KR20180006963A

KR20180006963A - 육모ㆍ발모 촉진제

Info

Publication number: KR20180006963A
Application number: KR1020177035903A
Authority: KR
Inventors: 이사오 오쿠니시; 토모에 카토
Original assignee: 킨지루시 가부시키 가이샤
Priority date: 2015-12-02
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2018-01-19
Also published as: CN113509478B; EP3300731A4; BR112017027147A2; JP7054242B2; KR20190133803A; KR102466224B1; CN113509478A; CN108135879B; EP3300731A1; JPWO2017094905A1; TWI740861B; JP2020055848A; TW201825082A; US20200108005A1; US11033473B2; CN108135879A; HK1255026A1; US20180250213A1; WO2017094905A1

Abstract

본 개시는 화학식(I)의 1종 또는 복수 종의 플라보노이드류를 유효성분으로 함유하는 육모ㆍ발모 촉진제를 제공하는 것이다. 또, 본 개시는 화학식(II)의 1종 또는 복수 종의 페닐프로파노이드류를 유효성분으로 함유하는 육모ㆍ발모 촉진제를 제공하는 것이다.

Description

육모ㆍ발모 촉진제{HAIR RESTORATION/GROWTH STIMULATING AGENT}

본 국제출원은 2015년 12월 02일에 일본국 특허청에 출원된 일본국 특허출원 제2015-235965호 에 의거하는 우선권을 주장하는 것으로, 일본국 특허출원 제2015-235965호의 전체 내용을 본 국제출원에 참조에 의해 원용한다.

본 개시는 육모ㆍ발모 촉진제에 관한 것이다.

모발의 성장은 성장기, 퇴행기 및 휴지기로 이루어지는 주기적인 헤어 사이클(모발의 주기)에 따라서, 성장 및 탈락을 반복하고 있다. 헤어 사이클에서는 다양한 세포가 작용하고 있지만, 당해 헤어 사이클을 제어하는데 있어서, 가장 중요한 역할을　하고 있는 것이 모유두세포이다. 모유두세포는 모근의 근간(뿌리와 줄기) 부분에 위치하는 세포이다. 모유두세포는 모유두세포의 주위에 존재하는 모모세포를 적극적으로 작용시켜서 모모세포의 증식을 촉진하는 등, 모발의 분화에 중요한 역할을 담당하고 있다.

또, 탈모는 가령, 생활환경 요인에 의한 스트레스, 호르몬 밸런스의 붕괴, 약제의 부작용 등이 원인이 되어 발생한다. 이러한 여러가지 원인에 의해 모유두세포의 대사가 저하되면, 모모세포의 활성화 및 분화가 억제된다. 그리고 헤어 사이클의 기간이 단축되는 것에　의해, 탈모가 발생한다.

최근, 스트레스의 증가나 식생활의 변화 등 여러가지 요인에 의해, 숱이 적은 머리나 빠지는 털로 고민하는 남녀는 증가 경향에 있고, 육모ㆍ발모 촉진제에 대한 기대가 높아지고 있다. 그러한 사회적 요구에 따라 다양한 육모ㆍ발모 촉진제가 개발되고 있다. 육모ㆍ발모 촉진제의 유효성분으로서는 예를 들면, 미녹시딜(화학명: 6-(1-피페리디닐)-2,4-피리미딘디아민-3-옥사이드)나 아데노신 관련 화합물 등이 알려져 있다.

미녹시딜은 모세혈관을 확장하는 것에　의해, 혈행을 촉진시키고, 모유두세포를 자극하는 것에 의해 육모를 촉진시키는 것이 알려져 있다. 또, 아데노신 및 그 유도체는 모유두세포의 아데노신 수용체에 작용하고, 섬유아세포 증식인자의 생산을 촉진하고, 모모세포를 활성화시키는 효과가 있는 것이 보고되고 있다(특허문헌 1 참조).

일본 공개특허공보 2000-297015호

그렇지만, 상술한 바와 같이 공지의 육모ㆍ발모 촉진제에서는 아직 수요자의 요구를 충분하게 충족시키기에는 이르지 않고 있다. 이러한 사정으로부터, 시장에서는 육모ㆍ발모 촉진 효과가 더욱 높은 육모ㆍ발모 촉진제가 소망되고 있었다.

상술한 바와 같이 과제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은 예의 연구한 결과, 종래, 육모 작용과의 관계가 전혀 알려져 있지 않았던 플라보노이드류 및 페닐프로파노이드류에 육모작용이 있음을 알아냈다.

즉, 본 개시의 일국면은 하기에 기재된 화학식(I)의 1종 또는 복수 종의 플라보노이드류를 유효성분으로 함유하는 육모ㆍ발모 촉진제를 제공하는 것이다.

(단, 상기 식에서, R¹은 글리코실, 글리코실-글리코실-O-시나포일 또는 H이고, R²는 O-시나포일 또는 OH이고, R³은 H 또는 OH이고, R⁴는 O-글리코실, OH 또는 O-글리코실-시나포일이다.)

또, 본 개시의 일국면은, 하기에 기재된 화학식(II)의 1종 또는 복수 종의 페닐프로파노이드류를 유효성분으로 함유하는 육모ㆍ발모 촉진제를 제공하는 것이다.

(단, 상기 식에서, R⁵는 H 또는 OH이고, R⁶은 OH 또는 OCH₃이다.)

본 발명자들의 연구결과에 의하면, 상기 화학식(I)의 1종 또는 복수 종의 플라보노이드류 및 상기 화학식(II)의 1종 또는 복수 종의 페닐프로파노이드류에는 모유두세포를 활성화하는 작용이 있다. 이러한 작용이 있는 것은, 후술하는 실시형태로부터 분명하다. 따라서 상기 플라보노이드류 및 상기 페닐프로파노이드류를 유효성분으로 함유하는 육모ㆍ발모 촉진제를 이용하면, 매우 뛰어난 육모ㆍ발모효과를 기대할 수 있다.

도 1은 인간 두발 모유두세포를 사용한 이소사포나린의 세포 독성시험을 실시한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 인간 두발 모유두세포를 사용한 이소사포나린 처리 1일후의 세포 부활작용을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 인간 두발 모유두세포를 사용한 이소사포나린 처리 3일후의 세포 부활작용을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 인간 두발 모유두세포를 사용한 이소사포나린 처리 3일후의 VEGF 생산 촉진작용을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 인간 두발 모유두세포를 사용한 아피게닌의 세포 독성시험을 실시한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 인간 두발 모유두세포를 사용한 쿠마르산의 세포 독성시험을 실시한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 인간 두발 모유두세포를 사용한 카페산 메틸에스테르의 세포 독성시험을 실시한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 인간 두발 모유두세포를 사용한 이소사포나린 이외의 피험물질에 의한 세포 부활작용을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 인간 두발 모유두세포를 사용한 이소사포나린 이외의 피험물질에 의한 VEGF 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 10은 인간 두발 모유두세포를 사용한 이소사포나린 이외의 피험물질에 의한 FGF-7 유전자 발현량을 나타내는 그래프이다.

본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제는, 상기 화학식(I)의 1종 또는 복수 종의 플라보노이드류를 유효성분으로 함유하는 것이다. 또, 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제는 상기 화학식(II)의 1종 또는 복수 종의 페닐프로파노이드류를 유효성분으로 함유하는 것이다. 여기에서 「함유하는」이란 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제가 1종 또는 복수 종의 플라보노이드류로 이루어지는 것일 수도 있고, 또 육모ㆍ발모 촉진제에 1종 또는 복수 종의 플라보노이드류 이외의 다른 성분이 함유될 수도 있은 것을 의미한다. 또, 본 개시의 「육모ㆍ발모 촉진제」란 후술하는 메커니즘에 의해 육모효과, 발모효과, 육모효과 겸 발모효과를 발휘하는 물질이다. 육모효과란 털을 발육시키고, 탈모를 예방하는 것, 및 탈모를 저감시키는 효과를 의미한다. 발모효과란 털을 발생시키는 효과를 의미한다. 따라서, 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제는 육모제(헤어토닉), 발모제, 및 육모제(헤어토닉) 겸 발모제, 어느 것으로도 사용될 수 있다.

