JP4911501B2 - 新規遺伝子発現抑制剤 - Google Patents
新規遺伝子発現抑制剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4911501B2 JP4911501B2 JP2006324088A JP2006324088A JP4911501B2 JP 4911501 B2 JP4911501 B2 JP 4911501B2 JP 2006324088 A JP2006324088 A JP 2006324088A JP 2006324088 A JP2006324088 A JP 2006324088A JP 4911501 B2 JP4911501 B2 JP 4911501B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vic
- sirna
- expression
- gene
- differentiation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
[1] ET-2/VIC mRNAの部分配列を標的配列とするsiRNA又はshRNAを有効成分として含有するET-2/VIC遺伝子発現抑制剤。
[2] 配列番号1及び配列番号2に表されるRNAを含む[1]のET-2/VIC遺伝子発現抑制剤。
[4] siRNA又はshRNAが配列番号1及び配列番号2に表されるRNAを含む[3]のトランスグルタミナーゼ1発現抑制剤。
[6] siRNA又はshRNAが配列番号1及び配列番号2に表されるRNAを含む[5]のケラチノサイト分化誘導抑制剤。
[8] siRNA又はshRNAが配列番号1及び配列番号2に表されるRNAを含む[7]の医薬組成物。
[10] 癌の予防又は治療剤である[7]又は[8]の医薬組成物。
[11] 角化異常が原因の脱毛を予防又は治療するための育毛剤である[7]又は[8]の医薬組成物。
[13] ET-2/VIC遺伝子をケラチノサイトの分化マーカーとして用い、ET-2/VIC遺伝子の発現を測定することを含むケラチノサイトの分化程度を決定する方法。
[14] ET-2/VIC遺伝子断片をプローブ又はプライマーとして含む、ET-2/VIC遺伝子をケラチノサイトの分化マーカーとして用い、ケラチノサイトの分化程度を決定するための検出試薬。
本発明は、ET-2/VIC siRNAを有効成分として含有するET-2/VIC遺伝子発現抑制剤である。
「siRNA」は、標的mRNAの翻訳を阻止する二本鎖RNA分子を意味する。
購入した滅菌済みS-MEM培地(Caフリー)にCa濃度を減らした9%牛胎児血清を添加した。ケラチノサイトを6cmディッシュに加え、37℃、5%CO2下に培養した。細胞がセミコンフルエント状態に達してから、10%牛胎児血清を添加したMEM培地と交換して、分化を開始した。ケラチノサイトは、Caが低い濃度(0.05mM程度)では分化せずに細胞を増殖するが、Ca濃度が高くなると(1.2mM〜)、増殖を停止し、分化を開始する。さらに0、20、40、60分間培地交換をしないで培養した。このようにして得られた培養物を、PBSで3回洗浄し、その後0.5ml(6cmディッシュ1枚あたり)ISOGEN(日本ジーン社)で2回可溶化し、それを混合、その後-80℃で保存した。製造業者(日本ジーン社)の推奨に従い、RNA抽出を行った。ひとつの条件につき0.5μgのRNA逆転写に、RNA PCR Kit (Takara)を用いた。プライマー配列、サイクル数及びアニーリング温度を以下の表1に示す。
購入した滅菌済みS-MEM培地150μLにトランスフェクション試薬(SiLent Fect Lipid Reagent, BIO-RAD)4.5μLを混合し(溶液1)、また、別個にS-MEM培地150μLに100μM siRNA stock溶液1.8μLを混合した(溶液2)。さらに溶液1と溶液2を混合し、室温で20分間、放置した。siRNAの配列を表2に示す。
上記(1)と同様にケラチノサイトを6cmディッシュに加え、37℃、5%CO2下に培養した。細胞が50%コンフルエント状態に達してから、培地を半分除去し、上記(2)で調製したsiRNA溶液を添加し、24時間培養を続けた。24時間後、上記(1)と同様にMEM培地と交換して分化を開始した。1時間後、上記(1)と同様に遺伝子発現の解析を行った。図2は、ET-2/VIC siRNA添加24時間後、MEM培地と交換し、分化を開始した時のET-2/VIC遺伝子発現のRT-PCRによる評価を示す。データは18SrRNA発現量に対して標準化した。分化開始後、ET-2/VICはET-2/VIC siRNAによって著しく発現抑制された。
この結果は、ET-2/VICsiRNAがET-2/VIC遺伝子発現上昇を確かに抑制することを示す。
上記(3)と同様に上記(2)で調製したsiRNA溶液を添加し、24時間培養を続けた。24時間後、上記(1)と同様にMEM培地と交換して分化を開始した。2日間培地交換しないで培養し、位相差顕微鏡により形態観察をした。顕微鏡観察によって分化の様子を評価した結果を図3に示す。ET-2/VIC siRNA 100nM添加することにより、ケラチノサイトの分化抑制が観察された(図3)。さらに、分化開始5日間培地交換しないで培養し、分化の指標である、cornified envelope (CE)の形成とTGase 1発現について調べた。CEの形成は次のようにして測定した。得られた培養物をPBSで2回洗浄し、その後0.5mLの可溶化液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1% Triton X-100 at pH 8.0、1mM PMSF)に溶解しつつセルスクレイパーで回収した。これをホモジナイザーで処理、均一溶液にしたのち、タンパク量をBCA Protein assayキット(Pierce Biotechnology)によって測定した(全タンパク量)。その後、遠心分離(10000g、15分間)を行い、上澄み溶液はウエスタンブロット(WB)分析用に回収保存した。遠心分離後得られた不溶物から、100℃の溶解液(100mM Tris-HCl、1% 2-メルカプトエタノール、2% SDS at pH 9.0)によって2回、溶解物を除去し、残った不溶物をCEとした。さらに、可溶化液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1% Triton X-100 at pH8.0、1mM PMSF)で洗浄3回行い、さらに、ホモジナイザーで処理、均一溶液にし、上記同様にタンパク量を測定した(CEタンパク量)。CE形成量は、CE/TPの割合として計算した。その結果を図4に示す。ET-2/VIC siRNA 100nM添加することにより、CEの形成量が抑制された(図4)。さらに、TGase 1の発現はウエスタンブロットによって測定した。上記で回収済みWB用サンプルを同様にタンパク量測定し、一定量(50μg)を10%アクリルアミドゲルに供し、SDS-PAGEを行った。PVDF膜に転写後、ブロッキング、1次抗体反応(anti-TGase 1 polyclonal, 1:200, Santa Cruz)、アルカリホスファターゼ2次抗体と反応、発色させた。バンドにおける発色強度をNIH Imageを用いて定量した。図5は、ET-2/VIC siRNAを添加した場合のTGase 1発現のWBによる評価を示す。データはscramble-negative control発現量に対して標準化した。TGase 1は発現抑制された。
Claims (4)
- ET-2/VIC mRNAの部分配列を標的配列とするsiRNA又はshRNAを有効成分として含有するトランスグルタミナーゼ1発現抑制剤。
- siRNA又はshRNAが配列番号1及び配列番号2に表されるRNAを含む請求項1記載のトランスグルタミナーゼ1発現抑制剤。
- ET-2/VIC mRNAの部分配列を標的配列とするsiRNA又はshRNAを有効成分として含有するケラチノサイト分化誘導抑制剤。
