KR101413686B1 - 피부줄기세포 배양방법 및 이를 이용한 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화장품 조성물로 허용된 성분들을 혼합하여 포유동물의 세포를 배양할 수 있는 배지를 제조하는 것이다. 상기의 개발된 배지를 사용하여 인간유래의 피부세포와 피부줄기세포를 배양하였을 때, 세포의 생장과 증식을 확인하여 피부세포 및 피부줄기세포의 생산에 적합함을 확인하였다. 본 발명에서 제조된 배지는 피부세포 및 피부줄기세포 수준에서 주름개선, 미백, 피부재생을 유도하는 기능을 갖는다. 또한, 배지를 조성물로 화장품을 제조하여 사용하였을 때, 피부의 보습, 주름개선, 미백에 뛰어난 효과를 나타냈으며, 상기한 화장품의 제형은 스킨세럼, 스킨에센스, 두피에센스 및 양모제, 영양크림을 포함한다.

Description

피부줄기세포 배양방법 및 이를 이용한 피부상태 개선용 조성물{Methods for Culturing Skin Stem Cells and Compositions for Improving skin conditions Using the Same}

본 발명은 인간에서 유래한 세포의 배양에 특화된 배지를 개발하여 난치성 질환의 치료를 위한 세포치료제를 생산하는 방법과, 개발된 배지를 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물의 개발에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 개발된 배지를 사용하여 세포치료에 이용될 수 있는 피부세포 및 줄기세포를 효율적으로 생산하고, 또한 개발된 배지를 피부의 보습, 주름개선, 미백, 피부재생용 화장품의 조성물로 이용하는 방법에 관한 것이다.

인간과 동물의 세포를 배양하는 배지는 세포치료제의 생산과 유전자 재조합방식에 의한 생리활성물질과 생물의약품의 생산에 널리 이용되고 있다. 생물의약품은 다양한 생물종에서 생산되므로, 세포배양법을 이용하여 생산할 경우 인간의 건강에 대한 안전성과 유효성이 확보되어야 한다.

배양된 세포의 특성을 분석하고 세포생산성을 비교 분석하여 세포의 특이적 증식을 위한 최적의 배양조건으로 배지조성을 개발하는 것이 매우 중요하다.

그러나, 기존의 상용화된 배지는 연구용 세포를 생산하기 위한 용도로 개발된 것으로, 인체에 투여가 제한된 페놀레드, 항생제 등이 포함되어 있으며(Blattner 외 10인, Science 196:161 1977), 동물에서 유래된 물질이나, 타가세포에서 유래된 성분이 포함되어 교차감염을 방지하고 안전성을 확보하기 위하여 또 다른 노력이 필요하다(화장품 안전성 정보관리규정, 식약청고시 제2011-10호, 2011.03.08).

또한, 최근에는 피부세포나 다양한 줄기세포를 배양한 후 수거된 배양액이나 배양액의 분리된 분획물을 유효성분으로 화장품 조성물로 사용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다(Sauirkaya 외 3인, Turk J Vet Anim Sci 8:779, 2004).

그러나, 기존의 줄기세포 배지에는 화장품 원료로 허용되지 않는 Choline chloride, Hypoxanthine-sodium salt, Thymidine, Putrescine dihydrochloride, Ferric nitrate, L-glutamin, 등의 성분이 포함되어 화장품의 조성물로 적합하지 않다.

사람의 피부는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있다. 표피층의 세포들은 외부 환경으로부터 인체를 보호하여 질병을 방지하고, 생리적, 기능적, 구조적인 항상성을 유지하는 기능을 갖는다. 표피층의 각질화 된 세포는 기저세포인 케라티노사이트가 분화하여 형성되며, 일정한 기간이 지나면 신체에서 떨어져 나가게 된다. 진피층은 탄력 섬유인 콜라겐과 엘라스틴이 결합되어 피부의 탄력을 유지하고 피부의 지지체의 역할을 한다(Wollina 외 3인 Dermatol Ther. 21(2):118, 2008).

