CN101970660B - 用于使脱靶效应最小化并使RNAi机制的饱和消除的新的siRNA结构及其用途 - Google Patents

用于使脱靶效应最小化并使RNAi机制的饱和消除的新的siRNA结构及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新的siRNA结构及其用途，更具体地说，本发明涉及双链小干扰RNA分子(siRNA分子)，其包括19-21个核苷酸(nt)的反义链和具有与反义链互补的序列的15-19nt的有义链，其中反义链的5’端具有平头末端，反义链的3’端具有突出端，本发明还涉及使用siRNA分子使目标基因的表达沉默的方法。

Description

用于使脱靶效应最小化并使RNAi机制的饱和消除的新的siRNA结构及其用途
技术领域
本发明涉及新的siRNA结构及其用途，更具体地说，本发明涉及新的siRNA分子，其具有高度基因沉默效率(silencing efficiency)，不使RNAi机制饱和并使由siRNA有义链引起的脱靶效应最小化。
背景技术
RNA干扰(此后缩写为“RNAi”)是其中细胞或其类似物被引入了双链RNA(此后缩写为“dsRNA”)的现象，所述双链RNA包括与目标基因的mRNA同源的有义RNA和与有义RNA互补的反义RNA，该dsRNA可诱导目标基因mRNA的降解并抑制目标基因的表达。如上所述由于RNAi可被用于抑制目标基因的表达，其作为可应用于基因治疗的方法或者作为代替以复杂且效率低下的同源重组为基础的常规基因断裂方法的简单基因敲除(knockout)方法引起了极大关注。RNAi现象最初在线虫中发现(Fire，A.等人，Nature，391：806，1998)。目前，该现象不仅在线虫中被观察到，而且在各种生物体包括植物、线形动物门、果蝇、实蝇和原生动物中观察到(Fire，A.，Trends Genet.，15：358，1999；Sharp，P.A.，Genes Dev.，15：485，2001；Hammond，S.M.等人，Nature Rev.Genet.，2：110，2001；Zamore，P.D.，Nat.Struct.Biol.，8：746，2001)。已经确认当将外源dsRNA引入到这些生物体内时目标基因表达受到实际抑制。RNAi还被用作建立敲除个体(knockout individual)的方法。
在哺乳动物细胞中，与其他生物体类似，已经尝试通过引入外源dsRNA来诱导RNAi。但是，在这种情况下，宿主细胞针对病毒感染的防御机制由引入的dsRNA运行，由此抑制了蛋白质合成，观察不到RNAi。但是，据报道，当包括2或3个核苷酸(nt)的3’突出端的单链具有全长为21或22个碱基对(bp)的短dsRNA被引入到哺乳动物细胞中替代在其他生物体中使用的长双链RNA时，可在哺乳动物中诱导RNAi(Elbashir，S.M.等人，Nature，411：494，2001；Caplen，N.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：9742，2001)。
另外，据报道在反义链和有义链的每个3’端具有2nt的突出端并包括19-bp双螺旋区的siRNA分子是RNAi途径的引发子(initiator)，并且不管是具有平头末端的siRNA分子还是具有短于19bp(碱基对)的双螺旋区域的siRNA分子都显示了很低的效率，即便当它们被高浓度检测时也是如此(Elbashir等人，EMBO J.，20：6877，2001)。因此，长于19bp的siRNA分子已经被测定，相反短于19bp的siRNA分子的基因沉默效率由于阴性结果的报告而尚未测定。
同时，在由RNAi分子介导的基因沉默中发现了出乎意料的问题。具体地，问题在于外源siRNA分子使RNAi机制饱和。这种饱和导致siRNA分子之间的竞争。由于这种原因，细胞内miRNA效率被降低，并且当两种或多种siRNA分子被引入时，siRNA的基因沉默效率降低。此外，在常规siRNA分子中，有义链而不是反义链可起作用，因此存在脱靶效应的风险。
因此，本发明的发明人付出了极大的努力来提供新的siRNA分子，其具有高基因沉默效率，同时不与其他外源或内源RNAi机制相互干扰。结果，本发明的发明人构建了具有新的结构的siRNA分子，并发现构建的siRNA分子具有高于或者类似于先前已知的siRNA分子的基因沉默效率，不与其他外源或内源RNAi机制相互干扰，并且不显示由有义链引起的脱靶效应，由此完成本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供新的siRNA分子，其不使RNAi机制饱和，由此使其能够解决与siRNA之间的竞争有关的问题，解决与siRNA分子的有义链引起的脱靶效应有关的问题，同时具有极佳的基因沉默效果。
本发明的另一目的在于提供使用所述siRNA分子抑制细胞中目标基因表达的方法。
为实现上述目的，本发明提供了双链小干扰RNA分子(siRNA分子)，包括：19-21个核苷酸(nt)的反义链；和具有与反义链互补序列的15-19nt的有义链，其中反义链的5’末段具有平头末端，并且反义链的3’末端具有突出端。
本发明还提供了使用所述siRNA分子抑制细胞中目标基因表达的方法。
通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将更加明显。
附图说明
图1是显示当将siRNA引入到细胞中时根据TIG3mRNA-目标siRNA分子结构的TIG3mRNA水平的示意图。
图2是显示当将siRNA引入到细胞中时根据核纤层蛋白mRNA-目标和存活素mRNA-目标siRNA的分子结构的mRNA水平的示意图。
图3是显示以TIG3、核纤层蛋白和存活素的mRNA为靶标的16+3AsiRNA结构的基因沉默效率的示意图。
图4是显示包括以TIG3、核纤层蛋白和存活素的mRNA为靶标的21个核苷酸(nt)的反义链的siRNA分子的基因沉默效率的示意图。
图5是显示与15+4A和17+2A siRNA结构相比，将15+4S和17+2SsiRNA结构引入到细胞中时mRNA的水平的示意图。
图6是显示与17+2A和15+4A siRNA结构相比，将17-2A和15-4AsiRNA结构引入到细胞中时mRNA的水平的示意图
图7是显示以整合素mRNA为靶标的17+2A和16+3A siRNA结构的基因沉默效率的示意图。
图8是显示对于TIG3、核纤层蛋白、存活素和整合素siRNA的IC50值的示意图。
图9示出了用于各种基因的16+5A siRNA结构。
图10是显示将siRNA引入到细胞中时图9中的每个基因的mRNA水平的示意图。
图11是显示为检查存活素基因和NF-kB基因的表达是否被引入到细胞中的16+3A或者16+5A siRNA结构所沉默而进行的免疫印迹结果的照片。
图12是显示使用siRNA处理的细胞的表现型的荧光照片和示意图。
图13显示了通过将19+2和16+3A siRNA结构引入到细胞中并对细胞进行5’RACE分析得到的结果。
图14示出了显示通过将19+2和16+3A siRNA结构引入到细胞中然后测定siRNA对于血清核酸酶的灵敏度的照片和示意图。
图15是显示当将siTIG、si存活素和si核纤层蛋白分别与siCREB3一起引入到细胞中时根据siRNA结构的CREB3mRNA水平的示意图。
图16是显示当引入siTIG3时根据siRNA结构的含有miR-21靶标位点的报告子(reporter)的标准荧光素酶活性与不含miR-21靶标位点的报告子的标准荧光素酶活性之比的示意图。
图17示出了当设计脱靶效应的实验时的有义靶标mRNA与反义靶标mRNA。
图18是显示根据脱靶效应实验中siRNA结构的通过siRNA有义链和反义链的荧光素酶表达的抑制效果的示意图。
图19是显示16+3和16+3A siRNA结构的有义链的脱靶效果的比较的示意图。
图20是其有义链的5’端已经被修饰的19+2和16+3A siRNA结构的有义链的脱靶效应；以及显示将siTIG结构与siCREB3一起引入到细胞中时根据siRNA结构的CREB3mRNA水平的示意图。
具体实施方式
在本发明的详细说明中使用的所有科技术语及其类似物定义如下。在本文中，“siRNA”是以序列特异性的方式介导有效基因沉默的短双链RNA(dsRNA)。
术语“内源基因”指的是在细胞基因组中其原始位置的内源基因(native gene)。相反，术语“转基因”指的是将来自外源诸如病毒或者细胞内寄生虫的基因或者通过重组技术或者其他物理方法引入的基因。
术语“基因”必须被认为是最广义的，目标基因可编码结构蛋白或者调节蛋白。术语“调节蛋白”包括转录因子、热休克蛋白或者在DNA/RNA复制、转录和/或翻译中涉及的蛋白。目标基因还可以是已经整合到动物基因中或者作为染色体外(遗传)因子存在的病毒基因组中固有的。例如，目标基因可以是HIV基因组上的基因。在这种情况下，siRNA分子对于哺乳动物细胞中HIV基因的转录失活来说是有用的。
术语“核苷酸(nt)”指的是核酸的基本单位，术语“19nt核苷酸”指的是19个核苷酸的单链核酸。
在一个方面，本发明涉及双链小干扰RNA分子(siRNA分子)，包括：19-21个核苷酸(nt)的反义链；以及具有与反义链互补的序列的15-19nt有义链，其中反义链的5’端为平头末端，反义链的3’端为突出端。
在本发明中，反义链的长度优选为19nt，有义链的长度优选为15-17nt，突出端的长度优选为2-4nt。在本发明中，siRNA分子可化学或者酶合成。
换言之，根据本发明的siRNA结构包括所谓的″17+2A″、″16+3A″和″15+4A″结构，这些结构分别如下。术语“17+2A siRNA结构″指的是包括19nt反义链和具有与其互补的序列的17nt的有义链的双链siRNA分子，其中反义链的5’端为平头末端，反义链的3’端为具有2nt的突出端。而且，术语“16+3A siRNA结构”指的是包括19nt反义链和具有与其互补的序列的16nt的有义链的双链siRNA分子，其中反义链的5’端为平头末端，反义链的3’端为具有3nt的突出端。最后，术语“15+4AsiRNA结构”指的是包括19nt反义链和具有与其互补的序列的15nt的有义链的双链siRNA分子，其中反义链的5’端为平头末端，反义链的3’端为具有4nt的突出端。
根据本发明的siRNA结构具有有效抑制目标基因的表达而不使RNAi机制饱和的效果。而且，它们具有消除由siRNA分子的有义链引起的脱靶效应的效果。
根据本发明的siRNA分子可具有15+4A结构，其中有义链的长度为15nt并且反义链的3’端突出端长度为4nt。15+4A siRNA结构不明显地与其他siRNA竞争，显示了高度的基因沉默效率并且在siRNA的基因沉默时使副作用最小化。也就是说，该结构不使RNAi机制饱和并使由siRNA的有义链引起的脱靶效应最小化。
另外，根据本发明的siRNA分子可具有16+3A结构，其中有义链的长度为16nt并且反义链的3’突出端长度为3nt。16+3A siRNA结构不明显地与其他siRNA竞争，显示了高度的基因沉默效率并且使由siRNA的有义链引起的脱靶效应最小化。
同时，本发明的siRNA分子可以是按照常规方法合成的分子，但本发明的范围不限于此。也就是说，在本发明中，siRNA分子可以化学合成或者酶合成。本发明的siRNA分子可通过标准重组技术由天然存在的基因得到，唯一的要求是siRNA分子在核苷酸序列的水平上与其表达被修饰的目标基因的mRNA的至少一部分实质上互补。“实质上互补”的意思是合成siRNA的反义链的序列至少大约80％-90％与目标基因的mRNA互补，优选至少大约90-95％与目标基因的mRNA互补，更优选至少大约95-99％与目标基因的mRNA互补或完全互补。
