JP2009519971A - スキンケア組成物及び治療法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、馴化された細胞培地から、皮膚の局所的治療のための組成物又は製剤を作製可能であるという発見に基づいている。本発明の前記組成物は、培養された皮膚細胞から合成及び分泌された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する、医薬製剤又はスキンケア製品として使用される馴化培地である。
本発明は、真皮線維芽細胞及び表皮細胞などの培養皮膚細胞から生成された培養皮膚物質を含有する馴化培地組成物に関する。前記馴化培地中の前記培養皮膚物質は、医薬製剤、美容製剤及び外傷治癒製剤の調剤に用いられる生物活性分子である。
実施例1:二重層皮膚構成体の培養による馴化培地の作製
ヒトの新生児の包皮線維芽細胞(マサチューセッツ州カントンのOrganogenesis社から入手)を、5×105細胞個/162cm2で組織培養処理されたフラスコ(マサチューセッツ州ケンブリッジのCoster社、カタログ番号3150)に播種し、増殖培地にて増殖させた。前記増殖培地は、新生子ウシの血清(NBCS)(ユタ州ローガンのHyClone Laboratories社)を10%及びL−グルタミン(メリーランド州ウォーカーズヴィルのBioWhittaker社)を4mM添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)(メリーランド州ウォーカーズヴィルのBioWhittaker社、L−グルタミンを含有しない高グルコース製剤)から構成された。前記細胞を、37±1℃、CO2を10±1%含有する空気中で、インキュベータ内で維持した。前記培地を、2乃至3日毎に、新たに作成した培地と交換した。8日間の培養後、前記細胞は、コンフレントな状態となるまで、即ち前記組織培養フラスコの底部に沿って密集した単一層を形成するまで増殖した。前記培地を前記培養フラスコから吸引した。前記単一層を洗滌するために、滅菌ろ過されたリン酸緩衝生理食塩水を、各培養フラスコの底部に加え、次に前記フラスコから吸引した。5mLのトリプシン−ベルセン(原語versene)グルタミン((メリーランド州ウォーカーズヴィルのBioWhittaker社)を各フラスコに加えて静かに揺らし、前記単一層を完全に被覆させることで、細胞をフラスコから剥離させた。培養物をインキュベータに戻した。細胞が剥離した直後に、5mLのSBTI(大豆トリプシンインヒビター)を各フラスコに加え、懸濁液と混合させて、トリプシン−ベルセンの作用を停止させた。前記細胞懸濁液をフラスコから取り出し、複数の円錐形の滅菌遠心分離管に均等に分配した。細胞を、約800乃至1000×gで5分間遠心分離することで回収した。
馴化培地を、その開示が本願中に援用された、MurphyによるPCT国際特許出願公開No.WO00/29553に記載の真皮線維芽細胞によって内生的に生成された基質を有する二重層皮膚構成体を用いて作製した。
実施例1の馴化培地を含有する局所用クリームが皮膚の老化に対して及ぼす効果を調べるために、試験組成物を、馴化組織培養培地からの培養皮膚物質を含有しない対照組成物と比較する研究に、複数の対象を登録した。これらのボランティアの対象を、異なる2種類のクリーム製剤で局所的に治療した。試験領域を、各前腕部の肘前窩から2センチメートル遠位及び各腕部の肘前窩から2センチメートル近位の4領域に分割した。
培養二重層皮膚構成体の培養物からの馴化培地がケラチン合成細胞の移動に及ぼす効果を、本願中にその教示が本願中に引用をもって援用された、全米科学学術会議議事録76:5665−5668(1979)Green H、Kchinde O、Thomas J著「ヒト表皮細胞のグラフティングに適した多層上皮への成長」に教示されている方法を用いて評価した。馴化された維持培地を、エアリフト後(PAL)10乃至12日の間に、培養皮膚構成体から除去した。対照培地は、新鮮なFAD培地と1:1の割合で混合された新鮮な未馴化の維持培地と、新鮮なFAD培地(100%)であった。試験培地は、新鮮なFAD培地と1:1の割合で混合された馴化培地であった。100mm又は60mmのペトリ皿を、I型コラーゲンで被覆した。前記コラーゲン被覆されたディッシュに、フィーダー層として用いられる、1.5乃至5.0×105個のマイトマイシンCで処理された3T3細胞を播種した。前記3T3細胞は、FCSを10%含有し、EGFを含有しないFAD培地中の培養物であった。ケラチン合成細胞を、100mmディッシュ当たり100細胞個または60mmディッシュ当たり50細胞個播種した。2乃至3日ごとに培地を交換し、培養12日目に培養物を固定した。細胞をAcid Fucsin染色にてディッシュ上で見えるようにし、細胞数及びケラチン合成細胞コロニーの面積を測定した。データを、表1及び図2に示す。
