업화에 어려움을 겪고 있다. 또한, 유럽의 경우는 오래 전부터 사람 유래의 물질이나 관련 부산물을 화장품에 사용할 수 없도록 하고 있어 사람 줄기세포 배양 시 나오는 직접적인 세포나 관련 추출물은 물론 세포 배양액도 사용하지 못하게 하고 있다. 이러한 이유로 세계적으로 수많은 화장품 회사가 줄기세포 화장품 개발, 출시를 준비하고 있지만 안전한 소재 확보의 어려움으로 제품 개발이 늦어지고 있는 실정이다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 인체의 지방을 대체할 줄기세포 소스로 미니돼지가 있다. 미니돼지는 크기가 작고 취급이 용이하여 의학 및 약학 연구 등에 많이 이용되고 있다. 미니돼지를 줄기세포 화장품 원료로 사용할 경우, 동일한 연령과 성별의 개체에서 지방을 얻을 수 있기 때문에 일정하게 화장품 원료를 공급할 수 있다. Qu 등(2007)의 연구에 의하면 돼지의 지방에서 분리한 줄기세포가 지방흡입 시 분리한 지방에서 분리한 중간엽 줄기세포와 다른 종의 지방에서 분리한 중간엽 줄기세포와 비교하였을 때 형태가 유사하며 지방세포, 연골세포, 뼈, 신경으로 분화되는 등 다양한 계열의 분화능도 인체 지방유래 줄기세포와 일치한다고 하였다. 미니돼지의 경우 장기 이식과 약물 연구를 위해 이미 많은 연구가 되고 있고 무균상태에서 사육하는 무균미니돼지를 이용한다면 오염의 위험 없이 안전하고 일정한 줄기세포 화장품의 줄기세포 공급원으로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

이에, 본 발명에서는 바이오기술(biotechnology)을 통하여 미니돼지로부터 줄기세포 배양액을 대량생산하고, 수득한 줄기세포 배양액 생물고분자에 나노기술(nanotechnology)을 융합함으로써 기존 바이오 소재보다 월등한 안전성과 흡수 및 이동성이 좋은 나노-줄기세포배양 기능성 소재를 개발하였다.

이와 관련하여, 대한민국 특허출원 제2005-55017호에는 동종유래 또는 자기유래의 지방세포 또는 줄기세포 또는 이들로부터 분리된 섬유아세포성장인자를 함유하는 주름개선 및 노화방지용 함유하는 화장료 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제848056호 발명은 줄기세포 배양액 또는 그 배양액에서 분리된 단백질을 포함하는 미백용 화장료 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제2007-15211호에는 인간 지방 줄기세포를 항산화제, 비타민, 아미노산 및 무기질이 포함된 무혈청 배지에서 1일 이상 배양하여 수득한 조건배지를 함유하고, 조직 재생용 인간 줄기세포 함유 주사제에 사용되는 주사제용 첨가제가 개시되어 있다. 그러나, 본 발명과 같이 줄기세포 배양액을 나노섬유 또는 나노캡슐화하여 화장료 조성물로 제공된 예는 없다.

본 발명의 목적은 주름개선 및 미백 등에 탁월한 효과가 있는 줄기세포 배양액을 나노섬유화 또는 나노캡슐화 한 바이오 소재를 화장품에 적용하여, 강력한 항산화 효과가 있으면서도 그 효능이 지속적으로 유지될 수 있는 스킨, 로션, 크림 에센스 등 다양한 제형의 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 지방 유래 성체줄기세포 배양액의 나노섬유 또는 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 성체줄기세포는 미니돼지의 지방에서 유래한 것이다.

또한 바람직하게, 상기 지방 유래 성체줄기세포 배양액은 VEGF(Vascular endothelial growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), TGF(transforming growth factor)-β1, HGF(hepatocyte growth factor),KGF(keratinocyte growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor)-AA, PGA(placenta growth factor), 타입 I 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin), SOD(superoxide dismutase), 인터루킨- 6,8,10 및 RANTES 을 포함한다.

상기 조성물은 주름 개선, 미백 또는 항산화용으로 사용될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 포함한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 지방 유래 성체줄기세포 배양액의 나노섬유 또는 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 제조방법은

(1) 지방 유래 성체줄기세포 배양액을 제조하는 단계; 및

(2) 상기 지방 유래 성체줄기세포 배양액을 나노섬유 또는 나노캡슐화하는 단계를 포함한다.

