KR20130121448A - ｍｉＲ－21 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

ｍｉＲ－21 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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신근구
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부산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 miR-21 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, miR-21 유전자의 발현이 억제되어 혈관생성촉진인자의 생성 촉진 및 손상된 조직세포의 재생 촉진능을 갖는 중간엽 줄기세포 및 상기 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 miR-21의 발현이 억제된 중간엽 줄기세포는 혈관생성촉진인자의 생성을 촉진시키는 효과가 있으며, 손상된 조직세포의 재생을 촉진시키는 효과가 있어, 손상된 조직재생촉진을 위한 세포치료제 개발에 사용될 수 있고, 허혈성 질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ｍｉＲ－21 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating of ischemia comprising ｍｉＲ－21 inhibitor}
본 발명은 miR-21 기능 조절을 통하여 세포의 조직세포 재생능을 촉진할 수 있는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
허혈(Ischemia)이란 신체기관, 조직 또는 부위로 혈액을 공급하는 혈관이 협착 또는 수축하거나, 정상적인 혈관 생성이 충분히 이루어지지 않아 혈액 공급에 문제가 생겨 국부적으로 조직의 괴사가 일어난 상태를 말한다.
특히, 심장, 뇌는 혈류 공급 부족에 가장 민감한 신체 기관으로서, 조직 상에 허혈이 발생하면 허혈성 캐스캐이드라고 불리우는 일련의 과정들이 촉발되어 조직이 영구적으로 손상된다. 상기와 같은 허혈 증상을 나타내는 질환을 허혈성 질환이라 하고, 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과, 뇌졸중 및 말초혈관질환 등의 혈관질환을 포함한다.
허혈성 질환은 여러 가지 원인에 의하여 야기될 수 있으며, 예를 들면, 동맥경화, 저혈압, 혈관외부로부터의 혈관 압박(예를 들어, 혈관 외부의 암에 의한 혈관 압박), 혈전, 색전증, 사고로 인한 뇌혈관 손상, 뇌일혈, 뇌경색, 동정맥 기형, 말초 동맥 폐색 질환 등에 의하여 허혈 증상이 나타날 수 있다.
대표적인 허혈성 질환의 하나인 만성적 허혈성 심장질환의 경우, 심근에 혈액을 공급하는 관상 순환계의 이상으로 심근이 충분한 양의 산소와 영양분을 받지 못해서 흉통, 심부전으로 인한 호흡곤란, 허약감, 실신 등의 증상을 수반하는데, 최근 발생빈도가 급격히 증가하고 있다. 또한, 모근 및 모낭에 혈액의 공급이 원활하지 못하게 되면 모낭의 형성 즉 모발 형성이 되지 않아 탈모자 백발증을 유발할 수 있다. 그 밖에도, 허혈로 인한 혈핵 공급의 중단은 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 안질환, 허혈성 하지질환 등의 각종 허혈성 질환을 유발하게 된다.
이러한 허혈성 질환의 치료 방법으로는 약물 요법, 스텐트(stent)를 이용하여 좁은 혈관을 확장시켜 주는 관상 동맥 성형술이 있으며, 심장의 경우 동맥 우회술을 시행하기도 한다.
그러나, 이러한 치료방법은 혈관이 너무 많이 굳어 있거나, 이식에 사용할 수 있는 혈관을 모두 사용하였거나, 재협착으로 인한 동맥성형술의 반복 시행에도 계속적인 재발이 일어날 경우에는 적절한 치료 방법으로서의 역할을 하지 못하게 된다. 따라서 이와 같은 기존 치료방법의 한계를 극복하기 위해서는 새로운 방법이 필요하며, 혈관신생 인자(angiogenic factor)를 이용한 유전자 치료가 새로운 치료 전략으로 관심받고 있다. 최근에 개발된 좀 덜 침습적인 방식은 치료적 혈관생성(therapeutic angiogenesis)이며, 허혈성 조직의 신혈관 형성을 향상시키기 위해 허혈을 완화시키는 전구 혈관생성 인자의 도입에 의한 방법이다. 그러나 이러한 방법도 아직 허혈 질환을 완치하기에는 무리가 있고 예상치 못한 부작용이 있는 문제점이 있다.
