KR101627151B1 - miRNA21 형질전환 조절로 인한 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 주름개선 관련 성장인자의 발현 제어 및 분비를 촉진하는 성장인자 대량 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 관한 것으로,
miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 배양하여, 안정적으로 상기 줄기세포를 증식 및 배양할 수 있으며, 특히, 중간엽 줄기세포의 성장인자의 측분비 효과를 극대화하여 인간 성장인자를 대량으로 얻을 수 있다.

Description

miRNA21 형질전환 조절로 인한 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 주름개선 관련 성장인자의 발현 제어 및 분비를 촉진하는 성장인자 대량 생산방법{controlled the expression and the production of growth factors of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells by miRNA21 transfection}

본 발명은 miRNA21이 형질주입된 지방 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로 miRNA21 형질주입을 이용하여 줄기세포에서 분비되는 성장인자 중에서 특정 기능과 관련된 성장인자의 발현을 높이는 것에 관한 것이다.

줄기세포는 1960년 대에 캐나다 Ontario cancer institute의 Ernest A. McCulloch와 James E. Till에 의해 발견되었으며, 무한 자기복제 능력과 정상 염색체 유지 및 다양한 세포로의 분화능력을 갖고 있는 세포를 의미한다. 줄기세포의 유래에 따라 성체 줄기세포와 배아 줄기세포 및 그리고 최근에 개발된 역분화 줄기세포 등으로 나누어지는데 윤리적 논란이 있는 배아 줄기세포와 안전성이 확인되지 않은 역분화 줄기세포보다는 성체 줄기세포를 활용한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

성체 줄기세포는 살아있는 동안 끊임없는 세포분열을 통해 증식과 여러 가지 세포활성화 물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킴으로써 유해한 환경에 따른 세포들의 노화를 억제한다고 알려져 있다. 성체 줄기세포의 가장 중요한 생물학적 역할은 손상된 조직을 재생시키는데 있고, 평소에도 손상을 입자 않도록 꾸준히 복구하며 여러 가지 생리-생화학적인 일들을 하고 있으나 조직이 크게 손상된 경우 줄기세포들은 여러 가지 복부방법으로 손상된 부위를 빠르게 복구할 수 있다. 줄기세포를 피부에 적용하고자 하려는 아이디어는 다음 두 가지 실험에서 얻어졌는데, 쥐를 이용한 실험에서 손상된 조직에 줄기세포를 투여하면 손상된 부위가 복구될 수 있으며, 손상된 모낭은 줄기세포를 투여하면 새로운 털이 자라는 것을 볼 수 있다는 실험결과에서 줄기세포의 항노화, 항염증, 상처치유는 물론 탈모방지나 육모 등에 이용하려는 시도로 이루어지고 있다.

다양한 성체줄기세포 중에서 지방 유래 줄기세포는 성형목적의 지방흡입술 같은 처치 후에 상대적으로 쉬운 획득방법과 빠른 증식속도와 조직 재생효과를 보이는 혈관내피세포성장인자(VEGF), 상피세포성장인자(EGF), 인슐린유사성장인자(IGF), 간세포성장인자(HGF), 형질전환성장인자베타(TGFβ) 같은 성장인자들의 충분한 생산량 등의 이유로 최근에 치료목적의 사용이 늘어나고 있는 추세이다. 또한 지방 유래 줄기세포 및 그 배양액을 화장품의 원료로 적용한 최근의 연구에 따르면 항주름 효과를 보고 하였다.