본 발명은 바이오기술을 통하여 미니돼지로부터 줄기세포 배양액을 대량생산하고, 수득한 줄기세포 배양액 생물고분자에 나노기술을 융합함으로써, 기존 바이오 소재보다 월등한 안전성을 가지며 흡수 및 이동성이 좋은 나노-줄기세포 배양액 기능성 화장료 소재를 제공하는 효과가 있다.

도 1은 미니돼지 지방에서 분리한 성체줄기세포를 알카라인 포스페이트 활성을 통하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 지방 유래 성체줄기세포에 대하여 면역조직화학염색법 및 RT-PCR를 통해서 전사인자 OCT4, SOX2 및 NANOG 의 발현을 조사한 결과를 나타낸다.
도 3은 지방 유래 성체줄기세포에 대하여 유세포분리기를 이용하여 중간엽줄기세포 특이적 마커인 CD29, CD44, CD90 및 비멘틴(vimentin)의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 지방줄기세포의 골세포로의 분화를 von Kossa 염색법으로 확인(A) 및 지방줄기세포의 지방세포로의 분화를 oil red O 염색법으로 확인(B)한 결과를 나타낸다.
도 5는 지방줄기세포의 골세포로의 분화를 골 특이적 마커인 오스테오넥틴(osteonectin, ON), 오스테오칼신(osteocalcin,OC), Runx2의 발현을 통해 확인(A) 및 지방줄기세포의 지방세포로의 분화를 지방 특이 마커인 aP2와 PPARγ2의 발현을 통해 확인(B)한 결과를 나타낸다.
도 6은 리놀레인산(linoleic acid, LA)을 도입한 LA-키토산의 제조과정을 나타낸다.
도 7은 N-아세틸화 키토산의 합성방법을 나타낸다.
도 8은 지방줄기세포 배양액을 포함하는 나토캡슐을 나타낸다.
도 9는 전기방사를 통한 나노섬유의 제조과정을 나타낸다.
도 10은 전기방사를 통해 제조한 지방줄기세포 배양액의 나노섬유를 나타낸다.
도 11은 대조군 도포(왼쪽) 및 본 발명 제제 도포(오른쪽)시 주름개선효과를 나타낸 것이다.

본 발명에서 용어, '줄기세포 배양액' 이란 줄기세포를 배양하여 얻은 배지에 포함된 구성 성분을 포함하는 물질로서, 본 발명에서 상기 배양액을 제조하기 위한 줄기세포는 지방 유래의 성체줄기세포임을 특징으로 한다.

줄기세포 배양을 위한 배지는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 α-MEM 배지일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 지방 유래 성체줄기세포 배양액이 나노섬유 또는 나노캡슐화됨을 특징으로 한다. 고분자 다당체 구조인 지방줄기세포 배양액 유래 추출물의 특성상 상기 배양액을 제품에 그대로 사용할 경우 피부 각질층 투과율이 현저히 낮아 피부 진피층에서의 원료의 효능인 엘라스틴 및 콜라겐 생합성 효과를 발현하기 어려운 문제가 있다. 또한, 통상 20 여종 이상의 지용성 원료가 혼입되는 화장품의 특성상 원료 혼합 후 원료 간 상호 반응에 의한 상호작용이 발생하게 되어 원료가 변성되거나 원료물질의 효능이 반감될 수 있다.

이에, 본 발명에서는 줄기세포 배양액 추출물 원료 자체의 피부 흡수력 및 원료 안정성 문제를 극복하기 위하여, 나노기술(nanotechnology)을 융합함으로써 기존 바이오 소재보다 월등한 안전성과 흡수 및 이동성이 좋은 나노-줄기세포 배양액 기능성 화장료 소재를 제공한다.

캡슐화기술(encapsulation technology)은 고체, 액체, 기체 상의 물질을 차폐하거나 특정 조건하에서 조절된 속도로 내용물을 방출할 수 있도록 어떤 물질이나 조직 내부에 포장하는 기술을 말하며, 나노 크기의 포장단위를 나노캡슐(nanocapsule)이라고 한다. 나노캡슐은 수 나노미터(nm) 내지 수백 나노미터로 정의할 수 있다. 바람직하게, 키토산에 기능기를 도입하여 양친성을 부여하여 나노캡슐에 이용할 수 있으며, 이를 이용하여 줄기세포 배양액을 미세입자로 저분자화하여 피부 각질층에서의 흡수율을 높일 수 있다.

