KR101695549B1 - 주글론을 포함하는 피부 재생용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 약학적 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물, 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 주글론 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물은 자외선을 조사한 세포에서 독성을 띄지 않고, ROS 생산을 감소시켜 세포 생존율을 증가시키고, 세포 사멸로부터 세포를 보호하는 효과를 가진다. 나아가 상기 조성물은 생체 외 및 생체 내에서 우수한 상처 치유효과를 가지므로 피부 재생용 조성물로 이용될 수 있다.

Description

주글론을 포함하는 피부 재생용 조성물 {A composition for skin regeneration comprising Juglone}
본 발명은 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 약학적 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물, 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
피부 손상은 다양한 외인성 및 내인성 파괴 인자에 의해 피부의 생리적 기능, 형태 및 구조가 악화되는 현상을 의미한다. 특히, 자외선이나 물리적 손상과 같은 외인성 인자는 피부의 외형 및 기능을 악화시킨다.
자외선에 지속적이거나 주기적으로 노출되면 피부에 주름이 생기거나 피부 탄력성이 감소되는 등 피부 노화 과정이 진행될 수 있다. 자외선은 DNA 손상을 가져오며, 체내에서 다양한 핵심 신호 경로를 방해하는 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 수준을 증가시킨다. 또한, 세포외기질의 콜라겐을 파괴하며, 새로운 콜라겐의 합성을 저해한다.
한편, 피부에 대한 또 다른 손상 인자로서 찰과상, 화상 등과 같은 물리적 손상을 들 수 있다.
이와 같은 외인성 인자들에 의한 피부 손상으로부터 피부를 재생하기 위하여 피부에서는 재상피화 (re-epithelialization) 및 새살형성 (granulation) 과정이 필요하며, 이러한 회복 과정에 섬유아세포 (fibroblast)와 각질세포 (keratinocyte)가 핵심적인 역할을 한다.
호두는 또한 탈모, 항염 및 항산화 활성, 알츠하이머 질환에서 보호 작용, 및 항용혈 (antihemolytic) 활성을 가진 것으로 알려져 있으며, 호두에 천연적으로 존재하는 주글론 (juglone)은 한때 인간 세포에 독성이 있는 것으로 여겨졌으나, 현재는 항암제 및 항증식제로 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 항균, 항염 및 항암 활성을 가지는 것으로 잘 알려져 있으며, 더욱 최근에는 수명과 관련된 역할이 보고되었다. 그러나, 피부 노화 및 피부 상처에서 주글론의 역할은 보고된바 없다.
본 발명자들은 피부 손상을 회복시킬 수 있는 피부 재생용 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 주글론이 물리적 손상, 및 자외선으로 유도되는 ROS 생성 및 세포 사멸과 같은 피부 손상에 대한 보호 효과 및 피부 재생 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

[선행기술문헌 정보]
1. 한국공개특허 제2013-0063708호 (2013.06.17.)
2. Journal of Dental Research 2015, 94(2), 371-380 (2014.12.15.)
3. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013, 23, 3631-3634 (2013.04.11.)
본 발명의 하나의 목적은 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 주글론 (Juglone) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 “주글론 (Juglone)”은 호두나무과 (Juglandaceae family) 흑호두나무 (black walnut)로부터 유래하는 천연 나프토퀴논 화합물로서 5-하이드록시나프토퀴논 (5-hydroxynaphthoquinone)으로도 명명된다. 상기 주글론은 미생물 및 식물의 비오틴 생합성 경로에 관여하여 식물생장에 주요한 역할을 하는 KAPAS (7-keto-8-aminopelargonic acid synthase) 작용을 억제하고, 항암제 및 항증식제로 역할을 할 수 있으며, 항균, 항염 활성을 가지는 것으로 알려져있으나, 피부 재생 및 피부 상처 치유 효과에 대하여는 보고된 바 없다.
상기 주글론은 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015057212861-pat00001
본 발명에서 용어 “약학적으로 허용가능한 염”은 적절한 약학적으로 허용가능한 양이온 염 및 약학적으로 허용가능한 산 부가 염 둘 모두를 포함한다.
