KR101723633B1 - 세포 배양 배지, 표피성장인자 및 소혈청알부민을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 배양 배지, 표피성장인자 및 소혈청알부민을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물, 이를 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법, 및 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 EGF를 소량만 사용하여도 우수한 주름 개선, 상처 치유(wound healing) 효과를 나타낼 수 있어 피부 상태를 개선하거나, 피부 질환을 예방 또는 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 배양 배지, 표피성장인자 및 소혈청알부민을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSTION FOR IMPROVEMENT OF SKIN CONDITION COMPRISING CELL CULTURE MEDIUM, EPIDERMAL GROWTH FACTOR AND BOVINE SERUM ALBUMIN}
본 발명은 세포 배양 배지, 표피성장인자 및 소혈청알부민을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물, 이를 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법, 및 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
표피성장인자(epidermal growth factor, EGF)는 콜라겐 합성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 대표적인 성분이다. 그러나 EGF의 과도한 사용은 암세포의 성장과 이동을 촉진하는 문제가 있어, 안전상의 이유로 그 사용량에 제한이 있다. 따라서, EGF를 적은 양을 사용하고도 그 효과를 극대화할 수 있는 조성물의 개발이 요구된다.
한편, 피부 세포를 구성하는 세포는 동물 세포의 일종으로 각질세포(keratinocyte)와 섬유아세포(fibroblast)가 대표적이다. 상기 세포를 배양하기 위한 배지의 일반적인 조성은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle' s Medium) 및 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한다.
혈청은 성장 증진 작용, 영양분의 공급, 산화나 독소로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 세포 배양에 있어 혈청이 배제되는 경우에는 세포 배양 자체가 거의 이루어 지지 않아 혈청은 세포의 성장 및 증식에 필수적인 성분으로 인식되고 있다. 또한, 혈청에 포함되어 있는 혈청 알부민은 전체 혈청 단백질의 약 55-60%를 차지하며, 상기 알부민이 수분을 끌어들이는 작용을 하여 혈액 속의 수분함량을 유지하고, 피부탄력에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 현재 가장 널리 사용되는 혈청 성분으로는 FBS, FCS(fetal calf serum) 등이 있다.
그러나, 최근 FBS가 인간 광우병 발병의 원인이 될 수 있다고 보고된 바 있다. 이로 인해 시험자의 안전성이 위협받을 수 있고, 소태아로부터 직접 혈청을 채취하므로 동물 보호 차원에서도 문제가 될 수 있다. 또한, FBS는 고가이기 때문에 배지 가격을 상승시키는 단점이 있다.
이에, 생체에 안전하고 FBS를 함유하지 않고도 주름 개선, 피부 재생 및 상처 치유 등의 피부 상태를 개선시키는 데 우수한 효과를 나타내는 조성물에 대한 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 생체에 안전하면서도 주름 개선, 피부 재생 및 상처 치유와 같은 피부 상태를 개선하는데 우수한 효과를 나타내는 화장료 조성물, 및 상기 화장료 조성물을 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화장료 조성물과 동일한 조성을 갖는 약학 조성물, 및 이를 이용하여 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
a) 세포 배양 배지;
b) 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 0.4 내지 0.8 ng/ml; 및
c) 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1,000 μg/ml를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 이용하여 피부상태를 개선시키는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부상태 개선을 위한 화장료의 제조에 사용하기 위한 상기 화장료 조성물의 용도를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
a) 세포 배양 배지;
b) 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 0.4 내지 0.8 ng/ml; 및
c) 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1,000 μg/ml를 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 약학 조성물을 이용하여 피부질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 조성물은 주름 개선, 피부 재생, 상처 치유 등의 피부 상태를 개선하는 데 효과적일 뿐만 아니라, 아토피성 피부염, 알러지 등의 피부 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다:
도 1은 실시예 1, 비교예 1 및 2의 조성물을 인간 섬유아세포에 처리한 후 시간에 따른 세포 증식률을 보여주는 그래프이다.
도 2는 실시예 1, 비교예 1 및 2의 조성물을 인간 섬유아세포에 처리한 후 제3형 콜라겐 합성능을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 및 4는 실시예 1, 비교예 1 및 2의 조성물을 인간 섬유아세포에 처리하기 전/후의 세포 이미지 및 세포의 이동률로 정량화한 상처 치유능을 보여주는 그래프를 각각 나타낸 것이다.