상기 화학식(I)의 플라보노이드류로서는 예를 들면, 상기 화학식(I) 중, R1이 글리코실, R²가 OH, R³이 H, 및 R⁴가 O-글리코실로 나타나는 이소사포나린 [별명: 이소비텍신 4'-O-β-D-글루코피라노사이드(isovitexin 4'-O-β-D-glucopyranoside)], 상기 화학식(I) 중, R¹이 글리코실, R²가 O-시나포일, R³이 H, 및 R⁴가 O-글리코실로 나타나는 7-O-트랜스-시나포일이소비텍신 4'-O-β-D-글루코피라노사이드(7-O-trans-sinapoylisovitexin 4'-O-β-D-glucopyranoside), 상기 화학식(I) 중, R¹이 글리코실, R²가 O-시나포일, R³이 H, 및 R⁴가 OH로 나타나는 7-O-트랜스-시나포일이소비텍신(7-O-trans-sinapoylisovitexin), 상기 화학식(I) 중, R¹이 글리코실, R²가 O-시나포일, R³이 H, 및 R⁴가 O-글리코실-시나포일로 나타나는 7-O-트랜스-시나포일이소비텍신 4'-O-(6-O-트랜스-시나포일-β-D-글루코피라노사이드) (7-O-trans-sinapoylisovitexin 4'-O-(6-O-trans-sinapoyl-β-D-glucopyranoside)), 상기 화학식(I) 중, R¹이 글리코실-글리코실-O-시나포일, R²가 O-시나포일, R³이 H, 및 R⁴가 OH로 나타나는 6''-O-(2-O-트랜스-시나포일-β-D-글루코피래노실)-7-O-트랜스-시나포일이소비텍신(6''-O-(2-O-trans-sinapoyl-β-D-glucopyranosyl)-7-O-trans- sinapoylisovitexin), 상기 화학식(I) 중, R¹이 글리코실-글리코실-O-시나포일, R²가 O-시나포일, R³이 H, 및 R⁴가 O-글리코실로 나타나는 6''-O-(2-O-트랜스-시나포일-β-D-글루코피래노실)-7-O-트랜스-시나포일이소비텍신 4'-O-β-D- 글루코피라노사이드(6''-O-(2-O-trans-sinapoyl-β-D-glucopyranosyl)-7-O-trans-sinapoylisovitexin 4'-O-β-D-glucopyranoside), 상기 화학식(I) 중, R¹이 글리코실, R²가 OH, R³이 H, 및 R⁴가 OH로 나타나는 이소비텍신(isovitexin), 상기 화학식(I) 중, R¹이 글리코실, R²가 OH, R³이 OH, 및 R⁴가 OH로 나타나는 이소오리엔틴(isoorientin), 상기 화학식(I) 중, R¹이 글리코실, R²가 OH, R³이 OH, 및 R⁴가 O-글리코실로 나타내는 이소오리엔틴 4'-O-β-D-글루코피라노사이드(isoorientin 4'-O-β-D-glucopyranoside), 상기 화학식(I) 중, R¹이 H, R²가 OH, R³이 H, 및 R⁴가 OH로 나타나는 아피게닌[별명: 2-(4-하이드록시페닐)-5-하이드록시-7-하이드록시-4H-1-벤조피란-4-온(2-(4-hydroxyphenyl)-5-hydroxy-7-hydroxy-4H-1-benzopyran-4-one)], 상기 화학식(I) 중, R¹이 H, R²가 OH, R³이 OH, 및 R⁴가 OH로 나타난는 루테올린[별명: 2-(3-하이드록시-4-하이드록시페닐)-5-하이드록시-7-하이드록시-4H-1-벤조피란-4-온(2-(3-hydroxy-4-hydroxyphenyl)-5-hydroxy-7-hydroxy-4H-1-benzopyran- 4-one)] 등을 들 수 있다. 추가로, 상기 화학식(I)의 플라보노이드류는, 이소사포나린이 바람직하다. 또, 이소사포나린의 IUPAC에 의거한 명칭은, 4'-(β-D-글루코피래노실옥시)-5, 7-디하이드록시-6-β-D-글루코피라노실플라본이다. 이것들의 플라보노이드류는 단독으로 사용할 수 있지만, 복수 종을 혼합해서 사용할 수도 있다.

상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류로서는 예를 들면, 상기 화학식(II) 중, R⁵가 H, R⁶이 OH로 나타나는 쿠마르산, R⁵가 OH, R⁶이 OCH₃로 나타나는 카페산 메틸에스테르 등을 들 수 있다. 이것들의 페닐프로파노이드류는 단독으로 사용할 수 있지만, 복수 종을 혼합해서 사용할 수도 있다. 또, 플라보노이드류 및 페닐프로파노이드류를 혼합해서 사용해도 된다.

상기 화학식(I)의 플라보노이드류 및 상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류는 화학적인 합성법에 의한 것일 수도 있지만, 식물로부터 추출ㆍ정제한 것일 수도 있다. 상기 식물로서는 예를 들면, 유채과 식물, 패랭이꽃과 식물(왕불류행 학명Vaccaria segetalis), 미나리과 식물, 벼과 식물, 풍접초과 식물, 파파야과 식물, 목서초과 식물, 한련과식물 등을 들 수 있다. 따라서, 상기 화학식(I)의 플라보노이드류 및 상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류는 당해 식물 가운데 적어도 하나로부터 추출된 성분일 수도 있다. 예를 들면, 상기 화학식(I)의 플라보노이드류 및 상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류는 유채과 식물인 와사비(Wasabia japonica) [별명: 혼와사비] 및 서양 와사비(Armoracia rusticana) [별명: 산 와사비] 가운데 적어도 한쪽에서 추출된 성분일 수도 있다.

상기 식물로부터의 추출ㆍ정제 방법으로서는 예를 들면, 와사비나 서양 와사비로부터 상기 화학식(I)의 플라보노이드류 및 상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류를 추출하는 방법 등을 들 수 있다. 특히, 혼와사비로부터 이소사포나린을 추출하는 방법은 국제공개 제2011/058661호에 의해 공개되어 있다. 이소사포나린은 이소사포나린 이외의 상기 화학식(I)의 플라보노이드류보다도 혼와사비로부터 추출된 추출물에 많이 포함되어 있다. 따라서 이소사포나린은 혼와사비로부터 추출된 성분일 수도 있다.

상기 화학식(I)의 플라보노이드류는 하기의 실시예 1에 나타내는 바와 같이 모유두세포를 부활시키는 것이 인정되고 있다.

또, 상기 화학식(I)의 플라보노이드류는 하기의 실시예 2에 나타내는 바와 같이 모유두세포에 있어서의 혈관 내피세포 증식인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)의 양을 증가시키는 것이 인정되고 있다.

상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류는 하기의 실시예 7에 나타내는 바와 같이 모유두세포의 부활, VEGF 생산량의 증가, 및 FGF-7 유전자 발현량의 증가가 인정되고 있다.

여기에서, VEGF는 혈관 내피세포에 작용하고, 세포의 증식, 유주를 촉진시키거나, 혈관신생을 촉진시키거나, 또 혈관 투과성을 항진시키거나 하는 것이 알려져 있다. VEGF는 모든 세포에서 생산되지만, 모유두세포로부터도 생산되고 있다. 모유두세포로부터 생산된 VEGF는 혈관신생을 촉진하고, 그것에 의해 모유두세포의 주위에 존재하는 모모세포가 활성화함으로써 발모가 촉진되는 것으로 면 생각되고 있다. 따라서 VEGF 생산 촉진작용을 가지면, 모모세포 활성화 작용, 발모 촉진작용 등에 기여하는 것으로 생각된다.

FGF-7은 모유두세포로부터 분비되는 섬유아세포 증식인자이다. FGF-7은 모모세포에 작용해서 그 증식을 촉진시키는 것에 의해 모발의 성장을 촉진하고, 헤어 사이클에서의 성장기에 유효하다고 생각되고 있다.

상기 화학식(I)의 플라보노이드류는, 상기한 바와 같이, 모유두세포에 대해서 세포 부활작용 및 VEGF 생산 촉진작용을 가지고 있기 때문에 매우 양호한 육모ㆍ발모작용이 있다고 생각된다. 따라서, 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제는 상기 화학식(I)의 플라보노이드류를 함유하기 때문에, 뛰어난 육모효과, 발모효과, 및 육모효과 겸 발모효과를 발휘한다. 또, 상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류는 상기한 바와 같이, 모유두세포 부활작용, VEGF 생산 촉진작용, 및 FGF-7 유전자 촉진작용을 가지고 있기 때문에 매우 양호한 육모ㆍ발모작용이 있다고 생각된다. 따라서, 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제는 상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류를 함유하기 때문에, 뛰어난 육모효과, 발모효과, 및 육모효과 겸 발모효과를 발휘한다. 또, 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제는 모유두세포 부활 촉진제, 및 모유두세포의 VEGF 생산 촉진제로서도 사용할 수 있다.

상기 화학식(I)의 플라보노이드류는 화장품, 의약외품 및 의약품, 또는, 식품에 배합하는 것이 가능하다. 또, 상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류는 화장품, 의약외품 및 의약품, 또는, 식품에 배합하는 것이 가능하다. 그 때문에 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제는 화장품, 의약외품 및 의약품, 또는 식품으로서 사용 가능하다.

본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제를 화장품, 의약외품, 의약품의 형태로 실시하는 경우, 피부 외용제로서 사용할 수 있다. 단, 육모ㆍ발모 촉진제는 경구 섭취도 가능하기 때문에, 피부 외용제로 한정되는 것은 아니다.

본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제를 화장품의 형태로 실시하는 경우, 화장품중 의 플라보노이드류의 함유량은 0.001μmol/L∼5,000μmol/L이 바람직하고, 0.1μmol/L∼1,000μmol/L이 더욱 바람직하다. 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제를 의약외품의 형태로 실시하는 경우, 의약외품 중의 플라보노이드류의 함유량은 0.001μmol/L∼5,000μmol/L이 바람직하고, 0.1μmol/L∼1,000μmol/L이 더욱 바람직하다. 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제를 의약품의 형태로 실시하는 경우, 의약품 중의 플라보노이드류의 함유량은 0.1mg∼5.0g가 바람직하고, 0.2mg∼1.0g가 더욱 바람직하다. 또, 당해 의약품의 성인 1명당 1일 투여량은 1mg∼10g가 바람직하고, 20mg∼1.0g가 더욱 바람직하다.

본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제를 식품의 형태로 실시하는 경우, 기능성 식품, 예를 들면, 특정 보건용 식품이나 기능성 표시 식품 등으로 사용할 수 있다. 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제를 식품의 형태로 실시하는 경우, 식품 중의 플라보노이드류의 함유량은 0.1mg∼5.0g가 바람직하고, 0.2mg∼1.0g가 더욱 바람직하다.

본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제는 유효성분인 상기 화학식(I)의 플라보노이드류에 부가해서, 본 개시의 효과를 손상하지 않는 범위에서 일반적으로, 화장품, 의약외품 및 의약품, 또는, 식품에 사용할 수 있는 각종 임의 성분을 필요에 따라서 적당하게 배합할 수도 있다. 또, 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제는 유효성분인 상기 화학식(II)의 페닐프로파노이드류에 부가해서, 본 개시의 효과를 손상하지 않는 범위에서 일반적으로, 화장품, 의약외품 및 의약품, 또는, 식품에 사용할 수 있는 각종 임의성분을 필요에 따라서 적당하게 배합할 수도 있다. 예를 들면, 하기에 예시하는 성분이나 첨가제를 임의로 선택ㆍ병용할 수도 있다. 또, 육모ㆍ발모효과를 증강시킬 목적으로 항산화제 등의 임의의 약효성분, 생리활성 물질, 및 일반적으로 육모ㆍ발모효과에 유효하다고 알려져 있는 성분 등을 필요에 따라서 배합함으로써, 본 개시의 구성성분과의 시너지 효과가 발휘되고, 통상 기대되는 이상의 뛰어난 사용 효과를 가져오는 경우가 있다.

예를 들면, 유지류로서는 대두유, 달맞이꽃 오일, 미배아 오일, 미강유, 밀배아 오일, 아보카도 오일, 포도씨 오일, 동백 오일, 호호바유, 들깨 오일, 올리브유, 참깨 오일, 카카오 오일, 카밀레 오일, 당근 오일, 오이 오일, 우지지방산, 코코넛유, 홍화유, 옥수수 오일, 유채 오일, 피마자유, 면실유, 낙화생유, 밍크 오일, 난황오일, 팜오일, 팜핵 오일, 야자유, 우지, 라드, 시어버터, 스쿠알렌, 스쿠알란, 프리스탄 또는 이것들 유지류의 수소 첨가물(경화유 등) 등을 들 수 있다.

예를 들면, 왁스류로서는 밀랍, 미표백 밀랍, 카나바 왁스, 경랍, 라놀린류, 칸델릴라 왁스, 몬탄 왁스, 셸락 로우, 라이스 왁스 등을 들 수 있다.

예를 들면, 광물유로서는 유동 파라핀, 바셀린, 파라핀, 오조케라이트, 세레신, 마이크로크리스탈린 왁스 등을 들 수 있다.

예를 들면, 지방산으로서는 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 베헨산, 올레산, 리놀렌산, 리놀렌산, 도코사헥사엔산, 에이코펜타에노산, 라놀린 지방산 등의 천연지방산, 이소펜탄산 등의 지방산 등을 들 수 있다.

예를 들면, 알코올류로서, 에탄올, 이소프로판올, 에틸렌글리콜, 라우릴알코올, 세탄올, 스테아릴알코올, 올레일알코올, 라놀린알코올, 콜레스테롤, 페녹시에탄올, 2-헥실데칸올, 이소스테아릴알코올, 2-옥틸도데칸올 등, 다가 알코올류로서 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 폴리에틸렌글리콜, 산화 프로필렌, 프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 펜틸글리콜, 글리세린, 펜타에리트리톨, 트레이톨, 아라비톨, 크실리톨, 갈락티놀, 솔비톨, 만니톨, 락티톨, 말티톨 등을 들 수 있다.

예를 들면, 에스테르류로서는 미리스트산 이소프로필, 팔미트산 이소프로필, 스테아린산부틸, 라우르산 헥실, 미리스트산 미리스틸, 올레산 올레일, 오레산 데실, 미리스트산 옥틸도데실, 디메틸 옥탄산 헥실데실, 락트산 세틸, 락트산 미리스틸, 프탈산 디에틸, 프탈산 디부틸, 아세트산 라놀린, 모노스테아린산 에틸렌글리콜, 모노스테아린산 프로필렌글리콜, 모노스테아린산 글리세린, 디올레산 프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.

예를 들면, 금속비누류로서는, 스테아린산 알루미늄, 스테아린산 마그네슘, 스테어린산 아연, 스테아린산 칼슘, 팔미트산 아연, 미리스트산 마그네슘, 라우르산 아연 등을 들 수 있다.

예를 들면, 껌질, 당류 또는 수용성 고분자 화합물로서는 아라비아검, 크산탄검, 구아검, 카라야검, 한천, 카세인, 락토오스, 과당, 자당 또는 그 에스테르, 트레할로오스 또는 그 유도체, 덱스트린, 젤라틴, 펙틴, 전분, 카라기난, 키틴 또는 키토산류, 알긴산이나 히알루론산 및 콘도로이친 설페이트 또는 그 염, 헤파린, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 카복시에틸셀룰로오스, 결정 셀룰로오스, β-글루칸, 폴리비닐알코올, 폴리비닐메틸에테르, 폴리아크릴산염, 폴리알킬렌옥시드 또는 그 가교 중합물, 카복시 비닐폴리머 등을 들 수 있다.

예를 들면, 계면활성제로서는 알킬카복시산염, 알킬설폰산염, 알킬황산 에스테르염, 알킬인산 에스테르염 등의 아니온 계면활성제, 알킬아민염, 알킬 4급 암모니아염 등의 카티온 계면활성제, 카복시산형 양성계면활성제, 황산 에스테르형 양성계면활성제, 설폰산형 양성 계면활성제, 인산 에스테르형 양성 계면활성제, 비이온 계면활성제 등의 양성 계면활성제, 천연 계면활성제, 단백질 가수분해 생성물의 유도체, 고분자 계면활성제, 타이타늄ㆍ규소를 포함하는 계면활성제, 불화 탄소계 계면활성제 등의 기타 계면활성제 등을 들 수 있다.

예를 들면, 비타민류로서는 레티놀, 레티날, 데하이드로레티날, 카로틴, 리코펜 등의 비타민 A군, 티아민염산염, 티아민 황산염, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발라민, 엽산류 등의 비타민 B군, 비티민 C, 비오틴, 판토텐산, 인산 아스코르빌마그네슘염, 인산 아스코르빌나트륨염, 테트라헥실데칸산 아스코르빌 등의 비티민 C 유도체, 비타민 D군, 비타민 E군 및 그 유도체, 비타민 K군, 기타, 필수 지방산, 카르니틴, 페룰산, γ-오리자놀, 비타민 P류, 비타민 U류 등을 들 수 있다.

예를 들면, 아미노산으로서는 발린, 로이신, 이소로이신, 트레오닌, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 리신, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 시스테인, 시스틴, 타이로신, 프롤린, 하이드록시프롤린, 아스파라긴산, 글루탐산, 아르기닌, 오르니틴, 히스티딘 등이나, 그것들의 황산염, 인산염, 질산염, 시트르산, 혹은 피롤리돈카복시산 등의 아미노산 유도체 등을 들 수 있다.

예를 들면, 자외선 홉수/차단제로서는 β-이소프로필플라논 유도체, 유로카닌산, 유로카닌산 에틸, 파라디메틸 벤조산 옥틸, 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논, 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논-5-설폰산 등의 벤조페논 유도체, 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산 에틸 등의 파라아미노벤조산 유도체, 파라메톡시 계피산 에틸, 파라메톡시 신남산 이소프로필 등의 메톡시 신남산 유도체, 살리실산 유도체, 안트라닐산 유도체, 유로카닌산 유도체, 쿠마린 유도체, 아미노산계 화합물, 벤조트리아졸 유도체, 테트라졸 유도체, 이미다졸린 유도체, 피리미딘 유도체, 디옥산 유도체, 캄퍼 유도체, 퓨란 유도체, 피론 유도체, 핵산 유도체, 알란토인 유도체, 니코틴산 유도체, 비타민 B6 유도체, 움벨리페론, 에스쿨린, 계피산 벤질, 시녹세이트, 옥센벤존, 디옥시벤존, 옥타벤존, 설리소벤존, 벤조레조르시놀, 알부틴, 구아이아줄렌, 시코닌, 바이칼린, 바이칼레인, 베르베린, 네오헬리오판, 에스카롤, 산화아연, 산화 티탄, 탈크, 카올린 등을 들 수 있다.

예를 들면, 대사촉진작용/세포 부활물질로서는, 하이드로퀴논, 유산균 엑스, 태반 엑스, 영지 엑스, 비타민 A, 비타민 E, 알란토인, 비장 엑스, 흉선 엑스, 효모 엑스, 발효유 엑스, 식물 엑스(알로에, 황금, 쇠뜨기, 겐티아나, 우엉, 자근, 인삼, 하마멜리스, 홉, 율무쌀, 광대수염, 혈년초, 당귀, 금잔화, 감차, 고추나물, 오이, 백리향, 로즈메리, 파슬리) 등을 들 수 있다.

예를 들면, 활성산소 소거제로서 숙신산, 타닌산, 알란토인, 염화아연, 황산아연 등의 수렴제도 사용할 수 있고, 슈퍼옥사이드디스뮤타제(SOD), 카탈라아제, 글루타티온페르옥시다아제 등을 들 수 있다.

예를 들면, 항산화제로서 비티민 C 또는 그 염, 스테아린산 에스테르, 비타민 E 또는 그 유도체, 노르디하이드로 구아이아레트산, 부틸하이드록시톨루엔(BHT), 부틸하이드록시아니솔(BHA), 하이드록시티로솔, 파라하이드록시아니솔, 갈산프로플, 세사몰, 세사몰린, 고시폴, 프로폴리스 등을 들 수 있다.

예를 들면, 과산화 지질생성 억제제로서, β-카로틴, 식물 엑스, (참깨, 감차, 고추나물, 하마멜리스, 정자(丁子), 멜리사, 연명초, 자작나무, 살비아, 로즈메리, 남천촉, 영실, 은행나무, 녹차) 등을 들 수 있다.

예를 들면, 항염증제로서 이크타몰, 인도메타신, 카올린, 살리실산, 살리실산 나트륨, 살리실산 메틸, 아세틸 살리실산, 염산디펜히드라민, d-캠퍼, dl-캠퍼, 하이드로코르티손, 구아이아줄렌, 카마아줄렌, 말레인산 클로르페니라민, 글리시리진산 또는 그 염, 글리시레틴산 또는 그 염, 감초 엑스, 자근 엑스, 영실 엑스, 범의귀 엑스, 자소 엑스, 율무쌀 엑스, 프로폴리스 등을 들 수 있다.

예를 들면, 항균ㆍ살균ㆍ소독약으로서 히노키티올, 아크리놀, 황, 글루콘산 칼슘, 글루콘산 클로르헥시딘, 설파민, 머큐로크롬, 락토페린 또는 가수분해물, 염화 알킬디아미노에틸글리신액, 트리클로산, 하이포아염소산나트륨, 클로라민 T, 미표백분, 요오드 화합물, 요오도포름, 소르브산 또는 염, 프로피온산 또는 염, 살리실산, 데하이트로아세트산, 벤조산, 벤조산 나트륨, 파라하이드록시 벤조산 에스테르류, 운데실렌산, 티아민라우릴 황산염, 티아민라우릴 질산염, 페놀, 크레졸, p-클로로페놀, p-클로로-m-크실레놀, p-클로로-m-크레졸, 티몰, 페네틸알코올, O-페닐페놀, Irgasan CH3565, 할로카르반, 헥사클로로펜, 클로로헥시딘, 에탄올, 메탄올, 이소프로필알코올, 벤질알코올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 페녹시에탄올, 1, 2-펜탄디올, 징크 피리티온, 클로로부탄올, 이소프로필메틸페놀, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 등의 비이온 계면활성제, 양성 계면활성제, 라우릴황산 나트륨 등의 아니온 계면활성제, 염화벤잘코늄 등의 카티온 계면활성제, 포름알데히드, 헥사민, 감광소 101호, 감광소 201호, 감광소 401호, N-장쇄 아실 염기성 아미노산 유도체 및 그 산부가 염, 산화아연, 히노키티올, 고삼, 프로폴리스, 유용성 감초 엑스 등을 들 수 있다.

예를 들면, 보습제로서 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 트리카프릴 카프르산 글리세린, 글리콜산(-하이드록시산), 히알루론산 또는 그 염, 콘도로이친설페이트 또는 그 염, 수용성 키틴 또는 그 유도체 혹은 키토산 유도체, 피롤리돈 카복시산 또는 그 염, 락트산 나트륨, 요소, 솔비톨, 아미노산 또는 그 유도체, 올리브유, 카밀레 오일, 피마자유 등의 유지류 (경화유 포함한다), 밀랍, 라놀린, 셸락왁스 등의 왁스류, 유동 파라핀, 바셀린, 파라핀 등의 광물유, 낫토균 대사물, 낫토 추출 엑스, 명주섬유 추출물, 카밀레, 알로에 등의 식물 엑스 등을 들 수 있다.

예를 들면, 각질 용해제로서 플루오로인산 디이소프로필, 식물 엑스(황금, 고추나물, 고삼, 뽕잎, 계피, 이질풀, 컴프리, 살비아, 서양 딱총나무, 보리수, 목단피), 해초 엑스 등의 엘라스타아제 활성 저해제, 비타민 E 또는 그 유도체, 혈련초 엑스, 마늘 엑스, 인삼 엑스, 알로에 엑스, 겐티아나 엑스, 당귀 엑스, 세파란틴, 염화 카르프로늄, 미녹시딜 등의 모세혈관 혈류 촉진제, 게다가 고추팅크, 노닐산 바닐아미드, 칸타리스 팅크, 생강 팅크, 박하유, 1-멘톨, 캠퍼, 니코틴산 벤질 등의 자극제, 피리독신 또는 그 유도체, 황, 비타민 B6 등의 항지루제, 레조르신, 살리실산, 락트산, 요소등을 들 수 있다.

예를 들면, 향료로서 사향 등의 천연 동물성 향료, 멘톨, 스피어민트, 페퍼민트, 아니스 정유, 오렌지 정유, 카르다몬 정유, 구아이악우드 정유, 커민 정유, 계피정유, 시나몬 정유, 제라늄 정유, 코리안드롤 정유, 자소 정유, 시더우드 정유, 시트로넬라 정유, 재스민 정유, 진저글래스 정유, 삼목정유, 스피어민트 정유, 서양 박하 정유, 등자나무꽃 정유, 윈터그린 정유, 장미 정유, 노송나무 정유, 시래기 정유, 백단향 정유, 월계수 정유, 베르가못 정유, 유칼리 정유, 라임 정유, 라벤더 정유, 레몬 정유, 로즈메리 정유, 일본종 박하 정유 등의 식물성 향료, 기타 합성향료 등을 들 수 있다.

예를 들면, 호르몬류로서 에스트라디올 및 그 에스테르, 에스트론, 에티닐에스트라디올, 코르티손 및 그 에스테르, 하이드로코르티손 및 그 에스테르, 프리드니손, 프레드닐솔론 등을 들 수 있다.