培養皮膚構成体からの馴化培地がケラチン合成細胞の増殖に及ぼす効果を調べるために、実施例1に記載の3T3培養システムを使用した。この増殖アッセイを、コラーゲンで被覆された24ウェルプレートで実施した。3T3フィーダー細胞を、FAD培地を入れた前記プレートに播種した。ケラチン合成細胞を、前記フィーダー層に1×103細胞個/ウェルで播種し、2乃至3日毎に培地を交換しながら9日間培養した。試験対象の培地条件は、A.未馴化の維持培地100%
B.未馴化の維持培地100%+10ng/mlのEGF
C.未馴化の維持培地90%/エアリフト後10乃至12日目の培養皮膚構成体からの馴化維持培地10%
D.未馴化の維持培地50%/エアリフト後10乃至12日目の培養皮膚構成体からの馴化維持培地50%
E.エアリフト後10乃至12日目の培養皮膚構成体からの馴化維持培地100%
であった。
細胞移動アッセイを、本願中に引用を持って援用された、V.Ronfard及びY.BarrandonによるPCT国際特許出願第WO97/25617号に開示されたケラチン合成細胞の移動方法を用いて実施した。この方法に従って、フィブリンゲル基材を各ディッシュの底に作製した。
内皮細胞、平滑筋細胞及び真皮線維芽細胞の細胞増殖アッセイを、その教示が本願中に引用をもって援用された、Kratz及びHaegerstrandによる、Conditioned Medium from Cultured Human Kerationocytes Has Growth Stimulatory Properties on Different Human Cell Types. Journal of Investigative Darmatology,97:1039−1043(1991)に記載の方法を用いて実施した。
A.未馴化の維持培地100%
B.未馴化の維持培地100%+10ng/mlのEGF
C.未馴化の維持培地90%/エアリフト後10乃至12日目の培養皮膚構成体からの馴化維持培地10%
D.未馴化の維持培地50%/エアリフト後10乃至12日目の培養皮膚構成体からの馴化維持培地50%
E.エアリフト後10乃至12日目の培養皮膚構成体からの馴化維持培地100%
馴化培地、未馴化の対照培地、エアリフトで培養物を気液界面に配置するために使用した綿パッド及び培養皮膚構成体から抽出された細胞抽出物中のサイトカインの特性を、ELIZAを用いて調べた。詳細には、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、ケラチン合成細胞増殖因子(KGF)、形質転換増殖因子アルファ(TGFα)を、対照群のサイトカイン:KGF(R&D Systems社、カタログ番号DKG00)、bFGF(R&D Systems社、カタログ番号DFB00)及びTGFα(アルファ)(Oncogene Research Products社、カタログ番号QIA61)と比較した。
実施例1の馴化培地を、限外ろ過細胞フィルタを用いてろ過し、前記培地から分子量の大きな成分を除去した。前記限外ろ過を、分子量カットオフフィルタで隔てられた上部チャンバと下部チャンバとを有するAmicon 8050 Ultrafiltration Cell製品を用いて実施した。馴化培地を複数の限外ろ過装置の上部チャンバ内に配置し、加圧窒素ガスを用いて前記ろ過膜を通過させた。この馴化培地濃縮液を、新鮮な未馴化の培地とケラチン合成細胞培養物とに加えて、前記濃縮液を含有しない新鮮な培地と比較した増殖能力を試験した。前記馴化培地ろ過液を含有する新鮮な培地中で培養された細胞は、対照培養物よりも高い増殖能力を発揮した。
ケラチン合成細胞培養物に対して馴化培地が及ぼす移動効果がEGFによるものであるか否かを試験するために、以下の実験を実施した。新鮮な維持培地は当初EGFを含有しないため、実施例1の維持培地を回収し、個別に使用した。ヒトケラチン合成細胞を100mmプレート内でコンフレントとなるまで増殖させた後に、トリプシン処理し、細胞懸濁液を得た。これらの細胞を、抗体10μg/104細胞個/培地mlの濃度の中和抗EGF受容体抗体(Upstate Biotechnology、カタログ番号05−101)を含有する(GSR又はACM1R)か、或いは含有しない(GS又はACM1)培地1ml中で、室温で30分間インキュベートした。次に、これらの細胞をフィブリン基材上で平板培養し、これらの細胞の移動能力を、実施例6で述べたように試験した。未馴化の培地(GS)又は馴化培地(ACM)を、EGF(10ng/ml)の存在又は不在下で試験した。図10に示す結果は、3つの実験を表す。