또한, 나노섬유는 줄기세포 배양액을 생분해성 고분자와 함께 혼합하여 합성고분자 용액을 제조한 후 전기방사(electrospinning)를 통하여 수 나노미터(nm) 내지 수천 나노미터로 섬유화한 것을 말한다. 또는, 생분해성 고분자 또는 천연 고분자를 포함한 용액을 전기방사를 통하여 나노섬유화한 후 여기에 줄기세포 배양액을 분산시켜 화장료 조성물로 사용할 수 있다. 나노섬유를 구성하는 고분자는, 용도나 사용목적에 따라 선택되지만, 특히 화장품 용도에서는 피부나 인체에 자극을 주지 않는 고분자가 바람직하고, 폴리아미드, 폴리올레핀, 폴리에스테르, 불소계 고분자, 폴리비닐알콜(PVA) 또는 이들의 유도체를 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 주름 개선, 미백 또는 항산화용으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, '주름개선'은 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부의 구조 중에서 진피층에 존재하는 콜라겐 및 엘라스틴이 피부 탄력을 주관하는데, 콜라겐의 생합성은 피부의 내, 외적 영향을 받게 된다. 구체적으로 피부 내적 요인으로는 자연 노화로 인하여 세포 활성이 감소되며, 콜라겐 섬유의 감소가 일어나고, 외적 요인으로는 자외선의 과량 조사 및 스트레스 등으로 인하여 생성된 활성 산소가 단백질의 티올기(thiol: -SH)와 반응하여 효소의 활성을 저해하거나, 콜라겐, 엘라스틴 등을 분해시키는 효소(Matrix Metalloproteinases-1: MMP-1)인 콜라게나아제의 발현을 증가시켜 피부의 주름을 증가시키는 한편 탄력을 감소시키는 결과를 야기한다.

본 발명에서 사용되는 용어, '미백'은 피부의 색을 결정하는 세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 멜라닌 색소를 합성하는 능력을 억제시킴으로써 피부의 색이 어두워지는 것과 관련된 요소이다.

본 발명에서 사용되는 용어, 항산화능은 자외선의 영향으로 반응성이 높은 활성 산소와 자유 라디칼(free radical)에 의한 피부 구성 성분의 산화를 억제하는 기능을 의미한다. 활성 산소와 자유 라디칼은 피부를 구성하는 성분들을 산화시켜 과산화물을 생성하고, 그 결과 피부가 구조적 및 기능적으로 손상되어 노화가 촉진되는데, 본 발명의 항산화 기능은 이로부터 피부를 보호하는 기능을 수행한다. 본 발명의 줄기세포의 배양액을 포함하는 조성물은 상기 자유 라디칼을 불활성화시키는 기능을 수행할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, '화장료 조성물'은 상기 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물로서 그 제형은 어떠한 형태라도 가능하다. 이러한 제형의 예를 들면 상기 화장료 조성물을 이용하여 제조된 화장료는 크림류, 팩류, 로션류, 에센스류, 화장수류, 파운데이션류 및 메이크업 베이스류 등이고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다. 바람직하게, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 정제수, 보습제, 고급알코올, 고급지방산, 연화제(emollient), 킬레이트제, 점증제, 영영성분, pH조절제, 향료 등을 임의로 추가할 수 있다.

본 발명의 상기 지방 유래 성체줄기세포 배양액의 나노섬유 또는 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법은, 바람직하게,

(1) 지방 유래 성체줄기세포 배양액을 제조하는 단계; 및

상기 지방 유래 성체줄기세포 배양액을 제조하는 단계는, 미니돼지의 지방으로부터 성체줄기세포를 분리 및 배양하여 배양액을 수득함으로써 이루어질 수 있다. 줄기세포의 분리 및 배양은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

예컨대, 미니돼지의 복부 및 대퇴부 주위로부터 지방조직을 분리하고 지방조직의 세포외기질을 콜라게나제로 처리한 다음 원심분리하여 고밀도의 줄기세포를 수득할 수 있으며, 이후 세포 여과기를 통하여 기타 조직을 제거하고 단핵 세포만을 분리한 후 비유도성 배양액으로 배양 및 비접착성 세포들을 제거하여 지방줄기세포를 수득할 수 있다.

