KR102083324B1 - 동물세포 배양용 무혈청 배지 및 이를 이용한 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

동물세포 배양용 무혈청 배지 및 이를 이용한 피부상태 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물세포 배양을 위한 무혈청 배지 및 이를 이용한 피부상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 일반적으로 사용하는 동물세포 배양을 위한 무혈청 배지의 구성성분을 의약품 또는 화장품의 원료로 허용된 성분으로 구성하고 무기염, 아미노산, 비타민의 조성 성분과 함량을 변경함으로써 제형의 안정성을 증가시킨 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성에 사이토카인 조합을 첨가함으로써 피부 세포를 종래의 혈청 함유 배지의 세포 성장율로 배양할 뿐만 아니라 이를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물은 피부 탄력 개선, 리프팅 증가, 혈류량 증가, 밝기 및 투명도 개선을 보인다.

Description

동물세포 배양용 무혈청 배지 및 이를 이용한 피부상태 개선용 조성물{Serum-free medium for animal cell culture and compositions for improving skin conditions using the same}
본 발명은 동물세포 배양용 무혈청 배지 및 이를 이용한 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
현재 가장 널리 사용되는 혈청으로 FBS(Fetal Bovine Serum)나 FCS(Fetal Calf Serum)이 있다. 이들 첨가 성분의 기능은 명확하진 않지만 성장 증진 작용, 영양분의 공급, 산화나 독소로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이들 성분이 배제된 경우에는 세포배양 자체가 거의 안 되는 필수 성분이다. 그러나 고가의 혈청은 배지 가격을 상승시키고 또한 그 복잡한 성분으로 인해 재조합 단백질의 정제를 어렵게 할 뿐 아니라, 생산되는 과정마다 성분 차이가 있어서 실험을 할 때마다 다른 결과를 초래할 우려가 있다. 또한, 혈청은 동물 유래이기 때문에 배양과정 중에 세포들이 바이러스나 감염성 프리온 등에 오염될 가능성이 상존한다. 소혈청에 감염된 프리온은 사람에게 그대로 전이될 수 있으므로 동물세포 배양은 여러 가지 안전장치를 하고 있음에도 여전히 감염가능성은 존재한다고 해야 할 것이다.
통상 혈청 사용 시 다음과 같은 문제점을 수반한다:
ⅰ) 혈청의 조성 변이 때문에 세포에 대한 성장촉진 능력에 있어서 변이가 크다; ⅱ) 인간에게 사용될 세포 생산물의 제조 시, 혈청이 감염물질에 의한 오염 잠재성을 가지고 있다; ⅲ) 상업적으로 제조된 FBS나 FCS에서 박테리오파아지(bacteriophage)와 보바인 바이러스(bovine virus)가 검출된다; ⅳ) 박테리아 오염 때문에 생긴 각종 독소(toxin)로 인해 세포배양 억제 물질도 함유된다; ⅴ) 여과(filteration) 전에는 오염으로 인한 세균성 독소(bacterial toxin)가 존재한다; ⅵ) 세포배양에 있어 생물학적 오염원(mycoplasmas, bacteriophages, viruses)이 되기도 한다; ⅶ) 감마-글로불린 분획에 배양액과 교차반응(cross reaction)하는 항체 및 세균이 분비한 독소를 함유한다; ⅷ) 열 불활성화(heat inactivation)는 면역글로불린의 세포독성(cytotoxin) 작용을 감소시키지만 불안정한 구성물질까지 파괴되어 열처리하지 않은 혈청보다 만족한 결과가 항상 나타나는 것은 아니다; ⅸ) 혈청 단백질의 흡착/결합에 의한 세포표면의 변형이 유도된다; ⅹ) 세포생산물의 분리 시 방해의 원인이 된다; xi) 1차 배양 시에 섬유아세포의 과도한 성장이 조장된다.
이렇게 혈청의 경우 동물 유래로 바이러스나 감염성 물질에 오염될 수 있어 의약품 또는 화장품 성분으로 적합하지 않다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 무혈청 배지[비특허 문헌 1]를 연구하여 사용하고 있는데, 이 무혈청 배지의 구성성분 내에도 콜린 클로라이드(Choline Chloride)와 같은 의약품 또는 화장품 금지 성분이 일부 포함되어 있어 의약품 또는 화장품 조성으로 적합하지 않다. 또한, 배지 특유의 취는 제품의 만족도를 떨어트리고 높은 무기염의 함량은 제형의 안정성에 문제를 일으킨다.