예를 들면, 일반적으로 육모ㆍ발모효과에 유효하다고 알려져 있는 성분으로서는 펜타데칸산 글리세라이드, 콜레우스 엑스, 겐티아나 엑스, 솔방울 엑스, 로열젤리 엑스, 얼룩조릿대 엑스, t-플라바논, 6-벤질아미노푸핀, 혈련초 엑스, 염화 카르프로늄, 미녹시딜, 피나스테라이드, 아데노신, 니코틴산 아마이드, 뽕뿌리 엑스, 지황 엑기스, 5-아미노레불린산 등을 들 수 있다.

기타로서, 금속이온 봉쇄제, pH조정제, 킬레이트제, 방부ㆍ방곰팡이제, 청량제, 안정화제, 유화제, 동ㆍ식물 단백질 및 그 분해물, 동ㆍ식물성 다당류 및 그 분해물, 동ㆍ식물성 당단백질 및 그 분해물, 혈류 촉진제, 항염증제, 소염제, 방부제, 항알러지제, 창상 치료제, 증포제, 증점제, 효소, 색소, 정제수, 구강용제, 소염ㆍ탈취제, 고미제 등을 들 수 있다.

또, 본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제의 이용 형태는 임의이고, 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 화장품, 의약외품, 의약품으로서는 예를 들면, 내용ㆍ외용제, 화장수, 유액, 크림, 연고, 로션, 오일, 팩, 피부 세정제, 샴푸, 린스, 헤어 트리트먼트, 헤어크림, 포마드, 헤어스프레이, 정발료, 파마제, 헤어토닉, 염모제 등을 들 수 있다. 식품으로서는 예를 들면, 건강식품, 기능성 표시식품, 특정 보건용 식품 등의 보건 기능식품 및 특정 용도 식품, 소프트 드링크, 차음료, 건강음료, 알코올 음료등의 액체 식품, 과자, 쌀밥류, 빵류, 면류, 나물류, 조미료 등을 들 수 있다.

본 개시의 육모ㆍ발모 촉진제를 화장품, 의약외품, 의약품의 형태로 실시하는 경우, 제형은 한정되지 않고, 앰플, 캡슐, 분말, 과립, 환제, 정제, 고형제, 액제, 겔, 기포, 유액, 크림, 연고, 시트, 무스 등 다양한 것으로 할 수 있다.

이하에 본 개시를 더 상세하게 설명하기 위해서 실시예를 들지만, 본 개시는 이것들 에 의해서 하등 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1: 모유두세포 부활작용의 평가]

(1-1) 인간 두발 모유두세포의 배양 방법

시험 대상세포는 육모제(헤어토닉)의 약효평가에 널리 사용되어 있는 세포인 인간 두발 모유두세포(카탈로그 번호: CA60205a, 로트번호: 2548, 백인종, 47세 여성 유래, 판매원: TOYOBO CO., LTD.)를 사용했다. 인간 두발 모유두세포는 모유두세포 증식배지(카탈로그 번호: TMTPGM-250, 판매원: TOYOBO CO., LTD.)를 사용하고, 이산화탄소 인큐베이터(5% CO₂, 37℃) 내에서 배양했다. 배양에 사용한 플라스크는, I형 콜라겐으로 코팅해서 사용했다. 세포의 계대에는 모유두세포 전용 서브 컬쳐 세트(카탈로그 번호: CA090K, 판매원: TOYOBO CO., LTD.)를 사용해서 세포를 플라스크에서 박리해서 사용했다.

(1-2) 인간 모유두세포 독성시험

본 실시예에서는 이소사포나린을 피험물질로 하고, 인간 두발 모유두세포에 대한 독성의 유무를 평가했다.

인간 두발 모유두세포를 5×10³개/웰(본 시험에서는 0.1㎖/웰)이 되도록, I형 콜라겐 코팅에 96웰 플레이트에 파종했다. 이산화탄소 인큐베이터(5% CO₂, 37℃) 내에서, 1일간 배양 후(50% 컨플루언트), 이소사포나린을 포함하는 시험배지로 치환하고, 그 후에 3일간 배양했다. 세포의 증식성을 생세포 수 측정시약 SF(카탈로그 번호: 07553, 판매원: NACALAI TESQUE, INC.)로 비교 검토했다. 생세포 수 측정시의 흡광도 측정 시에 세포에 부착된 석출물이 흡광도에 영향을 미칠 가능성을 고려하고, 3일간의 배양 종료 후, 배양의 상청액을 제거하고, 인산 완충생리식염수(약칭: PBS)로 세포를 세정했다. PBS로 세정한 후, 생세포 측정시약 SF를 10% 포함하는 배지를 1웰당 100㎕ 첨가했다. 첨가 후, 30분 후 및 90분 후에 배양 상청액의 흡광도(측정파장 450nm, 참조파장 595nm)를 측정했다. 90분 및 30분의 값으로부터 1시간당의 흡광도 ABS의 변화량(단위: ABS/hr)을 산출했다. 시험수 3으로 실시했다.

도 1에 나타내는 바와 같이 이소사포나린은 1000μmol/L 이하라면 인간 두발 모유두세포에 대해서, 독성을 나타내지 않았다. 따라서 후술하는 이소사포나린의 평가 실험에 있어서는, 0.1μmol/L, 10μmol/L, 1000μmol/L의 이소사포나린 시험농도를 사용했다. 이 시험농도는 이소사포나린(분자량 594.52)을 100mmol/L이 되도록 모유두세포 증식배지에 용해한 스톡용액으로부터 조제되었다.

(1-3) 인간 두발 모유두세포 부활작용의 평가

인간 두발 모유두세포를 1.2×10⁴개/웰(본시험에서는 0.3㎖/웰)이 되도록, 48웰 플레이트에 파종했다. 이산화탄소 인큐베이터 내에서, 1일간 배양 후, 최종농도 0.1μmol/L, 10μmol/L, 1000μmol/L의 이소사포나린이 되도록 용해한 모유두세포 증식배지로 치환했다. 그 후에 1일간 및 3일간 배양하고, 각각의 세포의 증식성을 생 세포수 측정시약 SF로 비교검토했다. 1일간 및 3일간의 배양이 각각 종료한 후, 배양의 상청액을 제거하고, PBS로 세포를 세정했다. PBS로 세정한 후, 생세포 측정시약 SF를 10% 포함하는 배지를 1웰당 300㎕ 첨가했다. 첨가 후, 30분 후 및 90분 후에 1웰당의 배양 상청액 100㎕를 다른 96웰 플레이트로 옮기고, 마이크로플레이트 리더로 흡광도(측정파장 450nm, 참조파장 595nm)를 측정했다. 90분 및 30분의 값으로부터 1시간당의 흡광도 ABS의 변화량(단위: ABS/hr)를 산출하고, 세포 부활작용을 평가했다. 시험수 5로 실시했다. 또, 이소사포나린의 비교 대조구로서 무첨가 대조구를 사용했다.

양성대조로서, 최종농도 100μmol/L의 아데노신(카탈로그 번호: 016-10493, 판매원: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 및 최종농도 30μmol/L의 미녹시딜(카탈로그 번호: M4145-25MG, 판매원: Sigma-Aldrich Japan)을 첨가했을 경우에 대해서도, 동일한 시험을 실시했다. 또, 아데노신은 디메틸설폭사이드(약칭: DMSO)에 용해 후, DMSO의 최종농도가 0.1%가 되도록 시험배지에 첨가했다. 용매 대조로서 0.1% DMSO 시험구를 설치했다. 미녹시딜은 에탄올에 용해 후, 에탄올의 최종농도가 0.1%이 되도록 시험배지에 첨가했다. 일반적으로, 모유두세포에서는 0.1% 이하의 에탄올 농도에서는 세포기능에 영향을 미치지 않기 때문에, 미녹시딜의 비교 대조구로서 무첨가 대조구를 사용했다.

피험물질인 이소사포나린을 첨가 후, 1일간 배양한 측정결과를 도 2에 나타내고, 이소사포나린을 첨가 후, 3일간 배양한 측정결과를 도 3에 나타냈다. 비교 시험구간에서는 유의차 검정을 실시했다. 검정은 Student T-test로 실시하고, P<0.05(귀무가설이 5% 미만)의 것을 유의성 있음으로 판단하고, 도면 중에 기재했다.

