JP2011505868A - オフターゲット効果を極力抑えるとともに、ＲＮＡｉ機構を飽和させない新規なｓｉＲＮＡ構造及びその用途 - Google Patents

オフターゲット効果を極力抑えるとともに、ＲＮＡｉ機構を飽和させない新規なｓｉＲＮＡ構造及びその用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規なｓｉＲＮＡ構造及びその用途に係り、さらに詳しくは、１９〜２１ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンス鎖及び前記アンチセンス鎖に相補的な配列を有する１５〜１９ｎｔのセンス鎖からなる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子（small interfering ＲＮＡ molecule）であり、前記ｓｉＲＮＡはアンチセンス鎖の５’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の３’末端に突出部分を有することを特徴とするｓｉＲＮＡ分子及びこれを用いた標的遺伝子の発現抑制法に関する。

Description

本発明は新規なｓｉＲＮＡ構造及びその用途に係り、さらに詳しくは、標的遺伝子の発現抑制効率に優れており、ＲＮＡｉ機構を飽和させない他、ｓｉＲＮＡのセンス鎖によるオフターゲット効果を極力抑えた新規な構造のｓｉＲＮＡ分子及びこれを用いた標的遺伝子の発現抑制法に関する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ interference；ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列を有するセンス鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンス鎖と、からなる二本鎖ＲＮＡ（以下、「ｄｓＲＮＡ」と称する。）を細胞などに導入して標的遺伝子ｍＲＮＡの分解を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制しうる現象である。このようにＲＮＡｉは標的遺伝子の発現を抑制しうることから、従来の複雑で且つ非効率的な相同組み換えによる遺伝子破壊方法に取って代わる簡単な遺伝子ノックダウン方法として、または遺伝子治療の方法として大きな関心を集めている。当初、ＲＮＡｉは、線虫（Caenorhabditis elegans）においてのみ見られる現象と考えられていたが（Fire, A. et al., Nature, 391:806, 1998）、植物、線形動物、ショウジョウバエ（Drosophila）、原生動物など各種の生物においても観察されている（Fire, A., Trends Genet.,15:358, 1999; Sharp, P.A., Genes Dev., 15:485, 2001; Hammond, S.M. et al., Nature Rev. Genet., 2:110, 2001; Zamore, P.D., Nat. Struct. Biol., 8:746, 2001）。これらの生物においては、実際に外来の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらに、この技術はノックダウン個体を生産する方法として用いられている。
哺乳動物細胞においても、他の生物と同様に、外来ｄｓＲＮＡを導入することによりＲＮＡｉを誘導することが試みられている。しかしながら、この場合、導入されたｄｓＲＮＡによって、宿主が有しているウィルス感染などに対する防御機序が作動してタンパク質合成が阻害され、ＲＮＡｉが観察されなかった。但し、他の生物において用いられる長い二本鎖ＲＮＡの代わりに、一本鎖の２若しくは３ヌクレオチド（ｎｔ）の３’突出末端を含む全長２１若しくは２２塩基対（ｂｐ）の短いｄｓＲＮＡを哺乳動物細胞に導入することにより、哺乳動物細胞においてもＲＮＡｉを誘導しうるということが報告されている（Elbashir, S.M. et al., Nature, 411:494, 2001; Caplen, N.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:9742, 2001）。
さらに、アンチセンス鎖及びセンス鎖の３’末端に２−ｎｔの突出部分（オーバーハング）を有し、二重鎖部位は１９ｂｐであるｓｉＲＮＡ分子の構造がＲＮＡｉ経路のイニシエーターであり、ブラント末端のｓｉＲＮＡ分子や１９ｂｐよりも短い二重鎖部位を有するｓｉＲＮＡ分子は高濃度にてテストした場合でも効率が低かったことが報告されている（Elbashir et al., EMBO J., 20:6877, 2001）。そこで、１９ｂｐよりも長いｓｉＲＮＡ分子に対しては実験が行われてきたのに対し、前記否定的な結果報告により１９ｂｐよりも短いｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効率に対しては試験が行われてきていないのが現状である。
一方、ＲＮＡｉ分子により媒介される遺伝子発現抑制において予期しない問題点が見出されたが、これは、外部から導入されたｓｉＲＮＡ分子の場合、ＲＮＡｉ機構の飽和を引き起こすということである。このような飽和はｓｉＲＮＡ分子同士の競争を引き起こし、これにより、細胞内ｍｉＲＮＡの効率が低下し、且つ、２種以上のｓｉＲＮＡ分子が導入される場合にｓｉＲＮＡの発現抑制効率が低下するといった問題が発生していた。なお、従来のｓｉＲＮＡ構造の場合、アンチセンス鎖ではなくセンス鎖が働くことがあり、オフターゲット効果の恐れもあった。
そこで、本発明者らは、遺伝子の発現抑制効率が高いつつも、外部若しくは内部に起因する他のＲＮＡｉ機序を阻害しない新規な構造のｓｉＲＮＡ分子を提供するために鋭意努力した結果、新規な構造のｓｉＲＮＡ分子を作製し、このｓｉＲＮＡ分子の遺伝子の発現抑制効果が従来公知の構造のｓｉＲＮＡ分子より高いか等しく、且つ、外部または内部由来の他のＲＮＡｉ機序を阻害せず、そしてセンス鎖によるオフターゲット効果を示さないということを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ＲＮＡｉ機構を飽和させず、従ってｓｉＲＮＡ同士の競争による問題点を解消することができ、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖によるオフターゲット効果に起因する問題点を解消することができ、更に、標的遺伝子の発現抑制効果に優れた新規な構造のｓｉＲＮＡ分子を提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記ｓｉＲＮＡ分子を用いて細胞内標的遺伝子の発現を抑制する方法を提供するところにある。
前記目的を達成するために、本発明は、１９〜２１ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的な配列を有する１５〜１９ｎｔのセンス鎖と、からなる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子（small interfering ＲＮＡ molecule）であって、前記ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の３’末端に突出部分を有することを特徴とするｓｉＲＮＡ分子を提供する。
また、本発明は、前記ｓｉＲＮＡ分子を用いて細胞内標的遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。
本発明の他の特徴及び実現例は下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになるであろう。