APMIS. 1989 Oct;97(10):926-34, Cytotherapy. 2009 Jan;11(7):958-972
본 발명은 기존 동물세포 배양용 무혈청 배지를 의약품 원료 또는 식약청에서 고시한 화장품 원료로 허용된 성분으로 재구성한 배지로서 종래 동물세포의 혈청 함유 배지 보다 우수한 세포 성장율로 배양할 수 있는 새로운 동물세포 배양용 무혈청 배지를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 동물세포 배양용 무혈청 배지를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물로 제형 안정성과 제품 만족도를 높이고 피부 상태를 개선하는데 다른 목적이 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 무기염 3000 내지 5400 ppm, 아미노산 20 내지 80 ppm, 비타민 5 내지 20 ppm 및 탄소원 2000 내지 4000 ppm을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지를 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 무혈청 배지를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물 또는 피부외용제를 제공한다.
본 발명에 따른 동물세포 배양용 무혈청 배지는 기존 동물세포 배양용 무혈청 배지의 구성성분을 의약품 또는 화장품의 원료로 허용된 성분으로 무기염, 아미노산, 비타민의 조성 성분과 함량을 변경함으로써 원료의 안전성과 안정성을 증가시켰다. 또한, 사이토카인 조합을 첨가함으로써 피부세포를 종래의 혈청 함유 배지의 세포 성장율로 배양할 뿐만 아니라 이를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물은 피부 탄력 개선, 리프팅 증가, 혈류량 증가, 밝기 및 투명도 개선, 피부 복원력 개선 효과를 보였고 피험자 만족도 또한 우수하였다.
도 1은 비교제조예 1, 제조예 1 및 제조예 2의 동물세포 배양용 무혈청 배지에 대한 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1의 화장료 조성물에 대한 피부 탄력 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1의 화장료 조성물에 대한 Moire Topography 결과 및 안면 리프팅 개선율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1의 화장료 조성물에 대한 미세 조직 혈류량 측정 결과 및 혈류량 개선율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 1의 화장료 조성물에 대한 피부 투명도 개선율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 1의 화장료 조성물에 대한 피부 밝기 개선율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1의 화장료 조성물에 대한 피부 복원력 개선율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 1의 화장료 조성물에 대하여 피부 강압 조건 시 피부 복원력 개선 효과를 확인한 사진이다.
도 9는 실시예 1의 화장료 조성물에 대한 피험자의 주관적 만족도 평가를 나타낸 것이다.
본 발명은 기존 동물세포 배양용 무혈청 배지를 식약청에서 고시한 의약품 또는 화장품 원료로 허용된 성분으로 재구성한 배지로서 종래 동물세포의 혈청 함유 배지 보다 우수한 세포 성장율로 배양할 수 있는 새로운 동물세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것이다.
상기 동물세포는 포유동물 세포로서, 사람 또는 포유동물 기원일 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 배양될 수 있는 포유동물 세포의 예로는, 예컨대 피부 내 세포인 섬유아세포(fibroblast), 각질형성세포, 멜라닌형성세포와 줄기세포, 근육세포, 생식세포, 면역세포 등이 있다. 본 발명에서 사용된 기존 동물세포 배양용 무혈청 배지는 구체적으로 DMEM 배지(Gibco, USA)로 알려진 구성 성분과 함량을 근거로 그대로 제조하여 사용하였다.
본 발명에 따른 동물세포 배양용 무혈청 배지는 기존 배지 조성에서 각각의 함량을 현저히 줄인 것으로, 구체적으로, 무기염 3000 내지 5400 ppm, 아미노산 20 내지 80 ppm, 비타민 5 내지 20 ppm 및 탄소원 2000 내지 4000 ppm을 포함한다.
특히, 본 발명은 상기 배지에 사이토카인 0.1 내지 7 ppm을 추가로 포함할 수 있다.
상기 무기염은 일반적인 동물세포 배양용 무혈청 배지로 사용되는 무기염 성분 중에서 질산철 9수화물(Fe(NO3)3·9H2O), 황산마그네슘(MgSO4)가 배제되도록 하며, 바람직한 성분으로는 염화칼슘 무수물(CaCl2, anhydrous), 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 황산구리 5수화물(CuSO4·5H2O), 황산제1철 7수화물(FeSO4·7H2O), 염화마그네슘(MgCl2), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 황산아연 7수화물(ZnSO4·7H2O) 및 제일인산나트륨 1수화물(NaH2PO4·H2O)로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상이 바람직하다. 본 발명에서 무기염은 세포의 기능의 발현을 조절하는 역할을 하며, 3000 ppm 미만이면 세포의 기능의 조절에 문제가 있고, 5400 ppm을 초과하면 무기염은 반응성이 크기 때문에, 의약품이나 화장품으로 제형화되기 어려운 문제가 있다.