microRNA(miRNA)는 전사 후 조절과정(posttranscriptional regulation)에서 유전자의 발현을 조절하여 세포증식(proliferation)과 사멸(apoptosis), 발생(development), 분화(differentiation), 종양형성(tumorigenesis), 형태발생(morphogenesis), 조혈과정(hematopoiesis) 및 면역반응(immune reaction) 등 거의 모든 생명현상에 관여하여 세포의 운명과 항상성을 유지한다. miRNA의 발현은 세포 특이적, 질환 특이적 조건에 따라 miRNA pool이 변화한다. 또한 miRNA의 전사 후 조절과정을 통한 유전자 발현의 변화는 암을 포함한 다양한 질병의 발병기전과 밀접한 연관이 있다. DNA 염기서열의 변화(돌연변이, mutation)로만 질병이 발생되지 않을 뿐만 아니라 DNA 염기서열의 변화 없이도 유전자 발현이 변화될 수 있음이 밝혀졌고(후성학, epigenetics), non-coding DNA로부터 전사된 작은 사이즈의 non-coding RNA의 발견 및 mRNA의 단백질로의 번역(translation)을 조절하는 생물학적 기능이 알려지면서 세포의 기능·운명을 조절하는 새로운 조절자로 non-coding RNA의 하나인 miRNA의 연구가 가속화 되었다.

줄기세포에서 분비되는 성장인자들 중에서 신생혈관의 재생을 촉진시키는 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 및 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)의 분비양을 촉진시키기 위해 혈관내피세포 표적 miRNA로 알려진 miRNA-126을 형질주입하여 허혈성 질환에 적용하였더니 줄기세포의 생존력 향상과 신생혈관재생 관련 인자들의 발현을 촉진시켰다(비특허논문 1).

화장품 산업은 기술적 측면에서 화학, 생물학, 생리학 및 약학 등의 기초과학과 응용 기술이 복합적으로 적용되는 분야로, 기술집약적이고 고부가가치 산업이다. 오늘날 화장품은 사람의 피부에 직접 사용하는 제품으로써, 피부에 대한 안전성, 효능 및 사용 편의성 등을 갖추어야 하며, 아름다움을 가꾸는 미적 기능뿐 아니라 피부를 보호, 청결, 보습, 유연 및 피부 생리적 기능을 유지하는 생물학적 기능 또한 갖추어야 한다. 이 점에서, 최근 기능성이 높은 줄기세포에서 분비되는 성장인자들을 화장품에 적용하여 기능성이 높은 제품을 개발하고자 하는 시도들이 꾸준히 화장품 업체와 관련 소재개발 바이오 기업들을 중심으로 진행되고 있다.

주름의 주원인은 피부노화인데, 이는 다시 내재적 요인인 자연노화와 대표적 외재적 요인인 광노화로 나누어진다. 피부의 광노화는 얼굴과 목, 손 등에 자외선노출에 의하여 필연적으로 발생되며, 흡연 및 유해한 화학물질들부터의 노출로 인한 외재적 요인으로부터도 피부노화가 진행된다. 주름의 깊이, 거칠기, 건조도, 이완도, 색소성의 정도로 피부노화가 구분되며, 진피층에 자외선을 받으면 진피 섬유아세포로 하여금 콜라게나아제의 형성과 유전자의 발현을 도와서 결국 콜라겐이나 엘라스틴 같은 탄력섬유의 감소 같은 세포재생능력의 저하를 초래하여 발생된다고 알려져 있다. 상피세포층의 감소와 각질형성세포의 이형성이 전형적인 병리학적 피부 노화소견의 결과이다.

상피세포성장인자(Epidermal growth factor, EGF)는 피부의 주름을 줄이고 상처 후 재생을 효과적으로 돕는다고 보고되었다(비특허문헌 2). 또한, 재상피화(re-epithelialization)와 결합 조직 재생(connective tissue regeneration)에도 중요하며 줄기세포의 피부조직세포로의 분화에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

자외선 조사(UV irradiation)는 (100~400nm 파장) 파장대 별로 UVA (320~400nm), UVB (280~320nm), UVC (200~280nm)로 구분되고, 이 중에서 UVB는 전체 자외선 조사량의 4% 밖에 되지는 않지만, 피부에 심각한 악영향과 유전적 독성을 야기시킨다. 또한 일중항 산소(singlet oxygen), 과산화수소(hydrogen peroxide), 과산화물 음이온(superoxide anion)과 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)을 포함하는 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)의 형성과 광분해 생성물을 초래하는 주원인으로 알려져 있다.