実施例1の培養皮膚物質を含有する局所用製剤を、レーザーリサーフェシング後の赤みと不快感の程度を抑えることによって患者の回復を早めるためのスキンケア製品として開発した。前記局所用製剤は、試験の結果、以下の成分:FGF−1(線維芽細胞増殖因子)、IL−1α(インターロイキン)、IL−6(インターロイキン)、IL−8(インターロイキン)、IL−11(インターロイキン)、TGF−β1(形質転換増殖因子)、TGF−β3(形質転換増殖因子)、GMCSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)を含有することが判明した。
実施例1の皮膚培養物から回収された馴化培地を、ろ過法を用いて濃縮した。
培養皮膚物質を含有する試験製剤が光加齢した皮膚の外観を改善させる能力を判定するために、単施設の二重盲検対照パイロット試験を、35歳以上で、光加齢の兆候が見られる以外は健康な10名の試験対象に対して実施した。この試験における光加齢は、両手及び両腕の皮膚が、光加齢総合評価値2又はそれ以上(添付の評価段階を参照のこと)の光損傷を受けていることを意味する。
Claims (42)
- 医薬製剤又はスキンケア製品として用いられる、以下を備えた組成物:
(a)担体基材と;
(b)培養されたケラチン合成細胞及び線維芽細胞から合成及び分泌された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する、馴化細胞培地と;
(c)浸透促進剤。 - 医薬製剤又はスキンケア製品として用いられる、以下を備えた組成物:
(a)担体基材と;
(b)培養されたケラチン合成細胞及び線維芽細胞から合成及び分泌された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する、馴化細胞培地と;
(c)浸透促進剤と;
(d)酸化防止剤。 - 前記ケラチン合成細胞と前記線維芽細胞とが、天然の皮膚構造に類似した二重層構造中の共培養物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記共培養物が、収縮コラーゲン格子中の線維芽細胞と、その上に配置されたケラチン合成細胞とを含有する、請求項3に記載の組成物。
- 前記共培養物が、内生的に生成された基質中の線維芽細胞と、その上に配置されたケラチン合成細胞とを含有する、請求項3に記載の組成物。
- 前記共培養物が、コラーゲンスポンジ中の線維芽細胞と、その上に配置されたケラチン合成細胞とを含有する、請求項3に記載の組成物。
- 前記スポンジが、グリコサミノグリカン類を更に含有する、請求項6に記載の組成物。
- 前記共培養物が、網状の材料上の線維芽細胞と、その上に配置されたケラチン合成細胞とを含有する、請求項3に記載の組成物。
- 前記浸透促進剤が、化学的浸透促進剤、能動的浸透促進剤又は毛嚢浸透促進剤である、請求項1に記載の組成物。
- 培養皮膚細胞によって生成された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する馴化細胞培地を含有する製剤を作製するための、以下のステップを含む方法:
(a)皮膚細胞を栄養培地中で培養して、前記皮膚細胞を増殖させ、前記皮膚細胞に1つ又は複数の培養皮膚物質を合成させて前記培地中に分泌させるステップと;
(b)1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する前記馴化培地を、前記培養皮膚細胞から分離するステップと;
(c)1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する前記馴化培地を含有する製剤を作製するステップ。 - 培養皮膚細胞によって生成された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する馴化細胞培地を含有する製剤を作製するための、以下のステップを含む方法:
(a)皮膚細胞を栄養培地中で培養して、前記皮膚細胞を増殖させ、前記皮膚細胞に1つ又は複数の培養皮膚物質を合成させて前記培地中に分泌させるステップと;
(b)1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する前記馴化培地を、前記培養皮膚細胞から分離するステップと;
(c)前記馴化細胞培地中の前記培養皮膚物質の濃度を上昇させるステップと;
(d)前記馴化培地中の塩濃度を低下させるステップと;
(e)1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する前記馴化培地を含有する製剤を作製するステップ。 - 前記皮膚細胞が、天然の皮膚構造に類似した二重層構造中で共培養されたケラチン合成細胞及び線維芽細胞である、請求項11に記載の方法。