도 5 및 6은 실시예 6, 비교예 3 및 4의 조성물을 인간 섬유아세포에 처리하기 전/후의 세포 이미지 및 세포의 이동률로 정량화한 상처 치유능을 보여주는 그래프를 각각 나타낸 것이다.
도 7 및 8은 실시예 7, 비교예 5 및 6의 조성물을 인간 섬유아세포에 처리하기 전/후의 세포 이미지 및 세포의 이동률로 정량화한 상처 치유능을 보여주는 그래프를 각각 나타낸 것이다.
도 9 및 10은 실시예 1 내지 3, 및 비교예 1 및 2 의 조성물을 인간 섬유아세포에 처리하기 전/후의 세포 이미지 및 세포의 이동률로 정량화한 상처 치유능을 보여주는 그래프를 각각 나타낸 것이다.
도 11 및 12는 실시예 1, 4 및 5, 및 비교예 1 및 2 의 조성물을 인간 섬유아세포에 처리하기 전/후의 세포 이미지 및 세포의 이동률로 정량화한 상처 치유능을 보여주는 그래프를 각각 나타낸 것이다.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 a) 세포 배양 배지; b) 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 0.4 내지 0.8 ng/ml; 및 c) 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1,000 μg/ml를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 인체 피부에 적용하는 경우 피부에 존재하는 섬유아세포 등의 증가를 촉진하거나 활성화시키고, 콜라겐 합성을 증진시킴으로써 주름의 개선, 피부 노화 억제, 피부탄력 개선, 피부 흉터 등의 상처 회복, 피부 재생 등의 효과를 나타내어 피부의 상태를 개선시킬 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 세포의 기능 저하 또는 손실로부터 피부를 보호 또는 피부 상태를 개선시키거나; 또는 피부 질환을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.
상기 피부 세포의 기능 저하 또는 손실로부터 피부를 보호하거나 피부 상태를 개선시키는 것은 주름의 발생 억제, 피부 노화 억제, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 상처 또는 창상 치유(wound healing) 및 각막 재생 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 질환은 예를 들어, 아토피성 피부염, 알러지, 피부 습진, 여드름, 건선 등과 같은 염증성 피부질환을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부상태 개선을 위한 화장료의 제조에 사용하기 위한 상기 화장료 조성물의 용도를 제공한다.
상기 방법은 피부 상태의 개선을 필요로 하는 대상의 피부에 도포하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 세포 배양 배지를 포함한다.
상기 세포 배양 배지는 피부 내 세포인 섬유아세포, 각질형성세포, 멜라닌형성세포, 줄기세포, 근육세포, 생식세포 및 면역세포 등의 포유동물 세포를 배양할 수 있는 배지일 수 있다.
본 발명에서는 DMEM/F-12, DMEM 및 MEMα로 이루어진 군에서 선택되는 세포 배양 배지를 사용할 수 있다.
상기 세포 배양 배지는 FBS-무함유 배지일 수 있다. 본 발명에서는 고가이면서 안전성 문제를 유발할 수 있는 FBS를 영양성분으로 포함하지 않아도 우수한 세포 성장 및 증식을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 사이토카인으로서 EGF를 포함한다.
상기 EGF는 0.4 내지 0.8 ng/ml의 양으로 포함될 수 있다. 바람직하게는, 0.4 내지 0.6 ng/ml, 0.6 내지 0.8 ng/ml, 0.4 내지 0.5 ng/ml, 0.5 내지 0.8 ng/ml, 0.6 내지 0.7 ng/ml 또는 0.5 내지 0.7 ng/ml의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 EGF를 세포 배양 배지에 첨가함으로써 세포를 종래의 혈청 함유 배지보다 우수한 세포 성장율로 배양할 수 있다.
특히, 본 발명의 조성물은 EGF를 0.4 내지 0.8 ng/ml의 소량만 포함하여도 세포 성장의 문제가 없다. 또한, 콜라겐 합성을 촉진시킬 수 있고, 상처 치유 등의 피부 재생 효과를 나타낼 수 있다. 이는 본 발명의 화장료 조성물이 EGF와 BSA를 함께 포함하는 것에 따른 상승 효과이다.