본 발명에서 사용된 배지에서 무기염의 보다 바람직한 조성은 염화칼슘 무수물(CaCl2, anhydrous) 20 내지 30 ppm, 염화칼륨(KCl) 160 내지 240 ppm, 염화나트륨(NaCl) 3200 내지 4800 ppm, 제일인산나트륨 1수화물(NaH2PO4·H2O) 60 내지 100 ppm이다.
상기 아미노산은 일반적인 동물세포 배양용 무혈청 배지로 사용되는 아미노산 성분 중에서 엘-글루타민(L-Glutamine)이 배제되도록 하며, 바람직한 성분으로는 엘-아르기닌(L-Arginine), 엘-시스테인(L-Cystine), 글라이신(Glycine), 엘-히스티딘(L-Histidine), 엘-이소류신(L-Isoleucine), 엘-류신(L-Leucine), 엘-라이신(L-Lysine), 메치오닌(L-Methionine), 엘-페닐알라닌(L-Phenylalanine), 엘-세린(L-Serine), 엘-트레오닌(L-Threonine), 엘-트립토판(L-Tryptophan), 엘-타이로신(L-Tyrosine), 엘-프롤린(L-Proline), 엘-알라닌(L-Alanine), 엘-아스파라긴(L-Asparagine), 엘-발린(L-Valine) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상이 바람직하다. 상기 염으로는 염산염(HCl), 아세트산염(CH3COOH) 등이 가능하다. 본 발명에서 아미노산은 단백질 합성의 원료로 세포의 성장에 이용되는 역할을 하며, 20 ppm 미만이면 세포의 성장 및 유지에 문제가 있고, 80 ppm을 초과하면 원료 특유의 취가 증가하는 문제와 제형 안정성에 문제가 있다.
본 발명에서 사용된 배지에서 아미노산의 보다 바람직한 조성은 엘-아르기닌 염산염(L-Arginine HCl) 2 내지 6 ppm, 엘-시스테인 2염산염(L-Cystine 2HCl) 2 내지 5 ppm, 글라이신(Glycine) 1 내지 3 ppm, 엘-히스티딘 염산 1수화물(L-Histidine HCl·H2O) 1 내지 3 ppm, 엘-이소류신(L-Isoleucine) 2 내지 8 ppm, 엘-류신(L-Leucine) 2 내지 8 ppm, 엘-라이 염산염(L-Lysine HCl) 3 내지 10 ppm, 엘-메치오닌(L-Methionine) 1 내지 3 ppm, 엘-페닐알라닌(L-Phenylalanine) 1 내지 5 ppm, 엘-세린(L-Serine) 1 내지 3 ppm, 엘-트레오닌(L-Threonine) 2 내지 6 ppm, 엘-트립토판(L-Tryptophan) 0.1 내지 3 ppm, 엘-타이로신(L-Tyrosine) 2 내지 8 ppm, 엘-발린(L-Valine) 2 내지 8 ppm이다.
상기 비타민은 일반적인 동물세포 배양용 무혈청 배지로 사용되는 비타민 성분 중에서 콜린 클로라이드, 칼슘판토테네이트(Calcium Pantothenate), 디-판토텐산나트륨(D-Na Pantothenic Acid)가 배제되도록 하며, 바람직한 성분으로는 엽산(Folic Acid), 미오-이노시톨(Myo-Inositol), 나이아신아마이드(Niacinamide), 피리독신(Pyridoxine), 바이오틴(Biotin), 리보플라빈(Riboflavin), 티아민(Thiamine) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상이 바람직하다. 상기 염으로는 염산염(HCl), 아세트산염(CH3COOH) 등이 가능하다. 본 발명에서 비타민은 세포 활성 유지 역할을 하며, 5 ppm 미만이거나 20 ppm을 초과하면 세포 활성 유지에 문제가 있다.
본 발명에서 사용된 배지에서 비타민의 보다 바람직한 조성은 엽산(Folic Acid) 1 내지 3 ppm, 미오-이노시톨(Myo-Inositol) 2 내지 6 ppm, 나이아신아마이드(Niacinamide) 1 내지 3 ppm, 피리독신 염산염(Pyridoxine HCl) 1 내지 3 ppm, 리보플라빈(Riboflavin) 0.1 내지 0.3 ppm, 티아민 염산염(Thiamine HCl) 1 내지 3 ppm이다.
상기 탄소원은 일반적인 동물세포 배양용 무혈청 배지로 사용되는 탄소원 성분 중에서 소듐파이로베이트(Na-Pyruvate)가 배제되도록 하며, 바람직한 성분으로는 디-글루코오스(D-Glucose) 및 탄산수소나트륨(NaHCO3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 바람직하다. 본 발명에서 탄소원은 에너지원으로서 역할을 하며 탄산수소나트륨의 경우 배지의 pH를 유지하는 역할을 한다. 2000 ppm 미만이면 에너지원이 부족한 문제가 있고, 4000 ppm을 초과하면 제형 안정성에 문제가 있다.