도 2로부터 분명하게 나타내는 바와 같이, 처리기간 1일간에 있어서, 이소사포나린 처리를 한 그룹에서는, 0.1μmol/L∼1000μmol/L의 범위에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다 약간 이기는 하지만 유의한 세포 부활작용이 인정되었다. 또, 도 3로부터 분명하게 나타내는 바와 같이, 처리기간 3일간에 있어서, 이소사포나린 처리를 한 그룹에서는 0.1μmol/L∼1000μmol/L의 범위에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 현저한 세포 부활작용이 인정되었다. 그 세포 부활작용은 미녹시딜을 처리했을 경우의 약 3배의 작용이 인정되었다.

한편, 양성 대조물인 아데노신은 처리기간 3일간에 있어서, 인간 두발 모유두세포에 대해서, 0.1% DMSO 시험구보다도 유의한 세포 부활작용이 인정되었다. 또, 양성 대조물인 미녹시딜은 처리기간 1일간에 있어서, 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 약간 이기는 하지만 유의한 세포 부활작용이 인정되었다. 처리기간 3일간에 있어서는 미녹시딜은 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의한 세포 부활작용이 인정되었다.

이 결과로부터, 이소사포나린을 두피 등에 적용하는 것에　의해, 매우 뛰어난 모유두세포 부활작용을 발휘하고, 육모효과 및 발모효과를 기대할 수 있는 것임이 시사되었다.

[ 실시예 2: 이소사포나린의 VEGF 생산 촉진작용의 평가]

이소사포나린 처리를 실시한 인간 두발 모유두세포가 생산하는 VEGF량을 측정하는 것에 의해, 인간 두발 모유두세포에 대한 이소사포나린의 VEGF 생산 촉진작용에 대해서 평가했다.

인간 두발 모유두세포에 대해서 이소사포나린을 3일간 처리한 배양 상청액에 있어서의 VEGF량을 ELISA kit(제품명: Human VEGF Quantikine ELISA, 카탈로그 번호: DVE00, 판매원: R&D시스템사)로 측정했다. 이소사포나린을 3일간 처리한 배양 상청액은, 상기 (1-3)항에 있어서 3일간 배양했을 때의 상청액을 사용했다. 구체적으로는 상기 (1-3)항에서는, 흡광도를 측정하기 위해서, 이소사포나린의 첨가 3일 후, 배양의 상청액을 제거했지만, VEGF 생산 촉진작용의 평가시험에 있어서는, 이소사포나린의 첨가 3일 후의 배양 상청액을 회수하고, 당해 상청액을 검체로 사용했다. 시험수 5로 실시했다.

이하에 VEGF의 측정방법을 상세하게 설명한다. 또, VEGF의 측정에는 상청액을 희석하지 않고, 원액을 사용했다.

순서 1-1. VEGF 표준원액(2000pg/㎖)을 바탕으로, 반응 완충액을 사용해서, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6pg/㎖의 VEGF 표준용액을 조제했다.

순서 1-2. VEGF 표준용액 및 검체(배양 상청액) 200㎕을 50㎕의 희석용액을 각 웰에 첨가한 VEGF 고상화 마이크로플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 반응했다 (1차반응).

순서 1-3. 웰 내의 용액을 제거하고, 세정액으로 3회 세정했다.

순서 1-4. 서양 와사비 페록시다아제 결합 VEGF 항체용액을 각 웰에 200㎕씩 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다 (2차 반응).

순서 1-5. 웰 내의 용액을 제거하고, 세정액으로 3회 세정했다.

순서 1-6. 기질용액 200㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 20분 반응시켰다.

순서 1-7. 반응 정지용액을 각 웰에 50㎕씩 첨가하고, 플레이트 믹서로 1분간 혼화 후, 플레이트 리더로 각 웰의 흡광도를 측정했다 (측정파장 450nm).

순서 1-8. 표준곡선으로부터, 검체 중의 VEGF 농도를 산출했다.

또, 이소사포나린의 비교 대조구로서 무첨가 대조구를 사용했다.

양성 대조로, 최종농도 30μmol/L의 미녹시딜을 첨가했을 경우에 대해서도, 동일한 시험을 실시했다. 미녹시딜의 비교 대조구로서 무첨가 대조구를 사용했다.

피험물질을 3일간 처리한 배양 상청액 중의 VEGF량을 측정한 결과를 도 4에 나타냈다. 상기 (1-3)항과 동일하게, 유의차 검정을 실시하고, 도면 중에 기재했다.

도 4로부터 분명하게 나타내는 바와 같이, 인간 두발 모유두세포에 대해서, 이소사포나린 1000μmol/L 농도구에서, 무첨가 대조구와 비교하고, 유의하게 VEGF량이 증가하고 있었다. 한편, 양성 대조물인 미녹시딜은 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구와 비교해서 유의하게 VEGF량이 증가하고 있었다.

이 결과로부터, 이소사포나린을 두피 등에 적용하는 것에　의해, VEGF 생산량을 높일 수 있고, 뛰어난 육모효과 및 발모효과를 기대할 수 있는 것임이 시사되었다.

[ 실시예 3: 화장품의 제조]

혼와사비 100kg를 물에서 세정한 후, 1cm 폭으로 자르고, 커터 믹서로 분쇄했다. 분쇄한 혼와사비에 50% 부틸렌글리콜을 200kg 첨가하고, 1시간 교반했다. 그 후에 압착해서 180kg의 압착액을 얻었다. 또, 당해 압착액을 90℃에서 30분 가열살균해서 추출물을 얻었다. 이렇게 해서 수득된 혼와사비의 추출물을 사용해서 하기에 나타내는 배합의 두발용 화장품을 제조했다. 하기의 배합은 전량을 100g로 표시했다. 당해 두발용 화장품 100g 중에 이소사포나린은 1.5mg 함유한다.

물 86.48g

부틸렌글리콜 5.0g

글리세린 2.0g

혼와사비의 추출물 5.0g

트레할로오스 1.0g

페녹시 에탄올 0.5g

시트르산 나트륨 0.01g

시트르산 0.01g

[ 실시예 3의 변형예 ]

상기 실시예 3에서는, 화장품으로서 두발용 화장품 100g 중에 이소사포나린 1.5mg 함유하는 예를 나타냈지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 화장품 100㎖ 중에 이소사포나린 5㎍(0.1μmol/L)∼59.0mg(1,000μmol/L) 함유할 수도 있다.

또, 상기 실시예 3에서는 두발용 화장품 중에 이소사포나린이 함유되어 있는 예를 나타냈지만, 페닐프로파노이드류가 함유되어 있을 수도 있다. 구체적으로는 두발용 화장품 100㎖에는 페닐프로파노이드류가 1.0mg 함유될 수도 있다. 또, 페닐프로파노이드류의 함유량은 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 화장품 100㎖ 중에 페닐프로파노이드류 0.001∼100mg를 함유할 수도 있다.

[ 실시예 4: 식품의 제조 1]

혼와사비 100kg를 물로 세정한 후, 1cm 폭으로 자르고, 커터 믹서로 분쇄했다. 분쇄한 혼와사비에 50% 에탄올을 200kg 첨가하고, 1시간 교반했다. 그 후에 압착해서 180kg의 액을 얻었다. 또, 당해 액을 농축해서 알코올분을 제거한 후, 90℃에서 30분 가열처리에 의해 살균했다. 셀룰로오스 10kg를 첨가해서 혼련한 후, 건조ㆍ분쇄해서 혼와사비의 엑스 분말을 얻었다. 이렇게 해서 수득된 엑스 분말 200mg를 하드캡슐(3호)에 충전하고, 제형이 캡슐인 식품(예를 들면 서플리먼트 등)을 제조했다. 당해 캡슐 중의 이소사포나린은 1mg/알 함유한다.

[ 실시예 5: 식품의 제조 2]

실시예 4에서 제작한 엑스 분말 150mg를 사용해서, 하기에 나타내는 배합비로 원료 조성물을 조제하고, 타정하고, 제형이 정제인 식품(예를 들면 서플리먼트 등)을 제조했다. 당해 정제 중의 이소사포나린의 함유량은 0.75mg/알이다.

정제 1.5g/알(5알/일）

그라뉴당 1.20g

농축 과즙 0.045g

시트르산 0.075g

향료 0.03g

혼와사비의 엑스 분말 0.15g

[ 실시예 6: 식품의 제조 3]

혼와사비 100kg를 세정해서 자르고, 50% 에탄올을 200kg 첨가하고 180kg의 추출액을 얻었다. 수득된 추출액을 농축해서 알코올분을 제거하고, 셀룰로오스를 30kg 첨가해서 건조, 분말화했다. 수득된 분말을 타정하고, 1정 200mg의 정제를 작성했다. 1정 중에는, 1.0mg의 페닐프로파노이드류가 포함된다.

