JP2023530661A

JP2023530661A - 急性心筋梗塞後の左室機能不全の治療方法

Info

Publication number: JP2023530661A
Application number: JP2022576386A
Authority: JP
Inventors: フィガルドミンゴアンドレスパスカル; ペレスアントニオマヌエルラックス; ロペスマリアカルメンアセンシオ
Original assignee: Universidad de Murcia
Current assignee: Universidad de Murcia
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2023-07-19
Also published as: EP4162046A1; WO2021250124A1; CA3185338A1; AU2021290158A1; CN116096893A; IL298791A; EP3922720A1

Abstract

本発明は、ヒト又は動物対象の心臓細胞におけるＹｉｎＹａｎｇ－１（Ｙｙ１）遺伝子の発現を、当該細胞における化合物の非存在下で観察される発現に対して減少させることができる化合物を含む組成物に関し、化合物は、Ｙｙ１遺伝子のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）であり、当該組成物は、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）後の左室（ＬＶ）機能不全の治療方法における使用のためのものであり、当該組成物は、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１２時間～７日の間に投与される。

Description

本発明は、生物医学分野、特に急性心筋梗塞後の左室機能不全の治療方法に関する。

急性心筋梗塞（ａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ＡＭＩ）に罹患している患者では、閉塞した冠動脈を開くことが、酸素供給を回復し、虚血性心筋損傷を制限するための最良の戦略である。しかし、一次血管形成術及び／又は線維素溶解薬に基づく再灌流療法は、症状発症後最初の１２時間以内に行われた場合にのみ有効である［１］。残念なことに、患者のかなりの部分が適時に再灌流療法にアクセスせず、３０分の遅延ごとに、１年で死亡リスクが相対的に７．５％増加する［２］。この死亡率の過剰は、虚血時間が梗塞サイズの主要な決定因子であり、心機能及び構造の病理学的変化をもたらすために説明される。これらの病理学的過程は有害な心臓リモデリングとして知られており、収縮不全、心腔拡張及び心筋異常を含む［３，４］。これらの過程の延長は、心不全（ＨＦ）、心室性不整脈及び短期及び長期の追跡調査における死亡への進行を決定する。したがって、ＡＭＩ後の有害な心筋リモデリング及び心臓合併症を最小限に抑えるための新しい治療法の探索は、心血管医療における優先事項である。

腫瘍形成の可溶性抑制２（Ｓｏｌｕｂｌｅｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓｓ：ｓＳＴ２）は、インターロイキン１受容体ファミリーのメンバーであり、インターロイキン１受容体様１（ＩＬ１ＲＬ１）としても公知であり［５］、２つの主要なアイソフォーム：膜結合受容体（ＳＴ２リガンド［ＳＴ２Ｌ］）及び可溶性ＳＴ２アイソフォーム（ｓＳＴ２）を有する［４］。ｓＳＴ２は、病的心臓過程に関連する固有のバイオマーカーである［６，７］。特に、ＡＭＩに罹患している患者では、ｓＳＴ２の循環濃度は、短期間（３０日間）及び長期追跡調査においても、死亡のより高いリスク及びＨＦへの有害な心筋リモデリングの進行を繰り返し特定している［８－１３］。

インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）は、ＳＴ２Ｌと相互作用することによって［１４］、ＩκＢαリン酸化並びにＮＦ－κＢプロモーター活性の活性化の両方の遮断に関連する心臓保護的な抗リモデリング応答［７、１５］を引き起こす［１６］。循環中の増加した濃度のｓＳＴ２は、膜結合ＳＴ２Ｌへのその結合を阻害することによって、ＩＬ－３３に直接結合し、デコイ受容体として作用することができ、したがってＩＬ－３３の心臓保護作用を遮断し、そのような阻害は、心肥大、心筋線維症、及び心室機能不全をもたらす［７、１５］。いくつかの実験研究は、心臓線維芽細胞及び心筋細胞の両方におけるＩＬ－３３及びｓＳＴ２の発現が心臓ストレスに応答して増加したことを示している。Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｔａｌ．は、２００２年に、ＳＴ２が生体力学的ストレスに応答して最も高度に誘導された転写物であり、ｓＳＴ２及びＳＴ２Ｌ形態が、周期的歪みを受けた新生児心筋細胞で誘導されたことを決定した［１０］。したがって、心筋梗塞モデルを使用して、本発明者らは、４週間後の心筋ｓＳＴ２レベルの増加が、炎症マーカー及び線維症マーカー等の心臓リモデリングマーカーと正に相関することを示した［１７］。したがって、ＩＬ－３３／ＳＴ２Ｌ経路を良好に調節することが治療選択肢として示唆されている［１８］。

本発明者らは、ＳＴ２の可溶性形態及び膜形態が二重プロモーターの細胞特異的調節を介して発現されることを知っているが［１０］、ＡＭＩ後の特異的ｓＳＴ２発現に関連する分子要素は未知である。生体力学的歪み下での計算ゲノミクス及び新生児心筋細胞を使用して、本発明者らは、ｓＳＴ２の心臓発現に関連する転写因子としてＹｉｎｙａｎｇ－１（Ｙｙ１）を同定した［１９］。このインビトロ研究では、内因性Ｙｙ１発現のサイレンシングは、ｓＳＴ２の発現及び放出の減少をもたらした［１９］。全体として、これらの所見は、Ｙｙ１発現レベルを低下させることがＡＭＩ後の有望な抗有害心臓リモデリング療法であるという考えを支持する。

本発明は、ＡＭＩ後の心機能障害及び有害な心筋リモデリングを改善するための新しい治療法を提供する。

ＩｂａｎｅｚＢ，ＪａｍｅｓＳ，ＡｇｅｗａｌｌＳ，ＡｎｔｕｎｅｓＭＪ，Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ－ＤｕｃｃｉＣ，ＢｕｅｎｏＨ，ＣａｆｏｒｉｏＡＬＰ，ＣｒｅａＦ，ＧｏｕｄｅｖｅｎｏｓＪＡ，ＨａｌｖｏｒｓｅｎＳ，ＨｉｎｄｒｉｃｋｓＧ，ＫａｓｔｒａｔｉＡ，ＬｅｎｚｅｎＭＪ，ＰｒｅｓｃｏｔｔＥ，ＲｏｆｆｉＭ，ＶａｌｇｉｍｉｇｌｉＭ，ＶａｒｅｎｈｏｒｓｔＣ，ＶｒａｎｃｋｘＰ，ＷｉｄｉｍｓｋｙＰ，ＢａｕｍｂａｃｈＡ，ＢｕｇｉａｒｄｉｎｉＲ，ＣｏｍａｎＩＭ，ＤｅｌｇａｄｏＶ，ＦｉｔｚｓｉｍｏｎｓＤ，ＧａｅｍｐｅｒｌｉＯ，ＧｅｒｓｈｌｉｃｋＡＨ，ＧｉｅｌｅｎＳ，ＨａｒｊｏｌａＶＰ，ＫａｔｕｓＨＡ，ＫｎｕｕｔｉＪ，ｅｔａｌ．２０１７ＥＳＣＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｗｉｔｈＳＴ－ｓｅｇｍｅｎｔｅｌｅｖａｔｉｏｎ．ＥｕｒＨｅａｒｔＪ２０１８；３９：１１９－１７７．ＤｅＬｕｃａＧ，ＳｕｒｙａｐｒａｎａｔａＨ，ＯｔｔｅｒｖａｎｇｅｒＪＰ．ｅｔａｌＴｉｍｅｄｅｌａｙｔｏｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｉｎｐｒｉｍａｒｙａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙｆｏｒａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｅｖｅｒｙｍｉｎｕｔｅｏｆｄｅｌａｙｃｏｕｎｔｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ２００４；１０９：１２２３－１２２５．ＳｕｔｔｏｎＭＧ，ＳｈａｒｐｅＮ．Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇａｆｔｅｒｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ２０００；１０１：２９８１－２９８８．ＫｏｎｓｔａｍＭＡ，ＫｒａｍｅｒＤＧ，ＰａｔｅｌＡＲ，ＭａｒｏｎＭＳ，ＵｄｅｌｓｏｎＪＥ．Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｉｎｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔｃｏｎｃｅｐｔｓｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｎｄａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．ＪＡＣＣＣａｒｄｉｏｖａｓｃＩｍａｇｉｎｇ２０１１；４：９８－１０８．ＧａｒｌａｎｄａＣ，ＤｉｎａｒｅｌｌｏＣＡ，ＭａｎｔｏｖａｎｉＡ．Ｔｈｅｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ｆａｍｉｌｙ：ｂａｃｋｔｏｔｈｅｆｕｔｕｒｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０１３；３９：１００３－１８．Ｐａｓｃｕａｌ－ＦｉｇａｌＤＡ，ＪａｎｕｚｚｉＪＬ．ＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙｏｆＳＴ２：ＴｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳＴ２ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＰａｎｅｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５；１１５：３Ｂ－７Ｂ．Ｐａｓｃｕａｌ－ＦｉｇａｌＤＡ，ＬａｘＡ，Ｐｅｒｅｚ－ＭａｒｔｉｎｅｚＭＴ，ｅｔａｌ．ＣｌｉｎｉｃａｌｒｅｌｅｖａｎｃｅｏｆｓＳＴ２ｉｎｃａｒｄｉａｃｄｉｓｅａｓｅｓ．ＣｌｉｎＣｈｅｍＬａｂＭｅｄ２０１６；５４：２９－３５．ＷｅｉｒＲＡＰ，ＭｉｌｌｅｒＡＭ，ＭｕｒｐｈｙＧＥＪ，ｅｔａｌ．ＳｅｒｕｍｓｏｌｕｂｌｅＳＴ２：ａｐｏｔｅｎｔｉａｌｎｏｖｅｌｍｅｄｉａｔｏｒｉｎｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒａｎｄｉｎｆａｒｃｔｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇａｆｔｅｒａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．ＪＡｍＣｏｌｌＣａｒｄｉｏｌ２０１０；５５：２４３－５０．ＢｉｅｒｅＬ，ＧａｒｃｉａＧ，ＧｕｉｌｌｏｕＳ，ｅｔａｌ．ＳＴ２ａｓａｐｒｅｄｉｃｔｏｒｏｆｌａｔｅｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇａｆｔｅｒｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．ＩｎｔＪＣａｒｄｉｏｌ２０１８；２５９：４０－４２．ＷｅｉｎｂｅｒｇＥＯ，ＳｈｉｍｐｏＭ，ＤｅＫｅｕｌｅｎａｅｒＧＷ，ｅｔａｌ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＴ２，ａｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ，ｉｎｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓａｎｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ２００２；１０６：２９６１－６．ＳａｂａｔｉｎｅＭＳ，ＭｏｒｒｏｗＤＡ，ＨｉｇｇｉｎｓＬＪ，ｅｔａｌ．ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｒｏｌｅｓｆｏｒｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｏｆｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｔｒａｉｎＳＴ２ａｎｄＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅＢ－ｔｙｐｅｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＳＴ－ｅｌｅｖａｔｉｏｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ２００８；１１７：１９３６－４４．ＳｈｉｍｐｏＭ，ＭｏｒｒｏｗＤＡ，ＷｅｉｎｂｅｒｇＥＯ，ｅｔａｌ．Ｓｅｒｕｍｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＳＴ２ｐｒｅｄｉｃｔｍｏｒｔａｌｉｔｙａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｏｕｔｃｏｍｅｉｎａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ２００４；１０９：２１８６－９０．ＪｅｎｋｉｎｓＷＳ，ＲｏｇｅｒＶＬ，ＪａｆｆｅＡＳ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃＶａｌｕｅｏｆＳｏｌｕｂｌｅＳＴ２ＡｆｔｅｒＭｙｏｃａｒｄｉａｌＩｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ＡＣｏｍｍｕｎｉｔｙＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．ＡｍＪＭｅｄ２０１７；１３０：１１１２．ｅ９－１１１２．ｅ１５．ＳｃｈｍｉｔｚＪ，ＯｗｙａｎｇＡ，ＯｌｄｈａｍＥ，ｅｔａｌ．ＩＬ－３３，ａｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１－ｌｉｋｅｃｙｔｏｋｉｎｅｔｈａｔｓｉｇｎａｌｓｖｉａｔｈｅＩＬ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＳＴ２ａｎｄｉｎｄｕｃｅｓＴｈｅｌｐｅｒｔｙｐｅ２－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２００５；２３：４７９－９０．ＳｅｋｉＫ，ＳａｎａｄａＳ，ＫｕｄｉｎｏｖａＡＹ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ＰｒｅｖｅｎｔｓＡｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＩｍｐｒｏｖｅｓＳｕｒｖｉｖａｌＡｆｔｅｒＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｙｏｃａｒｄｉａｌＩｎｆａｒｃｔｉｏｎＴｈｒｏｕｇｈＳＴ２Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｉｒｃ．Ｈｅａｒ．Ｆａｉｌ．２００９；２：６８４－６９１．ＳａｎａｄａＳ，ＨａｋｕｎｏＤ，ＨｉｇｇｉｎｓＬＪ，ＳｃｈｒｅｉｔｅｒＥＲ，ＭｃＫｅｎｚｉｅＡＮＪ，ＬｅｅＲＴ．ＩＬ－３３ａｎｄＳＴ２ｃｏｍｐｒｉｓｅａｃｒｉｔｉｃａｌｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙｉｎｄｕｃｅｄａｎｄｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７；１１７：１５３８－４９．Ｓａｎｃｈｅｚ－ＭａｓＪ，ＬａｘＡ，Ａｓｅｎｓｉｏ－ＬｏｐｅｚＭ，ｅｔａｌ．ＭｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＩＬ－３３／ＳＴ２ｓｙｓｔｅｍｉｎｐｏｓｔ－ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｃａｒｄｉａｃｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｍａｒｋｅｒｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１４；４４：６４３－５１．ＫａｋｋａｒＲ，ＬｅｅＲＴ．ＴｈｅＩＬ－３３／ＳＴ２ｐａｔｈｗａｙ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔａｎｄｎｏｖｅｌｂｉｏｍａｒｋｅｒ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ２００８；７：８２７－４０．Ａｓｅｎｓｉｏ－ＬｏｐｅｚＭＣ，ＬａｘＡ，ＦｅｒｎａｎｄｅｚｄｅｌＰａｌａｃｉｏＭＪ，ｅｔａｌ．Ｙｉｎ－Ｙａｎｇ１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｍｏｄｕｌａｔｅｓＳＴ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇａｄｖｅｒｓｅｃａｒｄｉａｃｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｐｏｓｔ－ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１９；１３０：２１６－２３３．