허혈(Ischemia)이란 신체기관, 조직 또는 부위로 혈액을 공급하는 혈관이 협착 또는 수축하거나, 정상적인 혈관 생성이 충분히 이루어지지 않아 혈액 공급에 문제가 생겨 국부적으로 조직의 괴사가 일어난 상태를 말한다.
특히, 심장, 뇌는 혈류 공급 부족에 가장 민감한 신체 기관으로서, 조직 상에 허혈이 발생하면 허혈성 캐스캐이드라고 불리우는 일련의 과정들이 촉발되어 조직이 영구적으로 손상된다. 상기와 같은 허혈 증상을 나타내는 질환을 허혈성 질환이라 하고, 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과, 뇌졸중 및 말초혈관질환 등의 혈관질환을 포함한다.
허혈성 질환은 여러 가지 원인에 의하여 야기될 수 있으며, 예를 들면, 동맥경화, 저혈압, 혈관외부로부터의 혈관 압박(예를 들어, 혈관 외부의 암에 의한 혈관 압박), 혈전, 색전증, 사고로 인한 뇌혈관 손상, 뇌일혈, 뇌경색, 동정맥 기형, 말초 동맥 폐색 질환 등에 의하여 허혈 증상이 나타날 수 있다.
대표적인 허혈성 질환의 하나인 만성적 허혈성 심장질환의 경우, 심근에 혈액을 공급하는 관상 순환계의 이상으로 심근이 충분한 양의 산소와 영양분을 받지 못해서 흉통, 심부전으로 인한 호흡곤란, 허약감, 실신 등의 증상을 수반하는데, 최근 발생빈도가 급격히 증가하고 있다. 또한, 모근 및 모낭에 혈액의 공급이 원활하지 못하게 되면 모낭의 형성 즉 모발 형성이 되지 않아 탈모자 백발증을 유발할 수 있다. 그 밖에도, 허혈로 인한 혈핵 공급의 중단은 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 안질환, 허혈성 하지질환 등의 각종 허혈성 질환을 유발하게 된다.
이러한 허혈성 질환의 치료 방법으로는 약물 요법, 스텐트(stent)를 이용하여 좁은 혈관을 확장시켜 주는 관상 동맥 성형술이 있으며, 심장의 경우 동맥 우회술을 시행하기도 한다.
그러나, 이러한 치료방법은 혈관이 너무 많이 굳어 있거나, 이식에 사용할 수 있는 혈관을 모두 사용하였거나, 재협착으로 인한 동맥성형술의 반복 시행에도 계속적인 재발이 일어날 경우에는 적절한 치료 방법으로서의 역할을 하지 못하게 된다. 따라서 이와 같은 기존 치료방법의 한계를 극복하기 위해서는 새로운 방법이 필요하며, 혈관신생 인자(angiogenic factor)를 이용한 유전자 치료가 새로운 치료 전략으로 관심받고 있다. 최근에 개발된 좀 덜 침습적인 방식은 치료적 혈관생성(therapeutic angiogenesis)이며, 허혈성 조직의 신혈관 형성을 향상시키기 위해 허혈을 완화시키는 전구 혈관생성 인자의 도입에 의한 방법이다. 그러나 이러한 방법도 아직 허혈 질환을 완치하기에는 무리가 있고 예상치 못한 부작용이 있는 문제점이 있다.
한편, 최근에는 허혈 질환의 치료를 위한 세포치료제 연구도 증가하고 있으며, 특히 줄기세포를 이용한 기술도 개발되고 있는데, 대한민국 공개특허 제2006-0091296호에는 배아 줄기세포를 이용한 허혈 질환의 치료 기술 내용이 개시되어 있다.