상기 분리된 지방줄기세포는 당업계에 알려진 기본 배지, 예를 들면, DMEM, MEM, BME, RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM, G-MEM 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등, 바람직하게는 α-MEM 배지를 사용하여 배양할 수 있으며, 배양시킨 후, 배지를 수거한 다음 세포 데브리스(debris)를 제거하고 남은 브로스(broth)를 줄기세포 배양액으로 수득할 수 있다. 결국 상기 배양물에는 배지가 함유하고 있던 주요 성분 및 지방줄기세포의 분비물이 포함되어 있다고 할 수 있다.

다음으로, 지방 유래 성체줄기세포 배양액을 나노섬유 또는 나노캡슐화하는 단계를 수행할 수 있다.

나노캡슐화의 구체적인 바람직한 양태로, 용매증발 방법(solvent evaporation method), 용매치환 방법(solvent displacement method) 또는 유화 용매 확산법(emulsification solvent diffusion), 초임계유체 추출 공정 등을 사용할 수 있다.

용매증발 방법은 물에 섞이지 않은 휘발성 유기용매에 캡슐화하는 물질과 유용성 물질을 용해하고, 이 용액을 응집방지제가 첨가된 수용액에 분산시켜 입자를 형성하게 한 후 휘발성 유기 용매를 증류시켜 입자를 제조하는 것이다. 이 때, 입자의 크기는 분산시킬 때의 교반 속도에 크게 좌우되며, 일반적인 교반기(agitator)를 사용할 경우에는 수 마이크론 단위의 입자가 형성되며, 고속 교반 유화기(homogenizer)를 사용할 경우에는 수백 나노미터의 입자가 형성될 수 있다. 일반적으로 수십 나노수준의 입자를 얻고자 할 경우에는 고압 유화기(high pressure homogenizer)를 사용하여 100나노미터 이하 크기의 입자를 얻을 수 있다. 상기 용매증발방법을 이용할 경우 유기용매는 휘발성이 높은 용매를 사용하며, 구체적인 예로 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 등이 있다.

용매치환 방법 또는 유화 용매 확산법은 물과 섞이는 휘발성 유기용매에 캡슐화하는 물질과 유용성 물질을 용해하고, 이 용액을 응집방지제가 첨가된 수용액에 분산시켜 입자를 형성하게 한 후 휘발성 유기 용매를 증류시켜 입자를 제조하는 것이다. 이 방법은 물과 섞이는 휘발성 유기용매를 사용하기 때문에 물과 유기용매의 공용매상에서의 캡슐화하는 물질과 유용성 물질의 용해도 차이에 의해 입자가 형성되므로, 응집방지를 위한 수용성 계면활성제 및 기타 계면활성제를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 캡슐화된 유용성 활성물질의 안정화를 위해서 소수성 계면활성제를 사용할 수 있다. 상기 용매치환 방법을 이용하여 입자제조시 제조된 입자의 크기에 영향을 미치는 인자는 유기용매와 물의 비율, 사용하는 유기용매에 사용되는 캡슐화제 및 난용성 활성 성분의 농도, 소수성 계면활성제의 양, 친수성 계면활성제의 양, 및 교반속도를 들 수 있으며, 일반적으로 이러한 구성성분 및 방법을 통해서 얻어지는 입자의 크기는 100~300㎚ 사이가 된다.

초임계유체 추출공정은 다른 추출공정에 비하여 입자 내에 독성용매나 계면활성제가 없는 관계로 의약품, 식품, 화장품 등에 널리 사용될 수 있으며, RESS(Rapid Expansion of Supercritical Solutions), GAS(Gas Anti-Solvent), SAS(Supercritical fluid Anti-Solvent), ASES(Aerosol Solvent Extraction System), SEDS(Solution Enhanced Dispersion by Supercritical Fluids), PGSS(Particles from Gas Saturated Solutions), RPSS(Reactive Precipitaion in Supercritical Solution) 방법을 사용할 수 있다.

