BRPI0619967A2 - composições para o cuidado da pele - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES PARA O CUIDADO DA PELE. A invenção refere-se a composições que contêm agentes de crescimento sintetizados de células cultivadas da pele. Células da pele, tais como ceratinócitos e fibroblastos, são cultivados in vitro em um meio celular e ,no curso da cultura, as células cultivadas sintetizam e secretam agentes no meio celular. Os agentes contidos no meio são coletados e incorporados nas preparações farmacêuticas ou cosméticas para tratar um indivíduo. A preparação é aplicada e tem efeito rejuvenescedor sobre as células e tecido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES PARA O CUIDADO DA PELE".

CAMPO DA INVENÇÃO

O campo da invenção é cultura de células e biotecnologia médi- ca, particularmente composições que compreendem agentes de pele culti- vados sintetizados de células cultivadas da pele. Células da pele, tais como ceratinócitos e fibroblastos dérmicos, são cultivadas in vitro em meio celular e no curso da cultura as células cultivadas sintetizam e secretam agentes no meio celular. Os meios contendo os agentes são coletados e incorporados em preparações tópicas para tratar um indivíduo. A preparàção é aplicada à pele de um indivíduo e tem efeito rejuvenescedor sobre as células e os teci- dos para reduzir a aparência de linhas finas e rugas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Conforme a pele envelhece, secura e perda de elasticidade se tornam mais prevalentes. Além disso, exposição ao sol, ar, poluição e a ou- tras substâncias irritantes externas e ao estresse do meio ambiente podem agravar o envelhecimento da pele. As alterações nos componentes estrutu- rais e funcionais da pele em conseqüência da exposição à radiação ultravio- leta são coletivamente referidas como fotoenvelhecimento ou fotodano. Pen- sava-se que a maioria das características clínicas do fotoenvelhecimento eram aquelas do envelhecimento cronológico, i.e., manchas de idade (lenti- gos actínicos) e rugas. É previsto que correntes mudanças no estilo de vida de exposição aumentada da pele ao sol e às fontes de UV artificiais e os conseqüentes efeitos crônicos da radiação ultravioleta (IV) na pele resultarão em um número crescente de pacientes fotoenvelhecidos que requere trata- mento para aperfeiçoar a pele com transtornos.

Na população em geral, as diferenças no fotoenvelhecimento é dependente dos tipos de pele (por exemplo, pele clara sofrerá fotoenvelhe- cimento mais facilmente que pele escura) e alterações na pigmentação pa- recem ser uma característica mais importante que o enrugamento em pele envelhecida prematuramente. Essas diferenças podem ser possivelmente devidas às diferenças inerentes à exposição ao sol de indivíduos e aos me- canismos de defesa contra exposição crônica ao sol.

Exposição crônica à radiação ultravioleta provoca alterações ca- racterísticas nos componentes celulares da pele. Alguns dos sinais clínicos, os quais incluem formação de rugas finas e grosseiras, mudanças pigmenta- res, aspereza, flacidez, palidez e telangiectasia (vasos sangüíneos finos proeminentes), levam à aparência de envelhecimento prematuro e podem ter um impacto significante em certos aspectos da qualidade de fica. Histologi- camente são observadas atrofia epidérmica e displasia, elastose dérmica e atividade aumentada do melanócitos. Alterações displásicas e neoplásicas tais como ceratoses actínicas e carcinomas de células basais e escamosas são também características extremas da pele fotoenvelhecida.

Embora tenha se pensado que o envelhecimento fosse irreversí- vel, estudos feitos durante a última década mostraram que alguns compos- tos tópicos e procedimentos cirúrgicos podem aperfeiçoar dano à pele rela- cionado à idade. Tratamentos cirúrgicos e interventivos incluem cirurgia plás- tica da face, dermabrasão, resurfacing a laser, injeção da toxina botulínica e injeção de colágeno. Esses tratamentos cirúrgicos produzem aperfeiçoamen- to clínico e histológico em pele fotoenvelhecida, mas não sem risco e não contêm elemento de prevenção.

Para aperfeiçoar a aparência, vários produtos para cuidado da pele e tratamentos para cuidado da pele foram desenvolvidos. Além disso, uma variedade de tratamentos médicos foi desenvolvida para tratar proble- mas crônicos de pele, tais como acne, lesões pré-cancerosas, cicatrizes, distúrbios de pigmentação, rugas e similares.

Existem vários produtos recentes para cuidado da pele aplicados topicamente e tratamentos para cuidado da pele que estão sendo corrente- mente usados ou sendo pesquisados. Por exemplo, a vitamina A (retinol) e derivados da vitamina A, chamados retinóides, são tratamentos tópicos que se acreditam trabalharem para afrouxarem a camada de topo da pele e en- corajarem a renovação celular. Aplicações tópicas de vitamina C (ácido as- córbico), que neutraliza os radicais livres, são usadas para curar a pele e reduzir a aparência de linhas finas e rugas. A vitamina K é topicamente apli- cada para auxiliar a curar vasos sangüíneos rompidos, veias aranhas, con- tusões, olheiras e pele com manchas vermelhas. Alfa-hidróxi ácidos (AHAs) e beta-hidróxi ácidos (BHAs) são esfoliantes tópicos que aperfeiçoam o viço da pele e ajudam a prevenir acne. Aplicações tópicas de fator de crescimen- to da pele (EGF) podem aperfeiçoar a função da pele e criar uma aparência total mais jovem. Pesquisadores continuam a pesquisar as características da pele que contribuem para a aparência do envelhecimento.

Uma característica da pele de interesse no estudo do envelhe- cimento é a zona de Grenz. A zona de Grenz é uma faixa de material homo- gêneo que é encontrada na derme imediatamente abaixo da epiderme que é desprovida de fibras de oxitalano (i.e. fibras de elastina). A zona de Grenz é eosinofílica, i.e. ela se colore de rosa quando colorida com o corante de he- motoxilina e de eosina. Embora alguns definam a zona de Grenz como sen^ do equivalente à derme papilar, este não é realmente o caso. A zona de Grenz constitui graus variados da derme papilar, mas ela não é equivalente à derme papilar, pois as propriedades de coloração da zona de Grenz são bem distintas. A zona de Grenz é o resultado de nova deposição de coláge- no (Tipos I e III) e estudos recentes mostraram que uma zona de Grenz es- pessada é o resultado da síntese aumentada de mRNA de colágeno. Na Iite- ratura dos últimos anos é mencionado que pode haver alguma deposição de nova elastina na zona de Grenz (imediatamente sob a membrana base). No contexto de fotodano por UV e alterações induzidas pela idade, já que o fo- toenvelhecimento está ligado ao acúmulo de material elastótico (i.e. elastina mais velha fragmentada) na derme papilar, a espessura aumentada da zona de Grenz pode compensar esta perda de flexibilidade do tecido através da deposição de colágeno novo.

Como uma alternativa à cirurgia plástica ou facial para fazer com que a pele pareça mais jovem, muitas pessoas estão optando por tratamento de resurfacing da pele que não são tão invasivos quanto os procedimentos cirúrgicos. Esses procedimentos incluem peelings a laser, peelings químicos, dermabrasão e dermoalisamento. Todos esses tratamentos de resurfacing funcionam essencialmente do mesmo modo. Em primeiro lugar, as camadas externas de pele danificada são retiradas até um grau que nivela a profundi- dade das rugas e cicatrizes à pele circundante. Para resurfacing superficial ou médio, as camadas do tecido da pele removida podem ser limitadas à epiderme e derme papilar. Para resurfacing mais profundo, os níveis superi- ores da derme reticular podem ser também removidas. Penetração variada permite tratar manchas e rugas específicas. No tempo depois do tratamento, as novas células se multiplicam e migram para a área resurfaced durante o processo de cicatrização, surgindo uma superfície de pele mais macia, mais firme e de aparência mais jovem. Durante o processo de cicatrização, os produtos de cuidado da pele são aplicados à área tratada para intensificar e acelerar a cicatrização da pele.

Uma variedade de preparações cosméticas está amplamente disponível para aperfeiçoar a pele fotoenvelhecida, cuja eficácia não está clara. Portanto, dado o grande número de tratamentos de eficácia desco- nhecida, é aqui vital que sejam identificadas àquelas preparações que são eficazes e seguras para se monitorar o fotoenvelhecimento. Assim, é uma meta contínua de ambas as indústrias cosméticas e as companhias farma- cêuticas desenvolver produtos de cuidado da pele e tratamentos de cuidado da pele para aperfeiçoar a aparência da pele e aperfeiçoar o processo de cicatrização da pele danificada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção é baseada na constatação que o meio celular condicional pode ser preparado como uma composição ou preparação para uso no tratamento tópico da pele. A composição desta invenção é um meio condicionado que contém um ou mais agentes de pele cultivados, sintetiza- dos e secretados das células de pele cultivadas para uso como uma prepa- ração farmacêutica ou como um produto de cuidado da pele.

Como uma preparação farmacêutica, o produto que contém um meio celular condicionado é topicamente aplicado para tratar condições da pele, tal como promover a cicatrização de ferimentos. A composição tópica pode incluir qualquer veículo farmaceuticamente apropriado.

Como um produto de cuidado da pele, ou como um tratamento de cuidado da pele, o produto que contém um meio celular condicionado é topicamente aplicado à pele para aperfeiçoar a aparência da pele em uma quantidade suficiente para aumentar a proliferação celular e para diminuir a senescência celular.

A invenção é também direcionada a um método para produzir uma composição ou uma preparação que contém um meio celular condicio- nado que contém um ou mais agentes de pele cultivados produzidos por cé- lulas da pele cultivadas. O método inclui cultivar células da pele, tanto cera- tinócitos como fibroblastos, ou preferivelmente co-cultivar ambos os tipos de células, em um meio contendo nutrientes para crescer as células da pele e então induzir as células a sintetizarem e secretarem uma ou mais citocinas no médio. O meio celular condicionado assim produzido, agora contendo um ou mais agentes de pele cultivados, é separado das células da pele cultiva- das e usado para produzir uma composição ou preparação para administra- ção tópica à pele.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 ilustra um aparelho para formar uma construção da pele que produz citocinas e deposita as mesmas no meio circundante para condicioná-lo.

A Figura 2 é um gráfico que mostra o efeito do meio condiciona- do (ACM) sobre o tamanho de colônia de ceratinócitos.

A Figura 3 é um gráfico que mostra o efeito do meio condiciona- do (ACM) sobre a proliferação de ceratinócitos.

A Figura 4 é um gráfico que mostra o efeito do meio condiciona- do (ACM) na migração de ceratinócitos sobre a fibrina.

A Figura 5 é um gráfico que mostra o efeito do meio condiciona- do (ACM) sobre voltas de hélice dos ceratinócitos na migração ao longo de um substrato de fibrina.

A Figura 6 é um gráfico que mostra o efeito do meio condiciona- do (ACM) na proliferação de células endoteliais.

A Figura 7 é um gráfico que mostra o efeito do meio condiciona- do (ACM) sobre a proliferação de células da musculatura lisa. A Figura 8 é um gráfico que mostra o efeito do médio condicio- nado (ACM) sobre a proliferação de fibroblastos.

A Figura 9 é um gráfico que mostra a caracterização das citoci- nas do meio condicionado (ACM) no meio condicionado, o chumaço de al- godão, e extrato de células da construção de pele.

A Figura 10 é um gráfico que demonstra que o efeito do meio condicionado (ACM) é independente da via de receptor de EGF.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção é direcionada à composição de meio condicionado que contém agentes de pele cultivados produzidos de células cultivadas da pele tais como fibroblastos dérmicos e células epidérmicas. Os agentes de pele cultivados no meio condicionado são moléculas biologicamente ativas que são usadas para formular preparações farmacêuticas, cosméticas, e de cicatrização de ferimentos.

Quando os agentes de pele cultivados das células são usados no campo das formulações cosméticas, eles beneficiam o consumidor quan- to ao rejuvenescimento total da pele, incluindo a aparência de flexibilidade, maciez e elasticidade aumentadas; redução de rugas; evidência reduzida do processo de envelhecimento e regeneração da pele. Quando usado em uma base regular e periódica, como, por exemplo, em base diária, os agentes de pele cultivados são absorvidos pela pele e iniciam a proliferação e produção de novas células da pele, ceratinócitos e fibroblastos, os tipos de células chaves encontrados na pele, e diminuem a senescência celular e suportam a síntese dos componentes de matriz extracelular pelas células da pele, tais como a síntese e deposição de elastina e colágeno novos na zona de Grenz por fibroblastos, para esconder, interromper ou reverter o enrugamento da pele e a aparência das rugas por espessamento da zona de Grenz. Também resulta em uma uniformidade aperfeiçoada da pigmentação da pele.

Como preparação farmacêutica, os agentes de pele cultivados nos meios condicionados são usados para intensificar o processo de cicatri- zação depois de queimaduras de segundo grau, tratamentos da pele, reten- ção de umidade; redução de dor; acalmamento, e estabelecimento de cica- trização mais completa com nova pele mais rápida depois da abrasão, der- moalisamento, esfoliação, peeling químico, tratamento a laser, queimadura solar, queimadura com o vento, queimaduras por irradiação, tratamentos da pele, formação de vesículas, tratamentos em spa, e outros procedimentos e eventos que provocam trauma na pele. Celulite, alopecia, neuropatia, mar- cas de extensão (também conhecidas como estrias) podem ser tratadas também.

Estrias são marcas de extensão que podem aparecer quando a pele é rapidamente estendida. Elas são freqüentemente associadas ao alar- gamento do abdome durante a gravidez. Elas podem ser encontradas em crianças que se tornaram rapidamente obesas. Elas podem ocorrer também durante o rápido crescimento da puberdade em homens e em mulheres. Es- trias estão mais comumente localizadas no busto, quadris, coxas, nádegas, abdome e flanco. Marcas de extensão aparecem como riscas paralelas de pele brilhante, afinada, vermelha que com o tempo fica esbranquiçada e de aparência similar a uma cicatriz. As marcas de extensão podem estar ligei- ramente deprimidas e terem uma textura diferente da pele normal. As estrias podem também ocorrer em conseqüência de formação anormal de colágeno ou em conseqüência de medicamentos ou produtos químicos que interferem na formação de colágeno. Elas podem estar também associadas à adminis- tração prolongada de cortisona, diabetes melito, doença de Cushing, e pós- gravidez.

As preparações que contêm agentes de pele cultivados podem ser usadas também para promover angiogênese em tecidos. As preparações farmacêuticas que contêm essas citocinas podem ser similarmente usadas para tratar superfícies das membranas mucosas depois de cirurgia ou lesão.

Nas preparações de cicatrização de ferimentos, uma preparação que contém agentes de pele cultivados de meios condicionados é usada por aplicação direta da preparação ao leito do ferimento ou por incorporação em um curativo de ferimento. A preparação pode ser usada como um adjunto com enxertos, tal como um autoenxerto (pele removida de um paciente e reaplicada em outro lugar no mesmo paciente) ou uma construção de pele cultivada por revestimento da superfície do enxerto, o enxerto inteiro ou a leito de ferimento com a preparação. Quando usados como um adjunto na cicatrização de ferimento, os agentes de pele cultivados contidos na prepa- ração de cicatrização de ferimento geralmente aumentam e aperfeiçoam o fechamento do ferimento por indução da proliferação de ceratinócitos e fi- broblastos, e a formação de tecido de granulação e de vasos sangüíneos.

Meio condicionado significa que o meio contatou uma cultura tecidual e foi usado pelas células da cultura tecidual como fonte de nutrien- tes, vitaminas, hormônios, e compostos inorgânicos e sais e por terem con- tatado a cultura tecidual, têm agora produtos de células adicionados, ou "a- gentes de pele cultivados", tais como citocinas, proteínas, componentes de matriz extracelular, ou qualquer combinação destes, sintetizados e secreta- dos pelas células no meio. Condicionamento é o ato da síntese de células e da secreção de citocinas, proteínas e componentes de matriz extracelular, em meio fresco mediante contato, exposição, troca e interação entre as célu- las e o meio por um tempo, preferivelmente por um tempo entre 6 horas e 3 dias, mais preferivelmente 12 horas e 12 dias, para condicionar o meio. O meio então condicionado é removido do aparelho de cultura que contém a construção de pele na cultura e é coletado para purificação de seus agentes de pele cultivados ou é usado, integralmente ou em parte, como um produto farmacêutico, cosmético ou composição de cicatrização de ferimento ou para uso em cultura celular, in vitro.

