KR20180096330A - 남성형 탈모 표적 유전자의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA - Google Patents

남성형 탈모 표적 유전자의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA Download PDF

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Abstract

본 발명은 남성형 탈모 표적 유전자의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 SRD5A1 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 1), SRD5A2 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 2) 또는 AR (Adrogen receptor) 유전자의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA 및 상기 비대칭 siRNA를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

남성형 탈모 표적 유전자의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA {Asymmetric siRNA Inhibiting Expression of Genes Directed to Male Type Depilation}
본 발명은 남성형 탈모 표적 유전자의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 SRD5A1 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 1), SRD5A2 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 2) 또는 AR (Adrogen receptor) 유전자의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA 및 상기 비대칭 siRNA를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
인간의 모발은 모낭에서 형성된다. 모낭에는 모유두가 있는데, 모유두에는 작은 혈관들이 분포되어 모발 성장에 필요한 영양분을 공급하며, 모유두 측면 상단에는 모발을 보호하기 위해 피지를 분비하는 피지선이 분포하고 있다. 모유두는 모발의 성장을 조절하는 부위로 남성형 탈모에서 남성 호르몬이 작용하는 부위이기도 하다. 모유두에서의 조절에 따라 세포 분열이 일어나는 부위가 모기질이며 모발을 생성하는 부위이다.
남성 탈모의 주요 인자는 비정상적인 호르몬의 영향에 기인한 것이다. 사춘기가 되면 성호르몬이 활발하게 분비되면서 제2차 성징이 나타난다. 이러한 변화는 성호르몬인 안드로겐(남성호르몬)과 에스트로겐(여성호르몬)에 의한 것이다. 안드로겐은 눈썹 이하의 체모를 발육시키며 에스트로겐은 주로 모발의 성장을 촉진한다. 남성의 경우 탈모는 안드로겐이 과다 분비되고, 과다 분비된 안드로겐이 에스트로겐의 작용을 억제하기 때문이다.
구체적으로, 남성 호르몬에 의한 남성 탈모 기전과 관련하여 5알파-환원효소 (Steroid 5-alpha reductase)가 관여하는데, 5알파-환원효소는 남성 호르몬인 테스토스테론(testosterone)을 DHT (dihydrotestosterone)로 환원시키는 주요 효소이다. 변환된 DHT는 안드로겐 수용체(androgen receptor)와 결합하여 모낭에서 털의 성장을 조절하고 피지선 증식에 관여하는 것으로 알려져 있다.
안드로겐 수용체는 남성 호르몬(안드로겐) 수용체로 테스토스테론과 DHT에 모두 결합할 수 있지만 DHT와 더 강한 결합력을 보이는 것으로 알려져 있다. 5알파-환원효소와 안드로겐 수용체가 억제되면 모발 성장인자들이 증가하며 모발의 성장을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 반대로 5알파-환원효소와 안드로겐 수용체가 활성화되면 모발의 성장을 억제하여 탈모가 발생하는 것으로 알려져 있다.
5알파-환원효소에는 제1형과 제2형 두 가지가 있다. 5알파-환원효소 제1형은 피부전반 특히 피지선에 주로 분포하고, 제2형은 모낭의 모유두(Dermal papilla) 주위와 외측모근초 (Outer root sheath)에 주로 분포한다. 약물 개발 초반에는 제2형의 5알파-환원효소만을 표적으로 하는 탈모치료제가 주로 개발되어 왔지만, 최근에는 제1형도 모발의 성장에 영향을 주는 것으로 밝혀져 5알파-환원효소 제1형과 제2형을 모두 억제하는 치료제를 개발 중에 있다.
이 중, 5알파-환원효소 제2형을 억제하는 약물로는 피나스테라이드(finasteride)를 예시할 수 있다. 피나스테라이드는 원래 양성 전립성비대증 치료제로 개발되었지만 약물을 복용한 환자에서 모발 성장 촉진이 확인되어 남성형 탈모 치료제로 FDA와 국내 식약처에 승인을 받은 성분이다. 두타스테라이드(Dutasteride)는 5알파-환원효소 제1형과 제2형을 모두 억제하는 치료제 성분으로 알려져 있다. 안드로겐 수용체에 결합하여 DHT의 결합을 방해하는 길항제 역할을 하는 약물을 항-안드로겐 약물이라 하며, 이러한 항-안드로겐 약물로는 시메티딘(Cimetidine), 스피로노락톤(Spiromolactone), 플루타마이드(Flutamide), 시프로테론 아세테이트(Cyproterone acetate) 등이 알려져 있다.
다만, 이러한 치료제 성분들은 성기능 장애, 피로감 호소 등의 문제점을 가지고 있으며, 가임기의 여성에게 사용이 제한적이다. 임산부들에게 노출되었을 때 태아의 기형을 유발할 수 있다. 따라서, 이러한 부작용이 없는 탈모 치료제 개발이 필요한 실정이다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 SRD5A1 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 1), SRD5A2 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 2) 또는 AR (Adrogen receptor) 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 통해 부작용이 낮은 RNAi 신약을 개발하여 목적하는 탈모 방지 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SRD5A1 코딩 유전자, SRD5A2 코딩 유전자 또는 AR 코딩 유전자에 특이적으로 결합하는 비대칭 siRNA (asymmetric shorter duplex siRNA, asiRNA)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 비대칭 siRNA를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물, 또는 탈모의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 SRD5A1 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 1) 코딩 유전자, SRD5A2 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 2) 코딩 유전자 또는 AR (Adrogen receptor) 코딩 유전자에 특이적으로 결합하고, 15-17nt의 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 19nt 이상의 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 센스가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단 (blunt end)을 형성하는 것을 특징으로 하는 siRNA를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 탈모 예방 또는 치료방법을 제공한다.
남성형 탈모에서 모낭 성장에 필요한 단백질 합성을 저해하고 모유두를 축소시켜 탈모 유발에 주요하게 기능하는 5α-환원효소 제1형, 5α-환원효소 제2형, 안드로겐 수용체 코딩 유전자를 표적 유전자로 선정하고, 이에 대한 억제 효율이 높은 비대칭 siRNA를 선별하였으며, 본 발명에 따른 siRNA는 높은 전달 효율을 가지면서도 안정적으로 목적하는 정도로 유효하게 5α-환원효소 제1형, 5α-환원효소 제2형, 안드로겐 수용체 표적 유전자에 대한 발현 억제능을 나타내는 바, 탈모 예방 또는 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 SRD5A1를 표적으로 하는 100종의 서열에 대한 asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. HuH-7 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 asiRNA를 0.3nM 형질감염 (transfection)한 뒤 24시간 후에 qRT-PCR을 이용하여 SRD5A1 mRNA의 발현 정도를 측정하였다. 그래프는 2회 반복 실험의 평균과 SD를 나타낸다.
도 2는 SRD5A1를 표적으로 하는 12종의 서열에 대한 asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. HuH-7 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 asiRNA를 0.3, 1, 10 nM 형질감염한 뒤 48시간 후에 웨스턴 블랏을 이용하여 SRD5A1 단백질의 발현 정도를 측정하였다.
도 3은 두 번의 반복 실험을 통해 SRD5A1를 표적으로 하는 다양한 화학적 변형 (chemical modification)이 추가된 12종의 cp-asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. HuH-7 세포에 각 염기 서열을 표적으로 하는 cp-asiRNA를 1uM, 3uM 인큐베이션한 뒤 48시간 후에 웨스턴 블랏으로 SRD5A1 단백질의 발현 정도를 측정하였다.