본 발명에서 사용된 배지에서 탄소원의 보다 바람직한 조성은 디-글루코오스(D-Glucose) 480 내지 720 ppm, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 1600 내지 2400 ppm이다.
상기 사이토카인은 상피세포성장인자(epidermal growth factor; EGF), 섬유아세포증식인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 혈소판유래성장인자-AA(platelet-derived growth factor-AA; PDGF-AA), 혈소판유래성장인자-BB(platelet-derived growth factor-BB; PDGF-BB), 이오탁신(Eotaxin), 프렉탈카인(Fractalkine), 인터페론 알파 2a(interferon Alfa-2a; IFNa2a), 인터루킨-10(interleukin-10; IL-10), 인터루킨-2(interleukin-2; IL-2), 인터루킨-3(interleukin-3; IL-3), 인터루킨-5(interleukin-5, IL-5), 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6), 인터루킨-1베타(interleukin-1beta; IL-1b), 인터루킨-1알파(interleukin-1alpha; IL-1a), 단핵세포화학유인물질단백질 1 (monocyte chemoattractant protein 1; MCP-1; CCL2). CCL5(Regulated upon Activation Normal T cell Expressed presumed Secreted; RANTES), 인터루킨-17a(interleukin-17a; IL-17a) 및 FLT-3-리간드(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 바람직하다. 본 발명에서 사용된 배지에서 사이토카인은 0.1 내지 7 ppm이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1 내지 5 ppm이다.
본 발명에서 사이토카인을 배지에 첨가함으로써 세포를 종래의 혈청 함유 배지 보다 우수한 세포 성장율로 배양할 수 있다. 사이토카인을 0.1 ppm 미만 첨가시키면 세포 성장이 제한적인 문제가 있고, 7 ppm을 초과 사용하면 세포 독성에는 문제가 없으나 세포 성장률 또한 크게 증가하지 않아 불필요하다.
이와 같은 조성 성분과 함량의 변화로 세포 배양 효과도 우수하면서도 원료의 안전성과 안정성을 증진시킬 수 있었다.
본 발명은 또한, 상기 무혈청 배지를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
상기 무혈청 배지를 유효성분으로 포함한 피부상태 개선용 조성물은 피부 상태를 개선할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부 탄력 개선, 피부 리프팅 효과 증가, 피부 미세조직 혈류량 개선, 피부 투명도 및 밝기 개선, 피부 복원력 개선 등의 효능이 있으므로 피부 상태를 개선할 수 있다. 또한, 상술한 효과를 갖는 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 사용자 관능성 평가에서도 만족할 만한 효과를 나타내었다.
본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부 상태, 예를 들어 피부 탄력 개선, 피부 리프팅 효과 증가, 피부 미세조직 혈류량 개선, 피부 투명도 및 밝기 개선, 피부 복원력 개선 등을 목적으로 화장품 및 의약품의 제형으로써 제공되는 것이 바람직하다.
구체적인 또 하나의 양태로서, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부상태 개선을 목적으로 한 피부에 직접 적용되는 화장료로서 제공된다.
상기 화장료는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
화장료의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 화장료 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
또한, 상기 화장료 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 상기 화장료 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료에 포함되는 성분은 유효성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 화장료는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 샴푸, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태이다.
구체적인 또 하나의 양태로서, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부 상태의 개선을 목적으로 한 피부외용제로서의 의약품으로 제공될 수 있다.
상기 의약품은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 스프레이, 연고, 패취제, 겔제, 크림제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 의약품에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed, 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 의약품은 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 경피 투여 주사제, 연고제, 액제, 크림제, 결제, 스프레이제, 패취제 등의 피부외용제의 제형으로 투여할 수 있다.
또한, 상기 의약품의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1~2 및 비교제조예 1: 세포 배양 배지의 제조
무기염류, 비타민, 아미노산, 세포의 에너지원 등을 하기 표 1의 조성비율로 첨가하여 제조하였다.
기본 배지의 제조에 사용된 각 성분은 의약품 또는 화장품 원료로 허용된 성분이며 각 성분들의 일정한 함량을 초순수 정제수에 혼합하였고 용해도가 낮은 아미노산과 비타민은 산 또는 염기용액에 용해시킨 후 첨가하여 충분히 용해시켜 사용하였다. 모든 성분들이 용해된 것을 확인한 후 0.22mm 여과기로 여과하였다.
특히, 비교제조예 1의 배지는 현재 구성 성분과 함량이 알려져 있으며 시판되어 사용중인 DMEM(Gibco, USA) 배지를 제조하여 사용하였다. 동물세포 배양용 무혈청 배지를 사용하였다.