캡슐화제로 사용하는 생분해성 고분자는 제조된 나노입자가 피부에 침투할 경우 체내 안전성을 고려하여 생체적합성과 생분해성이 우수하여야 하며, 예를 들면 천연 고분자류로서 전분, 키토산, 알긴산, 레시틴, 글루코만난, 폴리사카라이드, 아카시아검, Irish moss, karaya gum, gum tragacanth, gum guaiac, xanthan gum, locust bean gum과 이의 유도체가 가능하며, 카세인, 젤라틴, 콜라겐, 알부민, 글로블린, 피브린 등의 단백질과 이의 유도체, 셀룰로오스, 덱스트린, 펙틴, 전분, 아가, 만난 등의 천연유래 카보하이드레이트류와 이의 유도체, 합성된 고분자로서 폴리비닐류 고분자와 이의 유도체(예: 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르 등), 폴리카르복시산과 이의 유도체(예: 폴리아크린산, 폴리메타크릴산, 폴리메틸메타그릴레이트 등), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 hydrocarbone류와 이의 이성질체, 폴리사카라이드와 이의 유도체( 폴리슈크로즈, 폴리글루코스, 폴리락토스 및 이의 염류) 등이 가능하며, 상기한 고분자들이 가교화된 형태의 고분자들이 가능하다. 천연유래 고분자는 생체적합성이 우수한 것으로 알려져 있으며, 상기한 고분자류는 생체적합성이 우수한 고분자로서 본 발명의 나노입자에 적용이 가능하다.

또한, 예를 들면, 지방산 고분자(예: 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리시트린산, 폴리말린산 등)와 이의 유도체, 폴리-, 알파-, 시아노아크린산과 이의 유도체, 폴리-, 베타-, 히드록시부티르산, 폴리알킬렌 옥살레이트(예 : 폴리메틸렌옥살레이트, 폴리테트라메틸렌옥살레이트 등), 폴리오르소에스터류, 폴리오르소카보네이트류, 폴리카보네이트류(예 : 폴리에틸렌 카보네이트, 폴리에틸렌-프로필렌 카보네이트 등), 폴리아미노산(예 : 폴리감마벤질글루타민산, 폴리알라닌, 폴리감마메틸글루타민산 등) 등이 사용 가능하며, 생체적합성은 뛰어나지만 생분해성은 없는 폴리스티렌, 폴리아크린산과 이의 유도체, 폴리메타크린산과 이의 유도체, 아크린산-메타크린산의 공중합체, 폴리아미드(예 : 나이론), 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리아미노산, 실리콘고분자류, 덱스트란스테아레이트, 에틸셀룰로오스, 아세틸세룰로오스, 니트로세룰로오스, 폴리우레탄, 무수 말레인산 공중합체, 에틸렌-비닐아세테이트 공중합체, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴아미드와 같은 단일고분자 중합체, 두가지 이상의 공중합체 및 상기 고분자의 혼합물이 이용가능하며, 그 유도체와 염류를 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명에서 나노캡슐은 소수성과 친수성을 가지는 양친성 생물고분자로 구성될 수 있다. 바람직하게, 생물고분자인 키토산의 C-2에 리놀레인산(linoleic acid)을 결합시키거나 알킬 무수물(alkyl anhydrides) 또는 할로젠화물(halides)을 결합시켜 N-아실화(N-acylated) 키토산을 합성하여 키토산에 친수성과 소수성을 동시에 갖는 양친성(amphipathicity) 성질을 부여한 다음 O/W 에멀젼 방법 또는 버퍼 용액에 넣어 초음파분해(sonication) 방법으로 나노캡슐을 제조할 수 있다. 이와 같이 제조된 키토산 나노캡슐은 생체 적합성과 분해성, 안정성이 뛰어나 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 전달에 유용하게 이용될 수 있다.

이 외에도, 액정화 기술을 사용하여 고체와 액체의 중간적 성질을 띄는 액정(Liquid Crysta)을 사용하여 유효성분의 피부 내 전달을 촉진시키거나, 수소화된 레시틴(hydrogenated lecithin)을 이용한 2중막의 액정 형성 기술을 사용할 수 있다. 또한, 파우더 입자의 표면을 실리콘 등 다른 원료로 코팅하여 파우더 표면 성질을 개질시켜 사용할 수 있다.

한편, 나노섬유의 경우 줄기세포 배양액을 생분해성 고분자와 함께 혼합하여 합성고분자 용액을 제조한 후 전기방사(electrospinning)를 통하여 제조할 수 있다. 또는, 생분해성 고분자 또는 천연 고분자를 포함한 용액을 전기방사를 통하여 나노섬유화한 후 여기에 줄기세포 배양액을 분산시켜 화장료 조성물로 사용할 수 있다. 전기방사공정은 고분자 용액이나 용융된 고분자를 소정 전압으로 하전 시킬 때 발생하는 전기적 인력 및 척력을 이용하여 섬유를 형성시키는 기술로, 전기방사공정을 이용하여 수 nm ~ 수천 nm 크기의 다양한 직경을 갖는 섬유를 제조할 수 있다. 나노섬유를 구성하는 고분자는, 용도나 사용목적에 따라 선택되지만, 특히 화장품 용도에서는 피부나 인체에 자극을 주지 않는 고분자가 바람직하고, 폴리아미드, 폴리올레핀, 폴리에스테르, 불소계 고분자, 폴리비닐알콜(PVA) 또는 이들의 유도체를 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전기방사를 이용한 나노입자의 제조방법의 예로서, 국내특허등록 제10-0743502호 등을 참고할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 지방유래 중간엽줄기세포의 분리, 배양 및 검정

1-1. 지방줄기세포의 분리 및 배양

지방흡입수술에서 얻은 지방과 미니돼지의 복부 및 대퇴부 주위로부터 지방을 채취하여 콜라게나제(collagenase) 처리를 통하여 단일 세포(single cell)로 분리하였다. 각종 성장인자 (basic fibroblast growth factor, stem cell factor, leukemia inhibitory factor 등)를 첨가한 줄기세포 배양액(ADMEM)에 39℃, 5% CO₂ 에 배양하였다. 지방유래 중간엽줄기세포는 배양 디쉬에 접착력이 있으므로 접착된 세포를 제외한 모든 세포를 제거하여 배양하였다.

1-2. 지방줄기세포의 검증 및 특성

실시예 1-1 에서 분리 및 배양한 세포들을 AP chromogen kit (BCIP/NBT)를 이용하여 염색하여 알카라인 포스페이트 활성(Alkaline phosphate activity)을 확인하였고 (도 1), 면역조직화학염색법(Immunocytochemistry)과 RT-PCR를 통해서 전사인자 OCT4, SOX2 및 NANOG 의 발현을 조사하였다 (도 2). 또한, 중간엽줄기세포 특이 마커를 확인하기 위하여, 유세포분리기를 이용하여 CD29, CD44, CD90 및 비멘틴(vimentin)의 발현 정도를 확인하였다 (도 3).

1-3. 지방줄기세포의 인 비트로 분화능 검증

실시예 1-1 에서 분리 및 배양한 세포들이 70~80% 컨플루언스(confluence)되면, 일부는 DMEM에 10% FBS, 0.1uM 덱사메타손, 50 uM 아스코르베이트-2-포스페이트, 10 mM β-글리세롤 포스페이트가 함유된 배양액에 3주 동안 배양하여 골세포로 분화 유도하였고, 일부는 DMEM에 10% FBS, 1uM dexamethasone, 10uM insulin, 200uM indomethacin 및 500uM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)이 함유된 배양액에 3주 동안 배양하여 지방세포로 분화 유도하였다.

지방줄기세포의 골세포로의 분화는 von Kossa 염색법(도 4A) 및 골 특이 마커인 오스테오넥틴(osteonectin, ON), 오스테오칼신(osteocalcin,OC), Runx2의 발현을 통해 확인하였고(도 5A), 지방줄기세포의 지방세포로의 분화는 oil red O 염색법(도 4B) 및 지방 특이 마커인 aP2와 PPARγ2의 발현을 통해 확인하였다(도 5B).

실시예 2. 줄기세포 배양액 성분 확인

실시예 1-1 에서 분리한 줄기세포를 각종 성장인자(basic fibroblast growth factor, stem cell factor, leukemia inhibitory factor 등)를 첨가한 줄기세포 배양액(ADMEM)에 39℃, 5% CO₂ 에 배양한 다음 일정한 간격으로 배양액을 회수하였다. 배양액의 성분을 확인하기 위하여, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블랏(Western blot assay) 및 RT-PCR 을 통하여 분석하였다.