도 4는 SRD5A1를 표적으로 하는 다양한 화학적 변형이 추가된 2종의 cp-asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. HuH-7 세포에 각 염기 서열을 표적으로 하는 cp-asiRNA를 0.3μM, 1 μM, 3 μM 인큐베이션한 뒤 24시간 후에 real-time PCR을 이용하여 SRD5A1 mRNA의 발현 정도를 측정하였다. 그래프는 4회 반복 실험의 평균과 SD를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 SRD5A2를 표적으로 하는 112종의 서열에 대한 asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. HuH-7 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 asiRNA를 0.3nM 형질감염 (transfection)한 뒤 24시간 후에 qRT-PCR을 이용하여 SRD5A2 mRNA의 발현 정도를 측정하였다. 그래프는 2회 반복 실험의 평균과 SD를 나타낸다.
도 6a는 SRD5A2를 표적으로 하는 23종의 서열에 대한 asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. 도 6b는 SRD5A2를 표적으로 하는 6종의 서열에 대한 asiRNA 및 4종의 서열에 대한 asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. HuH-7 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 asiRNA를 3, 10 nM 형질감염한 뒤 48시간 후에 웨스턴 블랏을 이용하여 SRD5A2 단백질의 발현 정도를 측정하였다.
도 7은 두 번의 반복 실험을 통해 SRD5A2를 표적으로 하는 다양한 화학적 변형이 추가된 12종의 cp-asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. HuH-7 세포에 각 염기 서열을 표적으로 하는 cp-asiRNA를 1uM 인큐베이션한 뒤 48시간 후에 웨스턴 블랏으로 SRD5A2 단백질의 발현 정도를 측정하였다.
도 8은 선정된 2종의 cp-asiSRD5A2에 대한 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. HuH-7 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 cp-asiRNA를 1.95nM 농도에서 1000nM 범위까지 인큐베이션한 뒤 24시간 후에 RT-PCR을 이용해 SRD5A2 mRNA의 발현 정도를 측정하였다.
도 9는 선정된 2종의 cp-asiSRD5A2에 대한 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. HuH-7 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 cp-asiRNA를 0.1, 0.3, 1, 3μM 인큐베이션한 뒤 48시간 후에 웨스턴 블랏으로 SRD5A2 단백질의 발현 정도를 측정하였다.
도 10a 및 도 10b는 AR을 표적으로 하는 118종의 서열에 대한 asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. A549 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 asiRNA를 0.3nM 형질감염한 뒤 24시간 후에 qRT-PCR을 이용하여 AR mRNA의 발현 정도를 측정하였다. 그래프는 2회 반복 실험의 평균과 SD를 나타낸다.
도 11은 AR을 표적으로 하는 20종의 서열에 대한 asiRNA의 단백질 수준에서의 억제 효율을 나타낸 결과이다. A549 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 asiRNA를 0.3 nM 형질감염한 뒤 48시간 후에 웨스턴 블랏을 이용하여 AR 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 3회 반복 실험을 실시하였다.
도 12는 AR을 표적으로 하는 9종의 서열에 대한 asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. A549 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 asiRNA를 0.1nM 형질감염한 뒤 48시간 후에 qRT-PCR과 웨스턴 블랏을 이용하여 각각 AR의 mRNA와 단백질의 발현 정도를 측정하였다.
도 13은 AR을 표적으로 하는 다양한 화학적 변형이 추가된 9종의 cp-asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. A549 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 cp-asiRNA를 1 또는 3 μM 인큐베이션한 뒤 48시간 후에 real-time PCR을 이용하여 AR mRNA의 발현 정도를 측정하였다. 그래프는 4회 반복 실험의 평균과 SD를 나타낸다.
도 14는 AR을 표적으로 하는 다양한 화학적 변형이 추가된 9종의 cp-asiRNA의 유전자 억제 효율을 나타낸 결과이다. A549 세포에 각 염기서열을 표적으로 하는 cp-asiRNA를 1 μM 인큐베이션한 뒤 48시간 후에 웨스턴 블랏 어세이를 이용하여 AR 단백질의 발현 정도를 측정하였다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 678의 SRD5A1 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 1) 코딩 유전자, 서열번호 679의 SRD5A2 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 2) 코딩 유전자 또는 서열번호 680의 AR (Adrogen receptor) 코딩 유전자에 특이적으로 결합하고, 15-17nt의 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 19nt 이상의 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 센스가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단 (blunt end)을 형성하는 것을 특징으로 하는 siRNA에 관한 것이다.
남성형 탈모, 예를 들어 안드로겐성 탈모의 표적 유전자인 SRD5A1 코딩 유전자는 NM_001047.3, NM_001324322.1 또는 NM_001324323.1의 mRNA accession number를 가지며, 각각은 서열번호 669, 서열번호 670 및 서열번호 671의 서열을 포함한다. SRD5A2 코딩 유전자는 NM_000348.3의 mRNA accession number를 가지며, 서열번호 672의 서열을 포함한다. AR 코딩 유전자는 NM_001011645.2의 mRNA accession number를 가지며, 서열번호 673의 서열을 포함한다.
본 발명에서의 siRNA는 일반적인 RNAi(RNA interference) 작용을 가지는 모든 물질을 포함하는 개념이다. RNAi는 1998년 Caenorthabditis elegans에서 최초로 발견된 세포 내 유전자 조절 기작으로 작용기전은 세포 내로 투입된 RNA 이중 가닥 중 안티센스 가닥이 표적 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 유전자 분해를 유도한다고 알려져 있다. 그 중 siRNA (small interfering RNA)는 "in vitro" 에서 유전자의 발현을 억제하는 방법 중에 하나다. 19-21bp의 siRNA는 이론적으로 거의 모든 유전자에 대한 선택적 억제가 가능하여 암, 바이러스성 감염 등의 다양한 유전자 관련 질환 치료제로 개발이 가능하며, 최근 가장 각광받는 신약 개발 후보 기술이다. 포유동물에서 siRNA를 사용한 생체 내 치료를 첫 시도한 경우는 2003년 중반이었으며, 그 이후로 응용 연구에 대한 많은 시도로 생체 내 치료에 관하여 다수 보고되었다.
다만, 가능성과 반대로 siRNA의 부작용 및 단점이 계속적으로 보고되어 있다. RNAi 기반 치료제의 개발이 이루어지기 위해서는 1) 효과적인 전달시스템의 부재 2) 오프타겟 효과 3) 면역반응 유도 4) 세포 내 RNAi 기구 포화와 같은 장벽을 극복해야 할 필요성이 있다. siRNA가 표적 유전자의 발현을 직접적으로 조절할 수 있는 효과적인 방법임에도 불구하고 이와 같은 문제들로 인해 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 출원인은 비대칭 siRNA (asymmetric shorter duplex siRNA, asiRNA) 구조 관련 기술을 개발한 바 있다 (WO2009/078685). asiRNA는 종래의 siRNA가 가지는 19+2 구조에 비해 짧은 이중나선 길이를 갖는 비대칭 RNAi 유도 구조이다. 기존 siRNA 구조 기술에서 확인되는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화, TLR3에 의한 면역반응 등의 문제점들을 극복한 기술이며, 이에 따라 부작용이 낮은 RNAi 신약 개발이 가능하다.
이를 바탕으로, 본 발명에서는 15-17nt의 길이를 가지는 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 19nt 이상의 안티센스 가닥을 포함하는 비대칭 siRNA를 제시함으로써, 본 발명에 따른 siRNA는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화, TLR3에 의한 면역반응 등의 문제를 일으키지 않아 안정적으로 높은 전달 효율을 유지하면서, 목적하는 정도로 유효하게 5α-환원효소 제1형, 5α-환원효소 제2형, 안드로겐 수용체 표적 유전자에 대한 발현을 억제할 수 있다.
본 발명에서 센스가닥은 SRD5A1, SRD5A2 또는 AR 코딩 유전자와 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미하고, 15-17nt의 길이를 가진다. 하나의 실시예에서, 상기 센스가닥은 15nt, 16nt 또는 17nt의 길이를 가질 수 있다.
본 출원의 발명자들은 남성형 탈모에서 모낭 성장에 필요한 단백질 합성을 저해하고 모유두를 축소시켜 탈모 유발에 주요하게 기능하는 5α-환원효소 제1형, 5α-환원효소 제2형, 안드로겐 수용체를 표적 유전자로 선정하였다. 각 표적 유전자에 대한 100종 이상의 siRNA를 스크리닝하여 억제 효율이 뛰어난 siRNA를 선별한 결과, 서열번호 5, 6, 15, 18, 40, 48, 49, 59, 62, 69, 77, 86, 205, 208, 228, 231, 232, 233, 237, 238, 239, 240, 242, 248, 249, 259, 260, 262, 265, 283, 284, 285, 291, 292, 300, 471, 477, 498, 500, 502, 503, 505, 506, 507, 509, 510, 515, 517, 518, 521, 524, 534, 538, 539 및 546로 구성된 군에서 선택되는 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA는 SRD5A1, SRD5A2 또는 AR 코딩 유전자의 mRNA 발현을 유효하게 감소시킴을 확인하였다.
구체적으로, 서열번호 5, 6, 15, 18, 40, 48, 49, 59, 62, 69, 77 또는 86의 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA는 SRD5A1 코딩 mRNA의 발현을 감소시킬 수 있고, 서열번호 205, 208, 228, 231, 232, 233, 237, 238, 239, 240, 242, 248, 249, 259, 260, 262, 265, 283, 284, 285, 291, 292 또는 300의 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA는 SRD5A2 코딩 mRNA의 발현을 감소시킬 수 있으며, 서열번호 471, 477, 498, 500, 502, 503, 505, 506, 507, 509, 510, 515, 517, 518, 521, 524, 534, 538, 539 또는 546의 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA는 AR 코딩 mRNA의 발현을 감소시킬 수 있다.
구체적으로, 서열번호 48, 49, 69, 86, 231, 259, 260, 262, 498, 500, 506, 509, 510, 518, 538, 539 및 546로 구성된 군에서 선택되는 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA는 SRD5A1, SRD5A2 또는 AR 단백질 발현도 유효하게 억제함을 확인하였다.
상기 센스가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단 (blunt end)을 형성한다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8nt의 오버행을 포함할 수 있다.
본 발명에서 안티센스 가닥은 타겟 유전자에 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 19nt 이상, 예를 들어 20 nt 이상, 21 nt 이상, 22 nt 이상, 23 nt 이상, 24 nt 이상, 25 nt 이상, 26 nt 이상, 27 nt 이상, 29 nt 이상, 30 nt 이상 또는 31 nt 이상의 길이를 가진다. 하나의 실시예에서, 상기 안티센스 가닥은 19-24nt의 길이, 예를 들어 19nt, 20nt, 21nt, 22nt, 23nt 또는 24nt의 길이를 가질 수 있다. 상기 안티센스 가닥은 비대칭 구조를 고려하면 센스가닥과 일부분에서 상보적인 서열을 가질 수 있다.
상기 안티센스 가닥은 예를 들어, 서열번호 105, 106, 115, 118, 140, 148, 149, 159, 162, 169, 177, 186, 317, 320, 340, 343, 344, 345, 349, 350, 351, 352, 354, 360, 361, 371, 372, 374, 377, 395, 396, 397, 403, 404, 412, 589, 595, 616, 618, 620, 621, 623, 624, 625, 627, 628, 633, 635, 636, 639, 642, 652, 656, 657, 664로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
구체적으로, 서열번호 148, 149, 169, 186, 343, 371, 372, 374, 616, 618, 624, 627, 628, 636, 656, 657 및 664로 구성된 군에서 선택되는 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA는 SRD5A1, SRD5A2 또는 AR 단백질 발현도 유효하게 억제함을 확인하였다.
경우에 따라서, 상기 siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함할 수 있다.
일반적인 siRNA는 포스페이트 백본 구조에 의한 높은 음전하 및 높은 분자량 등의 이유로 세포막을 통과할 수 없고 혈액에서의 빠른 분해 및 제거되어 실제 표적 부위에 RNAi 유도를 위한 충분한 양을 전달하는데 어려움이 있다. 현재 in vitro 전달의 경우 cationic lipids와 cationic polymers들을 이용한 높은 효율의 delivery 방법이 많이 개발되어 있지만, in vivo의 경우에는 in vitro만큼의 높은 효율로 siRNA를 전달하기 어렵고, 생체 내에 존재하는 다양한 단백질들과 상호작용에 의하여 siRNA 전달 효율이 감소하는 문제점이 있다.
이에, 본 출원의 발명자들은 비대칭 siRNA 구조에 화학적 변형을 도입하여 별도의 전달 비히클 없이 효과적이고 세포 내 전달을 할 수 있는 자가 전달능을 가진 asiRNA 구조체 (cell penetrating asiRNA: cp-asiRNA)를 개발하였다.
상기 센스가닥 또는 안티센스 가닥에서 화학적 변형은 예를 들어, 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다:
뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환;
뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 산소가 황으로 치환;
뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형;
PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및
콜레스테롤 또는 세포 침투 펩타이드 결합.
하나의 실시예에서, 상기 화학적 변형은 센스가닥 또는 안티센스 가닥에서 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환, 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate)으로 변형, 또는 콜레스테롤 결합일 수 있다. 이를 통해 siRNA의 생체 내 안정성을 향상시킬 수 있다.
당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환되거나 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트로 변형되면, 핵산분해효소에 대한 저항성을 높일 수 있고, 콜레스테롤 결합을 통해 세포막과 결합하게 됨으로써 세포 내로 siRNA의 전달을 용이하게 할 수 있다.
구체적으로, 센스가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환되는 변형; 센스가닥 또는 안티센스 가닥 중 2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환되는 변형; 센스 또는 안티센스 가닥에서 25% 이상의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트로 변형; 및 센스가닥의 3' 말단에 콜레스테롤 결합으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환되는 변형과 관련하여, 센스가닥의 5' 말단에 위치하는 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환될 수 있다. 또한, 센스가닥의 5'말단에서 3' 말단 방향으로 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환된 2′-O-메틸 뉴클레오시드 (2′-O-methylated nucleoside)가 연속적 또는 비연속적으로 포함될 수 있다. 상기 센스가닥에서 2′-O-메틸 뉴클레오시드 (2′-O-methylated nucleoside)가 비변형 뉴클레오시드와 교대로 포함될 수 있다. 상기 센스가닥에서 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 연속적 2′-O-메틸 뉴클레오시드가 비변형 뉴클레오시드와 교대로 포함될 수 있다. 상기 센스가닥에서 2′-O-메틸 뉴클레오시드가 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 2-8개 또는 8개 존재할 수 있다.
상기 안티센스 가닥의 5'말단에서 3' 말단 방향으로 2′-O-메틸 뉴클레오시드 (2′-O-methylated nucleoside)가 연속적 또는 비연속적으로 포함될 수 있다. 상기 상기 안티센스 가닥에서 2′-O-메틸 뉴클레오시드 (2′-O-methylated nucleoside)가 비변형 뉴클레오시드와 교대로 포함될 수 있다. 상기 안티센스 가닥에서 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 연속적 2′-O-메틸 뉴클레오시드가 비변형 뉴클레오시드와 교대로 포함될 수 있다. 상기 안티센스 가닥에서 2′-O-메틸 뉴클레오시드가 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 2-7개 존재할 수 있다.
뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트로의 변형과 관련하여, 센스가닥에서 라이보뉴클레오티드 사이의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 포스포로티오에이트로 변형될 수 있다. 경우에 따라서, 센스가닥에서 라이보뉴클레오티드 사이의 결합 전부 (100%)가 포스포로티오에이트로 변형될 수 있다.
상기 안티센스 가닥에서 라이보뉴클레오티드 사이의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 포스포로티오에이트로 변형될 수 있다. 경우에 따라서, 안티센스 가닥에서 라이보뉴클레오티드 사이의 결합 전부 (100%)가 포스포로티오에이트로 변형될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 siRNA를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 치료는 조성물을 투여받은 개체에서 탈모의 증상 또는 탈모의 심각도가 감소하거나 악화되는 것을 방지함을 의미하며, 경우에 따라서 발모가 진행되는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 예방은 탈모의 개시를 방지하거나, 탈모의 개시를 지연시키거나, 탈모의 발생 가능성을 감소시킬 수 있음을 의미한다.
상기 조성물은 유효성분인 siRNA 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다.
상기 조성물의 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
또 다른 관점에서, 상기 siRNA를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 탈모의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명에 따른 예방 또는 치료방법에 포함되는 구성은 앞서 설명한 발명에 포함되는 구성과 동일하므로, 위 설명은 예방 또는 치료방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[실시예 1] SRD5A1를 표적으로 하는 RNAi 유도 이중가닥 핵산 분자 100종 스크리닝
SRD5A1을 표적으로 하는 고효율의 RNAi 간섭을 유도하는 이중 가닥의 핵산 분자를 확보하기 위해 SRD5A1 유전자에 대한 표적 서열 선정 후 asiRNA를 디자인 하였다. asiRNA 구조는 일반적으로 알려진 siRNA와 다른 구조를 가져 일반적인 siRNA 디자인 프로그램을 사용하여 asiRNA의 염기서열을 디자인하는 경우 최적화된 asiRNA의 디자인이 다소 어려울 수 있다. 따라서, asiRNA는 다음과 같은 방법으로 제작하였다. NCBI db 검색을 통해 남성형 탈모(안드로겐성탈모) 질환의 표적 유전자인 SRD5A1 유전자 정보를 획득하였다 (mRNA accession number: NM_001047.3, NM_001324322.1, NM_001324323.1). 추후에 진행할 동물실험을 위해 생쥐와의 염기서열 homology를 고려한 염기 서열을 확보한 뒤 GC content 30~62%, 4개 이상의 G, C 연속 배열은 배제하는 등의 디자인 방법에 따라 100종의 asiRNA 디자인 후 OliX Inc. (Korea)에서 합성하였다. 합성된 센스가닥 및 안티센스 가닥 RNA oligonucleotide를 95℃ 2분, 37℃ 1시간 incubation 과정을 거쳐 annealing 하였고, 10% PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 통해 annealing된 asiRNA를 UV transilluminator 를 통해 확인하였다.
[표 1] 3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 1를 표적으로 하는 100종의 asiRNA 염기 서열
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
[실시예 2] SRD5A1를 표적으로 하는 RNAi 유도 이중가닥의 핵산 분자 스크리닝
mRNA 수준에서 유전자 억제 효율을 확인하기 위해, 선정한 100종의 asiRNA를 HuH-7 세포주에 0.3 nM 농도로 형질감염한 후 qRT-PCR을 수행하여 SRD5A1 mRNA의 발현 정도를 측정하였다.
HuH-7 세포주는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco), 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 100 units/ml Penicillin 100 μg/ml Streptomycin 조건에서 배양하였다. HuH-7 세포를 96 well plate에 5 x 103 cells/well로 seeding 해 주고 asiRNA (0.3 nM, OliX Inc.)와 Lipofectamine2000 (1 μl/ml, Invitrogen Inc.)를 이용하여 총 volume 100 μl Opti-MEM 조건에서 Invitrogen 제공 프로토콜에 따라 Reverse 형질감염 실험을 수행하였다. 24시간 후에 TOYOBO superprep에서 제공하는 기본 프로토콜에 따라 RNA 정제 및 cDNA를 합성하였고 BioRad CFX-4000 기계로 SRD5A1 TaqMan probe (Hs00602694_mH)를 이용해 SRD5A1 유전자 발현 정도를 확인하였으며, 그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.
100종의 asiRNA screening 결과를 통해 상위 12종 (표 1에서 No. 5, 6, 15, 18, 40, 48, 49, 59, 62, 69, 77, 86)을 선별하여 0.3, 1, 3, 10 nM 농도로 처리한 후 Western blot을 통해 단백질 발현 억제 효과를 분석하였다. HuH-7 세포를 6 well plate에 2.5 x 105 cells/well 로 seeding한 후 asiRNA와 Lipofectamine 2000 (1 μl/ml, Invitrogen Inc.)를 이용하여 총 volume 2 ml Opti-MEM 조건에서 Invitrogen 제공 프로토콜에 따라 Reverse Transfection 실험을 수행하였다. 48시간 후에 Mammalian Protein Extraction buffer (GE healthcare)을 이용해 cell lysis 한 후 Bradford assay로 단백질을 정량하였다. 12% SDS-PAGE를 사용하여 각 샘플마다 10μg 단백질을 80V에서 20분, 120V에서 1시간 동안 전기영동 후 PVDE membrane (Bio-rad)로 300mA에서 1시간 20분 동안 transfer하였다. Transfer 후에 membrane을 5% skim milk에서 1시간 blocking 해 준 후 SRD5A1 antibody (ABcam, ab110123) 1:2000으로 12시간 동안 반응시켜주었다. 다음 날 anti-Goat HRP(Santa cruz) 1:10000으로 1시간 반응시킨 후 ChemiDox (BioRad)을 사용해 SRD5A1 단백질 발현 정도를 비교하였다. 도 2의 결과를 통해, SRD5A1 단백질 발현을 억제할 수 있는 4종의 (표 1에서 No. 48, 49, 69, 86) asiRNA를 선정하였다.
[실시예3] SRD5A1 유전자를 표적하는 세포 자가 전달능이 있는 cp-asiRNA 16종
SRD5A1를 표적으로 하는 4종(표 1에서 No. 48, 49, 69, 86)의 asiRNA에 2'OMe(Methyl), PS (phosphothioated bond), Cholesterol 개수와 위치에 따라 3가지 modification pattern을 가진 SRD5A1 cp-asiRNA (총 16 strands)을 디자인 후 OliX Inc. (Korea)에서 합성하였다. cp-asiRNA는 endocytosis 효율 및 stability를 높여 delivery vehicle의 도움 없이도 높은 효율로 세포막을 투과하여 표적유전자의 발현을 억제할 수 있다. 합성된 센스가닥 및 안티센스 가닥 RNA oligonucleotide를 95℃ 2분, 37℃ 1시간 incubation 과정을 거쳐 annealing 하였고 10% PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 통해 annealing된 cp-asiRNA를 UV transilluminator를 통해 확인하였다.
[표 2] SRD5A1를 표적으로 하는 16종의 cp-asiRNA 염기서열
Figure pat00007
[실시예 4] SRD5A1 유전자를 표적하는 세포 자가 전달능이 있는 cp-asiRNA 스크리닝
위 표 2에 따른 12종의 cp-asiRNA를 이용하여 HuH-7 세포주에서 SRD5A1의 발현 억제 효과를 확인하였다. HuH-7 세포주에 12종의 cp-asiRNA를 OptiMEM media 조건에서 1 μM, 3 μM 로 24시간 incubation한 뒤 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco), 10% Fetal Bovine Serum (Gibco), 100 units/ml Penicillin 100 μg/ml Streptomycin 조건으로 media를 교체하였고, media 교체 24시간 후에 단백질 수준에서 SRD5A1 발현을 확인하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 두 번의 반복 실험 결과 SRD5A1 cp-asiRNA #49(2,4), #86(7,4)가 50% 이상의 유전자 억제 효율을 보이는 것을 확인하였다.
위에서 선별된 2종의 cp-asiRNA를 이용하여 HuH-7 세포주에서 SRD5A1의 발현 억제 효과를 확인하였다. HuH-7 세포 주에 2종의 cp-asiRN를 OptiMEM media 조건에서 0.3 μM, 1 μM, 3 μM 로 24시간 incubation한 뒤 mRNA 수준에서 SRD5A1 발현을 확인하였다. 네 번의 반복 실험 결과, SRD5A1 cp-asiRNA #49(2,4), #86(7,4) 가 1 μM 이상 농도 조건에서 50% 이상의 유전자 억제 효율을 보이는 것을 확인하였다 (도 4).
[실시예 5] SRD5A2를 표적으로 하는 RNAi를 유도하는 이중가닥의 핵산 분자 112종 스크리닝
SRD5A2을 표적으로 하고 고효율의 RNAi 간섭을 유도하는 이중 가닥의 핵산 분자를 확보하기 위해 SRD5A2 유전자에 대한 표적서열 선정 후 asiRNA를 디자인 하였다. asiRNA 구조는 일반적으로 알려진 siRNA와 다른 구조를 가져 일반적인 siRNA 디자인 프로그램을 사용하여 asiRNA의 염기서열을 디자인하는 경우 최적화된 asiRNA의 디자인이 다소 어려울 수 있다. 따라서, asiRNA는 다음과 같은 방법으로 진행하였다. NCBI db 검색을 통해 남성형 탈모(안드로겐성탈모) 질환을 표적할 수 있을 것이라 생각되는 SRD5A2 유전자 정보를 획득하였다 (mRNA accession number: NM_000348.3). 추후에 진행할 동물실험을 고려하여 생쥐와 80% 이상의 homology를 보이는 염기 서열을 확보한 뒤 GC content 30~62%, 4개 이상의 G, C 연속 배열은 배제하는 등의 디자인 방법에 따라 100종의 asiRNA 디자인 후 OliX Inc. (Korea)에서 합성하였다. 합성된 센스가닥 및 안티센스 가닥 RNA oligonucleotide 를 95℃ 2분, 37℃ 1시간 incubation 과정을 거쳐 annealing 하였고 10% Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)를 통해 annealing된 asiRNA를 UV transilluminator를 통해 확인하였다.
[표 3] 3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 2를 표적으로 하는 112종의 asiRNA 염기 서열
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
[실시예 6] SRD5A2를 표적으로 하는 RNAi를 유도하는 이중가닥의 핵산 분자 스크리닝
mRNA 수준에서 유전자 억제 효율을 확인하기 위해, 선정한 112종의 asiRNA를 HuH-7 세포주에 0.3 nM 농도로 transfection한 후 qRT-PCR을 수행하여 SRD5A2 mRNA의 발현 정도를 측정하였다. HuH-7 세포주는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco), 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 100 units/ml Penicillin 100 μg/ml Streptomycin 조건에서 배양하였다. HuH-7 세포를 24 well plate에 5 x 104 cells/well로 seeding해 주고 asiRNA (0.3 nM, OliX Inc.)와 Lipofectamine2000 (1 μl/ml, Invitrogen Inc.)를 이용하여 총 volume 500 μl Opti-MEM 조건에서 Invitrogen 제공 프로토콜에 따라 Reverse Transfection 실험을 수행하였다. 24시간 후에 Trizol (TaKaRa)을 이용해 total RNA를 추출한 다음 High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)을 이용해 cDNA를 합성하였고, StepOne real-time PCR system 기계로 power SYBR green PCR master Mix (Applied Biosystems)과 아래의 primer를 이용해 SRD5A2 유전자 발현 정도를 확인하였다 (도 5a 및 도 5b).
실험에 사용된 primer 염기서열은 다음 표 4와 같다.
[표 4] primer 염기서열
Figure pat00014
112종의 asiRNA screening 결과를 통해 상위 23종 (표 3에서 No. 5, 8, 28, 31, 32, 33, 37, 38, 39, 40, 42, 48, 49, 59, 60, 62, 65, 83, 84, 85, 91, 92, 100)을 선별하여 10 nM 농도에서 Western blot 실험을 실시하였다. HuH-7 세포를 6well plate에 2.5 x 105 cells/well로 seeding한 후 asiRNA와 Lipofectamine2000 (1 μl/ml, Invitrogen Inc.)를 이용하여 총 volume 2 ml Opti-MEM 조건에서 Invitrogen 제공 프로토콜에 따라 Reverse Transfection 실험을 수행하였다. 48시간 후에 Mammalian Protein Extraction buffer (GE healthcare)을 이용해 cell lysis를 한 후 Bradford assay로 단백질을 정량하였다. 12% SDS-PAGE를 사용하여 각 샘플마다 10 μg 단백질을 80V에서 20분, 120V에서 1시간 동안 전기영동 후 PVDE membrane (Bio-rad)로 300mA에서 1시간 20분 동안 transfer하였다. Transfer 후에 membrane을 5% skim milk에서 1시간 blocking 해 준 후 SRD5A2 antibody (ABcam, ab124877) 1:2000으로 12시간 동안 반응시켜주었다. 다음 날 anti-Rabbit HRP(Santa cruz) 1:10000으로 1시간 반응시킨 후 ChemiDox (BioRad)을 사용해 SRD5A2 단백질 발현 정도를 비교하였다. 본 실험으로 SRD5A2 단백질 발현을 약 50% 이상 억제할 수 있는 4종의 (표 3에서 No. 31, 59, 60, 62) asiRNA을 선정하였다 (도 6a 및 도 6b).
[실시예 7] SRD5A2 유전자를 표적 하는 세포 자가 전달능이 있는 cp-asiRNA 16종
SRD5A2를 표적으로 하는 4종(표 3에서 No. 31, 59, 60, 62)의 asiRNA에 2'OMe(Methyl), PS (phosphothioated bond), Cholesterol 개수와 위치에 따라 3가지 modification pattern을 가진 SRD5A2 cp-asiRNA (총 16 strands)을 디자인 후 OliX Inc. (Korea)에서 합성하였다. cp-asiRNA는 endocytosis 효율 및 stability를 높여 delivery vehicle의 도움 없이도 높은 효율로 세포막을 투과하여 표적유전자의 발현을 억제할 수 있다. 합성된 센스가닥 및 안티센스 가닥 RNA oligonucleotide를 95℃ 2분, 37℃ 1시간 incubation 과정을 거쳐 annealing 하였고 10% Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)를 통해 annealing 된 cp-asiRNA를 UV transilluminator를 통해 확인하였다.