상기 상피세포 성장인자(Epidermal growth factor, EGF)는 자외선 조사로 초래된 광노화성 주름을 단백질 전달체(Protein Transduction Domain, PTD)로 상피내의 전달 효율을 높여 보호하는 효과를 보임이 입증되었다(비특허논문 3).

인슐린 유사 성장인자-1(Insulin-like growth factor-1, IGF-1)은 인간 상피 줄기세포(Human dermal stem/progenitor cells, hDSPCs)의 배양액 내에 높은 농도로 존재하였고, UVA조사로 초래된 MMP1의 과발현과 Collagen type 1, 4, 5과 TIMP1의 mRNA수준의 저하를 현저히 향상시켰다. 또한 UVA조사된 인간 상피 섬유아세포(Normal human dermal fibroblasts, NHDFs)의 상처 치유능 실험(Wound healing assay)에서 세포의 이동능력을 향상시켰으며 세포사멸을 현저히 줄였다(비특허논문 4).

간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor, HGF)는 망막색소 상피세포(Retinal pigment epithelium cell)에 세포의 사멸을 유도하는 DL-buthionine-(S,R)-sulfoxinine(BSO)를 처리했을 때, 세포 내 반응성 산소종(Intracellular reactive oxygen species, iROS)의 발현감소와 Bcl-2의 발현을 증가시켜 강력한 항산화 효과를 통하여 세포사멸을 감소시킨다고 보고 되었다(비특허문헌 5).

Huang F, Zhu X, Hu XQ, Fang ZF, Tang L, Lu XL, Zhou SH.; Int J Mol Med. 2013 Feb;31(2):484-92 Kyong KY; KIC News, Volume 13, No. 4, 2010 An JJ, Eum WS, Kwon HS, Koh JS, Lee SY, Baek JH, Cho YJ, Kim DW, Han KH, Park J, Jang SH, Choi SY.; J Cosmet Dermatol. 2013 Dec;12(4):287-95 Shim JH, Park JY, Lee MG, Kang HH, Lee TR, Shin DW.; PLoS One. 2013 Jul 11;8(7):e67604 Jin M, Yaung J, Kannan R, He S, Ryan SJ, Hinton DR; Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Nov; 46(11):4311-9

본 발명은 miRNA21이 형질주입으로 유도된 중간엽 줄기세포에서 분비된 성장인자를 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명에서는 miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 전술한 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 의해 배양된 배양액을 포함하는 피부재생 또는 주름개선용 화장료 조성물, 또는 피부 외용제를 제공한다.

본 발명에서는 miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 증식 및 배양하여, 안정적으로 상기 줄기세포를 증식 및 배양할 수 있으며, 특히 중간엽 줄기세포의 주름개선 기능 관련 성장인자의 측분비 효과를 극대화하여 인간 성장인자를 대량으로 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 배양된 배양액 중의 성장인자는 주름개선효과가 기대되어 피부 외용제 또는 화장료에 사용할 수 있다.

도 1 및 2는 본 발명의 실시예 및 비교예에 의해 제조된 배지 중의 특정 성장인자와 사이토카인의 발현을 측정한 사진(도 1) 및 그래프(도 2)이다.
도 3은 실시예 및 비교예에서 제조된 배지의 주름개선평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 및 비교예에서 제조된 배지의 세포독성평가 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 줄기세포 성장인자의 대량 생산을 위해 miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명에서 miRNA21은 C-Jun 키나아제의 활성을 억제하며, 줄기세포 성장인자의 대량 생산을 유도할 수 있다.

본 발명에서 용어 ‘줄기세포 성장인자’는 줄기세포에서 분비되는 성장인자를 의미한다.

