JP2007501225A - 転移防止におけるｓｉＲＮＡサイレンシングの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は合成ＲＮＡ、より具体的には組織因子発現を調節できる短い妨害ＲＮＡ（siＲＮＡ）と転移防止と癌治療にその使用に関する。

Description

本発明は合成ＲＮＡ、より具体的には組織因子（ＴＦ）発現を調節できる短い妨害ＲＮＡ（siＲＮＡ）と転移防止と癌治療でのその使用に関する。本発明は又マウスＴＦ標的の新規siＲＮＡ分子とその使用を開示する。

siＲＮＡの妨害
欲しない遺伝子発現のサイレンス機構は正常細胞機能に非常に重要であり、ＲＮＡサイレンシングはこの１０年で種々生命体の独立研究から合体した新規研究分野である。相同ＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ配列間の相互作用により遺伝子をサイレンス化でき、ＤＮＡのメチル化を誘導することは長く知られている。（バーンステイン、イー（Berstein, E）、コーディ、エイエイ（Caudy, AA）、ハモンド、エスエム（Hammond, SM）、ハノン、ジージェー（Hannon GJ）、ＲＮＡ妨害開始段階での二座リボヌクレアーゼの役割（Role for bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference）、ネーチャー（Nature）、４０９巻、３６３−３６６頁（２００１年））。１９９８年の線虫でのＲＮＡ妨害（ＲＮＡi）の発見により遺伝子サイレンシング誘発物として二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に注意が集まり、現在植物の多くの遺伝子サイレンシング効果がｄｓＲＮＡ仲介であることが知られている。（バーンステイン、イー等（Berstein, E, et al）、ＲＮＡ妨害開始段階での二座リボヌクレアーゼの役割（Role for bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference）、ネーチャー（Nature）、４０９巻、３６３−３６６頁（２００１年））。

ＲＮＡiは通常ｄｓＲＮＡが細胞質の相同ｍＲＮＡ分解を引き起こす転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）現象と説明される。（バーンステイン、イー等（Berstein, E, et al）、２００１年、前出）。しかし細胞核ｄｓＲＮＡが相同ＤＮＡ配列の後生修飾をもたらす経路に入り、転写レベルでサイレンシングする可能性も無視してはならない。又ＲＮＡサイレンシング細胞核性状は主として植物で研究されてきたが、類似のＲＮＡ命令ＤＮＡかクロマチン修飾が同様に他生命体で起ることが示唆されている。

動物のＲＮＡiや植物のＰＴＧＳ関連現象は同じ高度な保存機構から生じ、古い起源を示唆する。（バーンステイン、イー等（Berstein, E, et al）、前出（２００１年））。基本的プロセスはｄｓＤＮＡに関連し、短い単位（短い妨害ＲＮＡ、siＲＮＡと呼ぶ）に加工され、相同メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の認識と標的の開裂をもたらす。（加工後）ＲＮＡi／ＰＴＧＳを引き起こすｄｓＲＮＡは多くの方法で細胞核や細胞質に作成できる。

ｄｓＲＮＡをsiＲＮＡに加工し、次いでｍＲＮＡに分解する加工は二段ＲＮＡ分解プロセスである。第一段階ではｄｓＲＮＡを長さ２１乃至２５個のヌクレオチド（nt）のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡ、即ちsiRNAに加工するｄｓＲＮＡエンドヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＩＩＩ類似、ＲＮaseIII類似（RＮase-III like）活性を含む。ショウジョバエではこのＲＮaseIII型タンパク質をダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ぶ。第二段では産生アンチセンスsiＲＮＡは、相同一本鎖ｍＲＮＡを開裂するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ぶ異なるリボヌクレアーゼ複合体と結合し、且つへのガイドとして働く。ＲＩＳＣはアンチセンスsiＲＮＡと対をなす領域のほぼ中間でｍＲＮＡを切断し、次いでｍＲＮＡが更に分解する。

異なる供給源のｄｓＲＮＡがこのＲＮＡi／ＰＴＧＳをもたらす加工工程に入ることができる。更に最近の研究でも機能的に同等でない異種siＲＮＡを産生するｄｓＲＮＡ開裂に一つ以上の経路があることが示唆される。

ＲＮＡサイレンシング（細胞質と細胞核の異なるレベルの遺伝子発現が活性な）は転位因子やウイルス（その多くは複製時にｄｓＲＮＡを産生する）のような外来配列の増殖に対抗するのに関与してきたように思われる。しかしＲＮＡi／ＰＴＧＳが遠隔位でサイレンシングを誘導する移動信号を産生する場合、siＲＮＡの直接注入によるンパク質合成及び／又は機能の閉鎖を哺乳類細胞治療手段としての可能性も考慮せねばならない。

今までsiＲＮＡ配列での突然変異や化学修飾による一般的効果については殆どしられていない。ブートラ等（Boutla et al.）はｍＲＮＡ標的配列に関して中央位置での単一ミスマッチを持つ突然変異ＲＮＡがショウジョバエで十分な活性を保持することを報告した。（ブートラ、エイ（Boutla, A）、デリダキス、シー（Delidakis, C）、リバダラス、アイ（Livadaras, I）、ツアグリス、エム（Tsagris, M）、及びタブラー、エム（Tabler, M）、“短い５‘位−リン酸化二本鎖ＲＮＡによるショウジョバエによるＲＮＡ妨害の誘導”（Short 5'-phosphorylated double-stranded RNAse induce RNA interference in Drosophila）、カレントバイオロジー（Current Biol.）、１１巻、１７７６−１７８０頁、（２００１年））。その一方エルバシャー等（Elbashir et al.）は単一ミスマッチが体内ショウジョバエ胚溶解物アッセイの活性に有害であること見いだした。（エルバシャー、エスエム（Elbashir, S.M.）、マーティネス、ジェイ（Martinez, J.）、パトカニオブスカ、エイ（Patkaniiowska, A.）、レンデケル、タブリュ（Lendeckel, W.）及びツシュル、ティ（Tuschl, T.）、“キイロショウジョバエ胚溶解物における有効ＲＮＡi仲介に関するsiＲＮＡの機能分析”（Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate）、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）２０巻、６８７７−６８８８頁、（２００１年））。本出願ではこれら二つの対立結果をいくつかの因子、特にsiＲＮＡ標的位置、siＲＮＡ濃度、ｍＲＮＡ濃度、ｍＲＮＡ産生とsiＲＮＡ固有開裂活性、ミスマッチ突然変異により徐々に減少する活性が最終結果に影響する動的プロセスとして体内ＲＮＡiプロセスを動的プロセスを描いて調和しようとした。

いくつかの他の結果も又報告されている。例えばジャック等（Jacque et al.）（ジャック、ジェイエム（Jacque, J.M.）、トリク、ケイ（Triques, K.）、ステベンソン、エム（Stevenson, M.）、“ＲＮＡ妨害によるＨＩＶ―１複製の調節”（Modulation of HIV-1 replication by RNA interference）、ネーチャー(Nature)、４１８巻、４３５−４３８頁、（２００２年 ））はＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）標的のsiＲＮＡのでの単一ミスマッチではいくらかの活性を失うだけであるが、他のＨＩＶＶＩＦ標的のsiＲＮＡは殆ど全ての活性を失うこと見いだした。しかし４重突然変異により活性が完全に無効になった。完全な活性無効化の他例はそれぞれ５、６及び７重突然変異を用いて、ギトリン等（Gitlin et al.）（（ギトリン、エル（Gitlin, L.）、カレルスキー、エス（Karelsky, S.）、アンジイノ、アールAndino, R）、“ヒト細胞における短い妨害ＲＮＡによる細胞内抗ウイルス免疫授与”（Short interfering RNA confers intracellular antiviral immunity in human cells）、ネーチャー（Nature）、４１８巻、４３０−４３４頁、（２００２年）、クラール等（Klahre et al）（クラール、ユー（Klahre, U.）、クレテ、ピー（Crete, P.）、ロウエンベルガー、エスエイ（Leuenberger, S. A.）、イグレシアス、ブイエイ（Iglesias, V. A.）、メインス、エフジュニア（Meins, F. Jr.）、“植物における高分子量ＲＮＡと小さい妨害ＲＮＡによる浸透性転写後遺伝子サイレンシング誘導”（High molecular weight RNAs and small interfering RNAs induce systemic posttranscriptional gene slicing in plants）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sice. USA）、９９巻、１１９８１−１１９８６頁（２００２年）及びガラス等（Garrus et al.）（ガラス、ジェイイー（Garrus, J. E.）、ホンシュベルダー、ユーケイ（von Schedler, U.K.）、ポルニヨス、オーダブリュ（Pornillos, O.W.）、モルハム、エスジー（Morham, S.G.）、ザビッツ、ケイエッチ（Zavitz, K.H.）、ウオン、エッチイー（Wang, H.E.）、ウエットスタイン、ディエイ（Wettstein, D.A.）、ストレイ、ケイエム（Stray, K.K.）、コーツ、エム（Cote, M.）、リッチ、アールエル（Rich, R.L.）ミスズカ、ディジー（Myszka, D.G.）、サンドキスト、ダブリュアイ（Saundquist, W.I.）、“Ｔｓｇ１０１と液胞タンパク質の選別経路はＨＩＶ−１発芽に不可欠である”（Tsg101 and the vacuolar protein sorting pathway are essential for HIV-1 budding）、セル（Cell）、１０７巻、５５−６５頁（２００１年））に見られる。ブートラ等（Boutla et al.）と本発明者のグループ（ブートラ等（Boutla et al.）、“ショウジョバエにおける短鎖５‘位リン酸化二本鎖ＲＮＡによるＲＮＡ妨害の誘導”（Short 5'-phosphorylated double-stranded RNAs induce RNA interference in Drosophila）、カレントバイオロジー（Current Biol.）、１１巻、１７７６−１７８０頁、（２００１年）、エルバシャー等（Elbashir et al.）、“キイロショウジョバエ胚溶解物における有効ＲＮＡi仲介に関するsiＲＮＡの機能分析”（Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate）、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）２０巻、６８７７−６８８８頁、（２００１年））が用いた中央の二重突然変異は１７個の塩基対だけのsiＲＮＡを用いたユー等（ユー、ジェイワイ（Yu, J.Y.）、ドゥルーター、エスエル（DeRuiter, S.L.）、ターナー、ディエル（Turner, D.L.）、“哺乳類細胞における短い妨害ＲＮＡとヘアピンＲＮＡ発現によるＲＮＡ妨害（RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sice. USA）、９９巻、６０４７−５２頁（２００２年）及びウイルダ等（Wilda et al.）（ウイルダ、エム（Wilda, M.）、フックス、ユー（Fuchs, U.）、ウオスマン、ダブリュ（Wossmann, W.）、ボルクハート、エイ（Borkhardt, A.）、”ＲＮＡ妨害（ＲＮＡi）によるＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子を持つ白血病細胞の死滅（Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference (RNAi)）“、オンコーゲン（Oncogene）、２１巻、５７１６−２４頁（２００２年））でも重度の活性損失をもたらした。興味深いことに本発明者の非常に活性名末端メチル化siＲＮＡに照らしても、トゥシュルの報告では完全に２’位水酸基をメチル化siＲＮＡは不活性である。

更に単一突然変異による活性無効化について二つの報告がある。しかしその一つのブラメルカンプ等（Brummelkamp et al.）（ブラメルカンプ、ティアール（Brummelkamp, T.R.）、バーナード、アール（Bernards, R.）、アガミ、アール（Agami, R.）、“哺乳類細胞における短い妨害ＲＮＡの安定発現系（A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells）”、サイエンス（Science）、２９６巻、５５０−３頁（２００２年））の研究ではダイサー作用によるsiＲＮＡ産生を仮定する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（パディソン、ピージェイ（Paddison, P.J.）、コーディ、エイエイ（Caudy, A.A.）、バーンステイン、イー（Bernstein, E.）、ハノン、ジージェイ（Hannon, G.J.）、コンクリン、ディエス（Conklin, D.S.）、“哺乳類における短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）による配列特異的サイレンシングの誘導（Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells）”、ジーンデベロプメント（Genes Dev.）、１６巻、９４８−５８頁（２００２年））を使用している。このｓｈＲＮＡ作成物はｓｈＲＮＡの仮想第二ヌクレオチドの単回突然変異か仮想第九ヌクレオチドでの単一ミスマッチのいずれかにより不活性化した。一方ギトリン等（Gitlin et al.）（ギトリン、エル（Gitlin, L.）、カレルスキー、エス（Karelsky, S.）、アンジイノ、アールAndino, R）“ヒト細胞における短い妨害ＲＮＡによる細胞内抗ウイルス免疫授与”（Short interfering RNA confers intracellular antiviral immunity in human cells）、ネーチャー（Nature）、４１８巻、４３０−４３４頁、（２００２年））は、センス鎖の５‘位末端から数えてsiＲＮＡの第六ヌクレオチドか第九ヌクレオチドのいずれかでゲノムＲＮＡ上標的位での単一突然変異を含むsiＲＮＡ耐性ポリオウイルスを単離することにより単回突然変異による不活性化の場合をより強く議論している。結局異なるsiＲＮＡにより不活性化の程度も違う。

もともと核酸の化学修飾はとりわけ一本鎖核酸配列を核酸分解酵素分解を防ぐのに用いられており、その結果寿命のより長い配列が得られる。例えばＷＯ９１／１５４９９ではアンチセンスプローブとして有用な２‘−Ｏ−アルキルオリゴヌクレオチドを開示している。又２−Ｏアルキル化がハンマーヘッド型リボソームの安定化に用いられた。（アマルヅギオウイ、エム（Amarzguioui, M.）、ブレーデ、イー（Brede, G）、ババイー（Babaie E）、グロトリ、エム（Grogli, M）、スプロート、ビー（Sproat, B）、プリッツ、エッチ（Prydz, H）、“リボソーム用標的部位選択におけるツールとしてのｍＲＮＡの二次構造の推定と体外接近の可能性（Secondary structure prediction and in vitro accessibility of mRNA as tools in the selection of target sites for ribozymes）”、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Res.）、２８巻、４１１３−４１２４頁（２０００年））。しかしsiＲＮＡの化学修飾の影響については殆ど知られていない。更に５’位末端ヌクレオチドの２’位水酸基に大きな置換基が存在するとsiＲＮＡ活性に必要なことが示されたsiＲＮＡの適切なリン酸化を妨害するかもしれない。（ニカネン、エイ（Nykanen, A.）、ヘイリー、ビー（Haley, B.）及びザモーア、ピーディ（Zamore, P.D.）、“ＲＮＡ妨害経路におけるＡＴＰの必要性と小さいな害ＲＮＡ構造（ATP Requirement and Small Interfering RNA Structure in the RNA Interference Pathway）”、セル（Cell）、１０７巻、３０９−３２１頁（２００１年））。

組織因子と転移
現在癌は死の主原因のままであり、しばしば転移に帰結する。転移過程で腫瘍コロニーが最初の腫瘍（一次腫瘍）から脱離し、全身に広がった悪性細胞により確立する。転移形成は非常に複雑なプロセスであり、悪性細胞の一次腫瘍からの脱離、細胞外基質の侵入、内皮基底膜の侵入による体腔と血管へ入り、血液により運ばれた後の標的臓器への浸潤に依存する。最後に標的位での新規腫瘍の成長は血管新成に依存する。一次腫瘍を手術により除去できるが、手術処置後転移性沈着物が残ったり、一次腫瘍残遺物により発生する危険性が常にある。それ故転移防止が可能で癌患者に効果的治療を提供できる抗転移薬の必要性がある。

組織因子（ＴＦ）は主として血液凝固の強力な引き金としてしられた膜結合糖タンパク質であり（カメラー、イー（Camerer, E）、コルスト、エイビー（Kolsto AB）、プリッツ、エッチ（Prydz, H）、“組織因子の細胞生物学、血液凝固の主開始剤（Cell biology of tissue factor, the principal initiator of blood coagulation）、トロンボリサーチ（Rhromb Res.）、８１巻、１−４１頁（１９９６年））、動脈硬化プラークの破裂による動脈血栓症発生手段となる。通常ＴＦは循環で可溶な形も因子ＶＩＩ／ＶＩＩや他凝固因子含有血漿タンパク質に利用できる形では見いだせない。血管区画でのＴＦの発現は通常播種性血管内凝固症候群か局所凝固の開始をもたらす。

