KR102397455B1 - PD-1의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA - Google Patents
PD-1의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA Download PDFInfo
- Publication number
- KR102397455B1 KR102397455B1 KR1020200060495A KR20200060495A KR102397455B1 KR 102397455 B1 KR102397455 B1 KR 102397455B1 KR 1020200060495 A KR1020200060495 A KR 1020200060495A KR 20200060495 A KR20200060495 A KR 20200060495A KR 102397455 B1 KR102397455 B1 KR 102397455B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sirna
- cell
- antisense strand
- rna
- expression
- Prior art date
Links
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 175
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 99
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title abstract description 29
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 59
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 23
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 11
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 9
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 7
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 claims description 5
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 4
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 4
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 3
- 208000013056 classic Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 208000028466 reproductive system neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 claims description 2
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L methylphosphonate(2-) Chemical compound CP([O-])([O-])=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 2
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 claims description 2
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 claims description 2
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 claims description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims description 2
- 208000006593 Urologic Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 abstract description 41
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 18
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 8
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 164
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 127
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 101
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 51
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 35
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 35
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 27
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 23
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 14
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 10
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 10
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 8
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 5
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 5
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 4
- 238000010842 high-capacity cDNA reverse transcription kit Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100029290 Transthyretin Human genes 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- -1 piwiRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 101150100936 CD28 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010063003 Endocrine toxicity Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100268066 Mus musculus Zap70 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010061137 Ocular toxicity Diseases 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 1
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010044245 Toxic optic neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100033019 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Human genes 0.000 description 1
- 101710116241 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Proteins 0.000 description 1
- 208000008385 Urogenital Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940124691 antibody therapeutics Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 231100000146 endocrine toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000016847 malignant urinary system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000025020 negative regulation of T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000327 ocular toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940000673 orphan drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002859 orphan drug Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000007903 penetration ability Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007824 polyneuropathy Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 201000004435 urinary system cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000037964 urogenital cancer Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3513—Protein; Peptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
Abstract
본 발명은 PD-1(Programmed cell Death protein 1)의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 PD-1을 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하는 비대칭 siRNA, 상기 비대칭 siRNA를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 siRNA로 처리하여 수득된 PD-1의 발현이 억제된 면역세포 및 상기 면역세포를 포함하는 암의 치료용 면역세포 치료제에 관한 것이다.
Description
본 발명은 PD-1(Programmed cell Death protein 1)의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 PD-1을 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하는 비대칭 siRNA, 상기 비대칭 siRNA를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 siRNA로 처리하여 수득된 PD-1의 발현이 억제된 면역세포 및 상기 면역세포를 포함하는 암의 치료용 면역세포 치료제에 관한 것이다.
PD-1(Programmed cell Death protein 1)은 세포 표면에 발현되는 수용체의 하나로 면역 세포의 활성을 억제하는 역할을 한다. 후천적 면역 반응이 일어날 때 주된 역할을 하는 T림프구가 활성화되면 PD-1의 발현이 유도된다. 이것의 리간드인 PD-L1 및/또는 PD-L2와의 상호작용은, 항원으로부터의 자극 신호를 받아들이는 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR)에서 시작하는 신호전달 체계를 억제시키는 결과로 이어진다. 이는 PD-1이 포스파테이즈인 SHP-2를 이용하여 TCR의 작동체 분자(effector molecule)인 Zap70을 비활성화 시키는 방식으로 이루어진다.
이러한 PD-1/PD-L의 상호작용은 정상상태일 경우에는 자가 면역 반응이 일어나지 않도록 억제하고, 바이러스 감염등의 질병상태인 경우에는 면역세포가 지나치게 활성화되어 정상 조직의 세포가 의도치 않은 손상을 입는 것을 방지하는 역할을 한다. 따라서 PD-1/PD-L은 면역관문을 조절하는 역할을 수행한다.