본 발명의 화장료 조성물은 영양성분으로서 BSA를 포함한다.
상기 BSA는 10 내지 1,000 μg/ml의 양으로 포함될 수 있다. 바람직하게는 10 내지 100 μg/ml, 10 내지 500 μg/ml, 100 내지 500 μg/ml, 500 내지 1,000 μg/ml, 50 내지 200 μg/ml 또는 80 내지 120 μg/ml의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 아미노산, 비타민, 탄소원, 무기염 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 더 포함할 수 있다.
상기 아미노산은 일반적인 동물 세포 배양 배지에 사용되는 아미노산 성분을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 글리신, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-아스파라긴-모노하이드레이트, L-아스파르트산, L-시스테인 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-시스틴 2HCl, L-글루탐산, L-글루타민, L-히스티딘 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-이소류신, L-류신, L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 디소듐염 디하이드레이트, L-발린, L-히스티딘, L-티로신 디소듐염 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 아미노산은 단백질 합성의 원료로 세포의 성장에 이용되는 역할을 한다.
상기 아미노산은 조성물 총 중량을 기준으로 0.111 내지 0.161중량%, 예를 들어 1.110 내지 1.606g/L의 양으로 포함될 수 있다. 상기 범위 내의 함량으로 아미노산을 포함함으로써 세포의 성장 및 유지에 도움을 주고 제형 안정성을 향상시킬 수 있다.
상기 비타민은 일반적인 동물 세포 배양 배지에 사용되는 비타민 성분을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 B12, 염화콜린, i-이노시톨, 아스코르브산 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 비타민은 세포 활성 유지 역할을 한다.
상기 비타민은 조성물 총 중량을 기준으로 0.0027 내지 0.0060중량%, 예를 들어 0.027 내지 0.060g/L의 양으로 포함될 수 있다. 상기 범위 내의 함량으로 비타민을 포함함으로써 세포 활성 유지에 도움을 줄 수 있다.
상기 탄소원은 일반적인 동물 세포 배양 배지에 사용되는 탄소원 성분을 사용할 수 있으며, 예를 들어 D-글루코즈 (덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 티미딘, 리놀레산, 리포산, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘, 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시시티딘 HCl, 2'-데옥시구아노신 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 탄소원은 에너지원으로서 역할을 하며 특히 소듐바이카보네이트의 경우 배지의 pH를 유지하는 역할을 할 수 있다.
상기 탄소원은 조성물 총 중량을 기준으로 0.120 내지 0.463중량%, 예를 들어 1.201 내지 4.625g/L의 양으로 포함될 수 있다. 상기 범위 내의 함량으로 탄소원을 포함함으로써 에너지원이 부족하지 않아 세포 성장에 도움을 주고 제형 안정성을 향상시킬 수 있다.
상기 무기염은 일반적인 동물 세포 배양 배지에 사용되는 무기염 성분을 사용할 수 있으며, 예를 들어 염화칼슘 (CaCl2)(무수), 황산동 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO4-7H2O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO4)(무수), 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 인산수소이나트륨(Na2HPO4) 무수, 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO4-7H2O), 질산제이철 노나하이드레이트(Fe(NO3)3·9H2O), 탄산수소나트륨(NaHCO3) 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 무기염은 세포의 기능을 조절하는 역할을 한다.
상기 무기염은 조성물 총 중량을 기준으로 0.984 내지 1.092중량%, 예를 들어 9.838 내지 10.923g/L의 양으로 포함될 수 있다. 상기 범위 내의 함량으로 무기염을 포함함으로써 세포 기능 조절에 도움이 되고 의약품이나 화장품으로 제형화시키는 데 어려움이 없다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 상태 개선을 목적으로 하는 피부에 직접 적용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있으며, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 용매, 용매화제, 유탁화제 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르, 및 이의 혼합물 등을 들 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서 "담체 성분"이란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물로서, 피부에 접촉 시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 성분이다.
본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면 활성제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 보조제라면 사용에 제한이 없다.
또한, 본 발명은 a) 세포 배양 배지; b) 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 0.4 내지 0.8 ng/ml; 및 c) 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1,000 μg/ml를 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물의 유효성분은 앞서 전술한 바와 같은 화장료 조성물의 유효성분과 동일하다.
