JP2008239548A - 細胞賦活化剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ポリアミンを有効成分として含有することを特徴とする細胞賦活化剤、さらにそれらを有効成分とする化粧品・医薬部外品(皮膚外用剤、浴用剤、育毛剤等)、飲食品、医薬品に利用するための方法を提供する。
【選択図】 なし
Description
2.ポリアミンが、第一級アミノ基を2つ以上有する脂肪族炭化水素からなる群より選ばれた少なくとも1種以上の化合物であることを特徴とする前記1の細胞賦活化剤。
3.ポリアミンが、1,3−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、N,N−ビス(アミノプロピル)カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン及びホモカルドヘキサミンよりなる群から選ばれた少なくとも1種以上の化合物であることを特徴とする前記1又は2の細胞賦活化剤。
4.ポリアミンが、プトレシン、スペルミジン及びスペルミンからなる群から選ばれた少なくとも1種以上の化合物であることを特徴とする前記1〜3のいずれかの細胞賦活化剤。
5.前記1〜4のいずれかの賦活化剤を有効成分として含有することを特徴とする化粧品類。
6.前記1〜4のいずれかの賦活化剤を有効成分として含有することを特徴とする医薬部外品類。
7.前記1〜4のいずれかの賦活化剤を有効成分として含有することを特徴とする飲食品類。
8.前記1〜4のいずれかの賦活化剤を有効成分として含有することを特徴とする医薬品類。
9.(i)ポリアミンを動物に接触させる工程を含むことを特徴とする細胞賦活化方法。
動物、植物、微生物、前記抽出物及びエキス、ポリアミンを含有することを特徴とする賦活化剤、ポリアミンを有効成分として含有することを特徴とする化粧品類、ポリアミンを有効成分として含有することを特徴とする医薬部外品類、ポリアミンを有効成分として含有することを特徴とする飲食品類、ポリアミンを有効成分として含有することを特徴とする医薬品類などに含まれるポリアミン含量を以下の方法で調べることができる。ポリアミンは遊離型ポリアミン、化合型ポリアミン、結合型ポリアミンがあり抽出方法は異なるがいずれも解析することができる(Plant Cell Physiol., 43(2), 196-206, 2002, J. Nutr. Biochem., 4, 66-70, 1993, Biosci. Biotech. Biochem., 61(9), 1582-1584, 1997)。具体例として植物種子の遊離型ポリアミンの分析方法について詳細に示す。約0.1〜1.0gのダイズ種子に希釈内部標準液(1,6−hexanediamine、又は1,7−diaminoheptane、内部標準量=7.5又12nmol)と5%過塩素酸水溶液(試料生体重1.0g当たり5〜20mL)を加え、ポリトロンミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出する。磨砕液を、4℃・35,000×gで20分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とする。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに100〜400μLの遊離型ポリアミン溶液(ポリアミン組成物,精製ポリアミン組成物)、200μLの飽和炭酸ナトリウム水溶液、200μLのダンシルクロライド/アセトン溶液(10mg/mL)を加えて軽く混和する。チューブの栓をしっかりと閉めたのちアルミ箔で覆い、60℃のウォーターバスで1時間加温してダンシル化を行う。チューブを放冷した後、プロリン水溶液(100mg/mL)を200μL加えて混和する。アルミ箔で覆ってウォーターバスで30分間再加温する。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、600μLのトルエンを加えて激しく混和する。チューブを静置して2相に分かれた後に、上層のトルエン層を300μLマイクロチューブに分取する。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去する。チューブに200μLのメタノールを加えてダンシル化遊離型ポリアミンを溶解させる。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器(励起波長:365nm・発光波長:510nm)を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析する。HPLCカラムはμBondapak C18(Waters社製:027324、3.9×300mm、粒子径10μm)を使用する。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のHPLCチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出する。
評価は、以下の手順で行った。正常ヒト皮膚線維芽細胞を1ウェル当たり2.0×104個となるように48穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10%のウシ胎児血清を添加したものを用いた。37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にて24時間培養後、任意の濃度のポリアミン群試料を添加した試験培地に交換し、さらに48時間培養した。次いで3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を100μg/mL含有する培地に交換して3時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを2−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて550nmの吸光度を測定した。同時に濁度として650nmにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価結果を、コントロール(水添加)における細胞賦活作用を100とした相対値にて図1に示す。
・ ヒト毛乳頭細胞の培養方法
ヒト頭髪毛乳頭細胞(THPC−001)トータルキット(HDPCトータルキット:THPCK−001、製造元:セルアプリケイションズインク USA、輸入販売元:東洋紡績株式会社)を用いて、常法によりヒト毛乳頭細胞を培養した。解凍した細胞を懸濁するためのPCGM培地を10mL、15mL遠心チューブに分注し、氷令しておく。即ち、凍結したヒト頭髪毛乳頭細胞(THPC−001)の入ったバイアル瓶を37℃の恒温槽で急速に融解する。このバイアル瓶にPCGM培地を1mL程度徐々に滴下しDMSOを希釈後、全量をPCGM培地が入った遠心チューブに移し懸濁させる。浮遊細胞を冷却低遠心機で4℃、1000rpm、5分間遠心する。沈殿した細胞を吸わないように注意しながら上清を吸引し、1mLPCGM培地に再懸濁させる。この全量を、コラーゲン液でコートしたT−75フラスコに植え込み、加湿下で、二酸化炭素濃度5vol%、37℃に保たれたインキュベーターに入れ静置培養を行う。1日後、培地の交換を行う。以後、1日おきに培地の交換を行い継代培養する。尚、PCGM培地成分は、1%FBSを含有するPCGM基礎培地250mLに牛下垂体抽出液(BPE)100倍希釈液を2.5mL、牛胎児血清(FCS)100倍希釈液を2.5mL、インシュリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン溶液(ITT)200倍希釈液を1.25mL、サイロプロテイン溶液(Cyp)200倍希釈液を1.25mL添加したものを用いた。