梗塞ＬＶ領域におけるＹｙ１発現レベルの増加の図である。（ａ）Ｙｙ１ｍＲＮＡレベル；データをＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して正規化した。（ｂ）遠隔ＬＶ領域におけるＹｙ１ｍＲＮＡレベル；データをＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して正規化した。偽群と比較して、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ：有意でない。ｓｉＹｙ１療法は、梗塞ＬＶ領域における心臓Ｙｙ１転写因子の上方制御を防ぐことを示す図である。（ａ）代表的なスキームの実験手順。（ｂ）Ｙｙ１ｍＲＮＡレベル；データをＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して正規化した。それぞれの偽群に対して、^＊＊＊ｐ＜０．００１；ＡＭＩ＋ｓｉＣｔｒｌ群に対して＃＃＃ｐ＜０．００１。ｓｉＣｔｒｌ：干渉ＲＮＡ制御；ｓｉＹｙ１：Ｙｙ１転写因子に対する特異的干渉ＡＲＮ；ＡＭＩ：急性心筋梗塞；ｎｓ：有意でない；Ｙｙ１：Ｙｉｎｙａｎｇ－１転写因子。ｓｉＹｙ１療法はＡＭＩ後の心機能を改善することを示す図である。（ａ～ｆ）心エコー検査で決定されたＥＦ（ａ）、ＦＳ（ｂ）、ＬＶＥｄＤ（ｃ）、ＬＶＥｓＤ（ｄ）、ＬＶＥｄＶ（ｅ）、又はＬＶＥｓＶ（ｆ）。それぞれの偽群に対して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１；ＡＭＩ＋ｓｉＣｔｒｌ群に対して＃＃＃ｐ＜０．００１。ＥＦ：駆出率；ＦＳ：短絡率；ＬＶＥｄＤ：左室拡張末期径；ＬＶＥｓＤ：左室収縮末期径；ＬＶＥｄＶ：左室拡張末期容積；ＬＶＥｓＶ：左室収縮末期容積；他の略語を上に示す。ｓｉＹｙ１療法は心機能及びＡＭＩ誘発性心肥大を改善することを示す図である。（ａ）心肥大の尺度としての心臓重量と脛骨長との比（ＨＷ／ＴＬ）。（ｂ、ｃ）左室組織における心臓リモデリングのためのマーカーのリアルタイムＰＣＲ定量化；Ｍｙｈ７／Ｍｙｈ６、β－及びα－ミオシン重鎖をコードするｍＲＮＡの比。Ｎｐｐａ、心房性ナトリウム利尿ペプチド。（ｄ）ＣＭ領域。ｎｓ：有意でない；それぞれの偽群に対して^＊＊＊ｐ＜０．００１。ＡＭＩ＋ｓｉＣｔｒｌ群に対して、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１。ＣＭ：心筋細胞。ｓｉＹｙ１療法はＡＭＩ後の心線維症を予防することを示す図である。（ａ～ｆ）ＴＧＦ－β、ｓｍａｄ－２、ｓｍａｄ－３、α－ｓｍａ、ｃｏｌ１ａ１、及びｃｏｌ３ａ１ｍＲＮＡレベル；データをＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して正規化した。（ｇ）示された群のシリウスレッド及びマッソン染色心筋からの代表的な画像切片；スケールバー：０．２５ｃｍ。ｎｓ：有意でない；^＊＊＊それぞれの偽群に対して、ｐ＜０．００１。ＡＭＩ＋ｓｉＣｔｒｌ群に対して＃＃＃ｐ＜０．００１。ｓｉＹｙ１療法はＡＭＩ後の有害な心臓炎症を遮断することを示す図である。（ａ～ｄ）ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＰＴＸ３及びＣＲＰｍＲＮＡレベル；データをＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して正規化した。ｎｓ：有意ではない；それぞれの偽群に対して^＊＊＊ｐ＜０．００１；ＡＭＩ＋ｓｉＣｔｒｌ群に対して＃＃＃ｐ＜０．００１。ＴＮＦ：腫瘍壊死因子；ＩＬ：インターロイキン；ＰＴＸ：ペントラキシン：ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質。ｓｉＹｙ１療法はＡＭＩ後の心筋死を改善することを示す図である。（ａ～ｃ）ＭｙＯ、Ｈ－ＦＡＢＰ及びＢＮＰｍＲＮＡレベル；データをＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して正規化する。それぞれの偽群に対して^＊＊＊ｐ＜０．００１；ＡＭＩ＋ｓｉＣｔｒｌ群に対して＃＃＃ｐ＜０．００１。ＭｙＯ：ミオグロビン；Ｈ－ＦＡＢＰ：脂肪酸結合タンパク質；ＢＮＰ：脳性ナトリウム利尿ペプチド。ｓｉＹｙ１療法はＩＬ－３３／ＳＴ２Ｌ軸を調節することを示す図である。（ａ－ｃ）ＩＬ－３３、ＳＴ２Ｌ及びｓＳＴ２ｍＲＮＡレベル；データをＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して正規化する。それぞれの対照に対して、^＊＊＊ｐ＜０．００１；ＡＭＩ＋ｓｉＣｔｒｌ群に対して＃＃＃ｐ＜０．００１。ＩＬ：インターロイキン；ＳＴ２Ｌ：膜受容体ＳＴ２Ｌ；ｓＳＴ２：可溶性アイソフォームＳＴ２。時間依存性戦略の代表的な実験計画の図である。ＭＩ後のｓｉＹｙ１開始の異なる時間に基づく研究の設計。黒色矢印は偽／ＭＩ手順を示す。矢印の頭は、処置の時間点を示す。ＭＩ後３０分で、生存動物をＭＩ及び偽の２つの全体的な群に無作為化した。ＭＩ後、ｓｉＹｙ１療法、又はｓｉＣｔｒｌ若しくはＤＰＢＳの開始時間に従って、動物を異なる処置サブグループに無作為化した。１時間（＝Ｓ１ｈ）、２４時間（＝Ｓ２４ｈ）、３日間（＝Ｓ３ｄ）、７日間（＝Ｓ７ｄ）又は１４日間（＝Ｓ１４ｄ）。ＳｉＹｙ１療法（６ｍｇ／ｋｇ静脈内）を３回の投与が完了するまで７日ごとに繰り返した。サブグループＳ１ｈ、Ｓ２４ｈ、Ｓ３ｄ及びＳ７ｄの動物をＭＩ後４週間で屠殺し、一方、Ｓ１４ｄの動物をＭＩ後８週間で屠殺した。ＳｉＹｙ１療法は、開始時間にかかわらず、ＭＩ後にＹｙ１転写因子の下方制御を誘導したことを示す図である。ＭＩ後４週間（Ｓ１ｈ～Ｓ７ｄ群）又はＭＩ後８週間（Ｓ１４ｄ群）の梗塞ＬＶ領域におけるＹｙ１ｍＲＮＡレベル。偽群と比較して、梗塞ＬＶ心筋におけるＹｙ１ｍＲＮＡレベルは、ＭＩの存在下で上昇し（ＭＩ－ｓｉＹｙ１）、全ての治療群（ＭＩ＋ｓｉＹｙ１）においてｓｉＹｙ１療法によって有意に低下した（ｐ＜０．００１、全ての場合）。ｓｉＹｙ１療法はＭＩ後の心肥大に対して保護することを示す図である。（ａ）ＭＩ後４週間（Ｓ１ｈ～Ｓ７ｄ）又は８週間（Ｓ１４ｄ）に採取され、ｓｉＹｙ１で治療された、又はされていない心臓の代表的な画像。スケールバー：０．５ｃｍ。（ｂ）心臓重量対体重比（ｃ）心筋細胞肥大の分子マーカー（Ｍｙｈ７／Ｍｙｈ６及びＮｐｐａ）の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。ＰＣＲをそれぞれ２回反復して行った。全ての定量的データは、ＭＩと偽（ＭＩ－偽）との間の変化の平均±ＳＥＭとして報告される。計算された平均値は、各群の異なる数の動物を補正するための限界平均値であった。対照は、各開始（スチューデントのｔ検定）による処置間の変化（ｄｉｆｆ－ｉｎ－ｄｉｆｆ）の差を比較するために行った。破線（三角形）は非治療的ＭＩを示し、実線（円）はｓｉＹｙ１で治療されたＭＩを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１及び^＊ｐ＜０．０５。略語：ＢＷ：体重；ＤＰＢＳ：平衡塩類溶液；ＨＷ：心臓重量；ＬＷ：左室重量；Ｍｙｈ：ミオシン重鎖；Ｎｐｐａ：ナトリウム利尿ペプチドＡ；ｎｓ：有意でない；Ｓ１ｈ…Ｓ１４ｄ：処理開始；ｓｉＣｔｒｌ：干渉ＲＮＡ制御；ｓｉＹｙ１：サイレンシングＹｙ１に対する特異的干渉ＲＮＡ組成。他の略語は前述の通りである。最初の３日以内に開始したｓｉＹｙ１治療が、肉眼的心肥大（ａ）、ＨＷ／ＢＷ比（ｂ）に関して、ＭＩ誘発性心肥大に対して保護した。最初の７日以内に開始したｓｉＹｙ１療法が、肥大関連マーカー遺伝子Ｍｙｈ７（Ｍｙｈ６に関連する）及びＮｐｐａ（ｃ）のレベルに関して、ＭＩ誘発性心肥大に対して保護した。１４日目に開始されたｓｉＹｙ１治療は効果がなかった。ｓｉＹｙ１療法は、心エコー検査によって評価されるＭＩ後の有害なＬＶリモデリング：収縮期ＬＶ機能不全及びＬＶ拡張に対して保護することを示す図である。Ｙｙ１をサイレンシングするためのＲＮＡ干渉ベースの治療は、ＭＩ後の心機能障害を保護する。（ａ、ｂ）ＭＩの４週間後（Ｓ１ｈ～Ｓ７ｄ群）又はＭＩの８週間後（Ｓ１４ｄ群）の偽手術マウス及びＭＩ手術マウスにおける左室駆出率（ａ）及び短縮率（ｂ）の心エコー分析。（ｃ、ｄ）ＭＩの４週間後（Ｓ１ｈ～Ｓ７ｄ群）又はＭＩの８週間後（Ｓ１４ｄ群）の偽手術マウス及びＭＩ手術マウスにおける左室拡張末期径（ｃ）及び左室収縮末期径（ｄ）の心エコー分析。（ｅ，ｆ）ＭＩの４週間後（Ｓ１ｈ～Ｓ７ｄ群）又はＭＩの８週間後（Ｓ１４ｄ群）の偽手術マウス及びＭＩ手術マウスにおける左室拡張末期容積（ｅ）及び左室収縮末期容積（ｆ）の心エコー分析。全ての定量的データは、ＭＩと偽（ＭＩ－偽）との間の変化の平均±ＳＥＭとして報告される。計算された平均値は、各群の異なる数の動物を補正するための限界平均値であった。対照は、各開始（スチューデントのｔ検定）による処置間の変化（ｄｉｆｆ－ｉｎ－ｄｉｆｆ）の差を比較するために行った。破線（三角形）は非治療的ＭＩを示し、実線（円）はｓｉＹｙ１で治療されたＭＩを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１及び^＊ｐ＜０．０５。略語：ＬＶＥｄＤ：左室拡張末期径；ＬＶＥｓＤ：左室収縮末期径；ＬＶＥｄＶ：左室拡張末期容積；ＬＶＥｓＶ：左室収縮末期容積；ｍｌ：ミリリットル；ｍｍ：ミリメートル。他の略語は前述の通りである。最初の３日以内に開始されたｓｉＹｙ１治療は、ＬＶ駆出率（ａ）及び短縮率（ｂ）の有意に低い低下に関してＬＶ収縮機能不全に対して保護し、最初の７日以内に開始されたｓｉＹｙ１治療は、ＬＶ拡張末期径及び収縮末期径（ｃ、ｄ）、並びにＬＶ拡張末期容積及び収縮末期容積（ｅ，ｆ）のより低い増加に関してＬＶ拡大に対して保護した。１４日目に開始されたｓｉＹｙ１治療は効果がなかった。ｓｉＹｙ１療法はＭＩ後の線維化を予防することを示す図である。ｓｉＹｙ１療法は最初の７日以内に開始され、有意に低いシリウスレッド染色（ａ）（パネルｂの代表的な画像）並びに有意に低いレベルの異なる線維症関連マーカー遺伝子の調節解除（ｃ～ｆ）に関して、梗塞心筋における線維化に対して保護した。（ａ）示された群におけるシリウスレッド染色を示す代表的な顕微鏡写真（×２０）。グラフは、間質性線維症の定量的分析を示す。スケールバー：１００μｍ。（ｂ～ｅ）心線維症の分子マーカー（ＴＧＦ－β、α－ｓｍａ、ｃｏｌ１ａ１、ｃｏｌ３ａ１）の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。ＰＣＲをそれぞれ２回反復して行った。全ての定量的データは、ＭＩと偽（ＭＩ－偽）との間の変化の平均±ＳＥＭとして報告される。計算された平均値は、各群の異なる数の動物を補正するための限界平均値であった。対照は、各開始（スチューデントのｔ検定）による処置間の変化（ｄｉｆｆ－ｉｎ－ｄｉｆｆ）の差を比較するために行った。破線（三角形）は非治療的ＭＩを示し、実線（円）はｓｉＹｙ１で治療されたＭＩを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、及び^＊ｐ＜０．０５。略語：α－ｓｍａ：α－平滑筋アクチン；ＴＧＦ－β：トランスフォーミング成長因子ベータ；Ｃｏｌ：コラーゲン。他の略語は前述の通りである。１４日目に開始した治療は効果がなかった。ｓｉＹｙ１療法はＭＩ後の心臓炎症に対して保護することを示す図である。（ａ）示された群におけるＣＤ４５染色を示す代表的な顕微鏡写真（×２０）。グラフは、ＣＤ４５陽性の定量分析を示す。スケールバー：１００μｍ。（ｂ、ｃ）心臓炎症の分子マーカー（ＩＬ－６及びＴＮＦα）の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。ＰＣＲをそれぞれ２回反復して行った。全ての定量的データは、ＭＩと偽（ＭＩ－偽）との間の変化の平均±ＳＥＭとして報告される。計算された平均値は、各群の異なる数の動物を補正するための限界平均値であった。対照は、各開始（スチューデントのｔ検定）による処置間の変化（ｄｉｆｆ－ｉｎ－ｄｉｆｆ）の差を比較するために行った。破線（三角形）は非治療的ＭＩを示し、実線（円）はｓｉＹｙ１で治療されたＭＩを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１。略語：ＩＬ：インターロイキン；ＴＮＦ：腫瘍壊死因子。他の略語は前述の通りである。最初の７日以内に開始したｓｉＹｙ１療法が、より低レベルのＣＤ４５陽性染色（ａ）（パネルｂの代表的な画像）及び炎症関連特異的マーカー（ｃ～ｄ）に関して、梗塞心筋における炎症に対して保護した。１４日目に開始した治療は効果がなかった。ｓｉＹｙ１療法はＭＩ後の心筋死に対して保護することを示す図である。（ａ）示された群における活性カスパーゼ３染色を示す代表的な顕微鏡写真（×２０）。グラフは、活性カスパーゼ３の定量分析を示す。スケールバー：１００μｍ。（ｂ、ｃ）心臓死の分子マーカー（ＢＮＰ及びＭｙＯ）の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。ＰＣＲをそれぞれ２回反復して行った。全ての定量的データは、ＭＩと偽（ＭＩ－偽）との間の変化の平均±ＳＥＭとして報告される。計算された平均値は、各群の異なる数の動物を補正するための限界平均値であった。対照は、各開始（スチューデントのｔ検定）による処置間の変化（ｄｉｆｆ－ｉｎ－ｄｉｆｆ）の差を比較するために行った。破線（三角形）は非治療的ＭＩを示し、実線（円）はｓｉＹｙ１で治療されたＭＩを示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１。略語：ＭｙＯ：ミオグロビン；Ｈ－ＦＡＢＰ：脂肪酸結合タンパク質；ＢＮＰ：脳性ナトリウム利尿ペプチド。他の略語は前述の通りである。最初の７日以内に開始されたｓｉＹｙ１療法は、カスパーゼ３タンパク質レベルの有意に低い増加（ａ）、並びにＢＮＰ及びＭｙＯｍＲＮＡレベルの有意に低い増加（ｃ～ｄ）に関して細胞死に対して保護した。ｓｉＹｙ１療法は、ヒトｉＰ由来心筋細胞の伸張誘導性肥大を予防することを示す図である。（ａ）延伸後のＣＭにおけるＹｙ１ｍＲＮＡレベルの定量を評価した。（ｂ、ｃ）心筋細胞肥大の分子マーカー（Ｍｙｈ７／Ｍｙｈ６及びＮｐｐａ）の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。ＰＣＲをそれぞれ２回反復して行った。全ての定量的データを平均±ＳＥＭとして報告する。対照群（Ｓｃｒ）と比較して、^＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｓｃｒ＋ＰＭＡ群と比較して＃＃＃ｐ＜０．００１；二元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてボンフェローニの事後検定によって決定した。略語：Ｓｃｒ：スクランブル。他の略語は前述の通りである。