본 발명의 약학 조성물은, 아토피성 피부염, 알러지, 피부 습진, 여드름, 건선 및 이의 조합으로 이루어진 염증성 피부질환에서 선택되는 피부 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 이용하여 피부질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다.
상기 방법은 본 발명에 따른 약학 조성물을 필요로 하는 대상의 피부에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대상은 포유 동물일 수 있고, 구체적으로 인간일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에도 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1중량% 내지 약 99.99중량%, 바람직하게는 약 90중량% 내지 약 99.99중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 약 0.1중량% 내지 약 20중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 바람직하게는 국소 투여 방식으로 피부에 직접 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 제형은 경피 투여 주사제, 연고제, 액제, 크림제, 결제, 스프레이제, 패취제 등과 같은 피부 외용제 형태일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
하기 표 1의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배지에, EGF 0.8 ng/ml 및 BSA 100μg/ml을 첨가하여 피부 상태 개선용 조성물을 제조하였다.
실시예 2
하기 표 1의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배지에, EGF 0.4 ng/ml 및 BSA 100μg/ml을 첨가하여 피부 상태 개선용 조성물을 제조하였다.
실시예 3
하기 표 1의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배지에, EGF 0.6 ng/ml 및 BSA 100μg/ml을 첨가하여 피부 상태 개선용 조성물을 제조하였다.
실시예 4
하기 표 1의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배지에, EGF 0.8 ng/ml 및 BSA 10μg/ml을 첨가하여 피부 상태 개선용 조성물을 제조하였다.
실시예 5
하기 표 1의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배지에, EGF 0.8 ng/ml 및 BSA 1,000μg/ml을 첨가하여 피부 상태 개선용 조성물을 제조하였다.
[표 1]
Figure 112016010557188-pct00001
Figure 112016010557188-pct00002
실시예 6
하기 표 2의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에, EGF 0.8ng/ml 및 BSA 100μg/ml을 첨가하여 피부 상태 개선용 조성물을 제조하였다.
[표 2]
Figure 112016010557188-pct00003
실시예 7
하기 표 3의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 MEMα 배지에, EGF 0.8ng/ml 및 BSA 100μg/ml을 첨가하여 피부 상태 개선용 조성물을 제조하였다.
[표 3]
Figure 112016010557188-pct00004
Figure 112016010557188-pct00005
비교예 1 및 2
표 1의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배지에, EGF만을 1 ng/ml 또는 20 ng/ml로 각각 첨가하여 조성물을 제조하였다.
비교예 3 및 4
표 2의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에, EGF만을 1 ng/ml 또는 20 ng/ml로 각각 첨가하여 조성물을 제조하였다.
비교예 5 및 6
표 3의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 MEMα 배지에, EGF만을 1 ng/ml 또는 20 ng/ml로 각각 첨가하여 조성물을 제조하였다.
상기 실시예 및 비교예에 따른 조성물의 조성을 정리한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure 112016010557188-pct00006
실험예 1: 세포 증식률 비교
배양 접시에서 배양 중인 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast cell, 한국세포주은행)를 트립신 0.05%(w/v)로 처리하여 배양 접시로부터 분리시켰다. 상기 분리된 인간 피부 섬유아세포 3×103개를 100μl의 상기 표 1의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배양액과 함께 섞어준 후 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣어 주었다. 하루 동안 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양한 후 96 웰 플레이트 바닥에 세포가 완전히 붙으면 기존의 배양액을 제거한 후, 여기에 실시예 1, 비교예 1 또는 비교예 2의 조성물을 각각 처리하였다. 이때 음성 대조군으로는 EGF 및 BSA가 첨가되지 않은 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배지로 하였다.
이어, 상기 혼합물을 24시간, 48시간 및 72시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양시킨 후, 석션기를 이용하여 첨가물을 제거하고 멸균된 인산완충생리식염수(PBS)를 이용하여 잔여 배양액을 96 웰 플레이트에서 완전히 제거하였다.
