JP2020508699A - 男性型脱毛標的遺伝子の発現を抑制する非対称siRNA - Google Patents
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Abstract
Description
前記センス鎖又はアンチセンス鎖において化学的修飾は、例えば、次に構成された群から選ばれる一つ以上を含むことができる:
ヌクレオチド内糖(sugar)構造の酸素が硫黄に置換;
ヌクレオチド結合がホスホロチオエート(phosphorothioate)、ボラノホスフェート(boranophosphate)、又はメチルホスホネート(methyl phosphonate)で修飾;
PNA(peptide nucleic acid)、LNA(locked nucleic acid)又はUNA(unlocked nucleic acid)形態への修飾;及び
コレステロール又は細胞侵入ペプチド結合。
SRD5A1を標的とする高効率のRNAi干渉を誘導する二本鎖の核酸分子を確保するために、SRD5A1遺伝子に対する標的配列の選定後にasiRNAをデザインした。asiRNA構造は一般に知られたsiRNAと異なる構造を有するので、一般のsiRNAデザインプログラムを用いてasiRNAの塩基配列をデザインする場合、最適化したasiRNAをデザインすることが多少困難である。したがって、asiRNAは、次のような方法で作製した。NCBI db検索によって男性型脱毛(アンドロゲン性脱毛)疾患の標的遺伝子であるSRD5A1遺伝子情報を取得した(mRNA受託番号:NM_001047.3、NM_001324322.1、NM_001324323.1)。後で行う動物実験のために、マウスとの塩基配列相同性(homology)を考慮した塩基配列を確保した後、GC含量30〜62%、4個以上のG、C連続配列は排除するなどのデザイン方法によって100種のasiRNAをデザイン後に、OliX社(韓国)で合成した。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖RNAオリゴヌクレオチドを95℃2分間、37℃1時間インキュベーション過程を経てアニールし、10%PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)により、アニールされたasiRNAをUVトランスルミネーターで確認した。
mRNAレベルで遺伝子抑制効率を確認するために、選定した100種のasiRNAをHuH−7細胞株に0.3nM濃度で形質感染した後、qRT−PCRを行ってSRD5A1 mRNAの発現程度を測定した。
SRD5A1を標的とする4種(表1でNo.48、49、69、86)のasiRNAに2’OMe(メチル)、PS(ホスホロチオエート結合)、コレステロールの個数及び位置によって3つの修飾パターンを持つSRD5A1 cp−asiRNA(総16本鎖)をデザイン後、OliX社(韓国)で合成した。cp−asiRNAはエンドサイトーシス効率及び安定性(stability)を高め、伝達ビークル(delivery vehicle)の援助なしにも高い効率で細胞膜を透過して標的遺伝子の発現を抑制することができる。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖RNAオリゴヌクレオチドを95℃2分間、37℃1時間インキュベーション過程を経てアニールし、10%PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)により、アニールされたcp−asiRNAをUVトランスルミネーターで確認した。
上記の表2による12種のcp−asiRNAを用いてHuH−7細胞株でSRD5A1の発現抑制効果を確認した。HuH−7細胞株に12種のcp−asiRNAをOptiMEM培地条件で1μM又は3μMで24時間インキュベーションした後、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(Gibco)、10%ウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum)(Gibco)、100units/mlペニシリン100μg/mlストレプトマイシン条件で培地を交換し、培地交換24時間後に、タンパク質レベルでSRD5A1発現を確認した。図3に示すように、2回の反復実験の結果、SRD5A1 cp−asiRNA #49(2,4)、#86(7,4)が50%以上の遺伝子抑制効率を示すことを確認した。
SRD5A2を標的とし、高効率のRNAi干渉を誘導する二本鎖の核酸分子を確保するために、SRD5A2遺伝子に対する標的配列選定後にasiRNAをデザインした。asiRNA構造は一般に知られたsiRNAと異なる構造を有するため、一般のsiRNAデザインプログラムを用いてasiRNAの塩基配列をデザインする場合、最適化したasiRNAをデザインすることが多少難しい。したがって、asiRNAは、次のような方法で行った。NCBI db検索によって、男性型脱毛(アンドロゲン性脱毛)疾患を標的し得ると考えられるSRD5A2遺伝子情報を取得した(mRNA受託番号:NM_000348.3)。後で行う動物実験を考慮して、マウスと80%以上の相同性を示す塩基配列を確保した後、GC含量30〜62%、4個以上のG、C連続配列は排除するなどのデザイン方法で100種のasiRNAをデザイン後に、OliX社(韓国)で合成した。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖RNAオリゴヌクレオチドを95℃2分間、37℃1時間インキュベーション過程を経てアニールし、10%PAGEにより、アニールされたasiRNAをUVトランスルミネーターで確認した。