発明の簡単な説明

本発明の初期の態様は、ヒト又は動物対象の心臓細胞におけるＹｉｎＹａｎｇ－１（Ｙｙ１）遺伝子の発現を、当該細胞における化合物の非存在下で観察される発現に対して減少させることができる化合物を含む組成物に関し、化合物は、Ｙｙ１遺伝子のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）であり、当該組成物は、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）後の左室（ＬＶ）機能不全の治療方法における使用のためのものであり、当該組成物は、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１２時間～７日の間に投与される。

好ましくは、当該組成物は、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１～７日の間に投与される。

より好ましくは、当該組成物は、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１２時間～３日の間に投与される。更に好ましくは、当該組成物は、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１～３日の間に投与される。

更に好ましくは、当該組成物は、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後３～７日の間に投与される。

好ましい実施形態では、組成物が対象において心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１２時間～３日の間に投与されるか、又は対象において心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１～３日の間に投与される場合、当該組成物は、左室（ＬＶ）駆出率及び／又は短縮率の喪失を予防すること、治療すること、緩和すること、若しくは減少させることによって、並びに／あるいはＭＩ誘発性心肥大を予防すること、治療すること、緩和すること、若しくは減少させることによって、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）後のＬＶ機能不全を治療する方法において使用するためのものである。

好ましい実施形態では、組成物が対象において心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１日～７日の間に投与されるか、又は対象において心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後３～７日の間に投与される場合、当該組成物は、左室（ＬＶ）拡大を予防すること、治療すること、緩和すること、若しくは減少させることによって、対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）後のＬＶ機能不全を治療する方法において使用するためのものである。

好ましい実施形態では、Ｙｙ１遺伝子の干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）は、以下の化合物：センス配列番号１及びアンチセンス配列番号２を有する化合物１、センス配列番号３及びアンチセンス配列番号４を有する化合物２、センス配列番号５及びアンチセンス配列番号６を有する化合物３、センス配列番号７及びアンチセンス配列番号８を有する化合物４、センス配列番号４９及びアンチセンス配列番号５０を有する化合物５、センス配列番号５１及びアンチセンス配列番号５２を有する化合物６、センス配列番号５３及びアンチセンス配列番号５４を有する化合物７、並びにセンス配列番号５５及びアンチセンス配列番号５６を有する化合物８の任意のものからなる群より選択されるｓｉＲＮＡである。

好ましい実施形態では、化合物は静脈内投与される。

好ましい実施形態では、組成物は、以下の化合物：センス配列番号１及びアンチセンス配列番号２を有する化合物１、センス配列番号３及びアンチセンス配列番号４を有する化合物２、センス配列番号５及びアンチセンス配列番号６を有する化合物３、センス配列番号７及びアンチセンス配列番号８を有する化合物４、センス配列番号４９及びアンチセンス配列番号５０を有する化合物５、センス配列番号５１及びアンチセンス配列番号５２を有する化合物６、センス配列番号５３及びアンチセンス配列番号５４を有する化合物７、並びにセンス配列番号５５及びアンチセンス配列番号５６を有する化合物８、又はこれらのオリゴヌクレオチドを発現するベクターの任意のものからなる群より選択されるｓｉＲＮＡの治療有効量と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物である。

発明の詳細な説明

本発明は、概して、内因性Ｙｙ１発現を抑制し、ｓＳＴ２の発現及び放出を減少させ、ＩＬ－３３／ＳＴ２Ｌ軸に関連する心保護反応を促進する化合物に関し、特にＹｙ１発現レベルを低下させる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び有害な心筋リモデリングの予防又は治療、特に心筋線維症、心臓炎症、心肥大及び／又は機能障害等のＡＭＩ後の心臓合併症の予防又は治療のための、ＡＭＩの２～４８時間後のそれを必要とする対象へのこれらのｓｉＲＮＡの投与に関する。全体として、これらの所見は、ＡＭＩの２時間以上後に再灌流療法の有効な代替治療を提供するという技術的問題を解決する。

また、本発明は更に、ＩＬ－３３／ＳＴ２Ｌ軸、特に、ＡＭＩの１２時間後～７日後に投与される左室機能不全の治療方法において、内因性Ｙｙ１の細胞における発現を下方制御するのに有効な量で、Ｙｙ１発現レベルを低下させる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関連する心保護反応を促進する、ｓＳＴ２の発現及び放出の減少をもたらす内因性Ｙｙ１発現をサイレンシングする化合物を一般的に提供する。特に、ＡＭＩ後最初の３日以内に開始される治療方法では、好ましくは肉眼的心肥大に関して、ＡＭＩ誘発性心肥大を治療又は予防する。好ましくは、最初の７日以内に開始される治療方法では、好ましくは（Ｍｙｈ６に関連する）肥大関連マーカー遺伝子Ｍｙｈ７及びＮｐｐａのレベルに関して、ＡＭＩ誘発性心肥大を治療又は予防する。好ましくは、最初の３日以内に開始される治療方法において、ＬＶ駆出率及び／又は短縮率の有意に低い低下に関して、ＬＶ収縮機能不全に対して治療又は保護する。好ましくは、ＡＭＩ後最初の７日以内に開始される治療方法では、好ましくはＬＶ拡張末期径及び収縮末期径並びに／あるいはＬＶ拡張末期容積及び収縮末期容積のより低い増加に関して、ＬＶ拡大に対して治療又は保護する。

本明細書では、Ｙｙ１（ＹｉｎＹａｎｇ－１）は、Ｙｙ１遺伝子によってコードされるヒトの転写抑制タンパク質であることに留意されたい（ＳｈｉＹｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９１Ｏｃｔ１８；６７（２）：３７７－８８；ＺｈｕＷｅｔａｌ．，ＭａｍｍＧｅｎｏｍｅ．１９９４Ａｐｒ；５（４）：２３４－６）。

より好ましくは、本発明は、ヒト又は動物対象の心臓細胞における内因性Ｙｙ１の発現を、当該細胞における化合物の非存在下で観察される発現に対して下方制御する化合物であって、例えばｓｉＲＮＡ、好ましくはセンス配列番号１及びアンチセンス配列番号２を有する化合物１、センス配列番号３及びアンチセンス配列番号４を有する化合物２、センス配列番号５及びアンチセンス配列番号６を有する化合物３、センス配列番号７及びアンチセンス配列番号８を有する化合物４、センス配列番号４９及びアンチセンス配列番号５０を有する化合物５、センス配列番号５１及びアンチセンス配列番号５２を有する化合物６、センス配列番号５３及びアンチセンス配列番号５４を有する化合物７、並びにセンス配列番号５５及びアンチセンス配列番号５６を有する化合物８として列挙される化合物に関し、ＡＭＩ後の有害な心筋リモデリングの予防又は治療、特に心筋線維症、心臓炎症、心肥大及び／又は機能障害等のＡＭＩ後の心臓合併症の予防又は治療におけるこれらの化合物の使用に関し、これらの化合物は、ＡＭＩの発症の２～４８時間後にそれを必要とする対象に投与される。好ましくは、そのような化合物は、ＡＭＩの４～４８時間後に投与される。より好ましくは、ＡＭＩの６～４８時間後である。更により好ましくは、ＡＭＩ後１２～４８時間又は２４～４８時間である。更により好ましくは、ＡＭＩ後２、４、６又は１２～２４時間後である。

