JP4054844B2 - 副作用のないRNAi医薬 - Google Patents
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Description
RNAi法は、遺伝子の発現制御による遺伝子機能解析、遺伝子の発現制御機構の解明、RNAiによる遺伝子治療等に利用を目的に種々の検討が行われている。
RNAiに関して、dsRNAによるインターフェロン(α、β)の発現誘導と、細胞障害が報告されている(K.Kariko et al.,Cells Tissues Organs 2004;177:132−l38:S.Pebernard et al.,Differentiation(2004)72:103−111:C.A.Sledz et al.,Nature Cell Biology,advance online publication,24 August 2003:D.H.Kim et al.,Nature Biotechnology volume 22,Number 3,321−325,2004:A.J.Bridge et al.,Nature Genetics,volume 34,number 3,263−264,2004:S.P.PERSENGIEV et al.,RNA(2004),10:12−18:K.Kariko et al.,J.of Immunol.,2004,172:6545−6549,2004を参照)。例えば、dsRNAがToll−like receptor3(TLR3)を介して認識され、配列特異的な遺伝子の発現だけではなく、TLR3によりI型インターフェロンの発現が誘導され、配列非特異的にRNAを分解する2’−5’−オリゴアデニレートシンテターゼを誘導することが報告され、またdsRNA依存的プロテインキナーゼ(PKR)がsiRNAにより活性化されIFN−βの発現をアップレギュレートすることが報告されている。
このように、現行のRNAi法においては、dsRNAによるインターフェロンの発現誘導でインターフェロン反応が引き起こされること、あるいは細胞障害を起こしてしまうという問題点がある。dsRNAを実験用試薬として用いる場合、非特異的な発現抑制のため、用いたdsRNAの効果を正確に評価できないという問題点があり、さらに医薬として用いる場合、非特異的な発現抑制や細胞障害により投与被験体に副作用をもたらすという問題点があった。
本発明者らは、上記問題に鑑み、インターフェロンの発現を誘導せずにRNAiを引き起こすdsRNAの開発について鋭意検討を行った。その結果、ループ構造を有するshRNAにおいて、センス鎖の5’末端に1個または複数のGからなるオーバーハングを設けることにより、shRNAがインターフェロンの発現を誘導せず、非特異的なRNA分解や細胞障害を引き起こさないことを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[1] インターフェロンおよび/または細胞障害を誘導せずに配列特異的に標的mRNAを切断する、標的mRNAの標的配列と相同な配列からなるセンス鎖と該センス鎖の配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなるshRNAであって、センス鎖の5’末端に1個または複数のGからなるオーバーハング塩基を有するshRNA。
[2] センス鎖の5’末端のGからなるオーバーハング塩基の数が1〜10個である[1]のshRNA。
[3] センス鎖の5’末端のGからなるオーバーハング塩基の数が1〜3個である[2]のshRNA。
[4] センス鎖およびアンチセンス鎖の塩基長がl5〜50である[1]〜[3]のいずれかのshRNA。
[5] [1]〜[4]のいずれかのshRNAの鋳型DNAを含み該shRNAを発現するベクター。
[6] [1]〜[5]のいずれかのshRNAを含む、細胞における標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をin vitroでインターフェロンおよび/または細胞障害を誘導せずに抑制する遺伝子発現抑制剤。
[7] [1]〜[5]のいずれかのshRNAを細胞に導入することを含む、細胞における標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をin vitroでインターフェロンおよび/または細胞障害を誘導せずに抑制する方法。
[8] [1]〜[5]のいずれかのshRNAを有効成分として含む、標的配列を含む遺伝子またはノンコーディング領域が関与する疾患の予防および/または治療のためのインターフェロンおよび/または細胞障害を誘導しない医薬組成物。
[9] 標的配列がウイルスの遺伝子配列またはノンコーディング領域であって、疾患がウイルス感染症である、[8]の医薬組成物。
[10] 標的配列がHIVの遺伝子配列またはノンコーディング領域である、[9]の医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005−021960号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図2は、テンプレートDNAの構造を示す図である。
図3は、pppGG−shDISによるIFN−βの誘導およびCPEの検討の結果を示す写真である。Aは、ウエスタンブロットによるIFN−βの検出の結果を示し、Bは、pppGG−shDIS導入による細胞変性効果(Cytopathic effects:CPE)を示す。
図4は、ppp−shDISの塩基配列を示す図である。
図5は、shRNA5’オーバーハングのIFN誘導への影響を示す写真である。Aは、CPEの結果を示し、Bはウエスタンブロットの結果を示し、CはELISAの結果を示す。
図6は、shLuc2の標的配列およびshLuc2の構造を示す図である。AはshLuc2の標的配列を示し、BはshLuc2の構造を示す。
図7は、5’オーバーハングの塩基数依存的なIFN−β誘導を示す写真である。
図8は、ppp−GGshDISによる抗HIV効果を示す図である。
図9は、ホタルルシフェラーゼを標的としたppp−shLuc6の構造を示す図である。
図10は、脱リン酸化したshLuc6の構造を示す図である。
図11は、ウエスタンブロットによるIFNβ産生確認試験の結果を示す写真である。
図12は、ELISAによるIFNβ産生確認試験の結果を示す図である。
本発明において、2本鎖部分を含みセンス鎖とアンチセンス鎖がループ配列を介して連結しているステムループ構造を有するショートヘアピンRNA(shRNA)が用いられる。2本鎖構造は、1本のRNA鎖中にセンス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む自己相補的RNA鎖によって形成される。ショートヘアピンRNAは、細胞内または生体内でプロセッシングを受けてsiRNAが産生される。本発明のshRNAは少なくともセンス鎖の5’末端にオーバーハングを有し、該オーバーハングは、1〜20、好ましくは1〜15もしくは1〜10、さらに好ましくは1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5もしくは1〜4、特に好ましくは、1〜3、2もしくは1のG(グアニン)からなる配列からなる。Gの数が多過ぎる場合は、オーバーハング部分が4重鎖構造を形成することによりdicerに認識されなくなることがある。Gの適切な数は、Gからなるオーバーハングを付加した本発明のshRNAを細胞に投与して、遺伝子発現抑制効率およびインターフェロンおよび/または細胞障害の誘導の程度を測定することにより容易に決定することができる。また、Gからなるオーバーハング塩基の5’側には、三リン酸(ppp)が結合していてもよい。また、アンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有していてもよく、該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、1〜5、好ましくは1〜3、さらに好ましくは1もしくは2塩基からなる配列が挙げられ、例えば、UUが挙げられる。なお、本発明において、オーバーハングとは、shRNAの一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。
2本鎖部分は、RNA干渉によりノックダウンしようとする標的遺伝子の配列またはノンコーディング領域に含まれる特定の標的配列にハイブリダイズし得る配列を有するRNA鎖(センス鎖)および該配列に相補的なRNA鎖(アンチセンス鎖)が相補的に結合した構造を有する。
本発明のshRNAにおいて、センス鎖の3’末端とアンチセンス鎖の5’末端がループ(ヘアピンループ配列)を介して連結されている。ヘアピンループ配列は限定されないが、5〜12塩基からなるUUで始まる配列、例えばUUCAAGAGA(配列番号1)が挙げられる。そのほかのループ配列としては、Lee NS.et al.(2002)Nat.Biotech.20,500−505、Paddison PJ.et al.(2002)Genes and Dev.16,948−958、Sui G.et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,5515−5520、Paul CP.et al.(2002)Nat.Biotech.20,505−508、Kawasaki H.et al.(2003)Nucleic Acids Res.31,700−707等に記載の配列からなるループを採用することができる。
本発明のshRNAは、センス鎖の5’末端のオーバーハング塩基、センス鎖、ループ配列、アンチセンス鎖を少なくとも含み、センス鎖とアンチセンス鎖が相補的に結合している構造を有し、さらに上記のように、アンチセンス鎖の3’末端のオーバーハング塩基を有していてもよい。オーバーハング塩基を有する部位、ループ部位は、2本鎖構造をとらないが、本発明においては、RNAがセンス鎖とアンチセンス鎖からなる2本鎖部分を含むので、2本鎖RNAという場合がある。
標的遺伝子は、本発明のshRNAを投与しようとする生物体由来の遺伝子または生体に感染し生体内部に存在するウイルス、細菌、真菌、原生動物等の遺伝子等である。生物体由来の遺伝子としては、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、発生に関与する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、その他疾患を引き起こす疾患に関与した遺伝子等が挙げられる。また、ウイルス、細菌としてはHIV、HCV、HBV、HTLV−1、HTLV−2、インフルエンザウイルス、SARSコロナウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、腸管出血性大腸菌、結核菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、緑膿菌、腸球菌、カンジダ、溶連菌、ヘリコバクターピロリ、梅毒スピロヘータ、クラミジア・トラコマチス等が挙げられる。本発明のshRNAの標的遺伝子またはノンコーディング領域の特定の標的配列の塩基数は、限定されず、15〜500塩基の範囲で選択される。好ましくは15〜50、15〜45、15〜40、15〜35もしくは15〜30塩基、さらに好ましくは20〜35塩基、さらに好ましくは19〜30塩基、特に好ましくは19〜29塩基もしくは28塩基である。shRNAの長さが長くなると、インターフェロン反応が誘発されやすくなるという報告もあるが(特開2003−219893号公報)、本発明のshRNAは、センス鎖の5’末端にGからなるオーバーハング塩基を付加することにより、インターフェロン反応が抑制されているので、標的配列が長くなっても、インターフェロン反応は誘導しない。標的遺伝子またはノンコーディング領域中の標的配列は、例えば標的遺伝子により適宜発現抑制効果の大きい部分を選択すればよい。本発明のshRNAと標的配列は、同一であることが望ましいが、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。すなわち、本発明のshRNAのセンス鎖配列と標的配列がハイブリダイズする限り1または複数、すなわち、1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは、1〜3個、2個もしくは1個のミスマッチがあってもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、本発明のshRNAを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のshRNAを試薬としてin vitroで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件あるいは高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃から70℃で12〜16時間でのハイブリゼーション条件が挙げられる。また、本発明のshRNAのセンス鎖配列と標的配列は、90%以上、好ましくは95%以上、さらに好ましくは95、96、97、98もしくは99%以上の配列相同性を有する。
本発明のshRNAは、化学合成や、プロモーターおよびRNAポリメラーゼを用いた転写系によりin vitroで合成することができる。化学合成による合成は、互いに相補的な配列を逆方向配列として有し自己相補性を有するRNA1本鎖を合成し、自己相補性部分で結合させればよい。また、プロモーターおよびRNAポリメラーゼを用いた合成は、1つのプロモーターの下流にセンス鎖とアンチセンス鎖をループで連結した構造を有するテンプレートDNAを合成しRNAポリメラーゼによりRNAを転写すればよい。shRNAのセンス鎖の5’末端にGからなるオーバーハング配列を付加するためには、プロモーターの末端にGからなる配列を付加すればよい。この際、DNA配列には、適宜ターミネーター等を含ませる。ターミネーター配列として例えば、TTTTTT(配列番号2)配列を用いればよい。プロモーターとしては、in vitroで製造する場合、T3プロモーター、T7プロモーター等が用いられ、ベクターに本発明の2本鎖RNAのテンプレートDNAを導入し、該ベクターを生体内に投与して生体内で2本鎖RNAを合成する場合、U6プロモーター、H1プロモーターなどのPolIII系プロモーター等が用いられる。ベクターを用いる場合、ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。プラスミドベクターとしては、pBAsiベクター、pSUPERベクター等を用いればよく、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることができる。なお、本発明のshRNAの合成にT7プロモーター等を用いた場合、Gからなる配列の存在によりT7プロモーターが活性化され、shRNAの製造効率が高まるという利点もある。
本発明のshRNAは、発現を抑制しようとする被験体に導入する。被験体は限定されず、細胞、組織、個体である。被験体として用いる個体としては、インターフェロン反応の誘導が起こり得る動物が挙げられる。動物に対しては、病気の予防、治療用医薬として用いることができる、さらに、本発明のshRNAは、研究用試薬として用いることができ、この場合本発明のshRNAは、遺伝子発現抑制剤、RNAi試薬等として用いることができる。本発明のshRNAを試薬として用いた場合、shRNAを細胞に導入することにより、細胞における標的配列を含む標的遺伝子の発現をin vitroでインターフェロンおよび/または細胞障害を誘導せずに抑制することができる。本発明でin vitroという場合、生体内に投与する場合以外を含む、例えば、試験管内での細胞や組織にshRNAを導入する場合も、in vitroでshRNAを導入するという。
本発明のshRNAを疾患の治療または予防に用いる場合の疾患は、該shRNAにより発現を抑制しようとする遺伝子に関与する疾患である。具体的には、APC遺伝子(大腸癌)、BRCA1/BRCA2遺伝子(乳癌)等の癌遺伝子が関与する癌、PS1遺伝子(アルツハイマー)、LPL遺伝子(高脂血症)、INS/INSR遺伝子(糖尿病)等の種々の遺伝子の転写異常が関与する神経変性症等が挙げられる。本発明のshRNAの治療対象となる癌としては、例えば、食道がん、胃がん、大腸がん、肝細胞がん、膵がん、胆管がん、乳がん、肺がん、肺腺がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮体がん、子宮頚がん、鼻咽喉がん、甲状腺がん、卵巣がん、皮膚がん、白血病、骨髄腫、リンパ腫、リンパ肉腫等が含まれる。これらの癌も関連癌遺伝子の発現を抑制すればよい。また、ウイルスや細菌等の微生物の感染症の場合、ウイルス遺伝子や細菌遺伝子の発現を抑制すればよい。ウイルス、細菌としてはHIV、HCV、HBV、HTLV−1、HTLV−2、インフルエンザウイルス、SARSコロナウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、腸管出血性大腸菌、結核菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、緑膿菌、腸球菌、カンジダ、溶連菌、ヘリコバクターピロリ、梅毒スピロヘータ、クラミジア・トラコマチス等が挙げられる。これらの全または部分的なゲノム配列と遺伝子情報は公知であり、該ゲノムおよび遺伝子情報に従って、標的配列を選択することができる。
本発明のshRNAの導入方法としては、被験体が細胞や組織の場合、細胞や組織と同時に培養することにより導入することができる。その他、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。被験体が動物個体の場合、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することができる。また、特定の部位に投与する場合、ドラッグデリバリーシステムを用いて特定部位にデリバリーしてもよい。ドラッグデリバリーシステムは種々の公知の方法があり、投与しようとする部位に応じて適当な方法を採用することができる。ドラッグデリバリーシステムとしては、例えば、キャリアとしてリポソーム、エマルジョン、ポリ乳酸等を利用した公知の方法等が挙げられる。投与は、医薬的に許容され得る希釈剤またはキャリアと混合して行うことが望ましい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。導入するshRNAの量は、予防、治療しようとする疾患の種類、重篤度、被検体の年齢、体重等により適宜決定することができるが、疾患部の細胞1個当たり少なくとも、1コピーのshRNAが導入されるような量が好ましい。
本発明において、RNA干渉により標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現を抑制(サイレンシング)するとは、遺伝子の発現をその遺伝子またはノンコーディング領域のmRNAまたはタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、本発明のshRNAを導入しない場合に対して、100%抑制される場合のみならず、75%以上、50%以上あるいは20%以上抑制される場合も含まれる。発現抑制の程度は、遺伝子またはノンコーディング領域のmRNAまたはタンパク質の産生量をshRNA導入前後で比較すればよい。mRNAの場合は、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR、in situ hybridization等により測定することができ、タンパク質の場合は、ウエスタンブロッティング、ELISA、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定等により測定することができる。また、本発明のshRNAは、細胞や個体に導入しても該細胞、個体でインターフェロン反応を引き起こさないことを特徴とする。インターフェロンを誘導しないとは、インターフェロンαまたはβの発現を誘導しないことをいい、インターフェロンの合成のみならず、インターフェロンが関与するパスウェイを活性化しないことを含む。インターフェロンの発現が100%抑制される場合のみならず、75%以上、50%以上、20%または10%以上抑制される場合も含まれる。インターフェロン反応の有無は、インターフェロン自体またはインターフェロンのmRNAの産生を測定することに決定することができる。この測定には、上記のようにノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR、in situ hybridization、ウエスタンブロッティング、ELISA、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定を行えばよい。さらに、本発明のshRNAは、細胞や個体に導入しても該細胞や、個体の細胞に細胞障害を誘導しないことを特徴とする。一般的に二本鎖RNAを投与した場合、dsRNA依存的プロテインキナーゼ(PKR)の活性化により、細胞障害を誘導し得るが、本発明のshRNAはPKRを活性化することがなく細胞障害を誘導することもない。ここで、細胞障害とは、細胞が正常の機能を発揮しないか、あるいは増殖が抑制される程度障害を受けていることをいい、アポトーシス、ネクローシス等の細胞死を含む。本発明において、細胞障害を誘導しないとは、細胞障害を全く誘導しない場合のみならず、センス鎖の5’末端にGからなる配列を付加しない2本鎖RNAを導入した場合に比べ、細胞障害を起こす細胞の数が75%以下、50%以下、20%以下、または10%以下である場合を含む。細胞障害が誘導されたか否かは、細胞を観察し細胞変性効果(CPE)が出現したかどうかを調べることによりわかり、また、細胞の代謝活性を測定したり、トリパンブルー等の色素排除アッセイにより判断することができる。本発明のshRNAは、インターフェロン誘導および細胞障害の両方を誘導しないか、またはインターフェロン誘導または細胞障害のいずれかを誘導しない。上記のように本発明において、「インターフェロンおよび/または細胞障害を誘導せずに」とは、誘導が完全に阻害される場合だけではなく、誘導が減じられる場合も含む。また、インターフェロンおよび/または細胞障害の誘導の阻害も試験系や被験体によって、程度が異なってくることがあるが、少なくとも一つの系または被験体においてインターフェロンおよび/または細胞障害を誘導しなければ、本発明のインターフェロンおよび/または細胞障害を誘導しないshRNAに含まれる。
本発明は、さらに本発明のshRNAを生物体に投与して、該生物体において標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をインターフェロンの発現を誘導せずに抑制する方法、本発明のshRNAを動物に投与して、標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域が関与する疾患を、インターフェロンの発現を誘導せずに予防、治療する方法を包含する。さらに、本発明は、本発明のshRNAの標的配列を含む標的遺伝子が関与する疾患を、インターフェロンの発現を誘導せずに予防、治療する医薬の製造のための使用も包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
(1)shRNA(pppGG−shDIS)の合成
HIV−1(Human Immunodeficiency virus type 1)のDIS(Dimerization Initiation Site)の塩基配列から、shRNA(shDIS)を合成した。shRNAの配列は図1に示す。図1に示すように、HIV−1DISに対するshRNA(pppGG−shDIS)は、5’末端から三リン酸、GG、センス鎖(5’−GGCUUGCUGAAGCGCGCACGG−3’;配列番号3)、ループ配列(5’−UUCAAGAGA−3’;配列番号1)、アンチセンス鎖、UUとなっている。
shRNAの合成方法は、T7プロモーター(5’−TAATACGACTCACTATAGG−3’;配列番号4)を付加したshort hairpin RNA(shRNA)配列を有する2本鎖DNA(図2)を用いて、T7 RNAポリメラーゼ(AmpliScribeTMT7−FlashTMTranscription Kits,EPICENTRE,Cat.No.ASF3507)により合成した。図2に示すように、5’末端からT7プロモーター、センス鎖、ループ配列、アンチセンス鎖、UUとなっておる。このDNAを用いてT7RNAポリメラーゼを作用させると、図1に示すshRNAが合成される(配列番号5)。図2においては、センス鎖のみ記してあり、これに相補的なアンチセンス鎖が結合している。配列番号5の配列は、標的配列としてHIV−1のDISを用いた場合であり、センス鎖の部分はいかなる標的配列であってもよい。
(2)pppGG−shDISのインターフェロンβ誘導能の評価
pppGG−shDISをHeLa CD4+細胞に導入し、そのインターフェロンβ(IFN β)誘導能を試験した。
まず、HeLa CD4+細胞を6ウェルプレートに1.4×105cells/wellでまき、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)で1日培養した(37℃、5%CO2 atmosphere)。培養後、培地をすべて取り除き新たにRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)800μlを滴下した。pppGG−shDIS(400、200、100、50、25pmol)にDMRIE−C(Invitrogen)、およびOpti−MEM(Invitrogen)を加え(shRNA:Reagent=1μg:3μL)、200μLに調整し、室温で20分間インキュベートした。インキュベートしたpppGG−shDIS−Reagent複合体をHeLa CD4+細胞へ滴下し、1.5時間培養し、pppGG−shDISを細胞へ導入した。これと同時にIFN β誘導のコントロールとしてPoly(I:C)(1.8、0.9μg)も同様の方法で細胞へ導入した。培養後HeLa CD4+細胞をRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)により洗浄し、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)1mLを滴下した。その後12時間培養した。培養後、細胞を回収し、細胞内のIFN βの発現をウエスタンブロット法により解析した(図3A)。この際、コントロールとして、Poly(I:C)を用いた。図中、N.C.は何も導入していないサンプルを示す。
また、上記と同様の方法でpppGG−shDISを導入し、48時間培養後、細胞変性効果(Cytopathic effects:CPE)を顕微鏡にて観察した(図3B)。
図3Aに示すように、コントロールであるPoly(I:C)ではIFN−βが誘導されたのに大して、pppGG−shDISはどの導入量においてもIFN−βの誘導は認められなかった。また、pppGG−shDISを200、400pmol導入した系において、CPEが確認できた。これらの結果より、このpppGG−shDISはIFNを誘導しないことがわかった。さらに、PKR/2−50ASは誘導される可能性があることが示唆された。
(3)shRNA(ppp−shDIS)の合成
pppGG−shDISにおいてはIFN βの誘導は認められなかった。そこで異なるタイプのshRNA(ppp−shDIS)を合成した(図4)。このppp−shDISはpppGG−shDISの5’末端overhangのGGが欠損しているものである。これら2つのタイプのshRNAについてIFNβの誘導能について検討した。
ppp−shDISの合成方法は、T7プロモーターの塩基配列を(5’−TAATACGACTCACTATAGG−3’;配列番号4)から(5’−TAATACGACTCACTATA−3’;配列番号6)に変更することで合成した。合成は(1)と同様にT7 RNAポリメラーゼ(AmpliScribeTM T7−FlashTMTranscription Kits,EPICENTRE,Cat.No.ASF3507)により合成した。Ppp−shDISは、5’末端から三リン酸、センス鎖、ループ配列(5’−UUCAAGAGA−3’;配列番号1)、アンチセンス鎖、UUとなっている。
(4)pppGG−shDISのインターフェロンβ誘導能の評価
pppGG−shDISまたはppp−shDISをHeLa CD4+細胞に導入し、そのIFN β誘導能を試験した。
まず、HeLa CD4+細胞を6ウェルプレートに1.4×105cells/wellでまき、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)で1日培養した(37℃、5%CO2atmosphere)。培養後、培地をすべて取り除き新たにRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)800μlを滴下した。pppGG−shDISまたはppp−shDIS(200、100、50pmol)にDMRIE−C(Invitrogen)、およびOpti−MEM(Invitrogen)を加え(shRNA:Reagent=1μg:3μL)、200μLに調整し、室温で20分間インキュベートした。インキュベートしたshDIS−Reagent複合体をHeLa CD4+細胞へ滴下し、1.5時間培養し、shDISを細胞へ導入した。培養後HeLa CD4+細胞をRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)により洗浄し、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)1mLを滴下した。48時間培養後、細胞変性効果(Cytopathic effects:CPE)を顕微鏡にて観察した(図5A)。
また、上記と同様の方法でpppGG−shRNAまたはppp−shDISを導入し、12時間培養後、細胞を回収し、細胞内のIFN βの発現をウエスタンブロット法により解析し(図5B)、また同時に培養上清を回収しELISA法によりIFN βの発現を解析した(図5C)。図中、N.C.は何も導入しないサンプルである。
図5Aに示すように、5’オーバーハング塩基数を変化させてCPEを観察した結果、ppp−shDISではpppGG−shDISと比べてCPEが多く観察された。また、図5BおよびCに示すように、IFN誘導能を評価した結果、ppp−shDISではIFN−βが誘導され、pppGG−shDISではIFN−βは誘導されなかった。これは細胞内(B)、細胞外(C)共に同じ結果であった。これらの結果から、shRNAによるIFN誘導は5’オーバーハングの塩基数に依存している可能性が示唆された。
(1)shLuc2の合成
上記の結果から、T7 RNAポリメラーゼで合成したshRNAのIFN誘導能は5’オーバーハングの塩基数に依存している可能性が示唆された。そこで新たに5’オーバーハングの塩基数を0、1、2、3個のshRNAを合成し、この可能性について検討した。さらにshRNAの標的配列の依存性を合わせて検討するために標的をHIV−1からFirefly Luciferaseに対するものに変更した(shLuc2)。図5にその標的配列と4つのタイプのshLuc2の塩基配列を示す。
これら4つのタイプのshLuc2の合成は、(1)と同様にT7RNAポリメラーゼ(AmpliScribeTMT7−FlashTMTranscription Kits,EPICENTRE,Cat.No.ASF3507)により合成した。また5’オーバーハングの制御はT7プロモーターの塩基配列を変更することにより行った。それぞれのT7プロモーターの塩基配列は、ppp−shLuc2(5’−TAATACGACTCACTATA−3’;配列番号6)、pppG−shLuc2(5’−TAATACGACTCACTATAG−3’;配列番号7)、pppGG−shLuc2(5’−TAATACGACTCACTATAGG−3’;配列番号4)、pppGGG−shLuc2(5’−TAATACGACTCACTATAGGG−3’;配列番号8)とした。
(2) shLuc2のインターフェロンβ誘導能の評価
shLuc2をHeLa CD4+細胞に導入し、そのインターフェロンβ(IFNβ)誘導能を試験した。
まず、HeLa CD4+細胞を6ウェルプレートに1.4×105cells/wellでまき、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)で1日培養した(37℃、5%CO2atmosphere)。培養後、培地をすべて取り除き新たにRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)800μlを滴下した。4つのタイプのshLuc2(200pmol)にDMRIE−C(Invitrogen)、およびOpti−MEM(Invitrogen)をそれぞれ加え(shRNA:Reagent=1μg:3μL)、200μLに調整し、室温で20分間インキュベートした。インキュベートしたshLuc2−Reagent複合体をHeLa CD4+細胞へ滴下し、1.5時間培養し、shLuc2を細胞へ導入した。培養後HeLa CD4+細胞をRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)により洗浄し、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)1mLを滴下した。その後12時間培養した。培養後、細胞を回収し、細胞内のIFN βの発現をWestern Blot法により解析した(図6)。
図6に示すように、IFN誘導の5’オーバーハング依存性を検討した結果、5’オーバーハングの塩基数が少ないほどIFNが誘導されることが確認された。また、標的配列には依存しないことも確認された。
実施例1および2からT7 RNA polymeraseで合成したshRNAによるIFN誘導は5’オーバーハングによって規定されていることが示された。また、PKR/2−50ASについては5’オーバーハングの違いでは影響を受けないことが示唆された。
pppGG−shDIS(DISはHIVゲノム中の機能的ノンコーディング配列)またはLacZを標的としたコントロールRNA(LacZ)をHeLa CD4+細胞に導入し、HIV−1発現プラスミドであるpNL4−3を導入し、抗HIV−1効果の検討を行った。
まず、HeLa CD4+細胞を12ウェルプレートに5×104細胞/ウェルでまき、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)で1日培養した(37℃、5%CO2雰囲気)。培養後、培地をすべて取り除き新たにRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、l00μg/mlストレプトマイシン)400μlを滴下した。pppGG−shDISまたはLacZ(25、12.5、6.25pmol)にDMRIE−C(Invitrogen)、およびOpti−MEM(Invitrogen)を加え(shRNA:試薬=1μg:3μL)、100μLに調整し、室温で20分間インキュベートした。インキュベートしたshDIS:試薬複合体をHeLa CD4+細胞へ滴下し、1.5時間培養し、shDISを細胞へ導入した。培養後HeLa CD4+細胞をRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)により洗浄し、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)1mLを滴下した。FugenTM6(Roche)DNA:試薬=1μg:3μL)とOpti−MEM(Invitrogen)を加え室温で5分間インキュベートした。さらにpNL4−3(100ng)を加え、50μlに調整し、室温で15分間インキュベートした。インキュベートしたpNL4−3:試薬複合体をHeLa CD4+細胞へ滴下し、48時間培養後、培養上清を回収し、p24抗原量を測定した(図8)。図8に示すように、ppp−GGshDISによるHIV−1抑制効果は、P.C.と比較して約70%の減少が得られた。また、コントロールRNAであるLacZ導入によるp24量の減少は確認されなかったため、shRNA導入による細胞障害が引き起こす抗ウイルス効果ではないことが示唆された。
(1) shLuc6の合成
実施例2の結果から、T7 RNAポリメラーゼで合成したshRNAのIFN誘導能は5’オーバーハングの塩基数に依存している可能性が示唆された。そこで新たに5’オーバーハングの塩基数を0、1、2または3個のshRNAを合成し、この可能性について検討した。さらにshRNAの標的配列の依存性を合わせて検討するために標的をHIV−1からホタルルシフェラーゼに対するものに変更した(shLuc6)。下ににホタルルシフェラーゼを標的とした標的配列を示す。
Luc:5’−GGAGCCUUCAGGAUUACAAGA−3’ (配列番号9)
これら4つのタイプのshLuc6の合成は、実施例2と同様にT7 RNAポリメラーゼ(AmpliScribeTMT7−FlashTMTranscription Kits,EPICENTRE,Cat.No.ASF3507)により合成した。また5’オーバーハングの制御はT7プロモーターの塩基配列を変更することにより行った。それぞれのT7プロモーターの塩基配列は、ppp−shLuc6(5’−TAATACGACTCACTATA−3’;配列番号10)、pppG−shLuc6(5’−TAATACGACTCACTATAG−3’;配列番号11)、pppGG−shLuc6(5’−TAATACGACTCACTATAGG−3’;配列番号12)、pppGGG−shLuc6(5’−TAATACGACTCACTATAGGG−3’;配列番号13)とした。図9にIFN誘導能評価に用いたshRNAの構造を示す。5’オーバーハングの塩基数を0、1、2および3のもちょを構築した。 さらに、IFN産生を誘導している因子を同定するため、CIP(Alkaline Phostase,Calf Intestinal,New England Biolabs,Cat.No.188114)による脱リン酸化処理を行ったshLuc6を構築した(図10)。
(2) shLuc6のインターフェロンβ誘導能の評価
shLuc6をHeLa CD4+細胞に導入し、そのインターフェロンβ(IFN−β)誘導能を試験した。
まず、HeLa CD4+細胞を12ウェルプレートに1×105細胞/ウェルでまき、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)で1日培養した(37℃、5%CO2雰囲気)。培養後、培地をすべて取り除き新たにRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)400μlを滴下した。4つのタイプのshLuc6(100pmol)にDMRIE−C(Invitrogen)、およびOpti−MEM(Invitrogen)をそれぞれ加え(shRNA:試薬=1μg:3μL)、200μLに調整し、室温で20分間インキュベートした。インキュベートしたshLuc6−試薬複合体をHeLa CD4+細胞へ滴下し、1.5時間培養し、shLuc6を細胞へ導入した。培養後HeLa CD4+細胞をRPMI−1640(含100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)により洗浄し、RPMI−1640(含10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)1mLを滴下した。その後12時間培養した。培養後、細胞内のIFN−βの発現をウエスタンブロット法により解析した。図11にウエスタンブロットによるshLuc6のIFN−β誘導能の検討の結果を示す。HeLa CD4+細胞にshLuc6(100pmol)を導入し、導入12時間後に細胞内タンパク質を回収しウエスタンブロットによりIFN−βの検出を行った結果である。
また、培養上清中のIFN−βの発現をELISAにより解析した。図12にELISAによるshLuc6のIFN−β誘導能の検討の結果を示す。HeLa CD4+細胞にshLuc6(100pmol)を導入し、導入12時間後に培養上清を回収しELISAによりIFN−βの検出を行った結果である。N.C.は何も導入していないサンプルを示す。
5’末端にG残基を2つ以上付加したタイプのshRNAではIFN−β産生は確認されなかった。この結果は、DISを標的とした場合と相関性が得られた。よって、標的配列が異なってもIFN産生の回避が行われたため、同RNAの有用性が期待される。さらに、CIP処理によりIFN産生を回避したことから、本研究においてIFNを誘導する因子は三リン酸であることが示唆された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
Claims (6)
- インターフェロンおよび/または細胞障害を誘導せずに配列特異的に標的mRNAを切断する、標的mRNAの標的配列と相同な配列からなるセンス鎖と該センス鎖の配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなるショートヘアピンRNA(shRNA)であって、センス鎖およびアンチセンス鎖の塩基長が 19 〜 29 であり、センス鎖の5’末端に1個〜3個のG(グアニン)からなるオーバーハング塩基を有し、該オーバーハング塩基の5’側に三リン酸が結合したshRNA。
- 請求項1に記載のshRNAの鋳型DNAを含み該shRNAを発現するベクター。
- 請求項1に記載のshRNAまたは請求項2に記載のベクターを含む、細胞における標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をin vitroでインターフェロンおよび/または細胞障害を誘導せずに抑制する遺伝子発現抑制剤。
- 請求項1に記載のshRNAまたは請求項2に記載のベクターを細胞に導入することを含む、細胞における標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をin vitroでインターフェロンおよび/または細胞障害を誘導せずに抑制する方法。
- 請求項1に記載のshRNAまたは請求項2に記載のベクターであって、標的配列がウイルスの遺伝子配列またはノンコーディング領域である shRNA またはベクターを有効成分として含む、ウイルス感染症の予防および/または治療のためのインターフェロンおよび/または細胞障害を誘導しない医薬組成物。
- 標的配列がHIVの遺伝子配列またはノンコーディング領域である、請求項5に記載の医薬組成物。
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