세포 증식률(cell proliferation)을 확인하기 위하여, CCK-8 반응액(Dojindo) 10μL를 각 웰에 처리하고, 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 모델 680 마이크로플레이트 리더(Bio-rad, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
음성 대조군인 싸이토카인이 첨가되지 않은 배양액에서 자란 세포의 흡광도 값을 기준으로 하여 각 웰의 흡광도 값을 비교한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 조성물-처리군에서는 세포 독성을 나타내지 않아 세포 증식률이 우수함을 알 수 있었다. 특히, 배양 72시간 후에는 EGF를 20 ng/ml의 고농도로 첨가한 비교예 2의 조성물 처리군보다 세포 증식률이 더 향상된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 콜라겐 합성 효과 평가
사람의 피부조직에서 분리된 인간 피부 섬유아세포(한국세포주은행)를 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 1%가 함유된 DMEM/F12 배지(Gibco)에서 5% CO2 조건에서 배양한 후, 6 웰 플레이트에 상기 배양 세포 3×105 개를 분주(seeding)하였다. 다음날 PBS를 이용하여 상기 배양 세포를 한번 세척한 다음, FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배지로 갈아주고, 여기에 실시예 1, 비교예 1 또는 비교예 2의 조성물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
반응이 끝난 세포 배양액을 모아 제3형 콜라겐(collagen)에 대한 ELISA 분석(CUSABIO Biotech Co., Wuhan, China)을 실시하여 각각의 콜라겐 합성 농도를 측정하였다. ELISA 분석은 키트에 포함된 회사가 제공하는 가이드라인에 따라 실시하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 조성물 처리군은 가장 우수한 콜라겐 합성능을 나타내었는데, 이러한 EGF를 20 ng/ml의 고농도로 첨가한 비교예 2의 조성물 처리군과 유사한 수준임을 알 수 있었다.
실험예 3: 인간 피부 섬유아세포의 이동능(migration) 확인
본 발명의 조성물의 상처 치유능을 확인하기 위하여, 인간 피부 섬유아세포에서의 이동능 확인하였다.
먼저, 인간 피부 섬유아세포(한국세포주은행) 6x104 개/ml를, 70 μm 격막에 의해 분리된 2개의 저장소(reservoir)로 구성된 IBIDI Culture insert(Ibidi GmbH, M, Germany) 챔버 내에 분주하였다. 이어 챔버 내 세포를 5% CO2 및 37℃ 조건에서 12시간 동안 배양시켰다.
상기 배양 세포에, 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 조성물을 각각 처리하였다. 상기 조성물 처리 전 및 처리 후 9시간이 경과한 때의 세포 이동 정도를 도립현미경(Olympus)으로 촬영하여 얻은 이미지를 도 3에 나타내었다.
또한, 상기 이미지들을 T-Scratch 소프트웨어(Computational Science ＆ Engineering Laboratory, ETH Zurich, Switzerlane)를 이용하여, 음성 대조군 결과를 100%로 하여 각 처리군의 세포 이동율을 세포로 덮인 부분의 비율(%)로 산출하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 3 및 4에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 조성물 처리군은 가장 우수한 상처 치유능을 나타내었는데, 이는 EGF를 20 ng/ml의 고농도로 첨가한 비교예 2의 조성물 처리군과 유사한 수준임을 알 수 있었다.
또한, 실시예 6, 비교예 3 및 4의 조성물을 이용하여 상기와 동일한 방식으로 상처 치유능을 확인한 결과를 도 5 및 6에 나타내었다. 또한, 실시예 7, 비교예 5 및 6의 조성물을 이용하여 상기와 동일한 방식으로 상처 치유능을 확인한 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.
도 5 및 6, 및 도 7 및 8에서 보는 바와 같이, FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지 또는 FBS가 포함되지 않은 MEMα배지에 EGF 및 BSA를 동시에 첨가하여 제조한 실시예 6 및 7의 조성물 처리군이 가장 우수한 상처 치유능을 나타내었으며, 이들은 각각 EGF를 20 ng/ml로 단독으로 첨가한 비교예 4 및 6의 조성물 처리군과 유사한 수준임을 알 수 있었다.