[표 5] SRD5A2를 표적으로 하는 16 strands의 cp-asiRNA 염기서열
Figure pat00015
[실시예 8] SRD5A2 유전자를 표적하는 세포 자가 전달능이 있는 cp-asiRNA 스크리닝
위 표 5에 따른 12종의 cp-asiRNA를 이용하여 HuH-7 세포주에서 SRD5A2의 발현 억제 효과를 확인하였다. HuH-7 세포주에 12종의 cp-asiRNA를 OptiMEM media 조건에서 1 μM, 3 μM로 24시간 incubation한 뒤 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco), 10% Fetal Bovine Serum (Gibco), 100 units/ml Penicillin 100 μg/ml Streptomycin 조건으로 media를 교체하였고, media 교체 24시간 후에 단백질 수준에서 SRD5A2 발현을 확인하였다. 두 번의 반복 실험 결과, SRD5A2 cp-asiRNA #59(4,4), #62(4,4) 가 50% 이상의 유전자 억제 효율을 보이는 것을 확인하였다 (도 7).
[실시예 9] 선정된 cp-asiRNA 2 종에 대한 표적유전자 SRD5A2 발현 억제 효율 확인
위에서 선별된 2종의 cp-asiRNA를 이용하여 HuH-7 세포주에서 SRD5A2의 발현 억제 효과를 확인하였다. HuH-7 세포주에 2종의 cp-asiRNA를 OptiMEM media 조건에서 1.95, 3.9, 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1000 (nM)로 24시간 incubation 한 뒤 mRNA 수준에서 SRD5A2 발현을 확인하였다. 세 번의 반복 실험 결과, SRD5A1 cp-asiRNA #59(4,4), #62(4,4) 가 각각 22.37 nM, 27.18 nM 의 IC50 값을 갖는 것을 확인하였다 (도 8).
위에서 선별된 2종의 cp-asiRNA를 이용하여 HuH-7 세포주에서 SRD5A2의 발현 억제 효과를 확인하였다. HuH-7 세포주에 2종의 cp-asiRNA를 OptiMEM media 조건에서 0.1, 0.3, 1, 3 μM 농도로 24시간 incubation한 뒤 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco), 10% Fetal Bovine Serum (Gibco), 100 units/ml Penicillin 100 μg/ml Streptomycin 조건으로 media를 교체하였고, media 교체 24시간 후에 단백질 수준에서 SRD5A2 발현을 확인하였다. 두 번의 반복 실험 결과, cp-asiSRD5A2 #59(4,4), #62(4,4) 의 처리 농도가 높아짐에 따라 표적으로 하는 유전자 SRD5A2 의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다 (도 9).
[실시예 10] AR을 표적으로 하는 RNAi를 유도하는 이중가닥의 핵산 분자 118종 스크리닝
AR를 표적으로 하는 고효율의 RNAi 간섭을 유도하는 이중 가닥의 핵산 분자를 확보하기 위해 AR 유전자에 대한 표적서열선정 후 asiRNA를 디자인 하였다. asiRNA 구조는 일반적으로 알려진 siRNA와 다른 구조를 가져 일반적인 siRNA 디자인 프로그램을 사용하여 asiRNA의 염기서열을 디자인하는 경우 최적화된 asiRNA의 디자인이 다소 어려울 수 있다. 따라서, asiRNA는 다음과 같은 방법으로 진행하였다. NCBI db 검색을 통해 남성형 탈모(안드로겐성탈모) 질환의 표적 유전자인 AR 유전자 정보를 획득하였다. (mRNA accession number: NM_001011645.2) 추후에 진행할 동물실험을 고려하여 생쥐와 80% 이상의 homology를 보이는 염기 서열을 확보한 뒤 GC content 30~62%, 4개 이상의 G, C 연속 배열은 배제하는 등의 디자인 방법에 따라 100종의 asiRNA 디자인 후 OliX Inc. (Korea)에서 합성하였다. 합성된 센스가닥 및 안티센스 가닥 RNA oligonucleotide를 95℃ 2분, 37℃ 1시간 incubation 과정을 거쳐 annealing하였고 10% Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)를 통해 annealing된 asiRNA를 UV transilluminator를 통해 확인하였다.
[표 6] Androgen Receptor를 표적으로 하는 118종의 asiRNA 염기 서열
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
[실시예 11] AR을 표적으로 하는 RNAi 유도 이중가닥의 핵산 분자 스크리닝
mRNA 수준에서 유전자 억제 효율을 확인하기 위해, 선정한 118종의 asiRNA를 A549 세포주에 0.3 nM 농도로 transfection한 후 qRT-PCR을 수행하여 AR mRNA의 발현 정도를 측정하였다.
A549 세포주는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco), 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 100 units/ml Penicillin 100 μg/ml Streptomycin 조건에서 배양하였다. A549 세포를 96 well plate에 5 x 103 cells/well로 seeding해 주고 asiRNA (0.3 nM, OliX Pharmaceuticals Inc.)와 RNAiMAX (1 μl/ml, Invitrogen Inc.)를 이용하여 총 volume 100 μl Opti-MEM 조건에서 Invitrogen 제공 프로토콜에 따라 Transfection 실험을 수행하였다. 24시간 후에 TOYOBO superprep에서 제공하는 기본 프로토콜에 따라 RNA 정제 및 cDNA를 합성하였고 BioRad CFX-4000 기계로 AR TaqMan probe (T) 를 이용해 AR 유전자 발현 정도를 확인하였다. 118종 중에서 88종을 우선 asiRNA screening 실험을 진행하였고 표적 유전자의 발현을 감소시키는 억제 효력을 기준으로 상위 13종 (표 6에서 No. 43, 49, 67, 70, 72, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 87)을 선별하였으며, 선발된 13종은 나머지 30종과 (표 6에서 No. 88~118) 2차 asiRNA Screening 실험을 실시하였다 (도 10a 및 도 10b).
2차의 asiRNA Screening을 거쳐 표적 유전자의 발현을 감소시키는 억제 효력을 기준으로 상위 20종 (표 6에서 No. 43, 49, 70, 72, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 87, 89, 90, 93, 96, 106, 110, 111, 118)을 선별하였고, 선발된 20종을 단백질 수준에서의 AR 발현 억제 효력을 확인하는 실험을 실시하였다. A549 세포를 12 well plate에 5 x 104 cells/well로 seeding한 후 asiRNA (0.3 nM, OliX Pharmaceuticals Inc.)와 RNAiMAX (1 μl/ml, Invitrogen Inc.)를 이용하여 총 volume 1 ml Opti-MEM 조건에서 Invitrogen 제공 프로토콜에 따라 Transfection 실험을 수행하였다. 48시간 후에 Mammalian protein Extraction Buffer (GE Healthcare) 로 cell lysis를 한 후 Bradford assay로 단백질을 정량하였다. 10% SDS-PAGE를 사용하여 각 샘플마다 20 μg 단백질을 80V에서 20분, 120V에서 1시간 동안 전기영동 후 PVDE membrane (Bio-rad)로 300mA에서 1시간 동안 transfer 하였다. Transfer 후에 membrane을 5% skim milk에서 1시간 blocking해 준 후 AR antibody (ABcam, ab133273) 1:2000으로 12시간 동안 반응시켜주었다. 다음 날 anti-Rabbit HRP(Santa cruz) 1:5000으로 1시간 반응시킨 후 ChemiDox (BioRad)을 사용해 AR 단백질 발현 정도를 비교하였다. 이를 통해 AR 단백질 발현을 보다 효과적으로 억제할 수 있는 상위 9종의 (70, 72, 78, 81, 82, 90, 110, 111, 118) asiRNA를 선정하였다 (도 11).
asiRNA Screening을 거쳐 표적 유전자의 발현을 감소시키는 억제 효력을 기준으로 상위 9종의 (표 6에서 No. 70, 72, 78, 81, 82, 90, 110, 111, 118) asiRNA 후보들을 선별하였고 선발된 9종을 더 낮은 농도(0.1 nM)에서 실험하여 mRNA와 단백질 수준에서의 AR 발현 억제 효력을 확인하는 실험을 실시하였다. A549 세포를 12 well plate에 5 x 104 cells/well로 seeding한 후 asiRNA와 RNAiMAX (1 μl/ml, Invitrogen Inc.)를 이용하여 총 volume 0.5 ml Opti-MEM 조건에서 Invitrogen 제공 프로토콜에 따라 Transfection 실험을 수행하였다. 48시간 후에 Trizol (TaKaRa)을 이용해 total RNA를 추출한 다음 High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)을 이용해 cDNA를 합성하였고, StepOne real-time PCR system 기계로 power SYBR green PCR master Mix (Applied Biosystems)과 아래 표 7의 primer를 이용해 AR 유전자 발현 정도를 확인하였다.