いくつの報告は又ＴＦが癌主導の血管新成と転移で主な役割を果たすことを示唆する。（ラッフ、ダブリュ（Ruf, W）及びミューラー、ビーエム（Mueller, B.M.）、“癌血管新成と転移における組織因子（Tissue Factor in cancer angiogenesis and metastasis）”、血液学における現在の見解（Current Opinion in Hematology）”、３巻、３７９−３８４頁（１９９６年）、大田等（Ohta, et al.）、“前立腺癌における臨床兆候と血管新成関連組織因子の発現（Expression of Tissue Factor in Associated with Clinical Features and Angiogenesis in Prostate Cancer）”、アンチキャンサーリサーチ（Anticancer Research）、２２巻、２９９１−２９９６頁（２００２年）、ブロンベルグ等（Bromberg et al.）、“組織因子による血液凝固から独立な経路によるメラノーマ転移の促進（Tissue Factor promotes melanoma metastasis by a pathway independent of blood coagulation）”、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、９２巻、８２０５−８２０９頁（１９９５年）、コニグスベルグ等（Konigsbert et al.）、“ＴＦとＶＩＩの複合体：臨床的意義、構造―機能関係及び前兆におけるその役割及び転移（The TF:VIIa Complex: Clinical Significance, Structure-function Relationship and its Role in Signaling and Metastasis）、トロンボヘモスタシス（Thromb Haemost.）、８６巻、７５７−７７１頁（２００１年））。

ザング等（Zhang et al.）（ザング等（Zhang et al.）、ジャーナルオブクリニカルインベスティゲーション（J. Clin. Invest.）、９４巻、１３２０−１２３７頁（１９９４年）はＴＦがＭｅｔｈ Ａ肉腫細胞のセンスＴＦｃＤＮＡ作成物とアンチセンスＴＦｃＤＮＡ作成物を用いた実験に基づいて腫瘍血管新成に影響すること示唆した。その一方でトゥーミー等（Toomey et al.）腫瘍の成長と腫瘍由来ＴＦの有無との間には関係がないと結論した。（トゥーミー等（Toomey et al）、“マウスの組織因子欠損の影響と腫瘍発達（Effect of tissue factor deficiency on mouse and tumor development）“、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、９４巻、６９２２−６９２６頁（１９９７年）。しかし他者は種々の組織因子阻害剤が転移減少能を持つと報告した。（フー及びガレン（Hu and Garen）、”前立腺癌のマウスモデルにおける免疫治療用組織因子による腫瘍血管内皮細胞と腫瘍細胞の標的化（Targeting tissue factor on tumor vascular endothelial cells and tumor cells for immunotherapy in mouse models of prostatic cancer）“、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、９８巻（２１号）、１０１８０−１２１８５頁（２００１年）、アミルクホスラビ、エイ等（Amirkhosravi A. et al.）。”組織因子経路阻害剤によるＢ１６メラノーマの実験的肺転移の減少（Tissue Factor Pathway Inhibitor Reduces Experimental Lung Metastasis of B16 Melanomas）“、トロンボヘモスタシス（Thromb Haemost.）、８７巻、９３０−９３６頁（２００２年））。ＴＦの転移能の機構については未だ未知であるが、ブロンベルグ等（Bromberg et al.）はＴＦの細胞外領域とＶＩＩaと形成の複合体のリン酸化がＴＦの転移効果に必要であることを見いだした。（ブロンベルグ等（Bromberg et al.）、“転移における組織因子の役割：分子の細胞質領域と細胞外領域の機能（Role of Tissue Factor in Metastasis: Functions of the Cytoplasmic and Extracellular Domains of the Molecule）、トロンボヘモスタシス（Thromb Haemost.）、８２巻、８８−９２６頁（１９９９年））。

ＴＦと転移間の相関にかんする種々の報告にもかかわらず、現在の所ＴＦ阻害に基づく抗転移薬は利用できない。従って癌患者の転移を防ぐためにＴＦを調節したりサイレンス化させる方法が明らかに必要である。本発明者は以下の詳細説明と実施例から明らかなように、ＴＦに向かうsiＲＮＡ分子が転移防止に驚くほど有効であることを見出した。

ＴＦサイレンシングでのsiＲＮＡの使用
特許出願ＷＯ０１／７５１６４（Ａ２）で体外系のショウジョバエを用いてｄｓＲＮＡを長さがＲＮＡセグメント２１−２３ヌクレオチド（nt）に加工することが示され、この２１−２３ｎｔ断片がＲＮＡ分解の特異的メディエーターであることを開示した。カプレン等（Caplan et al.）はＣＡＴ遺伝子と線虫―unc２２遺伝子標的の合成siＲＮＡが脊椎動物と無脊椎動物それぞれでの発現を減少することを報告している。（カプレン、エヌジェイ等（Caplan, N.J et al.）、”無脊椎動物と脊椎動物系における小さな二重鎖ＲＮＡによる遺伝子発現の特異的阻害”（Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、９８巻（１７号）、９７４２―４７頁（２００１年））。しかしＷＯ０１／７５６４も前出のプラン等（Caplan et al.）（２００１年）のいずれも哺乳類のＴＦ発現を直接調節できるsiＲＮＡに関しては何も開示していない。ジャノブスキー（Janowsky）とシュベンザー（Schwenzer）（１９９８）はオリゴヌクレオチド促進者によるハンマーヘッド型リボソームの活性化を、とりわけハンマーヘッド型リボソーム作成物とｈＴＦ標的オリゴヌクレオチドプロモーターを例示した報告をしている。（ジャノブスキー（Janowsky, E,）及びシュベンザー（Schwenzer, B.）、”オリゴヌクレオチドプロモーターによりンマーヘッド型リボソームが多回ターンオーバー活性を持つ長いＲＮＡ基質を切断する能力（Oligonucleotide facilitators enable a hammerhead ribozyme to cleave long RNA substrates with multiple-turnover activity）、“ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）、２５４巻、１２９−１３４頁（１９９８年））。しかしジャノブスキー（Janowsky）とシュベンザー（Schwenzer）が用いたハンマーヘッド型リボソームとオリゴヌクレオチドプロモーターによる遺伝子発現の阻害機構（ジャノブスキー（Janowsky, E,）及びシュベンザー（Schwenzer, B.）、１９９８年、前出）はsiＲＮＡがＴＦコード化遺伝子のようないずれの遺伝子発現を阻害する機構とは明らかに異なる。

抗体に関する予備研究以外では臨床的に有用なＴＦの直接的阻害剤は利用できず、又遺伝子発現レベルで有効に調節もできない。植物の導入遺伝子サイレンシングに関する研究により遺伝子表現抑止にむしろ一般的な機会をもたらし、ｄｓＲＮＡは例えば植物、線虫やショウジョバエの遺伝子サイレンシングでの日常的ツールとしてすでに確立されている。（クレメンス等（Clements, J.C. et al.）、“二重鎖ＲＮＡ妨害の利用によるショウジョバエ株化細胞の信号変換経路分析（Use of double-stranded RNA interference in Drosophilla cell lines to dissect signal transduction pathways）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、９７巻、６４９９−６５０３頁（２０００年））。しかしｄｓＲＮＡは不確定な効果のため哺乳類には使用できない。更に全ての遺伝子表現は一般には例えばオリゴヌクレオチド（合成鎖）、リボソームやsiＲＮＡ分子を用いて抑止できるが、siＲＮＡが高度に位置依存であるため、特定の遺伝子抑止に活性な一つ以上のsiＲＮＡ合成にどの部分のｍＲＮＡ配列を使用すべきかを見いだすのは非常に困難である。この点は更にハーボース等（Harborth et al.）による報告からも支持され,（ハーボース等（Harborth et al.）、”小さな妨害ＲＮＡ使用による培養哺乳類細胞における必須遺伝子の同定（Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs）“、ジャーナルオブセルサイエンス（J. Cell Science）、１１４巻、４５５７−４５６５頁（２００１年））。異常な特性を何も見ることなしに、同一遺伝子の異なる配列に向かうsiＲＮＡ配列が全く異なる効率で作用することになった。更にｍＲＮＡ標的上の部位がリボソームに差別的に接近できるが（アマルヅギオウイ、エム（Amarzguioui, M.）、ブレーデ、イー（Brede, G）、ババイー（Babaie E）、グロトリ、エム（Grogli, M）、スプロート、ビー（Sproat, B）、プリッツ、エッチ（Prydz, H）、“リボソーム用標的部位選択ツールにおけるｍＲＮＡ二次構造の推定と体外接近の可能性（Secondary structure prediction and in vitro accessibility of mRNA as tools in the selection of target sites for ribozymes）”、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Res.）、２８巻、４１１３−４１２４頁（２０００年））、毒性が殆どないか全くなしにＴＦに対して実際に有効なリボソームを同定する努力は未だ成功していない。

最近ＴＦに向かうsiＲＮＡ分子はＴＦ活性を調節し、ＴＦ減少活性は非常に配列特異的であることが示された。（ＰＣＴ／ＮＯ０３／０００４５、ホレン、ティ等（Holen, T. et al）、“ヒト凝固引き金ね組織因子を標的とする短い妨害ＲＮＡの位置効果（Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Res.）、３０巻、１７５７−１７６６（２０００年））。siＲＮＡを用いてＴＦを阻害しその結果転移を防ぐことは癌治療の有望な方法の構成要素となるであろう。

本発明の目的はＲＩＳＣと共に哺乳類のＴＦ発現を直接調節でき、その結果転移情報を防ぐsiＲＮＡを提供することである。これらの目的は取り入れた特許請求の範囲で特徴づけられる本発明で達成される。通常本発明は二重鎖か一重鎖で少なくとも１９個のヌクレオチドを含み、このsiＲＮＡがＴＦの遺伝子発現を調節できる短い妨害ＲＮＡ分子に関する。

siＲＮＡは配列特異的ＲＮＡ分解を引き起こす時に重要な中間体として働くことが示された約２１−２５個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。最近ＴＦに対するsiＲＮＡはRNAseＩＩＩ類似ＲＮＡi開始剤ダイサーを迂回し、ＴＦｍＲＮＡが分解するようエフェクター核酸分解酵素ＲＩＳＣに直接命令することが示された。（ＰＣＴ／ＮＯ０３／０００４５）。又同じ標的でも異なるsiＲＮＡ効率は変化し、その結果siＲＮＡはＴＦｍＲＮＡの異なる部位を標的に合成され、ＲＩＳＣと一緒になってＴＦｍＲＮＡを特異的分解／サイレンシングに導くことが示された。

本発明者はマウスモデルの腫瘍でＴＦ標的siＲＮＡ分子により悪性細胞能力が減少し体内で新規腫瘍が定着形成することを見いだした。siＲＮＡの全身注入後ＴＦ標的siＲＮＡによる転移減少効果が示された。従ってＴＦ標的siＲＮＡ分子は脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトの癌の転移防止と治療に有効である。

より具体的には本発明は転移防止用薬組成の作成にＴＦ標的の短い妨害ＲＮＡ（siＲＮＡ）を使用することに関する。更に本発明の核酸配列又はその断片をコード化した組織因子（ＴＦ）標的の二重鎖か一重鎖siＲＮＡを使用すること関し、そのsiＲＮＡ分子を
（a）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７で、その補体がＳＥＱ ＩＤＮＯ４８―ＳＥＱ ＩＤ ５３で示される核酸配列を持つsiＲＮＡ分子、
（ｂ）約９０％が（a）のsiＲＮＡ分子に相同な配列を持つsiＲＮＡ分子、
（ｃ）補体がＳＥＱ ＩＤＮＯ４８―ＳＥＱ ＩＤ ５３であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７の５‘位又は３’位末端方向のいずれかで、ヌクレオチド７個までシフトした標的部位を持つ配列に妥協したsiＲＮＡ分子、
（ｄ）約９０％が（ｃ）のsiＲＮＡ分子と相同なる配列を持つsiＲＮＡ分子、及び
（e）（a）―（ｄ）の核酸配列を持つsiＲＮＡ分子で、配列がＣ_１−Ｃ_３アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_３アルケニル基又はＣ_１−Ｃ_３アルキリル基を配列の一つ以上の２‘位ＯＨ水酸基に導入するか及び／又はリン酸ジエステル結合をチオリン酸エステル結合で置換して修飾しりことからなる一群から選ぶ。

本発明の転移防止へのsiＲＮＡ使用により、より良くより効果的な癌治療が提供でき、好ましくは生存率の増加をもたらす。好ましくはこのsiＲＮＡは二重鎖である。

このsiＲＮＡはＴＦｍＲＮＡ、より好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１かＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２で特定のＴＦｍＲＮＡの開裂を誘導する。

本発明の他様態によるとこの組成は長さ２１−２５個のヌクレオチド、より好ましくは長さ２１個のヌクレオチドで且つもっと好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８で特定のsiＲＮＡを含む。

本発明の更なる他様態ではsiＲＮＡは脊椎動物起源、好ましくは哺乳類起源、もっと好ましくはヒト起源のＴＦ又はその断片を標的とする。

更に他様態によると好ましくはsiＲＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８で示すsiＲＮＡ分子の約９０％が相同な配列を含有するか、siＲＮＡがＣ_１−Ｃ_３アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_３アルケニル基又はＣ_１−Ｃ_３アルキリル基を一つ以上の２‘位ＯＨ水酸基に導入したＳＥＱＩＤＮＯ１及びＳＥＱＩＤＮＯ８で示す配列を含む。好ましくはsiＲＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１で示す配列を有する。

更に他様態によると好ましくはこのsiＲＮＡ分子はリン酸ジエステル結合がチオリン酸エステル結合で置換されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８で示す配列を含む。好ましくは修飾配列は補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４０の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４、補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４４のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８又は補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４５のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２９である。

更に本発明は又例えば転移機構やＴＦの役割研究の研究手段として利用できる新規マウスsiＲＮＡ配列を提供する。本発明の好ましい様態によるとsiＲＮＡは補体がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５３であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７で示す核酸配列を有する。

本発明により作成した組成は更に例えば希釈剤、潤滑剤、結合剤、担体、崩壊手段、吸収手段、着色剤、甘味剤及び／又は風味剤を含有できる。好ましくはこの組成は補助剤及び／又は他の治療方式を含む。

更に他の様態ではこの組成を例えば非経口（例えば皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内注入か点滴）、経口、経鼻、頬側、直腸、膣投与及び／又は吸入やガス吸入投与できる。より好ましくは組成は例えば在来の無毒性薬剤容認の担体、補助剤及び／又は媒体含有の用量処方で、点滴溶液や点滴懸濁液、エアロゾル、カプセル、錠剤、丸薬、噴霧、座薬などとして処方できる。組成は一回用量、分割用量で又は持続性放出器具により、好ましくは単独か他の薬と一緒に投与できる。

本発明法による投与経路は例えば非経口（例えば皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内注入か点滴）、経口、経鼻、頬側、直腸、膣投与及び／又は吸入やガス吸入投与がある。
ここで用いた用語“二重鎖”とはセンス鎖とアンチセンス鎖の両者を持つ核酸分子を意味する。このセンス鎖とアンチセンス鎖は同一核酸分子からでも或いは二つの核酸分子から構築し且つリンカー分子（例えばポリヌクレオチドリンカーか非ヌクレオチドリンカー）で共有結合しても良い。

ここで用いた用語“核酸分子”、“オリゴヌクレオチド”や“核酸塩基オリゴマー”とはいずれかのヌクレオチド鎖か核酸擬態鎖を意味する。この定義に修飾と非修飾の両者で天然及び非天然オリゴヌクレオチドを含む。

更に“薬剤容認の担体”とは治療哺乳類に生理学的に容認され、投与化合物の治療物性が保持される担体を意味する。薬剤容認担体の一典型物質は生理食塩水である。他の生理学的容認担体とその処方は技術の熟知者には既知であり、例えばゲネロ、エイ（Gennaro,.）編、レミントンの医薬品科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（２０版）、リピンコット（Lippincott）、ウイリアムスアンドウイルキンス（Williams & Wilkins）、フィラデルフィア（Philadelphia）、ペンシルバニア州（PA）に記載されている。

ここで用いた“減少か阻害”とはタンパク質かオリゴヌクレオチドレベルで参照試料（例えばsiＲＮＡで処理していない試料）に比し全体での減少が好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上起こる能力を意味する。このＲＮＡ発現かタンパク質発現の減少又は阻害は標的ｍＲＮＡの開裂か分解により起こる。タンパク質発現や核酸発現用アッセイは技術的に既知であり、例えば酵素結合吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質発現用ウェスタンブロット分析、ＤＮＡ分析用サザンブロット法かＰＣＲ及びＲＮＡ用ノーザンブロット法かRNase保護アッセイを含む。“減少や阻害“は又ＴＦの生物活性が全体で好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上減少することを意味する。ＴＦ活性用アッセイは技術的に既知で、体外凝固アッセイ、一段凝固アッセイ、二段凝固アッセイ、ＴＦ凝固時間アッセイ及びプロトロンビン時間アッセイを含む。

ここで用いた“小さな妨害ＲＮＡ”や“siＲＮＡ”は崩壊標的遺伝子やｍＲＮＡの同定に用いる好ましくは長さ１０個以上のヌクレオチド、より好ましくは長さ１５個のヌクレオチド、最も好ましくは長さ１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドの単離ＲＮＡ分子を意味する。１９乃至２５個範囲のヌクレオチドがsiＲＮＡとして最も好ましいサイズである。siＲＮＡとしては又siＲＮＡ二本鎖の両鎖を単一ＲＮＡ分子内に含む短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も含むことができる。二重鎖siＲＮＡは通常センス鎖とアンチセンス鎖からなる。一重鎖siＲＮＡは通常標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖からなる。siＲＮＡとしてはいずれの形のＲＮＡ、好ましくはｄｓＲＮＡ（より大きなｄｓＲＮＡのタンパク分解的開裂産物、部分的精製ＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み替え産生ＲＮＡ）、更には一つ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換及び／又は変更により天然に存在のＲＮＡとは異なる変質ＲＮＡを含む。この変質は２１乃至２３ヌクレオチドＲＮＡの一つ以上の末端や内部（ＲＮＡ中の一つ以上のヌクレオチド）での非ヌクレオチド材の付加を含む。好ましい実施形態ではＲＮＡ分子は３‘位水酸基を含有する。本発明のＲＮＡ分子でのヌクレオチドは又非天然に存在のヌクレオチドやデオキシリボヌクレオチドを含む非標準ヌクレオチドを含むことができる。二重鎖オリゴヌクレオチドは例えばチオリン酸エステル、ジチオリン酸エステルのような修飾バックボーンや技術的に既知の他修飾バックボーン含むことができ、又非天然ヌクレオシド内結合も含むことができる。全体でこの変質ＲＮＡの全てを修飾siＲＮＡと呼ぶ。

本発明のsiＲＮＡはＲＮＡiの仲介能を持つことで天然ＲＮＡと十分類似している必要である。ここで用いた“ＲＮＡiの仲介“とはどのＲＮＡが分解するかを区別又は同定する能力を意味する。

好ましくはＲＮＡiは細胞のＴＦ発現を少なくとも１０％、２０％、３０％か４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％か７０％、最も好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％以上減少できる。好ましい一実施形態では短い２１、２２，２３，２４か２５ヌクレオチド二重鎖ＲＮＡを用いてＴＦ発現を下方制御する。このようなＲＮＡは哺乳類組織培養株細胞の遺伝子発現を下方制御するのに有効である。（参考文献としてここに組み入れたエルバシャー等（Elbashir et al.）、ネーチャー（Nature）、４１１巻、４９４−４９８頁（２００１年））。

ここで用いた“ｓｈＲＮＡ”とはｍＲＮＡに相補的な二重鎖領域含有ＲＮＡを意味する。例えば短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は二重鎖の長さが１９と２９個の塩基の間で、鎖が一重鎖の３，４，５、６，７，８，９か１０塩基リンカー領域で分離されたヌクレオチド含有二重鎖領域を含む。最適にはリンカー領域は長さ６個の塩基である。

ここで用いた“組織因子タンパク質”とは長さ又はいずれかの哺乳類ＴＦ又はＴＦ前駆体分子と実質的に同一の翻訳後修飾（例えばグリコシル化やリン酸化）と関係なく、いずれかのアミノ酸鎖を意味する。例えばジェンバンク受入番号ＡＡＨ１１０２９（ヒト）、ＮＰ００１９８４（ヒト）、Ｐ２０３５２（マウス）、ＡＡＨ２４８８６（マウス）、ＡＡＨ１６３９７（マウス）、Ｐ４２５３３（ラット）、Ｐ３０９３１（ウシ）、Ｑ９ＪＬＵ８（モルモット）を参照。ＴＦは外因経路を通して血液凝固を引き起こせる内在性膜糖タンパク質である。（バッチ等（Bach et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５６巻、８３２４−８３３１（１９８１年））。ＴＦはタンパク質成分（以前はＴＦアポタンパク質―ＩＩＩと呼ばれた）とリン脂質からなる。（オステルッド及びブローズ等（Osterud and Rapaport）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、７４巻、５２６０−５２６４頁（１９７７年））。種々の臓器や種のＴＦは４２０００乃至５３０００の相対分子量を有すると報告されている。ＴＦの精製もヒト脳（グハ等（Guha et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、８３巻、２９９−３０２頁（１９８６年）及びブローズ等（Broze et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６０巻、１０９１７−１０９２０（１９８５年））、ウシ脳（バッチ等（Bach et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５６巻、８３２４−８３３１（１９８１年））、ヒト胎盤（ボム等（Bom et al.）、トロンボシスリサーチ（Thrombosis Res.）、４２巻、６３５−６４３頁（１９８６年）及び安藤等（Andoh et al.）、トロンボシスリサーチ（Thrombosis Res.）、４２巻、６３５−６４３頁（１９８６年））、ヒツジ脳（カールソン等（Carlson et al.）、トロンボスヘマトスタシス（Thromb. Haemostas.）、４８巻、３１５−３１９頁（１９８６年））及び肺（グラス及びアストラップ（Glas and Astrup）、アメリカンジャーナルオブフィジオロジー（Am. J. Physiol.）、２１９巻、１１４０−１１４６頁（１９７０年））のような種々な組織で報告されている。ウシ組織とヒト組織トロンボプラスチンはサイズ、機能共に同一あることが報告された。（例えばブローズ等（Broze et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６０巻、１０９１７−１０９２０（１９８５年）参照）。ＴＦタンパク質構造には種間で相違があるが、体外凝固アッセイ測定では機能上差はないことが広く認められている。ここで用いるようにＴＦはＴＦ生物活性を有するここに記載の種や組織のいずれかのＴＦタンパク質を含む。ＴＦ生物活性は技術的に既知のいくつかのアッセイのいずれかにより測定できる。非制限の例としては体外凝固アッセイ、一段凝固アッセイ、二段凝固アッセイ（ピトリック及びネマーソン（Pitlick and Nemerson）、メソッドエンザイモロジー（Methods Enzymol.）、４５巻、３７−４８頁（１９７６年））、ＴＦ凝固時間アッセイ（サンタッシ等（Santucci et al.）、トロンボスヘマトスタシス（Thromb. Haemostas.）、８３巻、４４５―４５４頁（２０００年））及びプロトロンビン時間アッセイが含まれる。

“組織因子核酸”とは哺乳類ＴＦ、ＴＦ前駆体核酸分子或いは上記のＴＦタンパク質のいずれをもコード化する核酸分子のいずれかと実質的に同一である核酸分子（例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）を意味する。例えばジェンバンク受入番号Ｍ１６５５３（ヒト）、ＢＣ０１１０２９（ヒト）、ＮＭ０１９９３（ヒト）、ＡＦ５４０３７７（ヒト）、Ｕ０７６１９（ラット）、Ｍ５７８９６（マウス）及びＭ５５３９０（ウサギ）を参照。

更にここで用いた用語“治療する”か“治療”とは予防目的及び／又は治療目的用化合物か薬組成を投与することを意味する。“病気を治療”することや“治療処置”への使用とは病気をすでに患っている被験者に投与処置をして被験者の状態を改善することを意味する。好ましくは被験者は凝固障害か転移の可能性のある腫瘍を患っていると診断されている。“疾患を防止する”とはまだ病気ではないが、特定の病気に感染するか進行する危険がある被験者の予防治療を意味する。一例では被験者が凝固障害や以前の心疾患についての家族歴を基に凝固障害発症の危険があると判定する。他例では被験者が悪性腫瘍があると診断された場合、被験者は腫瘍転移に進行する危険があると判定する。従って特許請求の範囲と実施形態では治療するとは治療目的か予防目的のいずれかで哺乳類に投与することである。

“腫瘍”とは急速で抑制不能な細胞増殖により成長し、新規成長を開始した刺激が停止後も成長を続ける異常群の細胞や組織を意味する。腫瘍は構造機構と正常組織との機能的連携の一部又は完全な欠如を示し、通常良性か悪性かいずれかの明確な組織の塊を形成する。腫瘍の非制限の例としては膀胱腫瘍、血液腫瘍、骨腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、軟骨腫瘍、結腸腫瘍、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、リンパ節腫瘍、神経組織腫瘍、卵巣腫瘍、脾臓腫瘍、前立腺腫瘍、骨格筋腫瘍、皮膚腫瘍、脊髄腫瘍、脾臓腫瘍、胃腫瘍、睾丸腫瘍、胸腺腫瘍、甲状腺腫瘍、気管腫瘍、尿生殖路腫瘍、尿管腫瘍、尿道腫瘍、子宮腫瘍及び膣腫瘍がある。

“転移”とはガン細胞が身体の最初の部位から他部位に広がることを意味する。転移形成は非常に複雑なプロセスであり、悪性細胞の一次腫瘍からの脱離、細胞外基質の侵入、内皮基底膜の侵入により体腔と血管へ入り、血液により運ばれた後標的臓器への浸潤に依存する。最後に標的部位での新規腫瘍の成長は血管新成に依存する。腫瘍転移は腫瘍細胞や構成物が残り転移の可能性が広がるので、一次腫瘍を除去後でもしばしば起こる。

本発明の他の特性と利点は好ましい実施形態の以下の記載と特許請求の範囲から明らかになる。

本発明を図面と実施例との関連でより詳細に説明する。
図１は、siＲＮＡ、レポーター作成物及び導入遺伝子発現のＲＮＡiを示す。a）ヒトＴＦ（ジェンバンク参加受入番号Ｍ１６５５３）ｍＲＮＡ内の八個所を標的とするsiＲＮＡ種のセンス（上側）鎖とアンチセンス（下側）鎖を示す。ｂ）ヒトＴＦのルシフェラーゼレポーター作成物及びｃ）同時形質移入アッセイのsiＲＮＡによるＲＮＡi（それぞれ３通りで、三回以上の独立実験の平均その標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す）。

図２は、ＨａＣａＴ細胞の標準同時形質移入アッセイでのsiＲＮＡの有効性を示す。異なる合成バッチのｈＴＦ１６７i siＲＮＡは同程度の有効性を示した。結果はそれぞれ三通りで少なくとも三実験の平均値である。

図３は、内因性ＴＦ発現のsiＲＮＡ仲介による減少を示す。a）ｈＴＦ１６７iとｈＴＦ３７２iは形質移入細胞のｍＲＮＡ開裂を誘導した。ＧＡＤＰＨを対照としてsiＲＮＡ（１００nＭ）によるＨａＣａＴ細胞の形質移入後、ＴＦｍＲＮＡのノーザン分析を行った。矢印はsiＲＮＡ作用で生じた開裂断片を示す。ｂ）定常状態のｍＲＮＡレベル（黒塗りバー）、凝血原活性（点線バー）及びＴＦタンパク質（抗原）発現（斜線バー）に対するsiＲＮＡ効果の測定ではsiＲＮＡがｍＲＮＡ、ＴＦ抗原レベル及び凝血原活性を減少することを示す。凝血原活性及び抗原の測定ではＴＦタンパク質半減期の７−８時間に順応するため、細胞をsiＲＮＡ形質移入後４８時間で回収した。データは三通りで代表的実験を示す。

図４は、ｈＴＦ１６７iの用量反応曲線を示す。

図５は、siＲＮＡ仲介によるＲＮＡiの時間依存性を示す。a）突然変異（Ｍ１とＭ２はそれぞれ一重と二重突然変異に関するが）をsiＲＮＡに導入すると、阻害活性は減少する。細胞を１００nＭ siＲＮＡで形質移入し、ｍＲＮＡ単離のため４時間、８時間、２４時間及び４８時間（それぞれ黒塗りバー、線入りバー、黒斑点付き白バー及び斜線バー）で回収した。発現レベルをＧＡＤＰＨに対して正規化し、全時間点で模擬形質移入細胞に対し標準化した。ｂ）ｍＲＮＡレベル（黒塗りダイアモンド）、レポーター遺伝子活性（白三角）及び（凝血原活性）（黒塗りバー）に関する阻害効果減衰の時間経過を示す。

図６は、siＲＮＡ修飾を示す。（Ａ）突然変異型と野生型バージョンのsiＲＮＡｈＴＦ１６７iを示す。野生型（ｗｔ）siＲＮＡのセンス鎖配列はヒト組織因子（受入番号Ｍ１６５５３）の位置１６７−１８７と一致する。一重突然変異体（ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４，ｓ７、ｓ１０、１２２、ｓ１３、ｓ１６）と二重突然変異体（ｄｓ７／１０、ｄｓ１０／１１、ｄｓ１０／１３、ｄｓ１０／１６）は全てセンス鎖の５‘位末端から数えた突然変異位置に基づいて名付けた。全での突然変異（太字）は野生型に関してＧＣ逆転である。（Ｂ）siＲＮＡｈＴＦ１６７iの化学修飾バージョンを示す。非修飾リボヌクレオチドは下段である。チオリン酸エステル結合は星印（＊）で示し、２’−Ｏ−メチル化リボヌクレオチドと２’−Ｏ−アリル化リボヌクレオチドはそれぞれ上段の正規太字と下線付き太字で示す。

図７は、内因性ｈＴＦｍＲＮＡに対する突然変異体活性を示す。ＨａＣａＴ細胞を形質移入後２４時間でｍＲＮＡ単離のために回収した。ＴＦ発現をＧＡＰＤＨ発現に対し正規化した。模倣形質移入細胞の正規化発現を１００％に設定した。データは少なくとも三つの独立実験の標準誤差付き平均である。

図８は、内因性ＴＦｍＲＮＡに対する化学修飾siＲＮＡ活性を示す。実験は図７に記載のように実施分析した。

図９は、化学修飾siＲＮＡによるＴＦサイレンシングの持続性を示す。Ａ）１００nＭ siＲＮＡの形質移入後５日での特異的ＴＦ発現を示す。Ｂ）ＴＦｍＲＮＡサイレンシングの時間経過を示す。１００n siＭＲＮＡの単一形質移入後１日目、３日目及び５日目で回収の細胞を示す。培地は二日目ごとに置換した。

図１０は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＴＦsiＲＮＡ形質移入Ｂ１６細胞の静脈注射の効果を示す。

図１１は、siＲＮＡの全身投与効果を示す。対照グループのマウスはＢ１６メラノーマ細胞で一回静脈注射した。試験グループマウスはＴＦ標的siＲＮＡを更に三回静脈注射した。これらの注射は細胞内注射一日前と三日後と六日後に行った。

発明の詳細な説明

腫瘍転移でのＴＦ役割の示唆はあるものの、ＴＦの診療に利用できる直接的阻害剤は未だ特定されていない。ＴＦがうまく遺伝子発現レベルで調節できその結果転移を防げるという明白な証拠もまだない。

本発明は腫瘍転移処置と防止に使用できるＴＦ標的のsiＲＮＡ含有組成を提供する。
ＲＮＡiはsiＲＮＡ導入により始まる転写後遺伝子サイレンシングの形である。短い２１乃至２５個のヌクレオチド二重鎖ＲＮＡは線虫（ザモーア等（Zamore, et al）、セル（Cell）、１０１巻、２５−３３頁（２０００年））や哺乳類組織培養株細胞（エルバシャー等（Elbashir et al.）、ネーチャー（Nature）、４１１巻、４９４−４９８頁（２００１年））で下方制御遺伝子発現に有効である。哺乳類でのこのやり方の更なる治療的有効性がマッカフリー等により更に体内で示された。（ネーチャー（Nature）、４１８巻、３８−３９頁（２００２年））。ＴＦのような哺乳類遺伝子の核酸配列を用いて使用の特異的２１乃至２５個のヌクレオチドＲＮＡ配列を持つＴＦ標的遺伝子を不活性化する小さな妨害ＲＮＡ（siＲＮＡ）をデザインできる。ＴＦを標的とするsiＲＮＡを、例えば治療薬として用いて凝固障害や転移腫瘍を防止するのに使用できる。

哺乳類遺伝子配列を備えた場合、siＲＮＡを興味の標的遺伝子が不活性化するようデザインし、ここに記載のように有効な遺伝子サイレンシングのために選別できる。ここに開示のsiＲＮＡ以外に追加のsiＲＮＡも標準法を用いてデザインできる。パッディソン等（Paddison et al.）が記述しているように短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も又ＲＮＡiに使用できる。（プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、９９巻、６０４７−６０５２頁（２００２）；ジーンアンドデベロプメント（Genes & Dev.）、１６巻、９４８−９５８頁（２００２年））。

種々のパラメーターが有望なＲＮＡi標的の同定に使用するが、最も有効なsiＲＮＡとｓｈＲＮＡ候補配列は経験的テストで同定される。このテストの一戦略は部分的５‘ＵＴＲ配列と３’ＵＴＲ配列含有の最大配列化ｃＤＮＡにより興味の組織因子を良く包含するベクターのコード化非オーバーラップ合成siＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡの大きなライブラリーを構築することである。組織因子のイントロンーエキソン構造についての知識やタックマン（Taqman）定量逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＲＣＰ）やＥＬＩＳＡアッセイにような標的ノックダウンの鋭敏な測定法が備る場合には、一旦形質移入と標的測定の条件を最適化するとsiＲＮＡかｓｈＲＮＡ選択プロセスは比較的容易である。

技術的に知られているようにヌクレオシドは核酸塩基―糖連結である。ヌクレオシドの塩基部は通常複素環塩基である。二つの最も共通種の複素環塩基はプリンとピリミジンである。ヌクレオチドはヌクレオシドの糖部と共有結合したリン酸エステル基を更に含むヌクレオシドである。ペンタフラノシル糖含有ヌクレオシドではリン酸エステル基は糖の２‘、３’又は５‘位水酸基のいずれかと結合できる。オリゴヌクレオチドが形成されると、リン酸エステル基は互いに隣接ヌクレオシドと共有結合し線状ポリマー化合物を形成する。順次この線状ポリマーの各末端が連結して環状構造を形成する。通常開放型線状構造が好ましい。オリゴヌクレオチド構造内ではリン酸エステル基は通常オリゴヌクレオチドのバックボーン形成に関する。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常結合かバックボーンは３’位リン酸ジエステル結合か５‘位リン酸ジエステル結合である。

本発明で用いるＲＮＡは好ましくは修飾バックボーンか非天然インターヌクレオシド結合含有オリゴヌクレオチドを含む。この明細書の定義では修飾バックボーンを持つオリゴヌクレオチドはバックボーンにリン原子を保持するものと、バックボーンにリン原子を保持しないものを含む。この明細書の目的にはヌクレオシド内バックボーンにリン原子を持たない修飾核酸塩基オリゴマーも核酸塩基オリゴマーと考える。

修飾オリゴヌクレオチドバックボーンを持つ核酸塩基オリゴマーの制限なしの例としては、例えばチオリン酸エステル、キラルチオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、３‘−アルキレンホスホン酸エステルとキラルホスホン酸エステルを含むメチル及び他アルキルホスホン酸エステル、ホスフィン酸エステル、３’−アミノアミドリン酸エステル及びアミノアルキルアミドリン酸エステルを含むアミドリン酸エステル、チオアミドリン酸エステル、チオアルキルホスホン酸エステル、チオアルキルリン酸トリエステル及び正常３‘―５’結合を持つホウ素リン酸エステル、この２‘−５’結合類似体及びこれらの逆転極性を持つものがあるが、ここでヌクレオシド単位の隣接対は３‘−５’と５‘−３’又は２‘−５’と５‘−２’と連結する。種々の塩、混合塩や遊離酸型も含む。このリン含有結合作成法は米国特許３，６８７，８０８、４，４６９，８６３．４，４７６，３０１、５，０２３，２４３，５，１７７，１９６，５，１８８，８９７，５、２６４、４２３，５，２７６，０１９，５，２７８，３０２，５，２８６，７１７，５，３２１，１３１，５，３９９，６７６，５，４０５，９３９，５，４５３，４９６，５，４５５，２３３、５，４６６，６７７，５，４７６，９２５，５，５１９，１２６，５，５３６，８２１，５，５４１，３０６，５，５５０，１１１，５，５６３，２５３，５，５７１，７９９，５，５８７，３６１及び５，６２５，０５０に開示のように技術の熟知者には既知であり、それぞれをここに文献として取り入れる。

リン原子を含有しない修飾バックボーンを持つ核酸塩基オリゴマーは、短鎖アルキルか環状アルキルヌクレオシド内結合、複素原子とアルキル又は環状アルキル混合のヌクレオシド内結合又は一つ以上の短鎖複素原子か複素環状ヌクレオシド内結合により形成したバックボーンを有する。これらとしてはモルホリン結合（一部ヌクレオシドの糖部と形成）、シロキサンバックボーン、スルフィド、スルホキシド及びスルホンバックボーン、ホルミルアセチル及びチオホルミルアセチルバックボーン、メチレンホルミルアセチル及びチオホルミルアセチルバックボーン、アルケン含有バックボーン、スルファミン酸バックボーン、メチレンイミノとメチレンヒドラジンバックボーン、スルホン酸塩とスルホンアミドバックボーン、アミドバックボーン及び窒素、酸素、硫黄原子混合成分部をもつその他のものがある。上記オリゴヌクレオチド作成法は、例えば米国特許５，０３４，５０６，５，１６６，３１５，５，１８５，４４４，５，２１４，１３４，５，２１６，１４１，５，２３５，０３３，５，２６４，５６２，５，２６４，５６４，５，４０５，９３８、５，４３４，２５７，５，４６６，６７７，５，４７０，９６７，５，４８９，６７７，５，５４１，３０７，５，５６１，２２５，５，５９６，０８６，５，６０２，２４０，５，６１０，２８９，５，６０２，２４０，５，６０８，０４６、５，６１０，２８９，５，６１８，７０４，５，６２３，０７０，５，６６３，３１２，５，６３３，３６０，５，６７７，４３７及び５，６７７，４３９が有り、それぞれをここに文献として取り入れる。
他の形のオリゴヌクレオチドで糖はヌクレオシド内結合、即ちバックボーンを両者の新規な基で置換する。この種分子の一つはペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ぶ。ＰＮＡ化合物はアミドバックボーン、より具体的にはアミノエチルグリシンバックボーンを含有する。核酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部のアザ窒素原子と直接又は間接的に結合する。この核酸塩基オリゴマーの作成法と使用法は、例えばニールセン、ピーイー編（Neilsen, P.E. Ed.）“ペプチド核酸：手順と応用（Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications）”、ホライゾン出版（Horizon Press）、ノーフォーク（Norfolk）、英国（United Kingom）、１９９９年に記載されている。ＰＮＡ作成法は例えば米国特許５，５３９，０８２、５，７１４，３３１及び５，７１９，１６２に開示されており、それぞれをここに文献として取り入れる。

本発明の特別な実施形態では核酸塩基オリゴマーはチオリン酸エステルバックボーンと複素原子バックボーンを持つヌクレオシドを有し、特に-HC₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-（メチレン（メチルイミノ）又はＮＭＩバックボーンとして知られている）、-CH₂-O-N(CH)₃-CH₂-、-CH₂-N(CH)₃-N(CH₃)-CH₂- 及び-O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-を有する。他の実施形態ではオリゴヌクレオチドは米国特許５，０３４，５０６に記載のようにモルホリンバックボーン構造を有する。

核酸塩基オリゴマーは一つ以上の置換糖基を含有できる。核酸塩基オリゴマーは２‘位に以下の物の一つを含有する。水酸基、フッ素原子、Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル、Ｏ−アルキルーＯ―アルキルでここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換Ｃ_１乃至Ｃ_１０アルキルかＣ_２乃至Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルである。特に好ましいのはO[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)nOCH_3、 O(CH₂)_nNH_2、 O(CH₂)_nCH_3、 O(CH₂)_nONH₂及び、O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]]₂であり、ここでｎとｍは１から約１０である。他の好ましい核酸塩基オリゴマーとしては２’位に以下の一つを含む物である。Ｃ_１−Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルキルアリル、アラルキル、Ｏ−アルキルアリルかＯ−アラルキル、チオール、チオメチル、イソシアネート、塩素原子、臭素原子、シアノ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、メチルスルホキシド、メチルスルホン、硝酸エステル、ニトロ、アミノ、複素シクロアルキル、複素シクロアルキルアリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、介入物、核酸塩基オリゴマーの薬物動態学的物性を改良する基、核酸塩基オリゴマーの薬力学的物性を改良する基及び類似物性を持つ他置換基がある。好ましい修飾としては２‘−Ｏ−メチル基及び２’−メトキシエトキシ基（2'-O-CH₂CH₂OCH₃、又２‘−Ｏ−（２−メトキシエチル）や２’―ＭＯＥとて知られる）がある。他の望ましい修飾には２‘―ＤＭＡＯＥと知られる２’−ジメチルアミノオキシエトキシ基（即ちO(CH₂)₂ON(CH₃)₂）がある。他の修飾としては２‘−アミノプロポキシ基（2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂）と２’−フルオロ基（２‘−Ｆ）が含まれる。同様の修飾又はオリゴヌクレオチドの他位、特に３’−末端ヌクレオチドの糖か２‘−５’連結オリゴヌクレオチドの糖の３‘位及び５‘末端ヌクレオチドの５’位でできる。オリゴヌクレオチドは又ペンタフラノシル糖の代わりにシクロブチル基のような糖模倣物でも良い。このような修飾糖構造の作成法は、例えば米国特許４，９８１，９５７，５，１１８，８００，５，３１９，０８０、５．３５９，０４４，５，３９３，８７８、、５，４４６，１３７，５，４６６，７８６、５，５１４，７８５，５，５１９，１３４，５，５６７，８１１，５，５７６，４２７，５，５９１，７２２，５，５９７，９０９，５，６１０．３００，５，６２７，０５３，５，６３９，８７３，５，６４６，２６５，５，６５８，８７３，５，６７０，６３３及び５．７００，９２０に開示され、それぞれの全体をここに文献として取り入れる。

オリゴヌクレオチドは又核酸塩基修飾又は置換を含んでも良い。ここで用いた“非修飾”か“天然“核酸塩基はプリン塩基のアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）及びピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）とウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基としては５−メチルシトシン（５―me―Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンとグアニンの６−メチル及び他アルキル誘導体、２−プロピル及び他アルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシルとシトシン、５−プロピニルウラシルとシトシン、６−アゾウラシル、シトシンとチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８―ハロ、８−アミノ、８−ヒドロキシチオ、８−チオアルキル、８−ヒドロキシ及び他の８位置換アデニンとグアニン、５−ハロ（例えば５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルと他の５位置換ウラシルとシトシン、７−メチルグアニンと７−メチルアデニン、８−アザグアニンと８−アザアデニン、７−デアザグアニンと７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンと３−デアザアデニンのような他の合成核酸塩基と天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基としては米国特許３，６８７，８０８に開示のもの、クロシュウイッツ、ジェイアイ編（Kroschwitz JI ed.）、簡潔ポリマー科学と工学百科事典（Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering）、８５８−８５９頁、ジョンウイリーアンドサンズ（John Wiley & Sons）、１９９０年に開示のもの、イングリッシュ等（Englisch）、アンゲバンテケミー、国際版（Angewandte Chemie, International Edition）、３０巻、６１３頁、１９９１年に開示のもの、サングヴィ、ワイエス（Sanghvi, Y.S.）、アンチセンス研究と応用（Anisense Research and Applications）、１５章、２８９−３０２頁、クルーク、エスティ及びレブルー、ビー編（Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed.）、ＣＲＣ出版（CRC Press）、１９９３年に開示のものが含まれる。これら核酸塩基のある物は本発明アンチセンスオリゴヌクレオチド結合能の増加に特に有用である。これとしては２−アミノプロピルアデニン、５−プロピルウラシル及び５−プロピルシトシンを含む５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換により核酸二本鎖の安定性が塩基対当たり０．１−１．２℃だけ増加し（サングヴィ、ワイエス（Sanghvi, Y.S.）、クルーク、エスティ（Crooke, S.T）及びレブルー、ビー編（Lebleu, B., ed.）、アンチセンス研究と応用（Antisense Research and Applications）、２７６−２７８頁、ＣＲＣ出版（CRC Press）、ボカラトン（Boca Raton）、１９９３年）、特に２‘−Ｏ−メトキシエチルか２’−Ｏ−メチル糖修飾と組み合わすと特に望ましい塩基置換であることが示された。上記修飾核酸塩基と同様に他のある修飾核酸塩基作成法は技術の熟知者には既知であり、例えば米国特許４，８４５，２０５，５，１３０，３０２，５，１３４，０６６，５，１７５，２７３，５，３６７，０６６，５，４３２，２７２，５，４５７，１８７，５，４５９，２５５，５，４８４，９０８，５，５０２，１７７、５，５２５，７１１，５，５５２，５４０，５，５８７，４６９，５，５９４，１２１，５，５９６，０９１，５，６１４，６１７，５，６８１，９４１及び５，７５０，６９２に開示され、それぞれをここに文献として取り入れる。

本発明の核酸塩基オリゴマーの他修飾としてはオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを増強する一つ以上の部分か複合物を核酸塩基オリゴマーと化学結合することがある。このような部分としては限定はされないがコレステロール部（レッツンガー等（Letsinger et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、８６巻、６５５３−６５５６頁（１９８９年））、コール酸（マノハラン等（Manoharan et al.）、バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Let.）、４巻、１０５３−１０６０頁（１９９４年）、チオエーテル、例えばヘキシルーＳ−トリチルチオール（マノハラン等（Manoharan et al.）、アニュアルニューヨークアカデミーオブサイエンス（Ann. N.Y. Accd. Sci.）、６６０巻、３０６−３０９頁（１９９２年）、マノハラン等（Manoharan et al.）、バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Let.）、３巻、２７６５―２７７０頁（１９９３年））、チオコレステロール（オーバーハウザー等（Oberhauser et al.）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Res.）、２０巻、５３３−５３８頁（１９９２年））、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールやウンデシル残基（セイソンーベーモラス等（Saison-Behmoaras et al.）、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）、１０巻、１１１１−１１１８頁（１９９１年）、カバノブ等（Kabanov et al.）、ＦＥＢＳレター（FEB Lett.）、２５９巻、３２７−３３０頁、（１９９０年）、スビナルチャック等（Svubarchuk et al.）、ビオケミー（Biochimie）、７５巻、４９−５４頁（１９９３年））、リン脂質、例えばジヘキサデシルーラセミーグリセロール又は１，２−ジーＯ−ヘキサデシルーラセミーグリセロー３−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（マノハラン等（Manoharan et al.）、テトラヘドロンレターズ、３６巻、３６５１−３６５４頁（１９９５年）、シー等（Shea et al.）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Res.）、１８巻、３７７７−３７８３頁（１９９０年））、ポリアミン鎖かポリエチレングリコール鎖（マノハラン等（Manoharan et al.）、ヌクレオサイドアンドヌクレオチド（Nucleosides & Nucleotides）、１４巻、９６９−９７３頁（１９９５年））、アダマンタン酢酸（マノハラン等（Manoharan et al.）、テトラヘドロンレターズ（Tetrahedron Lett）、３６巻、３６５１−３６５４頁（１９９５年））、パルミチル基（ミシュラ等（Mishra et al.）、バイオキミバイオフィジックアクタ（Biochim. Biophys. Acta）、１２６４巻、２２９−２３７頁（１９９５年））やオクタデシルアミン又はヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール基（クルーク等（Crooke et al.）、ジャーナルオブファーマコロジーエクスペリメントアンドセオリー（J. Pharmacol. Exp. Ther.）、２７７巻、９２３−９３７頁（１９９６年））のような脂質を含む。上述の核酸塩基オリゴマー複合物の作成法は米国特許４，５８７，０４４，４、６０５，７３５、４，６６７，０２５、４，７６２，７７９，４，７８９，７３７，４，８２４，９４１，４，８２８，９７９，４，８３５、２６３，４，８７６，３３５，４，９０４，５８２，４，９４８，８８２，４，９５８，８８２，４，９５８，０１３，５，０８２，８３０、５，１０９，１２４，５，１１２，９６３，５，１１８，８０２，５，１３８，０４５，５，２１４，１３６，５，２１８，１０５，５，２４５，０２２，５，２５４，４６９，５，２５８，５０６，５，２６２，５３６，５，２７２，２５０，５，２９２，８７３，５，３１７，０９８，５，３７１，２４１，５，３９１，７２３，５，４１４，０７７，５，４１６，２０３、５，４５１，４６３，５，４８６，６０３，５，５１０，４７５，５，５１２，４３９，５，５１２，６６７、５，５１４，７８５，５，５２５，４６５、５，５４１，３１３，５，５４５，７３０，５，５５２，５３８，５，５６５，５５２，５，５６７，８１０，５，５７４，１４２，５，５７８，７１７，５，５７８，７１８，５，５８０，７３１，５，５８５，４８１，５，５８７，３７１，５，５９１，５８４，５，５９５，７２６、５，５９７，６９６，５，５９９，９２３，５，５９９，９２８，５，６０８，０４６及び５，６８８，９４１に開示され、それぞれをここに文献として取り入れる。

本発明は又キメラ化合物の核酸塩基オリゴマーも含む。“キメラ”核酸塩基オリゴマーは、特に少なくともそれぞれ一つのモノマーからなる二個以上の化学的に異なる領域を含有するオリゴヌクレオチド、即ちオリゴヌクレオチドの場合ヌクレオチドである核酸塩基オリゴマーである。これら核酸塩基オリゴマーは通常核酸塩基オリゴマー上に核酸塩基オリゴマーを修飾して核酸分解酵素分解に対する抵抗性の増加、細胞取り込みの増加及び／又は標的核酸への結合親和性の増加をもたらす領域を少なくとも一つ含有する。核酸塩基オリゴマーの追加領域はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドかＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂できる酵素用基質として働く。例としてはRNase ＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。それ故RNase Ｈの活性化によりＲＮＡ標的の開裂をもたらし、その結果遺伝子発現の核酸塩基オリゴマー阻害効率を大いに増強する。その結果キメラ核酸塩基オリゴマーを用いた場合、同じ標的領域でのチオリン酸エステルオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に比しより短い核酸塩基オリゴマーで同定の結果が得られる。

本発明のキメラ核酸塩基オリゴマーは上述のように二個以上の核酸塩基オリゴマーの複合構造でできていても良い。この核酸塩基オリゴマーはオリゴヌクレオチドの場合技術的にはハイブリッドかギャップマーと呼ばれる。このハイブリッド構造の作成を教示す代表的米国特許としては、米国特許５，０１３，８３０，５，１４９，７９７，５，２２０、００７，５，２５６，７７５，５，３６６，８７８，５，４０３，７１１，５，４９１，１３３，５，５６５，３５０、５，６２３，０６５，５，６５２，３５５，５，６５２，３５６及び５，７００，９２２が含まれ、それぞれの全てをここに文献として取り入れる。

本発明で用いる核酸塩基オリゴマーは良く知られた固相合成法により便利に日常的作られる。この合成装置は例えばアプライドバイオシステム（Applied Biosystems）（フォスターシティ（Foster City）、カルフォルニア州（Calif.））を含むいくつかのベンダーから発売されている。技術的に既知の他合成法を追加に又は代わりに使用できる。チオリン酸エステルやアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチド合成に類似法を用いるのは既知である。

本発明の核酸塩基オリゴマーは取り込み、分配及び／又は吸収を助けるため、他分子、分子構造物又は化合物の混合物、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口処方、直腸処方、局所処方又は他処方で混合、カプセル化、複合化或いは組み合わしても良い。以下の特許に取り込みの助け、分配及び／又は吸収を助ける処方を提供する適切処方の作成を開示した制限のない例を表す。米国特許５，１０８，９２１，５，３５４，８４４，５，４１６，０１６，５，４５９，１２７、５，５２１，２９１、５，５４３，１５８，５，５４７，９３２，５，５８３，０２０，５，５９１，７２１，４，４２６，３３０，４，５３４，８９９，５，０１３，５５６、５，１０８，９２１，５，２１３，８０４，５，２２７，１７０，５，２６４，２２１，５，３５６，６３３，５，３９５，６１９、５，４１６，０１６，５，４１７，９７８，５，４６２，８５４，５，４６９，８５４，５，５１２，２９５，５，５２７，５２８，５，５３４，２５９，５，５４３，１５２，５，５５６，９４８，５，５８０，５７５及び５，５９５，７５６で、それぞれをここに文献として取り入れる。

本発明の核酸塩基オリゴマーは薬剤容認の塩、エステル、そのエステルの塩のいずれかか動物に投与すると生物活性代謝物かその残渣を（直接的か間接的に）提供できる他化合物のいずれかを含む。従って例えば本開示では本発明化合物のプロドラッグと薬剤容認塩、このプロドラッグの薬剤容認塩及び他の生物学的同等物も入る。

用語“プロドラッグ”は内在酵素や他の薬品及び／又は条件の働きで身体か細胞内で活性形（即ち薬）に変化する不活性形の治療薬をあらわす。

用語“薬剤容認塩”とは親化合物の望ましい生物活性を保持し、それにより望ましくない毒性効果を与えない塩を意味する。薬剤容認の塩基付加塩はアルカリ金属やアルカリ土類金属又は有機アミンのような金属やアミンとで形成する。カチオンとして用いる金属例としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び類似体がある。適切なアミンの例としてはＮ，Ｎ‘−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカインがある。（例えばベルジ等（Berge et al.）、ジャーナルオブファルマサイエンス（J. Pharma Sci.）、６６巻、１−１９頁（１９７７年）参照）。酸性化合物の塩基付加塩は在来法で遊離酸の形で十分な量の望ましい塩基と接触して塩を生成する。遊離酸の形はその塩を酸と接触し、在来法で遊離単離して再生できる。遊離酸形は極性溶媒中の溶解度のようなある物理的物性がその塩形といくらか異なるが、その他ではその塩は本発明の目的には各遊離酸と同等である。ここで用いる“医薬付加塩”としては本発明組成構成物の一つの酸形での薬剤容認塩を含む。これらとしてはアミンの有機酸塩か無機酸塩を含む。好ましい酸塩は塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の適切な薬剤容認塩は技術の熟知者には既知であり、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸かリン酸のような無機酸、有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸、リン酸かＮ−置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸かイソニコチン酸、自然でのタンパク質合成に関与する２０のα―アミノ酸、例えばグルタミン酸やアスパラギン酸のようなアミノ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタンー１，２―ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−又は３−ホスホグリセリン酸、グルコースー６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメート形成）又はアスコルビン酸のような他の有機酸化合物のような種々無機酸と有機酸の塩基性塩を含む。化合物の薬剤容認塩は又薬剤容認のカチオンから作成できる。適切な薬剤容認のカチオンは技術の熟知者には既知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム及び四級アンモニウムカチオンを含む。

オリゴヌクレオチドや他の核酸塩基オリゴマーに適切な薬剤容認塩としては（i）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンとスペルジミンのようなポリアミンのようなカチオンと形成する塩、（ii）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸及び類似体と形成する酸付加塩、（iii）有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマール酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸及び類似体と形成する塩及び（iv）塩素、臭素やヨウ素のような元素アニオンで形成する塩を含む。

本発明は本発明の核酸塩基オリゴマー含有薬組成と処方を含む。本発明の薬組成は局所又は全身治療のいずれか望ましい治療場所に依存し、多くの方法で投与できる。投与は局所的（眼や膣と直腸デリバリーを含む粘膜を含む）に、例えば粉末か噴霧器によるエアロゾルの吸入かガス吸入により肺に、気管内、鼻孔内、表皮及び経皮で、経口か非経口で行える。非経口投与としては静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射か点滴、頭蓋内、例えばくも膜下腔内か脳室内投与が含まれる。

上記記載の修飾以外にＴＦ標的のsiＲＮＡ分子の突然変異も又本発明に含まれる。好ましい突然変異としては限定はしないが実施例５に記載のものを含む塩基対の一重突然変異と限定はしないが実施例５に記載のものを含む塩基対の二重突然変異を含む。

siＲＮＡの細胞への導入
siＲＮＡ分子の操作と取り扱いを簡単化する方法の一つはsiＲＮＡ分子をコード化するｃＤＮＡカセットを適切なプロモーター制御下に置くことである。プロモーターは所望の標的ホスト細胞のsiＲＮＡ発現を促進するに違いない。適切なプロモーターの選択は容易に達成できる。好ましくは高度な発現プロモーターを用いる。適切なプロモーターの例としては規定配列の転写物を生成できる自給型重合酵素ＩＩＩプロモーターＵ６か又は１を含む。適切な重合酵素ＩＩプロモーター例としえは７６３―塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターがある。

この発現を増強する他の要素も含まれ、例えばＴａｔ遺伝子とＴａｌエレメントのような高レベルの発現が起こるエンハンサーや系がある。組み替えベクターはｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２や例えば大腸菌起源の複製を含む他の既知プラスミドベクターのようなプラスミドベクターがある。（サムブルック等（Sambrook et al.）、分子クローニング：実験室での手引き書（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、コールドハーバースプリングラボラトリー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年参照）。プラスミドベクターとしてマーカーペプチドが治療生命体の代謝に悪影響しないとして、アンピシリン耐性のβラクタム分解酵素のような選択的マーカーを含む。カセットは又ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２２６１８に開示の系のように、合成デリバリーシステムの核酸結合部位と結合できる。

核酸は使用ベクターに適切ないずれかの手段で細胞に導入できる。このための多くの方法が技術的に既知である。（サムブルック等（Sambrook et al.）、前出及びワトソン等（Watson et al.）、“組み替えＤＮＡ（Recombinant DNA）”、１２章、第２版、サイエンティフィックアメリカンブックス（Scientific American Books）、１９９２年）。組み替えベクターはリン酸カルシウム沈殿、電気穿孔、リポソーム仲介形質移入、遺伝子銃、微量注入、ウイルスキャプシド仲介転移、プリブレン仲介転移又はプロトプラスト融合のような方法で転移する。リポソーム作成、内容物の標的化とデリバリー方法の総説については、マンニノとグールドーフォゲイリッテ（Mannino and Gould-Fogerite）、（バイオテクニック（Bio Techniques））、６巻、６８２−６９０頁、１９８８年、フェルグナーとホルム（Felgner and Holm）（ベセスダリサーチラボラトリーホーカス（Bethesda Res. Lab. Focus）、１１巻、２１頁、１９８９年）及びマウラー（Maurer）、ベセスダリサーチラボラトリーホーカス（Bethesda Res. Lab. Focus）、１１巻、２５頁、１９８９年）を参照。

組み替えベクター（プラスミドベクターかウイルスベクターのいずれか）の転移は羊水への直接注入か静脈内デリバリーにより達成できる。アデノウイルスベクターかアデノ関連ベクター（ＡＡＶ）を用いる遺伝子デリバリーも使用できる。アデノウイルスは多数の動物に存在し、あまり病原性でなく且つ分裂細胞と静止細胞で一様に良く複製できる。通例遺伝子デリバリーに用いるアデノウイルスはウイルス複製に必要な遺伝子一個以上欠けている。複製欠損組み替えアデノベクターは技術的に既知な方法で産生できる。（クアンティン等（Quantin et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Science. USA）、８９巻、２５８１−２５８４頁（１９９２年）、ストラットフォードーペリカデット等（Stratford-Perricade et al.）、ジャーナルオブクリニカルインベスティゲーション（J. Clin. Invest.）、９０巻、６２６−６３０頁（１９９２年）およびローゼンフェルド等（Rosenfeld et al.）、セル（Cell）、６８巻、１４３−１５５頁（１９９２年）参照）。

細胞内のsiＲＮＡやｓｈＲＮＡの発現にプラスミドベクター又はウイルスベクターは限定はされないが重合分解酵素Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩＨ１、Ｕ６、ＢＬ．ＳＭＫ、７ＳＫ、ｔＲＮＡＰｏｌｙＩＩＩ、ｔＲＮＡ（メット）誘導及びＴ７プロモーターを含むプロモーター、ステムループＲＮＡコード化挿入断片用クローン化部位及び４−５−チミジン転写終止信号を含有できる。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは通常良く規定された開始部位と停止部位を持ち、その転写はポリＡ尾部に欠ける。これらプロモーター用終止信号はポリチミジン経路により規定され、その転写は通常二番目のウリジンの次で開裂する。この位置での開裂は発現ｓｈＲＮＡに合成siＲＮＡの３‘位オーバーハングと類似の３’位ＵＵオーバーハングを生成する。

ｄｓＲＮＡの哺乳類細胞への形質移入か導入には種々の方法が利用できる。例えばいくつかの市販形質移入試薬があり、限定はされないがトランスＩＴ―ＴＫＯ３（TransIT-TKO3）（ミラス、カタログ番号 ＭＩＲ２１５０（Mirus, Cat.#2150）、トランスメッセンジャー３（Transmessenger3）（キアゲン、カタログ番号、３０１５２５（Qiagen, Cat.#301525））及びオリゴフェクタミン３（Oligofectamine3）（インビトロゲン、カタログ番号ＭＩＲ１２２５２−０１１（Invitrogen, Cat.# MIR 12252-011）を含む。各形質移入試薬用の手続きは製造メーカーから入手できる。オリゴヌクレオチドや他の核酸塩基オリゴマーのデリバリーを助ける追加処方は以下に記載されている。（例えば米国特許５，６５６，６１１、５，７５３，６１３，５，７８５，９９２，６，１２０，７９８，６，２２１，９５９、６，３４５，６１３及び６，３５３，０５５参照）。

各標的と各株細胞に用いるＲＮＡ濃度は変わるが、通常０．０５nＭから５００nＭ、より好ましくは０．１nＭから１００nＭ、最も好ましくは１nＭから５０nＭである。もし望むなら細胞を遺伝子サイレンシング効果を最適化するために複数siＲＮＡを用いて複数回形質移入できる。

siＲＮＡの安定発現
最近ＤＮＡ鋳型法を用いてsiＲＮＡ分子が創製送達された。（ツッシュル、ティ（Tuschl, T.）、ネーチャーバイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、２０巻、４４６−４４８、（２００２年）に概説）。siＲＮＡ鋳型を通常小さい細胞核ＲＮＡＵ６かヒトRNAseP ＲＮＡＨ１をコード化するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写単位にクローンする。これら発現カセットによりセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの両者が発現できる。導入ＤＮＡ鋳型によるsiＲＮＡの内在性発現は外因性siＲＮＡデリバリーのある限度、特に表現形の一過性喪失に打ち勝つと考えられる。事実これらsiＲＮＡ発現カセットを用いて機能表現形の安定に喪失した安定な株細胞を得た。（宮岸および平良（Myagishi M. and Taira K.）、ネーチャーバイオテクノロジー（Nature Biotech）、２０巻４９７−５００頁（２００２年）、ブラッメルカンプ、ティアール等（Brummelkamp, T.R. et al.）、サイエンス（Science）、２９６巻、５５０−５５３頁（２００２年））。もし望むなら上記の方法でＴＦのＲＮＡi用の安定な株細胞も生成できる。