한편, 본 발명의 조성물 내 EGF 함량에 따른 상처 치유능을 확인하기 위하여, 실시예 1 내지 3, 및 비교예 1 및 2의 조성물을 이용하여 상기와 동일한 방식으로 실험을 수행하였으며 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다. 도 9 및 10에서 보는 바와 같이, EGF를 0.4 내지 0.8 ng/ml로 포함하는 실시예 1 내지 3의 조성물 처리군 모두 음성 대조군보다 최대 50% 향상된 효과를 나타내었으며, 이는 EGF 20 ng/ml를 단독으로 첨가한 비교예 2의 조성물을 처리한 군과 유사한 수준임을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 조성물 내 BSA 함량에 따른 상처 치유능을 확인하기 위하여, 실시예 1, 4 및 5, 및 비교예 1 및 2의 조성물을 이용하여 상기와 동일한 방식으로 실험을 수행하였으며 그 결과를 도 11 및 12에 나타내었다. 도 11 및 12에서 보는 바와 같이, BSA를 10 내지 1,000 μg/ml로 포함하는 실시예 1, 4 및 5의 조성물 처리군 모두 음성 대조군보다 최대 약 40% 향상된 효과를 나타내었으며, 이는 EGF 20 ng/ml를 단독으로 과량 첨가한 비교예 2의 조성물을 처리한 군과 유사한 수준임을 알 수 있었다.
이와 같은 결과는, EGF 및 BSA의 조합을 포함하는 본 발명의 조성물의 구성이 EGF만을 단독으로 과량 포함하는 구성에 비해 우수한 콜라겐 합성 및 세포 재생 효과를 나타냄을 입증한다.
따라서, 본 발명의 조성물은 세포 독성을 나타내지 않고, EGF를 소량 포함하여도 콜라겐 합성을 증가시킴으로써 주름 개선 효과를 나타냄은 물론, 향상된 상처 치유능을 나타내어 피부 재생 효과가 우수하다. 뿐만 아니라, 생산 단가를 약 1/20로 낮출 수 있어 가격 경쟁력이 우수할 뿐만 아니라, EGF 과량 사용으로 인한 암 발생률을 현저히 낮출 수 있어 생체에 안전하게 적용할 수 있다.

Claims (17)

  1. a) 세포 배양 배지;
    b) 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 0.4 내지 0.8 ng/ml; 및
    c) 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1,000 μg/ml
    를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항 있어서,
    상기 세포 배양 배지가 소태아혈청-무함유 배지인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양 배지가 포유동물 세포 배양 배지인 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 포유동물 세포 배양 배지는 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle' s Medium/Nutrient Mixture F-12), DMEM 및 MEMα(Minimum Essential Mediumα)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 아미노산, 비타민, 탄소원, 무기염 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 더 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 아미노산이 글리신, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-아스파라긴-모노하이드레이트, L-아스파르트산, L-시스테인 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-시스틴 2HCl, L-글루탐산, L-글루타민, L-히스티딘 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-이소류신, L-류신, L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 디소듐염 디하이드레이트, L-발린, L-히스티딘, L-티로신 디소듐염 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 비타민이 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 B12, 염화콜린, i-이노시톨, 아스코르브산 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 탄소원이 D-글루코즈 (덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 티미딘, 리놀레산, 리포산, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘, 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시시티딘 HCl, 2'-데옥시구아노신 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 무기염이 염화칼슘 (CaCl2)(무수), 황산동 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO4-7H2O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO4)(무수), 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 인산수소이나트륨(Na2HPO4) 무수, 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO4-7H2O), 질산제이철 노나하이드레이트(Fe(NO3)3·9H2O), 탄산수소나트륨(NaHCO3) 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 조성물이 1.110 내지 1.606g/L의 아미노산, 0.027 내지 0.060g/L의 비타민, 1.201 내지 4.625g/L의 탄소원 및 9.838 내지 10.923g/L의 무기염을 포함하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선이 주름의 발생 억제, 피부 노화 억제, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 상처 또는 창상 회복(wound healing), 각막 재생 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 피부 세포의 기능 저하 또는 손실로부터 피부를 보호 또는 피부 상태를 개선시키는 것인 조성물.
  12. a) 세포 배양 배지;
    b) 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 0.4 내지 0.8 ng/ml; 및
    c) 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1,000 μg/ml
    를 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법.
  13. 삭제
  14. a) 세포 배양 배지;
    b) 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 0.4 내지 0.8 ng/ml; 및
    c) 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1,000 μg/ml를 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 피부 질환이 아토피성 피부염, 알러지, 피부 습진, 여드름, 건선 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
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