ＴＩＧ３ ｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡの導入時における、ｓｉＲＮＡ分子の構造によるＴＩＧ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。 ラミン及びスルビビンｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡの導入時における、ｓｉＲＮＡ分子の構造による各ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 ＴＩＧ３、ラミン及びスルビビンｍＲＮＡをターゲットとする１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効率を示すグラフである。 ＴＩＧ３、ラミン及びスルビビンｍＲＮＡをターゲットとする、アンチセンス鎖の長さが２１ｎｔのｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効率を示すグラフである。 １５＋４Ａ構造及び１７＋２Ａ構造と比べて、１５＋４Ｓ構造及び１７＋２Ｓ構造のｓｉＲＮＡの導入時におけるｍＲＮＡレベルを示すグラフである。 １７＋２Ａ構造及び１５＋４Ａ構造と比べて、１７−２Ａ構造及び１５−４Ａ構造のｓｉＲＮＡの導入時におけるｍＲＮＡレベルを示すグラフである。 インテグリンｍＲＮＡをターゲットとする１７＋２Ａ構造及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効率を示すグラフである。 ＴＩＧ３、ラミン、スルビビン及びインテグリンｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を示すグラフである。 様々な遺伝子に対する１６＋５Ａ構造のｓｉＲＮＡを示す。 図９の各遺伝子に対するｓｉＲＮＡの導入時における各遺伝子ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 １６＋３Ａまたは１６＋５Ａ構造のｓｉＲＮＡの導入時にスルビビン遺伝子及びＮＦ−ｋＢ遺伝子発現抑制の有無を確認するためにウェスタンブロットを行った結果を示す写真である。 ｓｉＲＮＡ処理時に細胞の表現型を観察して示す蛍光写真及びグラフである。 １９＋２及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡを導入後に５’ＲＡＣＥ分析を行った結果を示す写真である。 １９＋２及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡを導入後にセラムヌクレアーゼに対する感受性を測定した結果を示す写真及びグラフである。 ｓｉＣＲＥＢ３と一緒にそれぞれｓｉＴＩＧ、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ及びｓｉＬａｍｉｎを導入したときのｓｉＲＮＡ構造によるＣＲＥＢ３ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 ｓｉＴＩＧ３の導入時における、ｓｉＲＮＡ構造別のｍｉＲ−２１ターゲット部位なしレポーターの標準化されたルシフェラーゼ活性に対するｍｉＲ−２１ターゲット部位付きレポーターの標準化されたルシフェラーゼ活性の比を示すグラフである。 オフターゲット効果実験の設計時におけるセンス−ターゲットｍＲＮＡとアンチセンス−ターゲットｍＲＮＡの例示図である。 オフターゲット効果実験における、ｓｉＲＮＡ構造別ｓｉＲＮＡのセンス鎖によるルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果とアンチセンス鎖によるルシフェラーゼ発現抑制効果を示すグラフである。 １６＋３構造及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡのセンス鎖によるオフターゲット効果の比較結果を示すグラフである。 センス鎖の５’末端を修飾した１９＋２構造のｓｉＲＮＡと１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡのセンス鎖によるオフターゲット効果及び前記構造のｓｉＴＩＧをｓｉＣＲＥＢ３と一緒に導入したときのｓｉＲＮＡ構造によるＣＲＥＢ３ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。
本発明の詳細な説明などに用いられる主な用語の定義は、次の通りである。
この明細書における「ｓｉＲＮＡ」とは、配列特異的に効率的な遺伝子発現抑制を媒介する短い二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を意味する。
「内因性遺伝子」とは、細胞に対して固有なものであり、元々細胞に内在されている遺伝子を意味する。これに対し、「導入遺伝子」とは、ウィルス、細胞内寄生虫など外因性供給源に由来する遺伝子または組み換え手段や他の物理的な手段により導入された遺伝子のことを言う。
「遺伝子」は最広義の意味として扱われる必要があり、標的遺伝子は構造タンパク質または調節タンパク質を暗号化することができる。「調節タンパク質」は、転写因子、ヒートショックタンパク質、またはＤＮＡ／ＲＮＡ複製、転写及び／または翻訳に関与するタンパク質を含む。標的遺伝子はウィルスゲノムに内在されているものであり、動物遺伝子に取り込まれて存在してもよく、染色体外構成要素として存在してもよい。例えば、標的遺伝子はＨＩＶゲノム上の遺伝子であってもよい。この場合、ｓｉＲＮＡ分子は哺乳動物細胞内ＨＩＶ遺伝子の翻訳を不活性化させる上で有効である。
「ヌクレオチド（ｎｔ）」は核酸の基本単位であり、１９ｎｔの核酸とは、１９個のヌクレオチドからなる一本鎖の核酸を意味する。
本発明は、一観点において、１９〜２１ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的な配列を有する１５〜１９ｎｔのセンス鎖と、からなる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子（small interfering ＲＮＡ molecule）であって、前記ｓｉＲＮＡはアンチセンス鎖の５’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の３’末端に突出部分を有することを特徴とするｓｉＲＮＡ分子に関する。
本発明において、前記アンチセンス鎖の長さは１９ｎｔであり、前記センス鎖の長さは１５〜１７ｎｔであり、前記突出部分の長さは２〜４ｎｔであることを特徴としてもよい。本発明において、前記ｓｉＲＮＡ分子は化学的または酵素学的に合成されたものであってもよい。
すなわち、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造は、いわゆる「１７＋２Ａ」、「１６＋３Ａ」及び「１５＋４Ａ」構造を含み、各構造は次の通りである。「１７＋２Ａ」構造とは、１９ｎｔのアンチセンス鎖及びこれに相補的な配列を有する１７ｎｔのセンス鎖からなる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖の５’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の３’末端には２ｎｔの突出部分を有する構造を意味する。また、「１６＋３Ａ」構造とは、１９ｎｔのアンチセンス鎖及びこれに相補的な配列を有する１６ｎｔのセンス鎖からなる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖の５’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の３’末端には３ｎｔの突出部分を有する構造を意味する。最後に、「１５＋４Ａ」構造とは、１９ｎｔのアンチセンス鎖及びこれに相補的な配列を有する１５ｎｔのセンス鎖からなる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖の５’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の３’末端には４ｎｔの突出部分を有する構造を意味する。
本発明に係るｓｉＲＮＡ構造は、効率的に標的遺伝子の発現を抑制しつつもＲＮＡｉ機構を飽和させないという効果がある。また、ｓｉＲＮＡのセンス鎖によるオフターゲット効果を除去する効果がある。
本発明に係るｓｉＲＮＡ分子は、前記センス鎖の長さは１５ｎｔであり、前記アンチセンス鎖の３’末端の突出部分の長さは４ｎｔである構造（１５＋４Ａ構造）であってもよい。１５＋４Ａ構造のｓｉＲＮＡの場合、優れた標的遺伝子の発現抑制効率を示しつつもｓｉＲＮＡ同士の競争をほとんど引き起こさない構造であり、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制に際して副作用を極力抑える。すなわち、ＲＮＡｉ機構を飽和させず、センス鎖によるオフターゲット効果を極力抑える構造である。
さらに、本発明に係るｓｉＲＮＡ分子は、前記センス鎖の長さは１６ｎｔであり、前記アンチセンス鎖の３’突出部分の長さは３ｎｔである構造（１６＋３Ａ構造）であってもよい。１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡの場合でも優れた標的遺伝子の発現抑制効率を示しつつもｓｉＲＮＡ同士の競争をほとんど引き起こさず、センス鎖によるオフターゲット効果を極力抑える。
一方、本発明のｓｉＲＮＡ分子は一般的な方法によって合成されたものであってもよいが、これに制限されることはない。すなわち、本発明において、前記ｓｉＲＮＡ分子は化学的または酵素学的に合成されたものであってもよい。本発明のｓｉＲＮＡ分子は標準的組み換え技術により自然発生的遺伝子から誘導可能であるが、この場合、発現を変化させる標的遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部とヌクレオチド配列レベルにおいて実質的に相補的であることを特徴としてもよい。このとき、「実質的に相補的」とは、合成されたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列が標的遺伝子のｍＲＮＡに対して約８０〜９０％以上、より好ましくは、約９０〜９５％以上、さらに好ましくは、約９５〜９９％以上配列が互いに相補的であるか、あるいは、完全に相補的にハイブリダイゼーションできることを意味する。
本発明は、他の観点において、前記ｓｉＲＮＡ分子を用いて細胞内標的遺伝子の発現を抑制する方法に関する。
本発明において、前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的であることを特徴としてもよい。本発明において、前記標的遺伝子は、内因性遺伝子であってもよく、導入遺伝子であってもよい。
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
特に、下記の実施例においては、標的遺伝子として、ＴＩＧ３、ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）、スルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、カルシニューリン（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）、ＡＴＦ６、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＩＦ−１α−０１、ＨＩＦ−１α−０２及びＮＦ−ｋＢ遺伝子だけを例示しているが、その他の標的遺伝子をターゲットとしてｓｉＲＮＡ分子を製造した場合であっても同じ結果が得られるということは当業界において通常の知識を持った者にとって自明であると言える。
《実施例１：ｓｉＲＮＡ分子の製造：ＴＩＧ３のｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡ》
いくつものヒトの腫瘍細胞株において抑制及び調節をすると知られている腫瘍抑制遺伝子であるＴＩＧ３遺伝子のｍＲＮＡをターゲットとする様々なｓｉＲＮＡ構造変異体を表１に示す方法により製造した。
Figure 2011505868
表１に示すように、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造である「１７＋２Ａ」、「１６＋３Ａ」及び「１５＋４Ａ」構造よりも簡略に表現するために、表１の（ａ）のように従来最も効率的な遺伝子の発現抑制効果を有するｓｉＲＮＡ分子の構造であると知られている１９塩基対（ｂｐ）の二本鎖に各２ｎｔの３’突出部分を有する構造を「１９＋２」構造と命名した。また、表１の（ｂ），（ｃ），（ｅ），（ｇ）及び（ｉ）のようにいずれもブラント末端二本鎖ＲＮＡ構造であって、それぞれ１９ｂｐ，１７ｂｐ，１６ｂｐ，１５ｂｐ及び１３ｂｐの長さを有する構造をそれぞれ１９＋０構造、１７＋０構造、１６＋０構造、１５＋０構造及び１３＋０構造と命名した。さらに、同様に、表１の（ｊ）のように、１９ｎｔのアンチセンス鎖及びこれに相補的な配列を有する１３ｎｔのセンス鎖からなる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子であって、アンチセンス鎖の５’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の３’末端には６ｎｔの突出部分を有する構造を１３＋６Ａ構造と命名した。
《実施例２：ｓｉＲＮＡの遺伝子（ＴＩＧ３）発現抑制効率の分析》
実施例１に従い製造された表１の構造を有するｓｉＲＮＡをLipofectamine 2000トランスフェクション試薬（Invitrogen社製）を用いてＴ９８Ｇ細胞（ヒト神経膠芽腫細胞株（ＡＣＴＣＣＲＬ１６９０）に導入した。前記ｓｉＲＮＡをそれぞれ１００ｎＭ、１０ｎＭ及び１ｎＭにて処理し、ＴＩＧ３遺伝子の発現抑制効率は定量的なリアルタイム逆転写ＰＣＲ（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction）を用いて測定した。細胞はｓｉＲＮＡのトランスフェクションから４８時間後に回収し、細胞溶解物からTri−reagent Kit（Ambion社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した後、このトータルＲＮＡ（１μｇ）をｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用するが、ｃＤＮＡ合成はImprom-II（商標）Reverse Transcription System（Promega社製）を用いて製造者のプロトコールに従い実行した。ｃＤＮＡ反応物の分液（１／２０）がRotor-Gene 3000（Corbett Research社製）を用いて定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析された。データはRotor-Gene ６ソフトウェア（Corbett Research社製）を用いて分析され、使用したプライマー配列は次の通りである。
TIG3-RT-PCR用プライマー対
TIG3-forward（配列番号: 13）: 5’- AGA TTT TCC GCC TTG GCT AT-3’
TIG3-reverse（配列番号: 14）: 5’- TTT CAC CTC TGC ACT GTT GC-3’
その結果、図１に示すように、従来最も効率的な構造であると知られている１９＋２構造に比べて、１９＋０、１７＋０、１５＋０及び１３＋０構造のブラント末端の二本鎖ｓｉＲＮＡ処理群においてＴＩＧ３ ｍＲＮＡレベルが高く現れ、ＴＩＧ３遺伝子の抑制効果が低いことが示された。特に、１３＋０構造の場合、ほとんど抑制効果がないことが示され、１５＋０構造の場合でもｓｉＲＮＡを１００ｎＭ及び１０ｎＭにてそれぞれ処理した場合に４０％までＴＩＧ３ ｍＲＮＡレベルを減少させたが、１ｎＭの濃度にて処理した場合には抑制効果が極めて低いことが示された。
これに対し、本発明に係る１７＋２Ａ構造及び１５＋４Ａ構造のｓｉＲＮＡの場合、二本鎖部位が１９ｎｔよりも短いにも関わらず、効率性が最も高い構造であると知られている１９＋２構造のｓｉＲＮＡとほとんど同様のＴＩＧ３ ｍＲＮＡレベルが観察された。しかしながら、１３＋６Ａ構造においてはｍＲＮＡ量の減少幅が少ないことが観察された。
前記実験結果は、従来より、１９ｎｔよりも短いｓｉＲＮＡ構造は、遺伝子の発現抑制効果が従来公知の１９＋２構造に比べて低いことが知られているのに対し、二本鎖部位が１７ｎｔ、１５ｎｔと短いにも関わらず、アンチセンス鎖の３’にそれぞれ２ｎｔ及び４ｎｔの突出部分を有し、アンチセンス鎖の５’側の末端はブラント末端にする場合に遺伝子の発現抑制効率が従来最も高いと知られている１９＋２構造とほとんど同じ発現抑制効率を示すことを意味する。但し、１３＋６Ａ構造においては遺伝子の発現抑制効率が高くないことが示されたが、好適なｓｉＲＮＡ構造は１７＋２Ａ、１６＋３Ａ及び１５＋４Ａ構造であることが分かった。
以下、他のｍＲＮＡをターゲットとしてさらに実験を行うことにより、前記結果がＴＩＧ３遺伝子に限って現れる結果であるかどうかを調べた。
《実施例３：ｓｉＲＮＡの遺伝子（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ及びＳｕｒｖｉｖｉｎ）発現抑制効率の分析》
ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）及びスルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）ｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡを、表２及び３に示すように、１９＋２構造、１９＋０構造、１７＋０構造、１７＋２Ａ構造及び１５＋４Ａ構造にして準備した。表２は、ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）ｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡ分子であり、表３は、スルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）ｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡ分子を示す。
Figure 2011505868
Figure 2011505868
前記製造されたｓｉＲＮＡをそれぞれ１００ｎＭ、１０ｎＭ及び１ｎＭの濃度にてLipofectamine 2000トランスフェクション試薬（Invitrogen社製）を用いてＨｅＬａ細胞（ＡＣＴＣＣＣＬ−２）に導入し、やはり実施例２の方法と同様にして定量的なリアルタイム逆転写ＰＣＲ（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction）を用いてｍＲＮＡレベルを測定した。
LaminA/C RT-PCR用プライマー対
Lamin-forward（配列番号: 29）: 5’-CCG AGT CTG AAG AGG TGG TC-3’
Lamin-reverse（配列番号: 30）: 5’-AGG TCA CCC TCC TTC TTG GT-3
Survivin RT-PCR用プライマー対
Survivin-forward（配列番号: 31）: 5’-GCA CCA CTT CCA GGG TTT AT-3’
Survivin-reverse（配列番号: 32）: 5’-CTC TGG TGC CAC TTT CAA GA-3’
その結果、図２に示すように、１７＋２Ａ構造のｓｉＲＮＡは、Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ及びＳｕｒｖｉｖｉｎ ｍＲＮＡの量をテストした濃度においていずれもそのレベルを極めて効率的に減少させることが観察され、これは、１９＋２構造よりも効率性に一層優れていることを意味する。１５＋４Ａ構造の場合、１００ｎＭ及び１０ｎＭにおいては１９＋２構造と同じ発現抑制効率を示し、１ｎＭにおいては１９＋２や１７＋２Ａ構造よりも発現抑制効率が僅かに減少されたことが示された。
この結果から、他の遺伝子をターゲットとしてｓｉＲＮＡを製造した場合でも、実施例２と同様に、本発明に係る１７＋２Ａ構造及び１５＋４Ａ構造が１９＋２構造の遺伝子の発現抑制効果とほとんど同じ発現抑制効率を有するということを確認することができ、さらに、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が特定の遺伝子に制限されるものではなく、一般的に適用可能な構造であることが分かった。
《実施例４：ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効率の分析：１６＋３Ａ構造実験》
ＴＩＧ３、ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）及びスルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）ｍＲＮＡをターゲットとする１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡ分子に対して１ｎＭ及び１０ｎＭの濃度にて実施例２及び３の方法と同様にして実験を行い、各ｍＲＮＡのレベルを測定した。ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）及びスルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）ｍＲＮＡをターゲットとする１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡを製造し、その配列は次の通りである。
LaminA/C 16+3A 構造
アンチセンス：5’ UGUUCUUCUGGAAGUCCAG（配列番号 17）
センス ：3’ ACAAGAAGACCUUCAG （配列番号 33）
Survivin 16+3A 構造
アンチセンス：5’ UGAAAAUGUUGAUCUCCUU（配列番号 24）
センス ：3’ ACUUUUACAACUAGAG （配列番号 34）
その結果、図３の（ａ），（ｂ）及び（ｃ）に示すように、ＴＩＧ３、ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）及びスルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）ｍＲＮＡのレベルを測定した結果、いずれも１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡを導入した場合、１９＋２構造または１７＋２Ａ構造とほとんど同じレベルのｍＲＮＡが観察された。前記実験結果は、１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡの場合、１５＋４Ａ構造よりも１７＋２Ａ構造の方に一層近い遺伝子の発現抑制効率を有することを示唆する。
《実施例５：ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効率の分析：アンチセンス鎖の長さが２１ｎｔである場合》
ＴＩＧ３、ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）及びスルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）ｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡの構造をアンチセンス鎖の長さが２１ｎｔになるようにして準備した。製造されたｓｉＲＮＡ構造は、表４から６に示す通りである。
Figure 2011505868
Figure 2011505868
Figure 2011505868
前記製造されたｓｉＲＮＡを１０ｎＭ及び１ｎＭの濃度にてLipofectamine 2000トランスフェクション試薬（Invitrogen社製）を用いてＨｅＬａ細胞（ＡＣＴＣＣＣＬ−２）に導入し、やはり実施例２及び３の方法と同様にして定量的なリアルタイム逆転写ＰＣＲ（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction）を用いてｍＲＮＡレベルを測定した。
先ず、表４のｓｉＲＮＡを細胞内に導入してｍＲＮＡレベルを測定した結果、図４の（ａ）に示すように、ＴＩＧ３ ｍＲＮＡは、１９＋２Ａ構造、１７＋４Ａ構造、１６＋５Ａ構造及び１５＋６Ａ構造のｓｉＲＮＡを１０ｎＭの濃度にて導入した場合、従来の１９＋２構造とほとんど同じ遺伝子発現抑制効率を示し、１４＋７Ａ構造及び１３＋８Ａ構造において次第に遺伝子発現抑制効率が減少することが示された。なお、１ｎＭの濃度にて導入した場合、１４＋７Ａ及び１３＋８Ａ構造において遺伝子発現抑制効率が大幅に減少し始めた。
前記実験結果は、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の長さを２１ｎｔまで拡張した場合でも、アンチセンス鎖の５’方向の末端をブラント末端にし、アンチセンス鎖の３’末端に突出部分を持たせる場合、優れた遺伝子の発現抑制効率を示すことを示唆する。但し、１４＋７Ａ構造や１３＋８Ａ構造の場合、発現抑制効率が減少することが示されるため、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の長さは１５〜１９ｎｔとすることが好適であることが分かった。
さらに、図４の（ｂ）及び（ｃ）に示すように、ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）及びスルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）ｍＲＮＡのレベルを測定した結果、表５のｓｉＲＮＡを細胞内に導入した場合、１５＋６Ａ構造において遺伝子の発現抑制効率が減少することが示されたが、１９＋２Ａ構造、１７＋４Ａ構造及び１６＋５Ａ構造において優れた発現抑制効率を示した。さらに、表６のｓｉＲＮＡを細胞内に導入した場合、１５＋６Ａ構造を１ｎＭの濃度にて処理した場合には遺伝子の発現抑制効率が僅かに減少することが示されたが、１５＋６Ａ構造のｓｉＲＮＡを１０ｎＭの濃度にて処理した場合と１９＋２Ａ構造、１７＋４Ａ構造及び１６＋５Ａ構造の場合、遺伝子の発現抑制効率が従来の１９＋２構造とほとんど同じであることが分かった。
前記実験結果は、前記ＴＩＧ３遺伝子だけではなく、他の遺伝子をターゲットとしてｓｉＲＮＡを製造した場合でも、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造である１９＋２Ａ、１８＋３Ａ、１７＋４Ａ及び１６＋５Ａの構造が従来の１９＋２構造の遺伝子の発現抑制効果とほとんど同じ発現抑制効率を有することを示唆する。これより、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が特定の遺伝子に制限されるものではなく、一般的に適用可能な構造であることを確認することができた。
《実施例６：ブラント末端及び突出部分の方向性Ｉ》
本発明に係るｓｉＲＮＡ構造においてブラント末端及び突出部分の方向性が遺伝子の発現抑制効率に及ぼす効果を調べるために、表７及び表８に示す構造のｓｉＲＮＡ分子を製造して実施例２（ＴＩＧ３）及び３（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）と同じ方法により実験を行った。
Figure 2011505868
Figure 2011505868
その結果、図５の（ａ）に示すように、ＴＩＧｍＲＮＡをターゲットとする表７のｓｉＲＮＡ分子を導入した場合のｍＲＮＡレベルを調べると、表７の（ｂ）に示す１５＋４Ａ構造に比べて、表７の（ｃ）１５＋４Ｓ構造の場合にｍＲＮＡレベルが極めて高く現れた。また、図５の（ｂ）に示すように、ラミンｍＲＮＡをターゲットとする表８のｓｉＲＮＡ分子を導入後にラミンｍＲＮＡのレベルを観察した結果、１ｎＭの濃度にてｓｉＲＮＡを導入したときに、１７＋２Ａ構造に比べて、１７＋２Ｓ構造のｍＲＮＡレベルがやや高く現れた。
前記実験結果は、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造とは異なり、アンチセンス鎖の３’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖が１５〜１７ｎｔであり、センス鎖が１９ｎｔになるようにｓｉＲＮＡ構造を構成する場合に遺伝子の発現抑制効率が減少されることを示唆する。すなわち、ｓｉＲＮＡ構造において、アンチセンス鎖の５’方向の末端をブラント末端にし、アンチセンス鎖の３’末端に突出部分を有する場合の方が一層高い遺伝子発現効率を示すことが分かった。但し、これは、アンチセンス鎖の長さの変化による影響である可能性があるため、下記の実験をさらに行った。
《実施例７：ブラント末端及び突出部分の方向性ＩＩ》
表９及び表１０に示す構造のｓｉＲＮＡ分子を製造して実施例３（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）及び実施例２（ＴＩＧ３）の方法と同様にして実験を行い、ｍＲＮＡレベルを測定した。
Figure 2011505868
Figure 2011505868
その結果、図６に示すように、１７＋２Ａ及び１７−２Ａ構造を互いに比較したとき、全ての濃度において１７−２Ａ構造のラミンｍＲＮＡレベルが高く現れた（図６の（ａ））。１５＋４Ａ及び１５−４Ａ構造を比較した場合でも、１５−４Ａ構造のＴＩＧ３ ｍＲＮＡレベルが高く現れた（図６の（ｂ））。特に、１５−４Ａ構造の場合、濃度を１ｎＭにて処理した場合、ｍＲＮＡレベルは極めて高く現れた。
前記実験結果は、アンチセンス鎖の５’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の３’末端に突出部分がある場合、従来最も効率的な構造であると知られている１９＋２構造とほとんど同じ遺伝子の発現抑制効率を示すが、アンチセンス鎖の３’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の５’末端に突出部分がある場合にはその効率が低いことを示す。
この結果は、実施例６の結果と共に、ｓｉＲＮＡ構造のブラント末端と突出部分の方向性がｓｉＲＮＡ構造の効率に影響することを示唆する。
《実施例８：Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効率の分析及びＩＣ５０値の比較》
インテグリン遺伝子に対して表１１に示す構造のｓｉＲＮＡを製造した後、前記実施例２の方法と同様にして実験を行い、次いで、ｍＲＮＡレベルを測定し、これと前記ＴＩＧ３、Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子に対する実験結果から得られたＩＣ５０値とを比較した。
Figure 2011505868
 Integrin RT-PCR用プライマー対
Integrin-forward（配列番号: 45）: 5’-CGT ATC TGC GGG ATG AAT CT-3’
Integrin-reverse（配列番号: 46）: 5’ GGG TTG CAA GCC TGT TGT AT-3’
先ず、インテグリンｍＲＮＡのレベルを測定した結果、図７に示すように、１７＋２Ａと１６＋３Ａ構造の両方とも１９＋２構造のｓｉＲＮＡを導入した場合とほとんど同じレベルのｍＲＮＡが測定された。
一方、ＩＣ５０値を測定した結果、図８に示すように、１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡのＩＣ５０値は１９＋２構造のｓｉＲＮＡとほとんど同じレベルであるか（ｓｉＴＩＧ３及びｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ）、あるいは、やや増加されたことが（ｓｉＬａｍｉｎ及びｓｉＩｎｔｅｇｒｉｎ）分かった。
また、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖だけでもＲＮＡｉ媒介の遺伝子発現抑制を行うことができるかどうかを確認するために、さらに、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖だけを導入して遺伝子の発現抑制効率を測定した。すなわち、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎアンチセンス鎖を上記の方法と同様にして導入してスルビビンｍＲＮＡレベルを測定した結果、図８の（Ｂ）に示すように、アンチセンス鎖だけを導入した場合には遺伝子の発現抑制効率が極めて減少することが確認できた。
前記実験結果は、本発明に係るｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効率がｄｓＲＮＡ媒介ＲＮＡｉの構造によるものであることを示唆する。
《実施例９：１６＋５Ａ構造のｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効率の分析》
１６＋３Ａ構造のアンチセンス鎖の３’末端にｄＴｄＴを追加した形の１６＋５Ａ構造を図９に示すように作製して、１９＋２構造と１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡ活性を比較した。このとき、従来のＴＩＧ３、Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ及びＩｎｔｅｇｒｉｎ遺伝子だけではなく、様々な遺伝子に対するｓｉＲＮＡ構造を作製して活性を測定して従来の１９＋２構造と比較することにより、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が一般的に適用可能なものであるかどうかの実験をさらに行った。前記ｓｉＲＮＡの活性は、各遺伝子のｍＲＮＡレベルを、実施例２に示すように、定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うことにより測定した。ＴＩＧ３、ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ）、スルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）遺伝子に対するプライマー対は以上の実施例に開示されており、その他の遺伝子に対するプライマー対は、次の通りである。
Calcineurin RT-PCR用プライマー対
Calcineurin-forward （配列番号: 47）: 5’-GCA ACC ATG AAT GCA GAC AC-3’
Calcineurin -reverse（配列番号: 48）: 5’-TGG TGA AAG TCC ACC ATG AA-3’
ATF6 RT-PCR用プライマー対
ATF6-forward（配列番号: 49）: 5’-GCC TTT ATT GCT TCC AGC AG-3’
ATF6-reverse（配列番号: 50）: 5’-TGA GAC AGC AAA ACC GTC TG-3’
DBP RT-PCR用プライマー対
DBP-forward（配列番号: 51）: 5’-GTA GAC CTG GAC GCC TTC CT-3’
DBP-reverse（配列番号: 52）: 5’-CGG GTT CAA AGG TCA TCA AC-3’
TEF RT-PCR用プライマー対
TEF-forward（配列番号: 53）: 5’-CCC CAG CCT ATG ATC AAA AA-3’
TEF-reverse（配列番号: 54）: 5’-CCG GAT GGT GAT CTG ATT CT-3’
HIF1α RT-PCR用プライマー対（HIF1α-01 & HIF1α-02）
HIF1α-forward（配列番号: 55）: 5’-CCA GCA ACA GAA AGT CGT CA-3’
HIF1α-reverse（配列番号: 56）: 5’-GGC TAT ACT TGG GCA TGG AA-3’
NF-kB RT-PCR用プライマー対
NF-kB-forward（配列番号: 57）: 5’-CCT GGA GCA GGC TAT CAG TC-3’
NF-kB-reverse（配列番号: 58）: 5’-CAC TGT CAC CTG GAA GCA GA-3’
その結果、図１０の（ａ）から（ｉ）に示すように、各遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定した結果、いずれも１６＋５Ａ構造のｓｉＲＮＡを導入した場合でも、１９＋２構造とほとんど同じレベルにてｍＲＮＡが測定された。前記実験結果は、１６＋５Ａ構造のｓｉＲＮＡもまた優れた遺伝子の発現抑制効率を有することを示唆する。
《実施例１０：ウェスタンブロット法によるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効率の分析》
本発明に係るｓｉＲＮＡ構造の遺伝子の発現抑制効率を確認するために、スルビビン遺伝子及びＮＦ−ｋＢ遺伝子に対してウェスタンブロットを行った。先ず、１０ｎＭの１９＋２及び１６＋３Ａ構造のｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ及び１９＋２及び１６＋５Ａ構造のｓｉ ＮＦ−ｋＢをそれぞれLipofectamine 2000トランスフェクション試薬（Invitrogen社製）を用いてＨｅＬａ細胞（ＡＣＴＣＣＣＬ−２）に導入した後、４８時間後に１５０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５％ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡバッファを用いて溶解した。
その後、得られたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上においてTris-Glycine ＳＤＳ running bufferにより電気泳動した後、ニトロセルロース膜にトランスファーした。その後、５％ミルク粉を含むＴＢＳバッファによりブロッキングした後、それぞれスルビビンタンパク質及びＮＦ−ｋＢタンパク質に対する抗体（Cell Signaling社製）を入れて反応させ、ＥＣＬ検出システム（Amersham Biosciences社製）により現像し、Ｘ−ｒａｙフィルム（Kodak社製）により露出して結果を確認した。
その結果、図１１の（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、１６＋３Ａ及び１６＋５Ａ構造のｓｉＲＮＡは従来の１９＋２構造とほとんど同じレベルを示し、対照群（ｓｉＲＮＡ未処理群）に比べて各タンパク質の発現を顕著に抑制することが確認できた。
《実施例１１：ｓｉＲＮＡ処理時の表現型分析》
スルビビンはアポトーシスタンパク質のインヒビターであり、細胞生存及び適切な細胞周期の進行のために必要なタンパク質である。また、スルビビンの過発現が様々なガン細胞において観察されているが、この機能をブロッキングする場合に細胞の増殖が抑制され、様々な細胞株において倍数体の表現型が誘導されることが報告されている。このため、スルビビン遺伝子に対するｓｉＲＮＡを１９＋２構造と本発明に係る構造である１６＋３Ａ構造にして表現型変化を観察した。
先ず、１９＋２及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞にLipofectamine 2000トランスフェクション試薬を用いて導入した後、４８時間後に３．７％ホルムアルデヒドにより固定し、固定された細胞をジアミジノフェニルインドール（diamidinophenyl indole；ＤＡＰＩ）溶液（２μｇ）により染色して蛍光顕微鏡を用いて表現型を観察した。
その結果、図１２の（Ａ）に示すように、ｓｉＲＮＡの処理なしにトランスフェクション反応物だけを処理した対照群（ｍｏｃｋ）に比べて、１９＋２構造のｓｉＲＮＡの処理群は細胞のサイズが大きくなり、倍数体細胞の数が増加されたことが示され、１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡの処理群もまた倍数体の表現型が誘導されたことが観察された。
一方、細胞群のうち倍数体細胞の割合を定量化するために、フローサイトメトリーを行った。すなわち、１９＋２及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞にLipofectamine 2000トランスフェクション試薬を用いて導入した後、４８時間後に細胞を回収してリン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline：ＰＢＳ）中において２％ＦＢＳにて洗浄した後、７０％エタノールに一晩夜固定した。その後、細胞を５０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａを含む２５０μＬのＰＢＳに懸濁した後、３７℃で３０分間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）２５μＬ／ｍＬを処理した。ヨウ化プロピジウムにより染色された細胞はFACSCalibur System（Becton Dickinson社製）により分析した。
その結果、図１２の（Ｂ）に示すように、１９＋２及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡ処理群は両方とも同じ割合にて倍数体細胞を誘導することが観察された。
この結果は、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造である１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡが１９＋２構造のｓｉＲＮＡと同じレベルにてｍＲＮＡ発現を抑制するだけではなく、類似する表現型変化を誘導することを示唆する。
《実施例１２：遺伝子発現抑制機序の分析》
本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が従来の１９＋２構造のｓｉＲＮＡと同じＲＮＡｉ機序により遺伝子発現を抑制するかどうかを確認するために、次の実験を行った。すなわち、１９＋２及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡのターゲットｍＲＮＡにおける切断部位を分析するために５’−ＲＡＣＥ分析を行った。
先ず、ｓｉＲＮＡをLipofectamine 2000トランスフェクション試薬を用いてＨｅＬａ細胞に導入した後、２４時間後にTri-reagent kit（Ambion社製）によりトータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡ（２μｇ）は前処理なしに０．２５μｇのGeneRacer ＲＮＡ oligoをライゲーションした後、GeneRacer ＲＮＡ oligoのライゲーションされたトータルＲＮＡをGeneRacer oligo ｄＴ及びSuperScript（商標） III ＲＴkit（Invitrogen社製）を用いて逆転写させた。GeneRacer ５’プライマー及び遺伝子特異的な３’プライマーを用いて３５サイクルのＰＣＲを行った後、GeneRacer ５’ネスティッドプライマー及び遺伝子特異的な３’ネスティッドプライマーを用いて２５サイクルのネスティッドＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はＴ＆Ａ vector（ＲＢＣ社製）によりクローンした後、シーケンシングした。
TIG3 Gene specific 3’primer:
5’-GGGGCAGATGGCTGTTTATTGATCC-3’（配列番号: 59）
TIG3 Gene specific 3’nested primer:
5’-ACTTTTGCCAGCGAGAGAGGGAAAC-3’（配列番号: 60）
Lamin Gene specific 3’primer:
5’-CCAGTGAGTCCTCCAGGTCTCGAAG-3’（配列番号: 61）
Lamin Gene specific 3’ nested primer:
5’-CCTGGCATTGTCCAGCTTGGCAGA-3’ （配列番号: 62）
その結果、図１３に示すように、ＴＩＧ３とＬａｍｉｎ ｍＲＮＡは両方ともｓｉＴＩＧ及びｓｉＬａｍｉｎのアンチセンス鎖の５’末端から１０ｎｔの箇所において切断されることが確認され、１９＋２及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡによる違いはないことが確認された。
前記実験結果は、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が従来の１９＋２構造のｓｉＲＮＡと同じＲＮＡｉ機序によって遺伝子発現を抑制することを示唆する。
《実施例１３：遺伝子発現抑制機序の分析》
本発明に係るｓｉＲＮＡ構造は、従来の１９＋２構造に比べて二本鎖をなす部分が短く、末端に長い突出部分（オーバーハング）を有するため、セラムヌクレアーゼに対する感受性が１９＋２構造よりも大きいかどうかを確認するために次の実験を行った。
先ず、１９＋２構造のｓｉＴＩＧ３または１６＋３Ａ構造のｓｉＴＩＧ３の０．１ｎｍｏｌｅを４０μＬの１０％ＦＢＳ溶液中においてインキュベートした。各サンプルを指定された時間及び個所において７μＬ取った後、直ちに−８０℃で冷却した。その後、各サンプルの３μＬ分液を１５％（ｗ／ｖ）の非変性ポリアクリルアミドゲル上において分離した後、ＥｔＢｒにより染色し、ＵＶ透照により可視化した。
その結果、図１４に示すように、１９＋２及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡは両方ともほとんど同じ分解関数を示すことが示された。この実験結果は、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造の安定性が従来の１９＋２構造のｓｉＲＮＡとほとんど同じであるということを示唆する。
《実施例１４：ＲＮＡｉ機構の飽和度分析Ｉ》
実施例１及び３に従い製造されたｓｉＲＮＡ、すなわち、ＴＩＧ３ ｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡ（以下、「ｓｉＴＩＧ３」と称する。）、スルビビンｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡ（以下、「ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ」と称する。）及びラミンＡ／ＣｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡ（以下、「ｓｉＬａｍｉｎ」と称する。）のうち、１９＋２、１７＋２Ａ及び１５＋４Ａ構造のｓｉＲＮＡをそれぞれＨｅＬａ細胞にＣＲＥＢ３ ｍＲＮＡをターゲットとする他の１９＋２構造のｓｉＲＮＡ（以下、「ｓｉＣＲＥＢ３」と称する。）と一緒に導入した後、ｍＲＮＡレベルを測定した。ｓｉＲＮＡの導入及びｍＲＮＡの量測定は実施例２及び３の方法と同様にして行った。
ＣＲＥＢ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡ
siCREB3 antisense: 5’-GGCUCAGACUGUGUACUCC（dTdT）-3’（配列番号: 63）
siCREB3 sense: 5’-GGAGUACACAGUCUGAGCC（dTdT）-3’ （配列番号: 64）
その結果、図１５に示すように、ｓｉＲＮＡ未導入の陰性対照群と比較して、１９＋２構造のｓｉＣＲＥＢ３を処理した陽性対照群においてＣＲＥＢ３ ｍＲＮＡレベルが約２０％まで減少した。これに対し、１９＋２構造のｓｉＴＩＧ３、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ及びｓｉＬａｍｉｎを１９＋２構造のｓｉＣＲＥＢ３と一緒に導入した場合、ＣＲＥＢ３ ｍＲＮＡのレベルは陰性対照群のｍＲＮＡレベルに比べてそれぞれ６６％、５２％及び４２％減少した。
これに対し、１７＋２Ａ及び１５＋４Ａ構造のｓｉＴＩＧ３、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ及びｓｉＬａｍｉｎをそれぞれ１９＋２構造のｓｉＣＲＥＢ３と一緒に導入した場合には、陰性対照群のｍＲＮＡレベルに比べていずれも４０％以下に減少した。特に、１５＋４Ａ構造のｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ及びｓｉＬａｍｉｎと１７＋２Ａ構造のｓｉＬａｍｉｎの場合、ｍＲＮＡレベルは陽性対照群に比べてほとんど増加しなかった。
前記実験結果は、１９＋２構造のｓｉＲＮＡは他のｓｉＲＮＡと一緒に細胞内に導入される場合、互いに競争して標的遺伝子の発現抑制効果が減少されるものの、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造は他のｓｉＲＮＡの抑制効果を減少させるレベルが極めて少ないことを示唆する。この結果から、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造は、他のｓｉＲＮＡとほとんど競争せず、細胞内ＲＮＡｉ機構を飽和させないことが分かる。
《実施例１５：ＲＮＡｉ機構の飽和度分析ＩＩ》
本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が内部ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）活性を阻害しないかどうかを調べるために、実施例７において使用したｓｉＴＩＧ３に対して下記のようにして実験を行った。
先ず、ルシフェラーゼ遺伝子発現を抑制するｍｉＲ−２１活性を評価するために、ルシフェラーゼ遺伝子の３’非翻訳部位にｍｉＲ−２１ターゲット配列を含むルシフェラーゼレポーターを使用した。このようなルシフェラーゼレポータープラスミド（Ambion社製）をＨｅＬａ細胞内に導入したとき、ルシフェラーゼ活性はｍｉＲ−２１ターゲット配列を含まないルシフェラーゼレポーター対照群を導入した細胞に比べて相対的に極めて大幅に減少する。
そこで、ｍｉＲ−２１結合部位を有するｐＭＩＲ−ｌｕｃ基盤のホタルルシフェラーゼレポータープラスミド（Ambion社製）、導入効率の標準化のためのｐＲＬ−ＳＶ４０ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター（Ambion社製）及び１０ｎＭのｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＩＧ３）をＨｅＬａ細胞に導入し、相対的に標準化されたルシフェラーゼ活性（ｍｉＲ−２１ターゲット部位なしレポーターの標準化されたルシフェラーゼ活性に対するｍｉＲ−２１ターゲット部位付きレポーターの標準化されたルシフェラーゼ活性の比）を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ活性により標準化される。対照群（ｍｏｃｋ）は、ｓｉＲＮＡ競合物を導入せず、ｐＭＩＲ−ｌｕｃ基盤のホタルルシフェラーゼレポータープラスミド及びｐＲＬ−ＳＶ４０ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターだけを導入した。そして、細胞を回収して受動的溶解バッファ（二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム；Promega社製）により溶解した後、Victor3 plate reader（Perkin Elmer社製）を用いて２０μＬの各細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を測定した。
その結果、図１６に示すように、１９＋２構造のｓｉＴＩＧ３は相対的なルシフェラーゼ活性比が０．１５であることが示されたが、１７＋２Ａ構造及び１５＋４Ａ構造のｓｉＴＩＧ３の場合、活性比が０．１及び０．０８であり、０．１２よりも低いことが示された。
前記実験結果は、外部から導入された１９＋２構造のｓｉＲＮＡがｍｉＲＮＡにより媒介されるルシフェラーゼ遺伝子発現抑制活性を阻害するとはいえ、１７＋２Ａ及び１５＋４Ａ構造のｓｉＲＮＡはｍｉＲＮＡにより媒介されるルシフェラーゼ遺伝子発現抑制活性を阻害するレベルが低いことを示唆する。特に、１５＋４Ａ構造のｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡ未導入の対照群に比べて相対的なルシフェラーゼ活性比が僅かに高く現れ、内部ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）活性を阻害するレベルが低い構造であることが分かった。