구분
(ppm)		 성분 비교제조예1 제조예1 제조예2
무기염 염화칼슘 무수물 CaCl2 (anhydrous) 200 24 24
질산철 9수화물 Fe(NO3)3·9H2O 0.1 0 0
염화칼륨 KCl 400 200 200
황산마그네슘 MgSO4 (anhydrous) 97.67 0 0
염화나트륨 NaCl 6400 4000 4000
제일인산나트륨 1수화물 NaH2PO4·H2O 125 80 80
아미노산 엘-아르기닌 염산염 L-Arginine HCl 84 4 4
엘-시스테인 2염산염 L-Cystine 2HCl 62.57 3 3
엘-글루타민 L-Glutamine 584 0 0
글라이신 Glycine 30 2 2
엘-히스티딘 염산 1수화물 L-Histidine HCl·H2O 42 2 2
엘-이소류신 L-Isoleucine 104.8 5 5
엘-류신 L-Leucine 104.8 5 5
엘-라이신 염산염 L-Lysine HCl 146.2 7 7
엘-메치오닌 L-Methionine 30 2 2
엘-페닐알라닌 L-Phenylalanine 66 3 3
엘-세린 L-Serine 42 2 2
엘-트레오닌 L-Threonine 95.2 4 4
엘-트립토판 L-Tryptophan 16 1 1
엘-타이로신 L-Tyrosine 103.79 5 5
엘-발린 L-Valine 93.6 5 5
비타민 디-판토텐산칼슘 D-Ca Pantothenate 4 0 0
디-판토텐산나트륨 D-Na Pantothenic Acid 4 0 0
콜린클로라이드 Choline Chloride 4 0 0
엽산 Folic Acid 4 2 2
미오-이노시톨 Myo-Inositol 7 4 4
나이아신아마이드 Niacinamide 4 2 2
피리독신 염산염 Pyridoxine HCl 4 2 2
리보플라빈 Riboflavin 0.4 0.2 0.2
티아민 염산염 Thiamine HCl 4 2 2
탄소원 디-글루코오스 D-Glucose 4500 600 600
소듐파이로베이트 Na-Pyruvate 55 0 0
탄산수소나트륨 NaHCO3 3700 2000 2000
사이토카인 0 0 3
실험예 1: 세포증식 효과 측정
사이토카인 조합을 함유하는 세포배양 배지에 대하여 다음과 같이 세포증식 효과를 측정하였다. 실험에 사용된 세포는 HF(Human Fibroblast)로서 37 ℃, 5% CO2의 조건에서 10% FBS(Gibco), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린(penicillin), 0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B(amphotericin B)가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 충분히 증식시켰다. HF 세포를 96웰에 2 X 104 세포/웰의 밀도로 200 ㎕의 배지와 함께 분주한 뒤, 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 비교제조예 1, 제조예 1, 제조예 2를 각 웰에 처리하여 72시간 동안 배양하였다. PBS에 녹인 5 ㎎/㎖ MTT 용액을 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3시간 동안 37 ℃, 5% CO2에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 생성된 포르마잔 생성물(formazan product)을 이소프로필 알코올 100 ㎕를 첨가하여 30분 동안 추출하여 ELISA 리더(reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정, 상대 비교하였다.
그 결과, 재구성한 제조예 1의 배지도 비교제조예 1 배지 수준으로 세포가 배양됨을 확인할 수 있었으며, 사이토카인의 조합을 첨가한 제조예 2 배지의 경우는 35% 이상 세포 증식이 증가함을 확인하였다[표 2, 도 1]. 35% 이상의 세포 증식은 약 10% FBS를 일반 배지에 첨가했을 때 보이는 세포 증식 증가율의 수준이다.
시료 증식률(%)
비교제조예 1 100
제조예 1 113.4
제조예 2 135.3
실험예 2: 콜라겐 합성 촉진 효과 측정
키트[procollagen type-1 C-peptide EIA kit, Takara, Japan]를 사용하여 프로 콜라겐의 합성을 측정하였다.
HF 세포를 5 × 104 세포/㎖의 밀도로 24 웰 플레이트에 비교제조예 1 배지와 제조예 1, 2 배지를 넣고 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 48 시간 동안 배양하였다. 항-PIP 항체가 코팅된(anti-PIP antibody-coated) 96 웰 플레이트에 항체-POD가 결합된 용액(antibody-POD conjugate sol'n) 100 ㎕를 넣고 비교제조예 1, 제조예 1, 2 배지와 표준액 20 ㎕를 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 4회 세척 후 말끔히 제거하고 기질용액 100 ㎕를 첨가한 후 실온에서 15분간 둔 후, H2SO4 100 ㎕를 첨가하여 가볍게 흔든 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 사이토카인의 조합을 함유한 제조예 2의 배지에서 다른 배지보다 높은 콜라겐 합성 증가 효과가 있음을 확인하였다[표 3].