在另一方面，本发明涉及使用所述siRNA分子抑制细胞中目标基因的表达的方法。
在本发明中，siRNA分子的反义链优选与目标基因的mRNA序列互补。在本发明中，目标基因可以是内源基因或者转基因。
实施例
此后，将参照实施例对本发明进一步进行详细描述。但是应当理解的是，这些实施例仅用于说明的目的，而不解释为对本发明范围的限制。
优选地，在下列实施例中，仅仅TIG3、核纤层蛋白A/C、存活素、整合素、钙依赖磷酸酶、ATF6、DBP、TEF、HIF-1α-01、HIF-1α-02和NF-kB作为目标基因示出，但应当理解的是，当制备以其他基因为靶标的siRNA分子时，它们将显示与以示出的基因为靶标的siRNA分子相同的结果。
实施例1：siRNA分子的制备：以TIG3的mRNA为靶标的siRNAs
制备针对已知作为抑制并调节多种人类肿瘤细胞系的蛋白质表达的肿瘤抑制子基因的TIG3基因的mRNA的各种siRNA结构变体。制备的siRNA变体的序列在下表1中示出。
表1：以TIG3基因的mRNA为靶标的siRNA分子
如表1的(a)所示，在19-bp(碱基对)双链处具有的2 nt的3’突出端结构，其在现有技术中是已知的作为具有最佳基因沉默效果的siRNA分子结构，被命名为″19+2″结构以便表示其与根据本发明的siRNA结构的″17+2A″、″16+3A″和″15+4A″相比较。而且，如表1的(b)、(c)、(e)、(g)和(i)所示，分别将具有19bp、17bp、16bp、15bp和13bp长度的平头末端双链RNA结构命名为“19+0结构”、“17+0结构”、“16+0结构”、“15+0结构”和“13+0结构”。另外，如表1的(j)中所示，包括19nt反义链和具有与其互补的序列的13nt有义链的双链siRNA分子被命名为“13+6A”结构，其中反义链的5’端为平头末端并且反义链的3’端具有6nt的突出端。
实施例2：siRNA的基因(TIG3)沉默效率分析
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将在实施例1中制备并具有表1中所示的结构的siRNA引入到人恶性胶质瘤细胞系(ACTC CRL1690)中。将细胞分别使用100nM、10nM和1nM的不同浓度的siRNA处理，并使用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定每种siRNA的TIG3基因沉默效率。在引入siRNA之后48小时收集细胞，使用Tri-reagent Kit(Ambion)从细胞裂解物中提取总RNA。然后将总RNA(1μg)用作cDNA合成的模板，并根据生产商的操作手册使用Improm-IlTM逆转录系统(Promega)对cDNA合成进行分析。使用Rotor-Gene 3000(Corbett Research)通过实时定量RT-PCR分析cDNA产物的片段(1/20)。使用Rotor-Gene 6软件(Corbett Research)对数据进行分析，在RT-PCR中使用的引物序列如下。
用于TIG3的RT-PCR的引物对：
TIG3-正向引物(序列号：13)：5’-AGA TTT TCC GCC TTG GCT AT-3′
TIG3-反向引物(序列号：14)：5’-TTT CAC CTC TGC ACT GTT GC-3′
结果，如图1所示，TIG3mRNA的水平在使用具有19+0、17+0、15+0和13+0结构的平头末端双链siRNA处理的组中比使用现有技术中已知的最有效结构的19+2结构处理的组更高，表明19+0、17+0、15+0和13+0结构的TIG3基因沉默效应低于19+2结构的基因沉默效应。特别是，当使用100nM和10nM浓度的siRNA处理细胞时，13+0结构显示了具有很少或者没有基因沉默效应，15+0结构将TIG3mRNA水平降低到40％，但当使用1nM浓度的siRNA处理细胞时，其显示了非常低的基因沉默效应。
相反，在根据本发明的17+2A和15+4A siRNA结构的情况下，观察到TIG3mRNA水平几乎类似于现有技术中已知具有最高基因沉默效率的19+2siRNA结构的水平，尽管双链区少于19个核苷酸(nt)。但是，在13+6A结构中，观察到mRNA水平的更少降低。
上面描述的实验结果与短于19nt的siRNA结构的基因沉默效应比先前已知的19+2结构低的已有报道相反。也就是说，该实验结果表明，当siRNA被构造成使反义链的3’端分别具有2nt和4nt的突出端，并且反义链的5’端为平头末端，它们显示了几乎与现有技术中已知具有最高基因沉默效率的19+2siRNA结构的基因沉默效率相等的基因沉默效率，尽管其双链区短至17nt和15nt。但是，13+6A结构显示了较低的基因沉默效率，因此可以确定17+2A、16+3A和15+4A结构是优选的siRNA结构。
在下列实施例中，使用其他mRNA作为靶标进行了其他的实验以便检查上面提到的结果是否仅限于TIG3基因。
实施例3：siRNA的基因(核纤层蛋白A/C和存活素)沉默效率分析
如表2和3所示，以核纤层蛋白A/C和存活素的mRNA为靶标的siRNA制备成具有19+2结构、19+0结构、17+0结构、17+2A结构和15+4A结构。表2示出了以核纤层蛋白A/C mRNA为靶标的siRNA分子，表3示出了以存活素mRNA为靶标的siRNA分子。
表2；以核纤层蛋白A/C mRNA为靶标的siRNA分子
Figure BPA00001205361800111
表3；以存活素mRNA为靶标的siRNA分子
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将每个制备的siRNA以100nM、10nM和1nM的不同浓度引入到HeLa细胞(ACTC CCL-2)中，并以与实施例2中相同的方式使用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞中mRNA的水平。
用于核纤层蛋白A/C的RT-PCR的引物对
核纤层蛋白-正向引物(序列号：29)：5’-CCG AGT CTG AAG AGGTGG TC-3’
核纤层蛋白-反向引物(序列号：30)：5′-AGG TCA CCC TCC TTCTTG GT-3
用于存活素的RT-PCR的引物对
存活素-正向引物(序列号：31)：5’-GCA CCA CTT CCA GGG TTTAT-3’
存活素-反向引物(序列号：32)：5’-CTC TGG TGC CAC TTT CAAGA-3’
结果，如图2所示，在所有测试浓度下具有17+2A结构的siRNA非常有效地降低了核纤层蛋白A/C和存活素mRNA水平，并且其显示了比19+2结构更高的效率。在100nM和10nM浓度下15+4A结构显示了与19+2结构相同的基因沉默效率，并且在1nM浓度下其基因沉默效率略低于19+2或者17+2A结构。
这些结果表明，当制备以其他基因为靶标的siRNA时，根据本发明的17+2A结构和15+4A结构具有与实施例2中描述的19+2结构几乎相等的基因沉默效率。另外，这些结果表明，根据本发明的siRNA结构不仅仅限于某些基因，通常可应用于广泛的基因范围。
实施例4：siRNA的基因沉默效率分析：16+3A结构的实验
以实施例2和3中的相同方式以1nM and 10nM的不同浓度检测了以TIG3、核纤层蛋白A/C和存活素的mRNA的16+3A siRNA分子，并测定了基因的mRNA水平。制备了以核纤层蛋白A/C和存活素的mRNA为靶标的16+3A siRNA结构，其序列如下。
核纤层蛋白A/C 16+3A的结构
反义链：5′UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(序列号17)
有义链：3′ACAAGAAGACCUUCAG    (序列号33)
存活素16+3A的结构
反义链：5′UGAAAAUGUUGAUCUCCUU (序列号24)
有义链：3′ACUUUUACAACUAGAG    (序列号34)
结果，如图3的(a)、(b)和(c)所示，当测定TIG3、核纤层蛋白A/C和存活素的mRNA水平时，16+3A siRNA结构的引入显示了与19+2结构或者17+2A结构类似的mRNA水平。这些实验结果表明16+3A siRNA结构具有与17+2A结构类似的基因沉默效率，并高于15+4A结构的基因沉默效率。
实施例5：包括21nt反义链的siRNA的基因沉默效率分析
制备以TIG3、核纤层蛋白A/C和存活素的mRNA为靶标的siRNA结构，使反义链的长度为21nt。制备的siRNA结构在表4到6中显示
表4；以TIG3mRNA为靶标的siRNA分子
Figure BPA00001205361800131
Figure BPA00001205361800141
表5；以核纤层蛋A/C mRNA为靶标的siRNA分子
Figure BPA00001205361800142
表6；以存活素mRNA为靶标的siRNA分子
Figure BPA00001205361800151
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将每个制备的siRNA以10nM和1nM的不同浓度引入到HeLa细胞(ACTC CCL-2)中，并以与实施例2和3中相同的方式使用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定基因的mRNA的水平。
首先，将每个siRNA引入到细胞中，并测定mRNA水平。结果，如图4的(a)中所示，将每种19+2A、17+4A、16+5A和15+6A siRNA结构以10nM的浓度引入到细胞中时，每种siRNA结构的TIG3mRNA-沉默效率几乎与现有19+2结构相等。而且，TIG3mRNA沉默效率在14+7A结构和13+8A结构中逐渐下降。此外，将每种siRNA结构以1nM的浓度引入时，siRNA结构的TIG3mRNA沉默效率在14+7A结构和13+8A结构中极大地降低。
实验结果表明，siRNA分子的反义链长度增加到21nt时，如果其被构建成使反义链的5’端为平头末端并且反义链的3’端具有突出端的话，siRNA分子显示了很高的基因沉默效率。但是，14+7A结构或者13+8A结构显示了降低的基因沉默效率，表明siRNA分子的有义链的优选长度为15-19nt。
另外，测定了核纤层蛋白A/C和存活素的mRNA水平。结果，如图4的(b)和(c)所示，当将表5的siRNA引入到细胞中时，15+6A结构的基因沉默效率降低，但19+2A结构、17+4A结构和16+5A结构显示了较高的基因沉默效率。而且，当将表6的siRNA引入到细胞中时，使用1nM的15+6A结构处理的细胞显示基因沉默效率略微降低，但使用每种10nM的15+6A结构、19+2A结构、17+4A结构和16+5A结构处理的细胞显示了几乎与已有19+2结构相等的基因沉默效率。
这些实验结果表明，当制备针对TIG3以外的基因的19+2A、18+3A、17+4A和16+5A结构时，siRNA结构具有几乎与已有19+2结构相等的基因沉默效率。这表明根据本发明的siRNA结构不限于某些基因，并可应用于广泛的基因范围。
实施例6：平头末端和突出端的朝向I
为了检查本发明的siRNA结构的平头末端和突出端的朝向对基因沉默效率的影响，以实施例2(TIG3)和实施例3(核纤层蛋白A/C)中相同的方式制备并检测具有表7和8中显示的结构的siRNA分子。
表7；以TIG3mRNA为靶标的siRNA分子
Figure BPA00001205361800161
表8：以核纤层蛋白A/C mRNA为靶标的siRNA分子
Figure BPA00001205361800162
结果，如图5的(a)中所示，将以TIG mRNA为靶标的表7的siRNA分子引入到细胞中时，表7的(c)中显示的15+4S结构显示了比表7的(b)中显示的15+4A结构更高的mRNA水平。而且，将表8中显示的siRNA分子引入到细胞中然后观察核纤层蛋白mRNA水平。结果，如图5的(b)中所示，将每个siRNA以1nM的浓度引入时，17+2S结构显示了略高于17+2A结构的mRNA水平。
这些实验结果表明，当siRNA结构被构建成使反义链的3’端为平头末端，反义链的长度为15-17nt并且有义链的长度为19nt时，siRNA结构的基因沉默效率降低。换言之，可以看出其中反义链的5’端为平头末端并且反义链的3’端具有突出端的siRNA结构显示了更高的基因沉默效率。但是，由于这可能是由反义链的长度改变引起的效果，另外进行了下面的实验。
实施例7：平头末端和突出端的朝向II
以与实施例3(核纤层蛋白A/C)和实施例2(TIG3)中相同的方式制备具有表9和10中显示的结构的siRNA分子，并测定基因的mRNA水平。
表9；以核纤层蛋白A/C mRNA为靶标的siRNA分子
Figure BPA00001205361800171
表10；以TIG3mRNA为靶标的siRNA分子
Figure BPA00001205361800181
结果，如图6所示，当将17+2A与17-2A结构相互比较时，在所有浓度下17-2A结构都显示了更高的核纤层蛋白A/C mRNA水平(图6的(a))。当将15+4A与15-4A相互比较时，15-4A结构显示了更高的TIG3mRNA水平(图6的(b))。特别是，15-4A结构在1nM的浓度下显示了极高的mRNA水平。
这些实验结果表明，当反义链的5’端具有平头末端并且反义链的3’端具有突出端时，siRNA结构显示了几乎与已知的现有技术中最有效结构的19+2结构类似的基因沉默效率，但当反义链的3’末端为平头末端并且反义链的5’末端为突出端时，siRNA具有很低的基因沉默效率。
这些结果与实施例6的结果一起表明，siRNA结构的平头末端和突出端的朝向影响siRNA结构的基因沉默效率。
实施例8：整合素siRNA的基因沉默效率分析以及IC50的比较
对于整合素基因，具有表11中显示的结构的siRNA以实施例2中相同的方式制备并检测以测定mRNA水平，并将通过对于整合素基因以及上面提到的TIG3、核纤层蛋白A/C、存活素基因的实验结果得到的IC50值相互进行比较。
表11：以整合素mRNA为靶标的siRNA分子
Figure BPA00001205361800191
用于整合素RT-PCR的引物对
整合素-正向引物(序列号：45)：5’-CGT ATC TGC GGG ATG AATCT-3’
整合素-反向引物(序列号：46)：5’-GGG TTG CAA GCC TGT TGTAT-3’
首先，测定了整合素mRNA的水平。结果，如图7所示，17+2A和16+3A结构都显示了与19+2结构的siRNA类似的mRNA水平。
同时，测定了IC50值。结果，如图8所示，16+3A siRNA结构显示了几乎与19+2siRNA结构(siTIG3和si存活素)相等的IC50值，或者略微增加(si核纤层蛋白和si整合素)。
另外，为了检查RNAi-介导的基因沉默是否可仅仅通过siRNA的反义链来进行，仅仅将siRNA反义链引入到细胞中并测定基因沉默效率。特别是，以上面描述的相同方式将si存活素反义链引入到细胞中，并测定存活素mRNA的水平。结果，如图8B所示，当仅仅引入反义链时，基因沉默效率显著降低。
这些实验结果表明，根据本发明的siRNA分子的基因沉默效率由dsRNA-介导的RNAi引起。
实施例9：16+5A siRNA结构的基因沉默效率分析
将dTdT加入到16+3A结构的反义链的3’端以构建如图9所示的16+5A结构，并且将19+2和16+3A siRNA结构的沉默活性相互比较。此时，根据本发明的siRNA结构通常是否可被应用，通过构建用于除了已有的TIG3、核纤层蛋白A/C、存活素和整合素以外的各种基因的siRNA进行另外的检测，测定构建的结构的活性并将其与现有的19+2结构进行比较。通过经实施例2中描述的实时定量RT-PCR测定每个基因的mRNA水平来测定siRNA活性。用于TIG3、核纤层蛋白A/C、存活素和整合素基因的引物对在上面描述的实施例中已经提供，用于其它基因的引物对如下：
用于钙依赖磷酸酶的RT-PCR的引物对：
钙依赖磷酸酶-正向引物(序列号：47)：5’-GCA ACC ATG AAT GCAGAC AC-3’
钙依赖磷酸酶-反向引物(序列号：48)：5’-TGG TGA AAG TCC ACCATG AA-3’
用于ATF6RT-PCR的引物对
ATF6-正向引物(序列号：49)：5’-GCC TTT ATT GCT TCC AGCAG-3’
ATF6-反向引物(序列号：50)：5’-TGA GAC AGC AAA ACC GTCTG-3’
用于DBP RT-PCR的引物对
DBP-正向引物(序列号：51)：5’-GTA GAC CTG GAC GCC TTCCT-3’
DBP-反向引物(序列号：52)：5’-CGG GTT CAA AGG TCA TCAAC-3’
用于TEF RT-PCR的引物对
TEF-正向引物(序列号：53)：5’-CCC CAG CCT ATG ATC AAAAA-3’
TEF-反向引物(序列号：54)：5’-CCG GAT GGT GAT CTG ATT CT-3’
用于HIF1α(HIF1α-01和HIF1α-02)RT-PCR的引物对
HIF1α-正向引物(序列号：55)：5’-CCA GCA ACA GAA AGT CGTCA-3’
HIF1α-反向引物(序列号：56)：5’-GGC TAT ACT TGG GCA TGGAA-3’
用于NF-kB RT-PCR引物对
NF-kB-正向引物(序列号：57)：5’-CCT GGA GCA GGC TAT CAGTC-3’
NF-kB-反向引物(序列号：58)：5’-CAC TGT CAC CTG GAA GCAGA-3’
结果，如图10的(a)到(i)所示，当测定每种基因的mRNA水平时，16+5A siRNA结构的引入也显示了与19+2结构类似的mRNA水平。这些实验结果表明16+5A siRNA结构也具有很高的基因沉默效率。
实施例10：通过免疫印迹技术分析siRNA的基因沉默效率
为了检查根据本发明的siRNA结构的基因沉默效率，对存活素基因和NF-kB基因进行免疫印迹。首先，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将10nM的si存活素的19+2和16+3A结构以及siNF-kB的19+2和16+5A结构引入HeLa细胞(ACTC CCL-2)中，48小时后，将细胞在含有150mM NaCl、Tris pH 7.5、0.5％SDS、0.1％脱氧胆酸钠、0.02％叠氮化钠、1mM EDTA以及蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。
然后，使用Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液将得到的蛋白电泳到SDS-PAGE凝胶上，然后转移到硝酸纤维素膜上。然后，将膜使用含有5％奶粉的TBS缓冲液封闭，然后与针对存活素蛋白和NF-kB蛋白的抗体(细胞信号传导)一起孵化。使用ECL测定系统(Amersham Biosciences)形成印迹并暴露于X-射线膜(Kodak)。结果，如图11(a)和图11(b)所示，16+3A和16+5A siRNA结构显示了与已有的19+2结构类似的基因沉默效率，并且与对照组(没有使用siRNA处理)相比显著地抑制了每种蛋白质的表达。
实施例11：当使用siRNA处理时的表现型分析
存活素是对于细胞活力和细胞周期进程所需的细胞凋亡蛋白质的抑制剂。而且，已经报道存活素在大多数癌细胞中过表达，当其功能被阻断时，细胞增殖受到抑制并且诱导多倍体表现型。因此，在该实施例中，用于存活素基因的siRNA被构建成具有19+2结构和根据本发明的16+3A结构，并且观察到其表现型的变化。
首先，使用Lipofectamine 2000将19+2和16+3A siRNA结构分别引入到HeLa细胞中，48小时以后，将细胞使用3.7％的甲醛固定。将固定的细胞使用2μg二脒基苯基吲哚(DAPI)溶液染色，并使用荧光显微镜观察其表现型。
结果，如图12(A)所示，与仅使用转染试剂处理而没有siRNA的模拟(mock)相比，使用19+2siRNA结构处理的细胞组显示了增加的细胞尺寸和多倍体细胞数目的增加。而且，在使用16+3siRNA结构处理的细胞组中，观察到多倍体表现型被诱导。
同时，为了对每个细胞组中的多倍体细胞的比例进行定量，进行流式细胞术。具体地说，使用Lipofectamine 2000将19+2和16+3A siRNA结构分别引入到HeLa细胞中，48小时后，收集细胞，并在PBS(磷酸盐缓冲液)中使用2％FBS洗涤，然后在70％乙醇中固定过夜。然后将细胞悬浮在250μL的含有50μg/mL RNase A的PBS中，并在37℃下孵化30分钟，接着使用25μL/mL的碘化丙啶处理。通过FACSCalibur System(Becton Dickinson)分析碘化丙啶染色的细胞。
结果，如图12(B)所示，观察到分别使用19+2和16+3A siRNA结构处理的组均以相同的比例诱导了多倍体细胞。
这些结果表明，根据本发明的16+3siRNA结构以与19+2siRNA结构相同的水平抑制了mRNA的表达，并且还以与19+2siRNA结构类似的方式诱导了表现型的变化。
实施例12：基因沉默机制的分析
为了检查根据本发明的siRNA结构是否通过与已有的19+2siRNA结构相同的机制抑制基因表达，进行了下列实验。具体地说，进行5’-RACE分析以便分析每个19+2和16+3A siRNA结构的mRNA裂解位点。
首先，使用Lipofectamine 2000将siRNA结构分别引入到HeLa细胞中，24小时后，从细胞中通过Tri-试剂盒(Ambion)提取总RNA。将2μg总RNA与没有预处理的0.25μg GeneRacer RNA寡核苷酸(oligo)，并使用GeneRacer oligo dT和SuperScriptTM III RT试剂盒(Invitrogen)将GeneRacer RNA寡核苷酸连接的总RNA进行逆转录。使用GeneRacer 5’引物和基因特异性3’引物进行35个循环的PCR，然后使用GeneRacer 5’套式引物和基因特异性3’套式引物进行25个循环的套式PCR。将PCR产物克隆到T&A载体(RBC)中，然后测序。
TIG3基因特异性3’引物：
5’-GGGGCAGATGGCTGTTTATTGATCC-3’(序列号：59)
TIG3基因特异性3’套式引物：
5’-ACTTTTGCCAGCGAGAGAGGGAAAC-3’(序列号：60)
核纤层蛋白基因特异性3’引物：
5’-CCAGTGAGTCCTCCAGGTCTCGAAG-3’(序列号：61)
核纤层蛋白基因特异性3’套式引物：
5’-CCTGGCATTGTCCAGCTTGGCAGA-3’(序列号：62)
结果，如图13所示，将TIG3和核纤层蛋白mRNA都从每个siTIG和si核纤层蛋白的反义链的5’端裂解10nt，并且裂解位点在19+2与16+3A siRNA结构之间是相同的。
这些实验结果表明，根据本发明的siRNA结构通过与已有19+2siRNA结构相同的机制抑制了基因的表达。
实施例13：基因沉默机制分析
根据本发明的siRNA结构含有比已有19+2结构短的双螺旋区，并在末端具有长的突出端。因此，为了检查本发明的siRNA结构对血清核酸酶的灵敏度是否高于19+2结构的灵敏度，进行了下列实验。
首先，将0.1纳摩尔(nmole)的每种siTIG3的19+2和16+3A结构在40μL的10％FBS溶液中孵化，在预定时间点每种样品及时取7μL，然后立即在-80℃下冷却。然后，将每种样品的3-μL片段在15％(w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后使用EtBr对凝胶进行染色并通过UV透视法进行可视化。
结果，如图14所示，19+2和16+3A siRNA结构显示了类似的分辨率。这些实验结果表明，根据本发明的siRNA结构的稳定性与已有19+2siRNA结构类似。
实施例14：RNAi机制的饱和分析I
在实施例1到3中制备的siRNA中，即以TIG3mRNA为靶标的siRNA的(此后称为siTIG3)，以存活素mRNA为靶标的siRNA(此后称为si存活素)和以核纤层蛋白A/C mRNA为靶标的siRNA(此后称为si核纤层蛋白)，19+2，17+2A和15+4A siRNA结构的每种与以CREB3mRNA为靶标的19+2siRNA结构(此后称为siCREB3)一起引入到HeLa细胞中，然后测定每种基因的mRNA水平。SiRNA的引入和mRNA水平的测定以实施例2和3中相同的方式进行。
用于CREB3基因的siRNA
siCREB3反义链：5’-GGCUCAGACUGUGUACUCC(dTdT)-3’(序列号63)
siCREB有义链：5’-GGAGUACACAGUCUGAGCC(dTdT)-3’(序列号64)
结果，如图15所示，与没有引入siRNA的阴性对照组相比，在使用siCREB3的19+2结构处理的阳性对照组中CREB3mRNA水平下降到大约20％。相反，与阴性对照组的mRNA水平相比，当将siTIG3、si存活素和si核纤层蛋白的19+2结构与siCREB3的19+2结构一起引入时，CREB3mRNA水平分别降低到66％、52％和42％。
相反，当将siTIG3、si存活素和si核纤层蛋白的每个17+2A和15+4A结构与siCREB3的19+2结构一起引入时，与阴性对照组的mRNA水平相比，mRNA水平均下降到低于40％。特别是，si存活素和si核纤层蛋白的15+4A结构以及si核纤层蛋白的17+2A结构显示了与阳性对照组相比几乎没有实质性增加的mRNA水平。
这些实验结果表明，当将19+2siRNA结构与其他siRNA一起引入细胞时，它们彼此竞争，从而降低了目标基因的沉默效率，但根据本发明的siRNA结构基本上不降低其他siRNA的基因沉默效率。通过这些结果可以看出，根据本发明的siRNA结构基本上不与其他siRNA竞争，并且不影响细胞内RNAi机制。
实施例15：RNAi机制的饱和分析II
为了检查根据本发明的siRNA结构是否干扰细胞内miRNA(microRNA)的活性，对于在实施例7中使用的siTIG3结构进行以下实验。
首先，为了评估miR-21抑制荧光素酶基因表达的活性，使用在荧光素酶基因的3’未翻译区域中含有miR-21目标序列的荧光素酶报道子(reporter)。当将该荧光素酶报道子质粒(Ambion)引入到HeLa细胞中时，与引入了不含miR-21目标序列的荧光素酶报道子的细胞相比，细胞的荧光素酶活性极大地降低。
因此，将以pMIR-luc-为基础的具有miR-21结合位点的萤火虫荧光素酶报道子质粒(Ambion)、用于转染效率标准化的pRL-SV40Renilla荧光素酶表达载体(Ambion)和10nM的siRNAs(siTIG3结构)引入到Hela细胞中，并测定标准化的相对荧光素酶活性(含有miR-21目标位点的报道子的标准荧光素酶活性与不具有miR-21目标位点的报道子的标准荧光素酶活性的比值)。将萤火虫荧光素酶活性标准化为Renilla荧光素酶活性。将模拟使用以pMIR-luc-为基础的萤火虫荧光素酶报道子质粒和没有siRNA竞争者(competitor)的pRL-SV40Renilla荧光素酶表达载体引入。收集细胞并在被动裂解缓冲液(Dual-luciferase Reproter Assay System；Promega)中裂解细胞。然后，使用Victor3酶标仪(PerkinElmer)测定20μL每种细胞提取物的荧光素酶活性。
结果，如图16所示，19+2siTIG3结构显示了0.15的相对荧光素酶活性，但17+2A和15+4A siTIG3结构分别显示了0.1和0.08的相对荧光素酶活性，均低于0.12。
这些实验结果表明，由外部引入的19+2siRNA结构抑制了由miRNA介导的荧光素酶基因沉默活性，但是17+2A和15+4A siRNA结构显示了由miRNA介导的很低的荧光素酶基因沉默活性的抑制水平。特别是，15+4A siRNA结构显示了略高于没有引入siRNA的模拟的相对荧光素酶活性，表明其显示了很低的细胞内miRNA(microRNA)抑制水平。
这些结果与实施例14的结果一起表明，根据本发明的siRNA结构实质上不使细胞内RNAi机制饱和。
实施例16：脱靶效应分析
16-1：19+2与16+3A siRNA结构之间的比较
为了分析由根据本发明的siRNA结构的有义链引起的脱靶效应，进行了下列实验。在本文中，术语“脱靶效应”指的是其中siRNA的有义链引起不可预期的mRNA降解或者靶标基因沉默的任何情况，即使siRNA最初用于诱导具有与反义链互补的序列的mRNA的降解以便得到mRNA基因表达的抑制效果。
在该实施例中，将含有荧光素酶基因的载体(pMIR-REPORTTM-荧光素酶，Ambion)分成两组。在一个实验组(A)中，将序列号：65的DNA片段插入到荧光素酶基因之后，在另一个实验组(B)中，插入序列号：66的DNA片段，由此制备DNA载体。
序列号65：5′-TGAAAATGTTGATCTCCTT