評価は、以下の手順で行った。ヒト毛乳頭細胞を1ウェル当たり2.0×104個となるように48穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に1重量%のウシ胎児血清を添加したものを用いた。24時間培養後、任意の濃度のポリアミン群試料を添加した試験培地に交換し、さらに48時間培養した。次いで3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を100μg/mL含有する培地に交換して3時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを2−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて550nmの吸光度を測定した。同時に濁度として650nmにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価結果を、試料無添加のブランクにおける細胞賦活作用を100とした相対値にて図2に示す。
評価は、以下の手順で行った。正常ヒト皮膚線維芽細胞を1ウェル当たり1.0×105個となるように48穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に1%のウシ胎児血清を添加したものを用いた。37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にて24時間培養後、PBS(−)で2回洗浄した後、任意の濃度のポリアミン群試料を添加した無血清培地に交換し、さらに2日間同条件にて培養した。培養上清から、ヒト線維芽細胞が産生するI型プロコラーゲンC末端ペプチド(Procollagen typeI carboxyterminal propeptide:PIP)を、Procollagen type I C-peptide (PIP) EIA Kit (TaKaRa)で測定した。コラーゲン産生促進率は、標準品を上記ELISAキットにて測定し、その結果から検量線を作成、その検量線から試料添加時のコラーゲン産生量及び試料無添加時のコラーゲン産生量を求め、試料無添加時のコラーゲン産生量を100%として算出し、評価を行った。
ポリアミンはプトレシン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で用いた。評価は、以下の手順で行った。正常ヒト皮膚線維芽細胞を1ウェル当たり1.0×105個となるように48穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に1%のウシ胎児血清を添加したものを用いた。37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にて24時間培養後、PBS(−)で2回洗浄した後、任意のポリアミン濃度の試料を添加した無血清培地に交換し、さらに1日間、3日間、6日間同条件にて培養した。培養上清中のヒアルロン酸を測定した。尚プレート上の細胞を0.5% Triton-X100を含む細胞溶解液で溶解し回収後にタンパク質量を測定し(Bio Rad,プロテインアッセイキット)、細胞数の指標とした。ヒアルロン酸の測定は、正常ヒト皮膚線維芽細胞が産生するヒアルロン酸を、ヒアルロン酸プレート「中外」(富士レビオ社)を用いてHyaluronic acid binding protein(HABP)を用いたサンドイッチ法により測定した。ポリアミンを添加していない試料(コントロール)のヒアルロン酸量を100とした場合の、各ポリアミンのヒアルロン酸量を産生率とした。
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まない美容液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
スペルミジン 0.01
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まない乳液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
スペルミジン 0.01
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まないクリームも常法により製造した。
(組成) (重量%)
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
スペルミジン 0.01
精製水 全体で100となる量
実施例5〜7を用いて官能評価を行った。なお、ポリアミンを含まない比較例も同時に評価した。官能評価は、しわ、たるみ、くすみ等の症状の気になる40〜60歳のパネル20人を1群として実施例及び比較例をそれぞれ1日2回,3カ月間連続使用してもらい、3カ月後の肌状態についてアンケート調査をして行った。
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まない美容液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
プトレシン 0.05
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まない乳液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
プトレシン 0.05
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まないクリームも常法により製造した。
(組成) (重量%)
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
プトレシン 0.05
精製水 全体で100となる量
実施例9〜11を用いて官能評価を行った。なお、ポリアミンを含まない比較例も同時に評価した。官能評価は、しわ、たるみ、くすみ等の症状の気になる40〜60歳のパネル20人を1群として実施例及び比較例をそれぞれ1日2回,3カ月間連続使用してもらい、3カ月後の肌状態についてアンケート調査をして行った。
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まない美容液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
スペルミン 0.01
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まない乳液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
スペルミン 0.01
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まないクリームも常法により製造した。
(組成) (重量%)
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
スペルミン 0.01
精製水 全体で100となる量
実施例13〜15を用いて官能評価を行った。なお、ポリアミンを含まない比較例も同時に評価した。官能評価は、しわ、たるみ、くすみ等の症状の気になる40〜60歳のパネル20人を1群として実施例及び比較例をそれぞれ1日2回,3カ月間連続使用してもらい、3カ月後の肌状態についてアンケート調査をして行った。
評価は、以下の手順で行った。正常ヒト皮膚線維芽細胞を1ウェル当たり2.0×104個となるように48穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10%のウシ胎児血清を添加したものを用いた。37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にて24時間培養後、10μg/mlマイトマイシンC(抗生物質・ナカライテスク社製)を含むDMEMで2時間培養した。マイトマイシンCはDNAの複製を阻害する作用があることから、当該処置にて細胞増殖は抑制される。その後、PBSにて洗浄した後に、任意の濃度のポリアミン群試料を添加した試験培地に交換し、さらに48時間培養した。次いでWST−8〔2−(2−methoxy−4−nitrophenyl)−3−(4−nitrophenyl)−5−(2,4−disulfophenyl)−2H−tetrazolium,monosodium salt・ナカライテスク社製〕を100μg/mL含有する培地に交換して3時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを2−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。同時に濁度として600nmにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価結果を、コントロール(水添加)における細胞賦活作用を100とした相対値にて図7に示す。
評価は、以下の手順で行った。正常ヒト皮膚線維芽細胞を1ウェル当たり1.0×105個となるように48穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に1%のウシ胎児血清を添加したものを用いた。37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にて24時間培養後、PBS(−)で2回洗浄した後、任意の濃度のポリアミン群試料を添加した無血清培地に交換し、さらに3日間、6日間同条件にて培養した。培養上清から、ヒト線維芽細胞が産生するI型プロコラーゲンC末端ペプチド(Procollagen typeI carboxyterminal propeptide:PIP)を、Procollagen type I C-peptide (PIP) EIA Kit (TaKaRa)で測定した。尚プレート上の細胞を0.5% Triton-X100を含む細胞溶解液で溶解し回収後にタンパク質量を測定し(Bio Rad,プロテインアッセイキット)、細胞数の指標とした。コラーゲン産生促進率は、標準品を上記ELISAキットにて測定し、その結果から検量線を作成、その検量線からタンパク質(細胞数)当たりの試料添加時のコラーゲン産生量及び試料無添加時のコラーゲン産生量を求め、試料無添加時のコラーゲン産生量を100%として算出し、評価を行った。
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まない美容液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
スペルミジン 0.01
プトレシン 0.01
スペルミン 0.005
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まない乳液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
スペルミジン 0.01
プトレシン 0.01
スペルミン 0.005
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、ポリアミンを含まないクリームも常法により製造した。
(組成) (重量%)
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
スペルミジン 0.01
プトレシン 0.01
スペルミン 0.005
精製水 全体で100となる量
実施例19〜21を用いて官能評価を行った。なお、ポリアミンを含まない比較例も同時に評価した。官能評価は、しわ、たるみ、くすみ等の症状の気になる40〜60歳のパネル20人を1群として実施例及び比較例をそれぞれ1日2回,3カ月間連続使用してもらい、3カ月後の肌状態についてアンケート調査をして行った。
Claims (9)
- ポリアミンを有効成分として含有することを特徴とする細胞賦活化剤。
- ポリアミンが、第一級アミノ基を2つ以上有する脂肪族炭化水素からなる群より選ばれた少なくとも1種以上の化合物であることを特徴とする請求項1に記載の細胞賦活化剤。
- ポリアミンが、1,3−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、N,N−ビス(アミノプロピル)カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン及びホモカルドヘキサミンよりなる群から選ばれた少なくとも1種以上の化合物であることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞賦活化剤。
- ポリアミンが、プトレシン、スペルミジン及びスペルミンからなる群から選ばれた少なくとも1種以上の化合物であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の細胞賦活化剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の細胞賦活化剤を有効成分として含有することを特徴とする化粧品類。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の細胞賦活化剤を有効成分として含有することを特徴とする医薬部外品類。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の細胞賦活化剤を有効成分として含有することを特徴とする飲食品類。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の細胞賦活化剤を有効成分として含有することを特徴とする医薬品類。
- (i)ポリアミンを動物に接触させる工程を含むことを特徴とする細胞賦活化方法。
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Publication Number | Publication Date |
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