また、本発明は、ＡＭＩ後の１２時間～７日、好ましくはＡＭＩ後の１～７日に投与される、左室機能不全の治療方法における上記化合物の使用に言及する。特に、ＡＭＩ後最初の３日間、好ましくは１２時間～３日間、より好ましくは１～３日間で開始される治療方法では、好ましくは肉眼的心肥大に関して、ＡＭＩ誘発性心肥大を治療又は予防する。好ましくは、最初の７日間、好ましくは１２時間～７日間、より好ましくは１～７日間に開始される治療方法では、好ましくは肥大関連マーカー遺伝子Ｍｙｈ７（Ｍｙｈ６に関連する）及びＮｐｐａのレベルに関して、ＡＭＩ誘発性心肥大に対して治療又は保護する。好ましくは、最初の３日間、好ましくは１２時間～３日間、より好ましくは１～３日間に開始される治療方法では、ＬＶ駆出率及び／又は短縮率の有意に低い低下に関して、ＬＶ収縮機能不全に対して治療又は保護する。好ましくは、ＡＭＩ後最初の７日間、好ましくは１２時間～７日間、より好ましくは１～７日間で開始される治療方法では、好ましくはＬＶ拡張末期径及び収縮末期径並びに／あるいはＬＶ拡張末期容積及び収縮末期容積のより低い増加に関して、ＬＶ拡大に対して治療又は保護する。

本発明は更に、ＡＭＩ後の上記の時間間隔の任意内に組成物を必要とする患者に当該組成物を投与することによって、ＡＭＩ後の有害な心筋リモデリングに罹患している、特に、心筋線維症、心臓炎症、心肥大及び／又は機能障害等のＡＭＩ後の心臓合併症に罹患している患者において回復を促進するための組成物を調製するための、内因性Ｙｙ１の発現を下方制御する１つ又は複数の化合物、例えばｓｉＲＮＡ、好ましくはセンス配列番号１及びアンチセンス配列番号２を有する化合物１、センス配列番号３及びアンチセンス配列番号４を有する化合物２、センス配列番号５及びアンチセンス配列番号６を有する化合物３、並びにセンス配列番号７及びアンチセンス配列番号８を有する化合物４、センス配列番号４９及びアンチセンス配列番号５０を有する化合物５、センス配列番号５１及びアンチセンス配列番号５２を有する化合物６、センス配列番号５３及びアンチセンス配列番号５４を有する化合物７、並びにセンス配列番号５５及びアンチセンス配列番号５６を有する化合物８として列挙されるものの治療有効用量の使用を提供する。

したがって、本発明は、ヒト又は動物対象の心臓細胞におけるインビボでの内因性Ｙｙ１の発現を、当該細胞における化合物の非存在下で観察される発現に対して阻害するための方法及び組成物を提供する。一般に、方法は、心臓細胞中の内因性Ｙｙ１を標的とし、生物学的条件下（心臓細胞内）で当該ｍＲＮＡにハイブリダイズする又は相互作用する低分子干渉ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ）等のオリゴリボヌクレオチドを、ＲＮＡ干渉機構によって内因性Ｙｙ１の発現を下方制御するのに十分な量で投与することを含む。

したがって、本発明によれば、内因性Ｙｙ１のｓｉＲＮＡ分子又は阻害剤は、ＡＭＩの発症後に以前に示された時間間隔内にこれらの薬物を投与することによって、ＡＭＩ後に予防、治療又は回復を促進するための薬物として、それを必要とする患者において使用され得る。特に、これらの薬物は、ＡＭＩ後の有害な心筋リモデリングを予防又は治療するために、特に心筋線維症、心臓炎症、心肥大及び／又は機能障害等のＡＭＩ後の心臓合併症を予防又は治療するために投与される。より具体的には、内因性Ｙｙ１のｓｉＲＮＡ分子又は阻害剤は、ＡＭＩ後の１２時間～７日、好ましくはＡＭＩ後の１～７日に投与される左室機能不全の治療方法に使用される。特に、ＡＭＩ後最初の３日間、好ましくは１２時間～３日間、より好ましくは１～３日間で開始される治療方法では、好ましくは肉眼的心肥大に関して、ＡＭＩ誘発性心肥大を治療又は予防する。好ましくは、最初の７日間、好ましくは１２時間～７日間、より好ましくは１～７日間に開始される治療方法では、好ましくは肥大関連マーカー遺伝子Ｍｙｈ７（Ｍｙｈ６に関連する）及びＮｐｐａのレベルに関して、ＡＭＩ誘発性心肥大に対して治療又は保護する。好ましくは、最初の３日間、好ましくは１２時間～３日間、より好ましくは１～３日間に開始される治療方法では、ＬＶ駆出率及び／又は短縮率の有意に低い低下に関して、ＬＶ収縮機能不全に対して治療又は保護する。好ましくは、ＡＭＩ後最初の７日間、好ましくは１２時間～７日間、より好ましくは１～７日間で開始される治療方法では、好ましくはＬＶ拡張末期径及び収縮末期径並びに／あるいはＬＶ拡張末期容積及び収縮末期容積のより低い増加に関して、ＬＶ拡大に対して治療又は保護する。

したがって、本発明は、ヒト又は動物対象の心臓細胞における内因性Ｙｙ１の発現を、当該細胞における化合物の非存在下で観察される発現に対して下方制御する二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を提供する（本明細書における「本発明の化合物」又は「本発明のｓｉＲＮＡ」の後から）。本発明のｓｉＲＮＡ又は本発明の化合物は、センス鎖が内因性Ｙｙ１のｍＲＮＡ配列に由来し、アンチセンス鎖がセンス鎖に相補的である二重鎖オリゴリボヌクレオチドである。一般に、標的ｍＲＮＡ配列からのいくらかの逸脱は、ｓｉＲＮＡ活性を損なうことなく許容される（例えば、Ｃｚａｕｄｅｒｎａｅｔａｌ２００３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈＨ（Ｈ），２７０５－２７１６を参照されたい）。本発明のｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを破壊してもしなくても、転写後レベルで遺伝子発現を阻害する。理論に拘束されるものではないが、ｓｉＲＮＡは、特異的な切断及び分解のためにｍＲＮＡを標的化し得、及び／又は標的化されたメッセージからの翻訳を阻害し得る。

一般に、本発明で使用されるｓｉＲＮＡは、二本鎖構造を含むリボ核酸を含み、それによって、二本鎖構造は第１の鎖及び第２の鎖を含み、それによって、第１の鎖は連続したヌクレオチドの第１の伸長を含み、それによって、当該第１の伸長は標的核酸（内因性Ｙｙ１）に少なくとも部分的に相補的であり、第２の鎖は連続したヌクレオチドの第２の伸長を含み、それによって、当該第２の伸長は標的核酸（内因性Ｙｙ１）と少なくとも部分的に同一である。鎖は、糖及び／又はホスファート及び／又は塩基上で修飾されていてもよく、あるいは修飾されていなくてもよい。本発明の一実施形態では、当該第１の鎖及び／又は当該第２の鎖は、２’位に修飾を有する修飾ヌクレオチドの複数の群を含み、それにより、鎖内で、修飾ヌクレオチドの各群は、隣接するヌクレオチド群と片側又は両側で隣接し、それにより、ヌクレオチドの隣接群を形成する隣接ヌクレオチドは、未修飾ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドのいずれかである。更に、当該第１の鎖及び／又は当該第２の鎖は、当該複数の修飾ヌクレオチドを含んでもよく、当該複数の修飾ヌクレオチド群を含んでもよい。

修飾されたヌクレオチドの群及び／又は隣接するヌクレオチドの群は、多数のヌクレオチドを含み得、それによって、その数は、１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドを含む群から選択される。本明細書で指定される任意の範囲に関連して、各範囲は、当該範囲を定義する当該２つの図を含む範囲を定義するために使用されるそれぞれの図の間の任意の個々の整数を開示することを理解されたい。したがって、この場合、群は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド及び１０ヌクレオチドを含む。

当該第１の鎖の修飾ヌクレオチドのパターンは、第２の鎖の修飾ヌクレオチドのパターンに対して１つ以上のヌクレオチドだけシフトされ得る。

上に論じられる修飾は、アミノ、フルオロ、メトキシアルコキシ、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃｉ～Ｃｉｏ低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル又はアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロジクロアルキル；ヘテロジクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；とりわけ、欧州特許第５８６５２０号又は欧州特許第６１８９２５号に記載されているような、ポリアルキルアミノ又は置換シリルを含む群から選択され得る。

ｓｉＲＮＡの二本鎖構造は、片側又は両側が平滑末端であってもよい。より具体的には、二本鎖構造は、第１の鎖の５’－末端及び第２の鎖の３’－末端によって規定される二本鎖構造側で平滑末端であってもよく、又は二本鎖構造は、第１の鎖の３’－末端及び第２の鎖の５’－末端によって規定される二本鎖構造側で平滑末端であってもよい。

更に、２つの鎖のうちの少なくとも１つは、５’－末端に少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを有し得、オーバーハングは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドからなり得る。鎖の少なくとも１つは、３’－末端に少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを有していてもよい。ｓｉＲＮＡの二本鎖構造の長さは、典型的には約１７～２７塩基、より好ましくは１９又は２１塩基である。更に、当該第一の鎖の長さ及び／又は当該第二の鎖の長さは、互いに独立して、約１５～約２７塩基、１７～２１塩基及び１８又は１９塩基の範囲を含む群から選択されてもよい。具体例は２７塩基である。更に、当該第１の鎖と標的核酸との間の相補性は完全であってもよく、又は第１の鎖と標的核酸との間に形成される二重鎖は、少なくとも１５ヌクレオチドを含み得、当該第１の鎖と当該二本鎖構造を形成する標的核酸との間には、１つのミスマッチ又は２つのミスマッチがある。

いくつかの場合、第１鎖及び第２鎖の両方はそれぞれ、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの群及び少なくとも１つの隣接するヌクレオチドの群を含み、それによって、修飾ヌクレオチドの各群は少なくとも１つのヌクレオチドを含み、それによって、ヌクレオチドの各隣接する群は、第１鎖の修飾ヌクレオチドの各群が第２鎖の隣接するヌクレオチドの群と整列している、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、それによって、第１鎖の最末端５’ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドの群のヌクレオチドであり、第２鎖の最末端３’ヌクレオチドは、ヌクレオチドの隣接する群のヌクレオチドである。修飾ヌクレオチドの各群は、単一ヌクレオチドからなり得、及び／又はヌクレオチドの各隣接群は、単一ヌクレオチドからなり得る。

更に、第１の鎖では、ヌクレオチドの隣接基を形成するヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの群を形成するヌクレオチドに対して３’方向に配置された非修飾ヌクレオチドであり、第２の鎖では、修飾ヌクレオチドの群を形成するヌクレオチドは、ヌクレオチドの隣接基を形成するヌクレオチドに対して５’方向に配置された修飾ヌクレオチドであることが可能である。

更に、ｓｉＲＮＡの第一鎖は、８～１２個、好ましくは９～１１個の修飾ヌクレオチドの群を含み得、第二鎖は、７～１１個、好ましくは８～１０個の修飾ヌクレオチドの群を含み得る。

第１の鎖及び第２の鎖は、とりわけポリエチレングリコール等の非核酸ポリマーから構成され得るループ構造によって連結され得る。あるいは、ループ構造は核酸から構成されてもよい。

更に、ｓｉＲＮＡの第１の鎖の５’末端は、第２の鎖の３’末端に連結されていてもよく、又は第１の鎖の３’末端は、第２の鎖の５’末端に連結されていてもよく、当該連結は、典型的には１０～２０００個の核酸塩基の長さを有する核酸リンカーを介している。

特に、以前に既に示したように、本発明は、センス配列番号１及びアンチセンス配列番号２を有する化合物１、センス配列番号３及びアンチセンス配列番号４を有する化合物２、センス配列番号５及びアンチセンス配列番号６を有する化合物３、並びにセンス配列番号７及びアンチセンス配列番号８を有する化合物４、センス配列番号４９及びアンチセンス配列番号５０を有する化合物５、センス配列番号５１及びアンチセンス配列番号５２を有する化合物６、センス配列番号５３及びアンチセンス配列番号５４を有する化合物７、並びにセンス配列番号５５及びアンチセンス配列番号５６を有する化合物８からなる群より選択される本発明の化合物又は本発明のｓｉＲＮＡを提供し、これらの化合物の任意のものは、本明細書全体を通して示される修飾の任意のものを含んでいてもよい。好ましくは、本発明は、センス配列番号４９及びアンチセンス配列番号５０を有する化合物５、センス配列番号５１及びアンチセンス配列番号５２を有する化合物６、センス配列番号５３及びアンチセンス配列番号５４を有する化合物７、並びにセンス配列番号５５及びアンチセンス配列番号５６を有する化合物８からなる群より選択される本発明の化合物又は本発明のｓｉＲＮＡを提供し、これらの化合物のいずれも、本明細書全体を通して示される修飾の任意のものを含んでいてもよい。