구분 콜라겐 합성 증가율 (%)
비교제조예 1 100
제조예 1 104
제조예 2 143
비타민 C (최종농도 52.8 ㎍/mL) 130
실험예 3: 피부 1차 자극성 시험(폐쇄 첩포 실험)
상기 제조예 1, 2와 비교제조예 1에 대하여 피부 자극성을 알아보기 위해 건강한 성인 남, 여 50명을 대상으로 등 부위에 각 시료의 일정량(0.2 g)을 24시간 첩포한 후, 핀 챔버를 제거하고 4시간 경과한 다음 육안으로 피부 상태 변화를 판독하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
하기 표 4에서 보듯이, 제조예 1과 2는 자극도가 유사하게 나타났으나 비교제조예 1은 자극도가 높게 나타났다.
아미노산 및 무기염의 함량을 재구성하여 제조한 제조예 1과 2가 기존의 세포배지로 구성한 비교제조예 1 보다 더 안전성이 우수함을 확인할 수 있었다.
피부 1차 자극성 시험 결과
시료 피시험자수 판정결과 자극도
++ + +- -
비교제조예 1 50 - 1 3 42 0.10
제조예 1 50 - - 1 49 0.02
제조예 2 50 - - 1 49 0.02
[판정 기준]
- : 홍반이나 특이한 현상 없음.
+-: 주위보다 약간 붉어짐.
+ : 주위보다 현저히 붉어짐.
++: 주위보다 심하게 붉어지고 부풀어 오름.
[수학식 1]
자극도 = {(+-)수×1} + {(+)수×2} + {(++)수×3} /피시험자수
실험예 4: 안정성 평가
비교제조예 1 및 제조예 1, 2에 따라 제조된 화장료 조성물을 이용하여 성상의 안전성을 관찰하였고, 온도 및 시간 경과에 따른 제형의 안전성을 평가하여 다음 표 5에 나타내었다. 이때, FT(freezing and thawing)은 조성물을 완전히 얼리고 녹이는 과정을 반복하여 안전성을 관찰하였다.
온도에 따른 안전성 분석 결과, 본 발명에 따른 제조예 1, 2는 저온 및 고온에서 제형 성상의 안전성이 우수함을 확인할 수 있었다. 즉, 기존의 세포 배지로 구성한 비교제조예 1은 특히 고온에서 제형의 안전성을 유지하는 것에 문제가 있었으며, 아미노산 및 무기염의 함량을 재구성하여 제조한 제조예 1과 2는 세포의 생장을 유지하면서 제형 내의 안정성이 우수함을 알 수 있었다[표 5].
경시조건(온도, ℃) 비교제조예1 제조예1 제조예2
0 1주차 불안정 1개월 안정 1개월 안정
25 1주차 불안정 1개월 안정 1개월 안정
40 3일 불안정 1개월 안정 1개월 안정
45 3일 불안정 1개월 안정 1개월 안정
50 1일 불안정 1개월 안정 1개월 안정
60 1일 불안정 1개월 안정 1개월 안정
FT 1회 불안정 3회 안정 3회 안정
실시예 1: 제조예 2를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물
처방예는 하기 표 6과 같다. 실험예 1에서 4에 나타낸 바와 같이 효능과 안전성이 우수한 제조예 2를 유효성분으로 90 중량%를 배합하여 제조하였다.
이들의 제조방법은 하기 표 6의 조성에 따라, 먼저 원료 1-3을 투입하여 실온에서 분산 후 원료 4-5를 충분히 용해시키고, 원료 6을 투입하여 40 ℃에서 충분히 용해시켜 로션을 제조하였다.
순번 원료명 함량 (중량%)
실시예 1
1 유효성분 제조예 2 90
2 보존제 1,2-헥산디올 2.5
3 점증제 잔탄검 0.3
4 보습제 판테놀 2.5
5 보습제 히알루론산 1.2
6 보습제 글리세린 3.5
실험예 5: 피부 탄력 효과 평가
상기 실시예 1에 대하여 피부 탄력 개선 효과를 다음과 같이 평가하였다.
40~50대 여성 21명에게 시험제품을 4주간 1일 2회 얼굴 전체에 사용하도록 하였다. 평가는 제품 사용 전, 사용 4주 후 평가시점에서 Cutometer® MPA580을 이용하여 뺨 정면의 피부 탄력을 측정하고, 사용 전 후의 탄력개선율을 분석하였다.