- siRNA又はshRNAが配列番号1及び配列番号2に表されるRNAを含む請求項3記載のケラチノサイト分化誘導抑制剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006324088A JP4911501B2 (ja) | 2006-11-30 | 2006-11-30 | 新規遺伝子発現抑制剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006324088A JP4911501B2 (ja) | 2006-11-30 | 2006-11-30 | 新規遺伝子発現抑制剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008136383A JP2008136383A (ja) | 2008-06-19 |
JP4911501B2 true JP4911501B2 (ja) | 2012-04-04 |
Family
ID=39598493
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006324088A Expired - Fee Related JP4911501B2 (ja) | 2006-11-30 | 2006-11-30 | 新規遺伝子発現抑制剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4911501B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20180025701A (ko) * | 2016-09-01 | 2018-03-09 | (주)아모레퍼시픽 | 특정 siRNA을 포함하는 멜라닌 증진용 조성물 |
-
2006
- 2006-11-30 JP JP2006324088A patent/JP4911501B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008136383A (ja) | 2008-06-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10405749B2 (en) | RNA agents for P21 gene modulation | |
Yi et al. | A skin microRNA promotes differentiation by repressing ‘stemness’ | |
Xiao et al. | MicroRNA-885-3p inhibits the growth of HT-29 colon cancer cell xenografts by disrupting angiogenesis via targeting BMPR1A and blocking BMP/Smad/Id1 signaling | |
Chen et al. | Downregulation of TNIP1 expression leads to increased proliferation of human keratinocytes and severer psoriasis-like conditions in an imiquimod-induced mouse model of dermatitis | |
Chuang et al. | Functional role of the long noncoding RNA X-inactive specific transcript in leiomyoma pathogenesis | |
JP2007530431A (ja) | 膵臓癌を治療するための組成物および方法 | |
US20110082185A1 (en) | Cancer-testis gene silencing agents and uses thereof | |
Li et al. | Exosomes from PYCR1 knockdown bone marrow mesenchymal stem inhibits aerobic glycolysis and the growth of bladder cancer cells via regulation of the EGFR/PI3K/AKT pathway | |
Zhan et al. | LncRNA LINC00689 promotes the tumorigenesis of glioma via mediation of miR-526b-3p/IGF2BP1 axis | |
JP4467559B2 (ja) | 細胞増殖を阻害する組成物および方法 | |
JP4911501B2 (ja) | 新規遺伝子発現抑制剤 | |
US8796240B2 (en) | Cell growth inhibitor and screening method thereof | |
Lin et al. | RNA-Based Antipsoriatic Gene Therapy: An Updated Review Focusing on Evidence from Animal Models | |
Klein et al. | Epidermal ZBP1 stabilizes mitochondrial Z-DNA to drive UV-induced IFN signaling in autoimmune photosensitivity | |
Chen et al. | microRNA-196b alleviates lipopolysaccharide-induced inflammatory injury by targeting NRAS | |
WO2011074652A1 (ja) | HIF-2αの発現を抑制する核酸 | |
Wesche-Soldato et al. | Hydrodynamic delivery of siRNA in a mouse model of sepsis | |
US7956044B1 (en) | Compositions comprising inhibitors of RNA binding proteins and methods of producing and using same | |
JP2010529852A (ja) | 癌治療のためのNuMAのRNAi媒介ノックダウン | |
AU2006219666B2 (en) | Inhibition of SPAG9 expression with siRNAs | |
Sunil et al. | Transient silencing of Plasmodium falciparum Tudor Staphylococcal Nuclease suggests an essential role for the protein | |
JP5263730B2 (ja) | ネコ伝染性腹膜炎ウイルス(fipv)の予防及び治療剤 | |
Ma et al. | DNAJB1-PRKACA fusion protein-regulated LINC00473 promotes tumor growth and alters mitochondrial fitness in fibrolamellar carcinoma | |
Kang et al. | Silencing epidermal growth factor receptor by RNA interference in glioma | |
US8853182B2 (en) | Cell growth inhibitor and screening method thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090212 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110705 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110905 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111004 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111220 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120111 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4911501 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150127 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |