JPWO2005068630A1 - 干渉用二重鎖rna - Google Patents
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Abstract
Description
背景技術
このようにsiRNAがリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドを越える遺伝子の機能解析や発現制御のための強力なツールとして使用できることがわかり、その改良が日夜続けられている。特に、遺伝子の一次配列がヒトを含む多くの生物種でほぼ決定された現在、生体における遺伝子機能を網羅的かつ高効率に解析するための最も有力なツールとしてsiRNAの利用が注目されている。
一方、長い塩基数のRNAを用いた場合には、dsRNA依存的タンパク質依存キナーゼ(PKR)が活性化し、遺伝子全体の翻訳が阻害される。このため、RNA干渉効果の特異性が下がり、またアポトーシスも誘導されるため、細胞毒性が上がる。
そこで、本発明は、干渉用二重鎖RNAおよびsiRNAを発現するためのベクターおよび機能遺伝子ノックダウン細胞の生産方法に関する。
課題を解決するための手段
すなわち、本発明は、標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAとを含む干渉用二重鎖RNAであって、前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが連続した25塩基、26塩基、27塩基又は28以上の塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする干渉用二重鎖RNAを提供する。
このような二重鎖RNAとしては、前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されているものが望ましい。
このような二重鎖RNAとしては、前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されているものが望ましい。
このような二重鎖RNAとしては、アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入され、かつ、センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されているものが望ましい。
このようなベクターから生じる二重鎖RNAとしては、前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されているものが望ましい。
このようなベクターから生じる二重鎖RNAとしては、前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されているものが望ましい。
このようなベクターから生じる二重鎖RNAとしては、アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入され、かつ、センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されているものが望ましい。
また、本発明は上記ベクターまたは上記発現システムを含む組成物を提供する。このような組成物としては、医薬組成物が好ましい。
さらに本発明は、上記ベクターまたは上記発現システムを細胞に導入する工程と、前記ベクター又は前記発現システムが導入された細胞を選択する工程とを含む標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法を提供する。
また、本発明のベクターまたは発現システムは、化学合成によらずsiRNAを細胞内で合成できるため、より短いsiRNAを用いたときのように予め発現抑制効果の高い部位を特定することなく、かつ低毒性なsiRNAを、安価に作成することができる。このような本発明のベクターまたは発現システムを用いて、標的遺伝子の機能解析や、ウイルスの発現抑制、疾患原因遺伝子の発現抑制などによる遺伝子治療を行なうことができる。さらには、本発明のベクターまたはシステムを用いて、標的遺伝子の機能解析のための研究材料となるノックダウン細胞、ノックダウン動物または植物を作成することができる。植物細胞に本発明のsiRNAを導入した場合には、機能解析のみならず、品種改良に用いることができる。
ショートヘアピンRNAの転写は、40mMのHepes-KOH(pH7.8)、20mMのMgCl2、5mMのジチオトレイトール、1mMのNTP混合物、2mMスペルミジン、48μg/mlの牛血清アルブミン、100nMのDNA鋳型 (Hokkaido System Science Inc.)、0.47μg/mlのパン酵母無機ピロホスファターゼ(Sigma)及び5.7μg/mlのT7 RNAポリメラーゼを含む400μlの反応混合液中で42℃にて1時間行った。標的遺伝子として、HygEGFP遺伝子を標的とし、転写したショートヘアピンRNA(shRNA)は、トリミングループに結合している表1及び表2に示す二本鎖領域と一本鎖5’−GGG配列とを有している。トリミングループは、ループの2番目と最後の位置に2個の特異的なG残基を有している。RNase T1 (10,000U/ml)は、 100 mMのMgCl2の存在下で0℃という限定された条件下で、これら2個のG残基及び5’−GGG配列を特異的に切断する。トリミングしたsiRNAをフェノールで抽出し、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。精製したsiRNAの品質はPAGE分析及びMALDI−TOF質量スペクトル分析で確認した。
表1において、EGFP483-18〜EGFP483-28で示されるsiRNAは、そのアンチセンスRNAの3’末端の塩基がEGFP遺伝子のmRNAの483番目の塩基に対応するよう設定され、二重鎖RNAの部分の長さが、それぞれ16〜26塩基のものである。480〜490により示されるsiRNAは、そのアンチセンスRNAの3’末端の塩基が、それぞれEGFP遺伝子のmRNAの480〜490番目の塩基に対応するよう設定されている。
表2において、EGFP638-18〜EGFP638-28で示されるsiRNAは、そのアンチセンスRNAの3’末端の塩基がEGFP遺伝子のmRNAの638番目の塩基に対応するよう設定され、二重鎖RNAの部分の長さが、それぞれ16〜26塩基のものである。635〜645により示されるsiRNAは、そのアンチセンスRNAの3’末端の塩基が、それぞれEGFP遺伝子のmRNAの635〜645番目の塩基に対応するよう設定されている。
Hyg/EGFP を安定に発現しているHeLa細胞(HeLaS3/HygEGFP細胞)を、トランスフェクションに用い、RNAi活性の測定にはHygEGFP遺伝子を標的とするsiRNAを使用した。Hyg/EGFP 遺伝子は、EGFPとハイグロマイシン耐性遺伝子との融合タンパク質を発現するpHygEGFP (Clontech)に由来するものである。細胞は、10%牛胎児血清(FBS)、100unit/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン及び100μg/mlのハイグロマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地で培養した。7.5×104個の細胞を6穴プレートに接種し、48時間培養した。培地を、ハイグロマイシンを含まない1mlのOPTI-MEM I (Gibco)に交換した。10μlのオリゴフェクタミン(Invitrogen)を用いて、(1)で作成した10μmolのEGFP用siRNA(最終濃度10 nM) を細胞にトランスフェクションし、4時間インキュベートした後、30% FBS を含む500μlのダルベッコ改変イーグル培地を添加した。
トランスフェクションの72時間後に、細胞をトリプシンで処理し、冷PBSで2回洗浄し、0.1%アジ化ナトリウム及び0.2%BSAを含むHanks緩衝液に再懸濁した。EGFPの蛍光をFACScalibur (Becton Dickinson)を用いてフローサイトメトリーにより測定した。結果を図1及び図2に示す。
shRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が同様に活性を阻害するかどうか解析するために、図3に示すような2種のヘアピン型RNAを設計した。A/Bタイプヘアピンは、「A配列」をセンス鎖として、「B配列」をアンチセンス鎖として有するのに対して、B/Aタイプヘアピンは、「A配列」をアンチセンス鎖として、「B配列」をセンス鎖として有する。「A配列」と「B配列」は、それぞれ相補的である。また、比較のため、タンデム型のベクターを作成した。また、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターであるpGL3コントロールベクターに、A配列及びB配列の標的を挿入したものを作成した。
ウミシイタケルシフェラーゼ サイトC; (センス) 5’-AAG TAG TGT GGT GTA TTA TA-3’,
(アンチセンス) 5’-TAT AAT ACA CCG CGC TAC TT-3’.
5’-GAA CGT GAT AAC CAC TAC ACT ACG GAA ACC CTA TAG TGA GTC GTA TTA GGC GGG AAC CGC CTA ATA CGA CTC ACT ATA GG-3’.
これらのことから、ヘアピン型のsiRNA発現ベクターはセンス鎖の非特異的な作用を抑制できるため、より望ましいことがわかった。