피부의 재생과 관련해 중요한 역할을 담당하는 줄기세포는 모낭(hair follicle)에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이들 세포의 일부는 모발과 표피의 재생과 성장에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 또한, 표피의 기저층(the basal cell layer of epidermis)에 존재하는 것으로 알려진 줄기세포는 표피와 진피층의 섬유아세포의 증식과 분화를 조절하여 피부재생과 건강에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Fuchis. Cell Stem Cell. 4(6):499, 2009).

인간의 피부는 일생동안 지속적으로 재생(renewal)되며, 표피의 기저층(the basal cell layer of epidermis)에 존재하는 것으로 알려진 줄기세포는 상처가 난 피부의 재생에 참여하며, 피부세포의 증식과 분화에 영향을 미치는 다양한 성장인자, 국부조절인자, 호르몬 등이 알려져 있다(Wollina 외 3인 Dermatol Ther. 21(2):118, 2008).

피부세포의 증식과 분화를 조절하는 대표적인 성장인자로는 EGF(epidermal growth factor)와 FGF(fibroblast growth factor)로 알려져 있으며, EGF와 FGF의 영향을 받아 세포의 성장에 직접적으로 영향을 미치는 세포활성물질은 MCP-2(Monocyte chemotactic protein-2), MCP-4(Monocyte chemotactic protein-4), MDC(Macrophage Derived Chemokine), NAP-2(Neutrophil-activating peptide-2), ICAM-1(Intercellulat adhesion molecule-1/CD54), MIP-1(Macrophage inflammatory protein 1 alpha), MIP-1(Macrophage inflammatory protein 1 beta), sTNF-RII(soluble tumour necrosis factor receptor II), sTNFRI(soluble tumour necrosis factor receptor I), TIMP-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1), TIMP-2(Tissue inhibitor of metalloproteinase 2), uPAR(urokinase type plasminogen activator receptor), CD14(LPS-R lipopolysaccharide receptor), CXCL-16(Chemokine(C-X-C motif) ligand 16), MMP-9(Metrix metallopeptidase 9), PDGF-AA(Platelet-derived growth factor AA) 및 TGF 2(Transforming growth factor-beta2) 등이 알려져 있다(Do 외 1인, Reprod Fertil Dev. 17(1-2):143 2005; Li 외 3인, Oncol Rep. 24(4):1019 .2010; Bonnefont 외 3인, Cell Death Differ. 18(2):293 2011; Lanctt 외 2인, Exp Cell Res. 15;313(7):1449 2007).

이밖에도, 에스트로겐 등을 비롯한 여성호르몬 등과 PDGF, SCF등 혈관형성과 새로운 세포의 분열을 촉진 시키는 다양한 인자들이 피부에 영향을 줄 수 있는 성장인자로 알려져 있다(Imokawa 외 3인, Biochem J. 330( Pt3):1235, 1998; Liu 외 3인, Aging Cell. 10(4):661, 2011).

따라서, 세포배양에 적절한 수소이온 농도와 삼투압을 유지하며 미네랄, 아미노산, 비타민, 에너지원이 포함된 배지는 인간 유래의 피부줄기세포를 안정적으로 증식 및 배양할 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 피부를 구성하는 세포들의 증식, 분화, 재생을 촉진할 수 있으므로 미용 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 화장품의 원료로 허용된 성분으로만 구성된 배지를 개발하는 것은 새로운 기능성 화장품의 개발에 매우 유용하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 세포치료제를 생산하기 위한 줄기세포의 배양에 적합한 배지의 조성을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 무기염류, 비타민, 아미노산, 지질 및 세포의 에너지원으로 이루어진 영양성분을 포함하는 줄기세포 배양용 배지를 개발하고 이를 이용하여 배양된 줄기세포(바람직하게는, 피부줄기세포)가 높은 증식능을 가지며 멜라닌 합성을 효과적으로 억제한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 줄기세포 배양 또는 증식용 배지를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 줄기세포의 배양방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 무기염류 70-80 wt%, 비타민 0.05-0.40 wt%, 아미노산 3-15 wt%, 지질 0.001-0.004 wt% 및 세포의 에너지원 5-15 wt%로 이루어진 영양성분을 포함하는 줄기세포 배양 또는 증식용 배지로, 상기 배지는 pH 7.2-7.6 및 280-320(mOsmol/kg H₂O) 삼투압을 유지하는 것을 특징으로 하는 배지를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명자들은 세포치료제로서 줄기세포의 배양에 적합한 배지의 조성을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 무기염류, 비타민, 아미노산, 지질 및 세포의 에너지원으로 이루어진 영양성분을 포함하는 줄기세포 배양용 배지를 개발하고 이를 이용하여 배양된 줄기세포(바람직하게는, 피부줄기세포)가 높은 증식능을 가지며 멜라닌 합성을 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였다.