PD-1은 대개 활성화된 T 세포, B 세포, 및 대식세포 등 대부분의 면역세포에서 발현되며 PD-L1/L2는 항원 제시 세포나 스트로마 세포(stromal cell)의 표면에 발현된다.
암세포의 경우에는 이러한 면역 억제 기작을 이용하여 면역계의 감시로부터 벗어나 암세포가 성장하고 침투하기에 좋은 환경을 조성하기도 한다. 대표적인 방법은 PD-L1을 암세포에 과발현시켜, PD-1/PD-L1 상호작용을 이용해 T 세포를 아네르기(anergy) 상태에 이르게 하는 것이다. 아네르기 상태가 된 T 세포의 경우 증식하지 않고, 사이토카인(cytokine)의 분비도 더 이상 일어나지 않으며, 세포 독성 반응도 매개하지 못한다. 이러한 PD-L1을 제시함으로서 암세포는 면역체계의 큰 축을 차지하는 면역세포의 면역작용을 피해 성장하고 조직에 침투하며, 세포 치료법들의 효과를 저해하는 결과를 야기한다.
예를 들어, 한 연구에서 PD-L1이 발현된 종양 세포들이 세포 독성 T 세포(cytotoxic T cell)이 유도하는 세포 용해 반응에 덜 취약하고, 종양 형성과 침입성이 커진 것이 쥐를 통한 in vivo 모델에서 확인된 바 있다.(Iwai, Yoshiko, et al. "Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blockade." Proceedings of the National Academy of Sciences 99.19 (2002): 12293-12297). 게다가 PD-L1 발현 하나만으로 세포 독성 T 세포의 활성이 크게 감소하는 것이 확인된 경우도 있다(Juneja, Vikram R., et al. "PD-L1 on tumor cells is sufficient for immune evasion in immunogenic tumors and inhibits CD8 T cell cytotoxicity." Journal of Experimental Medicine (2017): jem-20160801).
이러한 암세포의 PD-1/PD-L 상호작용을 억제시키기 위한 연구가 진행되어 왔으며, PD-1 또는 PD-L과 상보적으로 결합하는 항체를 통해 경쟁적 또는 비경쟁적으로 PD-1/PD-L1의 작용을 저해하는 방식으로 암을 치료하는 연구 결과가 보고된 적이 있다.(Rizvi NA, Hellmann MD, Snyder A, Kvistborg P, Makarov V, Havel JJ, et al. (April 2015). "Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer". Science. 348 (6230): 124-128).
그러나, 이러한 PD-1/PD-L1 작용 저해성 항체 치료제의 부작용으로서 피부질환(Dermatologic Toxicities), 소화기 질환, 내분비 독성(Endocrine Toxicities), 간 독성(Hepatic Toxicities), 폐렴, 신경학적 증후군(Neurologic Syndromes), 안구독성(Ocular Toxicity), 신장독성(Renal Toxicity), 췌장독성(Pancreatic Toxcities) 등이 보고된바 있다( J. Naidoo, et al. "Toxicities of the Anti-PD-1 and Anti-PD-L1 Immune Checkpoint Antibodies" Annals of Oncology, mdv383. doi:10.1093/annonc/mdv383).
한편, RNA 간섭(RNA interference) 현상을 이용한 질병의 치료는 mRNA를 타겟으로 하여, 유전자의 발현을 translational level에서 조절하는 siRNA를 이용하기 때문에 보다 안전하게 질병을 치료할 수 있다. 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)는 표적 mRNA와 같은 시퀀스를 가진 sense strand와 그와 상보적인 시퀀스를 가진 antisense strand로 구성된다. conventional siRNA는 19-21bp의 짧은 duplex를 가지며 양쪽 strand 3'에 2개의 뉴클레오타이드가 돌출되어있다. siRNA는 세포 내로 들어가 표적 mRNA에 붙어 표적 mRNA를 분해시키며 표적 유전자의 발현을 억제한다. oligo의 시퀀스를 바꿈으로써 모든 mRNA를 표적으로 하는 것이 가능하기 때문에 구조가 복잡한 단백질의 발현도 억제할 수 있으며, 따라서 현재 치료가 어려운 암, 바이러스 감염, 유전병과 같은 질병의 치료를 가능하게 할 수 있다. 그러나 세포 내로 유입된 siRNA는 면역반응 유발, 비표적 유전자의 억제와 같은 부작용을 일으킬 수 있는데, 그 중에서도 siRNA를 세포 내로 도입하는 delivery system이 siRNA를 이용한 치료제 개발에서 가장 큰 문제가 되고 있다.