HeLaS3細胞にリポフェクトアミン2000(インビトロジェン社)を用いて、10ngのウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター(pRL-CMV)(プロメガ社)と30ngのホタルルシフェラーゼ発現ベクター(pGL3)および、様々なウミシイタケルシフェラーゼに対する2本鎖RNA(終濃度1nM)を導入した。使用した2本鎖RNAは、次の通りである。
5'-UUCACGCUGAAAGUGUAGUUU-3'
5'-ACUACACUUUCAGCGUGAAUU-3'
25塩基2本鎖RNA(両端平滑)
5'-AGCAAUAGUUCACGCUGAAAGUGUA-3'
5'-UACACUUUCAGCGUGAACUAUUGCU-3'
25塩基2本鎖RNA(両端2塩基突出)
5'-AGCAAUAGUUCACGCUGAAAGUGUAGU-3'
5'-UACACUUUCAGCGUGAACUAUUGCUUU-3'
27塩基2本鎖RNA(両端平滑)
5'-AGCAAUAGUUCACGCUGAAAGUGUAGU-3'
5'-ACUACACUUUCAGCGUGAACUAUUGCU-3'
25塩基2本鎖RNA(片端2塩基突出)
5'-AGCAAUAGUUCACGCUGAAAGUGUAGU-3'
5'-UACACUUUCAGCGUGAACUAUUGCU-3'
センス鎖の2本鎖部分の配列が、19、21、23、25又は27塩基のsiRNAを合成した(オーバーハングを含めると、21、23、25、29塩基)。センス鎖の5’末端の位置は、EGFPのORFのポジション438に相当する。オーバーハングは、センス鎖AG、アンチセンス鎖AUである。用いた配列を以下に記す。
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAU-AG-3'
アンチセンス 5’-AUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3'
21塩基 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAU-3’(2本鎖RNA領域)
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAU-AG-3'
アンチセンス 5’-AUAUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3'
23塩基 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCA-3’(2本鎖RNA領域)
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCA-AG-3'
アンチセンス 5’-UGAUAUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3'
25塩基 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUG-3’(2本鎖RNA領域)
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUG-AG-3'
アンチセンス 5’-CAUGAUAUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3'
27塩基 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGC-3’(2本鎖RNA領域)
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGC-AG-3'
アンチセンス 5’-GCCAUGAUAUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3'
トランスフェクション試薬はオリゴフェクトアミン(インビトロジェン社)を使用し、トランスフェクションボリュームは250μlとした。4時間後、30%FBSを含む培地(Dulbecco's modified Eagle培地)を125μl加え、引き続き培養した。siRNA導入から48時間後にフローサイトメトリーによって、EGFPの蛍光強度を測定した。結果を図7に示す。二本鎖部分が25塩基及び27塩基の二本鎖RNAについて、19塩基の二本鎖RNAより、RNAiの活性が高いことが確認された。
HeLa S3細胞を、10%胎児牛血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地において培養した。300ngのタンデム型または30ngのヘアピン型のsiRNAの発現プラスミド、30ngのホタルルシフェラーゼ発現プラスミド(pGL3; Promega, Madison, WI)、及び10ngのウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド(pRL-RSV)により、Promegaの指示書に従い、リポフェクトアミン2000(インビトロジェン社)を用いてトランスフェクションを行なった。Dual Luciferase System (Promega)により24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。相当するDNA量を確認するため、インサートの入っていないプラスミドを各トランスフェクションの適当なレベルに加えた。
U6プロモーターのすぐ下流に挿入された配列は、以下の通りである(センス配列のみ記載)。
pU6tandem26, GTG CGC TGC TGG TGC CAA CCC TAT TC;
pU6hairpin25, GTG CGC TGC TGG TGC CAA CCC TAT T
Claims (128)
- 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが連続した25塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが連続した26塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが連続した27塩基の塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが連続した28以上の塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 前記標的遺伝子のmRNAの配列に対して、前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1〜4番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- 前記標的遺伝子のmRNAの配列に対して、前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1〜4番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- 前記標的遺伝子のmRNAの配列に対して、前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1〜4番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換され、前記アンチセンスRNAの前記置換された塩基に対応する前記センスRNAの塩基が、前記アンチセンスRNAの前記置換された塩基と相補的塩基対を形成する他の塩基に置換されていることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目の塩基が、他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項5に記載の二重鎖干渉用RNA。
- センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目の塩基が、他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項6に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目の塩基及びセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目の塩基が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項7に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAまたはセンスRNAの塩基の置換が、グアニン(G)からウラシル(U)またはアデニン(A)への置換である請求項5〜10のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAまたはセンスRNAの塩基の置換が、シトシン(C)からウラシル(U)またはアデニン(A)への置換である請求項5〜10のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から17から19番目の塩基、またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から17から19番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項1〜4に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から19番目の塩基またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から19番目の塩基が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項13に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から19番目の塩基またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から19番目の塩基の置換が、G又はCからA又はUである請求項14に記載の二重鎖干渉用RNA。