본 발명의 배지 성분은 대한민국 식약청에서 고시한 화장품원료집에 등재되어 있는 성분을 사용하며, 각 성분의 함량을 초순수 정제수에 혼합하여 충분히 용해시켜 제조한다. 이때, 본 발명의 배지의 구성성분 중 물에 대한 용해도가 낮은 아미노산과 일부의 성분들은 염산, 수산화나트륨, 알콜 등을 사용하여 용해시킨 후 배지에 첨가한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지에 이용되는 무기염류의 양은 배지에 포함된 총 영양성분 중 60-90 wt%, 보다 바람직하게는 65-85 wt%, 보다 더 바람직하게는 70-80 wt%, 그리고 가장 바람직하게는, 77 wt%에 해당하는 양이 이용되고, 상기 무기염류는 소듐 클로라이드, 소듐 하이드로젠 카르보네이트, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드 디하이드레이트, 마그네슘 설페이트(heptahydrate), 소듐 디하이드젠포스페이트, 징크 설페이트(Zinc sulfate), 페릭 설페이트 및 쿠프릭 설페이트(cupric sulfate)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지에 이용되는 비타민의 양은 배지에 포함된 총 영양성분 중 0.04-0.80 wt%, 보다 바람직하게는 0.08-0.60 wt%, 보다 더 바람직하게는 0.10-0.40 wt%, 그리고 가장 바람직하게는, 0.15 wt%에 해당하는 양이 이용되고, 상기 비타민은 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B9, 비타민 F 및 비타민 H를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지에 이용되는 아미노산의 양은 배지에 포함된 총 영양성분 중 1-25 wt%, 보다 바람직하게는 2-20 wt%, 보다 더 바람직하게는 3-15 wt%, 그리고 가장 바람직하게는, 7 wt%에 해당하는 양이 이용되고, 상기 아미노산은 20종의 필수아미노산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지에 이용되는 지질의 양은 배지에 포함된 총 영양성분 중 0.0005-0.01 wt%, 보다 바람직하게는 0.001-0.004 wt%, 그리고 가장 바람직하게는, 0.002 wt%에 해당하는 양이 이용되고, 상기 지질은 리포익산(lipoic acid) 및 리놀레익산(linoleic acid)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지에 이용되는 세포의 에너지원의 양은 배지에 포함된 총 영양성분 중 3-25 wt%, 보다 바람직하게는 4-20 wt%, 보다 더 바람직하게는 5-15 wt%, 그리고 가장 바람직하게는, 10 wt%에 해당하는 양이 이용되고, 상기 세포의 에너지원은 글루코오스 및 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 pH 6.0-8.5, 보다 바람직하게는 pH 6.5-8.2, 보다 더 바람직하게는 pH 7.0-8.0, 그리고 가장 바람직하게는 pH 7.2-7.6을 유지한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 삼투압 200-400(mOsmol/kg H₂O), 보다 바람직하게는 230-370(mOsmol/kg H₂O), 보다 더 바람직하게는 260-340(mOsmol/kg H₂O), 그리고 가장 바람직하게는 280-320(mOsmol/kg H₂O)을 유지한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 배지를 이용하여 배양된 줄기세포는 장기간 높은 증식능을 가진다.