- 前記二重層構造が、収縮コラーゲン格子中の線維芽細胞と、その上に配置されたケラチン合成細胞とを含有する、請求項12に記載の方法。
- 前記二重層構造が、内生的に生成された基質中の線維芽細胞と、その上に配置されたケラチン合成細胞とを含有する、請求項12に記載の方法。
- 前記二重層構造が、コラーゲンスポンジ中の線維芽細胞と、その上に配置されたケラチン合成細胞とを含有する、請求項12に記載の方法。
- 前記スポンジにグリコサミノグリカン類が更に含有される、請求項15に記載の方法。
- 前記二重層構造が、網状の部材上の線維芽細胞と、その上に配置されたケラチン合成細胞とを含有する、請求項12に記載の方法。
- 前記培養皮膚物質の前記濃度が5乃至30倍に増加する、請求項11に記載の方法。
- 前記培養皮膚物質の前記濃度が10乃至25倍に増加する、請求項11に記載の方法。
- 前記培養皮膚物質の前記濃度が15乃至20倍に増加する、請求項11に記載の方法。
- ステップ(c)及び(d)を同時に実施する、請求項11に記載の方法。
- ステップ(c)及び(d)を繰り返す、請求項11に記載の方法。
- ステップ(c)及び(d)を、接線流ろ過を用いて実施する、請求項11に記載の方法。
- ステップ(c)を接線流ろ過を用いて実施する、請求項11に記載の方法。
- ステップ(d)を接線流ろ過を用いて実施する、請求項11に記載の方法。
- 馴化細胞培地を、細胞及び細胞破片を除去するために濃縮前に前ろ過する、請求項11に記載の方法。
- 培養皮膚細胞から合成及び分泌された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する馴化細胞培地の、医薬製剤の作製への使用。
- 個体の皮膚を治療するための、以下のステップを含む方法:
培養皮膚細胞から合成及び分泌された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する馴化細胞培地を含有する組成物を、前記皮膚に局所的に塗布するステップ。 - 前記個体の前記皮膚が、細胞の増殖及び生成を促進するように治療される、請求項28に記載の方法。
- 前記個体の前記皮膚が、前記皮膚における細胞の老化速度を減少させるように治療される、請求項28に記載の方法。
- 前記個体の前記皮膚が、前記皮膚における皺及び小皺を減少させるように治療される、請求項28に記載の方法。
- 前記個体の前記皮膚が、セルライトを減少させるように治療される、請求項28に記載の方法。
- 前記個体の前記皮膚が、血管新生を促進するように治療される、請求項28に記載の方法。
- 前記個体の前記皮膚が、神経疾患を治療するように治療される、請求項28に記載の方法。
- 前記個体の前記皮膚が、瘢痕の形成を抑制させるように治療される、請求項28に記載の方法。
- 前記個体の前記皮膚が、瘢痕を目立ちにくくさせるように治療される、請求項28に記載の方法。
- 前記個体の前記皮膚が、毛髪の成長を促進するように治療される、請求項28に記載の方法。
- 細胞の増殖及び生成を促進するため、及び細胞の老化を抑制するための、培養皮膚細胞から合成及び分泌された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する馴化細胞培地を用いて作製された局所塗布組成物を含む、皮膚治療薬。
- 医薬製剤又はスキンケア製品として使用される、以下を含有する組成物:
(a)担体基材と;
(b)培養されたケラチン合成細胞及び線維芽細胞から合成及び分泌された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する、馴化細胞培地と;
(c)シリコーンベースの浸透促進剤。 - 前記シリコーンベースの浸透促進剤が、シクロメチコン及びジメチコンコポリオールからなる群から選択される、請求項39に記載の組成物。
- 前記培養皮膚物質が、濃縮及び脱塩されており、概ね中性のpHを示す、請求項39に記載の組成物。
- 皺が出現している皮膚部位を治療するための方法であって:
前記皺が出現している皮膚部位に、培養皮膚細胞から合成及び分泌された1つ又は複数の培養皮膚物質を含有する馴化細胞培地を含有する組成物を局所的に塗布するステップが含まれ;
前記皮膚部位を治療するための局所塗布が、前記皮膚内の線維芽細胞に、前記皮膚の新生コラーゲン層内のエラスチンをデノボ合成させて前記新生コラーゲン層を肥厚させるように、少なくとも一日に一度行われる;
方法。
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