본 발명에서 용어 ‘줄기세포’는 스스로 세포 분열을 할 수 있고, 매우 다양한 형태의 특이 세포 타입(specific cell type)으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포이다. 이러한 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 한 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 상기 중간엽 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 중간엽 줄기세포는 공지의 중간엽 줄기세포 공급원, 예를 들어 지방, 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 상기 골수 또는 조직 등의 채취 대상 동물은 포유동물일 수 있으며, 구체적으로 인간일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 특히 본 발명에서는 인간 지방에서 유래된 중간엽 줄기세포(이하, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포라 할 수 있다.)를 이용할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포에서는 성장인자가 세포 밖으로 분비된다. 이러한, 중간엽 줄기세포에 분비되는 성장인자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, IGF-1(Insulin-like growth factor-1), EGF(epidermal growth factor), IL-1^α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE₂(Prostaglandin E2), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), FGF(fibroblast growth factor), α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 및 IL-6(Interleukin-6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로, EGF(epidermal growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor-1) 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 줄기세포에서 분비되는 성장인자(줄기세포 성장인자)는 주름개선 효과를 가지는데, 상기 주름개선 효과를 가지는 성장인자는 IGF-1(Insulin-like growth factor-1), EGF(epidermal growth factor), IL-1^α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor) 또는 HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE₂(Prostaglandin E2)일 수 있다.

본 발명에서는 이러한 주름개선과 관련된 성장인자의 세포 내 발현이 매우 높으며, 동시에 세포 밖으로 고농도로 분비할 수 있으므로, 성장인자의 발현-분비 기전에 대한 연구 및 분비된 성장인자를 이용한 관련 질환 개선-치료제 또는 화장품 원료 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물은 무혈청 배지(serum-free)일 수 있다. 무혈청 배지는 인간을 포함한 동물로부터 유래된 혈청(동물 유래 혈청)을 일정 함량 이상 함유하지 않는 임의의 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 무혈청 배지는 동물 유래 혈청을 총 조성물 함량 대비 0.1 중량% 미만 또는 0.01 중량% 미만으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 동물 유래 혈청을 함유하지 않을 수 있다.

본 발명에서 줄기세포 성장인자를 대량 생산하기 위한 일반적인 배지는 당업계에 공지되어 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하며, 배양 시 동물 유래 혈청을 약 5 내지 20% 정도 포함하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다. 그러나, 동물 유래 혈청은 미확인된 미량성분을 포함하므로, 세포의 성장에 영향을 미치며, 분석이 어렵고, 재현성 있는 시험 및 생산공정을 확립하는데 어려움이 있었다.

본 발명에서는 무혈청 배지에서 miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 안정적으로 증식 및 배양할 수 있고, 재현성 있는 안정한 시험 및 생산공정의 확립이 가능하며, 줄기세포 성장인자를 대량 생산할 수 있다.

본 발명에서는 전술한 줄기세포 성장인자를 대량 생산하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

miRNA21은 C-Jun 키나아제(C-Jun kinase)의 활성을 억제할 수 있다. 특히, miRNA21이 형질주입된 줄기세포는 EGF(epidermal growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor-1) 및/또는 HGF(Hepatocyte Growth Factor)의 발현 및 세포 외 분비를 증가시킬 수 있다.

본 발명에서 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 전술한 종류를 사용할 수 있으며, 구체적으로 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.

또한, 줄기세포 성장인자의 종류는 전술한 바와 같다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법은,

(a) 줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포를 miRNA21로 형질전환 후 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 한 구체예에서, 단계 (b)에 의해 배양된 배양액에서 줄기세포 성장인자를 분리하는 (c) 단계를 추가로 수행할 수 있다.

단계 (a)에서 혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 좋다. 본 발명에서는 일반적으로 세포배양에 사용하는 CNT-57, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium)을 사용할 수 있으며, 세포 배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함할 수 있다.

혈청은 0.1 내지 20％의 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 첨가하는 것이 좋고, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.

또한, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가할 수 있다.

항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 폰지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.

필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 70 내지 80％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 75％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다.

