KR102153636B1

KR102153636B1 - 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법

Info

Publication number: KR102153636B1
Application number: KR1020140007444A
Authority: KR
Inventors: 이상화; 김도형; 김효진
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2014-01-21
Publication date: 2020-09-08
Also published as: KR20150087047A

Abstract

본 발명은 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 글라브리딘(Glabridin)을 함유하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 증식 및 배양하여, 안정적으로 상기 줄기세포를 증식 및 배양할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 배양방법에 의해 배양된 줄기세포 배양액은 피부의 재생을 촉진시키고, 피부의 탄력과 주름을 개선하는 효과가 기대되어 피부 외용제 또는 화장료에 사용할 수 있다.

Description

줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법{Serum-free medium composition for stem cell culture and methods for culturing stem cell}

본 발명은 줄기세포의 배양을 위한 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 상기 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.

피부의 줄기세포는 피부의 건강과 생리학적 및 생화학적인 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 수행한다. 피부에 존재하는 줄기세포도 노화로 인하여 기능에 이상이 발생하게 되고, 이에 따라 피부의 항상성이 깨지면서 여러 가지 문제가 발생된다. 따라서 노화된 줄기세포를 다시 활성화시킨다면 피부의 나이를 역으로 돌리는 것과 같은 효과를 가져올 것이다.

피부는 외부로부터 표피, 진피 및 피하지방층의 3개의 층으로 구성되어 있다. 표피는 3개 층 가운데 가장 얇으며 부위에 따라 두께에 차이가 있다. 표피는 주로 각질 형성 세포로 구성되며, 이외에 멜라닌 색소를 생산하는 멜라닌 세포 및 면역학적 기능을 수행하는 랑게르한스 세포 등으로 구성되어 있다. 진피는 주로 교원질과 탄력섬유로 구성되는 결체조직 및 기질로 이루어지며, 그 속에 신경, 혈관, 림프관, 근육, 모낭, 피지선 및 땀샘선 등을 내포하고 있다.

발생학적으로 사람 피부의 모든 구성성분은 외배엽이나 중배엽에서 유래되는 것으로 알려져 있다. 표피, 모낭, 피지선 및 땀샘선 등은 외배엽에서 기원하며, 멜라닌 세포, 신경 및 특수 감각 수용체는 신경외배엽에서 유래된다. 신경외배엽에서 유래되는 멜라닌 세포는 발생 8 주 후 피부에 도달하며, 발생 4 내지 5 개월이 되면 수지상 돌기가 발달하여 주위 각질형성 세포로 멜라닌 소체를 이동시킨다. 이와 같이 발생학적 시기에 따라 배아의 줄기세포는 분화를 거듭하게 되며 각각 맡은 바 기능에 알맞은 특성을 갖게 된다. 성체가 된 후에도 일정수의 줄기세포는 조직에 남게 되는데 피부에서는 주로 두 곳에 줄기세포들이 존재한다. 첫째는 모낭(hair follicle)에 존재한다. 이곳은 세포분화가 일어나기 전의 세포로 표피의 재생과 관련해 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 털의 재생과 성장에도 중요한 역할을 수행하고 있다. 둘째는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)라고 불리는 표피의 기저층(the basal cell layer of epidermis)이다. 이곳에 자리하고 있는 줄기세포는 표피는 물론 진피층의 섬유아세포까지 관장하여 피부 건강을 지키는 중요한 역할을 수행하고 있음이 밝혀졌다. 이곳의 줄기세포는 양이 많고 쉽게 얻을 수 있다는 장점이 있어 피부줄기세포 연구에 널리 사용되고 있다. 피부는 지속적으로 재생(renew)되며, 피부의 상피에 존재하는 줄기세포 즉, 피부의 상피줄기세포(epidermal stem cells)는 상처 후 상피의 복구에 관여한다(비특허문헌 1 참조). 상기 피부의 상피줄기세포는 피부줄기세포(skin stem cells)로도 칭해지며, 상기 피부줄기세포를 활성화시킬 경우, 외상 등의 피부상처를 치료하거나 상처치료를 촉진할 수 있으며 피부의 주름완화 또한 기대할 수 있다. 피부줄기세포의 지표로는 인테그린β1(integrin β1) 및 인테그린 α6(integrin α6)이 사용되고 있고, 상피 형태 형성 및 분화에 필요한 피부줄기세포의 유지는 p63 단백질에 의해 조절된다고 보고되고 있다.

한편, 인간의 피부줄기세포를 이용하는 약학 조성물 또는 화장료 조성물로 개발하기 위해, 오염가능성을 최소화하면서 안정적으로 상기 피부줄기세포를 증식 및 배양하는 것이 필요하다. 종래에 알려져 있는 인간의 피부줄기세포의 배양방법은, 5 내지 20%의 소태아혈청(Fetal bovine Serum) 즉, 혈청 함유 배지의 사용을 포함한다. 상기 소태아혈청은 알부민 등의 고분자단백질 및 영양분 등을 함유하고 있으며, 호르몬이나 부착 인자와 같은 세포배양에 필요한 성분들을 함유하고 있다. 소태아혈청은 또한 인슐린 또는 EGF 등의 성장인자를 가지고 있으며, 배지의 독성성분을 중화시키는 역할을 하기도 한다. 그러나 소태아혈청에는 미확인된 미량성분이 있으며, 이러한 미량성분들이 세포의 성장에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 소태아혈청 내의 미량성분들은 분석이 매우 어려울 뿐 만 아니라, 생산시기나 장소에 따라 그 성분이 달라질 수 있으므로, 재현성 있는 시험 및 생산공정을 확립하는데 상당한 곤란성을 야기한다. 또한, 소태아혈청은 동물에서 채취되므로 광우병 등의 동물 질병이나 바이러스 등의 다른 요인으로부터의 오염에 대한 위험성을 갖고 있다. 나아가, 세포배양을 통한 생산물을 이용하고자 할 때, 혈청 성분들을 정제가 어려워 공정이 복잡해지는 경우가 많다.

따라서, 소태아혈청과 같은 이종 유래의 혈청이 없는 즉, 무혈청 배지 중에서 인간 유래의 피부줄기세포를 안정적으로 증식 및 배양할 수 있는 방법을 개발하는 것이 당업계에 요구되고 있다.

Cedric Blanpain and Elaine Fuchs, "Epidermal Stem Cells of the Skin", Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2006. 11, vol. 22, pp. 339-373

이에, 본 발명자들은 천연물 유래의 다양한 화합물들을 대상으로 줄기세포, 구체적으로, 피부줄기세포를 무혈청 배지 조건에서 증식 및 배양할 수 있는 화합물을 연구하였다. 그 결과, 글라브리딘(Glabridin)을 함유하는 무혈청 배지 조건에서 줄기세포가 효과적으로 증식 및 배양된다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 글라브리딘(Glabridin)을 포함하는 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 상기 글라브리딘(Glabridin)을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 전술한 줄기세포 배양방법으로 배양된 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 피부 외용제를 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 전술한 줄기세포 배양방법으로 배양된 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 글라브리딘(Glabridin)을 함유하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 증식 및 배양하여, 안정적으로 상기 줄기세포를 증식 및 배양할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 배양방법에 의해 배양된 줄기세포 배양액은 피부의 재생을 촉진시키고, 피부의 탄력과 주름을 개선하는 효과가 기대되어 피부 외용제 또는 화장료에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 줄기세포의 배양을 위한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(이하, 화학식 1의 화합물이라 한다.)의 용도, 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 화합물은 가능한 모든 이성질체를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 하기 화학식 2의 화합물을 포함할 수 있다.

[화학식 2]

상기 화학식 2의 화합물은 글라브리딘(Glabridin)이다.

상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물은 합성하여 이용하거나, 시판되고 있는 화합물을 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 '줄기세포'는 스스로 세포 분열을 할 수 있고, 매우 다양한 형태의 특이 세포 타입(specific cell type)으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포이다. 이러한 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 한 구체예에서, 상기 줄기세포는 피부줄기세포일 수 있다. 상기 '피부줄기세포'는 피부(표피, 진피 및 피하지방층)를 이루는 세포로 분화될 수 있는 줄기세포를 의미한다. 상기 피부를 이루는 세포는 표피에 존재하는 케라티노사이트(keratinocyte), 멜라노사이트(melanocyte) 및 진피에 존재하는 섬유아세포(콜라겐 및 엘라스틴의 생합성을 주로 담당)를 포함한다.

상기 피부줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 피부줄기세포는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있다. 예를 들어, 피부줄기세포는 공지의 피부줄기세포 공급원, 예를 들어, 모낭 또는 표피의 기저층에서 얻을 수 있으며, 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 한 구체예에서, 포유동물은 인간, 마우스, 랫트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 또는 고양이를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게 포유동물은 인간일 수 있다. 이러한, 피부줄기세포 공급원으로부터 피부줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에서 잘 알려져 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물은 무혈청 배지(serum-free)이다. 무혈청 배지는 인간을 포함한 동물로부터 유래된 혈청(동물 유래 혈청)을 일정 함량 이상 함유하지 않는 임의의 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 무혈청 배지는 동물 유래 혈청을 총 조성물 함량 대비 0.1 중량% 미만 또는 0.01 중량% 미만으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 동물 유래 혈청을 함유하지 않을 수 있다.

줄기세포를 배양하기 위한 일반적인 배지는 당업계에 공지되어 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하며, 줄기세포의 배양 시 동물 유래 혈청을 약 5 내지 20% 정도 포함하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다. 그러나, 동물 유래 혈청은 미확인된 미량성분을 포함하므로, 세포의 성장에 영향을 미치며, 분석이 어렵고, 재현성 있는 시험 및 생산공정을 확립하는데 어려움이 있었다.

본 발명에서는 줄기세포의 증식 및 배양을 위해 필요한 동물 유래 혈청 대신 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 동물 유래 혈청을 대체 가능할 정도로 줄기세포를 안정적으로 증식 및 배양할 수 있고, 재현성 있는 시험 및 생산공정의 확립이 가능하다.

상기 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물에서 화학식 1의 화합물의 농도는 특별히 제한되지 않으며, 1 내지 500 μM의 범위로 조절될 수 있다.

본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명에서 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 피부줄기세포일 수 있으며, 무혈청 배지는 앞에서 전술한 바와 같다.

상기 화학식 1의 화합물의 농도는 특별히 제한되지 않으며, 배지 내에서 1 내지 500 μM의 범위로 조절될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명에 따른 줄기세포의 배양방법은,

(1) 동물 유래 혈청을 함유하는 배지에서 피부줄기세포를 배양하는 단계; 및

(2) 단계 (1)에서 배양된 피부줄기세포를 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 피부줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 좋다. 본 발명에서는 일반적으로 세포배양에 사용하는 CNT-57, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium)을 사용하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다.

혈청은 0.1 내지 20％의 소태아혈청(FBS)을 첨가하는 것이 좋고, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.

또한, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다.

항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 폰지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.

필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 70 내지 80％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 75％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대 배양을 한다.

상기 단계에서 배양된 피부줄기세포를 화학식 1의 화합물이 첨가된 무혈청 배지에서 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 배양할 수 있다.

상기 무혈청 배지는 혈청을 포함하지 않는 초기단계 세포배양을 위한 배지로서 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 무혈청 배지는 상기 배지에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다.

상기 성장인자로 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 또는 PDGF 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 사이토카인으로 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-10 또는 IL-17 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 화학식 1의 화합물이 첨가된 무혈청 배지에서 배양된 피부줄기세포 배양액은 유효성분이 고농축으로 존재할 수 있으며, 예컨대, Decorin, MCP-1, DKK-3, TIMP-2, Angiogenin, Follistatin, Osteoprotegerin, betaIG-H3, MMP-10, MMP-7, LYVE-1, XEDAR, IL-22, RANK, IGFBP-6, Axl, FLRG, NRG1-beta1, PAI-1, Ferritin, Galectin-7, Resistin, Bate2 M, TSLP, VEGF-C, CD40, sTNT R1, IL-6, TRAIL R2, Osteopontin, TIMP-1, Growth Hormon, Thromboppoietin, CXCL-16, DPPIV, HVEM, IL-17B, IL-3, bFGF, IFN-γ, TGF, HGF 또는 PDGF 등이 포함될 수 있다.

한국등록특허 제10-1026070호에서는 무혈청 배지에서 배양된 피부줄기세포가 피부 섬유아세포의 콜라겐 발현을 촉진하여 주름개선에 효과가 있음을 제시하고 있다. 이를 통해, 본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 배양된 피부줄기세포 배양액 또한, 피부 재생 또는 주름개선에 효과가 있을 것으로 예측할 수 있다.

따라서, 본 발명의 줄기세포의 배양방법에 따라 얻을 수 있는 피부줄기세포 배양액은 상술한 유용성분을 통해 피부 재생 또는 주름개선을 위한 피부 외용제 또는 화장료 등의 유효성분으로 사용할 수 있다. 상기 배양액은 분획물로 이용될 수도 있다.

상기 배양액을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

상기 배양액이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

상기 배양액을 화장품으로 사용하는 경우, 상기 배양액을 유효성분으로 함유하여 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 또는 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수; 훼이셜 로션 또는 바디로션 등과 같은 유액; 영양 크림, 수분 크림 또는 아이 크림 등과 같은 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제; 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.

또한 상기 화장품은 상기 배양액에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

상기 배양액은 화장품으로 제품화되는 경우에 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제 또는 세정제와 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 배양액을 포함할 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림 또는 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 화학식 1의 화합물을 포함해도 무방할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 상기 배양액을 전체 조성물 중량에 대하여 0.000001 중량% 내지 10 중량%(바람직하게는 0.001 중량% 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%)로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 상기 배양액을 0.000001 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부 재생 또는 주름 개선 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 알러지 등 원치 않는 반응이 발생하거나 피부 안전성에 문제가 있을 수 있으므로 이를 방지하기 위한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 1> 글라브리딘 ( Glabridin )의 물질 정보

[화학식 2]

Glabridin, 4-[(3R)-3,4-Dihydro-8,8-dimethyl-2H,8H-benzo[1,2-b:3,4-b']dipyran-3-yl]-1,3-benzenediol, (R)-4-(3,4-Dihydro-8,8-dimethyl-2H,8H-benzo[1,2-b:3,4-b']dipyran-3-yl)-1,3-benzenediol

CAS No.: 59870-68-7

구입처: Sichuan Hongjie Import&Export CO., LTD

< 실시예 1> 무혈청 배지조건에서 피부줄기세포의 배양

Cellntec 사에서 구입한 인간 피부줄기세포(Human epidermal stem cell)를 48-웰 플레이트(6×10³cells/well)에, 소태아혈청(fetal bovine serum)과 유사한 BPE(Bovine pituitary extract)가 첨가된 CNT-57 배지(Cellntec사)를 이용하여 24 시간 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액을 흡입관을 통하여 제거한 다음, PBS 용액(GibcoBRL 사)을 이용하여 배지 성분을 제거하고, BPE가 포함되지 않은 CNT-57 배지에 화학식 2의 화합물 20 ㎍/mL을 처리하여 5％ CO₂ 및 37℃ 조건에서 72 시간 동안 배양하였다.

< 실험예 1> CCK -8 평가법을 통한 피부줄기세포 증식 촉진 효과

실시예 1에서 배양된 피부줄기세포에 CCK-8(Cell counting kit-8) 평가를 실시하였다. CCK-8 평가는 세포 내 전자전달계 내의 탈수소효소(Dehydrogenase)가 테트라졸리움 염(Tetrazolium Salt)를 분해하여 생성하는 포르마잔(Formazan)의 흡광도를 측정하여 살아있는 세포의 밀도를 간접적으로 나타내는 분석방법이다.

세포에 CCK-8 용액(배지부피의 1/10을 처리)을 37℃에서 2 시간 동안 처리한 후, 파장 450 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 분광학적으로 측정하였다. 화학식 2의 화합물의 피부줄기세포의 증식 촉진 효과는 측정된 흡광도 값으로부터 대조군(BPE 첨가한 CNT-57 배지) 대비 하기 수학식 1에 따라 증식율(%)을 구하고, 그 값을 하기 표 1에 나타냈다.

[수학식 1]

증식율(%) = (시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도) × 100

피부줄기세포의 증식 촉진 효과

첨가시료	농도	대조군 대비 세포 증식율(%)
화학식 2의 화합물	20 ㎍/mL	104
대조군	-	100

상기 표 1의 결과에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 화학식 2의 화합물을 처리한 배지조건에서의 피부줄기세포는 우수한 증식 촉진 효과를 나타내었다.

< 실험예 2> 피부줄기세포의 줄기세포성( stemness ) 유지 효과 확인

실시예 1에서 배양된 피부줄기세포의 줄기세포성 유지 효과 확인을 위해 p63 발현 정도를 평가하였다. p63은 세포 내 전사인자로서 피부줄기세포의 유지 마커로 잘 알려져 있다. 세포의 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 다음, Taqman 염색액으로 실시간-PCR을 수행하여 p63의 발현 정도를 측정하였다. 본 실험에서 RNA의 농도는 S16 리보솜 RNA로 표준화하였다.

상기 실험 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2에서 p63 증가 배수의 수치는 대조군(BPE 첨가한 CNT-57 배지) 대비 배수를 의미한다.

줄기세포성(stemness) 유지 효과(반복수 = 3)

첨가시료	농도	p63 증가 배수(배)
화학식 2의 화합물	20 ㎍/mL	4.75
대조군	-	1.0

상기 표 2의 결과에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 화학식 2의 화합물을 처리한 배지 조건은 피부줄기세포의 p63 발현을 촉진하여 줄기세포성 유지 효과가 우수하다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 피부줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물:
[화학식 1]
삭제
제1항에 있어서,
화학식 1의 화합물은 1 내지 500 μM의 농도로 포함되는 피부줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 피부줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 피부줄기세포의 배양방법:
[화학식 1]
삭제
제4항에 있어서,
화학식 1의 화합물은 1 내지 500 μM의 농도로 포함되는 피부줄기세포의 배양방법.
제4항에 따른 피부줄기세포의 배양방법으로 배양된 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 피부 외용제.
제4항에 따른 피부줄기세포의 배양방법으로 배양된 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물.