[표 7] primer 염기서열
Figure pat00023
또한, A549 세포를 12 well plate에 5 x 104 cells/well로 seeding한 후 asiRNA와 RNAiMAX (1 μl/ml, Invitrogen Inc.)를 이용하여 총 volume 0.5 ml Opti-MEM 조건에서 Invitrogen 제공 프로토콜에 따라 Transfection 실험을 수행하였다. 48시간 후에 Mammalian protein Extraction Buffer (GE Healthcare)로 cell lysis를 한 후 Bradford assay 로 단백질을 정량하였다. 10% SDS-PAGE를 사용하여 각 샘플마다 20 μg 단백질을 80V 에서 20분, 120V에서 1시간 동안 전기영동 후 PVDE membrane (Bio-rad) 로 300mA에서 1시간 동안 transfer하였다. Transfer 후에 membrane을 5% skim milk에서 1시간 blocking해 준 후 AR antibody (ABcam, ab133273) 1:2000으로 12시간 동안 반응시켜주었다. 다음 날 anti-Rabbit HRP(Santa cruz) 1:5000으로 1시간 반응시킨 후 ChemiDox (BioRad)을 사용해 AR 단백질 발현 정도를 비교하였다. 선발된 9종의 실험 결과 0.1 nM 농도에서도 효과적으로 72, 78, 110번이 50% 수준의 유전자 억제 효율을 보이는 것을 확인하였다 (도 12).
[실시예 12] AR 유전자를 표적 하는 세포 자가 전달능이 있는 cp-asiRNA 9종
AR을 표적으로 하는 3종의 asiRNA에 2'OMe(Methyl), PS (phosphothioated bond), Cholesterol 개수와 위치에 따라 3가지 modification pattern을 가진 AR cp-asiRNA (총 9종)을 디자인 후 Dharmacon에 합성 의뢰하였다. cp-asiRNA는 endocytosis 효율 및 stability를 높여 delivery vehicle의 도움 없이도 높은 효율로 세포막을 투과하여 표적유전자의 발현을 억제할 수 있다. 합성된 센스가닥 및 안티센스 가닥 RNA oligonucleotide 를 95℃ 2분, 37℃ 1시간 incubation 과정을 거쳐 annealing 하였고 10% Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)를 통해 annealing된 cp-asiRNA를 UV transilluminator를 통해 확인하였다.
[표 8] AR을 표적으로 하는 9종의 cp-asiRNA 염기서열
Figure pat00024
[실시예 13] AR 유전자를 표적 하는 세포 자가 전달능이 있는 cp-asiRNA 스크리닝
위 표 8에 따른 9종의 cp-asiRNA를 이용하여 A549 세포주에서 AR의 발현 억제 효과를 확인하였다. A549 세포주에 9종의 cp-asiRNA를 OptiMEM media 조건에서 1 또는 3 μM로 24시간 incubation 한 뒤 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco), 10% Fetal Bovine Serum (Gibco), 100 units/ml Penicillin 100 μg/ml Streptomycin 조건으로 media를 교체하였고 다시 24시간이 지난 후에 mRNA 수준에서 AR의 발현을 확인하였다. 4 번의 반복 실험 결과, 9종의 AR cp-asiRNA 3 μM 수준에서 50% 수준의 유전자 억제 효율을 보이는 것을 확인하였다 (도 13).
동일한 실험 조건에서 9종의 cp-asiRNA를 이용하여 A549 세포주에서 AR의 발현 억제 효과를 단백질 수준에서 확인하였다. A549 세포주에 9종의 cp-asiRNA를 OptiMEM media 조건에서 1 또는 3 μM로 24시간 incubation한 뒤 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco), 10% Fetal Bovine Serum (Gibco), 100 units/ml Penicillin 100 μg/ml Streptomycin 조건으로 media를 교체하였고 다시 24시간이 지난 후에 Protein 수준에서 AR의 발현을 확인하였다. 이 중에서 #72(7,4), #78(7,4)(4,4)(2,4), #110(7,4)(4,4)에서 1 μM 수준에서 No treatment (NT) sample과 1/2 NT sample의 band intensity를 기준으로 50% 이상 표적 유전자 단백질 발현의 억제 효율을 보였다 (도 14).
구체적 구성을 참조하여 본 발명을 상세하게 기재하였으나, 이러한 기재는 바람직한 구현예에 관한 것이고, 발명의 범위를 제한하지 않음은 당업자에 자명한 것이다. 이에, 본 발명의 실질적 범위는 출원된 청구항 및 그 등가물에 의해 정의된다 할 것이다.