Citocinas são proteínas que exercem alterações na função ou na atividade de uma célula, tais como diferenciação, proliferação, secreção ou motilidade. Fatores de crescimento são um subgrupo de citocinas que são também proteínas que provocam mudanças nas funções ou nas atividades que promovem ou inibem crescimento, proliferação, migração celular, ou outros eventos celulares relacionados. Quimiocinas formam um outro sub- conjunto de citocinas que atraem e guiam células T, células B, e outras célu- las responsivas à quimiocina para tecidos específicos do corpo. Linfocinas formam ainda um outro subgrupo de citocinas envolvido em imunorresposta. Como usado aqui, o termo "citocinas" inclui citocinas, incluindo fatores de crescimento, quimiocinas e lifocinas, e não estão limitadas a sua estrutura normal e função, mas podem incluir também suas variantes e híbridos que ocorrem naturalmente. Os agentes de pele cultivados da invenção compre- endem citocinas.

Durante a sua fabricação e quando inteiramente formadas, as construções de pele cultivadas que contêm células vivas que sintetizam e secretam uma série de citocinas e outras substâncias na matriz da constru- ção e no meio que está sendo banhado pela construção. As células cultiva- das nas construções de pele cultivadas consistem tipicamente em fibroblas- tos dérmicos e células epidérmicas; células epidérmicas são também referi- das como ceratinócitos. No processo de fabricação e cultura de uma cons- trução de pele de bicamada, as camadas de tecido epidérmico e dérmico proporcionam um ambiente similar ao tecido, uma co-cultura organizada que incorpora uma matriz extracelular, para interações célula com célula e matriz com célula, similares àquelas que ocorrem na pele de mamíferos nativos e de humanos. Essas interações na construção em desenvolvimento permitem que um amplo perfil de expressão e secreção de citocinas nos meios induza outras células na cultura a realizarem funções de desenvolvimento de matriz extracelular, produção de membrana de base, e proliferação e diferenciação celular.

Citocinas e fatores de crescimento que são produzidos por cons- truções de pela cultivadas que são uma característica desta invenção inclu- em, mas sem limitação: fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGR); fator de crescimento epidérmico (EFG); fator de crescimento de ceratinócitos (KGF); fator alfa transformador de crescimento (TGFa); fator beta transfor- mador de crescimento (TG Fp), incluindo fator beta-1 transformador de cres- cimento (TGFpI) e fator beta-2 transformador de crescimento (TGFP2); fator estimulador de formação de colônias (GCSF); fator de crescimento insulina- símile (IGF); fator de crescimento endotelial (VEGF), e fator de necrose tu- moral (TNF). No subconjunto de quimiocinas, as interleucinas favorecem a apoptose celular. Várias interleucinas, inclusive interleucina-1, interleucina-6, interleucina-8, interleucina-11, são também sintetizadas pelo desenvolvimen- to de construção de pele e são também uma característica desta invenção. Deve ser observado que os termos entre parênteses, mencionados acima, são abreviaturas comumente conhecidas e usadas na técnica para a no- menclatura normal que a precedem.

Outras citocinas e fatores de crescimento que compreendem os agentes de pele cultivados da invenção compreendem: Anfirregulina; Agio- genina; Angiopoietina-2; DTK; EGR-R; ENA-78; FAS; FGF-1; FGF-2; FGF-6; FGF-7; FGF-9; Iigante FIT-3; GCP-2; G-CSF; GM-CSF; GRO-alfa; HGF; IGF-1; IGF-2; IGFBP-2; IL-11; IL-lalfa; IL-lbeta; L-1RA; II-6; IL-6R; IL-8; Lep- tina; MCP-1; MCP-2; M-CSF; Osteprotegrina; PDGF; RANTES; Fator de Cé- lulas-tronco, TGF-alfa; TGFbetaI; TGFbeta2; TGFbeta3; TIMP-1; TIMP-2; TRAIL; UPAR; e VEGF. Deve ser observado que os termos mencionados acima são abreviaturas comumente conhecidas e usadas na técnica e a no- menclatura por extenso de cada termo é a aqui incorporada a título de refe- rência.

Preferivelmente, os meios convencionais da invenção são pro- duzidos por células cultivadas de células da pele: ceratinócitos, fibroblastos dérmicos, ou ambos, mais preferivelmente quando as células são cultivadas juntas como uma co-cultura de ambos os ceratinócitos e os fibroblastos dérmicos. Os meios condicionados da invenção são mais preferivelmente produzidos quando a co-cultura é uma construção de pele cultivada tendo pelo menos uma camada dérmica e uma camada epidérmica dispostas em orientação similar à pele nativa. As camadas dérmicas compreendem células de fibroblastos, preferivelmente de origem dérmica e de matriz extracelular, principalmente de colágeno. Será apreciado por aquele versado na técnica que a construção de pele cultivada pode conter, tanto por adição intencional como com cultura continuada de fibroblastos de fontes primárias, outras cé- lulas encontradas na pele e outros componentes de matriz extracelular.

Tipos de células preferidas para uso nesta invenção são deriva- dos de mesênquima. Tipos de células mais preferidas são fibroblastos, célu- las estromais, e outras células teciduais conjuntivas de suporte, ou, como na modalidade mais preferida, fibroblastos dérmicos humanos. Linhagens de células de fibroblastos humanos podem ser derivadas de numerosas fontes que incluem, mas sem limitação, prepúcio masculino neonato, derme, ten- dão, pulmão, cordões umbilicais, cartilagem, uretra, estroma corneana, mu- cosa oral, e intestino. As células humanas podem incluir, mas sem limitação, fibroblastos, células da musculatura lisa, condrócitos e outras células do te- cido conjuntivo de origem mesenquimal. É preferido, mas não requerido, que a origem de célula produtora de matriz usada na produção de uma constru- ção de tecido seja derivada de um tipo de tecido que é para se assemelhar ou mimetizar depois de empregar os métodos de cultura da invenção. Por exemplo, uma construção de folha de multicamada é cultivada com fibroblas- tos para formar uma construção de tecido conjuntivo vivo; ou mioblastos pa- ra uma construção de musculatura esquelética. Mais que um tipo de célula pode ser usado para fabricar uma construção de tecido. Doadores de células podem variar em desenvolvimento e idade. As células podem ser derivadas de tecidos de doadores de embrião, ou indivíduos mais velhos, inclusive a- dultos. Células progenitoras embrionárias, tais como células-tronco mesen- quimais, podem ser usadas na invenção e induzidas para se diferenciarem no desenvolvimento do tecido desejado.

Embora as células humanas sejam preferidas para uso na in- venção, as células a serem usadas no método da invenção não são limita- das às células de fontes humanas. Células de outras espécies de mamíferos que incluem, mas sem limitação, fontes eqüinas, caninas, porcinas, bovinas, felinas, caprinas e ovinas podem ser usadas. Células de murinos, e outras células de fontes de roedores, podem ser usadas também. Além disso, célu- Ias geneticamente engenheiradas que são transfectadas espontaneamente, quimicamente ou viralmente, podem ser também usadas nesta invenção. Para aquelas modalidades que incorporam mais que um tipo de célula, mis- turas de células geneticamente modificadas ou transfectadas podem ser u- sadas e misturas de duas ou mais espécies ou fontes de tecidos podem ser usadas, ou ambos.

Células recombinantes ou geneticamente engenheiradas podem ser usadas na produção da construção do tecido para criar uma construção de tecido que age como um enxerto de distribuição de fármaco para um pa- ciente que necessite de níveis aumentados de produtos de células naturais ou de tratamento com um produto terapêutico. As células podem produzir produtos de células recombinantes, fatores de crescimento, hormônios, pep- tídeos ou proteínas para uma quantidade contínua de tempo ou conforme necessitado quando biologicamente, quimicamente, ou termicamente sinali- zado devido às condições na cultura. As células podem ser também geneti- camente engenheiradas para expressar citocinas, proteínas ou tipos diferen- tes de componentes de matriz extracelular, que são 'normais', mas expres- sos em altos níveis ou de qualquer modo modificados para produzir produtos celulares que são terapeuticamente vantajosos para cicatrização de ferimen- tos, neovascularização facilitada ou direcionada. Esses procedimentos são geralmente conhecidos da técnica, e são descritos por Sambrook et al., Mo- lecular Cloninq. A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), aqui incorporado a título de referência. Todos os tipos de células mencionadas acima podem ser usados nesta invenção para a produ- ção de uma construção de pele cultivada que sintetizará os meios condicio- nados que contêm citocinas. As células em uma construção de pele cultiva- da são cultivadas em uma matriz que suporta as células em uma disposição e composição que mimetiza àquela encontrada na pele normal.

O colágeno é uma composição comum e preferida para os equi- valentes de pele cultivada. Embora o colágeno seja a composição de matriz extracelular mais preferida para uso na produção de equivalentes de pele que produzem e secretam citocinas e outros agentes de pele cultivados para condicionar os meios de cultura, outros componentes de matriz extracelular podem ser usados. Esses componentes de matriz extracelular podem ser usados sozinhos ou, preferivelmente, podem ser incluídos com o colágeno para mimetizarem matriz dérmica nativa. Esses componentes de matriz ex- tracelular podem incluir: outros colágenos, tanto colágeno fibrilar como não fibrilar, da família de colágeno, tais como os colágenos tipo II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, Χ, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, outras proteínas de matriz, que podem incluir, mas sem limitação, elastina, poliglicanas tal como decorina ou biglicana, ou glicoproteínas tais como tenascina, vitronectina, fibronectina, laminina, trombospondina I, e glicoaminaglicanas (GAG) tal co- mo ácido hialurônico (HA). A matriz dérmica pode variar de composição e de estrutura. Esponjas de colágeno, biocompatíveis, bio-remodeláveis, derme descelularizada ou géis de colágeno. Em vez de proporcionar componentes de matriz extracelular às células dérmicas, eles podem ser cultivados em elementos de malha biodegradáveis (tal como náilon ou poligalactina (PGA)) para proporcionar um suporte de cultura e cultivados para produzirem matriz extracelular até que as células e suas matriz envolvam o suporte. Na moda- Iidade preferida, a camada dérmica é um gel de colágeno contraído, contraí- da por fibroblastos, tais como aqueles descritos na Patente US 4.485.096 de Bell, aqui incorporada a título de referência. Em uma modalidade mais prefe- rida, o gel de colágeno contraído é disposto sobre uma camada de colágeno acelular mássica em uma membrana porosa para ancorar o gel à membrana e para impedir a contração radial excessiva do gel. Métodos para incorporar uma camada de colágeno acelular mássica são descritos na Patente US 5.536.656 de Kemp et al., por Wilkins, L.M, et al., em Development of a Bila- yered Living Skin Construct for Clinicai Applications. Biotechnology and Bio- engineering, Vol. 43, pp. 747-756 (1994), e por Parenteau, N.L. Skin Equiva- lents. Por: I. Leigh e F. Watt (eds.), The Keratinocvte Handbook. Cambridge University Press, Londres (1994), cujas exposições são aqui incorporadas a título de referência.

Ambos o equivalente de tecido e o gel de colágeno hidratado acelular, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados usando o colágeno derivado de pele e tendão, incluindo tendão de cauda de rato, colágeno de pele de ovelha, e tendão de extensor de bezerro. Outras fontes de colágeno seriam adequadas. Uma composição de colágeno particular- mente preferida derivada de tendão de extensor digital comum de bezerro e métodos para derivar tais composições de colágeno são descritos na Paten- te US 5.106.949 de Kemp, cuja exposição é aqui incorporada a título de refe- rência.

Em uma modalidade da presente invenção, referente à Figura 1, um gel de colágeno hidratado acelular 25 é preparado de uma composição de colágeno que compreende pelo menos cerca de 0,5 a 2,0 mg/mL, preferi- velmente cerca de 0,9 a 1,1 mg/mL e meios nutrientes. Essa composição de colágeno é adicionada ao recipiente interno 20 e mantida sob condições que permitem que a composição de colágeno se componha e forme um gel hi- dratado acelular de dimensões adequadas, tipicamente cerca de 1 a 5 mm de espessura, uma faixa de espessura preferida sendo de cerca de 2 a cer- ca de 3 mm. Um gel de colágeno hidratado acelular 25 é preferivelmente espesso o bastante de modo que uma porção permaneça acelular conforme as células migram do equivalente de tecido para um gel de colágeno hidra- tado acelular e fino o bastante de modo que o equivalente de tecido não é indesejavelmente removido da fonte de nutriente proporcionado em recipien- te externo 10.

Um equivalente dérmico é a seguir moldado em um gel de colá- geno hidratado celular usando procedimentos de acordo com as patentes mencionadas acima e conforme descritas a seguir. Um mistura de molda- gem que contém colágeno e fibroblastos é adicionada ao recipiente interno 20 sobre um gel de colágeno hidratado acelular 25 e mantido sob condições que permitem que o equivalente de tecido se forme. Conforme o equivalente de tecido se forma sobre um gel de colágeno hidratado acelular 25, ele se contrai radialmente.

Tipicamente, as laterais da camada dérmica 26 se inclinam em direção à periferia externa de gel de colágeno hidratado 25 para formar uma mesa conforme mostrada na Figura 1 em 52. A camada dérmica 26 é a se- guir semeada com células epiteliais para formar a camada epidérmica 28. As células epidérmicas são semeadas em meio de cultura em uma concentra- ção de entre cerca de 0,3 χ 106 e cerca de 30 χ 106 células/mL. O volume de células epidérmicas semeadas dependerá do tamanho da mesa.

A concentração de colágeno, o número de células e o volume da 30 mistura de moldagem podem ser controladas para otimizar o diâmetro e a espessura do equivalente de tecido. A mistura de moldagem compreende as células em uma concentração de cerca de 1,25 χ 104 a cerca de 5 χ 104 de células/mL e colágeno de cerca de 0,5 a cerca de 2,0 mg/mL em um meio de nutrientes. Uma concentração de células preferida é de cerca de 2,5 χ 104 células/mL. Foi verificado que a razão do volume da mistura de modelagem para o equivalente de tecido para o volume da mistura de modelagem para o gel de colágeno hidratado acelular tem um efeito sobre a viabilidade e dife- renciação celular. Razões úteis, volume para volume (v/v), de mistura de modelagem de equivalente de tecido para mistura de modelagem de gel de colágeno são de cerca de 3:1 a cerca de 1:3. Uma razão preferida em que a concentração de células na rede de colágeno está em cerca de 2,5 χ 104 células/ml é de 3:1.

As culturas são mantidas em uma incubadora para assegurar condições ambientais suficientes de temperatura, umidade e mistura gasosa controladas para a cultura de células. As condições preferidas estão entre cerca de 34°C e cerca de 38°C, mais preferivelmente cerca de 37±1°C com uma atmosfera entre cerca de 5-10±1% de CO2 e uma umidade relativa (UR) entre cerca de 80 e 90%.

Métodos para proporcionar células epidérmicas para um substra- to dérmico, e métodos para sua cultura, incluindo indução de diferenciação dérmica e cornificação para formar um ceratinócito diferenciado são conhe- cidos da Patente US 5.712.163 de Parentau et al. e da Patente US 5.536.656 de Kemp et al., de Wilkins (1994), acima, e de Parenteau (1994), acima, cujos ensinamentos são aqui incorporados a título de referência. Tipi- camente, para realizar a epidermalização da construção de matriz celular, ceratinócitos são semeados para a construção de matriz celular e cultivados sobre a mesma até que camada atinja de uma a três camadas de espessu- ra. Os ceratinócitos são então induzidos à diferenciação para formarem uma epiderme de multicamada e são então induzidos para formarem um estrato córneo.

No método para formar uma camada epidérmica diferenciada, ceratinócitos subcultivados são retirados do estoque de células e seus nú- meros de células são expandidos. Quando um número necessário de células tiver sido obtido, elas são liberadas do substrato de cultura, suspensas, con- tadas, diluídas e então semeadas para a superfície de topo da construção de matriz celular em uma densidade entre cerca de 4,5 χ 103 células/cm2 e cer- ca de 5,0 χ 105 células/cm2, mais preferivelmente entre cerca de 1,0 χ 104 células/cm2 e cerca de 1,0 χ 105 células/cm2, e mais preferivelmente em cer- ca de 4,5 χ 104 células/cm2. As construções são então incubadas para entre cerca de 60 e cerca de 90 minutos a 37±1°C, 10% de CO2 para permitir que os ceratinócitos se liguem. Depois da incubação, as construções são sub- mersas no meio de epidermalização. Depois de um intervalo de tempo sufi- ciente em cultura, os ceratinócitos proliferam e se espalham para formar uma monocamada confluente através da camada confluente através da construção de matriz celular. Uma vez confluente, a formulação de meios celulares é trocada para o meio de diferenciação para induzir a diferenciação celular. Quando um epitélio de multicamada é formado, o meio de cornifica- ção é então usado e a cultura é levada para a interface de ar-líquido. Para a diferenciação e cornificação de ceratinócitos, as células são expostas a uma interface de ar-líquido secada ou de baixa umidade. Uma interface seca ou de baixa umidade pode ser caracterizada conforme se tenta duplicar os ní- veis de umidade da pele. Com o tempo, os ceratinócitos expressarão a mai- oria ou todas as queratinas e outras características encontradas na pele na- tiva quando expostas a estas condições.