분석 결과, 제조예 2를 함유한 화장료 조성물의 경우 사용 전과 비교하여 통계적으로 유의 차 있게 사용 4주 후 8.14%의 피부 탄력 개선 효과를 보였다[도 2].
실험예 6: 피부 리프팅 효과 평가
상기 실시예 1에 대하여 피부 리프팅 개선 효과를 다음과 같이 평가하였다.
40~50대 여성 21명에게 시험제품을 4주간 1일 2회 얼굴 전체에 사용하도록 하였다. 평가는 제품 사용 전, 사용 4주 후 각 평가시점에서 피부 처짐 정도를 등고선으로 표현해 주는 Moire Topography를 이용하여 Digital Camera로 뺨 측면을 촬영하고, 저장된 이미지를 Image-pro® plus를 이용하여 등고선의 중심에서부터 수직으로 4~5번째 위치에서 코끝 아래까지의 각도를 분석하였다.
그 결과, 사용 전과 비교하여 통계적으로 유의 차 있게 사용 4주 후 2.36%의 피부 리프팅 개선 효과를 보였다[도 3].
실험예 7: 피부 혈류량 개선 효과 평가
상기 실시예 1에 대하여 피부 혈류량 개선 효과를 다음과 같이 평가하였다.
40~50대 여성 21명에게 시험제품을 4주간 1일 2회 얼굴 전체에 사용하도록 하였다. Laser Doppler Perfusion Imager(LDPI, PeriScan PIM II, Perimed AB, Sweden)는 도플러 이론에 기초하여 미세 조직 혈류량(blood perfusion)을 측정하며, 측정단위는 임의의 단위(AU, arbitrary unit)이다. 시험 부위(볼)에 대해 LDP image analysis software(LDPIwin version 2.6)를 이용하여 혈류량을 측정하고 그 결과를 분석하였다. 평가는 사용 전(baseline), 사용 4주 후에 동일한 방법으로 측정하였다. 이렇게 측정된 수치를 다음 수학식 2에 적용시켜 피부 혈류량 개선율을 계산하였다.
[수학식 2]
Figure 112013014902105-pat00001
그 결과, 사용 전과 비교하여 통계적으로 유의 차 있게 사용 4주 후 63.85%의 혈류량 개선 효과를 보였다[도 4].
실험예 8: 피부 투명도 개선 효과 평가
상기 실시예 1에 대하여 피부 투명도 개선 효과를 다음과 같이 평가하였다.
40~50대 여성 21명에게 시험 제품을 4주간 1일 2회 얼굴 전체에 사용하도록 하였다. 평가는 제품 사용 전, 사용 4주 후 각각 평가시점에서 Radioscan(True system,Korea)를 이용하여 좌측 또는 우측 뺨 측면 부위의 피부 투명도를 입사각 60도, 반사각 20도~70도 각도에서 측정하여 확산반사(subsurface reflection) 값을 분석하였다.
그 결과, 사용 전과 비교하여 통계적으로 유의 차 있게 사용 4주 후 2%의 피부 투명도 개선 효과를 보였다[도 5].
실험예 9: 피부 밝기 개선 효과 평가
상기 실시예 1에 대하여 피부 밝기 개선 효과를 다음과 같이 평가하였다.
40~50대 여성 21명에게 시험제품을 4주간 1일 2회 얼굴 전체에 사용하도록 하였다. Visia-CR(Canfiled Imaging System, USA) 특수하게 제작된 턱 받침대와 이마 고정대가 장착되어 있어 촬영 시 일정한 각도를 유지하며 피험자와 카메라의 거리가 항상 일정하게 유지되었다. 매 측정 시 기기 내부에 장착된 스트로보를 이용하여 촬영 조건을 고정하나 후 cross 모드로 설정하여 피험자의 안면을 촬영하였다.
그 결과, 사용 전과 비교하여 통계적으로 유의 차 있게 사용 4주 후 2.73%의 피부 밝기 개선 효과를 보였다[도 6].
실험예 10: 피부 복원력 개선 효과 평가
상기 실시예 1에 대하여 피부 복원력 개선 효과를 다음과 같이 평가하였다.
40~50대 여성 21명에게 시험 제품을 4주간 1일 2회 얼굴 전체에 사용하도록 하였다. 시험부위인 볼 부위를 PRIMOS Lite로 촬영한 뒤에 무거운 물체를 2분30초 간 볼 위에 얹어 굴곡의 자국을 남겼다. 자국이 새겨진 직 후와 피부가 복원되도록 대기한 8분 후 다시 한번 촬영하고, 촬영된 이미지를 PRIMOS software를 이용하여 측정한 Ra 값의 변화량을 이용하여 개선 여부를 평가하였다.
동일한 피부 강압 조건 시 피부 탄력 복원력 개선 효과 평가 결과, 사용 전과 비교하여 통계적으로 유의 차 있게 사용 2주 후 2분30초 후에 45.65%, 8분 후에 56.24%, 사용 4주 후 2분 30초 후에 46.57%, 8분 후에 55.88%의 피부 복원력 개선 효과를 보였다[도 7, 도 8]. 따라서, 시험 시료는 사용 2주 후부터 동일한 피부 강압 조건 시 피부 복원력 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다.
실험예 11: 피험자의 주관적 만족도 평가
상기 실시예 1에 대하여 사용 4주 후 40~50대 여성 21명에게 제품을 1일 2회 얼굴 전체에 사용하도록 하였다.
피험자를 대상으로 일반적 평가(사용감), 효능성 평가, 화장품적 적합성 평가, 안전성 평가, 제품에 대한 호감도 등을 설문 조사하였다.
그 결과는 도 9에 나타내었다.

Claims (11)

  1. 염화칼슘 무수물(CaCl2, anhydrous) 20 내지 30 ppm, 염화칼륨(KCl) 160 내지 240 ppm, 염화나트륨(NaCl) 3200 내지 4800 ppm, 제일인산나트륨 1수화물(NaH2PO4·H2O) 60 내지 100 ppm의 무기염;
    엘-아르기닌 염산염(L-Arginine HCl) 2 내지 6 ppm, 엘-시스테인 2염산염(L-Cystine 2HCl) 2 내지 5 ppm, 글라이신(Glycine) 1 내지 3 ppm, 엘-히스티딘 염산 1수화물(L-Histidine HCl·H2O) 1 내지 3 ppm, 엘-이소류신(L-Isoleucine) 2 내지 8 ppm, 엘-류신(L-Leucine) 2 내지 8 ppm, 엘-라이신 염산염(L-Lysine HCl) 3 내지 10 ppm, 엘-메치오닌(L-Methionine) 1 내지 3 ppm, 엘-페닐알라닌(L-Phenylalanine) 1 내지 5 ppm, 엘-세린(L-Serine) 1 내지 3 ppm, 엘-트레오닌(L-Threonine) 2 내지 6 ppm, 엘-트립토판(L-Tryptophan) 0.1 내지 3 ppm, 엘-타이로신(L-Tyrosine) 2 내지 8 ppm, 엘-발린(L-Valine) 2 내지 8 ppm의 아미노산;
    엽산(Folic Acid) 1 내지 3 ppm, 미오-이노시톨(Myo-Inositol) 2 내지 6 ppm, 나이아신아마이드(Niacinamide) 1 내지 3 ppm, 피리독신 염산염(Pyridoxine HCl) 1 내지 3 ppm, 리보플라빈(Riboflavin) 0.1 내지 0.3 ppm, 티아민 염산염(Thiamine HCl) 1 내지 3 ppm의 비타민; 및
    디-글루코오스(D-Glucose) 480 내지 720 ppm, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 1600 내지 2400 ppm의 탄소원;
    을 포함하는 인간 피부 세포 배양용 무혈청 배지.
  2. 제 1 항에 있어서,
    사이토카인 0.1 내지 7 ppm을 추가로 포함하는 인간 피부 세포 배양용 무혈청 배지.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 2 항에 있어서,
    상기 사이토카인은 상피세포성장인자(epidermal growth factor; EGF), 섬유아세포증식인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 혈소판유래성장인자-AA(platelet-derived growth factor-AA; PDGF-AA), 혈소판유래성장인자-BB(platelet-derived growth factor-BB; PDGF-BB), 이오탁신(Eotaxin), 프렉탈카인(Fractalkine), 인터페론 알파 2a(interferon Alfa-2a; IFNa2a), 인터루킨-10(interleukin-10; IL-10), 인터루킨-2(interleukin-2; IL-2), 인터루킨-3(interleukin-3; IL-3), 인터루킨-5(interleukin-5, IL-5), 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6), 인터루킨-1베타(interleukin-1beta; IL-1b), 인터루킨-1알파(interleukin-1alpha; IL-1a), 단핵세포화학유인물질단백질 1(monocyte chemoattractant protein 1; MCP-1; CCL2). CCL5(Regulated upon Activation Normal T cell Expressed presumed Secreted; RANTES), 인터루킨-17a(interleukin-17a; IL-17a) 및 FLT-3-리간드(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 인간 피부 세포 배양용 무혈청 배지.
  8. 삭제
  9. 제 1 항의 무혈청 배지를 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    전체 조성물 100 중량부에 대하여 제 1 항의 무혈청 배지 10 내지 95 중량부를 포함하는 피부 개선용 조성물.
  11. 제 1 항의 무혈청 배지를 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 피부외용제.
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