상기 약학적으로 허용가능한 양이온 염은, 이에 제한되는 것은 아니나, 알칼리 금속 염 (예를 들어, 나트륨 및 칼륨), 알칼리 토 금속 염 (예를 들어, 칼슘 및 마그네슘), 알루미늄 염, 암모늄 염 및 벤자틴 (N,N'-디벤질에틸렌디아민), 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민 (N-메틸글루카민), 베네타민 (N-벤질 펜에틸아민), 디에틸아민, 피페라진, 트로메타민 (2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올) 및 프로카인과 같은 염일 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은, 이에 제한되는 것은 아니나, 약제학에서 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 미네랄 또는 유기 산을 포함할 수 있다. 적절한 산에는, 예를 들어 무기 산, 예를 들어 할로겐화 수소산, 예를 들어 염화 수소산, 브롬화 수소산 등 또는 황산, 질산, 또는 인산; 또는 적절한 유기 산, 예를 들어 적절한 지방족 산, 예를 들어 지방족 모노 또는 디카르복실산, 하이드록시알칼산 또는 하이드록시알칸이산, 예를 들어 아세트산, 프로파노산, 하이드록시아세트산, 2-하이드록시프로파노산, 2-옥소프로파노산, 에탄이산, 프로판이산, 부탄이산, (Z)-2-부텐이산, (E)-2-부텐이산, 2-하이드록시부탄이산, 2,3-디하이드록시부탄이산 또는 2-하이드록시-1,2,3-프로판트리카르복실산; 페닐 치환 알칸 산; 또는 적절한 방향족 산, 예를 들어 2-하이드록시벤조산 또는 4-아미노-2-하이드록시 벤조산; 또는 적절한 설폰산, 예를 들어 알칸설폰산, 예를 들어 페탄설폰산 또는 에탄설폰산 또는 방향족 설폰 산, 예를 들어 벤젠설폰 산 또는 4-메틸벤젠설폰 산; 또는 사이클로헥산설팜 산일 수 있다.
또한, 본 발명의 주글론은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “피부 재생”은 피부 보습 증가, 피부 탄력 증진, 피부 두께 증가, 피부 주름 개선, 피부 자극 완화 및 피부 손상 회복 작용을 모두 통칭하는 것이며, 이에 제한되는 것은 아니나 본 발명에서는 특히 자외선에 의한 피부 손상 또는 물리적 손상으로부터 피부를 재생시키는 것일 수 있다.
본 발명의 주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 피부 재생 효과를 가지며, 이와 같은 효과는 주글론이 자외선 조사에 의해 증가된 Pin1 단백질의 발현을 감소시키고, 감소된 Sirt1 단백질의 발현을 증가시킴으로써 나타나는 것일 수 있다.
포유류의 7 개의 시르투인 (Sirtuin) 패밀리 중에서, Sirt1은 효모 Sir2의 가장 가까운 호몰로그로서 가장 많이 연구된 시르투인이다. Sirt1은 매우 일반적이고 널리 사용되는 조절 기전으로 유전자 발현을 조절하며, 다양한 질환에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.
최근 몇 년간 염증, 산화적 손상, 세포 사멸, 당뇨, 및 노화 등 상당히 다양한 질환에서 Sirt1의 역할을 규명한 연구들이 다 수 보고되었으나, 피부 광노화 및 상처 치유에서 Sirt1의 역할은 많이 보고되지는 않았다. 다만, 최근, 바이러스 또는 칼로리 제한으로 유도된 Sirt1 과발현이 상처 치유와 상당한 연관성이 있다는 보고가 있었다. 따라서 본 발명에서는, 주글론 (juglone)을 이용하여 피부 광노화 및 상처 치유에서 Sirt1의 관련성을 규명하고자 하였다.
한편, Pin1은 세포에서 계속적으로 발현되며 Ser/Thr-Pro 모티프를 인지하는 펩티틸-프롤릴 시스/트랜스 아이소머라제 (peptityl-prolyl cis/trans isomerase)이며, 표적 단백질에서 구조적, 기능적 위치결정 (localization) 또는 안정성 변화를 야기하는 인산화를 수행한다. Pin1은 상향 조절을 통해 암 발생에 역할을 하며, 피부암 및 유방암을 포함하는 다양한 종류의 암에서 D1 단백질을 표적으로 함으로써 세포 주기 조절을 변화시키는 것으로 잘 알려져 있다.
또한, 최근 Pin1이 자외선으로 유도된 피부암 발생에 관여하고 있다는 보고가 있었으며, 상피세포에서 Pin1과 ROS가 관련이 있다는 보고 및 Pin1의 억제가 염증 반응을 감소시킨다는 보고가 있었다.
따라서, 본 발명에서는 Pin1의 발현 수준을 다양하게 하여 피부 손상 및 상처 치유에서 Pin1 조절을 밝히고, Sirt1 발현과의 관계를 규명하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 자외선을 조사한 세포에 주글론을 처리한 경우 증가된 Pin1 단백질의 발현을 감소시키고, 감소한 Sirt1 단백질의 발현을 증가시켰으며 (도 17 내지 도 19), 자외선을 조사하지 않은 정상 세포에서 Sirt1의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다 (도 20 내지 도 25).
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 자외선을 조사한 세포에 주글론을 처리했을 때 활성산소종 (ROS) 생산이 감소되고 (도 1), 세포 생존율이 증가하며 (도 2) 세포 사멸이 감소하는 것을 확인하였다 (도 4 내지 도 8).
나아가, 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 생체 외 (도 9) 및 생체 내 (도 15)에서 주글론의 상처 치유 효과를 확인하였으며, 주글론이 상처 치유와 관련된 단백질인 Rac1, Cdc42, 액틴 및 α-Pak의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 11 내지 도 14).