遺伝子サイレンシング効果評価用アッセイ
ｍＲＮＡとタンパク質発現は限定はされないがノーザンブロット分析、RNAse保護アッセイ、ルシフェラーゼ又はβガルレポーターアッセイ、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡのような免疫法を含む種々の既知の技術的方法で分析できる。

治療への応用
本発明によるsiＲＮＡを用いて哺乳類ＴＦの発現や生物活性を下方制御できる。従って本発明のＲＮＡを用いて限定はされないがヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、鳥、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ヒヒや類似体を含む温血動物の腫瘍転移を治療や防止できる。治療は通常病院で始まるので、医師が治療効果を間近に観察し必要ないずれかの調節を行える。治療期間は治療腫瘍転移、患者の年齢と状態、患者疾患の段階と形及び治療に対し如何に患者身体が応答するかに依存する。治療を異なる間隔（例えば毎日、毎週又は毎月）で実施できる。治療を患者身体が健康な新規細胞を作り力を回復する機会があるように断続的周期でもできる。

転移腫瘍の治療処置を用いて腫瘍転移を防ぎ、転移を遅らせ、腫瘍主導血管形成を遅らせ、腫瘍成長を遅らせ、最初の腫瘍から身体の他の部分に広がった細胞を死滅抑止し又癌で起こる症状を軽減できる。

本発明のsiＲＮＡ分子は薬剤容認の希釈剤、担体又は賦活剤と共に単位用量の形で投与できる。在来の薬務を用いて過剰な細胞増殖で起こる病気を患った患者に化合物を投与するよう適切な処方か組成を提供する。投与は患者が徴候になる前に開始できる。いずれかの適切な投与経路が用いられ、例えば非経口、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、側脳室内、肝内、関節内、くも膜下腔内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、座薬或いは経口投与である。例えば治療処方は液体溶液か懸濁液の形でも良い。経口投与には処方は錠剤やカプセルの形でも良い。鼻腔内投与では粉末、点鼻薬かエアロゾルの形でも良い。一例では静脈内治療を用いてsiＲＮＡを凝固障害治療に直接血流に注入できる。他例では腫瘍へのsiＲＮＡの直接注入を用いて転移腫瘍を治療できる。処方作成に関する技術的に既知方法は、例えばゲンナーロ、エイアール編（Gennaro, A.R. Ed.）、“レミントン：薬学の科学と実施（Remington: The Science and Practice of Pharmacy）”、リッピンコートウイリアムスアンドウイルキンス（Lippincourt Williams & Wilkins）、フィラデルフィア（Philadelphia）、ペンシルバニア州（PA）、２０００年に見いだせる。非経口投与用の処方は、例えば賦活剤、減菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物油源の油又は水素化ナフタレンを含有しても良い。生体整合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレンーポリオキシプロピレンコポリマーを用いてこの化合物放出を制御できる。組織因子調節化合物に有用な可能性のある他の非経口デリバリーシステムとしては、エチレンー酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能な点滴系及びリポソームを含む。吸入用処方は賦活剤、例えば乳糖を含有しても良く、例えばポリオキシエチレンー９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩及びデオキシコール酸含有水溶液でも良く、又点鼻薬の形かゲルとして投与する油性溶液でも良い。

この処方を病気や病状の治療を提供するのにヒト患者に治療有効量（例えば病的状態を防止、除去又は減少する量）を投与する。本発明のsiＲＮＡ分子の好ましい用量は障害の形や程度、特定患者の全体の健康状態、化合物賦活剤処方及び投与経路のような変数におそらく依存するであろう。

本発明のsiＲＮＡ分子の哺乳類への供与においてsiＲＮＡ投与量は哺乳類の年齢、体重、身長、性別、一般的病状、過去の病歴、疾患の進行、腫瘍負担及び類似物のような因子に依存して変化する。用量は指示されたように投与する。他の治療薬もsiＲＮＡ分子と組み合わして投与できる。腫瘍治療に用いる薬組成は任意に他の化学療法剤、抗体、抗ウイルス剤、内在性免疫調節剤及び類似物を含にでも良い。凝固障害治療に用いる薬組成は任意に追加の血栓溶解剤やヘパリンのような抗凝血剤を含有できる。

ここに記載のsiＲＮＡを用いる治療効果はＤＮＡ、ＲＮＡ又はＴＦの遺伝子産物の発現、濃度又は生物活性の変化、血栓溶解、血栓防止、腫瘍退縮、転移退縮、転移防止又は腫瘍関連病理や症状の減少を決定して評価できる。

ＴＦ標的ＲＮＡの作成
ヒトＴＦ（ｈＴＦ）サイレンシングを得るsiＲＮＡを提供するため、２１個のヌクレオチドＲＮＡをＰＣＴ／ＮＯ０３／０００４５に記載のようにホスホラミダイト（ファルマシアアンドエイビーアイ（Pharmacia and ABI））を用いて化学的に合成した。ｈＴＦｍＲＮＡに対する１３個のsiＲＮＡを合成した。（ウイガー、エムティ（Wiiger MT）、プリングル、エス（Pringle S）、ペターソン、ケイエス（Pettersen KS）、奈良原（Narahara N）、プリッズ、エッチ（Pryddz H.）、ヒト内皮細胞における誘導組織因子へのリガンド（ＦＶＩＩ）結合の効果（Effects of binding of ligand (FVIIa) to induced tissue factor in human endothelial cells.）、トロンボリサーチ（Thromb Res.）、９８巻、３１１−３２１頁（２０００年））（図１a）。これらsiＲＮＡの八個をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８と名付ける。本発明はとりわけＰＣＴ／ＮＯ０３／０００４５に開示のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３１による合成siＲＮＡの使用に関する。

更に本発明は新規マウスsiＲＮＡ分子とその使用、具体的には補体がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５３であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２らＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７で示される核酸配列を持つsiＲＮＡに関する。

ＴＦ標的の種々のsiＲＮＡを又体系的に位置付けした。siＲＮＡの二本鎖安定性への影響を避けるため、以下の実施例５で記述するように対反転によりＧＣ対のみを突然変異の標的とした。

二重ルシフェラーゼ系（プロメガ社（Promega）に用いるヒトＴＦのレポーター作成物をホタルルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子でインフレームクローンしたＴＦのコード化領域を用いてデザインし、融合作成物ＴＦ−ＬＵＣ（受入番号ＡＦ４１６９８９）を産生した。融合作成物の番号付けはＴＦのジェンバンク受付のものと、ＬＵＣのｐＧＬ３−エンハンサープラスミド（プロメガ社（Promega））とに基づく。ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ、示してない）をコード化したプラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｒｌｕｃ（受付番号Ａ４１６９９０）を内部対照に用いた。作成物内に含有のＴＦ領域とＬＵＣｃＤＮＡ領域を図１ｂに表示した。二重ルシフェラーゼ系はＴＦｍＲＮＡがsiＲＮＡによりどれだけ分解するかを検出するのに用いるレポーター系である。

ＨｅＬａ， Ｃｏｓ−１及び２９３細胞を１０％ウシ胎児血清（ギブコＢＲＬ社（Gibco BRL））で補足したダルベッコ基礎培地（ＤＭＥＭ）で維持した。ヒトケラチン生成株細胞ＨａＣａＴを表皮成長因子２．５nｇ／ｍｌとウシ下垂体抽出物２５μｇ／ｍｌで補足した無血清ケラチノサイト培地で培養した。全株細胞を定期的にサブコフレンスで継代した。ＤＭＥＭでの実験細胞培養前日にトリプシン処理し、蒔く前に全培地に再懸濁した。ＨａＣａＴ細胞を剥離するまでトリプシン処理した。トリプシン阻害剤を次いで添加し、補足培地で再度懸濁し蒔く前に細胞を５分間４００ｘｇで遠心分離した。細胞を１日か２日後形質移入した。

リポフェクタミン仲介一過性同時形質移入をプラスミド０．４０μｇ／ｍｌ（レポーター０．３８μｇ／ｍｌと対照０．２０ng／ｍｌ）と通常３０ｎＭ siＲＮＡ（０．４３μｇ／ｍｌ）で実質的に記載されているように三通り１２穴プレートで実施した。（アマルズギオウイエム等（Amarzguioui et al.）前出（２０００年））。ルシフェラーゼ活性レベルを二重ルシフェラーゼアッセイ（プロメガ社（Promega））を用いて形質移入の２４時間後に細胞溶解物２５μｌで測定した。連続形質移入を先ず１００nＭ siＲＮＡで形質移入し、次いで回収時点前にレポータープラスミッドおよび内部対照プラスミッドにより形質移入した。

ノーザン分析では６穴プレートのＨａＣａＴ細胞を無血清培地で１００nＭ siＲＮＡで形質移入した。リポフェクタミン２０００をより高い形質移入効率に用いた。ポリＡポリメラーゼｍＲＮＡをダイナビーズ（Dynabeads）オリゴ（ｄＴ）_２５（ディナル（Dynal））を用いて形質移入２４時間後に単離した。単離ｍＲＮＡを１．３％アガロース／フォルマリン（０．８Ｍ）ゲル上で１６−１８時間分別し、ナイロン膜（マグナチャージ（MagnaCharge）、ミクロンセパレーション社（Micron Separations Inc.））上でブロットした。膜を製造メーカーが推薦するように、無作為刺激したＴＦ（ｃＤＮＣの位置６１−１２１７）とパーフェクトハイブ（PerfectHyb）ハイブリダーゼーション緩衝液（シグマ社（Sigma））のＧＡＰＤＨ（１．２ｋｂ）ｃＤＮＡプローブでハイブリッド形成した。

ＴＦ活性測定のためＨａＣａＴ細胞単分子層を氷冷のバルビタール緩衝化生理食塩水（ＢＢＳ）、ｐＨ７．４（ＢＢＳ、３ｍＭバルビタールナトリウム、１４０ｍＭ食塩）で三回洗浄し、ＢＢＳに掻爬した。回収と均質化直後に活性を二個のドナーと１０ｍＭ塩化カルシウムと混合したクエン酸処理貧血小板の正常血清を用いて、一段凝固アッセイで測定した。活性を標準と関連づけた。（ウイガー、エムティ（Wiiger MT）、プリングル、エス（Pringle S）、ペターソン、ケイエス（Pettersen KS）、奈良原（Narahara N）、プリッズ、エッチ（Pryddz H.）、ヒト内皮細胞における誘導組織因子へのリガンド（ＦＶＩＩa）結合の効果（Effects of binding of ligand (FVIIa) to induced tissue factor in human endothelial cells.）、トロンボリサーチ（Thromb Res.）、９８巻、３１１−３２１頁（２０００年）、カメルマー、イー（Carmerer E.）、プリングル、エス（Pringle S）、スカリトリーン、エイエッチ（Skartlien AH）、プリッズ、ケイ（Pryddz K.）、コルスト、エイビー（Kolsto AB）、プリッズ、エッチ（Pryddz H.）、ヒト臍帯静脈内皮細胞とマディンーダービー（Martin-Darby）イヌ腎臓内皮細胞における組織因子の反対並べ替え（Opposite sorting of tissue factor in human umbilical vein endothelial cells and Martin-Darby canine kidney epithelial cells）、ブラッド（Blood）、８８巻、１３３９−１３４９頁（１９９６年））。ＴＦ ＥＬＩＳＡの決定では一単位（Ｕ）ＴＦは１．５ｎｇＴＦに相当する。（ウイガー、エムティ等（Wiiger MT et al.）、前出（２０００年）及びカメルマー、イー等（Carmerer E.）、前出（１９９６年））。活性はバイオラドＤＣ（BioRad DC）アッセイで測定したように細胞ホモジネート中のタンパク質含有量に正規化した。

ＴＦ抗原はイムバインド（Imubind）組織因子ＥＬＩＳＡキット（アメリカンダイアグノスチカ社（American Diagnostica）、グリーンウイッチ（Greenwich）、コネチカット州（CT）、米国（USA））を用いて定量した。このＥＬＩＳＡはＴＦアポタンパク質、ＴＦとＴＦ凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）の複合体を認識する。試料を放置して３７℃で融解し均質化した。一定分割量の各ホモジネート（１００μｌ）を１％ＢＳＡと０．１％トリトンＸ−１００含有リン酸緩衝化生理食塩水で希釈した。この試料をＥＬＩＳＡ穴に加え、製造メーカーの方法を次いで実施した。抗原レベルを細胞ホモジネート中の全タンパク質含有量に対し正規化した。

野生型siＲＮＡ配列について以前に記載のように種々の突然変異siＲＮＡを全てリポフェクタミン２０００仲介形質移入２４時間後にＨａＣａＴ細胞中の内在性ＲＴＦｍＲＮＡの減少を分析した。

本発明で今使用する薬組成の作成を技術の熟知者は既知の方法を用いて提供する。組成は一つ以上のこのsiＲＮＡと任意に技術的に全て既知の希釈剤、潤滑剤、結合剤、担体崩壊及び／又は吸収手段、着色剤、甘味剤、風味剤などを含む。更にこの組成は賦活剤及び／又は治療手段を含有でき、単独か他の薬と一緒に投与できる。この組成は在来の癌治療計画、例えば細胞分裂停止治療、放射線照射など以前に、同時に又は以後に使用できる。この組成は例えば一次腫瘍残遺物の転移を防ぐために外科的介入以前に、同時に又は以後に使用できる。

本使用で作成の薬組成は例えば非経口（例えば減菌溶液か懸濁液の皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内注入か点滴）、経口（例えばカプセル、錠剤、丸薬、懸濁液か溶液）、経鼻（例えば溶液か噴霧の形で）、頬側、直腸（例えば座薬の形で）、膣（例えば座薬の形で）、吸入やガス吸入（例えばエアロゾルや溶液／噴霧の形で）で埋め込み容器を通じて、或いはいずれかの適切な投与経路で、在来の無毒性な薬剤容認担体、希釈剤及び／又は媒体含有の用量処方で投与できる。この薬組成は更に一回用量、分割用量又は持続性放出器具により投与できる。

ここで本発明を実施例により説明する。実施例は本発明の好ましい実施形態を表すが、それらは本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

ヒトＴＦのサイレンシングを与えるisＲＮＡを得るために、ＰＣＴ／ＮＯ０３／０００４５に記載の方法によりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３１のsiＲＮＡとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７の新規マウスＴＦ（ｍＴＦ）siＲＮＡを化学的に合成した。

標的ＴＦｍＲＮＡ配列上のある部分配列に相補的な二重鎖siＲＮＡは哺乳類細胞のこの特定ｍＲＮＡの分解を誘導する。（実施例１参照）。この効果は非常に配列依存性が高く、低級生命体でのデータとは反対にＴＦｍＲＮＡの数個の部位のみが相当siＲＮＡに対して非常に鋭敏であった。実施例２に見られるように、ＴＦｍＲＮＡの減少によりＴＦタンパク質と凝血原活性が顕著に減少する。

ｍＴＦＲＮＡ配列標的部位は全てｈＴＦの最善ＲＮＡ標的を宿す領域に相当する２００ｂｐ領域内に存在する。（ＰＣＴ／ＮＯ０３／０００４５参照）。具体的には互いに３ｂｐシフトした三つの異なる標的位をｈＴＦ１６７iに相当する座位に対してデザインした。可能な場合には各座位内でのsiＲＮＡの位置取りをヒト配列と可能な限り最大に合致するように選んだ。全siＲＮＡを２ｂｐ標的の特定リボヌクレオチドオーバーハング（即ち末端にＤＮＡ無し）で合成する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２−３７は実施例７に記載するようにマウスモデルで転移活性の著しい減少を示した。

ｈＴＦ−ＬＵＣとｈＴＦsiＲＮＡで一過的に同時形質移入した細胞でのｈＴＦsiＲＮＡ効率の分析（即ち同時形質移入アッセイのsiＲＮＡにようるＲＮＡiの分析）
ＴＦsiＲＮＡ効率の初期分析を二重ルシフェラーゼ系（プロメガ（Promega））を用いてｈＴＦ−ＬＵＣ（図１ｂ）とｈＴＦsiＲＮＡ（図１a）で一過的に同時形質移入したＨｅＬａ細胞で実施した。ＬＵＣ発現とＲｌｕｃ発現の比を代表的な関係siＲＮＡであるプロテインセリンキナーゼ３１４i（ＰＳＫ３１４i）で形質移入した細胞レベルに正規化した。

siＲＮＡは最適候補のｈＴＦ１６７iとｈＴＦ３７２iに関して同時形質移入アッセイに強力且つ特異的な効果を持ち、ＨｅＬａ細胞の残留ルシフェラーゼ活性は１０―１５％だけになった。（図１ｃ）。更にｈＴＦ５６２iは中程度の効果を示し、ｈＴＦ４７８iは非常に低活性を示すように位置効果も見られた。このパターンは２９３、ＣＯＳ−１及びＨａＣａＴ細胞（図１ｃ）、異なる合成処理単位でや異なる濃度（siＲＮＡは同時形質移入アッセイで１−１００nＭの濃度範囲で同定の阻害を起こした。データは示さないが。）でも見られた。

siＲＮＡの形質移入細胞をレポータープラスミドの形質移入細胞と共培養すると、ＨｅＬａ細胞内と接触阻害成長のＨａＣａＴ細胞内の両者で、培地仲介転移が以前他の研究者により報告されているにもかかわらず細胞間のsiＲＮＡ転移（データは示していないが）は示唆されかった。（カプレン、エヌジェイ（Caplen, N.J.）、フリーノール、ジェイ（Fleenor, J.）、ファイヤー、エイ（Fire, A.）及びモーガン、アールエイ（Morgan, R. A.）、培養ショウジョバエ細胞におけるｄｓＲＮＡ仲介遺伝子サイレンシング：ＲＮＡ妨害分析用組織培養モデル（dsRNA-mediated gene silencing in cultured Drosophila cells: a tissue culture model for the analysis of RNA interference）、ジーン（Gene）、２５２巻、９５−１０５頁（２０００年））。

コドンレベル解決におけるsiＲＮＡ位置依存性の研究
最良siＲＮＡ（即ちｈＴＦ１６７i）の標的位周囲領域でより高度な解決へ到達できるかを調べた。siＲＮＡ（ｈＴＦ１５８i，ｈＴＦ１６１i、ｈＴＦ１６４i、ｈＴＦ１７０i、ｈＴＦ１７３i及びｈＴＦ１７６i）をｈＴＦ１６７の両側に３nt増分だけシフトした部位を標的年、それぞれが２１ntの内１８ntをその隣接物と共有するように合成した。（図１ｃ）。驚くべきことにこれらsiＲＮＡ間の配列と位置差が最小にもかかわらず、広範囲の活性を示すことが見られた。（図２）。上流siＲＮＡではより顕著なｈＴＦ１６７iの全活性が徐々に遠ざかる変化が起こる。二つのsiＲＮＡのｈＴＦ１５８iとｈＴＦ１６１iはそれぞれｈＴＦ１６７iから９個と６個のヌクレオチドだけ遠ざかるようにシフトするが、その活性は大幅に減少した。この結果は一つ又は複数の局所因子が位置効果を起こすことを示唆する。

内在性ｍＲＮＡに対するｈＴＦsiＲＮＡ効率の分析
基質としてレポーター遺伝子の強制発現を用いた同時形質移入アッセイの結果は説明しにくい。siＲＮＡの効果をそれ故ＴＦを恒常的に発現するＨａＣａＴ細胞の内在性ｍＲＮＡにおいて測定した。（図３a）。二つの最良高ＴＦ siＲＮＡのｈＴＦ１６７iとｈＴＦ３７２iはこのアッセイで強活性を示し、正規化ＴＦｍＲＮＡはそれぞれ１０％と２６％に減少した。（図３a）。興味あることにＲＮＡiに基づくｍＲＮＡの開裂アッセイでは今のところ哺乳類系では失敗しているが、サイズは標的配列の一次開裂物と一致する開裂産物が減少した主バンドの下に明白に現れた。（ツシュル、ティ（Tuschl, T）、ザモーア、ピーディ（Zamore PD）、レーマン、アール（Lehman R）、バーテル、ディピー（Bartel DP）、シャープ、ピーエイ（Sharp PA）、二重鎖ＲＮＡによる体外での標的ｍＲＮＡの分解（Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro）、ジーンデベロプメント（Gene Dev.）、１３巻、３１９１−３１９７頁（１９９９年））。従って本発明は哺乳類細胞のｍＲＮＡを開裂できるsiＲＮＡと関連する。更に観察効果はＲＩＳＣが又哺乳類でも活性であることを示唆する。同時形質移入アッセイの三番目に良いsiＲＮＡのｈＴＦ２５６iは又ＴＦｍＲＮＡレベルを著しく減少した。（残留発現は５７％、データは示してない）。残留ＴＦsiＲＮＡはノーザンアッセイによる測定で活性を全く示さず（図３ｂ）、ＴＦ発現も又刺激しなかったが、ある興味ある点では、化学修飾リボソームの形質移入によりＴＦｍＲＮＡ誘導は三倍になった。（データは示してない）。従って関連siＲＮＡの相対的不活性（即ち非特異的効果を持つsiＲＮＡ）は更にsiＲＮＡベースの薬の期待を強める。

ＨａＣａＴ細胞の凝固活性は模擬形質移入細胞に比しｈＴＦ１６７iとｈＴＦ３７２iによる形質移入細胞でそれぞれ５倍と２倍減少した。（図３ｂと図５ｂ）。全細胞ＴＦタンパク質に対するsiＲＮＡの効果を測定し（図３ｂ）、通常凝血促進活性に対する観察効果より大きな阻害効果を示した。それ故本発明者はsiＲＮＡのｈＴＦ１６７iとｈＴＦ３７２iは複雑な生理系で特異性と有効性を示し、他siＲＮＡ分子が同じ標的ｍＲＮＡに対して基本的に不活性なことから位置効果を示したと結論づけた。新しい組のＴＦsiＲＮＡのデータはこの結論を支持し（データは示してない）、あるsiＲＮＡの不活性は不可入性タンパク質が覆うことによりｍＲＮＡ折りたたみ構造や開裂部位の閉塞に原因するであろう。（エルバシャー、エスエム（Elbashir SM）、ハーボース、ジェイ（Harborth J）、レンデケル、ダブリュ（Lendeckel W）、ヤルシン、エイ（Yalcin A）、ウェバー、ケイ（Weber K）、ツシュル、ティ（Tuschl）、培養哺乳類細胞における２１個のヌクレオチドＲＮＡ二本鎖によるＲＮＡ妨害の仲介（Duplexes of 21-nucleotide RNAs medate RNA interference in cultured mammalian cells）、ネーチャー（Nature）、４１１巻、４９４−４９８頁（２００１年））。

ＲＮＡサイレンシングの時間経過と持続性の分析
ｍＲＮＡサイレンシングの時間経過を測定し、形質移入開始４，８、２４及び４８時間後回収の細胞ノーザン分析では２４時間後に最大のsiＲＮＡサイレンシングを示した。（図５a）。ｈＴＦ１６７iはｈＴＦ１７３iに比し各時間点でｍＲＮＡレベルをより減少したので、見かけの減少速度に差があるように思われる。類似のことがｈＴＦ１６７iの修飾バージョンでも観察され、誘導突然変異（Ｍ１とＭ２）により阻害効率が減少した。アンチセンス鎖での突然変異はセンス鎖での相当の突然変異よりより明白な効果があった。siＲＮＡ誘導による標的分解が不完全であるという事実（最も有効なsiＲＮＡでも残留標的ｍＲＮＡが約１０％のレベル）は、保護区画、即ちスプライソソームか他の細胞核位置のｍＲＮＡ区画の存在によるのであろう。しかし上のデータと競争実験データの観点から、分解は時間のかかるプロセスなので、転写と分解間の動力学な決定のバランスによる可能性が高い。植物（パラッキ、ジェイシー（Palauqui JC）、バルゼルグ、エス（Balzergue S）、ＤＮＡの局所的導入による全身確保のサイレンシングの活性化（Activation of systemic acquired silencing by localized introduction of DNA）、カレントバイオロジー（Curr Biol.）、９巻、５９−６６頁（１９９９年）及び線虫（ファイヤー、エイ（Fire, A.）、ＲＮＡ引き金による遺伝子サイレンシング（RNA-triggered gene silencing）、トレンドジェネティック（Trends Genet.）、１５巻、３５８−３６３頁（１９９９年）、グリショック、エイ（Grishok, A.）、田原（Tahara, H.）、メロー、シーシー（Mello CC）、線虫ＲＮＡi遺伝での遺伝子的必要性（Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans）、サイエンス（Science）、２８７巻、２４９４−２４９７頁（２０００年））での実験によりあるsiＲＮＡ遺伝子が誘導表現形の遺伝力と関連する系の存在が示唆された。哺乳類細胞でのこの繁殖体の存在を調べるため、非常に低細胞密度で形質移入したＨａＣａＴ細胞でのsiＲＮＡサイレンシングの持続性を測定した。レポーター作成物の連続形質移入に基づく実験で、形質移入後３日と５日の間で発現が徐々に回復し、内因性ＴＦｍＲＮＡに対するsiＲＮＡ効果の時間依存性は同等であった。（図５ｂ）。模倣形質移入制御細胞のＴＦｍＲＮＡレベルは実験経過とともに徐々に低下し、発現の細胞増殖依存の下方制御であるように思われる。興味あることに凝血原活性は形質移入細胞制御レベルに回復する兆しを殆ど示さない。（図５ｂ、列）。同様のことがｈＴＦ３７２iとｈＴＦ１６７i、ｈＴＦ３７２i及びｈＴＦ５６２iの組み合わせで見られた。（データは示してない）。

ＲＮＡ配列での塩基対突然変異導入効果の分析
前述のごとく突然変異が全siＲＮＡ内で等しく許容できるのかどうかを決めるため、siＲＮＡをより体系的に位置づけした。全部で８つの異なる新規一重突然変異体siＲＮＡをデザインし、突然変異（ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４，ｓ７、ｓ１３、ｓ１６、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９−１７）の位置（センス鎖の５‘位から開始）に従い名付けた。前述の中央一重突然変異体Ｍ１（実施例４）をこの分析に加えｓ１０と改名した。全siＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（１５％）変性により増殖アニーリングを分析した。

種々の突然変異体siＲＮＡ全てを前述のようにリポフェクタミン２０００仲介形質移入２４時間後にＨａＣａＴ細胞の内在性ＴＦｍＲＮＡの減少を分析した。データの要約を図７に示す。野生型siＲＮＡおよび正の対照として含む突然変異体ｓ１０は、予期され以前に報告されたようにＴＦｍＲＮＡを約１０％と２０％の残渣レベルに減少した。他の突然変異体の活性はsiＲＮＡに沿った位置に依存して三つの異なるグループに分けられる。siＲＮＡ（ｓ１−ｓ３）の極限５‘位末端での突然変異には非常に良く許容でき、野生型と実質的に同じ活性を示す。更に内側に位置する突然変異体でsiＲＮＡ（ｓ４、ｓ７、ｓ１０、ｓ１１）のおおよその中間点迄はその活性をわずかに減じ、ｍＲＮＡレベルを２５−３０％の残留レベルまで減少する。しかしsiＲＮＡの３’位の半分での両突然変異では活性は大きな減少を示した。これはsiＲＮＡの突然変異に対する許容性に偏りがあることを示唆する。中央位置（ｓ１０）が一つの追加位置（ｓ７，ｓ１１，ｓ１３，ｓ１６）と一緒に突然変異した数個の二重突然変異体の活性を分析した。これらの活性順位が変異体位置での一重突然変異体活性のそれを酷似しているので、突然変異許容性の偏りはこの二重突然変異体でも明白であった。この観察により突然変異体の異なる活性がsiＲＮＡ配列に沿った標的不一致に対する許容性に固有な偏りがあるいう主張を強める。この偏りに関する理由としてはＲＩＳＣ複合体が標的ｍＲＮＡの開裂を“かなえる”のに（１５）主として用いるsiＲＮＡの支配者領域が存在するという提案と結びつくであろう。

siＲＮＡ配列の化学修飾効果
siＲＮＡ鎖の極限５‘位と３’位末端それぞれ一個修飾した一連のsiＲＮＡ（Ｐ１＋１、Ｍ１＋１、Ａ１＋１、即ちそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２２とその補体ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２６とその補体ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３０とその補体ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４６を先ず合成した。化学合成siＲＮＡの５‘位末端は活性になる体内でリン酸化されねばならないので、修飾により鋭敏であろう。（ニーカネン、エイ（Nykanen, A.）、ヘイリー、ビー（Haley, B.）及びゼイモアー、ピーディ（Zamore, P.D.）、ＲＮＡ妨害経路におけるＡＴＰの必要性と小さな妨害ＲＮＡ構造（ATP Requirements and Small Interfering RNA Structure in the RNA Interference Pathway）、セル（Cell）、１０７巻、３０９−３２１頁（２００１年））。それ故種々なタイプの修飾を許容できる非塩基対３’位オーバーハングでのみ二修飾したsiＲＮＡ（siＲＮＡ Ｐ０＋２、Ｍ０＋２及びＡ０＋２、即ちそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３、２７及び３１、図６参照）を含めた。（エルバシャー、エスエム（Elbashir SM）、ハーボース、ジェイ（Harborth J）、レンデケル、ダブリュ（Lendeckel W）、ヤルシン、エイ（Yalcin A）、ウェバー、ケイ（Weber K）、ツシュル、ティ（Tuschl T）、培養哺乳類細胞における２１個のヌクレオチドＲＮＡ二本鎖によるＲＮＡ妨害の仲介（Duplexes of 21-nucleotide RNAs medate RNA interference in cultured mammalian cells）、ネーチャー（Nature）、４１１巻、４９４−４９８頁（２００１年）、エルバシャー、エスエム（Elbashir SM）、マーティネス、ジェイ（Martinez, J.）、パニカニオブスカ、エイ（Patkaniowska, A.）、レンデケル、ダブリュ（Lendeckel W）及びツシュル、ティ（Tuschl T）、“キイロショウジョバエ胚溶解物における有効ＲＮＡi仲介に関するsiＲＮＡの機能分析”（Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate）、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）２０巻、６８７７−６８８８頁）（２００１年）、エルバシャー、エスエム（Elbashir SM）、レンデケル、ダブリュ（Lendeckel W）及びツシュル、ティ（Tuschl T）、２１と２２nt ＲＮＡによるＲＮＡ妨害の仲介（RNA Interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs）、ジーンデベロプメント（Gene Dev.）、１５巻、１８８−２００頁（２００１年））。形質移入ＨａＣａＴ細胞のノーザン分析により両末端をアリール化したsiＲＮＡ以外は、実質的に全修飾siＲＮＡの活性が減少しないことが示された。（図８）。３‘位末端でのアリール基修飾のみでは活性に対する効果は無かった。５’位末端ヌクレオチドの２‘位水酸基に大きな置換基が存在すると、ニーカネン等が必要性を示したsiＲＮＡの適切なリン酸化が妨害されるのであろう。（ニーカネン、エイ（Nykanen, A.）、ヘイリー、ビー（Haley, B.）及びゼイモアー、ピーディ（Zamore, P.D.）、ＲＮＡ妨害経路におけるＡＴＰの必要性と小さな妨害ＲＮＡ構造（ATP Requirements and Small Interfering RNA Structure in the RNA Interference Pathway）、セル（Cell）、１０７巻、３０９−３２１頁（２００１年））。

次いでこれら修飾のいずれがsiＲＮＡ仲介サイレンシングの持続性増加に十分かどうかを知ろうとした。内在性ＴＦｍＲＮＡはｈＴＦ１６７標的野生型siＲＮＡの形質移入３−５日後に徐々に回復する。ＨａＣａＴ細胞を平行に活性な化学修飾siＲＮＡで形質移入したが、形質移入３日後と５日後でのサイレンシング活性には有意差は示されなかった。（データは示してない）。導入の穏やかな修飾は完全な初期活性を示すが、体内でsiＲＮＡを実質的に安定化するには明らかに不十分であった。

最初の穏やかな修飾後未だに無傷のＲＮＡ活性を持ち、修飾程度を３’位末端の４つと組み合わして両側の二つか５‘位末端の二つのいずれかを含むように拡張した。最初の組のアリール化バージョンでのあまり有望でない結果とこの修飾に伴う高コストのため、次組にはチオリン酸修飾とメチル化に限定するように決めた。新規のsiＲＮＡ組を同様にＨａＣａＴ細胞に形質移入２４時間後に初期活性を分析した。修飾siＲＮＡを形質移入した細胞の正規化発現レベルは野生型を形質移入した細胞の１１％に比し残留レベルは１６−１８％とにわずかに増加していた。最も大規模にチオリン酸化したsiＲＮＡは細胞に有毒であることがわかり、模倣形質移入細胞に比し約７０％の細胞が死滅した。（対照ｍＲＮＡ ＧＡＰＤＨの発現レベルとして測定）。この混乱のためこのsiＲＮＡ種は以後の分析に含めなかった。残りのsiＲＮＡを１００nＭ siＲＮＡの単一形質移入５日後にＴＦｍＲＮＡ発現を分析してサイレンシング持続性の増加を評価した。この時点で野生型siＲＮＡで形質移入細胞のＴＦ発現は殆ど完全に回復した。（模倣形質移入細胞に比し８０％残留発現）。（図９a）。しかし最も大規模に修飾のsiＲＮＡ（Ｍ２＋４，ＳＥ ＩＤ ＮＯ２９でその補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４５）で形質移入の細胞では、強いサイレンシングが今なお明白であった。（３２％残留発現）。より小さな規模で修飾のsiＲＮＡ（Ｐ２＋２，Ｍ２＋２、それぞれＳＥ ＩＤ ＮＯ２４でその補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４０及びＳＥ ＩＤ ＮＯ２８でその補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４４）では、Ｍｅ２＋４より効果が少ないが、形質移入５日後で野生型より低いＴＦ発現（５５−６０％）となった。時間経過実験により野生型siＲＮＡはサイレンシングが比較的損なわれない場合、形質移入３日後で最も効果的であったが、その後はサイレンシングは遙かに早く衰える。（図９ｂ）。

マウスＴＦに対するsiＲＮＡによる肺腫瘍形成の悪性細胞循環能の低下
組織因子（ＴＦ）のノックダウンにより尾静脈注入細胞のマウスの肺循環での定着と肺腫瘍を形成能を低下しするかどうかを調べるための実験をデザイン実施した。注射に対照マウスのＴＦレベルを１０−２０％低下したノックダウン細胞を注射する前にマウスＴＦに対するsiＲＮＡを細胞に形質移入した。細胞に注射の６−２５日後にマウスを犠牲にした。０．２ｍｌ培地に２０万乃至１００万個の細胞を各マウスに注入した。使用マウスは全てｈＣ５７Ｂ１あった。三つのグループについて各実験を試験した。グループ１：注入前の細胞を未知機能のセリンキナーゼのＰＳＫＨ１に対するsiＲＮＡで前処理。グループ２：細胞をマウスＴＦに対するsiＲＮＡで前処理。グループ３：細胞をヒトＴＦに対するsiＲＮＡで前処理。マウスの検死後肺の肉眼で可視の腫瘍数を数えた。結果の例を表１と２に示す。マウスＴＦに対するsiＲＮＡで処置のマウスの受け入れ細胞（グループ２）は低い数字の腫瘍を発現する。グループ１のマウスはグループ２のマウスに比し約１０倍以上の腫瘍を発現し,
グループ３のマウスはその肺に５００個以上の腫瘍を有する。標的ｍＲＮＡに対するＲＮＡの効果は非常に特異的であるので（もしＲＮＡ配列を他のヌクレオチド配列と結合しないように適切に選択している場合）、グループ３のマウスはグループ２のマウスに比し肺腫瘍は２００−２５０倍迄増加するであろう。この実験により注入細胞のＴＦレベルは非常に特異的効果、即ち肺での腫瘍形成能を増加することが示された。

従ってＴＦ標的のsiＲＮＡは転移防止に有効で哺乳類の癌治療に用いることができる。特定種のＴＦ配列に適した高度に特異的なＴＦsiＲＮＡはＰＣＴ／ＮＯ０４／００００７に開示の選別法で見つけることができる。

表１ Ｃ５７マウスでのＴＦsiＲＮＡ形質移入Ｂ１６細胞注入１０日後の肺転移数

表２ Ｃ５７マウスでのＴＦsiＲＮＡ形質移入Ｂ１６細胞注入１５日後の肺転移数

マウスＴＦに対するsiＲＮＡによる肺腫瘍形成の悪性細胞循環能の低下
この実施例は実施例７の検証を表す。ｈＴＦの最適siＲＮＡ標的をかくまう領域に２００ｂｐ以内で対応する位置の部位を標的とするマウスＴＦ（ｍＴＦ）に特異的な８つのsiＲＮＡをデザインした。（ホレン、ティ等（Holen, T. et al）、前出（２００２年））。１００nＭsiＲＮＡによるＢ１６細胞のリポフェクタミン２０００仲介形質移入では異なる標的配列によ効率が非常に変化することが示され、以前の観察と一致した。（ホレン、ティ等（Holen, T. et al）、前出（２００２年））。二つの最も有効なsiＲＮＡのｍＴＦ２２３iとｍＴＦ３２１iは培養Ｂ１６細胞でｍＴＦｍＲＮＡを常に７０−８０％減少した。

尾静脈注入は血液感染性転移による腫瘍受け取りモデルを表すと仮定した。Ｂ１６−Ｆ１０（Ｂ１６）マウスメロノーマ細胞のＣ５７ＢＬ／６マウスへの尾静脈注入により１０−１４日以内に肺コロニーを形成する良く確立されたモデルを用いた。Ｂ−１６細胞組織因子（ＴＦ）のノックダウンが体外で尾静脈内部注入後肺腫瘍傾向を減少するかどうかを調べるための実験をデザイン実施した。注入前日に細胞をｈＴＦに対する対照siＲＮＡ（ｈＴＦ１６７i）かｍＴＦを標的とする二つの異なるsiＲＮＡ（ｍＴＦ２２３iとｍＴＦ３２１i）のいずれかで形質移入した。対照siＲＮＡのｈＴＦ１６７iは意図標的に対して非常に活性であるが（ホレン、ティ等（Holen, T. et al）、前出（２００２年））、ｍＴＦに対してかなりの不一致を含有し、且つ培養Ｂ１６細胞のｍＴＦ発現には全く効果がなかった。

各実験グループと回収時点で少なくとも５匹マウスで、三つの独立な盲検実験を実施した。マウスを第一実験では１０日目に、第二実験では１０日目と１５日目に、第三実験では１５日目と２０日目に回収した。全実験のデータを表１に示す。１０日目と１５日目に回収の試験グループと対照グループの治療マウスの典型的肺写真を図１０に示す。活性（ｍＴＦ）siＲＮＡで一過的に形質移入した細胞で処置し、それ故ＴＦ発現の減少を示す両グループのマウスは、調査の全時間点で対照グループのマウスに比し腫瘍発現が非常に少なかった。従って本実験は活性ｍＴＦsiＲＮＡによるＢ１６細胞の単一リポソーム仲介形質移入により体外での静脈内注射細胞での肺腫瘍発現を標的配列に特異的な遅延をもたらす。これはＴＦ発現の一過的ノックダウンに直接起因する。

siＲＮＡの体外単一投与で達成する保護ウインドウを対照と試験の形質移入細胞注入マウスの生存を観察して評価した。各グループの５匹か６匹のマウスを毎日数回観察し、腫瘍関連ストレスの最初の徴候で犠牲にした。マウスの平均生存性は対照グループの２２日から活性ｍＴＦ２２３i siＲＮＡ注入マウスの２７日と大いに増加した。（Ｐ＝０．０１）。

結論としてこの結果によりＴＦはＣ５７ＢＬ／６マウスでのＢ１６メラノーマ細胞の肺腫瘍転移促進において重大な機能を持つことが明らかに示された。従ってＴＦ標的のsiＲＮＡは転移防止に有効であり、哺乳類の癌治療に用いることができる。特定種のＴＦ配列に適する高度に特異的なＴＦ siＲＮＡ分子はＰＣＴ／ＮＯ０４／００００７に開示の選別法で見いだすことができる。

表１ 全実験での腫瘍発生率。分析に含まれる腫瘍平均数とマウスの総数（括弧）を各実験グループと回収時間点に対して示す。試験グループ（ｍＴＦ２２３i，ｍＴＦ３２１i）と対照グループ（ｈＴＦ１６７i）での腫瘍差の有意水準は星印で示す。（＊：Ｐ＝０．０１、＊＊：Ｐ＜０．００１）。n.d.：決定せず。

siＲＮＡの全身適用効果
実施例７と８でＴＦのノックダウンがＢ１６メラノーマ細胞による肺コロニー形成を防ぐことが示された。本発明者は更にＴＦ標的siＲＮＡの効果も又siＲＮＡの全身注入後も明白で、siＲＮＡの治療使用の可能性を示した。（図１１参照）。ｈＴＦ１６７iを負の対照に用いた。

注入混合物を腹腔（i.p.）注入用にｍＴＦ siＲＮＡとｈＴＦ siＲＮＡの各混合物に対して全容量１５ｍｌで作成した。
アンニールしたsiＲＮＡ１０５０μｌ（５０μＭ，５０μｇ／ｍｌ）＋オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）６５００μｌ
リポフェクタミン２００１５００μｌ＋オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）６０００μｌ
５分後二つの溶液を一緒にし、注入前に２０分間保温した。注入に際し対照siＲＮＡ用混合物を１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５で置換した。

体内動物実験ではマウスをそれぞれ１０匹の動物グループに分けた。グループはＢ１６メラノーマ細胞で一回静脈注射した。試験グループは試験用のＴＦ標的siＲＮＡ分子含有注入混合物をもう一度静脈注射した。一回注射はＢ１６メラノーマ細胞投与の一日前に投与し、追加に静脈注射をこのメラノーマ細胞注射後３日目と６日目にそれぞれ一回注射した。

図１１に示す結果はＴＦ標的siＲＮＡはＢ１６メラノーマ細胞による肺のコロニー形成を阻害し、siＲＮＡサイレンシングが転移防止に有効であることを示す

siＲＮＡ、レポーター作成物及び導入遺伝子発現のＲＮＡiを示す。 ＨａＣａＴ細胞の標準同時形質移入アッセイでのsiＲＮＡの有効性を示す。 内因性ＴＦ発現のsiＲＮＡ仲介による減少を示す。 ｈＴＦ１６７iの用量反応曲線を示す。 siＲＮＡ仲介によるＲＮＡiの時間依存性を示す。 siＲＮＡ修飾を示す。 内因性ｈＴＦｍＲＮＡに対する突然変異体活性を示す。 内因性ＴＦｍＲＮＡに対する化学修飾siＲＮＡ活性を示す。 化学修飾siＲＮＡによるＴＦサイレンシングの持続性を示す。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＴＦsiＲＮＡ形質移入Ｂ１６細胞の静脈注射の効果を示す。 siＲＮＡの全身投与効果を示す。

Claims (22)

1. 転移防止に有効な薬組成作成として組織因子（ＴＦ）標的の一つ以上の短い妨害ＲＮＡ分子（siＲＮＡ）の使用。
2. ＴＦ又はその断片が脊椎動物起源、好ましくは哺乳類起源、より好ましくはヒト起源である請求項１の使用。
3. siＲＮＡが少なくとも１９のヌクレオチドからなる一重鎖siＲＮＡか二重鎖siＲＮＡで、且つ核酸配列かその断片をコード化する組織因子に向かい、siＲＮＡ分子が
   （a）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７で、その補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８―ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５３で示す核酸配列を持つsiＲＮＡ分子、
   （ｂ）（a）のsiＲＮＡ分子に約９０％相同な配列を持つsiＲＮＡ分子、
   （ｃ）標的部位が補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８―ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５３で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７の５‘位か３’位末端方向のいずれかにヌクレオチド７個までシフトした配列を含むsiＲＮＡ分子、
   （ｄ）（ｃ）のＲＮＡ分子に約９０％相同な配列を持つsiＲＮＡ分子、および
   （e）配列がＣ_１−Ｃ_３アルキル、Ｃ_１−Ｃ_３アルケニル又はＣ_１−Ｃ_３アルキリル基を配列の一つ以上の２‘位ＯＨ水酸基に導入して修飾するか、又はリン酸ジエステル結合をチオリン酸結合で置換修飾した（a）―（ｄ）の核酸配列を持つsiＲＮＡからなるグループから選択する請求項１と２のいずれかの使用。
4. このsiＲＮＡが二重鎖である請求項１の使用。
5. このsiＲＮＡが長さ２１乃至２５個のヌクレオチド、好ましくは長さ２１個のヌクレオチドである請求項１の使用。
6. このsiＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８で特定される請求項１乃至５のいずれかの使用。
7. siＲＮＡがｍＲＮＡ開裂を誘導する請求項１乃至６のいずれかの使用。
8. siＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１かＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ煮で特定される請求項７の使用．
9. siＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０乃至３１で示される配列の請求項８の使用。
10. 配列がＣ_１−Ｃ_３アルキル、Ｃ_１−Ｃ_３アルケニル又はＣ_１−Ｃ_３アルキリル基を配列の一つ以上の２‘位ＯＨ水酸基に導入修飾する請求項９の使用。
11. siＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９、１０又は１１で示される配列である請求項１０の使用。
12. 配列がリン酸ジエステル結合をチオリン酸結合で置換修飾する請求項１１の使用。
13. siＲＮＡ分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４でその補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８でその補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４４、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２９でその補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４５で示される配列である請求項１２のＲＮＡ分子（siＲＮＡ）。
14. siＲＮＡ分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２９でその補体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４５で示される配列である請求項１３の使用。
15. 薬組成が任意に例えば希釈剤、潤滑剤、結合剤、担体崩壊手段、吸収手段、着色剤、甘味剤及び／又は風味剤を含む請求項１乃至１４のいずれかの使用。
16. 組成が賦活剤及び／又は他の治療方針を含む請求項１乃至１５のいずれかの使用。
17. 薬組成が非経口（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内注射か点滴）、経口、経鼻、頬側、直腸、膣投与用に処方した請求項１乃至１６のいずれかの使用。
18. この薬組成が在来の無毒性薬剤容認の担体、補助剤及び／又は媒体含有の用量処方で、例えば点滴溶液や点滴懸濁液、エアロゾル、カプセル、錠剤、丸薬、噴霧、座薬などとして処方した請求項１乃至１７のいずれかの使用。
19. この薬組成を一回用量、分割用量で又は持続性放出処方により投与する請求項１乃至１８のいずれかの使用。
20. この薬組成を単独か他の薬と一緒に投与する請求項１乃至１９のいずれかの使用。
21. siＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７でその補体がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５３で特定される請求項１乃至５のいずれかの使用。
22. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７でその補体がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５３で示される核酸配列を持つことを特徴とするsiＲＮＡ。
    
    
    

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