Quando inteiramente formada, a camada epidérmica é uma ca- mada de multicamada, estratificada, e bem diferenciada, de ceratinócitos que exibem uma camada basal, uma camada suprabasal, uma camada gra- nular e um estrato córneo. Rudimentos de membrana básica ou uma mem- brana básica completa estão presentes na junção dermo-epidérmica e pare- ce mais espessa em torno dos hemidesmossomos, marcadas por fibrilas de ancoragem que são compreendidas do colágeno tipo VII, conforme visuali- zados por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As fibrilas de anco- ragem são vistas saindo de áreas de formação de membrana de base e cap- turando as fibrilas de colágeno na camada dérmica. Essas fibrilas de anco- ragem, bem como outros componentes de membrana de base, são secreta- das por ceratinócitos. É também conhecido que embora os ceratinócitos se- jam capazes de secretarem os componentes de membrana de base por sua própria conta, uma membrana de base reconhecível não se formará em au- sência de fibroblastos. Coloração imunoistoquímica da construção de pele da presente invenção tem mostrado também que laminina, uma proteína de membrana de base está presente.

Na sua formação, as construções de pele cultivadas são nutridas por contato com um meio de cultura que se torna condicionado pelas células na construção de pele conforme elas metabolizam os componentes do meio e secretam citocinas e outras proteínas nele. Um meio definido significa um meio de cultura para uso em cultura celular que contém componentes quimi- camente definidos e é isento de extratos de órgão animal não definido ou extratos de tecido, por exemplo, soro, extrato da pituitária, extrato hipotalâ- mico, extrato placentário, ou extrato embrionário ou proteínas e fatores se- cretados por células alimentadoras. Em uma modalidade mais preferida, o meio é isento de componentes não definidos e componentes biológicos defi- nidos derivados de fontes não humanas. Embora a adição de componentes não definidos não seja preferida, eles podem ser usados de acordo com os métodos descritos em qualquer ponto na cultura de modo a fabricar com su- cesso uma construção de tecido. Quando a invenção é efetuada utilizando células humanas selecionadas cultivadas empregando componentes quimi- camente definidos não derivados de componentes biológicos derivados de não humanos, a construção de tecido resultante é uma construção de tecido humano definido. As vantagens de usar tal construção para produzir o meio condicionado da invenção é a eliminação da preocupação com contamina- ção ou infecção por vírus de animal adventício ou de espécies cruzadas que podem estar presentes na construção de tecido ou no meio condicionado.

O meio de cultura, quando novo ou não usado, é compreendido de uma base nutriente usualmente suplementada adicionalmente com outros componentes. Aquele versado na técnica pode determinar bases nutrientes apropriadas na técnica de cultura de células animais com expectativas razo- áveis de produção com sucesso de uma construção de tecido e do meio condicionado da invenção. Muitas fontes de nutrientes comercialmente dís- poníveis estão úteis na prática da presente invenção. Essas incluem fontes de nutrientes comercialmente disponíveis que suprem sais inorgânicos, uma fonte de energia, aminoácidos, e vitaminas B, tais como Meio de Eagle Modi- ficado por Dulbecco (DEMEM); Meio Essencial Mínimo (MEM); M199; RPMI 1640; Meio de Dulbecco modificado por Iscove (EDMEM). Meio Essencial Mínimo (MEM) e M199 requerem suplementação adicional com precursores de fosfolipídios e aminoácidos não essenciais. Misturas ricas em vitaminas comercialmente disponíveis que fornecem aminoácidos adicionais, ácidos nucléicos, co-fatores de enzimas, precursores de fosfolipídio, e sais inorgâ- nicos incluem F-12 de Ham, F-10 de Ham, NCTC 109, e NCTC 135. Embora em concentrações variáveis, todos os meios basais proporcionam uma fonte de nutrientes básicos para as células na forma de glicose, aminoácidos, vi- taminas, e íons inorgânicos, juntamente com outros componentes de meios básicos. O meio de base preferida da invenção compreende uma base nutri- ente de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) ou isento de cálcio ou com baixo teor de cálcio, contendo glicose em 4,5 g/L, magnésio e L- glutamina a 7,25 mM, sem piruvato de sódio, e F-12 de Ham em uma razão de 3 para 1.

O meio de base é suplementado com componentes tais como aminoácidos, fatores de crescimento, e hormônios. Meios de cultura defini- dos para a cultura de células da invenção são descritos na Patente US 5.712.163 de Parenteau e na Publicação Internacional PCT WO 95/31473, cujas exposições são aqui incorporadas a título de referência. Outros meios são conhecidos da técnica tais como aqueles descritos por Ham e McKee- han, em Methods in Enzymology, 58:44-93 (1979), ou por outros meios qui- micamente definidos apropriados, por Bottenstein et al., em Methods in Enzymology, 58:94-109 (1979). Na modalidade preferida, o meio de base é suplementado com os seguintes componentes conhecidos por aquele versa- do na técnica em cultura de células animais: insulina, transferrina, triiodotiro- nina (T3), e uma ou ambas a etanolamina e a o-fosforil-etanolamina, em que as concentrações e substituições para os suplementos podem ser determi- nadas pelo versado na técnica. A insulina é um hormônio polipeptídico que promove a absorção de glicose e de aminoácidos para proporcionar benefícios de longo prazo sobre passagens múltiplas. A suplementação de insulina ou fator de cresci- mento insulina-símile (IGF) é necessária para cultura de longo prazo já que haverá um eventual esgotamento de capacidade das células de absorverem glicose e aminoácidos e uma possível degradação do fenótipo das células. Suplementação de insulina é recomendável para cultivo em série e é provida aos meios em uma faixa de concentração de preferivelmente entre cerca de 0,5 μg/mL e cerca de 50 μg/mL. Concentrações apropriadas para a suple- mentação de fator de crescimento insulina-símile, tal como IGF-1 ou IGF-2, podem ser facilmente determinadas por aquele versado na técnica para os tipos de célula escolhidos para a cultura.

A transferrina está no meio para a regulação de transporte de ferro. O ferro é um elemento, em traços, essencial encontrado no soro. Co- mo o ferro pode ser tóxico em sua forma livre, no soro ele é suprido às célu- Ias ligadas à transferrina em uma faixa de concentração de preferivelmente entre cerca de 0,05 e cerca de 50 μg/mL, mais preferivelmente em cerca de 5 μg/mL

Triiodotironina (T3) é um componente básico e é a forma ativa de hormônio da tireóide que está incluído no meio para manter as taxas do metabolismo celular. Triiodotironina é suplementada ao meio em uma faixa de concentração entre cerca de 0 e cerca de 400 pM, mais preferivelmente entre cerca de 2 e cerca de 200 pM e mais preferivelmente em cerca de 20 pM.

Ambas a etanolamina e a o-fosforil-etanolamina, que são fosfoli- pídios, são adicionadas, cuja função é um precursor importante na via de inositol e metabolismo dos ácidos graxos. A suplementação de lipídios que são normalmente encontrados no soro é necessária em um meio isento de soro. Etanolamina e o-fosforil-etanoíamina são providas aos meios em uma faixa de concentração entre cerca de 10"6 e cerca de 10"2 M, mais preferi- velmente em cerca de 1 χ 10'4 M.

Por toda a duração da cultura, o meio de base é adicionalmente suplementado com outros componentes para induzir a síntese ou diferencia- ção ou para aperfeiçoar o crescimento de célula tais como hidrocortisona, selênio, e L-glutamina.

A hidrocortisona tem mostrado que em cultura de ceratinócitos ela promove o fenótipo de ceratinócito e, portanto, aumenta as característi- cas diferenciadas tal como o teor de involucrina e de ceratinócito transgluta- minase (Rubin et al., J. Cell Physiol., 138:208-214 (1986)). Portanto, a hidro- cortisona é um aditivo desejável em casos onde essas características são benéficas, tal como na forma de enxertos de folhas de ceratinócitos ou cons- truções de pele. A hidrocortisona pode ser provida em uma faixa de concen- tração de cerca de 0,04 μςΛτιΙ. a cerca de 4,0 μg/mL., mais preferivelmente a cerca de 0,4 μg/mL..

Selênio é, adicionado aos meios de soro para re-suplementar os elementos em traços de selênio normalmente providos por soro. O selênio pode ser fornecido em uma faixa de concentração de cerca de IO'9 a cerca de 10-7 M; mais preferivelmente em cerca de 5,3 χ 10"8 Μ.

O aminoácido L-glutamina está presente em algumas bases nu- trientes e pode ser adicionado em casos onde não há nenhum presente ou em quantidades suficientes. L-glutamina pode também ser provida na forma estável tal como aquela vendida sob a marca, GlutaMAX-1® (Gibco BRL, Grand lsland, NY). GlutaMAX-1® é a forma de dipeptídeo estável de L-alanil- L-glutamina e pode ser usada intercambiavelmente com L-glutamina e é provida em concentrações equimolares como um substituto para L- glutamina. O dipeptídeo proporciona estabilidade para a L-glutamina contra a degradação com o tempo na armazenagem e durante a incubação que podem levar a incerteza quanto à concentração eficaz de L-glutamina no meio. Tipicamente, o meio de base é suplementado com preferivelmente entre cerca de 1mN e cerca de 6mM, mais preferivelmente entre cerca de 2mM e cerca de 5mM, e mais preferivelmente 4mM de L-glutamina ou Glu- taMAX-1®.

Fatores de crescimento, tal como fator de crescimento epidérmi- co (EGF), podem ser também adicionados ao meio para auxiliar no estabe- Iecimento das culturas através escalada celular e semeadura. EGF na forma nativa ou na forma recombinante pode ser usado. Formas humanas, nativas ou recombinantes, de EGF são preferidas para uso no meio quando está se fabricando um equivalente de pele sem componentes biológicos não huma- nos. EGF é um componente opcional e pode ser fornecido em uma concen- tração entre cerca de 1 e cerca de 1,5 ng/mL, mais preferivelmente entre cerca de 5 e cerca de 10 ng/mL.

O meio descrito acima é tipicamente preparado como descrito abaixo. Contudo, deve ser entendido que os componentes da presente in- venção podem ser preparados e construídos usando metodologia conven- cional compatível com suas propriedades físicas. É bem conhecido da técni- ca substituir certos componentes por um análogo apropriado ou agente que age funcionalmente equivalente para os propósitos de disponibilidade ou economia e chegam a um resultado similar. Fatores de crescimento que o- correm naturalmente podem ser substituídos com fatores de crescimento recombinantes ou sintéticos que têm qualidades e resultados similares quando usados na execução da invenção.

Os meios de acordo com a presente invenção são estéreis. Componentes estéreis são comprados ou tornados estéreis por procedimen- tos convencionais, tal como filtração, depois da preparação. Procedimentos assépticos próprios foram usados em todos os Exemplos a seguir. DMEM e F-12 são combinados e os componentes individuais são então adicionados para completar o meio. Soluções de estoque de todos os componentes po- dem ser armazenadas a -20°C, com exceção da fonte de nutrientes que po- de ser armazenada a 4°C. Todas as soluções de estoque são preparadas em 500X das concentrações finais listadas acima. Uma solução de estoque de insulina, trasnferrina e triiodotironina (todas da Sigma) é preparada como a seguir: triiodotironina é inicialmente dissolvida em etanol absoluto em ácido clorídrico 1N (HCI) em uma razão 2:1. A insulina é dissolvida em HCI diluído (aproximadamente 0,1 N) e a transferrina é dissolvida em água. As três são então misturadas e diluídas em água para uma concentração de 500X. Eta- nolamina e o-fosforil-etanolamina são dissolvidas em água para concentra- ção de 500X e são esterilizadas em filtro. Progesterona é dissolvida em eta- nol absoluto e diluída com água. A hidrocortisona é dissolvida em etanol ab- soluto e diluída em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Selênio é dissolvido em água para concentração de 500X e esterilizado em filtro. EGF é adquirido estéril e é dissolvido em PBS. Adenina é difícil de dissolver, mas pode ser dissolvida por quaisquer dos vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Albumina sérica humana (HSA) ou albumina sérica bo- vina (BSA) pode ser adicionada para armazenagem prolongada para manter a atividade das soluções de estoque de progesterona e EGF. O meio pode ser usado tanto imediatamente após a preparação, como armazenado a 4°C. Se armazenado, o EGF não deve ser adicionado até o momento de uso.

O modo de fornecer meio fresco para as culturas é feito por pi- petagem, decantação, ou bombeamento do meio no aparelho de cultura. O condicionamento do meio ocorre contatando o meio com uma construção de pele cultivada por um espaço de tempo suficiente, usualmente cerca de 6 horas a 3 dias ou mais para permitir que a construção absorva ou capture os nutrientes e similares do meio fresco e secrete citocinas no meio. Já que a construção de pele cultivada está em um estado metabólico constante, so- mente um curto espaço de tempo é necessário para condicionar o meio. É preferido que a construção e o meio entrem em contato um com o outro para a troca até que os nutrientes estejam quase esgotados do meio fresco.

O meio condicionado é removido e coletado das culturas por pi- petagem, aspiração, decantação, sifão, ou bombeamento no momento de cada troca do meio condicionado por meio fresco. Na fabricação de um e- quivalente de pele cultivada, é preferido que o meio condicionado seja cole- tado do aparelho que contém as construções quando ambos os fibroblastos dérmicos e as células epidérmicas estão presentes juntas na construção. As coleções de meios condicionados podem ser usadas individualmente como coleções individuais, ou agrupadas juntas. O desenvolvimento de uma cons- trução de pele cultivada é marcado com vários eventos que produzem um meio condicionado que tem um perfil de citocina variável em cada ponto de coleção. Como coleções separadas, o meio condicionado terá certas citoci- nas que podem ser desejáveis para indicação de um tratamento particular ou produto. Quando combinadas por agrupamento das coleções juntas, o meio condicionado terá uma faixa mais ampla de citocina para tratamentos ou produtos.

Um outro modo de coleção de citocinas da invenção é do chu- maço absorvente subjacente à membrana sobre a qual a construção de pele é formada. O chumaço é disposto embaixo da membrana para puxar do meio para a membrana em levantamento no ar, quando a cultura é elevada para a interface de ar-líquido para auxiliar na cornificação da camada de cé- lulas de ceratinócitos. O chumaço pode ser de qualquer material absorvente, mas é preferivelmente atóxico e compatível com as culturas celulares, tal como algodão. Com referência à Figura 1, o chumaço é disposto ao longo da superfície de fundo da membrana 24 entre a membrana 24 no fundo da câ- mara externa 60. O chumaço mostra ter concentrações mais altas de citoci- nas. Embora não se deseje estar ligado à teoria, devido ao fato de o chuma- ço estar em próxima oposição à construção de pele em desenvolvimento, ele coleta muitas das citocinas secretadas pela construção de pele. As citocinas podem ser utilizadas enquanto ainda no chumaço quando ele é usado como uma bandagem ou parte de uma bandagem ou elas podem ser extraídas ou drenadas do chumaço.

Uma vez coletado, o meio condicionado é usado como coletado ou posterior processamento é realizado no meio para purificação ou para facilitar a aplicação ou armazenagem antes do uso. O meio condicionado pode ser Iiofilizado ou evaporado para remover a porção de líquido, ou água, da composição. A remoção de água deixa uma forma de pó cristalino do meio condicionado que contém os agentes de pele cultivados: citocinas, pro- teínas e componentes de matriz extracelular, com volume diminuído. Essa forma torna mais fácil a preparação de produtos que contêm dosagens mais altas da composição de agentes de pele cultivados sem diluir a preparação e assim facilitar a armazenagem por causa de seu volume reduzido.

O meio condicionado pode ser também concentrado usado um método de filtração, particularmente um como um corte de peso molecular ou uma série de filtros de pesos moleculares. O uso de filtros de pesos mo- leculares removerá os componentes grandes encontrados no meio tais como albumina, certos componentes de pesos moleculares altos encontrados no soro, células e fragmentos de células. Embora não requerido, pode ser dese- jável pré-filtrar o meio condicionado para remover esses componentes maio- res antes da filtração com um filtro de poros menores para prevenir entupi- mento e capacidade de filtração diminuída de qualquer filtro empregado sub- seqüentemente. Outros métodos de filtração e de diálise podem ser usados para remover sal da composição de produto celular. Por exemplo, filtração de fluxo tangencial pode ser empregada para aumentar a concentração dos agentes de pele cultivados no meio condicionado. Além disso, filtração de fluxo tangencial pode ser empregada para reduzir a concentração de sal no meio condicionado. Para reduzir a concentração do sal, na medida em que o componente aquoso do meio condicionado é removido, ele é reposto com água. Certamente, a concentração dos agentes de pele cultivados e redução da concentração de sal podem ser repetidas pelo menos uma vez de modo que os agentes de pele cultivados são eficazmente rinsados de sais. Os a - gentes de pele cultivados podem ser ainda purificados, fragmentados, ou conjugados para formar uma citocina pura, proteína, ou composições de ma- triz extracelular, ou intensificados para distribuição direta a um tecido particu- lar, estrutura tecidual ou tipo de célula. Os aspectos dos sais purificados e reduzidos dos agentes de pele cultivados os tornam mais compatíveis, e são, portanto, preferidos, para formular preparações tópicas da invenção.

O meio condicionado que contém citocinas produzidas por cons- truções de pele ou pelas citocinas da invenção sozinha são úteis na cultura celular. O meio condicionado que contém citocinas é usado para crescer e sustentar linhagens de células por aumento de proliferação de células e ge- ração de novas células de pele vitais, controle da proliferação e diferencia- ção de células-tronco e progenitoras, e diferenciação mesenquimal (tal como diferenciação de células mesenquimais para células musculares). O meio condicionado é também usado para preparar outras construções de tecido para inibir ou estimular o crescimento de células em camadas ou direções particulares. O efeito do meio condicionado é dependente da concentração, com concentrações mais altas produzindo um efeito maior que concentra- ções mais baixas.

As composições de agentes de pele cultivados da invenção são particularmente úteis em preparações usadas no tratamento de pele. Assim, uma modalidade preferida da invenção compreende um meio de cultura ce- lular condicionado que contém qualquer um ou mais dos seguintes: citoci- nas, proteínas, e componentes de matriz extracelular, que são sintetizados e secretados das células de pele cultivadas para uso como uma preparação farmacêutica ou um produto para cuidado da pele. Em uma outra modalida- de preferida, a invenção é uma composição para cuidado da pele que com- preende agentes de pele cultivados sintetizados e secretados de células de pele cultivadas e um agente de veículo. O tipo das composições que contêm os agentes de pele cultivados a ser formulado dependerá da forma particular do agente e do uso pretendido. Aqueles com conhecimento no tratamento de tecidos epiteliais podem determinar a quantidade de agentes de pele cultiva- dos a ser formulada em uma preparação farmacêutica ou cosmética. Em uma modalidade preferida, a invenção é uma preparação cosmética, para administração tópica à pele, contendo os componentes do meio condiciona- do para cuidar e aperfeiçoar a aparência de pele. A preparação cosmética pode ser usada como está ou como um ingrediente dos seguintes exemplos de produtos não limitativos: hidratantes, cremes para a noite, cremes de ba- se, loções para bronzeamento solar, filtros solares, loções para as mãos, maquiagem e bases para maquiagem, máscaras, ou ungüentos.

Um benefício particular da invenção é um método simples de administração tópica à pele de uma composição para aumentar a geração e proliferação de células da pele, ceratinócitos e fibroblastos, diminuir a se- nescência celular epidérmica e suportar a síntese de componentes de matriz extracelular por células da pele, ou ambos, em um humano. O método não requer que a pele intacta seja pré-tratada para estimular o crescimento de células, o que torna este um método particularmente simples de administra- ção tópica à pele, não requerendo, de modo algum, abrasão da pele intacta por cirurgia plástica ou incisão. Contudo, em uma modalidade preferida da invenção, a pele é pré-tratada para remover todas ou algumas camadas do estrato córneo. O pré-tratamento pode ser mecânico, tal como, por exemplo, abrasão, com uma escova particular, bucha, ou similar, ou pode ser mecâni- co, inclusive bioquímico, tal como tratamento com um agente ceratolítico, tal como alfa-hidróxi ácido ou retina-A, ou com um óleo cosmeticamente aceitá- vel. Abrasão cirúrgica, usando dispositivos mecânicos, químicos ou laser, pode ser também realizada.

As formulações de agentes de pele cultivados usados no método da invenção são mais preferivelmente aplicadas na forma de composições apropriadas que compreendem agentes de pele cultivados de meio condi- cionado e um agente de veiculo. O veículo deve ser substancialmente inerte de modo a não reagir com os agentes de pele cultivados e diminuir sua ativi- dade. É preferível que o veículo intensifique e aperfeiçoe a permeação das citocinas na pele para aumentar sua eficácia. Veículos inertes adequados incluem água, álcool, polietileno glicol, óleo mineral ou gel de óleo, propileno glicol e outros conhecidos da técnica.

Para preparar as composições farmacêuticas desta invenção, uma quantidade eficaz dos agentes de pele cultivados particulares, como o ingrediente ativo, é combinada em mistura íntima com um veículo farmaceu- ticamente aceitável, em que o veículo pode tomar uma variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para administração. Essas composições farmacêuticas são desejáveis em forma de dosagem unitária adequada, particularmente, para administração tópica ou percutânea. Tam- bém incluídas estão as preparações em forma sólida que são destinadas a serem convertidas, imediatamente antes do uso, em preparações de forma líquida. Nas composições adequadas para administração percutânea, o veí- culo compreende adicionalmente um agente intensificador de penetração e/ou um agente molhante adequado, opcionalmente combinados com aditi- vos adequados de qualquer natureza em pequenas proporções, cujos aditi- vos não introduzem um efeito deletério significante na pele.

Devido ao fato de que os agentes de pele cultivados da invenção são, em geral, moléculas grandes, a composição de cuidado da pele da in- venção também compreende um "intensificador de penetração", algumas vezes denominado "intensificador de permeação", para auxiliar os agentes de pele cultivados em sua passagem através do estrato córneo. Intensifica- dores de penetração são substâncias que reduzem a capacidade da pele de realizar sua função de barreira. Sem um pouco de assistência, várias subs- tâncias não se difundirão na pele em taxas e quantidades significativas para serem terapêuticas. Intensificadores de penetração tornam a pele mais per- meável, permitindo que substâncias atravessem a pele em uma velocidade mais rápida, em concentrações mais altas, ou ambas. Deve ser observado què uma via de penetração particular da substância depende principalmente da condição da pele e das propriedades físico-químicas das substâncias que necessitam de intensificação de penetração.

A permeabilidade da pele humana depende das diferenças entre as pessoas bem como entre as várias regiões do corpo. A permeabilidade varia entre os indivíduos. A idade do paciente afeta a permeabilidade de substâncias através da pele. A pele de neonatos e de idosos é mais perme- ável que aquela de outros grupos de idade. Embora não se deseje estar li- gado à teoria, a etnia é também um fator na permeabilidade da pele; por e- xemplo, a pele dos caucasianos é bem mais permeável que a pele de afro- americanos. A permeabilidade varia entre regiões do corpo. As áreas mais permeáveis são as membranas mucosas, pele escrotal, e pálpebras. As á- reas de permeabilidade intermediária incluem a face, a cabeça, o peito, as costas, as nádegas, o abdome e os braços superiores e pernas. As áreas menos permeáveis são as superfícies palmares e plantares e unhas. A per- meabilidade varia com a pele ou condições. A pele hidratada é mais perme- ável que a pele seca. Por exemplo, água é um intensificador de permeação. Ao se aumentar a hidratação do estrato córneo, a função da barreira da pele pode ser reduzida, aumentando, assim, a permeabilidade da pele. Agentes oclusivos inibem a perda normal de água transepidérmica e provocam um aumento na hidratação da pele. Pelo uso de um agente oclusivo, a hidrata- ção de pele natural se torna um intensificador de penetração natural. Em pele rachada ou irritada, as substâncias podem mais facilmente se desvia- rem do estrato córneo, aumentando, assim, a permeabilidade. A pele mais quente é mais permeável. Inicialmente a pele com queimadura solar é me- nos permeável, mas depois do descascamento ela se torna mais permeável.

Pele termicamente queimada é mais permeável. As regiões da pele afetadas por eczema exibem permeabilidade aumentada. As regiões da pele afetadas por psoríase são mais espessas e menos permeáveis. Peelings químicos removem o estrato córneo e aumentam a permeabilidade da pele. Não so- mente a eficácia dos intènsificadores de penetração variará entre os tipos de pele e condições da pele, a via de penetração variará dependendo do inten- sificador de penetração e da substância que necessita de intensificação de penetração.

Existem várias vias principais pelas quais as substâncias podem atravessar o estrato córneo não rachado da pele e alcançar a circulação sis- têmica. Uma via direta é conhecida como a via transcelular, pelo que as substâncias atravessam a pele por passagem direta através de ambas as membranas de fosfolipídios e o citoplasma dos ceratinócitos mortos que constituem o estrato córneo. Embora este seja o caminho mais curto, as substâncias podem encontrar resistência significante à permeação porque os fármacos devem atravessar a membrana lipofílica de cada célula, então os conteúdos celulares hidrofílicos contendo a queratina, e então a bicama- da de fosfolipídios da célula, de novo. Por ter que passar através de várias células que compreendem o estrato córneo significa que esse potencial de resistência pode ser alto em alguns casos. Alguns intensificadores de pene- tração removem lipídios da pele para destruírem temporariamente a função de barreira da pele. Outras substâncias químicas podem intensificar a pene- tração em um outro modo mais complicado através da inibição da formação de estrato córneo, ou promoção de sua interrupção, para comprometer a função da barreira da pele e, talvez, intensificar de penetração.

Uma outra via através da pele é via a rota intracelular pelo que as substâncias que estão atravessando a pele por esta rota devem passar através dos pequenos espaços entre as células da pele, fazendo com que a rota fique mais tortuosa. Embora a espessura do estrato córneo seja de so- mente cerca de 20 μηι, a via de difusão real da maior parte das moléculas que está atravessando a pele é da ordem de 400 μητι. Um aumento de 20 vezes na via real de moléculas permeadoras reduz grandemente a taxa de penetração.

Ainda uma outra via de penetração é a rota folicular. Folículos do cabelo penetram através do estrato córneo para a derme, permitido acesso mais direto às células na matriz dérmica. Intensificadores de permeação foli- cular almejam a distribuição folicular por concentração nos poros e partição através da pele para transportar agentes para as células da pele sob o estra- to córneo. A rota folicular depende da presença de folículos de cabelo na pele.

Intensificadores de penetração podem ser classificados em ca- tegorias tais como "intensificador de penetração folicular", "intensificador de penetração químico" e "intensificador de penetração ativo".

Exemplos de intensificadores de penetração folicular incluem fosfolipase A2 e fosfolipase C dependente de fosfatidilcolina.

Exemplos de intensificadores de penetração químicos incluem álcoois tais como etanol, metanol, e isopropanol; clorofórmio; mentol; terpe- nos; acetonas; detergentes; bases; propileno glicol; pirrolidonas; dimetilace- tamida; dimetilformamida; sulfóxido de dimetila; sulfóxido de alquila; óxido de fosfina; tensoativos; caprolactams tal como azona; aminas e amidas; amino Ν,Ν-distribuído-acetato de alquila; sulfóxido de decilmetila; pirrolidonas; piro- tiodecano (HPE-101); benzalcônio; polímeros de cloreto de benzalcônio; po- límeros com base em silicone; ácidos graxos; uréias cíclicas; terpenos; e ciclodextrinas; e queratinolíticos tal como ácido salicílico uréia. Intensificado- res de penicilina com base em silicone preferidos incluem Ciclometicona e Dimeticona Copoliol (PEG/PPG-18/18 Dimeticona).

Exemplos de intensificadores de penetração ativos incluem Ii- possomos, fulerenos e fosfolipídios, tais como fosfolipídios descritos no Pe- dido de Patente US 20040220100 de Waugh.

Técnicas físicas que podem ser adicionalmente empregadas pa- ra penetração intensificada dos agentes de cuidado da pele da invenção in- cluem iontoforese, ultra-som, eletroporação, remoção de fitas, o uso de pis- tolas de genes ou outros dispositivos propelentes, pontas tais como aquelas usadas para testes de TB ou microagulhas que penetram na superfície ex- terna da pele; ou abrasivos que removem as camadas externas da pele.

Um intensificador de penetração químico preferido é um políme- ro com base em silicone. Polímeros com base em silicone preferidos para uso na invenção são selecionados do grupo que consiste em: ciclometicona e dimeticona copoliol (PEG/PPG-18/18 Dimeticona). Outros polímeros com base em silicone podem ser identificados ou incorporados em uma prepara- ção com os agentes de pele cultivados para auxiliarem na penetração de agentes de pele cultivados na pele de um indivíduo. Embora não se deseje estar ligado à teoria, o mecanismo de ação da penetração com base em sili- cone é que o polímero com base em silicone proporciona uma barreira de umidade sobre a pele de modo que a pele fica mais hidratada que sem o polímero com base em silicone. Conforme discutido acima, a pele hidratada é mais permeável que a pele seca e por aumento da hidratação do estrato córneo, a função de barreira da pele é reduzida, criando assim permeabili- dade à pele permitindo a passagem dos agentes de pele cultivados para as camadas da pele.

Além da aplicação tópica direta das preparações de agentes de pele cultivados, as composições desta invenção podem ser topicamente administradas por outros métodos, por exemplo, encapsuladas em uma ma- triz sensível à temperatura e/ou à pressão ou em filme ou veículo sólido, que é solúvel nos fluidos corpóreos e similares, para subseqüente liberação, pre- ferivelmente liberação constante do componente ativo.

Como composições apropriadas para aplicação tópica podem ser citadas todas as composições usualmente empregadas para administra- ção de produtos terapêuticos, por exemplo, cremes, gelatinas, curativos, xampus, tinturas, pastas, ungüentos, pomadas, pós, emulsões, formulação líquida ou semi-líquida e similar. A aplicação das ditas composições pode ser por aerosol, tal como com um propelente tais como ar, nitrogênio, dióxido de carbono, freon, ou sem propelente tal como pulverizador com bomba, atomizador, gotas, loções, ou um semi-sólido tal como uma composição es- pessada que pode ser aplicada como um cotonete. Em particular, as compo- sições semi-sólidas tais como pomadas, cremes, pastas, geléias, ungüentos e similares são convenientemente usados.

Os agentes de pele cultivados da presente invenção podem ser usados, como estabelecido acima, para muitas aplicações que podem ser consideradas como usos para cuidado da pele, tal como para manter a pele com uma aparência jovem. Um modo de reter tal aparência é cessar ou re- verter a senescência das células da pele. Vários estudos têm mostrado que células diplóides normais sofrem numerosas alterações celulares, fisiológi- cas, bioquímicas e moleculares durante passagem in vitro. A maioria das alterações é progressiva e cumulativa e leva a uma cessação irreversível da proliferação, seguida por morte celular. Essas alterações têm sido conside- radas como indicativas de envelhecimento celular in vitro. Similarmente, es- ses eventos ocorrem in vivo, e são visualmente apreciados na pele. Muitos pesquisadores estão trabalhando para cessar ou reverter a senescência pa- ra manter as populações de células jovens, saudáveis e proliferativas em tecidos do paciente. O tratamento de células da pele usando os agentes de pele cultivados da invenção resulta na síntese das células dos componentes de matriz extracelular para manter e restaurar a matriz extracelular que cir- cunda e suporta as mesmas. Segue que a manutenção e restauração da matriz extracelular resultam na cessação e reversão dos sinais e envelheci- mento, inclusive do aparecimento de linhas finas e rugas.

Composições de cuidado da pele conhecidas da técnica para uso tópico sobre a pele, preferivelmente hipoalergênicas e de pH controlado, são especialmente preferidas, e incluem águas de toalete, compressas, lo- ções, leites para a pele ou loções leitosas. As preparações contêm, além dos agentes de pele cultivados, os componentes usualmente empregados em tais preparações para funcionarem como veículos para as citocinas cultiva- das. Exemplos de tais componentes de veículo são óleos, gorduras, ceras, tensoativos, umectantes, agentes espessantes, antioxidantes, estabilizado- res de viscosidade, agentes quelantes, tampões, conservantes, perfumes, corantes, alcanóis inferiores, e similares. Se desejado, outros ingredientes podem ser incorporados nas composições, por exemplo, agentes antiinfla- matórios, antibacterianos, antifúngicos, desinfetantes, vitaminas, filtros sola- res, antibióticos, agentes de clareamento da pele, intensificadores de cicatri- zação/compostos de proliferação de fibroblastos, agentes bloqueadores neu- romusculares, filtros solares, ou outros agentes anti-acne.

Exemplos de óleos como agente de veículo compreende gordu- ras e óleos tais como óleo de oliva e óleos hidrogenados; ceras tais como ceras de abelha e lanolina; hidrocarbonetos tais como parafina líquida, cere- sina e esqualeno; ácidos graxos tais como ácido esteárico e ácido oléico; álcoois tais como álcool cetílico, álcool estearílico, álcool de lanolina, e he- xadecanol; e ésteres tais como miristato de isopropila, palmitato de isopropi- Ia e estearato de butila. Como exemplos de tensoativos como agentes de veículo podem ser citados tensoativos aniônicos tais como estearato de só- dio, cetilsulfato de sódio, polioxietileno Iauril éter fosfato, N-acil glutamato de sódio; tensoativos catiônicos tais como cloreto de estearildimetilbenzilamônio e cloreto de esteariltrimetilamônio; tensoativos anfolíticos tais como soluções de cloridrato de alquilaminoetilglicina e lecitina; e tensoativos não iônicos tais como monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitan, ésteres de ácido graxo sacarose, monoestearato de propileno glicol, éter de polioxietile- no oleílico, monoestearato de polietileno glicol, sorbitan-monopalmitato de polioxietileno, monoetanolamida de ácido graxo de coco polioxietileno, polio- xipropileno glicol (tais como os materiais vendidos sob a marca registrada "Pluronic"), óleo de mamona polioxietileno, e polioxietileno lanolina. Exem- plos de umectantes como agentes de veículo incluem glicerina, 1,3-butileno glicol, e propileno glicol; exemplos de álcoois inferiores incluem etanol e iso- propanol; exemplos de agentes espessantes incluem goma de xantano, hi- droxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, polietileno glicol e carboxime- til celulose sódica. Exemplos de antioxidantes compreendem hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, gaiato de propila, ácido cítrico, etoxiquina, ácido alfa-lipóico, vitamina C, vitamina E, coenzima Q-10, e idebenona; anti- oxidantes botânicos incluem caratenóides tal como licopeno; flavonóides tais como silimarina (cardo de leite), silibina, silidianina, silicristina; sojas (isofla- vinas); extrato de sementes de uva; polifenóis tais como extrato de chá ver- de, ácido rosmarínico (alecrim), hipercina (erva de São John), oleuropeína (folha de oliveira), curcurmina (raiz tumérica), tetraidrocurcumina, e picoge- nol (pinheiro de casca marinho). Exemplos de agentes antiinflamatórios in- cluem produtos botânicos antiinflamatórios tais como alantoína, babosa, ginkgo biloba, chá verde (também considerado um antioxidante). Exemplos de agentes de clareamento da pele são hidroquinona ou ácido kójico. Exem- pios de intensificadores de cicatrização/compostos de proliferação de fibro- blastos incluem peptídeos de cobre ou palmitoil-pentapeptídeo (pal-KTTKS). Exemplos de agentes bloqueadores neuromusculares tal como acetil hexa- peptídeo 3 (argirelina) ou dimetilaminoetanol. Exemplos de agentes quelan- tes incluem edetato de dissódio e difosfato de etanoidróxi. Exemplos de tampões como agentes de veículo compreendem ácido cítrico, citrato de só- „ dio, ácido bórico, bórax, e hidrogeno-fosfato dissódico; e exemplos de con- servantes são paraidroxibenzoato de metila, paraidroxibenzoato de etila, á- cido desidroacético, ácido salicílico e ácido benzóico.

Para preparar ungüentos, cremes, águas de toalete, leites para pele, e similares, tipicamente de cerca de 0,01 a cerca de 90%, em particular de cerca de 0,1 a cerca de 20% e mais em particular de cerca de 0,2 a cerca de 25% do ingrediente ativo, por exemplo, das citocinas cultivadas, serão incorporadas às composições. Em ungüentos ou cremes, o veículo, por e- xemplo, consiste em 1 a 20%, em particular 5 a 15% de um umectante, 0,1 a 10%, em particular de 0,5 a 5% de um espessante e água; o dito veículo po- de consistir em 70 a 99%, em particular 20 a 95% de um tensoativo, e 0 a 20%, em particular 2,5 a 15% de uma gordura; ou 80 a 99,9%, em particular 90 a 99% de um espessante, ou 5 a 15% de um tensoativo, 2-15% de um umectante, 0 a 80% de um óleo, pouquíssimas quantidades (<2%) de con- servante, agente corante e/ou perfume, e água. Em água de toalete, o veícu- lo consiste em, por exemplo, de 2 a 10% de um álcool inferior, 0,1 a 10% ou em particular de 0,5 a 1 % de um tensoativo, 1 a 20%, em particular 3 a 7% de um umectante, O a 5% de um tampão, água e pequenas quantidades (<2%) de conservante, corante e/ou perfume. Em um leite para a pele, o veí- culo consiste em 10-50% de óleo, 1 a 10% de tensoativo, 50-80% de água e 0 a 3% de conservante e/ou perfume. Nas preparações mencionadas acima, todos os símbolos % referem-se a peso em percentagem em peso.

Composições particulares para uso no método da presente in- venção são aquelas em que os agentes de pele cultivados são formulados em composições que contêm Iipossomos que são agentes de veículo fun- cionais para os agentes de pele cultivados. Lipossomos são vesículas artifi- ciais formadas por moléculas anfifáticas tais como lipídios polares, por e- xemplo, fosfatidil colinas, etanolaminas e serina, esfingomiclinas, cardiolipi- nas, plasmalogênios, ácidos fosfatídicos e cerebiosídeos. Lipossomos são formados quando moléculas anfifáticas adequadas são deixadas intumescer em água ou em soluções aquosas para formarem cristais líquidos usualmen- te de estrutura de multicamada compreendida de muitas bicamadas separa- das umas das outras por material aquoso (também denominados Iipossomos grosseiros). Um outro tipo de Iipossomo conhecido como consistindo em uma bicamada única que encapsula material aquoso é referido como vesícu- Ia unilamelar. Se materiais solúveis em água estão incluídos na fase aquosa durante o intumescimento dos lipídios eles ficam presos na camada aquosa entre as bicamadas de lipídio.

Ingredientes ativos solúveis em água tais como, por exemplo, várias formas de sal de agentes de pele cultivados, são encapsulados nos espaços aquosos entre as camadas moleculares. Ingredientes ativos solú- veis em lipídios de citocinas cultivadas, tal como um mimético orgânico, são predominantes incorporados nas camadas de lipídios, embora grupos de cabeça polar possam se projetar da camada para o espaço aquoso. A en- capsulação desses compostos pode ser efetuada por vários métodos. O mé- todo mais comumente usando envolve moldar um filme delgado de fosfolipí- dio sobre as paredes de um frasco por evaporação de um solvente orgânico. Quando esse filme é disperso em um meio aquoso adequado, Iipossomos multilamelares são formados. Mediante sonicação adequada, os Iipossomos grosseiros formam vesículas fechadas similarmente menores.

Ingredientes ativos solúveis em água são usualmente incorpora- dos por dispersão do filme moldado com uma solução aquosa do composto. O composto não encapsulado é então removido por centrifugação, cromato- grafia, diálise ou outros procedimentos adequados conhecidos da técnica. O ingrediente ativo solúvel em lipídio é usualmente incorporado por dissolução dele no solvente orgânico com o fosfolipídio antes de moldar o filme. Se a solubilidade do material na fase lipídica não está em excesso ou a quantida- de presente não está em excesso daquela que pode ser ligada ao lipídio, os Iipossomos preparados pelo método acima contêm usualmente a maior parte do material ligado nas bicamadas de lipídios; separação dos Iipossomos do material não encapsulado não é requerida.

Um método particularmente conveniente para preparar formas formuladas de Iipossomos de produtos terapêuticos contendo agentes de pele cultivados é o método descrito em EP-A-253.619, aqui incorporado a título de referência. Nesse método, Iipossomos de bicamada única contendo agentes de pele cultivados encapsulados são preparados por dissolução do componente de lipídio em um meio orgânico, injeção da solução orgânica do componente de lipídio sob pressão em uma componente aquoso enquanto são misturados simultaneamente os componentes orgânicos e aquosos com um homogeneizador de alta velocidade ou dispositivos misturadores, sobre os quais os Iipossomos são formados espontaneamente.

Os Iipossomos de bicamada única contendo os agentes de pele cultivados encapsulados podem ser empregados ou eles podem ser empre- gados em um veículo farmaceuticamente aceitável, adequado, para adminis- tração tópica. A viscosidade dos Iipossomos pode ser aumentada pela adi- ção de um ou mais agentes espessantes adequados tais como, por exem- plo, goma de xantano, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose e misturas destes. O componente aquoso pode consistir em água sozinha ou ele pode conter eletrólitos, sistemas tamponados e outros ingredientes, tais como, por exemplo, conservantes. Eletrólitos adequados que podem ser empregados incluem sais de metal, tais como sais de metal alcalino e de metal alcalino terroso. Os sais de metal preferidos são cloreto de cálcio, clo- reto de sódio e cloreto de potássio. A concentração do eletrólito pode variar de zero a 260mM, preferivelmente de 5mM a 160mM. O componente aquoso é colocado em um vaso adequado que pode ser adaptado para realizar a homogeneização efetuando grande turbulência durante a injeção do compo- nente orgânico. A homogeneização dos dois componentes pode ser realiza- da dentro do vaso, ou, alternativamente, os componentes aquosos e orgâni- cos podem ser injetados separadamente em um dispositivo misturador loca- lizado fora do vaso. No último caso, os Iipossomos são formados nos dispo- sitivos misturadores e então transferidos para um outro vaso para fins de coleta.

O componente de veículo orgânico consiste em um solvente farmaceuticamente aceitável, atóxico, adequado, tais como, por exemplo, etanol, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol, e um fosfolipídio adequa- do que é solúvel no solvente. Fosfolipídios adequados que podem ser em- pregados incluem, por exemplo, lecitina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fos- fatidiletanol amina, fosfatidilinositol, Iisofosfatidilcolina e fosfatidil glicerol. Outros aditivos lipofílicos podem ser empregados de modo a modificar sele- tivamente as características dos lipossomos. Exemplos de tais outros aditi- vos incluem estearilamina, ácido fosfatídico, tocoferol, colesterol e extratos de lanolina.

Além disso, outros ingredientes que podem prevenir a oxidação dos fosfolipídios podem ser adicionados ao componente orgânico. Exemplos de tais outros ingredientes incluem tocoferol, hidroxianisol butilado, hidroxito- Iueno butilado, palmitato de ascorbila e oleato de ascorbila. Conservantes, tais como ácido benzóico, metil parabeno e propil parabeno podem ser tam- bém adicionados.

À parte das composições descritas acima, pode ser feito uso de coberturas, por exemplo, emplastros, bandagens, curativos, chumaços de gaze e similares, contendo a composição desta invenção com uma quanti- dade apropriada de agentes de pele cultivados. Em alguns casos, podem ser usados emplastros, bandagens, curativos, chumaços de gazes e similares que tenham sido impregnados com uma formulação tópica contendo a for- mulação terapêutica. Selantes de tecido, tais como colas cirúrgicas, para auxiliar no fechamento do ferimento podem conter também agentes de pele cultivados. Um exemplo preferido de um selante de tecido é cola de fibrina devido a sua compatibilidade com células. Os selantes ou em forma líquida são apropriados para adição e mistura na composição de agentes de pele cultivados. Quando os agentes de pele cultivados da invenção são adiciona- dos aos selantes e a composição é aplicada a um ferimento para auxiliar no fechamento do ferimento, as citocinas intensificam a cicatrização do ferimen- to pelas células na área em que o selante é aplicado.

Em um método preferido para tratar pele com composição de agentes de pele cultivados, a composição de agentes de pele cultivados é misturada com um veículo que inclui um intensificador de penetração, tal como silicone, que é um exemplo de um intensificador de penetração quími- co, para formar uma composição de cuidado da pele. A composição de cui- dado da pele é topicamente aplicada a uma região da pele que exibe a apa- rência de rugas para tratar a pele de modo a reduzir a aparência de rugas. Preferivelmente, a aplicação tópica é feita repetidamente, pelo menos uma vez ao dia e, mais preferivelmente, duas vezes ao dia. A composição da in- venção, quando aplicada topicamente, induz os fibroblastos presentes na pele a sintetizarem elastina nova e aumentarem o colágeno na zona de Grenz da pele, conforme demonstrado por histologia. A aparência de rugas é reduzida conforme demonstrado por fotografia. Portanto, um método da in- venção é um método para reduzir a aparência de rugas na pele, em que o método compreende aplicar topicamente a composição à pele que tem uma região que exibe a aparência de rugas e, em que, a composição induz de novo a síntese de elastina e um aumento de colágeno na camada da zona de Grenz da pele pelas células da pele naquela região resultando em um decréscimo da aparência de rugas.

Em uma modalidade preferida, o método para tratar a pele com uma composição de agentes de pele cultivados, a pele foi inicialmente sub- metida a um tratamento de resurfacing. Todos os tratamentos de resurfacing da pele trabalham essencialmente do mesmo modo. Em primeiro lugar, as camadas externas de pele Iesionada são removidas. Então, conforme novas células se multiplicam e migram para a área que sofreu resurfacing durante o processo de cicatrização, surgindo uma superfície de pele mais lisa, mais firme, de aparência mais jovem. Durante o processo de cicatrização, as composições de agentes de pele cultivados derivados de meio condicionado são aplicadas à área tratada para intensificar e acelerar a cicatrização e re- pigmentação da pele. Para resurfacing superficial ou médio, as camadas de tecido de pele removido podem ser limitadas à epiderme e à derme papilar. Para resurfacing mais profundo, os níveis superiores da derme reticular po- dem ser também removidos. A penetração variada permite o tratamento de manchas específicas ou rugas.

Em resurfacing a laser, algumas vezes chamado de "peeling a laser", laser de dióxido de carbono (CO2) é usado para remover áreas da pele Iesionada ou enrugada, camada por camada. Resurfacing a laser é rea- lizado usando um feixe de energia laser que vaporiza as camadas superio- res da pele lesionada, em níveis de penetração controlados e específicos. O procedimento é mais comumente usado para minimizar a aparência de li- nhas finas, especialmente em torno da boca e dos olhos; contudo, é também eficaz no tratamento de cicatrizes e áreas faciais de pigmentação irregular. Freqüentemente, o procedimento é efetuado em conjunto com uma outra operação cosmética, tal como cirurgia facial ou da pálpebra.

"Dermabrasão" e "dermoalisamento" auxiliam a retocar as ca- madas de topo da pele através de um método de raspagem cirúrgica contro- lada. Os tratamentos amaciam as bordas agudas das irregularidades super- ficiais, proporcionando uma aparência mais lisa. A dermabrasão é mais fre- qüentemente usada para melhorar a aparência da pele facial deixada com cicatrizes por acidentes ou cirurgia anterior, ou para alisar as rugas faciais finas, tais como aquelas em volta da boca, mas é algumas vezes usada para remover crescimentos pré-cancerosos chamados ceratoses. Na dermabra- são, o cirurgião raspa a camada mais externa com uma escova de fios áspe- ros, ou uma broca contendo partículas de diamante, fixada a um cabo moto- rizado. A raspagem continua até que o cirurgião alcance o nível mais seguro que tornará a cicatriz ou ruga menos visível. Dermoalisamento é comumente usado para tratar cicatrizes de acne mais profundas. No dermoalisamento, o cirurgião usa um instrumento segurado pela mão chamado dermátomo.

Lembrando um aparelho de barbear elétrico, o dermátomo tem uma lâmina oscilante que se move para trás e para frente para raspar uniformemente as camadas de superfície da pele que circundam as crateras ou outros defeitos faciais. Essa raspagem continua até que o ponto mais inferior da cicatriz da acne ou ruga se torna mais uniforme com a pele circundante. Ambas a der- mabrasão e o dermoalisamento podem ser realizados sobre áreas pequenas da pele ou sobre a face inteira. Eles podem ser também usados sozinhos, ou em conjunto com outros procedimentos tais como cirurgia estética da face ("facelift"), remoção ou revisão de cicatriz, ou peeling químico.

Os peelings químicos usam uma solução química para aperfei- çoar e alisar a textura da pele facial por remoção de suas camadas externas danificadas. Fenol, ácido tricloroacético (TCA), e alfa-hidróxi ácidos (AHAs) são usados com esta finalidade. Embora o peeling químico possa ser reali- zado em conjunto com "facelift", ele não é um substituto, nem prevenirá ou retardará o processo de envelhecimento. Alfa-hidróxi ácidos (AHAs), tal co- mo ácido glicólico, láctico e de frutas são os mais moderados das fórmulas de peeling e produzem peelings leves. Peelings com AHA podem ser usados para o tratamento de rugas finas, áreas secas, pigmentação irregular e acne. Várias concentrações de um AHA podem ser aplicadas semanalmente ou em intervalos mais longos para obtenção do melhor resultado. Um alfa- hidróxi ácido, tal como o ácido glicólico, pode ser também misturado com uma lavagem ou creme facial em concentrações menores, contendo as cito- cinas como parte do regime diário de cuidado da pele para melhorar a textu- ra da pele. Ácido tricloroacético (TCA) pode ser usado em muitas concentra- ções, mas é também usado para peeling de profundidade média. Rugas su- perficiais finas, manchas superficiais e problemas de pigmentos são comu- mente tratados com um ou mais tratamentos com TCA. O fenol é a mais for- te das soluções químicas e produz um peeling profundo, e algumas vezes ele clareia as áreas tratadas e afeta a pigmentação da pele para o prazo i- mediato. Ele é usado principalmente para tratar pacientes com rugas faciais grosseiras, áreas de pele manchada e danificada por causa de exposição ao sol, ou crescimentos pré-cancerosos.

Depois de um procedimento de re-surfacing da pele, a pele fica muito vermelha e inchada, associada a algum formigamento, queimação, ou dor; qualquer dor pode ser controlada com medicações. O inchaço cede em uns poucos dias a uma semana e uma casca ou crosta de ferida se formará sobre a área tratada na medida em que ela começa a cicatrizar. Essa cairá conforme uma nova camada de pele rosa e firme se forma embaixo. Quando o procedimento termina, o cirurgião pode escolher tratar a área submetida ao resurfacing com aplicações de cremes protetores ou ungüentos que con- têm a composição de agentes de pele cultivados até que a cicatrização se complete. Se o ungüento é aplicado imediatamente depois da cirurgia, pouca ou nenhuma casca se formará. Alguns cirurgiões podem também escolher aplicar uma bandagem sobre as áreas tratadas que cobrirão e protegerão a pele em cicatrização pelos primeiros cinco a dez dias. O ungüento contendo a composição de agentes de pele cultivados que é aplicado às áreas que passaram pelo resurfacing beneficia o paciente por proporcionar fatores de crescimento que suportam o crescimento de células de pele jovem para cica- trização mais rápida e um efeito cosmético aperfeiçoado.

Os seguintes exemplos são proporcionados para mais bem ex- plicar a prática da presente invenção e não devem ser interpretados, de mo- do algum, como Iimitativos da presente invenção. Aqueles versados nas téc- nicas reconhecerão que várias modificações podem ser efetuadas nos mé- todos descritos aqui embora não se desviem do espírito e do escopo da pre- sente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Cultivar uma Construção de Pele de Bicamada para Produzir o

Meio Condicionado

Fibroblastos de prepúcio neonatal humano (originado em Orga- nogenesis, Inc. Canton, MA) foram semeados em 5 χ 105 células/162 cm2 do frasco tratado com cultura de tecido (Costar Corp., Cambridge, MA, cat# 3150) e crescidos em meio de crescimento. O meio de crescimento consistiu em: meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (formulação com alto teor de glicose, sem L-glutamina, Bio Whittaker, Walkersville, MD) suplemen- tado com 10% de soro de bezerro recém-nascido (NBSC) (HyClone Labora- tories, Inc., Logan, Utah) e 4mM de L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD). As células foram mantidas em uma incubadora a 37±1°C com uma at- mosfera de 10±1% de CO2. O meio foi substituído com meio recém- preparado a cada de dois a três dias. Depois de 8 dias em cultura, as células haviam crescido para confluência, ou seja, as células haviam formado uma monocamada compacta juntamente com o fundo do frasco de cultura de te- cido, e o meio foi aspirado do frasco de cultura. Para rinsar a monocamada, a solução salina tamponada com fosfato esterilizado em filtro foi adicionada ao fundo de cada frasco de cultura e então aspirada dos frascos. As células foram liberadas do frasco por adição de 5 mL de tripsina-verseno glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD) a cada frasco e girando gentilmente para assegurar a cobertura completa da monocamada. As culturas foram envia- das de volta para a incubadora. Tão logo as células foram liberadas 5 mL de SBTI (Inibidor de Tripsina de Soja) foram adicionados a cada frasco e mistu- rados com a suspensão para interromper a ação da tripsina-verseno. A sus- pensão de células foi removida dos frascos e uniformemente dividida entre os tubos de centrífuga cônicos estéreis. As células foram coletadas por cen- trifugação em aproximadamente 800-1.000 χ g por 5 minutos.

Um aparelho similar àquele mostrado na Figura 1 foi usado para conduzir o trabalho descrito a seguir. A cobertura é removida para conduzir a operação, mas é, de outro modo, mantida no lugar para manter a esterilida- de. Informação pertinente com respeito ao aparelho é listada: Recipiente externo 10 tem um diâmetro de 38 mm e uma capacidade de 35 mL. O reci- piente interno 20 tem um diâmetro de 24 mm e uma capacidade de 4 mL. O elemento permeável 24 consiste em uma membrana de policarbonato com um tamanho de poro de cerca de 3 μm (micra) e uma espessura de 5 μm (micra). Um gel de colágeno hidratado acelular 25 foi formado sobre o elemento permeável 24 como a seguir: Uma solução de "pré-mistura" de 16,2 mL de 10X de Meio Essencial Mínimo (MEM), 1,6 mL de 200mM de L- glutamina, 0,2 mL de 50 mg/mL de gentamicina, 18,0 mL de soro bovino fe- tal, 5,0 mL de 71,2 mg/mL de bicarbonato de sódio. As soluções de estoque foram assepticamente combinadas na seqüência acima, e estocadas a 4°C, por aproximadamente 30 minutos em um tubo estéril de 50 mL. Cerca de 27,8 g de 1 mg/mL de solução de colágeno (extraído com ácido do tendão extensor digital comum de bezerro) em 0,05% v/v de ácido acético, foram pesados em um tubo de 50 mL e armazenado a 4°C por 30 minutos. Cerca de 8,2 mL da pré-mitura descrita acima e 4 mL de DMEM completo (conten- do 10% de FBS, 4mM de L-glutamina, 50 μg/mL de gentamicina) foram adi- cionados e alíquotas de 1 mL foram pipetadas sobre a membrana do recipi- ente interno 20 e deixadas para formar gel na temperatura ambiente.

A camada dérmica, um gel de colágeno hidratado contendo as células, foi moldada com fibroblastos dérmicos humanos e semeada com células epidérmicas (epiteliais) humanas conforme descrição abaixo. Uma descrição dos procedimentos e reagentes pode ser também encontrada nas Patentes US 4.485.096 de Bell, US 5.536.656 de Kemp et ai., e US 5.712.163 de Parenteau. A mistura de moldagem para preparar a camada dérmica incluiu cerca de 8,2 mL da pré-mistura descrita acima à qual foram adicionados até 27,8 g de 1 mg/mL de colágeno em 0,05% v/v de ácido acé- tico, também descrita acima, e 4 ml de fibroblastos dérmicos humanos em uma densidade de 2,5 χ 105 células/mL. Alíquotas de cerca de 3 mL foram pipetadas no recipiente 20 sobre o gel de colágeno hidratado acelular 25 formado acima e deixada geleificar. Cerca de 4,5 mL de Meio Essencial Mí- nimo de DuIbecco (DMEM) completo foram adicionados ao recipiente exter- no 20 e então incubados a 36°C/10% de CO2 por 4 a 8 dias para deixar as células contraírem o colágeno para formar uma rede de colágeno contraído para servir como uma camada dérmica 52.

O seguinte meio foi preparado para proporcionar células epidér- micas para a superfície de topo da camada dérmica 52, um processo referi- do como epidermalização. Culturas de monocamada de células epidérmica foram cultivadas e colhidas de um modo similar aos fibroblastos dérmicos acima. A formulação do meio de epidermalização consistindo em uma mistu- ra de base de DMEM Isento de Cálcio e F-12 de Ham misturados em uma razão de volume por volume de 3:1 foram adicionados os seguintes compo- nentes: 1,1mM de hidrocortisona, 5 μς/ιηΐ- de insulina, 5 μ9/ηιΙ_ de transferri- na, 20 pM de triiodotironina (T3), 1 χ 104 de etanolamina, 1 χ "ICT4M de o- fosforiletanolamina, 0,18mM de adenina, 2 χ 10"9M de progesterona, 5,26 χ 10"8M de selênio, 0,3% de soro de bezerro recém-nascido, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF).

A epidermalização foi iniciada em 6 dias depois de moldar o e- quivalente de tecido. O meio que banhava a construção dérmica acima foi removido de ambos os recipientes interno 20 e externo 10. Uma suspensão de 50 μl de células epidérmicas humanas (aproximadamente 3,33 χ 106 cé- lulas) foi colocada sobre a construção dérmica. O recipiente foi então incu- bado a 36°C e 10% de CO2 por 24 horas, depois de cujo tempo 12,0 mL de meio de epidermalização foram então adicionados à câmara externa e 4 mL ao poço. As culturas foram então levadas de volta para a mesma incubado- ra.

Em dois dias pós-epidermalização, foi efetuada a diferenciação da camada epidérmica por adição de cálcio à formulação do meio de epi- dermalização. O meio de epidermalização condicionado foi removido da pla- ca de cultura, colocado de lado, e reposto com o meio de diferenciação. Ao meio de diferenciação que consistia em uma mistura de base de DMEM I- sento de Cálcio e F-12 de Ham misturados em uma razão de volume por volume de 3:1 foram adicionados os seguintes componentes: 1,1mM de hi- drocortisona, 5 μg/mL de insulina, 5 μg/mL de transferrina, 20 pM de triiodoti- ronina (T3), 1 χ 104 de etanolamina, 1 χ 10"4M de o-fosforiletanolamina, 0,18 mM de adenina, 2 χ 10"9M de progesterona, 5,26 χ IO 8M de selênio, 0,3% de soro de bezerro recém-nascido, 10 ng/mL de fator de crescimento epi- dérmico (EGF) e 1,8mM de cloreto de cálcio. As culturas foram então leva- das de volta para a mesma incubadora. Aos 5 dias após a epidermalização, a cultura foi levantada por ar para levar a superfície da camada epidérmica em formação da construção de pele cultivada para a interface ar-líquido, ou seja, para contatar a superfí- cie epidérmica com ar. O meio de diferenciação condicionado foi removido de ambas as câmaras interna e externa da placa, colocado de lado, e o reci- piente interno foi removido e chumaços de algodão foram posicionados no interior do fundo da câmara externa 10 e o meio de cornificação foi adiciona- do à câmara inferior para impregnas os chumaços. O recipiente interno 20 foi levado de volta para descansar sobre os chumaços de algodão impreg- nados, em que cuidado deve ser tomado para assegurar que não existem bolhas presas entre o recipiente e os chumaços. Ao meio de cornificação que consistia em uma mistura de base de DMEM Isento de Cálcio e F-12 de Ham misturados em uma razão de volume por volume de 3:1 foram adicio- nados os seguintes componentes: 1,1mM de hidrocortisona, 5 μg/mL de in- sulina, 5 μg/mL de transferrina, 20 pM de triiodotironina (T3), 1 χ 104 de eta- nolamina, 1 χ 10-4M de o-fosforiletanolamina, 0,18mM de adenina, 5,26 χ 10" 8M de selênio, 2% de soro de bezerro recém-nascido, e 2mM de ascorbato de sódio. As construções de pele cultivadas foram retornadas para a incuba- dora e cultivadas a 35,5°C e 10% de CO2.

A cada 4 dias, o meio condicionado foi removido, colocado de lado, e reposto com meio de manutenção fresco mais cálcio. Ao meio de manutenção que consistia em uma mistura de base de DMEM Isento de Cálcio e F-12 de Ham misturados em uma razão de volume por volume de 3:1 foram adicionados os seguintes componentes: 1,1mM de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina, 5 μg/mL de transferrina, 20 pM de triiodotironina (T3), 1 χ IO4M de etanolamina, 1 χ IO 4M de o-fosforiletanolamina, 0,18mM de ade- nina, 5,26 χ 10'8M de selênio, e 1% de soro de bezerro recém-nascido. Nes- te ponto, uma camada epidérmica bem estratificada 28 havia se formado sobre a superfície de topo da camada dérmica 52 que exibiu muitas das ca- racterísticas morfológicas e bioquímicas da pele nativa normal.

A epidermalização condicionada, diferenciação, cornificação, e meios de manutenção coletados do processo de fabricação de uma constru- ção de pele cultivada foram testados usando ensaios de proliferação de cé- lulas, migração, e ELISA.

Exemplo 2: Formação in vitro de uma Construção de Pele Formada de Ma- triz de Colágeno Produzida Endogenamente por Fibroblastos de Prepúcio Neonatal Humano

O médio condicionado foi produzido por construções de pele de bicamada tendo uma matriz produzida endogenamente por fibroblastos dér- micos conforme descrição na Publicação Internacional de Pedido PCT WO 00/29553 de Murphy, cuja exposição é aqui incorporada.

Fibroblastos de prepúcio neonatal humano foram cultivados, ex- pandidos em número, liberados de seu substrato, contados, concentrados, e então re-suspensos em uma concentração de 3 χ 106 células/mL, e semea- dos em inserções de membrana tratada com cultura de tecido, tamanho de poro de 0,4 mícron, diâmetro de 24 mm, em um bandeja de seis poços em uma densidade de 3,0 χ 106 células/TW (6,6 χ 105 células/cm2). Essas célu- las foram então mantidas com trocas de meios cada dois a três dias com meios frescos por 25 dias. Mais especificamente, o meio continha: uma mis- tura de base de 3:1 de DMEM, meio de Hams F-12 (Quality Biologics, Gai- thersburg, MD), 4mM de GIutaMAX (Gibco BRL, Grand lsland, NY) e aditi- vos: 5 ng/mL de fator de crescimento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 0,4 μg/mL de hidrocortisona (Sig- ma, St. Louis, MO), 1 χ IO 4M de etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY cat. #02400 de grau ACS), 1 χ 10"4M de o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/mL de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/mL de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20pM de triiodotironina (Sigma, St. Louis, MO), e 6,78 ng/mL de selênio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 50 ng/mL de ácido L-ascórbico (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0,2 μg/mL de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 μg/mL de glicina (Sigma, St. Louis, MO) e 0,05% de polietileno glicol (PEG) (Sigma, St. Louis1 MO).

Usando construções dérmicas de 25 dias conforme formadas acima, os ceratinócitos epidérmicos de prepúcio de neonatal humano normal foram semeados na superfície de topo da construção de matriz de células para formar a camada epidérmica da construção de pele. O meio foi assepti- camente removido da inserção de cultura e suas redondezas. Foram usados ceratinócitos epidérmicos humanos normais que haviam sidos graduados para a passagem 4 de estoque de células de subcultura congelado para con- fluência. As células foram então liberadas das placas de cultura usando trip- sina-verseno, agrupadas, centrifugadas para formar um precipitado de célu- las, re-suspensas em meio de epidermalização, contadas e semeadas no topo da membrana em uma densidade de 4,5 χ 104 células/cm2. As constru- ções foram então incubadas por 90 minutos a 37±1°C, 10% de CO2 para deixar que os ceratinócitos se fixassem. Depois da incubação, as constru- ções foram submersas em meio de epidermalização. O meio de epidermali- zação é composto de: uma mistura de base de 3:1 de Meio de Eagle Mofi- cado com Dulbecco (DMEM) (sem glicose e sem cálcio, BioWhittaker1 Wal- kersville, MD) e meio F12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg), suple- mentado com 0,4 μg/mL de hidrocortisona (Sigma St. Louis, MO), 1 χ 10'4 de etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 χ 10"4M de o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/mL de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/mL de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20pM de triiodotiroina (Sigma, St. Louis, MO), 6,78 ng/mL de selênio (Aldrich), 24,4 μg/mL de adenina (Bio- Whittaker, MD), 50 μg/mL de sal de L-ascorbato de sódio (Sigma Aldrich Fi- ne Chemicals Company, Milwaukee, WI), 16μΜ de ácido linoléico (Sigma, St. Louis, MO), 1μΜ de Acetato de tocoferol (Sigma, St. Loius, MO) e 50 μg/mL de sulfato de gentamicina (Amersham, Arlington Heights, IL). As construções foram cultivadas na meio de epidermalização por 2 dias a 37±1°C, 10±1% de CO2.

Depois de 2 dias, o meio foi trocado com meio fresco composto conforme acima, e retornado para a incubadora ajustada para 37±1°C, 10+1% de CO2 por 2 dias. Depois dos 2 dias, o veículo contendo a constru- ção foi assepticamente transferido para as novas bandejas de cultura com meios suficientes para obter um nível de fluido justo para a superfície da membrana de veículo para manter a construção em desenvolvimento na in- terface de ar-líquido. O ar que contata a superfície do topo da camada epi- dérmica em formação permite a estratificação da camada epitelial. As cons- truções foram incubadas a 37±1°C, 10% de CO2, e umidade baixa, em meios com trocas de meios a cada 2-3 dias por 7 dias. Esse meio continha uma mistura 1:1 de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (sem glicose e sem cálcio, BioWhittaker, Walkersville, MD, meio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), suplementado com 0,4 μg/mL de hidrocortiso- na (Sigma, St. Louis, MO), 5 x 10-4M de etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY), 5 x 10-4M de o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/mL de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/mL de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20pM de triiodotironina (Sigma, St. Louis, MO), 6,78 ng/mL de selênio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 24,4 μg/mL de adenina (Sigma Aldrich Fine Chemcials Company), 4mM de L-glutamina (BioWhittaker, Wal- kersville, MD), 2,65 μg/mL de cloreto de cálcio (Mallinckrodt, Chesterfield, MO), 16 μg/mL de ácido linoléico, 1 μg/mL de acetato de tocoferol, 1,5mM de serina (Sigma, St. Louis, MO), 0,64mM de cloreto de colina (Sigma, St. Louis, MO) e 50 μg/mL de sulfato de gentamicina (Amersham, Arlington Hei- ghts, IL). As culturas foram alimentadas a cada 2-3 dias, por 14 dias.

Depois da aplicação das células epidérmicas à construção dér- mica, os meios condicionados são aspirados da bandeja de cultura contendo a construção de pele em desenvolvimento e congelados até uso como estão ou tratados para concentração ou purificação dos agentes de pele produzi- dos pelas células.

Exemplo 3: Administração de uma Composição que Contém Agentes de Pe- le Cultivados a um Indivíduo

Para determinar os efeitos de um creme tópico contendo os meios condicionados do Exemplo 1 sobre a senescência da pele, pacientes são engajados em um estudo para comparar a composição de teste com uma composição de controle que não contém os agentes de pele cultivados dos meios de cultura de tecido condicionados. Esses pacientes voluntários são tratados topicamente com duas preparações diferentes de creme. As áreas de teste são divididas em quatro regiões sobre cada antebraço dois centímetros bdistais da fossa antecubital e cada braço dois centímetros pro- ximais à fossa antecubital.

Cada área de teste é tratada duas vezes ao dia, por 60 dias. Um mililitro do respectivo creme é aplicado a cada área de teste durante a dosa- gem. No final do período de 60 dias, fotografias respectivas foram obtidas de cada sítio em cada paciente; além disso, biópsias em corte de 2 mm são obtidas para cada área de teste. Essas biópsias são incubadas por doze ho- ras em uma solução de tripsina para separar a epiderme da derme. Uma vez que a epiderme foi separada, ela é submetida à análise citométrica de fluxo para determinar a percentagem de ceratinócitos na Fase S.

Os resultados demonstram que a preparação de teste aumenta as taxas de divisão celular sobre controles sugerindo que os agentes de pele cultivados dos meios de cultura exercem um efeito mitogênico que tem uma função de reverter ou cessar o ciclo celular epidérmico senescente.

Para determinar se um efeito dérmico é produzido pelos efeitos mesodérmicos fortes da composição de meios condicionados, a derme é ainda analisada quanto ao teor de hidroxiprolina como uma medida indireta da atividade celular. Os dados demonstram que por ensaio de hidroxiprolina a preparação de controle parece que não exerce efeito estatístico sobre a derme ao passo que o creme de teste que contém a preparação de agentes de pele cultivados obtidos de construção de pele cultivada produz um au- mento no teor de hidroxiprolina.

Exemplo 4: Cultura de Densidade Clonal de Ceratinócitos: Avaliação do Ta- manho de Colônia

O efeito de meio condicionado proveniente da cultura de cons- truções de pele de bicamada cultivadas foi avaliado na migração de cerati- nócitos usando o método ensinado por Green H, Kchinde O, Thomas J: "Growth of human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting'. Proceedings of the National Academy of Science USA, 76:5665-5668 (1979), cujos ensinamentos são aqui incorporados a título de referência. O meio de manutenção condicionado foi removido das construções de pele cultivadas entre 10 e 12 depois de levantadas por ar (PAL). Os meios de controle eram frescos, meio de manutenção não condicionado misturado 1:1 com meio FAD fresco e o meio de FAD fresco (100%); o meio de teste era meio condi- cionado misturado 1:1 com meio de FAD fresco. Placas de Petri de 100 mm ou de 60 mm foram revestidas com colágeno tipo I. Semeadas nas placas revestidas com colágeno estavam 1,5-5,0x105 células 3T3 tratadas com Mi- tomicina C usadas como uma camada alimentadora. As células 3T3 foram cultivadas em meio FAD com 10% de FCS sem EGF. Os ceratinócitos foram semeados em 100 células por placa de 100 mm ou 50 células por placa de 60 mm. As trocas de meio foram feitas a cada 2 a 3 dias e as culturas foram fixadas no dia 12 da cultura. As células foram visualizadas nos pratos usan- do corante de Fucsina Ácida e contagens de células e medições de áreas das colônias de células de ceratinócitos foram determinadas. Os dados são apresentados na Tabela 1 e na Figura 2.

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Os resultados demonstram um grande efeito do meio condicio- nado no tamanho da colônia de ceratinócitos e um número indicando que o meio condicionado contém componentes bioativos que aumentam a migra- ção de ceratinócitos sobre meios de controle frescos.

Exemplo 5: Medição de Proliferação de Ceratinócitos

Para estudar os efeitos do meio condicionado das construções de pele cultivadas sobre a proliferação de ceratinócitos, foi usado o sistema de cultura 3T3 descrito no Exemplo 1. O ensaio de proliferação foi realizado em placas de 24 poços providas com revestimento de colágeno. Células ali- mentadoras 3T3 foram semeadas nas placas no meio FAD. Os ceratinócitos foram semeados às camadas alimentadoras em 1 χ 103 células/poço e culti- vadas por 9 dias com trocas de meios a cada 2-3 dias. As condições dos meios testados foram:

A. 100% de meio de manutenção não condicionado.

B. 100% de meio de manutenção não condicionado + 10 ng/mL de EGF.

C. 90% do meio de manutenção não condicionado/10% de meio de manu- tenção condicionado das construções de pele cultivadas entre 10 e 12 dias de PAL.

D. 50% do meio de manutenção não condicionado/50% de meio de manu- tenção condicionado das construções de pele cultivadas entre 10 e 12 dias de PAL.

E. 100% do meio de manutenção condicionado de construções de pele cultivadas entre 10 e 12 dias de PAL.

Os resultados do ensaio de proliferação mostraram, conforme demonstrado na Figura 3, que o meio da Condição E exibiu proliferação au- mentada sobre o meio não condicionado contendo EGF da condição B. Ain- da, a mistura 1:1 dos meios não condicionados e condicionados da Condi- ção D exibiu proliferação aumentada de ceratinócitos sobre a mistura 9:1 de meios não condicionados e condicionados, da Condição C que, por sua vez, exibiu um maior efeito proliferativo sobre 100% de meio não condicionado da Condição A. Esses resultados sugerem que o meio condicionado contém outras citocinas diferentes de EGF que promovem a proliferação de cerati- nócitos.

Exemplo 6: Efeito do Meio Condicionado sobre a Migração Celular em um Substrato de Fibrina

Ensaios de migração celular foram realizados usando um méto- do para avaliar a migração de ceratinócitos de Ronfard, V. e Barrandon, Y., conforme no Pedido Internacional PCT WO 97/25617, cujos métodos são aqui incorporados a título de referência. Um substrato de gel de fibrina foi preparado nos fundos de cada placa de acordo com o método.

Ao topo do substrato de fibrina, 1 χ 104 ceratinócitos foram pla- queados em 50% de DMEM + 10% de soro de bezerro fetal/50% de meio de teste. Os meios de teste foram: meio de controle sem EGF, meio de controle contendo EGF, e meio condicionado. As culturas foram incubadas a 37°C, por 20-24 horas; fixadas, e a células que estavam migrando foram contadas juntamente com as voltas helicoidais feitas pelas células conforme elas mi- gravam para o substrato de gel de fibrina. Os dados de migração celular são apresentados nas Figuras 4 e 5. A Figura 4 mostra o número de células ade- rentes, ambas as células imóveis e móveis que migram em um padrão heli- coidal sobre o substrato de fibrina. A Figura 5 mostra o número médio de voltas helicoidais das células feito no substrato de fibrina. As células em meio condicionado (ACM) fazem quase o mesmo tanto de voltas que o meio de controle fresco contendo EGF indicando que há um efeito do fator de crescimento sobre a mobilidade das células indutoras sugerindo que o meio condicionado (ACM) também contém fatores de crescimento. Exemplo 7: Proliferação de Células de Outras Células

Ensaios de proliferação de células para células endoteliais, célu- las da musculatura lisa, e fibroblastos dérmicos foram realizados usando o método descrito por Kratz e Haegerstrand: "Condioned Médium from Cultu- red Human Keratinocytes Has Growth Stimulatory Properties on Different Human Cell Types." Journal of Investigative Dermatology, 97:1039-1043 (1991), cujos ensinamentos são aqui incorporados a título de referência.

As células endoteliais, quando cultivadas com meio condiciona- do tirado das construções de pele cultivadas, exibem atividade proliferativa intensificada sobre aquelas cultivadas em meio de controle. Os dados para proliferação de células endoteliais estão apresentados na Figura 6.

A atividade de proliferação das células da musculatura lisa e dos fibroblastos dérmicos (separadamente) foi testada nas seguintes condições dos meios:

A. 100% de meio de manutenção não condicionado.

B. 100% de meio de manutenção não condicionado + 10 ng/mL de EGF.

C. 90% de meio de manutenção não condicionada/10% de médio de ma- nutenção condicionado de construções de pele cultivadas entre 10 e 12 dias de PAL.

D. 50% de meio de manutenção não condicionado/50% de meio de manu- tenção condicionado de construções de pele cultivadas entre 10 e 12 dias de PAL.

E. 100% de meio de manutenção condicionado de construções de pele cultivadas entre 10 e 12 dias de PAL.

Os resultados do ensaio de proliferação da musculatura lisa são apresentados na Figura 7, e aqueles do ensaio de proliferação de fibroblas- tos dérmicos estão presentes na Figura 8. Para esses dois tipos de células testadas, o meio condicionado das construções de pele cultivadas estimulou a proliferação de células em nível acima dos meios condicionados e são crescentemente proliferativos em culturas que contêm concentrações mais altas do meio condicionado. Os achados sugerem que as construções de pele cultivadas produzem citocinas que são biologicamente ativas com efei- tos significantes sobre a proliferação de células.

Exemplo 8: ELISA

Citocinas em meios condicionados, meios de controle não con- dicionados, o chumaço de algodão para elevar no ar a cultura e levá-la para a interface de ar-líquido, e o extrato de células obtido da construção de pele cultivadas foram caracterizados usando ELISA. Especificamente, fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento de ceratinóci- to (KGF), e fator alfa transformador de crescimento (TGFa) foram medidos contra citocinas do grupo de controle: KGF (R&D Systems, cat.# DKG00); bFGF (R&D Systems, cat. # DFB00); e TGFa (alfa) (Oncogene Research Products, cat. #QIA61).

Os resultados, conforme apresentados na Figura 9, mostram que as pequenas quantidades de TGFa presentes no meio não condiciona- do fresco enquanto o meio condicionado também contém KGF, bFGF, e ní- veis aumentados de TGFa sobre aquele do controle indicando que as célu- las da construção de pele cultivada são produtoras de citocinas e depositan- do as mesmas no meio conforme ele é condicionado. Os chumaços de algo- dão dos quais o meio condicionado é obtido por compressão do meio dele têm obtido concentrações mais altas de bFGF e KGF e quase a mesma quantidade de TGFa. Os resultados também mostram que o extrato de célu- las obtido da construção de pele cultivada contém níveis altos de todos os três componentes em relação ao meio de controle e re-enfatiza o uso de construções de pele cultivadas para estimular o processo de cicatrização de ferimentos.

Exemplo 9: Purificação/Concentração

Os meios condicionados do Exemplo 1 são filtrados usando fil- tros de células de ultrafiltração para remover componentes de peso molecu- lar alto do meio. A ultrafiltração é realizada usando o produto de Amicon 8050 Ultrafiltration Cell que contém uma câmara superior e uma câmara infe- rior separadas por um filtro de corte de peso molecular. O meio condicionado é colocado nas câmaras superiores de várias unidades de ultrafiltração e é forçado através da membrana de filtração usando gás de nitrogênio pressu- rizado. O meio condicionado contendo o retentado é adicionado ao meio não condicionado fresco e adicionado às culturas de ceratinócitos para testar sua capacidade proliferativa quando em comparação com o meio fresco sem o retentado. Células cultivadas no meio fresco contendo o filtrado de meio condicionada exibe capacidade proliferativa aumentada em relação às cultu- ras de controle.

Exemplo 10: O Efeito do Meio Condicionado (ACM) sobre a Migração de Ceratinócitos Humanos é Independente da Via de Receptor de EGF

Para testar se o efeito de migração causado pelo meio condicio- nado nas culturas de ceratinócitos é devido ao EGF, foi conduzido o seguin- te experimento. O meio de manutenção do Exemplo 1 foi coletado e usado individualmente porque o meio de manutenção fresco não contém inicial- mente EGF. Ceratinócitos humanos foram crescidos para confluência em placas de 100 mm e então tripsinizados para obtenção de uma suspensão de células. As células foram incubadas 1/2 hora à temperatura ambiente, em 1 mL do meio em presença (GSR ou ACM1R) ou na ausência (GS ou ACM1) de um anticorpo de receptor anti-EGF neutralizador (Upstate Biote- chnology, catálogo # 05-101) em uma concentração de 10 μg de anticor- po/104 células/mL do meio. Então, as células foram plaqueadas sobre o substrato de fibrina, e testadas quanto a sua capacidade de migrar conforme previamente descrito no Exemplo 6. Meios não condicionados (GS) ou Meios condicionados (ACM) foram testados em presença ou na ausência de EGF (10 ng/mL). Os resultados mostrados na Figura 10 são representativos des- tes experimentos.

Os presentes resultados mostram que ceratinócitos humanos cultivados produzem um ou mais fatores que estimulam a migração dos ce- ratinócitos humanos cultivados, este efeito foi comparável àquele do EGF. Contudo, a adição de anticorpos de EGF, que bloquearam o efeito de EGF, não aboliu o efeito de ACM sugerindo que EGF não é responsável pelos e- feitos do meio condicionado. Esses resultados enfatizam o fato que ACM produzem um ou mais fatores diferentes de EGF que induzem ceratinócitos a migrarem conforme é necessário para tratamento da pele in vivo. Exemplo 11: Preparação de uma Composição para o Cuidado de Pele Con- tendo Agentes de Pele Cultivados e Tratamento de Paciente depois do Re- surfacing da Pele

Uma formulação tópica contendo agentes de pele cultivados do Exemplo 1 foi desenvolvida como um produto de cuidado da pele para inten- sificar a recuperação do paciente por controlar o grau de vermelhidão e des- conforto depois do resurfacing a laser. A formulação tópica foi testada e veri- ficada compreender pelo menos os seguintes componentes: FGF-1 (fator de crescimento de fibroblastos), IL-Ia interleucina), IL-6 (interleucina), IL-8 (in- terleucina), IL-11 (interleucina), TGF-βΙ (fator transformador de crescimen- to), TGF-p3 (fator transformador de crescimento), GMCSF (fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos).

Sob condições assépticas, os agentes de pele cultivados con- centrados a 40% v:v foram adicionados a uma base de cuidado da pele em gel (veículo) que consiste em carboximetilcelulose sódica, cloreto de sódio, triidrato de acetato de sódio, ácido acético glacial, metil parabeno, propilpa- rabeno com m-cresol como conservantes e cloridrato de 1-Iisina como um estabilizador para formar um produto de teste.

O potencial do produto de pele de teste para aperfeiçoar os re- sultados cosméticos quando aplicado depois de resurfacing a laser foi avali- ado em dez pacientes saudáveis. O estudo foi um estudo multicentral de duplo-cego conduzido em três centros clínicos localizados nos E.U.A. Na linha de base, todos os dez pacientes receberam resurfacing a laser com laser CO2 Coherent Ultrapulse 5000C utilizando um tamanho de local hexa- gonal 2, densidade 6, energia 300 mJ, passo único com limpeza depois da primeira camada. Cada tratamento recebido em ambos os lados da face so- bre as pálpebras inferiores. Cada lado foi aleatoriamente designado para receber ou o produto de teste (agentes para cuidado da pele no veículo) ou apenas o veículo, por 14 dias pós-operativamente. Portanto, cada paciente serviu como seu próprio controle. Durante os 4 primeiros dias depois do re- surfacing a laser, ambos os lados da pálpebra inferior foram cobertos com Curativo de Ferimento Tópico Flexzan (Dow B. Hickam, Inc., Sugar Land, TX) depois da aplicação do produto de teste ou controle aos respectivos sí- tios designados. Depois disso, os pacientes re-aplicaram o produto de teste ou de controle até do Dia de Estudo 14 e foram seguidos até o Dia de Estu- do 90.

As seguintes avaliações clínicas foram avaliadas nos Dias de Estudos 2, 4, 10, 14, 30 e 90: vermelhidão, edema, epitelialização, descon- forto do paciente, satisfação do paciente e resulto global do cosmético. O ponto final de eficácia primária foi o grau de eritema nos sítios de tratamento. O segundo ponto final primário foi o grau de edema, epitelialização, descon- forto do paciente e resultado cosmético global. A determinação do tratamen- to foi julgada pelo paciente e investigadores. Um clínico com especialização e experiência no tratamento de pacientes com resurfacing a laser reviu as fotografias em um modo cego na conclusão do estudo. Eritema foi avaliado em uma escala de quatro pontos: (1) Nenhum, (2) Leve, (3) Moderado, (4) Intenso. Segurança foi avaliada por observação clínica e por indagação ao paciente.

Todos os pacientes sofreram de eritema e edema de moderados para graves e quantidades variáveis de formação de casca de ferida nos dias que se seguiram ao resurfacing a laser. No dia 10 pós-operativo, a clas- sificação média do eritema (por avaliação fotográfica) foi menor para o lado do produto de teste em comparação com o controle, e permaneceu assim durante o estudo. A classificação média de eritema cumulativa de seis visitas foi de 1,85 para o lado tratado com o produto de teste em comparação com 1,91 para o lado tratado com controle. Todos os pacientes retornaram para uma avaliação de linha de base pelo Dia 90 pós-operativo. Embora essa di- ferença não seja estatisticamente significante usando uma análise estatística de teste-t de um lado, o limite inerente do tamanho de amostra pequeno será superado, promissoramente, por futuros estudos usando outras formulações de produto, protocolo refinado e tamanho de amostra maior.

Exemplo 12: Concentração e Remoção de Sal Usando Filtração de Fluxo

Os meios condicionados coletados das culturas de pele do E- xemplo 1 foram concentrados usando métodos de filtração.

Os meios condicionados foram primeiramente filtrados através de uma membrana microporosa para remover quaisquer particulados gran- des, tais como células de fragmentos celulares. A remoção de componentes grandes dos meios condicionados torna a filtração a jusante mais eficaz.

Um sistema de filtração de fluxo tangencial usado para concen- trar os meios condicionados coletados era um sistema em circuito fechado compreendendo um tanque de alimentação, cuja saída estava conectada em série a uma bomba de alimentação peristáltica, que por sua vez foi conecta- da em série a um módulo de filtração, que por sua vez foi conectado em sé- rie a uma válvula, que foi conectada em série à entrada do tanque de ali- mentação. O tanque de alimentação também permitiu alimentação contínua para manter o volume do sistema na medida em que o filtrado era removido. As conexões entre esses componentes eram via tubulação de grau médico. As válvulas de pressão foram conectadas em linha, localizadas em cada la- do do módulo de filtração. O módulo de filtração compreendia uma entrada e uma saída em linha com o circuito de filtração. Sobre o lado oposto do filtro, uma segunda saída removia o filtrado do sistema de circuito fechado.

Vasos de armazenagem contendo os meios condicionados fo- ram removidos da armazenagem refrigerada (cerca de 4°C) e decantados ou bombeados dos recipientes de armazenagem para o tanque de alimentação do sistema de filtração. Uma vez que o tanque de alimentação contivesse um volume suficiente de meios condicionados, a bomba era ligada. Quando os meios estavam circulando, os meios eram bombeados tangencialmente ao longo da superfície da membrana. Uma pressão aplicada serve para for- çar uma porção dos meios através da membrana do lado do filtrado enquan- to os particulados e macromoléculas que eram muito grandes para passa- rem através dos poros das membranas eram retidos no lado a montante, arrastados pelo fluxo tangencial, e assim permaneciam em circulação sem se incrustarem na superfície da membrana.

A bomba foi deixada ligada para conduzir a circulação dos meios condicionados através do circuito de filtração. Durante cada passo dos mei- os sobre a superfície da membrana, a pressão aplicada forçava uma porção do fluido através da membrana e para a corrente de filtrado, aumentado, as- sim, a concentração dos componentes de peso molecular do meio que eram muitos grandes para passarem através da membrana. Depois dos meios condicionados terem atingido uma concentração de cerca de 20X, ou seja, cerca de vinte vezes a concentração do meio condicionado (1X) não filtrado, a bomba foi desligada.

O sistema de filtração de fluxo tangencial também proporcionou um sistema e um dispositivo para a remoção do sal dos componentes dos meios condicionados concentrados. Ao tanque de alimentação do sistema de filtração, água filtrada estéril foi adicionada para diluir os sais solúveis em água e componentes de pesos moleculares grandes nos meios condiciona- dos. A bomba foi ligada para circular fluido através do sistema para re- concentrar os meios condicionados enquanto os sais solúveis em água eram removidos. Enquanto os componentes de pesos moleculares grandes per- maneciam no sistema, a porção aquosa, incluindo os sais solubilizados, passava através do filtro e era descartada como filtrado. Novamente, depois dos meios condicionados terem atingido uma concentração de cerca de 20X, ou seja, cerca de vinte vezes a concentração do meio condicionado (1X) não filtrado, a bomba foi desligada. O resultado foi uma concentração de sal re- duzida que compreendia os componentes dos meios condicionados filtrados e concentrados. Exemplo 12: Preparação e Teste de uma Composição de Cuidado da Pele Contendo Agentes de Pele Cultivados e um Intensificador de Permeação na Pele Fotoenvelhecida

Para determinar a exeqüibilidade de uma formulação de teste compreendendo agentes de pele cultivados para aperfeiçoar a aparência de pele fotoenvelhedida, um estudo piloto, controlado, duplo-cego, de centro único foi conduzido com 10 pacientes de estudo, com 35 anos ou mais, de outro modo saudáveis, com sinais de fotoenvelhecimento. Fotoenvelheci- mento para esse estudo significa pele fotodanificada nos braços e nas mãos com uma avaliação integrada global de fotoenvelhecimento de 2 ou mais (vide escala anexada) em ambas as mãos e braços contra-laterais.

Uma formulação de teste compreendendo agentes de pele culti- vados é formulada por adição de agentes de pele cultivados concentrados (20% v:v) a uma base de cuidado da pele (veículo) consistindo em compo- nentes largamente usados em produtos cosméticos com um intensificador de penetração. Os ingredientes de base da formulação de teste incluem: Água Purificada, Poli(metacrilato de glicerila) (E) Propileno Glicol, Vaselina, Éter Dicaprílico, PEG-5 Estearato de Glicerila, Glicerina, Dimeticona (E) Di- meticonol, Álcool Cetílico, Óleo de Amêndoa Doce, Polímero cruzado de A- crilatos/Acrilato de C10-30 Alquila, Acetato de Tocoferila, Fenoxietanol, Ál- cool Benzílico, EDTA Dissódio, Hidróxido de Sódio, Ácido Láctico.

Esse é um estudo piloto, controlado, duplo-cego do produto de teste versus controle (veículo somente como placebo). Cada paciente terá um controle interno (membro contra-lateral) e um controle histórico (linha base). O efeito do produto de teste será comparado às avaliações de pré- tratamento de linha base da área de teste de cada paciente do estudo bem como de seu membro contra-lateral. Dez pacientes do estudo com sinais de fotoenvelhecimento, conforme determinado por evidência de pigmentação, alterações vasculares, atrofia, e flacidez da pele, avaliação em um cartão de classificação semi-quantitativa, se engajarão no estudo. Os pacientes do estudo serão solicitados a descontinuar o uso de todos os agentes tópicos nos sítios de tratamento por duas semanas antes do estudo. Biópsias pa- drão em 4-6 mm de pele serão realizadas na linha de base dos sítios trata- dos pré-identificados e dos sítios de controle de seus braços, e na visita da Semana 12. No Dia 0, a cada paciente do estudo será fornecido um pacote de tratamento contendo tubos de cremes de teste rotulados "Esquerda" e "Direita", aleatoriamente designados, usando rótulos "Esquerda" ou "Direita", aplicados aos tubos em cada Pacote de Tratamento, e registros serão man- tidos para documentar que tubo neste Pacote de Tratamento contém o pro- duto de teste e qual contém somente o veículo. O código não será conheci- do nem do paciente e nem do investigador do estudo até conclusão do estu- do e da análise de dados. Tanto a mão/braço direito ou esquerdo servirão como o tratamento ou controle em cada paciente. Uma lista seqüencial dos Pacotes de Tratamento será mantida, e ao investigador será designado os Pacotes de Tratamento para cada novo paciente do estudo seqüencialmente na medida em que eles são engajados no estudo. Os pacientes do estudo serão providos de quantidades suficientes do produto de teste e creme de veículo (placebo) para uso durante o curso do estudo. Aos pacientes do es- tudo será solicitado aplicar o produto de teste e o creme de veículo aos an- tebraços, pulso, e no dorso das mãos duas vezes ao dia, e serão acompa- nhados por um período de 14 semanas. Será dito aos pacientes do estudo que usem um sabão brando e hidratante diariamente nas áreas de tratamen- to.

Os sítios de tratamento dos pacientes do estudo serão avaliados antes do tratamento no Dia 14, Dia 0, Semana 4, Semana 8, Semana 12, e Semana 14. Em cada visita, cada paciente do estudo será avaliado quanto à aparência das rugas finas, rugas grosseiras, hiperpigmentação malhada, lentigos, despigmentação irregular, aspereza tátil, telangiectasias, elastose, bem como uma avaliação integrada global. Cada um desses parâmetros se- rão classificados em uma escala de pontos de 1 a 6. A resposta global ao tratamento será também realizada em cada visita, comparando a condição do paciente do estudo com aquela na expressão na linha base em uma es- cala de pontos de 1 a 7. Adicionalmente, medições não invasivas serão rea- lizadas pelo investigadores para avaliar o tratamento e os sítios de controle. Esses incluem fotografias (digital, polarização cruzada, ultravioleta), espec- troscopia, e cutometria. Espectroscopia e cutometria são medições não in- vasivas que envolvem uma sonda colocada contra a pele no sítio tratado. Espectroscopia de excitação por fluorescência utiliza uma fonte de luz e um fotomultiplicador para detectar alterações na fluorescência endógena de cromóforos tais como colágeno, elastina e marcadores de proliferação celu- lar. Cutometria mede a elasticidade da pele através da sucção gerada na extremidade de uma sonda pequena. Pacientes do estudo serão também avaliados quanto à presença de lesões relacionadas ao tamanho de poro e ao fotodano (i.e. ceratoses actínicas), e o investigador observará no quadro se estas lesões estão presentes e se elas foram alteradas pelo creme do estudo. Na semana 14, os pacientes do estudo completarão um questionário para avaliar a aparência cosmética da sua pele em comparação com sua condição na linha de base e avaliar sua opinião sobre o creme do estudo. Em cada visita, os pacientes do estudo serão perguntados se eles sofreram quaisquer eventos adversos que possam ter se desenvolvido desde começo do estudo, alterações em suas medicações, ou desvios em quaisquer proce- dimentos.

Embora a invenção acima tenha sido descrita em algum detalhe a título de ilustração e de exemplo para propósitos de clareza e entendimen- to, será óbvio para aquele versado na técnica que certas alterações e modi- ficações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações apen- sas.

Claims (42)

1. Composição para uso como uma preparação farmacêutica ou um produto de cuidado da pele, que compreende: (a) uma base de veículo; (b) um meio celular condicionado que contém um ou mais agen- tes de pele cultivados sintetizados e secretados de ceratinócitos e fibroblas- tos; e, (c) intensificador de penetração.

2. Composição para uso como uma preparação farmacêutica ou como um produto o cuidado da pele, que compreende: (a) uma base de veículo; (b) um meio celular condicionado que contém um ou mais agen- tes de pele cultivados sintetizados e secretados de ceratinócitos e fibroblas- tos cultivados; e (c) um intensificador de penetração; e, (d) um antioxidante.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que os ce- ratinócitos e fibroblastos são uma co-cultura em uma configuração em bica- mada que se assemelha à configuração nativa da pele.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, em que a co- cultura compreende fibroblastos em um látice de colágeno contraído e cera- tinócitos dispostos nele.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, em que a co- cultura compreende fibroblastos em uma matriz produzida endogenosamen- te e ceratinócitos nela.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 3, em que a co- cultura compreende fibroblastos em uma esponja e ceratinócitos dispostos nela.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, em que a es- ponja também compreende glicosaminoglicanas.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 3, em que a co- cultura compreende fibroblastos sobre um elemento de malha e ceratinócitos sobre ele.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o in- tensificador de permeação é um intensificador de permeação químico, um intensificador de permeação ativo, ou um intensificador de permeação folicu- lar.

10. Método para produzir uma preparação que contém um meio celular condicionado que contém um ou mais agentes de pele cultivados produzidos por células da pele cultivadas, que compreende: (a) cultivar células da pele em um meio que contém nutrientes para crescer as células da pele para induzir as células da pele a sintetizar e secretar um ou mais agentes de pele cultivados no meio; (b) separar o meio condicionado que contém um ou mais agen- tes de pele cultivados das células da pele cultivadas; e (c) produzir uma preparação que compreende o meio condicio- nado que contém um ou mais agentes de pele cultivados.

11. Método para produzir uma preparação que contém um meio celular condicionado que contém um ou mais agentes de pele cultivados produzidos por células da pele cultivadas, que compreende: (a) cultivar células da pele em um meio que contém nutrientes para crescer as células da pele e induzir as células da pele a sintetizar e se- cretar um ou mais agentes de pele cultivados no meio; (b) separar o meio condicionado que contém um ou mais agen- tes de pele cultivados das células da pele cultivadas; e (c) aumentar a concentração dos agentes de pele cultivados no meio celular condicionado; (d) reduzir a concentração de sal do meio condicionado; (e) produzir uma preparação que compreende o meio condicio- nado que contém um ou mais agentes da pele cultivados.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que as célu- Ias da pele são ceratinócitos e fibroblastos co-cultivados em uma configura- ção em bicamada que se assemelha à configuração nativa da pele.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a confi- guração em bicada compreende fibroblastos em um látice de colágeno con- traído e ceratinócitos dispostos sobre ele.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a confi- guração em bicamada compreende fibroblastos em uma matriz produzida endogenosamente e ceratinócitos dispostos sobre a mesma.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a confi- guração em bicamada compreende fibroblastos em uma esponja de coláge- no e ceratinócitos dispostos sobre ela.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a espon- ja também compreende glicosaminoglicanas.

17. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a confi- guração em bicamada compreende fibroblastos sobre um elemento de ma- lha e ceratinócitos dispostos sobre ele.

18. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a con- centração dos agentes de pele cultivados é aumentada entre 5 e 30 vezes.

19. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a con- centração dos agentes de pele cultivados é aumentada entre 10 e 25 vezes.

20. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a con- centração dos agentes de pele cultivados é aumentada entre 15 e 20 vezes.

21. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que as eta- pas (c) e (d) ocorrem ao mesmo tempo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que as eta- pas (c) e (d) são repetidas.

23. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que as eta- pas (c) e (d) são realizadas usando filtração de fluxo tangencial.

24. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a etapa (c) é realizada usando filtração de fluxo tangencial.

25. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a etapa (d) é realizada usando filtração de fluxo tangencial.

26. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o meio celular condicionado é pré-filtrado para remover células e fragmentos de cé- lulas antes da concentração.

27. Uso de um meio celular condicionado que contém um ou mais agentes de pele cultivados sintetizados e secretados de células da pele cultivadas na preparação de uma preparação farmacêutica.

28. Método para tratar a pele de um indivíduo, que compreende: aplicar topicamente à pele uma composição que compreende um meio celu- lar condicionado que contém um ou mais agentes de pele cultivados sinteti- zados e secretados de células da pele cultivadas.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a pele do indivíduo é tratada para aumentar a proliferação e geração de células.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a pele do indivíduo é tratada para reduzir a taxa de senescência celular da pele.

31. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a pele do indivíduo é tratada para reduzir rugas e linha finas da pele.

32. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a pele do indivíduo é tratada para reduzir celulite.

33. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a pele do indivíduo é tratada para promover angiogênese.

34. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a pele do indivíduo é tratada para tratar neuropatia.

35. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a pele do indivíduo é tratada para reduzir a formação de cicatriz.

36. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a pele do indivíduo é tratada para reduzir a aparência de uma cicatriz.

37. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a pele do indivíduo é tratada para promover o crescimento de cabelo.

38. Tratamento da pele que compreende uma composição topi- camente aplicada para aumentar a proliferação ou geração de células e para diminuir a senescência celular, formulada com meio celular condicionado que contém um ou mais agentes de pele cultivados sintetizados e secreta- dos de células da pele cultivadas.

39. Composição para uso como uma preparação farmacêutica ou como um produto para cuidado da pele, que compreende: (a) uma base de veículo; (b) um meio celular condicionado que contém um ou mais agen- tes de pele cultivados sintetizados e secretados de ceratinócitos e fibroblas- tos cultivados; e (c) um intensificador de penetração com base em silicone.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 39, em que o intensificador de penetração com base em silicone é selecionado do grupo que consiste em: ciclometicona e dimeticona copoliol.

41. Composição, de acordo com a reivindicação 39, em que os agentes de pele cultivados são concentrados e dessalinizados, e exibem um pH aproximadamente neutro.

42. Método para tratar uma região da pele que exibe a aparência de rugas, que compreende: aplicar topicamente a uma região da pele, que exibe a aparência de rugas, uma composição que compreende um meio celular condicionado que contém um ou mais agentes de pele cultivados sintetizados e secreta- dos de células da pele cultivadas; em que a aplicação tópica é pelo menos uma vez ao dia para tratar a região da pele de modo que os fibroblastos na pele sejam induzidos a sintetizar de novo elastina na zona Grenz da pele para espessar a zona Grenz.