このような結果は、実施例１４の結果と共に、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が細胞内ＲＮＡｉ機構をほとんど飽和しないことを示唆する。
《実施例１６：オフターゲット効果の分析》
１６−１：１９＋２構造及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡ比較
本発明に係るｓｉＲＮＡ構造のセンス鎖によるオフターゲット効果を分析するために、次のようにして実験を行った。ここで、「オフターゲット効果」とは、元々ｓｉＲＮＡはアンチセンス鎖と相補的な配列を有するｍＲＮＡの分解を誘導して当該ｍＲＮＡの遺伝子発現を抑制する効果を得るために使用するものであるにも関わらず、ｓｉＲＮＡのセンス鎖により他のｍＲＮＡの分解が発生する場合、センス鎖により発生するこのような予期しない他のｍＲＮＡの分解または当該遺伝子の発現抑制効果を意味する。
ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクター（pMIR-REPORT（商標）−Luciferase;Ambion社製）を２群に分けた後、１つの実験群（Ａ）にはルシフェラーゼ遺伝子の後ろに配列番号６５のＤＮＡ断片を挿入し、残りの実験群（Ｂ）には配列番号６６のＤＮＡ断片を挿入してベクターを準備した。
配列番号 65: 5’-TGAAAATGTTGATCTCCTT
配列番号 66: 5’-AAGGAGATCAACATTTTCA
実験群Ａのベクターを導入したＨｅＬａ細胞（ＡＣＴＣＣＣＬ−２）においては、図１７の（ａ）に示すように、スルビビンｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ）のセンス鎖と相補的な断片（配列番号６７）を含むｍＲＮＡ（sense-target）が発現され、実験群Ｂのベクターを導入したＨｅＬａ細胞においては、図１７の（ｂ）に示すように、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎのアンチセンス鎖と相補的な断片（配列番号６８）を含むｍＲＮＡ（antisense-target）が発現された。
配列番号 67: 5’-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU-3’
配列番号 68: 5’-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3’
そこで、前記各ベクター２００ｎｇをＨｅＬａ細胞にLipofectamine 2000トランスフェクション試薬（Invitrogen社製）を用いて１９＋２構造及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡと一緒に導入し、トランスフェクションの２４時間後に二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社製）を用いてVictor3 plate reader（Perkin Elmer社製）によりルシフェラーゼ活性を測定してセンス鎖とアンチセンス鎖の活性を測定した。
その結果、図１８に示すように、１９＋２構造のｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎは実験群Ａ及びＢの両方においてルシフェラーゼ活性が低く現れた。これに対し、１６＋３Ａ構造の場合、実験群Ｂにおいてルシフェラーゼ活性が１９＋２構造と同様に低く現れたが、実験群Ａにおいてはルシフェラーゼ活性が高く現れた。これは、１６＋３Ａ構造のアンチセンス鎖と１９＋２構造のアンチセンス鎖のルシフェラーゼ活性発現抑制効率はほとんど同様であるが、１６＋３Ａのセンス鎖が１９＋２のセンス鎖よりも活性が少ないことを示す。
前記結果は、従来の１９＋２構造の場合、センス鎖によるオフターゲット効果が発生するものの、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造である１６＋３Ａ構造の場合、センス鎖によるオフターゲット効果が発生しないことを示唆する。
１６−２：１６＋３構造及び１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡ比較
本発明に係るｓｉＲＮＡ構造は非対称構造であるが、対称構造のｓｉＲＮＡと比較して、センス鎖によるオフターゲット効果を分析した。実験方法は、上記の方法と同様にして行った。使用したｓｉＲＮＡ構造は、表１２及び１３に示す通りである。
Figure 2011505868
Figure 2011505868
その結果、図１９に示すように、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造は、対称的な１６＋３ｓｉＲＮＡ構造に比べてセンス鎖により媒介されるオフターゲット効果が顕著に低いことが確認された。
１６−３：センス鎖の５’末端を修飾したｓｉＲＮＡとの比較
最近の研究によれば、化学的修飾を通じてのｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端のリン酸化の抑制は、センス鎖媒介オフターゲット効果の低減をもたらすことが報告されている。そこで、図２０の（Ａ）に示すように、１９＋２構造のｓｉＴＩＧ３の５’末端にアミン修飾を行い、その結果を調べた。実験方法は、上記と同様である。
その結果、図２０の（Ｂ）に示すように、センス鎖の５’末端を修飾した１９＋２構造のｓｉＲＮＡも、本発明に係る１６＋３Ａ構造のｓｉＲＮＡよりは高いものの、未修飾の１９＋２構造のｓｉＲＮＡに比べてはセンス鎖媒介遺伝子の発現抑制効果が減少することが確認された。しかしながら、図２０の（Ｃ）に示すように、１９＋２構造のｓｉＣＲＥＢ３と一緒に細胞内に導入した場合、依然として未修飾の１９＋２構造と同様に強い競合物としての潜在力を有しているという問題点があることが判明された。
前記実験結果は、要するに、本発明に係るｓｉＲＮＡ構造がＲＮＡｉを飽和させないつつも、センス鎖によるオフターゲット効果を解消しうる最も効果的なｓｉＲＮＡ構造であることを示唆する。
産業上利用の可能性
以上述べたように、本発明に係るｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖によるオフターゲット効果が発生することなく、しかも、外部または内部由来の他のＲＮＡｉ機序を阻害することなく優れた標的遺伝子の発現抑制効率を示すことから、従来のｓｉＲＮＡ分子の代わりに遺伝子治療などｓｉＲＮＡを基盤とする遺伝子発現抑制法に用いて好適である。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims (6)

  1. １９〜２１ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的な配列を有する１５〜１９ｎｔのセンス鎖と、からなる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子であって、アンチセンス鎖の５’方向の末端がブラント末端であり、アンチセンス鎖の３’末端に突出部分を有することを特徴とするｓｉＲＮＡ分子。
  2. 前記アンチセンス鎖の長さは１９ｎｔであり、前記センス鎖の長さは１５〜１７ｎｔであり、前記突出部分の長さは２〜４ｎｔであることを特徴とする請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  3. 前記センス鎖の長さは１６ｎｔであり、前記突出部分の長さは３ｎｔであることを特徴とする請求項２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  4. 前記センス鎖の長さは１５ｎｔであり、前記突出部分の長さは４ｎｔであることを特徴とする請求項２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  5. 請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の前記ｓｉＲＮＡ分子を用いて細胞内標的遺伝子の発現を抑制する方法。
  6. 前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
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