したがって、本発明の化合物は、共有結合によって連結された複数のヌクレオチドからなることが当業者によって容易に理解されるであろう。そのような各共有結合は、個々の鎖のヌクレオチド配列の長さに沿って、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、又はその両方の組合わせであり得る。他の可能な骨格修飾は、とりわけ米国特許第５，５８７，３６１号、同第６，２４２，５８９号、同第６，２７７，９６７号、同第６，３２６，３５８号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４８９，６７７号、及び同第５，５９６，０８６号に記載される。

本発明は更に、前述のオリゴリボヌクレオチドのどれかを非修飾形態で細胞において発現させることができ、その後に適切な修飾を行うことができるベクターを提供する。

本発明はまた、１つ又は複数の本発明の化合物又は本発明のｓｉＲＮＡを担体、好ましくは薬学的に許容される担体中に含む組成物を提供する。この組成物は、２つ以上の異なるｓｉＲＮＡの混合物を含み得る。

より具体的には、本発明は、担体と、内因性Ｙｙ１の細胞における発現を下方制御するのに有効な量の本発明の化合物の１つ以上と、を含む組成物を提供する。特に、既に示し、実施例２で説明したように、図１１に示す実験データは、担体と、内因性Ｙｙ１の細胞における発現を下方制御するのに有効な量の本発明の化合物の１つ又は複数と、を含む任意の組成物を用いたｓｉＹｙ１療法が、最初の３日以内に開始された場合、肉眼的心肥大（ａ）、ＨＷ／ＢＷ比（ｂ）に関して、ＭＩ誘発性心肥大から保護したことを示している。最初の７日以内にｓｉＹｙ１療法を開始した場合、肥大関連マーカー遺伝子Ｍｙｈ７（Ｍｙｈ６に関連する）及びＮｐｐａ（ｃ）のレベルに関して、ＭＩ誘発性心肥大から保護した。１４日目に開始されたｓｉＹｙ１治療は効果がなかった。図１２は、最初の３日以内に開始されたｓｉＹｙ１治療が、ＬＶ駆出率（ａ）及び短縮率（ｂ）の有意に低い低下に関してＬＶ収縮機能不全に対して保護し、最初の７日以内に開始されたｓｉＹｙ１治療は、ＬＶ拡張末期径及び収縮末期径（ｃ、ｄ）、並びにＬＶ拡張末期容積及び収縮末期容積（ｅ，ｆ）のより低い増加に関してＬＶ拡大に対して保護したことを示す。１４日目に開始されたｓｉＹｙ１治療は効果がなかった。図１３は、最初の７日以内に開始されたｓｉＹｙ１療法が、有意に低いシリウスレッド染色（ａ）（パネルｂの代表的な画像）並びに有意に低いレベルの異なる線維症関連マーカー遺伝子調節解除（ＴＧＦ－β、α－ｓｍａ、Ｃｏｌ１ａ１及びＣｏｌ３ａ１）（ｃ～ｆ）に関して、梗塞心筋における線維症に対して保護したことを示す。１４日目に開始した治療は効果がなかった。図１４は、最初の７日以内に開始したｓｉＹｙ１療法が、より低レベルのＣＤ４５陽性染色（ａ）（パネルｂの代表的な画像）及び炎症関連特異的マーカー（ｃ～ｄ）に関して、梗塞心筋における炎症に対して保護したことを示す。１４日目に開始した治療は効果がなかった。図１５は、最初の７日以内に開始されたｓｉＹｙ１療法が、カスパーゼ３タンパク質レベルの有意に低い増加（ａ）、並びにＢＮＰ及びＭｙＯｍＲＮＡレベルの有意に低い増加（ｃ～ｄ）に関して、細胞死に対して保護したことを示す。図１６は、ｓｉＹｙ１療法がヒトｉＰ由来心筋細胞の伸展誘導性肥大を予防することを示す。対照群（Ｓｃｒ）と比較して、ヒトｉＰ由来心筋細胞（ｈｉＰｓＣＭ）におけるＹｙ１ｍＲＮＡレベルは、伸張後に上昇し（ＰＭＡ＋Ｓｃｒ）（ｐ＜０．００１）、ｓｉＹｙ１療法によって有意に低下した（ｓｉＹｙ１＋ＰＭＡ）（ｐ＜０．００１）（ａ）。更に、ｓｉＹｙ１療法は、肥大関連マーカー遺伝子Ｍｙｈ７（Ｍｙｈ６に関連する）及びＮｐｐａ（ｂ、ｃ）のレベルに関して、ストレッチング誘発性心肥大から保護した。

したがって、本発明は、急性心筋梗塞後の左室（ＬＶ）機能不全を患者においてＡＭＩの１２時間後～７日後に治療する方法であって、本発明に記載の化合物又は組成物を治療有効用量で患者に投与し、それにより患者を予防的又は治療的に処置することを含む方法を提供する。好ましくは、方法はＡＭＩの１～７日後に投与される。より好ましくは、ＡＭＩの１２時間後～３日後、好ましくはＡＭＩの１～３日後である。また好ましくは、ＡＭＩの３～７日後である。

本発明は更に、ＡＭＩ後の有害な心筋リモデリングを治療する方法、特にＡＭＩ後の心臓合併症、例えば心筋線維症、心臓炎症、心肥大及び／又は機能障害を予防又は治療する方法、より詳細には急性心筋梗塞後、ＡＭＩの２～４８時間後に左室機能不全を治療する方法であって、本発明に記載の化合物又は組成物を治療有効用量で患者に投与し、それにより患者を予防的又は治療的に処置することを含む方法を更に提供する。好ましくは、この方法はＡＭＩの４～４８時間後に投与される。より好ましくは、ＡＭＩの６～４８時間後である。更により好ましくは、ＡＭＩ後１２～４８時間又は２４～４８時間である。更により好ましくは、ＡＭＩ語２、４、６又は１２～２４時間後である。

本発明は、急性心筋梗塞後の左室（ＬＶ）機能不全を患者においてＡＭＩの１２時間後～７日後に治療する方法であって、本発明に記載の化合物又は組成物を治療有効用量で患者に投与し、それにより患者を予防的又は治療的に処置することを含む方法を更に提供する。好ましくは、方法はＡＭＩの１～７日後に投与される。より好ましくは、ＡＭＩの１２時間後～３日後、好ましくはＡＭＩの１～３日後である。更により好ましくは、ＡＭＩの３～７日後である。

好ましい実施形態では、本発明は、急性心筋梗塞後の左室（ＬＶ）機能不全を、好ましくは患者のＡＭＩの１２～７２時間後に、ＬＶ駆出率及び／又は短縮率の減少を予防、治療、緩和又は低減することによって治療する方法であって、本発明に記載の化合物又は組成物を治療有効用量で患者に投与し、それにより患者を予防的又は治療的に処置することを含む方法を提供する。好ましくは、この方法はＡＭＩの２４～７２時間後に投与される。より好ましくは、ＡＭＩの３６～７２時間後である。更により好ましくは、ＡＭＩの４８～７２時間後である。

好ましい実施形態では、本発明は、急性心筋梗塞後の左室（ＬＶ）機能不全を、好ましくは患者のＡＭＩの１２～７２時間後に、好ましくは肉眼的心肥大に関して、ＭＩ誘発性心肥大を予防、治療、緩和、又は減少させることによって治療する方法であって、本発明に記載の化合物又は組成物を治療有効用量で患者に投与し、それにより患者を予防的又は治療的に処置することを含む方法を提供する。好ましくは、この方法はＡＭＩの２４～７２時間後に投与される。より好ましくは、ＡＭＩの３６～７２時間後である。更により好ましくは、ＡＭＩの４８～７２時間後である。

好ましい実施形態では、本発明は、好ましくは、患者のＡＭＩ後ＡＭＩ後３～７日目の、好ましくはＬＶ拡張末期径及び収縮末期径並びに／あるいはＬＶ拡張末期容積及び収縮末期容積のより低い増加に関して、好ましくは、ＬＶ拡大を予防、治療、緩和、又は減少させることによって、急性心筋梗塞後の左室（ＬＶ）機能不全を治療する方法であって、本発明に記載の化合物又は組成物を治療有効用量で患者に投与し、それによって患者を予防的又は治療的に処置することを含む方法を提供する。

送達：哺乳動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達の増強及び改善を特に目的とした送達系が開発されている。例えば、Ｓｈｅｎｅｔａｌ（ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ５３９：１１１－１１４（２００３）），Ｘｉａｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０：１００６－１０１０（２００２），Ｒｅｉｃｈｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＶｉｓｉｏｎ９：２１０－２１６（２００３），Ｓｏｒｅｎｓｅｎｅｔａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２７：７６１－７６６（２００３），Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ３２：１０７－１０８（２００２）ａｎｄＳｉｍｅｏｎｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ３１，１１：２７１７－２７２４（２００３）を参照されたい。ｓｉＲＮＡは、霊長類における阻害のために首尾よく使用されており、更なる詳細については、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏｅｔａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ２４（１）Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００４Ｉ１３２－１３８．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ｝’を参照されたく、ｓｉＲＮＡは、Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．の米国特許出願第２００４／００６３６５４号に記載されており、コレステロール結合ｓｉＲＮＡ（及び他のステロイド及び脂質結合ｓｉＲＮＡ）は、送達に使用することができ、ＳｏｕｔｓｃｈｅｋｅｔａｌＮａｔｕｒｅ４３２：１７３－１７７（２００４）．ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆａｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｂｙｓｙｓｔｅｍｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｄｉｆｉｅｄｓｉＲＮＡｓ；及びＬｏｒｅｎｚｅｔａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｌｅｔｔ．１４：４９７５－４９７７（２００４）ＳｔｅｒｏｉｄａｎｄｌｉｐｉｄｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｏｆｓｉＲＮＡｓｔｏｅｎｈａｎｃｅｃｅｌｌｕｌａｒｕｐｔａｋｅａｎｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｌｉｖｅｒｃｅｌｌｓを参照されたい。

本発明の化合物、ｓｉＲＮＡ又は医薬組成物は、個々の患者の臨床状態、投与の部位及び方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重、及び医療従事者に知られている他の要因を考慮して、優良医療行為に従って投与及び投薬される。

したがって、本明細書の目的のための「治療有効用量」は、当技術分野で知られているような考慮事項によって決定される。用量は、生存率の改善若しくはより迅速な回復、又は当業者によって適切な手段として選択されるような症状及び他の指標の改善若しくは排除を含むがこれらに限定されない改善を達成するのに有効でなければならない。本発明の化合物は、従来の投与経路の任意のものによって投与することができる。化合物は、化合物として又は薬学的に許容される塩として投与することができ、単独で、又は薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント及びビヒクルと組み合わせて有効成分として投与することができることに留意すべきである。化合物は、経口、皮下、又は静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、及び鼻腔内投与、並びに髄腔内及び注入技術を含む非経口投与することができる。好ましくは、本発明の化合物、ｓｉＲＮＡ又は医薬組成物は、非経口的に、好ましくは静脈内経路によって投与される。

化合物のインプラントも有用である。注射用に液体形態を調製することができ、この用語は、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、髄腔内及び他の親投与経路を含む。液体組成物は、有機共溶媒を含む及び含まない水溶液、水性又は油懸濁液、食用油を含むエマルジョン、並びに同様の医薬ビヒクルを含む。更に、特定の状況下では、本発明の新規な治療に使用するための組成物は、エアロゾルとして、鼻腔内投与等のために形成され得る。治療される患者は、温血動物、特にヒトを含む哺乳動物である。薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント及びビヒクル並びにインプラントイヤナーは、一般に、本発明の活性成分と反応しない不活性、非毒性の固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入材料を指し、リポソーム及びミクロスフェアを含む。本発明において有用な送達システムの例としては、米国特許第５，２２５，１８２号、同第５，１６９，３８３号、同第５，１６７，６１６号、同第４，９５９，２１７号、同第４，９２５，６７８号、同第４，４８７，６０３号、同第４，４８６，１９４号、同第４，４４７，２３３号、同第４，４４７，２２４号、同第４，４３９，１９６号、及び同第４，４７５，１９６号が挙げられる。他の多くのそのようなインプラント、送達システム、及びモジュールは、当業者に周知である。本発明の１つの特定の実施形態では、局部製剤及び経皮製剤が特に好ましい。

一般に、ヒトに対する化合物の活性用量は、１ｍｇ／ｋｇ～約２０～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．０１ｍｇ～約２～１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。

本明細書で使用される「治療」という用語は、疾患に関連する症状を改善する、疾患の重症度を低下させる若しくは疾患を治癒させる、又は疾患の発生を予防するのに有効な治療物質の投与を指す。特定の実施形態では、投与は静脈内投与を含む。別の特定の実施形態では、投与は局部投与又は局所投与を含む。

本発明の別の態様は、ＡＭＩ後の本明細書全体を通して示される時間間隔内の心筋線維症、心臓炎症、心肥大及び／又は機能障害を患者において治療する方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物を患者に投与し、それにより患者を予防的又は治療的に処置することを含む方法である。

本発明の別の態様では、これらのオリゴヌクレオチドを発現する化合物１～３又はベクターの任意のものと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物が提供される。本発明の別の態様は、ＡＭＩ後の本明細書全体を通して示される時間間隔内に、心筋線維症、心臓炎症、心肥大及び／又は機能障害に罹患している患者の回復を促進するための医薬品を調製するための治療有効量の任意の上記オリゴリボヌクレオチド又はベクターのいずれかの使用である。