그 결과, 지방줄기세포 배양액에는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), TGF(transforming growth factor)-β1, HGF(hepatocyte growth factor), KGF(keratinocyte growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor)-AA, PGA(placenta growth factor), 타입 I 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin), SOD(superoxide dismutase), 인터루킨- 6,8,10 및 RANTES 등이 포함되어 있음을 확인하였다. 이 중, 고농도로 함유되어 있는 단백질을 표 1에 정리하였다.

단백질	농도
PDGF	42.31±2.50 pg/mL
bFGF	130.23±30.30 pg/mL
KGF	86.30±20.40 pg/mL
TGF-β1	105.40±1.60 pg/mL
HGF	674.80±85.12 pg/mL
VEGF	802.54±93.23 pg/mL
타입 I 콜라겐	923.42±48.60 ng/mL
피브로넥틴	1460.15±461.23 ng/mL

실시예 3. 줄기세포 배양액의 나노캡슐화 및 나노섬유화

3-1. 양친성 키토산 나노캡슐의 제조

생물고분자인 키토산의 C-2에 EDC 반응을 유도하여 리놀레인산(linoleic acid)을 결합시키거나 알킬 무수물(alkyl anhydrides) 또는 할로젠화물(halides)을 결합시켜 N-아실화 키토산(N-acylated 키토산)을 합성하여 키토산에 친수성과 소수성을 동시에 갖는 양친성(amphipathicity) 성질을 부여하였다.

우선, 키토산(1g)을 1%(w/v) 아세트산 수용액(100ml)와 85ml의 메탄올에 녹였다. 실온에서 리놀레인산을 키토산의 글루코사민 잔기당 0.54mol/mol 비율로 첨가하고, 15ml의 EDC-메탄올 용액 (0.07g/L)을 dropwise 첨가하였다. 24시간 후에 반응용액을 200ml의 메탄올/암모니아 용액(7/3, v/v)에 넣고 교반해주면서 중화시켰다. 형성된 침전물을 필터 하고, 증류수, 메탄올과 에테르로 씻어주고, 실온에서 24시간 동안 진공드라이하여, LA-키토산을 합성하였다 (도 6).

또한, 키토산을 0.6% 아세트산 수용액과 메탄올 혼합용액 200ml에 녹였다. 실온에서 같은 양의 무수물 또는 할로젠화물를 키토산 용액에 dropwise 첨가하고, 5시간 동안 교반하였다. 그리고, 반응용액을 200ml의 메탄올/암모니아 용액(7/3, v/v)에 넣고, 교반해주면서 중화시켰다. 형성된 침전물을 필터하고, 증류수, 메탄올과 에테르로 씻어주고, 실온에서 24시간 동안 진공 드라이하여 N-아실화된 키토산을 합성하였다 (도 7).

3-2. 나노캡슐의 제조

실시예 3-1에서 제조한 양친성 키토산을 사용하여 용매 확산법에 의하여 100-200nm 크기의 나노 담체를 제조하고, 유화제(폴리옥시에틸렌 유형의 유화제, 포화 및 불포화 알킬설페이트, 지방산의 암모늄, 알칸설포네이트, 지방 알콜 포스포레이트, 지방산 부분 글리세라이드, 폴리글리세롤 에스테르, 지방산의 프로필렌 글리콜 에스테르, 지방산의 락테이트)를 혼합한 후 고속 교반 유화기(homogenizer)에서 교반하여, 내부에 지방줄기세포 배양액을 포함하는 용매 크림 등 화장품 제형으로 제조하였다 (도 8)

3-3. 나노섬유의 제조

전기방사장치 나노엔씨 NC-30K 를 이용하여 실시예 2에서 수득한 줄기세포 배양액을 이용하여 나노 섬유를 제조하였다. 제조과정을 도 8에 나타내었으며, 수득한 지방줄기세포 포함 나노섬유를 도 9에 나타내었다.

실시예 4. 화장품 제제의 효능 평가

4-1. 항산화 효능

프리라디칼의 소거작용효과를 관찰하기 위하여 0.2mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl methanol 용액 0.5㎖에 실시예 2에서 제조한 줄기세포 배양액 시료를 여러 농도(중량%)로 넣고 10% 에탄올 용액 1㎖을 첨가하여 섞은 다음 37℃에서 10분간 방치한 후 517nm에서 흡광도(%)를 측정하였다. 하기 표 2은 농도에 따른 각각의 시료들에 대한 프리라디칼 억제율을 나타낸 것이며, 대조군으로서 비타민 C 를 사용하였다.