<110> OLIX PHARMACEUTICALS INC. <120> Asymmetric siRNA Inhibiting Expression of Genes Directed to Male Type Depilation <130> 021 <160> 673 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 1 gcagauacuu gagcca 16 <210> 2 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 2 aagcagauac uugagc 16 <210> 3 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 3 caaagcagau acuuga 16 <210> 4 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 4 ugcaaagcag auacuu 16 <210> 5 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 5 gugcagugua ugcuga 16 <210> 6 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 6 uugugcagug uaugcu 16 <210> 7 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 7 cauugugcag uguaug 16 <210> 8 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 8 uuuuggcuug ugguua 16 <210> 9 <211> 16 <212> RNA 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<210> 19 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 19 ccaggagaua cuggau 16 <210> 20 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 20 aauaccaagg ggaggc 16 <210> 21 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 21 aaaauaccaa ggggag 16 <210> 22 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 22 gaggcuuauu ugaaua 16 <210> 23 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 23 cagccaacua uuuugg 16 <210> 24 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 24 ugcagccaac uauuuu 16 <210> 25 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 25 acugcagcca acuauu 16 <210> 26 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 26 uaacugcagc caacua 16 <210> 27 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA <400> 27 cguaacugca gccaac 16 <210> 28 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRNA 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gtttattatt tttttaactc ccttactctg agaaagggat attttgaagg 4740 actgtcatat atctttgaaa aaagaaaatc tgtaatacat atatttttat gtatgttcac 4800 tggcactaaa aaatatagag agcttcattc tgtcctttgg gtagttgctg aggtaattgt 4860 ccaggttgaa aaataatgtg ctgatgctag agtccctctc tgtccatact ctacttctaa 4920 atacatatag gcatacatag caagttttat ttgacttgta ctttaagaga aaatatgtcc 4980 accatccaca tgatgcacaa atgagctaac attgagcttc aagtagcttc taagtgtttg 5040 tttcattagg cacagcacag atgtggcctt tccccccttc tctcccttga tatctggcag 5100 ggcataaagg cccaggccac ttcctctgcc ccttcccagc cctgcaccaa agctgcattt 5160 caggagactc tctccagaca gcccagtaac tacccgagca tggcccctgc atagccctgg 5220 aaaaataaga ggctgactgt ctacgaatta tcttgtgcca gttgcccagg tgagagggca 5280 ctgggccaag ggagtggttt tcatgtttga cccactacaa ggggtcatgg gaatcaggaa 5340 tgccaaagca ccagatcaaa tccaaaactt aaagtcaaaa taagccattc agcatgttca 5400 gtttcttgga aaaggaagtt tctacccctg atgcctttgt aggcagatct gttctcacca 5460 ttaatctttt tgaaaatctt ttaaagcagt ttttaaaaag agagatgaaa gcatcacatt 5520 atataaccaa agattacatt gtacctgcta agataccaaa attcataagg gcaggggggg 5580 agcaagcatt agtgcctctt tgataagctg tccaaagaca gactaaagga ctctgctggt 5640 gactgactta taagagcttt gtgggttttt ttttccctaa taatatacat gtttagaaga 5700 attgaaaata atttcgggaa aatgggatta tgggtccttc actaagtgat tttataagca 5760 gaactggctt tccttttctc tagtagttgc tgagcaaatt gttgaagctc catcattgca 5820 tggttggaaa tggagctgtt cttagccact gtgtttgcta gtgcccatgt tagcttatct 5880 gaagatgtga aacccttgct gataagggag catttaaagt actagatttt gcactagagg 5940 gacagcaggc agaaatcctt atttctgccc actttggatg gcacaaaaag ttatctgcag 6000 ttgaaggcag aaagttgaaa tacattgtaa atgaatattt gtatccatgt ttcaaaattg 6060 aaatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atagtgtgtg tgtgtgttct 6120 gatagcttta actttctctg catctttata tttggttcca gatcacacct gatgccatgt 6180 acttgtgaga gaggatgcag ttttgttttg gaagctctct cagaacaaac aagacacctg 6240 gattgatcag ttaactaaaa gttttctccc ctattgggtt tgacccacag gtcctgtgaa 6300 ggagcagagg gataaaaaga gtagaggaca tgatacattg tactttacta gttcaagaca 6360 gatgaatgtg gaaagcataa aaactcaatg gaactgactg agatttacca cagggaaggc 6420 ccaaacttgg ggccaaaagc ctacccaagt gattgaccag tggcccccta atgggacctg 6480 agctgttgga agaagagaac tgttccttgg tcttcaccat ccttgtgaga gaagggcagt 6540 ttcctgcatt ggaacctgga gcaagcgctc tatctttcac acaaattccc tcacctgaga 6600 ttgaggtgct cttgttactg ggtgtctgtg tgctgtaatt ctggttttgg atatgttctg 6660 taaagatttt gacaaatgaa aatgtgtttt tctctgttaa aacttgtcag agtactagaa 6720 gttgtatctc tgtaggtgca ggtccatttc tgcccacagg tagggtgttt ttctttgatt 6780 aagagattga cacttctgtt gcctaggacc tcccaactca accatttcta ggtgaaggca 6840 gaaaaatcca cattagttac tcctcttcag acatttcagc tgagataaca aatcttttgg 6900 aattttttca cccatagaaa gagtggtaga tatttgaatt tagcaggtgg agtttcatag 6960 taaaaacagc ttttgactca gctttgattt atcctcattt gatttggcca gaaagtaggt 7020 aatatgcatt gattggcttc tgattccaat tcagtatagc aaggtgctag gttttttcct 7080 ttccccacct gtctcttagc ctggggaatt aaatgagaag ccttagaatg ggtggccctt 7140 gtgacctgaa acacttccca cataagctac ttaacaagat tgtcatggag ctgcagattc 7200 cattgcccac caaagactag aacacacaca tatccataca ccaaaggaaa gacaattctg 7260 aaatgctgtt tctctggtgg ttccctctct ggctgctgcc tcacagtatg ggaacctgta 7320 ctctgcagag gtgacaggcc agatttgcat tatctcacaa ccttagccct tggtgctaac 7380 tgtcctacag tgaagtgcct ggggggttgt cctatcccat aagccacttg gatgctgaca 7440 gcagccacca tcagaatgac ccacgcaaaa aaaagaaaaa aaaaattaaa aagtcccctc 7500 acaacccagt gacacctttc tgctttcctc tagactggaa cattgattag ggagtgcctc 7560 agacatgaca ttcttgtgct gtccttggaa ttaatctggc agcaggaggg agcagactat 7620 gtaaacagag ataaaaatta attttcaata ttgaaggaaa aaagaaataa gaagagagag 7680 agaaagaaag catcacacaa agattttctt aaaagaaaca attttgcttg aaatctcttt 7740 agatggggct catttctcac ggtggcactt ggcctccact gggcagcagg accagctcca 7800 agcgctagtg ttctgttctc tttttgtaat cttggaatct tttgttgctc taaatacaat 7860 taaaaatggc agaaacttgt ttgttggact acatgtgtga ctttgggtct gtctctgcct 7920 ctgctttcag aaatgtcatc cattgtgtaa aatattggct tactggtctg ccagctaaaa 7980 cttggccaca tcccctgtta tggctgcagg atcgagttat tgttaacaaa gagacccaag 8040 aaaagctgct aatgtcctct tatcattgtt gttaatttgt taaaacataa agaaatctaa 8100 aatttcaaaa aa 8112

Claims (11)

  1. 서열번호 678의 SRD5A1 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 1) 코딩 유전자, 서열번호 679의 SRD5A2 (3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 2) 코딩 유전자 또는 서열번호 680의 AR (Adrogen receptor) 코딩 유전자에 특이적으로 결합하고,
    15-17nt의 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 19nt 이상의 안티센스 가닥을 포함하며,
    상기 센스가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단 (blunt end)을 형성하는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 5, 6, 15, 18, 40, 48, 49, 59, 62, 69, 77, 86, 205, 208, 228, 231, 232, 233, 237, 238, 239, 240, 242, 248, 249, 259, 260, 262, 265, 283, 284, 285, 291, 292, 300, 471, 477, 498, 500, 502, 503, 505, 506, 507, 509, 510, 515, 517, 518, 521, 524, 534, 538, 539 및 546으로 구성된 군에서 선택되는 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 48, 49, 69, 86, 231, 259, 260, 262, 498, 500, 506, 509, 510, 518, 538, 539 및 546으로 구성된 군에서 선택되는 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  4. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 19-24nt의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  5. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 105, 106, 115, 118, 140, 148, 149, 159, 162, 169, 177, 186, 317, 320, 340, 343, 344, 345, 349, 350, 351, 352, 354, 360, 361, 371, 372, 374, 377, 395, 396, 397, 403, 404, 412, 589, 595, 616, 618, 620, 621, 623, 624, 625, 627, 628, 633, 635, 636, 639, 642, 652, 656, 657 및 664로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  6. 제5항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 148, 149, 169, 186, 343, 371, 372, 374, 616, 618, 624, 627, 628, 636, 656, 657 및 664로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  7. 제1항에 있어서, 상기 siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 화학적 변형은 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA:
    뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환;
    뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 산소가 황으로 치환;
    뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형;
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및
    콜레스테롤 또는 세포 침투 펩타이드 결합.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 화학적 변형은 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환, 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate)으로 변형, 또는 콜레스테롤 결합인 것을 특징으로 하는 siRNA.
  10. 제9항에 있어서,
    센스가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환되는 변형;
    센스가닥 또는 안티센스 가닥 중 2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸)로 치환되는 변형;
    센스 또는 안티센스 가닥에서 25% 이상의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트로 변형; 및
    센스가닥의 3' 말단에 콜레스테롤 결합으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물.
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