本発明はまた、本発明の１つ以上の化合物を薬学的に許容される担体と混合することを含む、医薬組成物を調製するプロセスを提供する。

好ましい実施形態では、医薬組成物の調製に使用される化合物は、薬学的に有効な用量で担体と混合される。特定の実施形態では、本発明の化合物は、ステロイド又は脂質あるいは別の適切な分子、例えばコレステロールにコンジュゲートされる。

ヌクレオチドの治療特性を改善するために、ヌクレオチドの修飾又は類似体を導入することができる。改善された特性には、ヌクレアーゼ耐性の増加及び／又は細胞膜透過能の増加が含まれる。

したがって、本発明はまた、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの機能に実質的に影響を及ぼさない本発明のオリゴヌクレオチドの全ての類似体又は修飾体を含む。好ましい実施形態では、そのような修飾は、ヌクレオチドの塩基部分、ヌクレオチドの糖部分及び／又はヌクレオチドのリン酸部分に関する。

本発明の実施形態では、ヌクレオチドは、天然に存在する塩基又は合成的に修飾された塩基から選択することができる。天然に存在する塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルが挙げられる。オリゴヌクレオチドの修飾塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチル－、２－プロピル－及び他のアルキルアデニン、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、６－アザ－シトシン及び６－アザ－チミン、偽ウラシル、４－チウラシル、８－ハロアデニン、８－アミノアデニン、８－チオールアデニン、８－チオールアルキルアデニン、８－ヒドロキシルアデニン及び他の８－置換アデニン、８－ハログアニン、８－アルニノグアニン、８－チオールグアニン、８－チオアルキルグアニン、８－ヒドロキシルグアニン及び他の置換グアニン、他のアザ及びデアザアデニン、他のアザ及びデアザグアニン、５－トリフルオロメチルウラシル及び５－トリフルオロシトシンが挙げられる。

更に、ヌクレオチドの構造が根本的に変化しており、治療試薬又は実験試薬としてより適しているヌクレオチドの類似体を調製することができる。ヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）中のデオキシリボース（又はリボース）リン酸骨格が、ペプチドに見られるものと同様のポリアミド骨格で置き換えられているペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に耐性であり、インビボ及びインビトロで長寿命であることが示されている。更に、ＰＮＡは、ＤＮＡ分子よりも相補的ＤＮＡ配列により強く結合することが示されている。この観察は、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間の電荷反発の欠如に起因する。オリゴヌクレオチドに行うことができる他の修飾としては、ポリマー骨格、環状骨格、又は非環状骨格が挙げられる。

一実施形態では、修飾は、リン酸部分の修飾であり、修飾リン酸部分は、ホスホロチオエートを含む群から選択される。

本発明の化合物は、リボ核酸（又はデオキシリボ核酸）オリゴヌクレオチドを合成するための当技術分野で周知の任意の方法によって合成することができる。そのような合成は、とりわけ、ＢｅａｕｃａｇｅＳ．Ｌ．ａｎｄＩｙｅｒＲ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９２；４８：２２２３－２３１１，ＢｅａｕｃａｇｅＳＸ．ａｎｄＩｙｅｒＲ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９３；４９：６１２３－６１９４及びＣａｒｕｔｈｅｒｓＭ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５４：２８７－３１３に記載されており、チオエートの合成は、とりわけ、ＥｃｋｓｔｅｉｎＦ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５；５４：３６７－４０２に記載されており、ＲＮＡ分子の合成は、ＳｐｒｏａｔＢ．，ｉｎＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ２００５ＥｄｉｔｅｄｂｙＨｅｒｄｅｗｉｊｎＰ．；Ｋａｐ．２：１７－３１に記載されており、それぞれの下流プロセスは、とりわけ、ＰｉｎｇｏｕｄＡ．ｅｔ．ａｌ．，ｉｎＩＲＬＰｒｅｓｓ１９８９ＥｄｉｔｅｄｂｙＯｌｉｖｅｒＲ．Ｗ．Ａ．；Ｋａｐ．７：１８３－２０８ａｎｄＳｐｒｏａｔＢ．，ｉｎＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ２００５ＥｄｉｔｅｄｂｙＨｅｒｄｅｗｉｊｎＰ．；Ｋａｐ．２：１７－３１（前出）に記載されている。

他の合成手順、例えば、Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，１９９０，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２６７７－２６８４；及びＷｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９７，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏＩ．Ｂｉｏ．，７４，５９に記載されているような手順が当該分野で知られており、これらの手順は、５’末端のジメトキシトリチル及び３末端のホスホラミダイト等の一般的な核酸保護及びカップリング基を利用することができる。修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル化）ヌクレオチド及び非修飾ヌクレオチドは、所望に応じて組み込まれる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、別々に合成することができ、例えばライゲーション（Ｍｏｏｒｅｅｔａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒｅｔａｌ．，国際公開第９３／２３５６９号；Ｓｈａｂａｒｏｖａｅｔａｌ．，１９９１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎｅｔａｌ．，１９９７，ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓＳｃＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎｅｔａｌ．，１９９７，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．８，２０４）によって、あるいは合成及び／又は脱保護後のハイブリダイゼーションによって、合成後に一緒に結合させることができる。

市販の機械（とりわけ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である）を用いてもよく、オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される配列に従って調製されることに留意されたい。重複する化学合成されたフラグメントの対は、当技術分野で周知の方法（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号を参照されたい）を使用して連結することができる。鎖は別々に合成され、次いでチューブ内で互いにアニーリングされる。次いで、ＨＰＬＣによってアニールされなかった一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、それらのうちの１つが過剰であるために）から二本鎖ｓｉＲＮＡを分離する。本発明のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ断片に関して、２つ以上のそのような配列を合成し、本発明で使用するために一緒に連結することができる。

本発明の化合物は、米国特許出願公開第２００４／００１９００１号明細書（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）に記載されているように、タンデム合成法を介して合成することもでき、ここで、両方のｓｉＲＮＡ鎖は、切断可能なリンカーによって分離された単一の連続するオリゴヌクレオチドフラグメント又は鎖として合成され、その後切断されて、ｓｉＲＮＡ二重鎖にハイブリダイズし、その精製を可能にする別個のｓｉＲＮＡフラグメント又は鎖を提供する。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。

本発明の化合物は、直接又はウイルスベクター若しくは非ウイルスベクターを用いてのいずれかで送達することができる。直接送達される場合、配列は一般にヌクレアーゼ耐性にされる。あるいは、配列は、本明細書において下で議論されるように、その配列が細胞において発現されるように、発現カセット又は構築物に組み込まれ得る。一般に、構築物は、標的細胞において配列が発現されることを可能にする適切な調節配列又はプロモーターを含む。本発明の化合物の送達のために場合により使用されるベクターは市販されており、当業者に公知の方法によって本発明の化合物の送達の目的のために改変され得る。

以下の実施例は、本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。

実施例１．
材料及び方法

動物のケア及び倫理的側面。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウス（体重２５～３０ｇ）をＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスを、１２時間の明暗サイクルを用いて２３±２℃で５０±５％の相対湿度を有する特定の病原体のない環境に収容した。マウスは、食物及び水を自由に摂取することができた。全ての動物実験は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｕｒｃｉａの動物使用に関する倫理審査委員会によって承認された（許可番号：Ａ１３１５０１０５）。７日の適応後、動物に外科的処置を施して、全身Ｙｙ１遺伝子サイレンシングの前にＡＭＩを誘導した。動物を無作為に６つの群に分けた（群及び実験計画を参照のこと）。

マウスにおける実験的ＡＭＩの誘導。外科的処置の前に、動物を腹腔内ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）及びメデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した後、１８ゲージ静脈内カテーテルで挿管及び換気し、温調パッド上で仰臥位で置いた。動物を、皮下に挿入した小型針を通して四肢に接続した心電図（ＥＣＧ）電極によって監視した。左側開胸術を、第３及び第４の肋間腔の間の小さな切開によって行った。切開は、肺が収縮領域で回避されるように、鈍端レトラクタによって拡張された。心臓を取り囲む心膜を切開したが、心臓は露出しなかった。左前下行枝（ＬＡＤ）の結紮部位を、起点から４ｍｍ離して決定した。先細の非外傷性針を使用して、８－０絹結紮糸をＬＡＤの下に通し、３つの結び目で結紮した。左室の前壁の目に見えるブランチング及びチアノーゼ並びに左心房の腫脹を、結紮の成功を示すものとみなした。ＥＣＧがＳＴ上昇を示し、左室の前壁がブランチングになった場合、処置は成功したとみなされた。６－０ビクリル溶解縫合糸を使用して肋骨及び筋肉を閉じ、胸腔内に残った空気を吸引するための小さな隙間を残した。再び肺に触れることなく、空気をインハウスのチューブ（直径２ｍｍ）によって吸引した。閉鎖時に、ネオマイシン粉末及びベタジンを筋肉及び皮膚の縫合部位にそれぞれ適用した。手術部位は、あらゆる感染を回避し、縫合部位のあらゆる裂開を監視するために毎日整えられた。麻酔の導入から２０分以内に全手順を実施した。偽手術ラットは、結紮なしで同じ手順を受けた。手術後、動物にブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下）を８時間間隔で４回投与した。偽群は、ＬＡＤ冠動脈を閉塞しなかったことを除いて、同じ外科的処置を受けた。心電図モニタリングを使用して、ＡＭＩ誘導後のＳＴセグメント上昇を確認した。心臓損傷の進展を評価するために、手術前、並びにＡＭＩの２４時間後、１週間後及び４週間後に、各マウスに対して心エコー検査を実施した（１６）。

実験設計及び試験プロトコル。ＡＭＩ後２４回、生存動物を無作為に６つの実験群にリンスした。（１）静脈内経路によりＰＢＳで処置した偽群（偽群ＰＢＳ、ｎ＝１０）；（２）静脈内経路によりｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（ｓｉＣｔｒｌ、表３参照）で処置した偽群（偽群ｓｉＣｔｒｌ、ｎ＝１０）；（３）ｓｉＹｙ１で処置した偽群（「ｓｉＹｙ１」という用語は、本明細書では、静脈内経路（偽群ｓｉＹｙ１、ｎ＝１０）によって内因性Ｙｙ１レベル（表３の化合物１～４）をサイレントにする４つの特異的ｓｉＲＮＡ配列によって形成されたプールと理解されるものとする）；（４）プラセボ（ＰＢＳ）を静脈内経路により処置した梗塞群（ＡＭＩ群ＰＢＳ、ｎ＝１０）；（５）静脈内経路によりｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（ｓｉＣｔｒｌ）で処置した梗塞群（ＡＭＩ群ｓｉＣｔｒｌ、ｎ＝１０）；（６）静脈内経路によってｓｉＹｙ１で処置した梗塞群（ＡＭＩ群ｓｉＹｙ１、ｎ＝１０）。動物は、屠殺するまで（ＡＭＩの４週間後）上記の条件に維持した。

マウスにおける内因性Ｙｉｎ－Ｙａｎｇ１転写因子サイレンシング。内因性Ｙｙ１因子発現レベルがサイレンスである実験モデルを生成するために、マウスに４つの特異的干渉ＲＮＡ配列の混合物（表３の化合物１～４）をトランスフェクトした。ＡＭＩの２４時間後に、動物の尾静脈を通して静脈内注入を行った。Ｙｙ１転写因子（カスタムｓｉＲＮＡ、インビボＨＰＬＣＡｃｃｅｌｌ）に対するｓｉＲＮＡ配列をＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ａ－０５０２７３－１３、－１４、－１５及び－１６）から取得し、ＡＭＩ後の１、７及び１４日目に６ｍｇ／ｋｇの３つの独立した用量で一緒に投与したところ、累積最終濃度は１８ｍｇ／ｋｇとなった。実験手順の概要を図２ａに示す。手短に言えば、使用直前に、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｂ－００５０００）のＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡＤｅｌｉｖｅｒｙＭｅｄｉａを使用して、４つのｓｉＲＮＡのそれぞれ１つの７５μｇを混合した。マウス特異的Ｙｙ１転写因子及び非標的化ＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＣｔｒｌ）の両方の標的配列を以下の表３に示す。

ＬＶ構造及び機能。経胸壁心エコー検査（２Ｄ及びＭモード心エコー検査）を、手術前（ベースライン）、ＡＭＩ後２４時間及びＡＭＩ後４週間に、Ｖｅｖｏ機械及び１３ＭＨｚプローブ（ＭＪＦＰ）を使用して麻酔したマウス（１．８％イソフルラン、吸入）で行った。四腔長軸図から、収縮末期（ＬＶＥｓＶ）及び拡張末期左室（ＬＶＥｄＶ）容積をシンプソン法によって決定し、駆出率（ＥＦ）をＥＦ（％）＝ＬＶＥｄＶ－ＬＶＥｓＶ／ＬＶＥｄＶ×１００として自動的に決定した。僧帽弁の腱索のレベルで、左室拡張末期径（ＬＶＥｄＤ）及び収縮末期径（ＬＶＥｓＤ）の測定をＭモードによって行った。データを表１に列挙する。データを分析した研究者は、実験群を盲検化した。

ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ－ＰＣＲ

新鮮な梗塞心室（約２０ｍｇ）を冷ＤＰＢＳで洗浄した。次いで、試料を予め冷却したガラスペトリ皿に入れ、鋭利なハサミを使用して氷浴中で細断した。ＲＮＡ単離及び定量的リアルタイムＰＣＲを、わずかな修正を加えた製造業者のプロトコルに従って実施した（１５）。定量的リアルタイムＰＣＲ分析に使用したプライマー配列を表２に記載する。

統計分析

データを平均±平均の標準誤差として表した。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ検定を用いて正常性を試験した。全ての群間の差をＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定で試験した。偽群との多重比較のために、Ｓｉｅｇｅｌ－Ｃａｓｔｅｌｌａｎ検定を使用した。非パラメトリック相関を、梗塞動物においてのみ、Ｋｅｎｄａｌｌの方法に従って試験した。統計学的有意性はｐ＜０．０５と仮定した。ＳＰＳＳ統計２２（ＩＢＭＣｏｒｐ．，Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用してデータを統計的に分析した。グラフ化は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１１．０ソフトウェアを使用して行った。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。
結果
ＡＭＩはＹｉｎｙａｎｇ－１（Ｙｙ１）転写因子の上方制御を誘導する

最初に、梗塞マウス及び非梗塞マウスの左室（ＬＶ）から抽出された全ＲＮＡ中のＹｙ１レベルを定量化した（図１）。図１ａに示すように、ＬＶ梗塞領域のＹｙ１ｍＲＮＡレベルは、ＡＭＩから１週間後に有意に増加し（ｐ＜０．０１）、期間を４週間に延長した場合より高い増加であった（ｐ＜０．００１）（図１ａ）。Ｙｙ１ｍＲＮＡの増加は、遠隔ＬＶ領域では生じなかった（図１ｂ）。
Ｙｙ１転写因子の遺伝的欠損はＡＭＩ後の有害な心臓リモデリングを防止する

次に、特定のｓｉＲＮＡによるＹｙ１レベル及び活性の減少がインビトロで新生児心筋細胞の肥大を予防したという観察から開始して（１５）、Ｙｙ１の全体的な遺伝子欠失がＡＭＩ後の病理学的心臓リモデリングを予防するかどうかを問うた。図２ａに示すように、及び上記のように、ＡＭＩ誘発後、ＳＴセグメント上昇直後に、ｓｉＹｙ１療法を開始した。梗塞したＬＶ領域（ＡＭＩ＋ｓｉＣｔｒｌ群）のＹｙ１ｍＲＮＡレベルを評価すると、偽群（Ｓｈａｍ＋ｓｉＣｔｒｌ群）で得られたｍＲＮＡレベルと比較して、動物をｓｉＹｙ１で治療した場合に予防される有意な増加（ｐ＜０．００１）が観察された（ＡＭＩ＋ｓｉＹｙ１対ＡＭＩ＋ｓｉＣｔｒｌ；ｐ＜０．００１）（図２ｂ）。

重要なことに、ｓｉＹｙ１で処置した梗塞マウスは、ＡＭＩ誘発性心肥大及び機能障害から保護された。処置動物は、より良好な心機能（図３）（ｐ＜０．００１）、より低い肉眼的心肥大（すなわち、心臓重量）（ｐ＜０．００１）（図４ａ）、より低いレベルの肥大関連マーカー遺伝子Ｍｙｈ７（Ｍｙｈ６に関連）及びＮｐｐａ（ｐ＜０．００１、いずれの場合も）（図４ｂ～ｃ）、並びにより低い心筋細胞肥大（ｐ＜０．０１）を示した（図４ｄ）。

注目すべきことに、線維症関連マーカー遺伝子の調節解除によって決定されるように、心筋線維症もこれらのｓｉＹｙ１欠損マウスにおいて減少した（図５ａ～ｆ）。シリウスレッド及びマッソン染色により、これらの保護結果が確認された（図５ｇ）。

ＡＭＩ後の心臓炎症に対するｓｉＹｙ１療法の効果を評価した場合、同様の効果が得られた。再び、ｓｉＹｙ１療法は、炎症関連マーカー遺伝子の調節解除の点でＡＭＩ後の有害炎症を予防した（図６）。

次に、心筋死に関する実験を行った。図７に示すように、ＡＭＩは梗塞したＬＶ心筋の細胞死を誘導し、これはＭｙＯ（ｐ＜０．００１）、Ｈ－ＦＡＢＰ（ｐ＜０．００１）及びＢＮＰｍＲＮＡレベル（ｐ＜０．００１）の有意な増加を特徴とする（図７）。ｓｉＹｙ１療法はこの増加を予防した（ｐ＜０．００１、全ての場合）。
ｓｉＹｙ１療法の保護的心臓効果は、ＩＬ－３３／ＳＴ２軸の調節に関連する。

次に、インビボでの心臓リモデリング中のｓｉＹｙ１療法の有益な効果がＩＬ３３／ＳＴ２Ｌ軸と関連しているかどうかを確認するために、定量的ＲＴ－ＰＣＲによってマウス由来の梗塞ＬＶ領域でＩＬ－３３、ＳＴ２Ｌ及びｓＳＴ２のｍＲＮＡレベルを評価した（図８）。ＡＭＩは、ＩＬ－３３（ｐ＜０．００１）、ＳＴ２Ｌ（ｐ＜０．００１）及びｓＳＴ２（ｐ＜０．０１）ｍＲＮＡ発現の増加と関連していた。興味深いことに、内因性Ｙｙ１の欠如は、ＩＬ－３３及びＳＴ２ＬｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさず、心筋ｓＳＴ２ｍＲＮＡレベルの上方制御を妨げた。損傷の非存在下又はＰＢＳの使用下でのＹｙ１のサイレンシングは、それぞれの対照と比較して、ＩＬ３３、ＳＴ２Ｌ及びｓＳＴ２の発現に影響を及ぼさなかった。
実施例２．
材料及び方法

動物のケア及び倫理的側面。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウス（体重２５～３０ｇ）をＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスを、１２時間の明暗サイクルを用いて２３±２℃で５０±５％の相対湿度を有する特定の病原体のない環境に収容した。マウスは、食物及び水を自由に摂取することができた。全ての動物実験は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｕｒｃｉａの動物使用に関する倫理審査委員会によって承認された（許可番号：Ａ１３１５０１０５）。７日の適応後、動物に外科的処置を施して、全身Ｙｙ１遺伝子サイレンシングの前にＭＩを誘導した。

マウスにおける実験的ＭＩの誘導。外科的処置の前に、動物を腹腔内ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）及びメデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した後、１８ゲージ静脈内カテーテルで挿管及び換気し、温調パッド上で仰臥位で置いた。動物を、皮下に挿入した小型針を通して四肢に接続した心電図（ＥＣＧ）電極によって監視した。左側開胸術を、第３及び第４の肋間腔の間の小さな切開によって行った。切開は、肺が収縮領域で回避されるように、鈍端レトラクタによって拡張された。心臓を取り囲む心膜を切開したが、心臓は露出しなかった。左前下行枝（ＬＡＤ）の結紮部位を、起点から４ｍｍ離して決定した。先細の非外傷性針を使用して、８－０絹結紮糸をＬＡＤの下に通し、３つの結び目で結紮した。左室の前壁の目に見えるブランチング及びチアノーゼ並びに左心房の腫脹を、結紮の成功を示すものとみなした。ＥＣＧがＳＴ上昇を示し、左室の前壁がブランチングになった場合、処置は成功したとみなされた。６－０ビクリル溶解縫合糸を使用して肋骨及び筋肉を閉じ、胸腔内に残った空気を吸引するための小さな隙間を残した。再び肺に触れることなく、空気をインハウスのチューブ（直径２ｍｍ）によって吸引した。閉鎖時に、ネオマイシン粉末及びベタジンを筋肉及び皮膚の縫合部位にそれぞれ適用した。手術部位は、あらゆる感染を回避し、縫合部位のあらゆる裂開を監視するために毎日整えられた。麻酔の導入から２０分以内に全手順を実施した。偽手術ラットは、結紮なしで同じ手順を受けた。手術後、動物にブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下）を８時間間隔で４回投与した。偽群は、ＬＡＤ冠動脈を閉塞しなかったことを除いて、同じ外科的処置を受けた。心電図モニタリングを使用して、ＭＩ誘導後のＳＴセグメント上昇を確認した。手術誘発ＭＩ後、梗塞マウスは、偽群と比較して心電図の有意な変化を示す（図９の上部パネル）。心臓損傷の進展を評価するために、心エコー試験を各マウスの屠殺時（ＭＩ後４又は８週間）に行った（ＳａｃｋｓＤ．ｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＳｔｒｏｋｅ．２０１８Ａｕｇ；１３（６）：６１２－６３２）。

マウスにおける実験設計及び試験プロトコル。ＭＩ後３０分で、生存動物をＭＩ及び偽の２つの全体的な群に無作為化した。各場合において、ＭＩ後１時間（Ｓ１ｈ）、２４時間（Ｓ２４ｈ）、３日（Ｓ３ｄ）、７日（Ｓ７ｄ）又は１４日（Ｓ１４ｄ）後に開始したｓｉＹｙ１治療開始（６ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）に基づいて動物を再度群分けした。ＳｉＹｙ１療法を、それぞれ合計３サイクルが完了するまで７日ごとに繰り返した（図９）。群Ｓ１ｈ、Ｓ２４ｈ、Ｓ３ｄ及びＳ７ｄに属する動物をＭＩ後４週間で屠殺し、一方、Ｓ１４ｄに属する動物をＭＩ後８週間で屠殺した（図９のスキーム）。

ヒトｉＰ由来心筋細胞（ｈｉＰｓＣＭ）調製及び生体力学的歪み。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）をＰｈｅｎｏｃｅｌｌ（ＰＣｉ－ＣＡＵ）から購入し、約０．５×１０５個の生細胞をクライオバイアルに入れた。最初に、細胞凝集体の付着を可能にする適切なマトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））上で、ｈｉＰＳＣを、ｍＴｅＳＲ（商標）＋培地を使用して８０％コンフルエンスまで成長させ、３７℃で５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気中で維持した。継代２０において、本発明者らの研究室で標準化プロトコルを使用してリプログラミング手順を開始した。簡潔には、培養培地を除去し、４μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含むＢ２７マイナスインスリン補助物質（基礎分化補助物質）を含むＲＰＭＩ－１６４０（０日目）に交換した。３日目に、培地を基礎分化補助物質及び３μＭのＩＷＲ－１に交換した。５日目に、培地を基礎分化補助物質でリフレッシュした。８日目に、培地を、Ｂ２７補助物質を含むＲＰＭＩ１６４０（上記でＲＭＰＩ／Ｂ２７として引用）に交換した。１１日目に、培地をグルコースを含まず、Ｂ２７マイナスインスリンを含むＲＰＭＩ１６４０に交換した。１４日目に、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７に交換した。分化のための培養物を３７℃の５％ＣＯ２／９５％空気環境で維持した。分化中、培地を３日ごとに交換した。２０日後に鼓動するクラスターが観察された。実験前に、ｉＣｅｌｌ維持培地（ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中でＨｉＰｓＣＭを１２日間回復させた。アッセイを開始する前に、ｈｉＰＳＣ及びｈｉＰｓＣＭの両方の標準化遺伝子発現プロファイリング（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を各ヒト単離クローンに行った。ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧｍＲＮＡレベルをｈｉＰＳＣ特異的マーカーとして使用し、ｃＴｎＴ及びＮＫＸ２－５に対するｍＲＮＡレベルをｉＰｓＣＭ特異的マーカーとして使用した。生体力学的歪みは、Ａｓｅｎｓｉｏ－ＬｏｐｅｚＭＣ．ｅｔａｌ．（ＳｃｉＲｅｐ．２０２１Ｆｅｂ１６；１１（１）：３９１５）によって記載された実験設計の適合を使用して行った。ここで、ｈｉＰｓＣＭを０．２μＭのＰＭＡ及び０．４μＭのＡ２３１８７で６時間共刺激し、したがって持続的な細胞伸長を誘導した。

内因性Ｙｉｎ－Ｙａｎｇ１転写因子サイレンシング。Ｙｙ１発現レベルが下方制御される実験モデルを生成するために、マウスを４つの特異的干渉ＲＮＡ配列の混合物（化合物１～４）で処置し、ｈｉＰｓＣＭを、ヒトＹｙ１ｍＲＮＡ配列に特異的に設計された同等の混合物（化合物５～８）でトランスフェクトした。