줄기세포는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화세포를 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 줄기세포는 포유동물에서 유래된 줄기세포이고, 바람직하게는 포유동물의 피부, 양막, 제대혈 또는 골수에서 유래한 줄기세포이며, 가장 바람직하게는 태아의 피부조직-유래된 피부줄기세포이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물은 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 포유동물은 인간이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 줄기세포는 피부줄기세포이다. 본 명세서의 용어, 피부줄기세포는 피부(표피, 진피, 피하지방층)을 이루는 세포로 분화될 수 있는 줄기세포를 의미한다. 상기 피부를 이루는 세포는 표피에 존재하는 케라티노사이트(keratinocyte), 멜라노사이트(melanocyte), 그리고 진피에 존재하는 섬유아세포(콜라겐 및 엘라스틴의 생합성을 주로 담당)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 배양된 줄기세포(바람직하게는, 피부줄기세포)는 80일 이상 동안 높은 증식능을 나타냈으며(참고: 도 1 및 도 3), 15계대 이상 동안 피부줄기세포 고유의 형태를 유지하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 배양된 피부줄기세포는 피부줄기세포의 표지인자의 발현이 양성인 세포이고, 보다 바람직하게는 CD29, CD44, CD49C, CD73 또는 CD105의 발현이 양성인 세포이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 배양방법에 따라 제조된 줄기세포 배지를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로써 상술한 본 발명의 배지를 포함하고 이를 이용하여 제조되기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 줄기세포 배지의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다. 본 명세서에서 용어 화장품학적 유효량은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명에서 인간의 피부줄기세포 배지를 유효성분으로 하는 화장품은 표 2에 제시된 성분으로 제조하였다. 제조된 화장품의 효능 검증은 상기의 개발된 배양액을 이용하여, 피부 진피층을 구성하는 섬유아세포에 대한 세포 활성 효능을 평가하여 주름형성 완화기능을 세포수준에서 분석하였으며, 미백기능의 유효성 평가는 개발된 화장품의 주요 조성물인 피부줄기세포 배지에서 멜라닌 색소 합성 억제능력을 측정하여 미백효과를 세포수준에서 측정하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의한 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부재생, 미백, 피부탄력 개선, 피부노화 방지 또는 피부보습 개선, 검버섯 제거, 여드름 치료 및 상처 제거를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 멜라닌의 합성을 억제한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 줄기세포, 바람직하게는 피부줄기세포의 증식 촉진용 배지, 이를 이용한 배양방법, 그리고 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 배지는 무기염류, 무기염류, 비타민, 아미노산, 지질 및 세포의 에너지원로 이루어진 영양성분을 포함하며, pH 7.2-7.6 및 280-320(mOsmol/kg H2O) 삼투압을 유지하도록 제조한다.

(c) 본 발명의 배지를 이용하여 배양된 줄기세포, 바람직하게는 피부줄기세포는 증가된 증식능을 나타낸다.

(d) 또한, 상기 조성물은 피부줄기세포에서 멜라닌 합성을 억제한다.

(e) 따라서, 본 발명의 줄기세포 배지를 유효성분으로 포함하는 조성물은 화장품, 의약 및 의약외품에 매우 효과적으로 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 제조된 줄기세포 배양액의 피부줄기세포가 장기간(80일 이상) 증식능과 고유형태를 유지하고 있음을 나타내는 결과이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 배지에서 배양된 피부줄기세포가 줄기세포-특이적 표지인자의 발현 패턴을 나타내는 결과이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 배양된 인간 섬유아세포의 증식 및 활성 촉진을 테스트한 결과이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 인간 피부줄기세포 증식용 배지의 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 배지의 제조

본 발명에서 배지의 성분개발 및 제조를 위한 배지의 조성은 표1과 같다. 제시한 각 성분의 함량을 초순수 정제수에 혼합하여 충분히 용해시켜 제조한다. 배지의 성분은 대한민국 식약청에서 고시한 화장품원료집에 등재되어 있는 물질을 사용한다.

본 발명의 배지 제조과정에서 물에 용해도가 낮은 아미노산과 일부의 성분들은 염산, 수산화나트륨, 알콜 등을 사용하여 용해시킨 후 첨가하였다. 모든 성분들이 녹은 것을 확인하여 0.22 ㎛ 여과기로 여과시킨 후 4℃에 보관하며 세포의 배양과 화장품 제조에 사용하였다.

또한, 본 발명의 배지의 제조에 있어서 완성된 배지의 pH는 7.2-7.6 사이를 유지하며, 삼투압은 280(mOsmol)에서 320(mOsmol) 사이를 유지하고, 고농도의 화장품의 조성물로 사용하기 위하여 2배에서 10배 사이의 농축액으로 제조한 후 다른 조성물과 혼합하여 사용하였다.

피부줄기세포 배양용 배지의(SM-C01) 조성과 함량.

성분명칭	화장품원료집 명칭	gram/1liter
Sodium chloride	소듐클로라이드	6.575900
Sodium hydrogen carbonate	소듐바이카보네이트	2.225600
Potassium chloride	포타슘크로라이드	0.300000
Calcium chloride dihydrate	칼슘클로라이드	0.214500
Magnesium sulfate (heptahydrate)	마그네슘설페이트	0.052800
Sodium dihydrogenphosphate	소듐포스페이트	0.121500
Magnesium chloride	마그네슘 클로라이드	0.028600
Zinc sulfate	징크설페이트	0.000645
Ferric sulfate(heptahydrate)	페러스설페이트	0.001225
Cupric sulfate(pentahydrate)	키퍼설페이트	0.000002
D-glucose	글루코오스	1.500000
Sodium pyruvate	소듐피루베이트	0.330000
L-arginine-hydrochloride	알지닌	0.147500
L-tyrosine sodium,-hydrate	타이로신	0.067080
L-lysine-hydrochloride	라이신	0.091250
L-leucine	류신	0.070800
L-isoleucine	이소류신	0.065400
L-threonine	트레오닌	0.064200
L-valin	발린	0.063420
L-phenylalanine	페닐알라닌	0.042600
L-histidine hydrochloride, hydrate	히스티딘에이치씨엘	0.037800
L-serine	세린	0.031500
Glycine	글라이신	0.022500
L-cysteine hydrochloride, hydrate	시스테인 에이치씨엘	0.058800
L-methionine	메치오닌	0.020700
L-proline	프롤린	0.020700
i- Inositol	이노시톨	0.015120
L-tryptophane	트립토판	0.010800
L-asparagine-monohydrate	아스파라긴	0.009000
L-glutamic acid	글루타믹애씨드	0.008820
L-asparatic acid	아스파틱애씨드	0.007800
L-alanine	알라닌	0.005340
Folic acid	폴릭애씨드	0.003975
D-calcium pantothenate	칼슘판토테네이트	0.003375
Thiamine-HCl	티아민에이치씨엘	0.003225
Pyridoxine-HCl	피리독신에이치씨엘	0.003045
Niacinamide	나이아신아마이드	0.003030
Vitamine B12	사이아노코발라인	0.001050
Rivoflavin	리보플라빈	0.000330
Lipoic acid	치오틱애씨드	0.000158
Linoleic acid	리놀레익애씨드	0.000060
D-biotin	바이오틴	0.000006

실험예 1: 제조된 배지에서 인간의 피부줄기세포의 배양 시 성장곡선과 배양중인 피부줄기세포의 형태

인간 피부 줄기세포는 유산된 태아조직으로부터 분리하였다. 치료목적으로 유산된 적출물의 태아 피부조직에 동일 부피의 PBS로 세척하고 피부조직만을 얻어 낸 뒤 이 조직을 37℃, 5% CO₂, 배양기에서 60분간 0.01 % 콜라게나아제로 효소처리한 후 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하여 줄기세포를 포함한 세포 분획을 수득하였다. 펠렛을 인산화 완충용액으로 세척하고 100 ㎛ 메쉬 사이즈의 여과기를 통해 순수 세포만을 수획하였다. 이후, PBS 세척된 세포를 DMEM(Dulbeccos modified eagles medium, Invitrogen), 10% 우태아혈청(FBS, Hyclone), 1% 페닐실린 스트렙토마이신(Invitrogen)이 포함된 배양액으로 37℃, 5% CO₂, 배양기에서 24시간 배양 후 비-접착성 세포들을 배양액 교환을 통해 제거 한 후 줄기세포를 분리하였다(Agostini 외 3인, Dev Biol Stand, 46:5, 1980). 분리한 줄기세포가 10⁴ cells/ml이 되도록 세포 부유액 5 ml을 T25 플라스크에 옮겨 상기 조건에서 1차 배양하여 얻은 피부줄기세포를 발명된 배지의 유효성 평가에 사용하였다.

본 발명에서 제조된 배지에서 줄기세포의 배양은 상기의 실시예 1에 따라 제조된 배양액에 10% 우태아혈청, 1% 페니실린 스트렙토마이신을 첨가하였다. 성장인자로 EGF는 200 ng/ml, bFGF는 20ng/ml의 농도로 첨가하였다.

본 발명에서 피부줄기세포 배지의 세포 성장 촉진 유효성을 확인하기 위해 세포의 성장속도와 증식능은 세포계수기 헤마토사이토메터를 이용하여 피부줄기세포의 수를 측정하여 분석하였다.

구체적인 줄기세포의 배양과정은, 제조된 배지 15 ml에 2 X 10⁵ cells의 피부줄기세포를 넣어 T75 플라스크에서 37℃, 5% CO₂, 배양 후 4일 간격으로 계대 배양하며 이때 계수된 세포의 수를 통해 세포의 성장속도를 측정하였다. 결과적으로, 줄기세포 배지에서 피부 줄기세포는 80일 이상 높은 증식능을 나타냈으며, 피부줄기세포 고유의 형태로 관찰되었다(도 1).

실험예 2: 배양된 세포의 피부줄기세포 표지인자 발현특성 분석

본 발명에서 배양된 세포의 피부줄기세포 표지인자 발현특성 분석은 15회의 계대배양 이후 나타나는 피부 줄기세포의 표면 마커를 유세포분석기(Flowcytometry)를 이용하여 측정 하였다.

간략하게 살펴보면 다음과 같다. 도 2와 같이, CD34, CD45, HLA-DR의 조혈모세포의 표면마커에서는 5% 이내의 음성으로 나타났으나(Loken 외 3인, Pathol Immunopathol Res. 7(5):357,1988) CD29, CD44, CD49C, CD73, CD105(Nakagawa 외 4인, Br J Dermatol 153(1):29 2005; Han 외 4인, Biochem Biophys Res Commun. 7;413(4):561, 2011)의 5가지 피부줄기세포의 표면마커는 95% 이상으로 강하게 보이며 15계대가 지나더라도 줄기세포 배양액 하에서 그 특징이 유지되는 것을 관찰할 수 있었다.

실험예 3: 주름개선 유효성 평가

본 발명에서는 줄기세포 배양액의 세포 성장 촉진 유효성을 확인하기 위해 단위시간 내 세포수의 변화를 섬유아세포 배양법으로 측정하였다.

구체적으로, 대조군인 DMEM 배양액과 줄기세포 배양액 5 ml에 각각 10⁴ cells의 섬유아세포를 T25 플라스크에 넣고 37℃, 5% CO₂, 배양기에서 24시간과 48시간 배양후 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA) 용액을 이용하여 모든 세포를 수획하여 계수하였다. 그 결과, 줄기세포 배양액에서 배양한 세포의 숫자가 대조군인 DMEM보다 24시간, 48시간 및 72시간 후 각각 108.99%, 125.24% 및 160.2%로 증가되었다.

실험예 4: 미백 유효성 평가

본 발명에서는 줄기세포 배양액의 멜라닌 분비 억제효과의 측정을 위해 멜라닌 분비세포가 포함된 피부줄기세포를 이용하여 48시간 후 분비되는 멜라닌의 양을 흡광분석기를 이용하여 측정하였다(Dieckmann 외 4인, Exp Dermatol. 19(6):543-5. 2010)

구체적으로, 대조군인 DMEM 배양액과 줄기세포 배양액 5 ml에 각각 10⁴ 피부줄기세포를 T25 플라스크에 넣고 37℃, 5% CO₂, 배양기에서 24시간 배양 후 세포만을 수획하여 에탄올에 녹였다. 이 과정에 있어 줄기세포 배양액의 멜라닌 합성 저해 효과의 감소치를 측정하기 위해 DMEM 배양액에 알부틴 0.001%를 첨가한 후 동시에 진행하였다. 에탄올에 녹인 시료들을 각각 PBS에 희석한 후 타이로시나아제(tyrosinase)와 섞고 37℃에서 6분간 반응 시킨 후 이 용액에 0.06 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)액을 첨가한 후 37℃에서 1분간 반응시켰다. 이 용액을 96-웰 디쉬에 넣은 후 판독기(microplate reader)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, DMEM 단독 처리군이 100의 멜라닌 합성율을 보일 때 줄기세포 배지는 66.1%의 멜라닌 합성율을 보였는데, 이는 알부틴 0.001%를 첨가한 DMEM 군의 62.2%와 유사한 멜라닌 합성 저해율을 나타냄을 확증하는 결과이다.

실시예 2: 제조된 배지를 조성물로 한 화장품의 제조

화장품의 제조성분 비율.

원재료 구분	원료농도	실시예 2-1	실시예 2-2	실시예 2-3	실시예 2-4
SM - C01 (10X)	10X	5.00%	5.00%	3.00%	10.00%
Serum Protein-P	100X	0.20%	0.20%	0.20%	1.00%
Serum Protein-L	100X	0.10%	0.10%	0.10%	0.50%
SM - C01 (1X)	1x	1.70%	1.70%	1.70%	0.00%
-glucan	1%	30.00%	30.00%	30.00%	0.40%
Oligo-Hyaluronic Acid		0.10%	0.10%	0.10%	0.50%
1,2-헥산디올		0.50%	0.50%	0.50%	0.00%
레몬껍질오일		0.02%	0.02%	0.02%	0.00%
정제수		16.24%	21.08%	44.79%	84.60%
갈조추출물	1X	45.00%	40.00%	0.00%	0.00%
Adenosine		0.04%	0.00%	0.04%	0.00%
에탄올		1.00%	1.00%	0.00%	0.00%
C11-15파레스-12		0.06%	0.06%	0.00%	0.00%
피이지-40하이드로제네이티드캐스터오일		0.04%	0.04%	0.00%	0.00%
상백피		0.00%	0.10%	0.00%	0.00%
고삼		0.00%	0.10%	0.00%	0.00%
shea butter	100%	0.00%	0.00%	5.00%	0.00%
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드		0.00%	0.00%	7.00%	0.00%
세테아릴올리베이트		0.00%	0.00%	3.50%	0.00%
소르비탄올리베이트		0.00%	0.00%	3.50%	0.00%
하이드로제네이티드레시틴		0.00%	0.00%	0.50%	0.00%
토코페롤아세테이트		0.00%	0.00%	0.05%	0.00%
EGF	20g/ml	0.00%	0.00%	0.00%	1.00%
bFGF	2g/ml	0.00%	0.00%	0.00%	1.00%
EURO-Napre	1%	0.00%	0.00%	0.00%	1.00%
합 계		100.00%	100.00%	100.00%	100.00%

본 발명에서 제조된 배지를 조성물로 한 화장품의 제조는 스킨세럼(실시예 2-1), 두피에센스 및 양모제(실시예 2-2), 영양크림(실시예 2-3), 스킨에센스(실시예 2-4)의 형태로 제조되었으며, 실시예 2에 제시된 성분을 혼합하여 제조하였다.

본 발명의 조성물로 제조되는 화장품의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 스킨세럼, 스킨크림, 스칼프세럼, 스킨에센스, 화장수, 영양크림, 에센스, 아이에센스, 아이크림, 로션 또는 팩 등을 예시할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장품 조성물은 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 초순수 증류수, 합성혈청, 세포활성인자, 영양성분, 보습제, 점증제, 천연방부제, pH조절제, 향료 등을 임의로 추가할 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물의 pH는 6.0 내지 8.0로 유지하는 것이 바람직하며, 이를 위해 pH조절제가 포함될 수 있다.

실험예 5: 피부줄기세포 배지를 성분으로 하는 화장 조성료의 미백 및 주름개선 관능 평가

스킨 에센스제형의 화장료에 대하여 보습, 미백, 주름 개선 및 피부자극 효과를 평가하기 위하여 하기와 같이 관능평가를 실시하였다. 피시험 대상은 25이상 55세 이하에 속하는 여성 20명으로 구성하였다. 피시험대상의 얼굴을 좌측과 우측으로 구분하여 우측의 얼굴에 실시예 2-4의 화장품 1 ml을 얼굴에 균일하게 도포하였으며, 좌측 얼굴은 피부줄기세포 배지, Serum protein-P, L, EGF, bFGF를 첨가하지 않은 대조군의 화장품을 동일하게 매일 도포하였으며, 시험 후 5일차 및 10일차에 관능 평가하도록 하였다. 보습효과, 주름개선 및 미백효과의 경우, 피시험자가 느끼는 효과가 매우 우수할 경우에는 5점, 전혀 효과가 없을 경우에는 0점으로 하여 평가하도록 하였다. 한편, 피부 자극 정도 및 사용감은 자극이 없거나 사용감이 우수한 경우를 0점, 자극이 심하거나 사용감이 나쁠 경우를 5점으로 평가하였다.

제조된 화장품의 미백 및 주름개선 관능 평가.

평가항목	5일차		10일차
	시험군	대조군	시험군	대조군
보습	3.4	2.5	4.5	2.6
주름개선	2.9	0.8	4.0	0.8
미백	1.5	0.2	3.2	1.2
피부자극, 사용감	0.1	0.1	0.0	0.1

상기한 표 3에 나타난 바와 같이, 시험군에서는 도포 후 시간이 경과함에 따라 보습, 미백 및 주름 개선 효과가 현저히 증가하였으나, 대조군에서는 주름개선 및 미백효과의 변화가 없었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

1. 무기염류 70-80 wt%, 비타민 0.05-0.40 wt%, 아미노산 3-15 wt%, 지질 0.001-0.004 wt% 및 세포의 에너지원 5-15 wt%로 이루어진 영양성분을 포함하는 피부줄기세포 배양 또는 증식용 배지로, 상기 배지는 pH 7.2-7.6 및 280-320(mOsmol/kg H₂O) 삼투압을 유지하고; 상기 무기염류는 소듐 클로라이드, 소듐 하이드로젠 카르보네이트, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드 디하이드레이트, 마그네슘 설페이트(heptahydrate), 소듐 디하이드젠포스페이트, 징크 설페이트(Zinc sulfate), 페릭 설페이트 및 쿠프릭 설페이트(cupric sulfate)이며; 상기 비타민은 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B9, 비타민 F 및 비타민 H이며; 상기 아미노산은 알지닌, 타이로신, 라이신, 류신, 이소류신, 트레오닌, 발린, 페닐알라닌, 히스티딘, 세린, 글라이신, 시스테인, 메치오닌, 프롤린, 트립토판, 아스파라긴, 글루타믹애씨드, 아스파틱애씨드 및 알라닌이고; 상기 지질은 리포익산(lipoic acid) 및 리놀레익산(linoleic acid)이며; 상기 에너지원은 글루코오스 및 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)인 것을 특징으로 하는 배지.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 1 항에 있어서, 상기 배지는 피부줄기세포의 증식능을 유지시키는 것을 특징으로 하는 배지.
   
9. 제 1 항 및 제 8 항 중 어느 한 항의 배지에서 피부줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 피부줄기세포의 배양방법.
   
10. 삭제
11. 제 9 항에 있어서, 상기 피부줄기세포는 80일 이상 증식능을 유지하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
    
12. 제 9 항에 있어서, 상기 피부줄기세포는 CD29, CD44, CD49C, CD73 또는 CD105의 양성 발현(positive expression)을 나타내는 것을 특징으로 하는 배양방법.
    
13. 제 1 항 및 제 8 항 중 어느 한 항의 줄기세포 배양용 배지에서 배양된 피부줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물로, 상기 피부상태 개선은 미백인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
14. 삭제
15. 삭제
16. 제 13 항에 있어서, 상기 피부줄기세포 배양액은 멜라닌의 합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
17. 삭제
18. 제 13 항에 있어서, 상기 조성물은 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.

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