따라서 본 발명의 주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 자외선에 의한 활성산소종 생산 및 세포 사멸에 대한 보호 효과를 가질 뿐만 아니라, 피부 상처를 치유하는 우수한 효과가 있어 피부 재생용 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 피부 재생 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용되는 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 주글론을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
상기 조성물은 주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 1 내지 10 μM 농도로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 2 내지 8 μM, 보다 바람직하게는 4 내지 6 μM 농도로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 주글론 (Juglone) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 건강기능식품을 제공한다.
주글론 및 피부 재생에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.
식품학적으로 허용가능한 염은 상기 주글론의 약학적으로 허용가능한 염에 대해 설명한 바와 유사하다.
상기 주글론은 세포에 독성을 나타내지 않고, 오히려 자외선이 조사된 세포에서 세포 생존율을 증가시키는 효과를 보이므로 피부 재생을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다.
건강기능식품 (functional food)이란, 특정보건용 식품 (food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 피부 재생에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
이때, 상기 건강기능식품에 포함되는 주글론의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강기능식품의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 식품학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 주글론 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 건강기능식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 상기 식품에는 피부 재생 효과에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 식품보조첨가제는 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 그 종류가 제한되는 것은 아니다.
이때, 상기 식품에 포함되는 주글론의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강기능식품의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.
식품이 음료인 경우에는 100 ㎖를 기준으로 1 내지 30 g, 바람직하게는 3 내지 20 g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품은 식품에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연 (Zn), 철 (Fe), 칼슘 (Ca), 크롬 (Cr), 마그네슘 (Mg), 망간 (Mn), 구리 (Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제 (소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제 (표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제 (부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제 (타르색소 등), 발색제 (아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제 (아황산나트륨), 조미료 (MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료 (둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료 (바닐린, 락톤류 등), 팽창제 (명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제 (호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물 (food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 피부 재생에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기한 주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 외에도 필요에 따라 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위 내에서 피부 외용제에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면 수용성 성분, 분말성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하여 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나, 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 파우더, 파운데이션 또는 세정제의 제형일 수 있다. 구체적으로 상기 화장료 조성물의 제형은 임의로 선택할 수 있으며, 유효성분인 주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 함께, 물, 생리식염수, 글리세롤, 유분, 계면활성제, 보습제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료 등과 같은 기 공지된 화장료용 부형제가 혼합되어 로션제 (lotiones), 액제 (液劑), 유제, 에멀션제, 현탁제 (懸濁劑), 정제 (錠劑) 및 캡슐제 (capsules) 형태를 이루는 화장료 조성물이 형성된다. 상기 화장료 조성물을 사용하여 유연 화장수, 밀크로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 클렌싱 폼, 클렌싱 워터, 팩 또는 바디오일 등의 기초 화장료 및 파운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료를 제조할 수 있으며, 또한 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다.
이러한 화장료 조성물의 주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 피부에 흡수 및 고정되는 것을 촉진하도록, 화장료용 부형제 중에서 글리세린 1∼7 중량%가 포함되어 주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 함유 화장료 조성물이 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 화장료 조성물에게 항산화 기능을 제공하도록, 화장료용 부형제 중에서 선플라워 오일 (sunflower oil)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 의약외품 조성물을 제공한다.
주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 피부 재생에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.
상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패치제, 크림제, 산제, 현탁제, 젤제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선크림 로션, 모발손질 제품, 에어프레쉬너 젤 또는 세정 젤일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제가 있다.
본 발명의 주글론 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물은 자외선을 조사한 세포에서 독성을 띄지 않고, ROS 생산을 감소시켜 세포 생존율을 증가시키고, 세포 사멸로부터 세포를 보호하는 효과를 가진다. 나아가 상기 조성물은 생체 외 및 생체 내에서 우수한 상처 치유효과를 가지므로 피부 재생용 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 NHDF 세포에서 ROS 생산을 확인한 것으로, UVB를 조사하지 않은 대조군 (Normal), UVB를 조사하고 주글론을 처리하지 않은 것 (UVB), 그리고 UVB를 조사하고 주글론 (Juglone)을 농도별로 처리한 것을 나타낸다.
도 2는 UVB를 조사하지 않거나, 조사한 조건에서 주글론을 농도별로 처리하여 세포 생존율을 확인한 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. *** 정상 세포 대비 p < 0.0005; # 대조군 대비 p < 0.05, ## 대조군 대비 p < 0.005, 및 ### 대조군 대비 p < 0.0005.
도 3은 UVB를 처리하고 주글론을 다양한 농도로 처리하거나 처리하지 않은 NHDF 세포의 광학 현미경 사진이다.
도 4는 UVB를 처리한 NHDF 세포에서 주글론 처리가 DNA 분해를 막는다는 것을 확인한 세포 사멸 DNA ladder 분석 결과이다.
도 5는 세포 사멸 관련 단백질인 사이토크롬 (cytochrome) C (세포질 및 미토콘드리아), Bax 및 Bcl-2의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 6은 Bax의 발현 수준을 정량화하여 나타낸 것이다.
도 7은 Bcl-2의 발현 수준을 정량화하여 나타낸 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. # 대조군 대비 p < 0.05, ## 대조군 대비 p < 0.005 및 ### 대조군 대비 p < 0.0005.
도 8은 사이토크롬 C의 발현 수준을 정량화하여 나타낸 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. ** 정상 세포 대비 p < 0.005, 및 ## 대조군 대비 p < 0.005.
도 9는 주글론의 상처 치유효과를 확인하기 위한 생체외 상처 치유 분석 사진이다. 주글론을 농도별로 처리하고 시간에 따라 사진을 찍었다.
도 10은 다양한 농도의 주글론을 처리한 뒤 NHDF 세포의 생존율을 MTT 분석으로 확인한 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * 용매 처리군 대비 p < 0.05.
도 11은 주글론을 농도별로 처리하였을 때 Rac1, Cdc42, 액틴 및 α-Pak를 포함하는 상처 치유와 관련된 다양한 단백질의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다. 특히, GTP 결합 상태에서 Rac1 및 Cdc42는 활성을 띄므로 GST 풀-다운 분석 후 웨스턴블랏을 수행하여 GTP 결합형을 분석하였다.
도 12는 Rac1의 발현 패턴을 정량화하여 나타낸 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * 용매 처리군 대비 p < 0.05, 및 ** 용매 처리군 대비 p < 0.005.
도 13은 Cdc42의 발현 패턴을 정량화하여 나타낸 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * 용매 처리군 대비 p < 0.05, 및 ** 용매 처리군 대비 p < 0.005.
도 14는 액틴 및 α-Pak의 발현 패턴을 정량화하여 나타낸 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * 용매 처리군 대비 p < 0.05, ** 용매 처리군 대비 p < 0.005 및 *** 용매 처리군 대비 p < 0.0005.
도 15는 생체 내에서 주글론 처리의 효과를 나타낸 것이다. 마우스에 직경 6 mm의 상처를 만든 뒤, 용매만 처리하거나 0.1 % 주글론 용액을 처리하였다.
도 16은 용매 또는 0.1 % 주글론 용액을 처리한 두 그룹에서 10 일 동안 상처 직경을 정량화한 그래프이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. ** 용매 처리군 대비 p < 0.005.
도 17은 UVB를 조사하지 않거나, UVB를 조사하고 주글론을 농도별로 처리한 조건에서 Pin1 및 Sirt1의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 18은 Pin1의 웨스턴블랏 밴드를 정량화한 그래프이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * 정상 세포 대비 p < 0.05, # 대조군 대비 p < 0.05, 및 ## 대조군 대비 p < 0.005 .
도 19는 Sirt1의 웨스턴블랏 밴드를 정량화한 그래프이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * 정상 세포 대비 p < 0.05, # 대조군 대비 p < 0.05, 및 ## 대조군 대비 p < 0.005.
도 20은 NHDF 세포에 주글론 또는 레스베라트롤을 농도별로 처리한 뒤 Pin1 및 Sirt1의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 21은 HaCaT 세포에 주글론 또는 레스베라트롤을 농도별로 처리한 뒤 Pin1 및 Sirt1의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 22는 NHDF 세포에서 Pin1의 발현을 정량화하여 나타낸 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 23은 HaCaT 세포에서 Pin1의 발현을 정량화하여 나타낸 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 24는 NHDF 세포에서 Sirt1의 발현을 정량화하여 나타낸 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * 정상 세포 대비 p < 0.05.
도 25는 HaCaT 세포에서 Sirt1의 발현을 정량화하여 나타낸 것이다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * 정상 세포 대비 p < 0.05 및 ** 정상 세포 대비 p < 0.005.
도 26은 로우손 (Lawsone) 또는 플럼바진 (Plumbagin)을 농도별로 처리한 뒤 Pin1 및 Sirt1의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 27은 UVB를 조사하지 않거나, UVB를 조사하고 로우손 또는 플럼바진을 농도별로 처리한 뒤 Pin1 및 Sirt1의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 28은 정상 세포에서 로우손 또는 플럼바진을 농도별로 처리하였을 때 Pin1의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 29는 UVB를 조사한 세포에서 로우손 또는 플럼바진을 농도별로 처리하였을 때 Pin1의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 30은 정상 세포에서 로우손 또는 플럼바진을 농도별로 처리하였을 때 Sirt1의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 31은 UVB를 조사한 세포에서 로우손 또는 플럼바진을 농도별로 처리하였을 때 Sirt1의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 32는 NHDF 세포에 로우손 또는 플럼바진을 다양한 농도로 처리하여 MTT 분석으로 세포 독성을 평가한 것이다.
도 33은 UVB를 조사한 NHDF 세포에 로우손 또는 플럼바진을 다양한 농도로 처리하여 MTT 분석으로 세포 독성을 평가한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 세포 배양
정상 인간 피부 섬유아세포 (normal human dermal fibroblasts, NHDFs) 및 HaCaT 세포는 한국세포주은행 (Seoul National University, Seoul, Korea)에서 구입하였다. HaCaT 세포는 10 % FBS (fetal bovine serum) 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신(PS)을 포함하는 고글루코스 DMEM (Thermo Scientific, Massachusetts, USA)에서 배양하였고, NHDF 세포는 섬유아세포 배지 (ScienCell, California, USA)에서 배양하였다. 세포는 5 % CO2, 37 ℃ 조건으로 배양하였고 5 내지 15 계대에서 실험에 사용하였다.