그러나 손상된 조직 내로 이식된 줄기세포는 손상된 조직재생으로의 세포분화가 이루어져야 하는데 이러한 줄기세포만을 이용한 치료효과는 탁월한 효과를 얻기가 힘들다. 따라서 보다 치료 효과가 우수할 수 있도록 유전자 변형 또는 줄기세포의 기능이 조절된 개선된 세포치료제의 개발이 필요한 실정이다. 한편, 최근에는 허혈 질환의 치료를 위한 세포치료제 연구도 증가하고 있으며, 특히 줄기세포를 이용한 기술도 개발되고 있는데, 대한민국 공개특허 제2006-0091296호에는 배아 줄기세포를 이용한 허혈 질환의 치료 기술 내용이 개시되어 있다.
그러나 손상된 조직 내로 이식된 줄기세포는 손상된 조직재생으로의 세포분화가 이루어져야 하는데 이러한 줄기세포만을 이용한 치료효과는 탁월한 효과를 얻기가 힘들다. 따라서 보다 치료 효과가 우수할 수 있도록 유전자 변형 또는 줄기세포의 기능이 조절된 개선된 세포치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 miR-21의 기능이 조절된 줄기세포가 동물모델에서 조직 재생능을 촉진시킬 수 있고, 혈관생성촉진인자의 생성을 촉진시키는 활성이 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 miR-21 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 miR-21의 발현이 억제된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 miR-21 유전자의 발현이 억제되어 혈관생성촉진인자의 생성 촉진 및 손상된 조직세포의 재생 촉진능을 갖는 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-21 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 1로 표시되는 miR-21의 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자, miR-21에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 RNA 앱타머일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 허혈성 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 miR-21의 발현이 억제된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 허혈성 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 miR-21 유전자의 발현이 억제되어 혈관생성촉진인자의 생성 촉진 및 손상된 조직세포의 재생 촉진능을 갖는 중간엽 줄기세포를 제공한다.
본 발명은 miR-21 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, miR-21 유전자의 발현이 억제되어 혈관생성촉진인자의 생성 촉진 및 손상된 조직세포의 재생 촉진능을 갖는 중간엽 줄기세포 및 상기 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 miR-21의 발현이 억제된 중간엽 줄기세포는 혈관생성촉진인자의 생성을 촉진시키는 효과가 있으며, 손상된 조직세포의 재생을 촉진시키는 효과가 있어, 손상된 조직재생촉진을 위한 세포치료제 개발에 사용될 수 있고, 허혈성 질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세포에서 miR-21 억제제를 이용하여 miR-21의 기능을 억제시켰을 때 혈관생성을 촉진하는 사이토카인의 발현이 증가함을 나타내는 RT-PCR 결과이다.
도 2는 miR-21의 기능을 억제시킨 중간엽 줄기세포를 면역결핍 쥐의 하지허혈 동물 모델에 이식하여 혈류량을 측정한 결과이다.
본 발명은 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 miR-21 억제제를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다는 점에 그 특징이 있다.
miR-21은 사람의 뇌 종양 교모세포종에서 가장 빈번하고 강하게 발현되는 micro RNA로 알려져 있다(J.A. Chan, A.M. Krichevsky, K.S. Kosik, MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells., Cancer Res 65 (2005) 6029-6033). 그 이후로, miR-21은 발생학, 종양학, 줄기세포 생물학 및 노화의 배경에 대하여 연구되어 왔다(A.M. Krichevsky, G. Gabriely, miR-21: a small multi-faceted RNA., J Cell Mol Med 13 (2009) 39-53., V. Jazbutyte, T. Thum, MicroRNA-21: from cancer to cardiovascular disease., Curr Drug Targets 11 (2010) 926-935). 본 발명자들은 이전의 연구에서 miR-21이 TGF-b 신호를 억제함으로써 지방세포로의 분화에 영향을 주고(Y.J. Kim, S.J. Hwang, Y.C. Bae, J.S. Jung, MiR-21 regulates adipogenic differentiation through the modulation of TGF-beta signaling in mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue., Stem Cells 27 (2009) 3093-3102), 또한 STAT3를 억제함으로써 증식을 저해한다는 것을 밝힌 바 있다(Y.J. Kim, S.H. Hwang, H.H. Cho, K.K. Shin, Y.C. Bae, J.S. Jung, MicroRNA 21 regulates the proliferation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and high-fat diet-induced obesity alters microRNA 21 expression in white adipose tissues., J Cell Physiol 227 (2012) 183-193). 그러나 허혈성 질환에서 miR-21의 효과 및 작용에 대해서는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 miR-21 기능 조절이 허혈성 질환에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 면역결핍 쥐의 하지허혈 동물 모델을 이용하여 miR-21 기능을 억제시킨 중간엽 줄기세포를 허혈 후에 손상된 조직에 이식하여 재생 촉진 여부를 조사하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세포에서 miR-21의 기능을 억제시키기 위하여 miR-21 억제제를 처리한 결과, 혈관생성을 촉진하는 사이토카인인 IL6, VEGF의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 1 참조).