상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포는 miRNA21로 형질전환시킨 후 무혈청 배지에서 배양할 수 있다(단계 (b)).

상기 무혈청 배지는 혈청을 포함하지 않는 초기단계 세포배양을 위한 배지로서 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 무혈청 배지는 상기 배지에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다.

상기 성장인자로 전술한 줄기세포 성장인자를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

무혈청 배지에서 배양된 줄기세포 배양액은 유효성분이 고농축으로 존재할 수 있다. 예컨대, 줄기세포 성장인자, 즉, IGF(Insulin-like growth factor), EGF(epidermal growth factor), IL-1^α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE₂(Prostaglandin E2), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), FGF(fibroblast growth factor), α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 성장인자가 포함될 수 있으며, 구체적으로 EGF(epidermal growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor-1), 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 성장인자가 고농축으로 존재할 수 있다.

이러한 배양액 중의 성장인자는 상기 성장인자를 분리하는 단계(단계 (c))를 통해 분리될 수 있다. 상기 성장인자의 분리는 당업계에서 사용되는 일반적인 공정을 통해 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 성장인자의 분리는 배양액을 체에 거르는 공정을 통해 수행될 수 있다. 이때, 체는 성장인자의 크기보다 작아 불순물을 걸러 상기 성장인자를 용이하게 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 의해 제조된 줄기세포 성장인자를 포함하는 배양액은 주름개선 효과를 가진다.

따라서, 본 발명의 배양액은 피부재생 또는 주름개선을 위한 피부 외용제 또는 화장료 등의 유효성분으로 사용할 수 있다. 상기 배양액은 분획물로 이용될 수도 있다.

구체적으로, 본 발명의 배양액은 miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 배양하여 제조되므로, 상기 배양액에는 EGF(epidermal growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor-1) 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)이 고농축으로 존재하며, 피부재생, 주름개선 효과를 지닐 수 있다.

상기 배양액을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

상기 배양액이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

상기 배양액을 화장품으로 사용하는 경우, 상기 배양액을 유효성분으로 함유하여 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 또는 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수; 훼이셜 로션 또는 바디로션 등과 같은 유액; 영양 크림, 수분 크림 또는 아이 크림 등과 같은 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제; 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.

또한 상기 화장품은 상기 배양액에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

상기 배양액은 화장품으로 제품화되는 경우에 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제 또는 세정제와 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 배양액을 포함할 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림 또는 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 화학식 1의 화합물을 포함해도 무방할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 상기 배양액을 전체 조성물 중량에 대하여 0.000001 중량% 내지 10 중량%(바람직하게는 0.001 중량% 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%)로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 상기 배양액을 0.000001 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부재생 또는 주름개선 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 알러지 등 원치 않는 반응이 발생하거나 피부 안전성에 문제가 있을 수 있으므로 이를 방지하기 위한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 1> miRNA21 정보

[시퀀스]

UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA

실시예

실시예 1

1. 골수 유래 중간엽 줄기세포 수득

인간 지방 유래 중간엽 줄기세포는 Invitrogen사의 STEMPRO^® Human Adipose-Derived Stem Cells(Cat. # R7788-115)을 구매하여 본 발명을 실행하였다.

2. 줄기세포의 배양

골수 유래 중간엽 줄기세포를 60 mm 배양 플레이트(3.2 x 10⁵ cells/plate)에, PBS 10% 첨가된 low glucose DMEM 배지를 이용하여 1일 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 세포배양기에서 배양하였다.

3. miRNA21 형질전환

2.에서 배양한 배양액을 흡입관을 통해 제거한 다음, PBS 용액을 이용하여 배지 성분을 제거하고, miRNA 형질전환용 siLentFact 시약을 Opti-MEM배지에 제조사의 지시에 맞게 희석하고 miRNA21 mimic과 함께 4시간 동안 5％ CO₂ 및 37℃ 조건의 세포배양기에서 배양하였다.