실시예 2. 자외선 조사 및 화합물 처리
상기 NHDF 및 HaCaT 세포를 6-웰 배양접시에 접종하였다 (1.2 x 105 세포/웰). 세포가 80 % 가득 찼을 때, PBS(phosphate-buffered saline, PAA Laboratories, Austria)로 2 회 세척하고, PBS에 세포를 얕게 담근 상태로 화합물을 처리하거나 처리하지 않는 조건에서 UVB로 조사하였다 (144 mJ/cm2).
실험에 사용된 화합물은 DMSO (Thermo Scientific, Massachusetts, USA)에 제조된 저장 용액 (stock solution)에 신선한 무혈청 배지를 첨가하여 최종 농도 1, 5 또는 10 μM로 제조하였고, 각 실험 조건에 맞추어 상기 화합물을 처리하였다. 그 다음 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 웨스턴블랏 분석을 수행할 때까지 세포를 배양하였다.
실시예 3. 웨스턴블랏 분석
완전히 가득찬 세포를 150 mM NaCl, 1 % NP40, 0.5 % 소듐 데옥시콜레이트 (Sodium Deoxycholate), 0.1 % SDS 및 50 mM Tris-Cl을 포함하는 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. BSA를 표준으로 하여, Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, California, USA)로 상기 용해물 상층액의 단백질 함량을 측정하였다.
그 다음, 전기영동을 위해 8-15 % SDS-PAGE 겔에 30 ㎍의 단백질을 로딩하고 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 그 다음 상기 멤브레인을 5 % 탈지유로 블록킹하였다. 그 다음 Pin1 (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA), Sirt1 (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA), α-Tubulin (Sigma Aldrich, Missouri, USA) 및 기타 단백질에 대한 항체를 이용하여 화학발광 (chemiluminescence) 검출 시스템 (Bio-Rad, California, USA)으로 단백질을 검출하였다.
실시예 4. 유세포 분석
70 % 가득찬 NHDF에 상기 실시예 2에서 기술한 바와 같이 자외선을 조사하였다. 그 다음, 상기 세포를 5 % CO2, 37 ℃에서 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 유세포 분석을 위해, 혈청을 포함하는 DMEM을 DMSO에 30 μM의 최종 농도로 만든 2',7'-디클로로플루오르신 디아세테이트 (2',7'-Dichlorofluorescin diacetate, Sigma Aldrich, Missouri, USA) 용액을 포함하는 무혈청 배지로 교체하였다. 그 다음 37 ℃에서 30 분 인큐베이션 한 후, 상기 세포를 회수하여 PBS로 세척하고 Cell Quest 소프트웨어가 장착된 FACs Calibur (BD, New Jersey, USA)로 분석하였다.
실시예 5. MTT 분석
세포 생존율을 확인하기 위해, 1 x 105 세포를 분석 24 시간 전에 6-웰 배양접시 (또는 40 mm 배양 접시)에 접종하였다. 그 다음 날, 1, 5 및 10 μM의 화합물 용액 2 ㎖을 포함하는 무혈청 배지로 교체하고 37 ℃에서 세포를 배양하였다. 24 시간 경과 후, 상기 화합물을 포함하는 배지를 제거한 뒤 500 ㎍/㎖ MTT 용액 2 ㎖을 첨가하고 37 ℃에서 인큐베이션 하였다. 1 시간 경과 후, 상기 MTT 용액을 제거하고, DMSO를 1 ㎖ 첨가하였다. 그 다음 배양접시를 오비탈 쉐이커에서 30 분 동안 흔들어준 뒤, 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, California, USA)로 570 nm 흡광도에서 측정하였다.
실시예 6. NO 분석
NO 분석을 위해, 세포를 화합물이 있거나 없는 조건에서 LPS와 함께 24 시간 동안 배양하였다. 상층액을 회수하고 (50 ㎕) 동량의 Griess 시약 (1 % 설프아닐아마이드 (sulfanilamide) 및 0.1 % N-1-나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드 (N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride)를 함유하는 5 % 포스포릭 산 (phosphoric acid))과 혼합하였다. 10 분 뒤에 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, California, USA)에서 흡광도를 측정하였다. NO2 농도를 계산하기 위한 표준으로 NaNO2를 사용하였다.
실시예 7. 세포 이동 분석
접종된 세포 층에 상처를 내고 무혈청 배지에 주글린을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건으로 Incucyte Zoom (Essen Bioscience, Michigan, USA)에서 4 시간 간격으로 스캔하면서 24 시간 동안 배양하였다.