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 하지혀혈을 유도한 동물모델에 miR-21의 기능을 억제시킨 중간엽 줄기세포를 이식하고, 혈류량을 측정한 결과 정상의 중간엽 줄기세포보다 miR-21의 기능을 억제시킨 중간엽 줄기세포를 이식한 그룹에서 혈류량이 더 증가되는 것으로 나타났다(도 2 참조).
따라서 본 발명자들은 miR-21 기능을 억제시킨 중간엽 줄기세포가 하지허혈 질환동물 모델에서 손상된 조직세포의 재생을 촉진함을 확인함으로써 miR-21 기능을 억제시킨 중간엽 줄기세포를 허혈질환 치료를 위한 세포치료제로 이용할 수 있음을 알 수 있었고, 또한, miR-21 유전자의 억제제 또는 miR-21 단백질의 활성 억제제를 허혈성 질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 miR-21 억제제를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "miR-21 억제제"는 세포 내에서 miR-21의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로서, 구체적으로는 miR-21에 직접적으로 작용하거나 또는 miR-21의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 miR-21의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나, 발현된 miR-21의 분해를 증가시키거나, 그 활성을 방해함으로써, miR-21의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 제제를 뜻한다.
또한, 마이크로 RNA는 대부분 염색체상의 인트론 등에 끼어 들어가 있으며 이는 전사가 일어난 후 드로사(Drosha)등에 의해 프로세싱되어 전구체 형태(precursor-miRNA, precursor form)로 바뀐 후 엑스포틴(exportin)에 의해서 핵을 빠져 나와 다이서(Dicer)에 의해 약 22bp 정도 길이의 성숙된 형태로 바뀌게 되고 이는 RISC (RNA interference silencing complex)와 결합하여 기능을 나타내게 된다 (Nat Rev Mol Cell Biol 6, 376-385;2005).
본 발명의 miR-21 억제제는 이러한 miR-21이 활성화되어 기능하는 경로에 관여하여 miR-21의 발현 수준을 감소시키거나, 활성을 억제할 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 miR-21 억제제는 miR-21 저해활성을 가진 물질이라면, 특별히 제한되지 않으나, 당업계에 공지된 표준 기법을 통해 세포에 처리될 수 있는 핵산 또는 폴리펩티드 같은 생물학적 분자, 화합물, 세균이나 식물 또는 동물로부터 분리된 추출물일 수 있다. 바람직하게는 miR-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자, miR-21에 특이적인 siRNA, RNA 앱타머 및 리보자임 등을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 miR-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자이다.
본 발명에서 상기 miR-21 염기서열은 바람직하게 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성된다.
본 발명에서 용어 “상보적인”은 뉴클레오티드 서열과 다른 뉴클레오티드 서열의 각 염기가 매치되는, 즉 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍을 형성할 수 있는 경우를 의미한다.
본 발명에서 용어 “안티센스 핵산”은 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체인 핵산서열을 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징을 가진다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에서 생체 내뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용되는 것으로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막을 수 있다.
본 발명의 안티센스 서열은 miR-21 mRNA에 상보적이고 miR-21 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, miR-21 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 서열과 길이는 특별히 제한되지 않으며, mRNA에 대응하지 않는 일부의 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100개의 염기로 이루어진 서열일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 40개의 염기로 이루어진 서열일 수 있다.