mRNAレベルで遺伝子抑制効率を確認するために、選定した112種のasiRNAをHuH−7細胞株に0.3nM濃度でトランスフェクションした後、qRT−PCRを行ってSRD5A2 mRNAの発現程度を測定した。HuH−7細胞株は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM,Gibco)、10%ウシ胎児血清(FBS,Gibco)、100units/mlペニシリン100μg/mlストレプトマイシン条件で培養した。HuH−7細胞を24ウェルプレートに5×104cells/wellで播種し、siRNA(0.3nM,OliX社)とLipofectamine2000(1μl/ml,Invitrogen社)を用いて総体積500μl Opti−MEM条件で、Invitrogen提供プロトコルに従ってリバーストランスフェクション実験を行った。24時間後にTrizol(TaKaRa)を用いてトータルRNAを抽出した後、High−capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems)を用いてcDNAを合成し、StepOneリアルタイムPCRシステム機械でpower SYBR green PCR master Mix(Applied Biosystems)と下記のプライマーを用いてSRD5A2遺伝子発現程度を確認した(図5A及び図5B)。
SRD5A2を標的とする4種(表3でNo.31、59、60、62)のasiRNAに2’OMe(メチル)、PS(ホスホロチオエート結合)、コレステロール個数及び位置によって、3つの修飾パターンを持つSRD5A2cp−asiRNA(総16本)をデザイン後、OliX社(韓国)で合成した。cp−asiRNAは、エンドサイトーシス効率及び安定性を高めるので、伝達ビークルの援助無しにも高い効率で細胞膜を透過して標的遺伝子の発現を抑制することができる。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖RNAオリゴヌクレオチドを95℃2分、37℃1時間インキュベーション過程を経てアニールし、10%PAGEにより、アニールされたcp−asiRNAをUVトランスルミネーターで確認した。
上記の表5による12種のcp−asiRNAを用いてHuH−7細胞株でSRD5A2の発現抑制効果を確認した。HuH−7細胞株に12種のcp−asiRNAをOptiMEM培地条件で1μM、3μMで24時間インキュベーションした後、ダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100units/mlペニシリン100μg/mlストレプトマイシン条件で培地を交換し、培地交換24時間後にタンパク質レベルでSRD5A2発現を確認した。2回の反復実験の結果、SRD5A2cp−asiRNA #59(4,4)、#62(4,4)が50%以上の遺伝子抑制効率を示すことを確認した(図7)。
上で選別された2種のcp−asiRNAを用いてHuH−7細胞株でSRD5A2の発現抑制効果を確認した。HuH−7細胞株に2種のcp−asiRNAをOptiMEM培地条件で1.95、3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000(nM)で24時間インキュベーションした後、mRNAレベルでSRD5A2発現を確認した。3回の反復実験の結果、SRD5A2 cp−asiRNA #59(4,4)、#62(4,4)がそれぞれ22.37nM、27.18nMのIC50値を有することを確認した(図8)。
ARを標的とする高効率のRNAi干渉を誘導する二本鎖の核酸分子を確保するために、AR遺伝子に対する標的配列の選定後にasiRNAをデザインした。asiRNA構造は一般に知られたsiRNAと異なる構造を有するので、一般のsiRNAデザインプログラムを用いてasiRNAの塩基配列をデザインする場合、最適化したasiRNAをデザインすることが多少難しい。したがって、asiRNAデザインは、次のような方法で行った。NCBI db検索によって男性型脱毛(アンドロゲン性脱毛)疾患の標的遺伝子であるAR遺伝子情報を取得した(mRNA受託番号:NM_001011645.2)。後で行う動物実験を考慮して、マウスと80%以上の相同性を示す塩基配列を確保した後、GC含量30〜62%、4個以上のG、C連続配列は排除するなどのデザイン方法によって100種のasiRNAをデザイン後、OliX社(韓国)で合成した。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖RNAオリゴヌクレオチドを95℃2分間、37℃1時間インキュベーション過程を経てアニールし、10%PAGEにより、アニールされたasiRNAをUVトランスルミネーターで確認した。
mRNAレベルで遺伝子抑制効率を確認するために、選定した118種のasiRNAをA549細胞株に0.3nM濃度でトランスフェクションした後、qRT−PCRを行ってAR mRNAの発現程度を測定した。
ARを標的とする3種のasiRNAに2’OMe(Methyl)、PS(ホスホロチオエート結合)、コレステロールの個数及び位置によって3つの修飾パターンを持つAR cp−asiRNA(総9種)をデザイン後、Dharmaconに合成を依頼した。cp−asiRNAはエンドサイトーシス効率及び安定性を高めるので、伝達ビークルの援助なしにも高い効率で細胞膜を透過して標的遺伝子の発現を抑制することができる。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖RNAオリゴヌクレオチドを95℃2分間、37℃1時間インキュベーション過程を経てアニールし、10%PAGEにより、アニールされたcp−asiRNAをUVトランスルミネーターで確認した。
上記の表8による9種のcp−asiRNAを用いてA549細胞株でARの発現抑制効果を確認した。A549細胞株に9種のcp−asiRNAをOptiMEM培地条件で1μM又は3μMで24時間インキュベーションした後、ダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100units/mlペニシリン100μg/mlストレプトマイシン条件で培地を交換し、さらに24時間経過後にmRNAレベルでARの発現を確認した。4回の反復実験の結果、9種のAR cp−asiRNA 3μMレベルで50%レベルの遺伝子抑制効率を示すことを確認した(図13)。
Claims (11)
- 配列番号678のSRD5A1(3−oxo−5−alpha−steroid 4−dehydrogenase 1)をコードする遺伝子のmRNA、配列番号679のSRD5A2(3−oxo−5−alpha−steroid 4−dehydrogenase 2)をコードする遺伝子のmRNA、又は配列番号680のAR(Adrogen receptor)をコードする遺伝子のmRNAに特異的に結合し、
15nt〜17ntのセンス鎖及び該センス鎖と相補的な19nt以上のアンチセンス鎖を含み、
前記センス鎖の3’末端及びアンチセンス鎖の5’末端はブラント末端(blunt end)を形成することを特徴とするsiRNA。 - 配列番号5、6、15、18、40、48、49、59、62、69、77、86、205、208、228、231、232、233、237、238、239、240、242、248、249、259、260、262、265、283、284、285、291、292、300、471、477、498、500、502、503、505、506、507、509、510、515、517、518、521、524、534、538、539及び546からなる群から選ばれるセンス鎖及び該センス鎖と相補的なアンチセンス鎖を含むことを特徴とする、請求項1に記載のsiRNA。
- 配列番号48、49、69、86、231、259、260、262、498、500、506、509、510、518、538、539及び546からなる群から選ばれるセンス鎖及び該センス鎖と相補的なアンチセンス鎖を含むことを特徴とする、請求項2に記載のsiRNA。
- 前記アンチセンス鎖は、19nt〜24ntの長さを有することを特徴とする、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記アンチセンス鎖は、配列番号105、106、115、118、140、148、149、159、162、169、177、186、317、320、340、343、344、345、349、350、351、352、354、360、361、371、372、374、377、395、396、397、403、404、412、589、595、616、618、620、621、623、624、625、627、628、633、635、636、639、642、652、656、657及び664からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記アンチセンス鎖は、配列番号148、149、169、186、343、371、372、374、616、618、624、627、628、636、656、657及び664からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載のsiRNA。
- 前記siRNAのセンス鎖又はアンチセンス鎖は一つ以上の化学的修飾(chemical modification)を含むことを特徴とする、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記化学的修飾は、次に構成された群から選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする、請求項7に記載のsiRNA:
ヌクレオチド内の糖構造の2’炭素位置で−OH基が−CH3(メチル)、−OCH3(メトキシ)、−NH2、−F(フッ素)、−O−2−メトキシエチル−O−プロピル(propyl)、−O−2−メチルチオエチル(methylthioethyl)、−O−3−アミノプロピル、−O−3−ジメチルアミノプロピルに置換;
ヌクレオチド内の糖(sugar)構造の酸素が硫黄に置換;
ヌクレオチド結合がホスホロチオエート(phosphorothioate)、ボラノホスフェート(boranophosphate)、又はメチルホスホネート(methyl phosphonate)で修飾;
PNA(peptide nucleic acid)、LNA(locked nucleic acid)又はUNA(unlocked nucleic acid)形態への修飾;及び
コレステロール又は細胞侵入ペプチド結合。 - 前記化学的修飾は、ヌクレオチド内の糖構造の2’炭素位置で−OH基が−CH3(メチル)に置換、ヌクレオチド結合がホスホロチオエート(phosphorothioate)で修飾、又はコレステロール結合であることを特徴とする、請求項7に記載のsiRNA。
- センス鎖の5’末端又は3’末端ヌクレオチド内糖構造の2’炭素位置で−OH基が−CH3(メチル)に置換される修飾;
センス鎖又はアンチセンス鎖のうち2個以上のヌクレオチド内の糖構造2’炭素位置で−OH基が−CH3(メチル)に置換される修飾;
センス又はアンチセンス鎖において25%以上のヌクレオチド結合がホスホロチオエートで修飾;及び
センス鎖の3’末端にコレステロール結合;からなる群から選ばれる一つ以上の修飾を含むことを特徴とする、請求項9に記載のsiRNA。 - 請求項1〜10のいずれか一項に記載のsiRNAを含む、脱毛予防又は治療用の組成物。
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