실시예 8. GST 풀-다운(Pull-down) 분석
세포를 다양한 농도의 주글론 (Juglone)으로 24 시간 동안 처리하고 단백질 추출을 위해 상기 세포를 회수하였다. 50 내지 70 ㎕의 PBD-GST를 10 ㎕의 글루타티온 (Glutathione) 아가로스 비드를 포함하는 600 ㎕ PBS에 첨가하고 4 ℃ 쉐이커에서 한 시간 동안 인큐베이션 하였다. 상기 표본을 원심분리하고 펠렛을 PBS로 세척한 뒤, NP40 용해 완충액 (Life Technologies, Massachusetts, USA) (아프로티닌 (Aprotinin) 2 ㎍/㎖, 펩스타틴 (pepstatin) 2 ㎍/㎖, 류펩틴 (leupeptin) 1 ㎍/㎖, PMSF 1 mM, Na4VO3 1 mM)으로 추출한 단백질 500 ㎍을 첨가하고, 상기 튜브를 다시 원심분리하였다. 펠렛을 PBS로 5 회 세척하고 30 내지 50 ㎕의 3x SDS 완충액을 첨가한 뒤, 표본을 SDS 겔에서 전기영동하고 Rac1 및 Cdc42 항체를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다.
실시예 9. 동물 실험
마우스는 세 개의 그룹으로 나누었다; 정상, 대조군 및 주글론 0.1 %, 각 그룹당 n = 3이다. 6 mm 생검 펀치 (biopsy punch)를 이용하여 마우스의 등 부위에 상처를 만들었다. 에탄올, 프로판디올 및 증류수의 혼합액에 용해시킨 0.1 % 주글론 용액을 10 일 동안 매일 상기 피부 상처에 도포하였다. 대조군은 용매만 처리하였다. 자를 이용하여 상처의 직경을 밀리미터 단위로 매일 측정하였고 평균을 내어 그래프를 그렸다.
상기 실시예에 따른 결과를 하기 실험예에 정리하였다.
실험예 1. 주글론의 ROS 생산 감소 및 세포 생존율 향상 효과 확인
활성산소종 (ROS)은 DNA 손상, 세포 사멸 또는 노화를 이끌 수 있는 특정 인자에 의해 야기되는 세포 손상을 직접적으로 측정할 수 있는 수단이 된다. 따라서 주글론이 자외선 조사에 의해 야기되는 피부 손상에 대한 보호 효과를 가지는 지를 확인하기 위해, UVB를 조사한 NHDF 세포에 주글론을 처리했을 때 ROS 생산을 평가하였다. 이를 위해 유세포 분석을 수행하였으며, 그 결과 주글론을 처리한 세포에서는 ROS 생산에 의해 나타나는 세포 형태 변화가 UVB만 조사한 세포에 비하여 상대적으로 덜 나타나는 것을 확인하였다 (도 1). 특히, 5 μM 주글론을 처리한 세포는 ROS 수준이 정상 세포와 유사하게 나타났다. 반면, 10 μM 주글론을 처리한 경우에는 5 μM을 처리한 경우보다 ROS 생산을 감소시키지 못했다. 상기 결과는 주글론 5 μM이 ROS를 감소시킴으로써 세포내 독성을 감소시키는 능력을 가진다는 것을 의미한다.
그 다음 MTT 분석을 통해 UVB 조사는 세포 생존율을 감소시키지만, 주글론을 처리한 경우 UVB만 조사한 세포에 비하여 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2).
세포 수 및 세포의 형태는 정상, UVB 조사, 및 다양한 농도의 주글론을 처리한 그룹에서 명확하게 다르게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
실험예 2. NHDF 세포에서 주글론의 세포 사멸 감소 효과 확인
다음으로, 주글론 처리가 자외선에 의해 야기되는 세포 사멸에 보호 효과를 가지는지를 확인하였다. 그 결과 UVB를 조사한 세포에 주글론을 처리한 경우 세포 사멸이 감소하는 것을 확인하였다 (도 4 내지 도 8). 상기 결과는 종래 주글론이 세포 사멸을 야기한다고 보고된 것과는 정 반대의 결과이다. 하지만, 차이점은 종래 보고에서 주글론이 세포 사멸을 야기한 세포가 암 세포라는 것이다. 본 발명에서는, UVB를 조사한 NHDF 세포를 사용하였고 암 세포를 사용한 것은 아니다.
구체적으로, UVB에 노출시킨 뒤 주글론을 처리한 세포를 세포 사멸 DNA ladder 분석 키트를 이용하여 아가로스 겔에서 확인한 결과, 세포 사멸에 따라 나타나는 DNA 분해가 감소한 것을 확인하였다 (도 4).