따라서 본 발명에서 사용될 수 있는 안티센스 핵산은 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 핵산을 포함한다. 또한 상기 핵산은 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당 분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당 분야에 널리 알려져 있으며 핵산 백본의 변형, 당 모이어티(moiety)의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 miR-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 세포 내의 miR-21 분자의 단일 가닥 단편에 상보적으로 결합하여 miR-21의 프로세프 효율을 감소시킴으로써, 이들의 발현을 억제하고, 기능을 저해시킬 수 있게 된다. miR-21 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙 마이크로RNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 마이크로RNA 분자는 주로 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 적어도 부분적으로 자가-상보적인(예를 들어 스템- 및 루프-구조)이다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 전구체 마이크로RNA 분자의 단일 가닥 단편에 상보적이거나, 성숙 마이크로RNA 분자에 상보적일 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 RNA-RNA, RNA-DNA, RNA-PNA(단백질 핵산) 상호작용에 의해 miR-21 핵산에 결합하여 이들의 활성을 변이시키는 비효소적 핵산 화합물이며, 이들은 하나의 연속서열이 miR-21 염기서열에 상보적일 수 있고, 이들 자체적으로 루프를 형성하여 루프를 형성하는 miR-21에도 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 miR-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 안티올리고뉴클레오티드 형태인 것이 바람직하며, 이들은 세포에 도입되었을 때, miR-21의 발현을 저해시킬 수 있으며, 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 내성이며, 생체 내에서 안정적인 선택적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생적인 염기, 당 및 당간(intersugar) 연결로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 또한, 이 용어는 유사하게 기능하는 비-자연 발생적인 단량체 또는 그의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 올리고머를 포함한다. 치환된 올리고머의 혼입은 세포 흡수 증대 또는 뉴클레아제 내성 증가를 비롯한 인자에 기초하며, 당업계에 공지된 바와 같이 선택된다. 전체 올리고뉴클레오티드 또는 그의 일부분이 치환된 올리고머를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 이들의 표적에 대한 친화성을 증가시키고 표적 서열의 미스매치(mismatch)에 대한 내성을 제공하도록 당업계에 공지된 방법으로 변형된 올리고머 모방체, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 및 고정(locked) 핵산(LNA)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 천연형 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 메틸포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포르아미데이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, H-포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 트리에스테르형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 알파-아노머형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 펩티드핵산, 그외 인조 핵산 및 핵산-변형된 화합물을 포함한, 변형된 올리고뉴클레오티드 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 miR-21 단일 가닥 염기서열에 상보적인 이중나선 또는 단일 나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당업계에 알려져 있고, 올리고뉴클레오티드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 당 변형의 예로는, 1-6 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 -O-저급 알킬기, 또는 2-6 탄소 원자를 포함하는 -O-아릴, 또는 알릴기로 2'-O-치환된 것을 포함하는, 리보스 모이어티의 2' 위치에 변형이 있으며, 상기 -O-알킬, 아릴 또는 알릴기는 아미노 또는 할로기(예, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸 시아노, 니트로 아실 아실옥시, 알콕시, 카르복시, 카르브알콕실 또는 아미노기)로 비치환 또는 치환될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예로는, 3', 5' 또는 3' 및 5' 말단에 2'-O-알킬화된 리보뉴클레오티드를 가지며, 적어도 4개 또는 5개의 연속 뉴클레오티드가 그렇게 변형된다. 2'-O-알킬화된 기의 예로는, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필 및 2'-0-부틸이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 miR-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 10 내지 40개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명에서 이용할 수 있는 miR-21 억제제로서, miR-21에 대한 siRNA, RNA 앱타머 및 리보자임 등도 사용할 수 있다.
본 발명에서 miR-21 억제제로 이용할 수 있는 siRNA는 miR-21에 특이적으로 작용하여 miR-21 분자를 절단(cleavage)하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference)현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 말한다. 본 발명의 siRNA는 miR-21 핵산 서열의 일부 또는 전부와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되어 세포 내에서 miR-21에 혼성화될수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 miR-21 억제제로 이용할 수 있는 RNA 앱타머는 특정의 3차원 입체 형태를 채택하는 능력에 의해 miR-21과 결합하여 이에 대해 길항 효과를 갖는 핵산 리간드 분자를 의미한다. 전형적으로 앱타머는 규정된 이차 및 삼차 구조, 예컨대 스템-루프구조로 접혀지는 15-50 염기 길이의 작은 핵산일 수 있다. 앱타머는 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12보다 적은 kd로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 앱타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 표적 분자와 결합할 수 있다. 또한, 앱타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 앱타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 miR-21 억제제로 이용할 수 있는 리보자임은 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 리보자임으로는 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한 뉴클레아제나 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형들 모두 가능하며, 예를 들면 햄머헤드 리보자임, 헤어핀 리보자임 및 테트라히메나 리보자임이다. 또한, 천연 시스템에서는 발견되지 않지만, 생체내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임도 이용가능하다. 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단할 수 있으며, 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단하게 되는데, 이러한 인식은 대부분 염기쌍 상호작용을 토대로 하므로, 표적 특이적 절단이 가능한 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 miR-21의 발현이 억제된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 바람직하게는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제의 형태로 제공할 수 있다.
본 발명의 miR-21 억제제 또는 miR-21 기능을 억제시킨 중간엽 줄기세포를 포함하는 조성물은 혈관생성촉진인자의 생성을 촉진시키는 활성 또는 손상된 조직세포 재생을 촉진시키는 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 기존의 허혈성 질환의 예방 및/또는 치료용 제제 또는 방법과 병용하여 사용할 수 있으며, 이 경우 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다.
즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 표면에 전달하는 임의의 방식으로 개체에게 투여될 수 있다. 적합한 비경구 투여 경로는 혈관내 투여(예, 정맥 내 볼루스 주사, 정맥 내 주입, 동맥 내 볼루스 주사, 동맥 내 주입, 맥관 내로의 카테터 점적주입), 피하 주입을 포함하는 피하 주사 또는 침착(deposition)(예를 들면 삼투압 펌프 이용), 조직 주위 및 조직 내 투여 또는 침착 등을 포함한다.
본 발명의 조성물은 허혈과 관련이 있는 질병을 앓고 있는 개체의 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 가능한 개체는 인간뿐만 아니라 새, 가금류, 가축 등의 동물도 포함한다. 본 발명에서, 치료는 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 경감시키거나, 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물에 함유되는 miR-21 활성을 저해하는 물질의 유효 투여량의 범위는 개체의 성별, 중증도, 연령, 건강상태, 체중, 약물에 대한 민감도, 투여방법과 횟수, 표적세포나 세포 및 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 miR-21 발현을 억제시키기에 충분한 양 또는 miR-21 작용을 억제하기에 충분한 양이다. 각 치료에 요구되는 총 용량은 수회 용량 또는 일회량으로 투여될 수 있다.
추가로 본 발명에 따른 miR-21 발현 또는 miR-21 단백질 활성이 억제된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물이 세포치료제 형태로 제공하는 경우, 상기 세포치료제는 당업계에 알려진 일반적인 세포치료제의 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과 수술적으로 허혈 질환 부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후, 허혈 질환 부위로 이동할 수 있다.
또한, 상기 세포치료제에 포함된 중간엽 줄기세포는 질병의 유형, 투여경로, 환자의 나이, 성, 질병의 정도에 따라 변할 수 있으며, 평균 성인 기준 104~106 세포수를 투여할 수 있다.
뿐만 아니라 본 발명은, 중간엽 줄기세포를 준비하는 단계; 및 상기 중간엽 줄기세포에 miR-21 유전자의 발현을 억제시키는 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 혈관생성촉진인자의 생성 촉진 및 손상된 조직세포의 재생 촉진능을 갖는 중간엽 줄기세포 및 상기 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포의 제조방법에서, 상기 miR-21 유전자의 발현을 억제시키는 단계는 miR-21 유전자에 대한 안티센스 RNA를 사용하여 miR-21 유전자의 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수도 있다. 상기 안티센스 RNA의 예로는 siRNA (short interfering RNA) 또는 shRNA (short hairpin RNA)를 사용할 수 있으며, 상기 siRNA는 적절히 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미디트(ribonucleoside phosphoramidites)와 종래의 DNA/RNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 본 발명에 따른 miR-21 유전자 발현이 억제된 중간엽 줄기세포, 상기 중간엽 줄기세포를 함유한 세포치료제 및 허혈 질환의 예방 및 치료용 조성물이 치료할 수 있는 상기 허혈성 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
miR -21의 기능 억제에 의한 혈관생성 사이토카인의 발현 변화
지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세포에서 miR-21의 기능을 억제하기 위하여 miR-21 억제제로서 Dharmacon 사에서 판매하고 있는 hsa-miR-21(miRIDIAN Hairpin Inhibitor, Cat No ; IH-300492-05-0005)을 세포에 처리하였다(실험군) 이때 상기 실험군과 동일 조건에서의 실험을 위하여 대조군으로는 세포에는 영향을 주지 않고 miR-21의 기능도 억제하지 않는 시약인 Dharmacon 사에서 구입한 anti-miRCon(miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitor Negative Control #1, Cat No ; IN-001005-01-05)을 사용하였다.
miR-21 유전자 염기서열: 5’-UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA-3’(서열번호 1)
Real-Time PCR로 관찰한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, miR-21 억제제인 hsa-miR-21을 사용하여 중간엽 줄기세포에서 miR-21의 기능을 억제한 결과, miR-21의 기능을 억제하지 않은 대조군에 비해 혈관생성을 촉진하는 사이토카인(IL6, VEGF)들의 발현이 증가됨을 확인하였다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은, miR-21 억제제를 혈관생성을 필요로 하는 질환의 치료용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 2>
하지허혈 동물 모델에 중간엽 줄기세포의 이식
나아가 본 발명자들은 miR-21의 기능을 억제시킨 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하여 하지 허혈을 치료할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 면역결핍된 쥐의 대퇴동맥을 묶고 혈류를 차단하여 하지허혈을 유도한 후, 1일 뒤에 PBS(phosphate buffered saline)만을 처리한 군, 상기 실시예 1에서 anti-miRCon을 처리하여 miR-21 기능이 억제되지 않은 중간엽 줄기세포를 이식한 군 및 hsa-miR-21을 처리하여 miR-21의 기능을 억제시킨 본 발명의 중간엽 줄기세포를 이식한 군을 대상으로 이식 후 7일과 14일째에 혈류량을 각각 측정하였다. 또한, 혈류량 측정은 상기와 같이 처리된 3개 군의 쥐를 대상으로 대퇴동맥을 묶기 전 혈류속도를 기준으로 대퇴동맥을 묶어 혈류를 차단하였을 때의 혈류속도를 비율로 계산하였다.
이식 후 7일과 14일째에 혈류량을 각각 측정한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, miR-21의 기능을 억제시킨 줄기세포를 이식한 군이 다른 군에 비해 혈류량이 세포를 이식한 그룹에서 혈류량이 더 증가하는 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과들을 종합해보면, 지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세포에서 miR-21 기능을 억제시킨 결과, 혈관생성촉진인자의 생성이 증가되는 것으로 나타났고, 나아가 하지허혈 동물모델 이식 실험에서도 miR-21 기능이 억제된 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 이식하여 사용한 결과, 손상된 조직세포의 재생이 촉진되는 것으로 나타났다.
따라서 miR-21 기능이 억제된 중간엽 줄기세포는 손상된 조직재생의 촉진을 위한 세포 치료제로서 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Pusan National University <120> Composition for preventing or treating of ischemia comprising miR 21 inhibitor <130> PN1203-039 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 72 <212> RNA <213> miR-21 sequence <400> 1 ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60 ggcugucuga ca 72

Claims (6)

  1. miR-21 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 억제제는 서열번호 1로 표시되는 miR-21의 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자, miR-21에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 RNA 앱타머인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 허혈성 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  4. miR-21의 발현이 억제된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 허혈성 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제.
  6. miR-21 유전자의 발현이 억제되어 혈관생성촉진인자의 생성 촉진 및 손상된 조직세포의 재생 촉진능을 갖는 중간엽 줄기세포.
KR1020120044658A 2012-04-27 2012-04-27 ｍｉＲ－21 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 KR20130121448A (ko)

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