	1.0	1.4	1.8	2.2	2.6	3.0
줄기세포 배양액 (실시예2)	35	39	50	57	68	71
비타민 C	22	29	40	48	60	66

4-2. 자동산화 억제효과

자동산화가 잘되는 물질인 리놀산을 이용하여 자동산화를 억제하는 정도를 측정하였다. 8㎖ 캡튜브에 10mM 리놀산 용액 3㎖ 와 4㎎/㎖ 로 조정한 시료 0.075㎖ 를 첨가한 후 4℃에서 24시간 방치하였다. 상기의 혼합액 0.1㎖ 를 75% 에탄올 4.7㎖ 에 첨가하여 교반한 후 30% 티오시안산암모늄 용액 0.1㎖ 와 20mM 염화제1철 0.1㎖ 를 첨가하여 3분간 방지한 후 발색시켜 500nm에서 흡수파장을 측정, 시료를 넣지 않은 대조군과 비교하여 항산화효과를 측정하였다. 이 결과는 아래 표 3과 같으며, 대조군으로서 비타민 C 를 사용하였다.

	줄기세포 배양액 (실시예2)	비타민 C
항산화 효과	94%	89%

4-3. 주름 개선 효능

건강한 여성 20명을 대상으로 대조군 제품(생리식염수 1cc)과 실시예 3에서 제조한 나노캡슐 및 나노섬유 제품(1cc)을 피험자에게 하루에 2회(아침, 자기 전) 눈 주위에 도포하도록 한 후, 4주 후 및 8주 후에 주름 완화 효과를 육안으로 관찰하고 그 결과를 표 3 및 도 11에 나타내었다 (단위 : 명).

	현저한 효과	완화 효과	효과없음
대조군	0	0	20
실시예 3의 나노캡슐	7	13	0
실시예 3의 나노섬유	9	11	0

4-4. 미백 효능

미백 실험으로써 본 발명 실시예 3에서 제조한 나노캡슐 및 나노섬유 제품과 경쟁사 제품 A를 실험자 30명(실험자 10명이 1개 그룹)의 얼굴에 도포하였다. 즉, 각각의 그룹군 10명의 얼굴에는 1일 2회 연속 1개월간 본 발명의 시료를 도포하였다. 그리고 같은 방법으로 상기 그룹군 중 1개 그룹의 실험자 얼굴에 경쟁사 제품 A를 도포하였다. 실험완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포부위 피부를 화상분석으로 얼굴색을 비교하여 어두운 색을 5, 중간색을 3, 밝은 색을 1로 정하고 평가하였다. 하기 표 5을 살펴보면, 본 발명의 시료가 경쟁사 제품 A 보다 수치가 낮은 것으로 나타났고 그 미백 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
경쟁사 A 제품	3.5	3.0	3.0	3.5	4.0	3.5	3.5	3.0	3.0	3.0
실시예 3의 나노캡슐	2.0	2.0	2.5	2.0	2.5	2.0	2.0	1.5	1.5	1.5
실시예 3의 나노섬유	1.5	2.0	2.0	2.0	2.0	1.5	2.0	1.5	2.5	2.0

이상에서 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능하며, 그러한 모든 적절한 변경 및 수정의 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되어야 할 것이다.

Claims

지방 유래 성체줄기세포 배양액의 나노섬유 또는 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 미니돼지의 지방에서 유래한 것인 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 나노캡슐은 양친성 키토산을 포함하는 것인 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 지방 유래 성체줄기세포 배양액은 VEGF(Vascular endothelial growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), TGF(transforming growth factor)-β1, HGF(hepatocyte growth factor),KGF(keratinocyte growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor)-AA, PGA(placenta growth factor), 타입 I 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin), SOD(superoxide dismutase), 인터루킨- 6,8,10 및 RANTES 을 포함하는 것인 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 주름 개선, 미백 또는 항산화용인 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 갖는 것인 화장료 조성물.
(1) 지방 유래 성체줄기세포 배양액을 제조하는 단계; 및
(2) 상기 지방 유래 성체줄기세포 배양액을 나노섬유 또는 나노캡슐화하는 단계를 포함하는,
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 화장료 조성물의 제조방법.