그 후, 10% 혈청 DMEM 배지에서 20시간 동안 배양 후, 무혈청 배지로 교환하여 24시간동안 세포배양기에서 배양하였다.

비교예 1

3. miRNA21 형질전환을 수행하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법으로 배양액을 제조하였다.

비교예 2

3. miRNA21 형질전환을 수행하지 않고, 1% O₂의 저산소에서 배양한 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법으로 배양액을 제조하였다.

비교예 3

줄기세포를 배양하지 않은 무혈청 배지를 사용하였다.

비교예 4.

줄기세포를 배양하지 않은 무혈청 배지에 EGF 5㎕/㎖를 첨가하여 양성대조군으로 사용하였다.

실험예 1. 사이토카인 발현 측정

사이코카인의 발현 측정은 Human Cytokine Arrays(RayBiotech, Inc.)을 이용하여 측정하였다.

측정 방법은 하기와 같다.

냉동 보관된 키트를 실온에 두어 실온과 동일한 온도를 만들어준다. Antibody Arrays를 조심스럽게 제거하고 # 마킹 부분이 위로 올라오도록 well에 넣는다. 2ml의 blocking buffer를 각 well에 넣고 30분 실온에서 배양한다. Blocking buffer를 제거하고 1 ml의 샘플(MSC 배양액만 농축하여 사용)을 각 well에 넣고 2시간 실온에서 배양한다. 샘플을 제거한 뒤 2 ml 1X wash buffer I으로 5분씩 3번 세척한 뒤, 2 ml 1X wash buffer II로 5분씩 2번 세척한다. 1ml biotin-conjugated antibody cocktail을 넣고 실온에서 2시간 배양한다. Biotinylated antibody cocktail을 제거한 뒤 2 ml 1X wash buffer I으로 5분씩 3번 세척한 뒤, 2 ml 1X wash buffer II로 5분씩 2번 세척한다. 2 mL의 HRP-Streptavidin을 각 well에 넣고 실온에서 2시간 배양한다. HRP-Streptavidin을 제거하고 2 ml 1X wash buffer I으로 5분씩 3번 세척한 뒤, 2 ml 1X wash buffer II로 5분씩 2번 세척한다. Detection buffer C와 D를 1:1로 섞은 뒤, 500 μl씩 각 well에 넣고 실온에서 2 분 배양한 뒤 X-ray film을 사용하여 각 멤브레인 마다 spot을 얻는다.

본 발명에서 도 1 및 2는 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배지의 특정 성장인자와 사이토카인의 발현을 측정하고자 실시된 사이토카인 분석결과 사진(도 1) 및 그래프(도 2)이다.

상기 도 1 및 2에서 control은 비교예 1의 배양액을 사용한 경우, Hypoxia는 비교예 2의 배양액을 사용한 경우, miRNA21은 실시예 1의 miRNA21 형질전환된 배양액을 사용한 경우를 나타낸다.

상기 도에 나타나듯이, miRNA21이 형질주입된 줄기세포 배양액이 표피세포 성장인자(Epidermal growth factor, EGF), 인슐린 유사 성장인자-1(Insulin-like growth factor-1, IGF-1), 및 간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor, HGF)의 발현을 가장 효과적으로 높였으며, 이로 인하여 항주름 기능성 조성물을 획득할 수 있다.

실험예 2. 주름개선 효능 평가

주름개선 효능 평가는 콜라겐 합성능 확인을 통해 수행했으며, 콜라겐 합성능은 Procollagen Type Ⅰ C-poptide(PIP) assay ELISA kit, Takara Bio를 이용해 측정되었다.

측정 방법은 하기와 같다.