序列号66：5′-AAGGAGATCAACATTTTCA
如图17(a)所示，在引入了实验组A的载体的HeLa细胞(ACTC CCL-2)中，表达含有与以存活素mRNA为靶标的siRNA(si存活素)的有义链互补的片段(序列号：67)的mRNA(有义链目标)。如图17(b)所示，在引入了实验组B的载体的HeLa细胞中，表达含有与si存活素的反义链互补的片段(序列号：68)的mRNA(反义链目标)。
序列号67：5′-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU-3′
序列号68：5′-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3′
因此，使用Lipofectamin 2000(Invitrogen)将每种载体200ng与19+2和16+3A siRNA结构一起引入到HeLa细胞中。在引入后24小时，使用Victor3酶标仪(PerkinElmer)通过双萤光素酶报告基因检测系统(Promega)测定细胞的荧光素酶活性，由此测定有义链和反义链的活性。
结果，如图18所示，si存活素的19+2结构在所有实验组A和B中都显示了很低的荧光素酶活性。另一方面，与19+2结构相同，16+3A结构在实验组B中显示了很低的荧光素酶活性，但在实验组A中显示了很高的荧光素酶活性。这表明16+3A结构的反义链的荧光素酶抑制效率几乎与19+2结构的反义链的抑制效率类似，但16+3A结构的有义链的活性低于19+2结构的有义链的活性。
这些实验结果表明，已有的19+2结构的有义链引起脱靶效应，但根据本发明的16+3A siRNA结构的有义链不引起脱靶效应。
16-2：siRNA的16+3结构与16+3A结构之间的比较
根据本发明的siRNA结构是非对称的，因此对其有义链的脱靶效应与对称siRNA的脱靶效应进行了比较分析。为此目的，以上面描述的相同方式进行试验。在实验中使用的siRNA结构在下表12和13中显示。
表12：以存活素mRNA为靶标的siRNA分子
表13：以TIG3mRNA为靶标的siRNA分子
结果，如图19所示，由有义链介导的脱靶效应在本发明的siRNA结构中显著低于对称16+3siRNA结构。
16-3：与其有义链的5’端已经被修饰的siRNA的比较
近来的研究显示通过化学修饰在siRNA的有义链的5’端磷酸化的抑制导致由有义链介导的脱靶效应降低。
因此，如图20A所示，19+2siTIG3结构的5’端被氨基修饰，结果被分析。为此目的，以上面描述的相同的方式进行了实验。
结果，如图20B所示，其有义链的5’端被修饰的19+2siRNA结构的有义链介导的基因沉默效应高于本发明的16+3A siRNA结构的基因沉默效应，但与未修饰的19+2siRNA结构相比有所降低。但是，如图20C所示，将其与siCREB3的19+2结构一起引入到细胞中时，与像没有修饰的19+2结构一样其仍具有作为强竞争者的潜能。
总而言之，实验结果表明，根据本发明的siRNA结构是不使RNAi机制饱和的最有效的siRNA结构，同时可消除由有义链引起的基因脱靶效应。
工业实用性
如上面详细描述的那样，根据本发明的siRNA结构显示了极佳的基因沉默效率，并且不通过siRNA的有义链引起脱靶效应或者与其他外源或者内源RNAi机制干扰。因此，根据本发明的siRNA结构可代替现有技术的siRNA分子并可在以siRNA为基础的基因沉默技术诸如基因治疗中有利地使用。
虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，本领域技术人员容易想到的是，本说明书仅仅用于优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由随附的权利要求书及其等同物来限定。
Figure IPA00001205361200011
Figure IPA00001205361200021
Figure IPA00001205361200031
Figure IPA00001205361200041
Figure IPA00001205361200051
Figure IPA00001205361200061
Figure IPA00001205361200071
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Figure IPA00001205361200091
Figure IPA00001205361200101
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Figure IPA00001205361200211
Figure IPA00001205361200221

Claims (3)

1.一种双链小干扰RNA分子(siRNA分子)，包括：19个核苷酸(nt)的反义链；和具有与反义链互补序列的16nt的有义链，其中反义链的5′末段具有平头末端，并且反义链的3′末端具有3nt的突出端。
2.一种使用权利要求1所述的siRNA分子使细胞中目标基因的表达沉默的方法。
3.根据权利要求2所述的使细胞中目标基因的表达沉默的方法，其特征在于，所述siRNA分子的反义链与目标基因的mRNA序列互补。
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Denomination of invention: Novel sirna structure for minimizing off-target effects and relaxing saturation of rnai machinery and the use thereof

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