나아가, UVB 및 주글론을 처리한 뒤 사이토크롬 C (cytochrome C), Bax 및 Bcl2와 같은 세포 사멸 관련 단백질의 발현을 확인하였다 (도 5). 그 결과, 세포 사멸 촉진 (pro-apoptotic) 단백질인 BAX의 발현은 크게 변하지 않았으나 (도 6), 항-세포 사멸 (anti-apoptotic) 단백질인 Bcl-2의 발현은 UVB 조사에 따라 감소하였으며 주글론 처리로 다시 회복되었다 (도 7). 또 다른 중요한 세포 사멸 촉진 단백질인 사이토크롬 C의 발현 또한 UVB 조사 후 주글론을 처리하였을 때 미토콘드리아 및 세포질에서 모두 감소하였다 (도 8).
따라서, 상기 결과들로부터 주글론이 상기 단백질들의 조절을 통해 자외선에 의한 스트레스에 대하여 세포 생존을 향상시키고 세포 사멸을 억제한다는 것을 알 수 있다.
실험예 3. 주글론의 상처 치유 효과 확인
피부 섬유아세포는 상처에 대한 치유 및 회복 과정에서 핵심적인 역할을 한다. 특히, 각질세포와의 상호 작용은 세포 형질전환 (cellular transformation) 및 회복에 필요한 성장인자들을 방출하는데 핵심적 역할을 한다. 따라서, 피부 재생은 섬유아세포의 성장 및 형질전환의 결과로 볼 수 있다.
주글론이 상처 재생 및 상처 회복 과정에서 긍정적인 효과를 가지는지 확인하기 위해, 배양된 NHDF 세포 층에 상처를 만들고 주글론이 있거나 없는 조건에서 24 시간 동안 세포를 배양하였다. 4 시간 간격으로 세포 성장을 확인한 결과, 무혈청 배지만으로 세포를 배양한 경우보다 주글론이 존재하는 조건에서 세포 성장이 더 빠른 속도로 나타나며, 세포 형태도 더 건강한 것을 확인하였다 (도 9). 5 μM 주글론에서 배양한 세포는 1 또는 10 μM을 처리한 것과 비교하여 더 빠르게 성장하며 더 높은 회복률을 보였으므로, 5 μM을 최적 농도로 결정하였다.
또한, 주글론의 세포 독성을 확인하기 위해 세포 생존율 분석을 수행하였다 (도 10). MTT 분석 수행 결과, 처리된 모든 농도에서 세포 독성은 관찰되지 않았다.
다음으로, 상처 치유 관련 마커 단백질인 Rac1, Cdc42, 액틴 및 α-Pak의 발현을 확인하였다. 그 결과 상기 모든 마커 단백질의 발현이 주글론 처리에 따라 증가되는 것을 확인하였다 (도 11).
다음으로 Rac1 및 Cdc42의 GTP-결합 활성형의 발현은 GST 풀-다운 분석 후 웨스턴블랏을 수행하여 확인하였다. 그 결과 상기 단백질들의 활성형도 주글론을 처리했을 때 상향 조절되는 것을 확인하였다 (도 12 및 도 13). 액틴 및 α-Pak의 발현에서도 유사한 증가 양상을 확인하였다 (도 14).
다음으로, 마우스 모델에서 주글론의 상처 치유 효과를 확인하였다. 구체적으로, 무모 마우스를 두 그룹으로 나누고 직경 6 mm의 상처를 만든 뒤 10 일 동안 용매만 처리하거나 0.1 %의 주글론 용액을 처리하였다. 그 결과, 용매만 처리한 마우스는 0.1 % 주글론 용액을 처리한 그룹과 비교하여 상처 회복 및 피부 재생률이 낮은 것을 확인할 수 있었다 (도 15). 특히, 처리 4 일 경과 후부터는 상처 크기의 차이가 매우 명확하게 관찰되었다. 주글론을 처리한 그룹에서는 처리 8 일째에 상처가 거의 아물었으나, 용매만 처리한 마우스에서는 10 일까지도 상처가 완전히 아물지 않았다 (도 16).
상기 생체 외 NHDF 세포 이동 분석 결과와 생체 내 상처 치유 결과를 종합하면, 주글론이 상처 치유를 촉진하는 우수한 효과가 있는 것을 알 수 있다.
실험예 4. 자외선을 조사한 피부 세포에서 주글론의 Pin1 및 Sirt1 발현 회복 효과 확인
자외선은 특히 피부 세포에서 분자 수준에서 매우 많은 변화를 야기할 수 있다. Pin1 및 Sirt1은 세포 주기, 암 생성, 세포 사멸 및 노화와 같이 매우 중요한 과정에 전반적으로 관련된 핵심 단백질이므로, NHDF 세포에 UVB 및 주글론을 처리한 뒤 상기 두 단백질의 발현을 확인하였다 (도 17).
그 결과, UVB를 조사한 경우 Pin1 발현은 증가하고 Sirt1 발현은 감소하였다. 그러나, UVB를 조사한 세포에 주글론을 처리하였을 때 상기 두 단백질의 발현은 정상 수준으로 변하는 경향을 확인할 수 있었다 (도 18 및 도 19). 따라서, 주글론은 UVB를 조사한 NHDF 세포에서 Pin1 발현을 감소시킬 뿐만 아니라 Sirt1의 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.
실험예 5. 주글론의 Sirt1 상향 조절 효과 확인
자외선을 조사하지 않은 세포에서 주글론의 효과를 규명하기 위해, 주글론 또는 레스베라트롤 (resveratrol)을 NHDF 세포 또는 HaCaT 세포에 처리한 후 Pin1 및 Sirt1의 발현을 확인하였다 (도 20 및 도 21). 레스베라트롤은 Sirt1 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있으므로 대조군으로 사용하였다. Pin1의 발현은 두 세포주에서 모두 크게 변하지 않았으나 (도 22 및 도 23), Sirt1의 발현은 주글론을 처리하였을 때 두 세포주에서 모두 증가하였다 (도 24 및 도 25). 한편, 대조군으로 사용된 레스베라트롤은 주글론이 효과적인 농도에서는 Sirt1의 발현을 증가시키지 못하였다. 이는 주글론이 Sirt1의 발현을 증가시키는데 레스베라트롤보다 효과적이라는 것을 의미한다.
상기 결과를 종합하면, 각질세포 및 섬유아세포는 모두 상처 치유 및 재생에 있어서 모두 중요한 세포이고, 주글론은 상기 두 세포주에서 모두 효과적이었으므로, 피부 재생에 있어서 주글론이 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 6. 주글론의 구조적 유사체 (analogue)와의 효과 비교
주글론과 유사한 구조를 가지는 화합물의 효과를 확인하기 위한 목적으로, 두 종류의 주글론의 구조적 유사체인 로우손 (lawsone, 화학식 2) 또는 플럼바진 (plumbagin, 화학식 3)을 정상 (도 26) 또는 UVB를 조사한 NHDF 세포 (도 27)에 처리하고 Pin1 및 Sirt1 발현을 확인하였다. 각 화학식을 하기 표 1에서 비교하여 나타내었다.
주글론 로우손 플럼바진
[화학식 1]

Figure 112015057212861-pat00002
 [화학식 2]

Figure 112015057212861-pat00003
 [화학식 3]

Figure 112015057212861-pat00004
그 결과, 상기 화합물은 두 그룹 모두 모든 농도에서 Pin1 발현에 효과가 거의 없었다 (도 28 및 도 29). 예외적으로 고농도 (50 μM)의 플럼바진은 정상세포에서 Sirt1 발현을 상당히 증가시킬 수 있었으나 (도 30), 주글론과는 달리 UVB를 조사한 세포에서는 Sirt1 발현을 증가시킬 수 없었다 (도 31). 주글론과 구조적으로 유사한 플럼바진은 Sirt1 발현에서 유사한 효과를 보일 수 있으나 주글론에서와 같이 낮은 농도, 즉 5 μM에서는 효과가 없었으며, 또한 UVB에 의해 유도된 Sirt1의 하향 조절을 회복시킬 수 없었다. 상기 결과는 주글론이 Sirt1의 더욱 가능성 있는 활성제라는 것을 의미한다.
또한, 플럼바진은 Sirt1의 발현을 증가시켰음에도 불구하고 활성 농도, 즉 50 μM에서 세포에 매우 독성을 띄었다 (도 32). UVB가 이미 세포에 대해 독성을 나타내고 세포 생존율을 감소시키기 때문에, 플럼바진을 활성 농도로 처리하는 것은 세포 생존율을 더욱 감소시켰다 (도 33).
상기 결과를 종합하면, 주글론은 활성 농도에서 독성을 나타내지 않고 Sirt1의 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 반면에, 구조적 유사체인 화합물들은 고농도에서 유사한 역할을 할 수 있으나 세포에 더욱 독성을 띈다.
결론적으로, 주글론은 자외선을 조사한 세포에서 독성을 띄지 않고 ROS 생산을 감소시켜 세포 생존율을 증가시키고 세포 사멸로부터 세포를 보호하는 효과를 가진다.나아가 생체 외 및 생체 내에서 우수한 상처 치유효과를 가지므로, 주글론 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물은 피부 재생용 조성물로 이용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자외선에 의해 DNA가 손상된 피부 재생용 약학적 조성물.
  2. 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 시험관내(in vitro) 섬유아세포의 손상 회복용 조성물.
  3. 제2항의 조성물을 섬유아세포에 처리하는 단계를 포함하는 시험관내(in vitro)에서 섬유아세포의 손상을 회복시키는 방법으로서, 상기 조성물이 자외선에 의해 증가된 Pin1의 발현을 감소시키고, 감소된 Sirt1 단백질의 발현을 증가시켜 섬유아세포의 손상을 회복시키는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 주글론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 1 내지 10 μM 농도로 포함하는 것인, 조성물.
  6. 주글론 (Juglone) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자외선에 의해 DNA가 손상된 피부 재생용 건강기능식품.
  7. 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자외선에 의해 DNA가 손상된 피부 재생용 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 파우더, 파운데이션 또는 세정제의 제형인 화장료 조성물.
  9. 주글론 (Juglone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자외선에 의해 DNA가 손상된 피부 재생용 의약외품 조성물.
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