Human dermal fibroblast를 6-well plate에 1×105 cells/㎖의 농도로 100㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24hr 배양한다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 각 실험군 배지의 적당하게 희석한 시료를 well당 2㎖씩 처리하고 48hr 배양한다. 배양 후 배지를 회수하여 4℃, 14,000rpm에서 10min 간 원심 분리를 시킨 후, 상층액만 회수한다. Takara procollagen type Ⅰ C-piptide (PIP) ELISA kit(#MK101)를 이용하여 배지 속에 있는 C-peptide의 양을 확인한다. Antibody coated microplate의 각 well에 antibody-POD conjugate solution을 100㎕씩 넣는다. Sample 및 농도 별로 희석된 standard를 20㎕씩 넣는다. 빛을 차단하여 37℃에서 3hr 반응시킨다. 반응이 끝난 후 시료를 제거하고 400㎕의 PBS를 이용하여 washing한다. 이 과정을 4회 반복하여 수행한다. 각 well에 substrate solution(TMBZ)을 100㎕씩 넣고 상온에서 15min 반응시킨다. 100㎕의 stop solution을 넣는다. ELISA reader를 이용하여 450nm 파장에서 흡광값을 측정한다.

본 발명에서 도 3 은 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배지의 주름개선 효능 평가를 측정하고자 실시된 콜라겐 합성능 확인 평가(Procollagen Type Ⅰ C-poptide(PIP) assay) 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 도 3에서 SFM은 비교예 3의 배양액을 사용한 경우, EGF는 양성대조군으로 비교예 4의 배양액을 사용한 경우, miRNA21은 실시예 1의 miRNA21이 형질주입된 배양액을 사용한 경우를 나타낸다.

상기 도 3에 나타나듯이, miRNA21이 형질주입된 줄기세포 배양액(실시예 1)이 콜라겐 합성능의 발현을 가장 효과적으로 높였으며, 양성대조군인 EGF 처리군(비교예 4)보다 우수한 콜라겐 합성능의 발현을 나타내었다.

이로 인하여 항주름 효과 기능성 조성물을 획득할 수 있다.

실험예 3. 세포독성평가

세포독성은 MTT(3-(4,5- Dimethylthiazol -2- yl )-2,5- Diphenyltetrazolium Bromide)시약(Life Technologies)을 이용해 측정되었다.

측정 방법은 하기와 같다.

실험에 사용 할 세포를 96-well plate에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 100㎕씩 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24hr 배양한다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 적당한 농도로 희석한 시료를 well 당 100㎕씩 처리하여 준 후 24hr 배양한다. 배양 후 PBS를 이용하여 5㎎/㎖의 농도로 녹인 MTT 시약을 20㎕씩 넣어주고 4hr 배양한다. MTT 시약과 시료가 포함된 배지를 모두 제거하고 각 well에 100㎕ isopropanol을 첨가하여 30min shaking(암조건)한 후, ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광값을 측정한다.

본 발명에서 도 4는 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배지에서 세포독성평가 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 도 4에서 SFM은 비교예 3의 배양액을 사용한 경우, control은 비교예 1의 배양액을 사용한 경우, Hypoxia는 비교예 2의 배양액을 사용한 경우, miRNA21은 실시예 1의 miRNA21 형질주입된 배양액을 사용한 경우를 나타낸다.

상기 도 4에 나타나듯이, miRNA21이 형질주입된 줄기세포 배양액이 세포독성평가에서 안전성이 상대적으로 높았으며, 이로 인하여 세포독성으로부터 안전한 기능성 조성물을 획득할 수 있다.

<110> Catholic Kwandong University Industry Foundation <120> controlled the expression and the production of growth factors of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells by miRNA21 transfection <130> P15U17C0122 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims (9)

1. SEQ ID NO: 1로 표시되는 miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는
   EGF(epidermal growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor-1) 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   miRNA21이 형질주입된 줄기세포를 배양하는 단계는 (a) 줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포에 miRNA21을 형질주입한 후, 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   (c) 단계 (b)에서 배양된 배양액에서 줄기세포 성장인자를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   줄기세포는 중간엽 줄기세포인 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 유래되는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. SEQ ID NO: 1로 표시되는 miRNA21이 형질주입된 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생 또는 주름개선용 화장료 조성물.
   
9. 삭제

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