マウスでは、ＭＩの１時間後、２４時間後、３日後、７日後又は１４日後に、動物の尾静脈を通して静脈内に注入を行った。Ｙｙ１転写因子（カスタムｓｉＲＮＡ、インビボＨＰＬＣＡｃｃｅｌｌ）に対するｓｉＲＮＡ配列をＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ａ－０５０２７３－１３、－１４、－１５、－１６）から入手し、ＭＩ後に６ｍｇ／ｋｇ／週の３つの独立した用量で一緒に投与した。実験手順の概要を図９に示す。手短に言えば、使用直前に、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｂ－００５０００）のＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡＤｅｌｉｖｅｒｙＭｅｄｉａを使用して、４つのｓｉＲＮＡのそれぞれ１つの７５μｇを混合した。マウス特異的Ｙｙ１転写因子及び非標的化ＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＣｔｒｌ）の両方の標的配列を上記の表３に示す（化合物１～４及び非標的化ＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＣｔｒｌ）として引用）。

ｈｉＰｓＣＭにおいて、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸを用いて、Ｙｙ１特異的ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を細胞にトランスフェクトした。センス鎖及びアンチセンス鎖の両方によって引き起こされるオフターゲット効果を防止するために、１つの遺伝子を標的とするように設計された４つの個々の二重鎖の市販の混合物を使用した（化合物５～８及びＳｃｒ；表３）。簡潔には、ｈｉＰｓＣＭ（約２０×１０３細胞）を６ウェルプレートに播種し、完全培地中３７℃で２日間増殖させた。次に、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従って細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション濃度は２５ｎＭであった。トランスフェクションミックスを添加した後、細胞を２４時間維持した。次いで、トランスフェクト細胞を３７℃でＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、先に示したように、ＰＭＡ及びＡ２３１８７で６時間共刺激した。

ＬＶ構造及び心機能。経胸壁心エコー検査（２Ｄ及びＭモード心エコー検査）を、ＭＩ後４週間又は８週間後に、ＶＥＶＯ機及び１３ＭＨｚプローブを使用して麻酔したマウス（１．８％イソフルラン、吸入）に対して行った。四腔長軸図から、収縮末期（ＬＶＥｓＶ）及び拡張末期左室（ＬＶＥｄＶ）容積をシンプソン法によって決定し、駆出率（ＥＦ）をＥＦ（％）＝ＬＶＥｄＶ－ＬＶＥｓＶ／ＬＶＥｄＶ×１００として自動的に決定した。僧帽弁の腱索のレベルで、左室拡張末期径（ＬＶＥｄＤ）及び収縮末期径（ＬＶＥｓＤ）の測定をＭモードによって行った。データを分析した研究者は、実験群を盲検化した。

組織試料及び組織学。ＬＡＤ動脈結紮の４週間後（Ｓ１ｈ、Ｓ２４ｈ、Ｓ３ｄ及びＳ７ｄ群）又は８週間後（Ｓ１４ｄ群）に動物を屠殺し、それらの心臓を０．２ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）塩化カリウム（ＭＥＲＣＫ，ＵＳＡ）の静脈内注射によって拡張期に停止させた。次いで、心臓を摘出し、右心室及び心房を除去する前に氷冷ＤＰＢＳですすいだ。組織病理学的分析のために、各処置群からの７匹のマウスの左室の中乳頭切片を、パラフィン包埋の２４時間前まで４％ホルムアルデヒドで固定した。シリウスレッド染色を行って、線維化を評価した。その定量化のために、境界梗塞領域からの少なくとも６つの不作為写真を、２０倍の倍率で各スライドから撮影した。コラーゲン沈着（赤色）を使用して線維症を定義し、これは、ＤＩＧＩＴＡＬＩＭＡＧＥＨＵＢソフトウェアバージョン４．０．６を使用して定量した赤色画素に対する赤色画素の割合として表される。他の分子細胞生物学的研究のために、梗塞部位を採取し、ＲＮＡ抽出のために－８０℃で保存した。画像解析、並びに分子及び細胞生物学的実験を行った観察者は、実験群に対して盲検化した。

免疫組織化学。次の実験手順は、いくつかの修正を加えて、前述のように実施した（Ａｓｅｎｓｉｏ－ＬｏｐｅｚＭＣ．ｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ．２０２１Ｆｅｂ１６；１１（１）：３９１５）。簡潔には、ＬＶのパラフィン包埋された中乳頭スライスからの切片（３μｍ）をポリ－ｌ－リジンでコーティングされたガラススライド上に置いた。次いで、切片を脱パラフィンし、ＤＡＫＯＰＴＬｉｎｋ中、９７℃で２０分間前処理した。ＣＤ４５又はカスパーゼ３染色のために、再水和した切片をウサギポリクローナルＣＤ４５抗体（作業希釈１：５００、ＡＢＣＡＭ［ａｂ１０５５８］）又はウサギポリクローナルカスパーゼ３抗体（希釈倍率１：３００、ＣＥＬＬＳＩＧＮＡＬＬＩＮＧ［９６６１］）と一晩インキュベートした。次に、切片を製造者の説明書に従って抗ウサギビオチン化標識ポリマー（ＤＡＫＯＥＮＶＩＳＩＯＮ）とインキュベートし、２－２’ジアミノベンシジン（ＤＡＢ）で明らかにした。細胞質の暗褐色沈殿物は、陽性免疫染色を示した。ＺｅｉｓｓＡｘｉｏＳｃｏｐｅＡ１０（ＣＡＲＬＺＥＩＳＳ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）顕微鏡を使用して画像を撮影した。各スライドの６つの無作為写真を２０倍の倍率で撮影した（ｎ＝７スライス／各処置群）。

ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ－ＰＣＲ総ＲＮＡを、梗塞心筋組織試料並びに伸展下のｈｉＰｓＣＭから単離した。ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを精製し、ｉＳｃｒｉｐｔｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＢＩＯＲＡＤＬＡＢ．ＩＮＣ．，Ｍａｄｒｉｄ）を用いて製造元の推奨に従ってｃＤＮＡを調製した。ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨＰｌｕｓ）ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴＡＫＡＲＡＢＩＯＩＮＣ．，Ｅｕｒｏｐｅ）を用いて、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を行った。グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をハウスキーピング遺伝子として使用した。使用したプライマー（ＭＥＲＣＫ，ＵＳＡ）の配列を追加の表４に列挙する。

統計分析梗塞（ＭＩ対偽）、処置（ｓｉＹｙ１対対照）及び処置開始時間の間の相互作用効果による線形回帰モデルを実施して、平均及び標準誤差（ＳＥ）を推定した。各群の動物の不均衡のため、周辺平均を使用した（ＥＭＭ、推定周辺平均）。梗塞（ＭＩと偽との間の変化、ＭＩ－偽）の効果を推定し、表及び図に報告した。これらの変化の差（ｄｉｆｆ－ｉｎ－ｄｉｆｆ）もまた、治療の各開始時間に従って治療間の比較及びｐ値計算のために推定した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。全ての分析は、統計ソフトウェアＲ（ｖ．４．０）及びｐａｃｋａｇｅｅｍｍｅａｎｓ（ｖ．１．５．４）を用いて行った。
結果

この例の結果を図９～図１６に示す。この意味で、図１１は、最初の３日以内に開始したｓｉＹｙ１治療が、肉眼的心肥大（ａ）、ＨＷ／ＢＷ比（ｂ）に関して、ＭＩ誘発性心肥大に対して保護したことを示すことに本明細書において留意されたい。最初の７日以内に開始したｓｉＹｙ１療法が、肥大関連マーカー遺伝子Ｍｙｈ７（Ｍｙｈ６に関連する）及びＮｐｐａ（ｃ）のレベルに関して、ＭＩ誘発性心肥大に対して保護した。１４日目に開始されたｓｉＹｙ１治療は効果がなかった。図１２は、最初の３日以内に開始されたｓｉＹｙ１治療が、ＬＶ駆出率（ａ）及び短縮率（ｂ）の有意に低い低下に関して、ＬＶ収縮機能不全から保護したことを示す。最初の７日以内に開始されたＳｉＹｙ１療法が、ＬＶ拡張末期径及び収縮末期径（ｃ、ｄ）、並びにＬＶ拡張末期容積及び収縮末期容積（ｅ、ｆ）のより低い増加に関して、ＬＶ拡大から保護した。１４日目に開始されたｓｉＹｙ１治療は効果がなかった。更に図１３に示されるように、最初の７日以内に開始されたｓｉＹｙ１療法が、有意に低いシリウスレッド染色（ａ）（パネルｂの代表的な画像）並びに有意に低いレベルの異なる線維症関連マーカー遺伝子調節解除（ＴＧＦ－β、α－ｓｍａ、Ｃｏｌ１ａ１及びＣｏｌ３ａ１）（ｃ～ｆ）に関して、梗塞心筋における線維症に対して保護した。１４日目に開始した治療は効果がなかった。図１４は、最初の７日以内に開始したｓｉＹｙ１療法が、より低レベルのＣＤ４５陽性染色（ａ）（パネルｂの代表的な画像）及び炎症関連特異的マーカー（ｃ～ｄ）に関して、梗塞心筋における炎症に対して保護したことを示す。１４日目に開始した治療は効果がなかった。図１５は、最初の７日以内に開始されたｓｉＹｙ１療法が、カスパーゼ３タンパク質レベルの有意に低い増加（ａ）、並びにＢＮＰ及びＭｙＯｍＲＮＡレベルの有意に低い増加（ｃ～ｄ）に関して、細胞死に対して保護したことを示す。図１６に示されるように、ｓｉＹｙ１療法はヒトｉＰ由来心筋細胞の伸展誘導性肥大を予防した。対照群（Ｓｃｒ）と比較して、ヒトｉＰ由来心筋細胞（ｈｉＰｓＣＭ）におけるＹｙ１ｍＲＮＡレベルは、伸張後に上昇し（ＰＭＡ＋Ｓｃｒ）（ｐ＜０．００１）、ｓｉＹｙ１療法によって有意に低下した（ｓｉＹｙ１＋ＰＭＡ）（ｐ＜０．００１）（ａ）。ｓｉＹｙ１療法は、肥大関連マーカー遺伝子Ｍｙｈ７（Ｍｙｈ６に関連する）及びＮｐｐａ（ｂ、ｃ）のレベルに関して、伸展誘発性心肥大から保護した。

Claims

ヒト又は動物対象の心臓細胞におけるＹｉｎＹａｎｇ－１（Ｙｙ１）遺伝子の発現を、前記細胞における化合物の非存在下で観察される発現に対して減少させることができる化合物を含む組成物であって、前記化合物は、Ｙｙ１遺伝子のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）であり、前記組成物は、前記対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）後の左室（ＬＶ）機能不全の治療方法における使用のためのものであり、前記組成物は、前記対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１２時間～７日の間に投与される、組成物。
前記組成物が、前記対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１～７日の間に投与される、請求項１に記載の使用のための組成物。
前記組成物が、前記対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１２時間～３日の間に投与される、請求項１に記載の使用のための組成物。
前記組成物が、前記対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後１～３日の間に投与される、請求項１に記載の使用のための組成物。
前記組成物が、前記対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）の発症後３～７日の間に投与される、請求項１に記載の使用のための組成物。
前記組成物が、左室（ＬＶ）駆出率及び／又は短縮率の減少を予防、治療、緩和、又は低減することによって、前記対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）後のＬＶ機能不全を治療する方法に使用するためのものである、請求項３又は４に記載の使用のための組成物。
前記組成物が、ＭＩ誘発性心肥大を予防、治療、緩和、又は低減させることによって、前記対象の心筋梗塞（ＡＭＩ）後の左室（ＬＶ）機能不全を治療する方法で使用するためのものである、請求項３又は４に記載の使用のための組成物。
前記組成物が、前記対象における心筋梗塞（ＡＭＩ）後の左室（ＬＶ）機能不全を、前記ＬＶ拡大を予防する、治療する、緩和する、又は減少させることによって治療する方法において使用するためのものである、請求項５に記載の使用のための組成物。
前記Ｙｙ１遺伝子の前記干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）は、以下の化合物：センス配列番号１及びアンチセンス配列番号２を有する化合物１、センス配列番号３及びアンチセンス配列番号４を有する化合物２、センス配列番号５及びアンチセンス配列番号６を有する化合物３、センス配列番号７及びアンチセンス配列番号８を有する化合物４、センス配列番号４９及びアンチセンス配列番号５０を有する化合物５、センス配列番号５１及びアンチセンス配列番号５２を有する化合物６、センス配列番号５３及びアンチセンス配列番号５４を有する化合物７、並びにセンス配列番号５５及びアンチセンス配列番号５６を有する化合物８の任意のものからなる群より選択されるｓｉＲＮＡである、請求項１～８のいずれかに記載の使用のための組成物。
前記Ｙｙ１遺伝子の前記干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）が、以下の化合物：センス配列番号４９及びアンチセンス配列番号５０を有する化合物５、センス配列番号５１及びアンチセンス配列番号５２を有する化合物６、センス配列番号５３及びアンチセンス配列番号５４を有する化合物７、並びにセンス配列番号５５及びアンチセンス配列番号５６を有する化合物８の任意のものからなる群より選択されるｓｉＲＮＡである、請求項１～８のいずれかに記載の使用のための組成物。
前記化合物が静脈内投与される、請求項１～１０のいずれかに記載の使用のための組成物。
前記組成物が、治療有効量の請求項９又は１０に記載のｓｉＲＮＡ又はこれらのオリゴヌクレオチドを発現するベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物である、請求項１～８のいずれかに記載の使用のための組成物。