- 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した25塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した26塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した27塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した28塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した25塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した26塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した27塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した28塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した24塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され、
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した25塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され、
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した26塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され、
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAと
を含む二重鎖干渉用RNAであって、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した27塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され、
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とする二重鎖干渉用RNA。 - 前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする請求項16〜19のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- 前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする請求項20〜23のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入され、かつ、センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されている請求項24〜27のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から18番目と19番目の塩基、またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から18番目と19番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されている請求項1〜4のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAの5’末端とセンスRNAの3’末端の間にリンカーRNAをさらに含む請求項1〜31のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- アンチセンスRNAの3’末端とセンスRNAの5’末端の間にリンカーRNAをさらに含む請求項1〜31のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- センスRNA鎖の3'側から3塩基以内の塩基、あるいは、アンチセンス鎖の5’側から3塩基以内の一以上の塩基が修飾されている請求項1〜33のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- センスRNA鎖の5'側から19番目の塩基、あるいは、アンチセンス鎖の3’側から19番目の塩基が修飾されている請求項1〜33のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- センスRNA鎖の5’側が平滑末端である請求項1〜35のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- センスRNA鎖の5’側が1塩基突出している請求項1〜35のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- センスRNA鎖の5’側が2塩基突出している請求項1〜35のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- センスRNA鎖の5’側が3塩基突出している請求項1〜35のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA
- センスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の3’末端が、2塩基突出している請求項1〜35に記載の二本鎖干渉用RNA。
- センスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の3’末端が、1塩基突出している請求項1〜35に記載の二本鎖干渉用RNA。
- センスRNA鎖の3’側が平滑末端であり、かつ、アンチセンスRNA鎖の3’末端が2塩基突出している請求項1〜35のいずれか1項に記載の二重鎖干渉用RNA。
- 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記ベクターから生成される前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが連続した25個の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記ベクターから生成される前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが連続した26個の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記ベクターから生成される前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが連続した27個の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記ベクターから生成される前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが連続した28個以上の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とするベクター。 - 前記標的遺伝子のmRNAの配列に対して、前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1〜4番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項26〜28のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記標的遺伝子のmRNAの配列に対して、前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1〜4番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項26〜28のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記標的遺伝子のmRNAの配列に対して、前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1〜4番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換され、前記アンチセンスRNAの前記置換された塩基に対応する前記センスRNAの塩基が、前記アンチセンスRNAの前記置換された塩基と相補的塩基対を形成する他の塩基に置換されていることを特徴とする請求項26〜27のいずれか1項に記載のベクター。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目の塩基が、他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項29に記載のベクター。
- センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目の塩基が、他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項30に記載のベクター。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目の塩基及びセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目の塩基が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項31に記載のベクター。
- アンチセンスRNAまたはセンスRNAの塩基の置換が、グアニン(G)からウラシル(U)またはアデニン(A)への置換である請求項47〜52のいずれか1項に記載のベクター。
- アンチセンスRNAまたはセンスRNAの塩基の置換が、シトシン(C)からウラシル(U)またはアデニン(A)への置換である請求項47〜52のいずれか1項に記載のベクター。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から17から19番目の塩基、またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から17から19番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項43〜46に記載のベクター。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から19番目の塩基またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から19番目の塩基が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項55に記載のベクター。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から19番目の塩基またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から19番目の塩基の置換が、G又はCからA又はUである請求項56に記載のベクター。
- 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した25塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した26塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した27塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した28塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した25塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した26塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した27塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した28塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した24塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され、
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した25塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され、
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した26塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され、
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とするベクター。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるためのベクターであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAから、前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した27塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され、
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とするベクター。 - 前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする請求項58〜61のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする請求項62〜65のいずれか1項に記載のベクター。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入され、かつ、センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されている請求項66〜69のいずれか1項に記載のベクター。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から18番目と19番目の塩基、またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から18番目と19番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されている請求項43〜46のいずれか1項に記載のベクター。
- リンカーをコードするリンカーDNAを、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとの間にさらに含む請求項73〜73のいずれか1項に記載のベクター。
- センスRNA鎖の5’側が平滑末端である請求項43〜74のいずれか1項に記載のベクター。
- センスRNA鎖の5’側が1塩基突出している請求項43〜74のいずれか1項に記載のベクター。
- センスRNA鎖の5’側が2塩基突出している請求項43〜74のいずれか1項に記載のベクター。
- センスRNA鎖の5’側が3塩基突出している請求項43〜74のいずれか1項に記載のベクター。
- センスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の3’末端が、2塩基突出している請求項43〜74に記載のベクター。
- センスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の3’末端が、1塩基突出している請求項43〜74に記載のベクター。
- センスRNA鎖の3’側が平滑末端であり、かつ、アンチセンスRNA鎖の3’末端が2塩基突出している請求項43〜74のいずれか1項に記載のベクター。
- プロモーターがpolIII系プロモーターである、請求項43〜80のいずれか1項に記載のベクター。
- polIII系プロモーターが、U6プロモーター、H1プロモーター、5S rRNAプロモーター、tRNAプロモーター、7SLプロモーター、7SKプロモーター、レトロウイルス性LTRプロモーター、アデノウイルスVAlプロモーターからなる群から選択される、請求項82に記載のベクター。
- プロモーターがpolII系プロモーターである、請求項43〜80のいずれか1項に記載のベクター。
- polII系プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、RSVプロモーター、EF−1αプロモーター、β−アクチンプロモーター、γ−グロブリンプロモーター、SRαプロモーターからなる群から選択される、請求項84に記載のベクター。
- 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記第一のベクターから生成される前記アンチセンスRNAと前記第二のベクターから生成される前記センスRNAとが連続した25個の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記第一のベクターから生成される前記アンチセンスRNAと前記第二のベクターから生成される前記センスRNAとが連続した26個の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記第一のベクターから生成される前記アンチセンスRNAと前記第二のベクターから生成される前記センスRNAとが連続した27個の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記第一のベクターから生成される前記アンチセンスRNAと前記第二のベクターから生成される前記センスRNAとが連続した28個以上の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とする発現システム。 - 前記標的遺伝子のmRNAの配列に対して、前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1〜4番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項86〜89のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記標的遺伝子のmRNAの配列に対して、前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1〜4番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項86〜89のいずれか1項に記載の発現システム。
- 前記標的遺伝子のmRNAの配列に対して、前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1〜4番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換され、前記アンチセンスRNAの前記置換された塩基に対応する前記センスRNAの塩基が、前記アンチセンスRNAの前記置換された塩基と相補的塩基対を形成する他の塩基に置換されていることを特徴とする請求項86〜89のいずれか1項に記載のシステム。
- アンチセンスRNAまたはセンスRNAの塩基の置換が、グアニン(G)からウラシル(U)またはアデニン(A)への置換である請求項90〜92のいずれか1項に記載のシステム。
- アンチセンスRNAまたはセンスRNAの塩基の置換が、シトシン(C)からウラシル(U)またはアデニン(A)への置換である請求項90〜92のいずれか1項に記載のシステム。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から17から19番目の塩基、またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から17から19番目の塩基のうちの1個が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項86〜89に記載のシステム。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から19番目の塩基またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から19番目の塩基が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項95に記載のシステム。
- アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から19番目の塩基またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から19番目の塩基の置換が、G又はCからA又はUである請求項96に記載のシステム。
- 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した25塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した26塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した27塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した28塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した25塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した26塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した27塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した28塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記センスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した24塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した25塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した26塩基の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とする発現システム。 - 二重鎖干渉用RNAを細胞内で発現させるための発現システムであって、
標的遺伝子のmRNAにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAから前記アンチセンスRNAを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域と相同なセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記センスコードDNAから前記センスRNAを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記標的遺伝子のmRNAにおける前記領域は、連続した27塩基以上の領域であり、
前記アンチセンスRNAと前記センスRNAとが二重鎖を形成し、
前記アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から1番目と2番目の塩基の間、2番目と3番目の塩基の間、3番目と4番目の塩基の間、または4番目と5番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に1個の塩基が挿入され
前記アンチセンスRNAに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスRNAの前記挿入された塩基に対応する前記センスRNAの位置に挿入されていることを特徴とする発現システム。 - アンチセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の3’側から18番目と19番目の塩基、またはセンスRNAの二重鎖を形成している領域内の5’側から18番目と19番目の塩基の間の位置に1個の塩基が挿入されている請求項86〜89のいずれか1項に記載のシステム。
- センスRNA鎖の5’側が平滑末端である請求項86〜110のいずれか1項に記載の発現システム。
- センスRNA鎖の5’側が1塩基突出している請求項86〜110のいずれか1項に記載の発現システム。
- センスRNA鎖の5’側が2塩基突出している請求項86〜110のいずれか1項に記載の発現システム。
- センスRNA鎖の5’側が3塩基突出している請求項86〜110のいずれか1項に記載の発現システム。
- センスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の3’末端が、2塩基突出している請求項86〜110の発現システム。
- センスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の3’末端が、1塩基突出している請求項86〜110の発現システム。
- センスRNA鎖の3’側が平滑末端であり、かつ、アンチセンスRNA鎖の3’末端が2塩基突出している請求86〜110のいずれか1項に記載のシステム。
- プロモーターがpolIII系プロモーターである、請求項86〜117のいずれか1項に記載のシステム。
- polIII系プロモーターが、U6プロモーター、H1プロモーター、5S rRNAプロモーター、tRNAプロモーター、7SLプロモーター、7SKプロモーター、レトロウイルス性LTRプロモーター、アデノウイルスVAlプロモーターからなる群から選択される、請求項118に記載のシステム。
- プロモーターがpolII系プロモーターである、請求項86〜117のいずれか1項に記載のシステム。
- polII系プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、RSVプロモーター、EF−1αプロモーター、β−アクチンプロモーター、γ−グロブリンプロモーター、SRαプロモーターからなる群から選択される、請求項120に記載のシステム。
- 請求項43〜85のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項86〜121のいずれか1項に記載の発現システムを保持した細胞。
- 植物細胞である請求項122に記載の細胞。
- 動物細胞である請求項122に記載の細胞。
- 哺乳動物細胞である請求項124に記載の細胞。
- 請求項43〜85のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項86〜121のいずれか1項に記載の発現システムを含む組成物。
- 医薬組成物である請求項126に記載の組成物。
- 標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、
請求項43〜85のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項86〜121のいずれか1項に記載の発現システムを細胞に導入する工程と、
前記ベクター又は前記発現システムが導入された細胞を選択する工程と
を含む方法。
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