[ 실시예 4, 5, 6의 변형예 ]

상기 실시예 5에서는 제형이 정제인 식품으로서, 1.5g/알의 정제에 이소사포나린 0.75mg/알 함유하는 예를 나타냈지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 250mg/알의 정제에 이소사포나린 0.5mg∼100mg/알 함유할 수도 있다.

또, 상기 실시예 5에서는 정제의 제조방법 예를 나타냈지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 이소사포나린과 덱스트린을 혼합하고, 타정하고, 정제를 제조할 수도 있다. 또, 예를 들면, 실시예 4에서 제작한 엑스 분말과 덱스트린을 혼합하고, 타정하고, 정제를 제조할 수도 있다.

또, 상기 실시예 6에서는, 1정 중에 1.0mg의 페닐프로파노이드류가 함유하는 예를 나타냈지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 농축율을 바꿈으로써, 1정 중에 1.0mg∼100mg의 페닐프로파노이드류를 함유할 수도 있다.

[ 실시예 7: 이소사포나린 이외의 피험물질에 의한 평가]

실시예 7에서는, 표 1에 나타내는 피험물질 각각이 첨가된 배양액으로 인간 두발 모유두세포를 배양한 후, 생 세포수 측정, VEGF 생산량, 및 FGF-7 유전자 발현량을 검증했다.

피험물질의 아피게닌으로서는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.의 카탈로그 번호 012-18913을 사용했다. 피험물질의 쿠마르산으로서는 Sigma Aldrich의 카탈로그 번호: C9008을 사용했다. 피험물질의 카페산 메틸에스테르로서는 AlfaAesar사의 카탈로그 번호: J63876을 사용했다.

또, 각 피험물질의 스톡용액을 제작하기 위해서 사용한 용매 및 스톡용액의 농도를 표 1에 나타낸다. 각 스톡용액은 여과 멸균해서 시험에 사용했다.

양성 대조인 아데노신은 DMSO를 용매로서 100mmol/L 스톡용액을 제작, 그것을 최종농도 100μmol/L이 되도록 시험배지에 첨가했다(용매대조로서 0.1% DMSO 시험구를 사용했다). 미녹시딜은 50% 에탄올을 사용해서 농도 15mmol/L의 스톡용액을 제작하고, 그것을 최종농도 30μmol/L이 되도록 시험배지에 첨가했다. 이 때의 용매(에탄올) 농도는 0.2%인 것으부터 0.2% 에탄올 시험구를 대조구로 했다.

(7-1) 인간 두발 모유두세포의 배양방법

시험 대상 세포는 인간 두발 모유두세포(카탈로그 번호: CA602t05a, 로트번호: 2868, 백인종, 51세 남성 유래, 정수리, 판매원: TOYOBO CO., LTD.)를 사용했다. 실시예 1의 (1-1)항에 기재된 방법과 동일하게, 인간 두발 모유두세포를 배양했다.

(7-2) 인간 모유두세포 독성시험

실시예 1의 (1-2)항에 기재된 방법과 동일하게, 피험물질의 인간 두발 모유두세포에 대한 독성의 유무를 평가했다. 그 결과를 도 5∼도 7에 나타낸다.

도 5에 나타내는 바와 같이 아피게닌은 0.08mmol/L 이상에서 인간 두발 모유두세포에 대해서 독성을 나타냈다. 도 6에 나타내는 바와 같이 쿠마르산은 2mmol/L 이상에서 인간 두발 모유두세포에 대해서 독성을 나타냈다. 도 7에 나타내는 바와 같이 카페산 메틸에스테르, 0.016mmol/L 이상에서 인간 두발 모유두세포에 대해서 독성을 나타냈다. 세포 독성시험의 결과를 바탕으로 본 시험에서의 시험농도를 표 2의 기재된 대로 했다.

각 피험물질의 시험 최고농도에서의 용매농도는 0.1% 이하인 것으로부터 본 시험에서의 용매의 영향이 없다고 판단하고, 유의차 비교에서는 무첨가 대조구를 비교기준으로 했다. 또, 검정은 Student T-test로 실시하고, P<0.1, P<0.05, P<0.01, 및 P<0.001의 것을 유의성 있음이라고 판단하고, 도면 중에 기재했다.

(7-3) 인간 두발 모유두세포 부활작용 및 VEGF 생산 촉진작용의 평가

인간 두발 모유두세포를 1.2×10⁴개/웰(본 시험에서는 0.3㎖/웰)이 되도록, 48웰 플레이트에 파종했다. 이산화탄소 인큐베이터(5% CO₂, 37℃) 내에서, 1일간 배양 후, 피험물질을 포함하는 배지로 치환한다. 그 후에 3일간 배양하고, 각각의 세포의 증식성을 생 세포수 측정시약 SF로 비교 검토했다. 시험수 5로 실시했다. 3일간의 배양이 종료한 후, 배양의 상청액을 회수하고, 당해 상청액 중의 VEGF 생산량을 실시예 2과 동일하게 ELISA kit로 측정했다.

또, 당해 상청액을 제거하고, PBS로 세포를 세정 후, 생세포 측정시약 SF를 10% 포함하는 배지를 첨가(300㎕/웰)했다. 첨가 후, 30분 후 및 90분 후에 1웰당의 배양 상청액 100㎕을 다른 96웰 플레이트로 옮기고, 마이크로플레이트 리더로 흡광도(측정파장 450nm, 참조파장 595nm)를 측정했다. 90분 및 30분의 값으로부터 1시간당의 흡광도 ABS의 변화량(단위: ABS/hr)을 산출하고, 세포 부활작용을 평가했다.

유의차 검정에 의해 유의성 있음이라고 판단된 피험물질에 대해서, 생세포 수의 측정결과를 도 8에 나타내고, VEGF 단백 생산량의 결과를 도 9에 나타낸다.

도 8에 나타내는 바와 같이 아피게닌을 처리한 그룹에서는, 0.001μmol/L∼1μmol/L의 범위에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의한 세포 부활작용이 인정되었다. 또, 아피게닌을 처리한 그룹에서는 10μmol/L에서 유의성을 나타내지 않았다. 따라서, 아피게닌을 처리한 그룹에 대해서는 0.001μmol/L∼9μmol/L의 범위에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의한 세포 부활작용이 인정되는 것으로 생각된다.

쿠마르산을 처리한 그룹에서는, 0.1μmol/L로 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의한 세포 부활작용이 인정되었다. 또, 쿠마르산을 처리한 그룹에서는 0.01μmol/L 및 10μmol/L에서 유의성을 나타내지 않았다. 따라서, 쿠마르산을 처리한 그룹에 대해서는, 0.011μmol/L∼9μmol/L에서, 바람직하게 0.011μmol/L∼5μmol/L에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의한 세포 부활작용이 인정되는 것으로 생각된다.

한편, 양성 대조물인 아데노신은 인간 두발 모유두세포에 대해서, 0.1% DMSO 시험구보다도 유의한 세포 부활작용이 인정되었다. 또, 양성 대조물인 미녹시딜은 인간 두발 모유두세포에 대해서, 0.2% 에탄올 시험구보다도 유의한 세포 부활작용이 인정되었다.

이 결과로부터, 아피게닌 및 쿠마르산을 두피 등에 적용하는 것에　의해, 우수한 모유두세포 부활작용을 발휘하고, 육모효과 및 발모효과를 기대할 수 있는 것임이 시사되었다.

또, 도 9에 나타내는 바와 같이 아피게닌을 처리한 그룹에서는, 0.001μmol/L∼0.01μmol/L의 범위에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의하게 VEGF량이 증가하고 있었다. 또, 아피게닌을 처리한 그룹에서는 0.1μmol/L에서 유의성을 나타내지 않았다. 따라서, 아피게닌을 처리한 그룹에 대해서는 0.001μmol/L∼0.09μmol/L의 범위에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의하게 VEGF량이 증가하는 것으로 생각된다.

카페산 메틸에스테르를 처리한 그룹에서는 1μmol/L에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의하게 VEGF량이 증가하고 있었다. 또, 카페산 메틸에스테르를 처리한 그룹에서는 0.1μmol/L 및 10μmol/L에서 유의성을 나타내지 않았다. 따라서 카페산 메틸에스테르를 처리한 그룹에 대해서는 0.11μmol/L∼9μmol/L에서, 바람직하게 0.011μmol/L∼5μmol/L에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의하게 VEGF량이 증가하는 것으로 생각된다.

한편, 양성 대조물인 아데노신은 인간 두발 모유두세포에 대해서, 0.1% DMSO 시험구보다도 약간 이기는 하지만 유의하게 VEGF량이 증가하고 있었다. 또, 양성 대조물인 미녹시딜은 인간 두발 모유두세포에 대해서, 0.2% 에탄올 시험구보다도 유의하게 VEGF량이 증가하고 있었다.

(7-4) FGF-7 유전자 발현의 평가

인간 두발 모유두세포를 1×10⁵개/웰(본 시험에서는 0.3㎖/웰)이 되도록, 콜라겐 코팅 48웰 플레이트에 파종했다. 이산화탄소 인큐베이터 내(5% CO₂, 37℃)에서, 1일간 배양 후(100% 컨플루언트를 확인한다), 피험물질(3단계 농도: 무독성 농도영역)을 포함하는 배지로 치환했다. 그 후에 2시간 배양하고, 토탈 RNA를 회수, cDNA에 역전사한 후, 리얼타임 PCR법으로 FGF-7 유전자 발현을 측정했다. 내부표준으로서 GAPDH 유전자를 사용해서 음성 대조그룹과의 상대값으로서 산출하고, 시험수 3으로 실시했다. 각 수법의 상세를 이하에 나타낸다.

우선, 세포로부터 토탈 RNA의 회수 및 cDNA화는 FastLane Cell RT-PCR 키트의 순서를 따라서 실시했다.

순서 7-1. PBS로 세정한 세포에 웰당 500㎕의 버퍼 FCW를 첨가, 곧바로 버퍼 FCW를 제거 흡인했다.

순서 7-2. 웰당 200㎕의 버퍼 FCP를 첨가, 실온(25℃)에서 5분간 인큐베이션 후, FastLane 라이세트를 96웰 PCR 튜브로 옮겼다. 튜브를 -80℃에서 다음 cDNA화 작업까지 보존했다.

순서 7-3. 실온으로 순서 7-2의 라이세트를 용해했다. 새로운 PCR 튜브에 2㎕의 gDNA Wipeout Buffer, 1㎕의 FastLane 라이세트, 11㎕의 RNase 자유수를 첨가하고 42℃에서 5분간 반응했다. 그 후에 곧 빙상으로 옮겼다 (실제로는 라이세트가 들어 간 튜브에 gDNA Wipeout Buffer, RNase 자유수의 마스터 믹스를 적당량 첨가했다. )

순서 7-4. 순서 7-3에서 수득된 반응액 14㎕에 역전사 반응 마스터 믹스(1㎕의 Quantiscript Reverse Transcriptase, 4㎕의 Quantiscript RT Buffer, 1㎕의 RT Primer Mix/튜브)를 6㎕첨가하고, 42℃, 30분간 인큐베이션했다.

순서 7-5. 반응액을 95℃, 3분간 처리함으로써 역전사효를 비활성화시켰다. 이 반응액을 합성 cDNA로 해서서 리얼타임 PCR에 사용했다. 해석에 사용할 때까지 -80℃에서 보존했다.

다음에, 리얼타임 PCR 전용 튜브에 아래와 같이 반응액을 조정하고, PCR을 실시했다. PCT반응으로서, 95℃ 10초간 및 60℃ 30초간을 60사이클 실시했다.

dsH₂O 2.4㎕

SYBER Premix Ex Taq 4.0㎕

포워드 프라이머(20μmol/L) 0.3㎕

리버스 프라이머(20μmol/L) 0.3㎕

합성 cDNA 1.0㎕

합계 8.0㎕

시험에 사용한 FGF-7의 특이적 프라이머, 및 내부표준으로 한 GADPH의 특이적 프라이머를 이하에 나타낸다.

FGF-7의 프라이머

포워드 프라이머:tctgtcgaacacagtggtacctgag (서열번호1)

리버스 프라이머:gccactgtcctgatttccatga (서열번호2)

GADPH의 프라이머

포워드 프라이머:catccctgcctctactggcgctgcc (서열번호3)

리버스 프라이머:ccaggatgcccttgagggggccctc (서열번호4)

각 유전자의 상대 발현량을 다음과 같이 산출했다. 각 유전자의 증폭곡선과 임계값선과의 교점에서, Ct값(PCR사이클 수)을 산출했다. 목적 유전자의 Ct값에서 내부표준 GAPDH 유전자의 Ct값을 뺀 Ct(목적 유전자)-Ct(GAPDH2)=ΔCt값이다. 또, ΔCt값에서 블랭크의 평균 ΔCt값을 뺀 ΔCt(샘플 처리구)-ΔCt(블랭크구)=ΔΔCt값으로 한다. ΔΔCt값을 승수 항에 대입한 2-ΔΔCt값이 상대 발현량이 된다.

유의차 검정에 의해 유의성 있음으로 판단한 피험물질에 대해서, FGF-7 유전자 발현량의 결과를 도 10에 나타낸다.

도 10에 나타내는 바와 같이 쿠마르산을 처리한 그룹에서는 0.001μmol/L에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의하게 FGF-7 유전자 발현의 상승을 나타냈다. 또, 쿠마르산을 처리한 그룹에서는 0.01μmol/L에서 유의성을 나타내지 않았다. 따라서, 쿠마르산을 처리한 그룹에 대해서는 0.001μmol/L∼0.009μmol/L에서, 바람직하게 0.001μmol/L∼0.005μmol/L에서 인간 두발 모유두세포에 대해서, 무첨가 대조구보다도 유의하게 FGF-7 유전자 발현의 상승을 나타내는 것으로 생각된다.

한편, 양성 대조물인 아데노신은 인간 두발 모유두세포에 대해서, 0.1% DMSO 시험구보다도 유의하게 FGF-7 유전자 발현의 상승을 나타냈다.

이상, 육모ㆍ발모 촉진제의 실시예에 대해서 설명했지만, 상술한 실시예에 있어서 예시한 구성에 대해서는 여러가지로 변형할 수 있다. 예를 들면, 상기 실시예에서는 상기 화학식(I)의 플라보노이드류의 예로서 이소사포나린 및 아피게닌을 사용하는 예를 나타냈지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 이소사포나린 및 아피게닌 이외에는, 이미 본 명세서 중에서 예시한 플라보노이드류를 사용할 수 있고, 이것들의 플라보노이드류를 사용하는 경우에도, 이소사포나린을 사용했을 경우와 동일한 육모·발모촉진 효과를 기대할 수 있다.

또, 상기 실시예에서는 화장품 및 식품의 원료로서, 혼와사비를 사용한 예를 나타냈지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 화장품 및 식품의 원료는 예를 들면, 서양 와사비일 수도 있고, 혼와사비와 서양 와사비를 병용할 수도 있다.

<110> KINJIRUSHI Co., Ltd <120> HAIR RESTORATION/GROWTH STIMULATING AGENT <130> SIP113389JP <150> PCT/JP <151> 2016-12-02 <150> JP 2015/235965 <151> 2015-12-02 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 tctgtcgaac acagtggtac ctgag 25 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gccactgtcc tgatttccat ga 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 catccctgcc tctactggcg ctgcc 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ccaggatgcc cttgaggggg ccctc 25

Claims

하기에 기재된 화학식(I)의 1종 또는 복수 종의 플라보노이드류 (아피게닌 및 루테올린을 제외한다.) 를 유효성분으로 함유하는 육모ㆍ발모 촉진제:

(단, 상기 식에서, R¹은 글리코실, 글리코실-글리코실-O-시나포일 또는 H, 이고, R²는 O-시나포일 또는 OH이고, R³은 H 또는 OH이고, R⁴는 O-글리코실, OH 또는 O-글리코실-시나포일이다.)
하기에 기재된 화학식(II)의 1종 또는 복수 종의 페닐프로파노이드류를 유효성분으로 함유하는 육모ㆍ발모 촉진제:

(단, 상기 식에서, R⁵는 H 또는 OH이고, R⁶은 OH 또는 OCH₃이다.)
제1 항에 있어서,
상기 플라보노이드류는 와사비 및 서양 와사비 가운데 적어도 한쪽에서 추출된 성분인 육모ㆍ발모 촉진제.
제1 항에 있어서,
상기 플라보노이드류가 이소사포나린인 육모ㆍ발모 촉진제.
제2 항에 있어서,
상기 페닐프로파노이드류는 와사비 및 서양 와사비 가운데 적어도 한쪽에서 추출된 성분인 육모ㆍ발모 촉진제.
제3 항에 있어서,
상기 플라보노이드류가 이소사포나린인 육모ㆍ발모 촉진제.