siRNA는 phosphate backbone 때문에 음전하를 띄게 되는데, 음전하를 갖는 세포막과 반발력을 갖게 되어 세포 내로 siRNA를 도입하려면 delivery system을 필요로 한다. delivery system의 한 예로는 양전하를 갖는 리포좀이나 폴리머로 siRNA를 감싸서 음전하를 상쇄시켜 세포 내로 도입하는 방법이 많이 사용되고 있다. 그러나 양전하를 갖는 전달체는 음전하를 갖는 세포막에 붙어 원하지 않는 독성을 나타내거나 세포 내의 여러 종류의 단백질과 상호작용을 통해 원하지 않는 복합체를 형성하는 등 다양한 부작용을 일으킬 수 있다. 또한 siRNA는 혈액 내의 핵산가수분해효소(nuclease)에 의해 빠르게 분해되기 때문에 표적으로 하는 세포에 도달되는 siRNA의 양이 표적 유전자의 발현을 상당히 감소시킬 만큼 충분하지 않을 수 있다. 따라서 siRNA가 안전하고 효과적으로 타겟 세포 내로 전달될 수 있는 방법이 필요하다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 비대칭 siRNA(asymmetric shorter duplex siRNA, asiRNA) 구조 관련 기술을 개발한 바 있다(WO 2009/078685). asiRNA는 19+2 구조에 비해 짧은 이중나선 길이를 갖는 비대칭 RNAi 유도 구조이다. 기존에 siRNA가 갖는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화, TLR3에 의한 면역반응 등의 문제점들을 극복한 기술이며, 이에 따라 RNAi 신약 개발에 유력한 플랫폼이 될 수 있다. 또한, 화학적, 구조적 변형(chemical, structural modification)이 더해져서 별도의 전달 시스템 없이 세포 내로 자가 전달이 가능하여 기존에 siRNA 전달을 하는 시스템이 갖는 문제점들을 극복함으로써 효과적인 차세대 치료제로 개발이 가능하다.
이에 본 발명자들은 RNA 간섭(RNA interference)을 통해 PD-1의 발현을 억제함으로서 암세포의 PD-L1 과발현으로 인한 면역세포 억제 기작을 방해할 수 있을 것으로 예상하였고, PD-1을 표적으로 하여 세포 내로의 효과적인 전달이 가능한 세포내 투과능있고 RNA 간섭을 유도하는 능력을 가진 핵산 분자를 발명하고자 노력하였다. 그 결과 RNA 간섭을 유도하여 표적 유전자의 발현을 억제하고 동시에 오프타겟 효과를 줄인 비대칭형 작은 간섭 RNA(asymmetric shorter duplex small interferencing RNA; asiRNA)를 개발하였다. 이에 더하여 비대칭 이중가닥의 핵산 분자에 여러가지 화학적 변형을 통하여 in vitro에서 전달체 없이 우수한 표적 유전자 억제 효율을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 PD-1(Programmed cell Death protein 1)의 발현을 특이적으로 억제하는 비대칭 siRNA(asymmetric shorter duplex siRNA, asiRNA)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 비대칭 siRNA를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비대칭 siRNA로 PD-1의 발현이 억제된 면역세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역세포를 포함하는 암의 치료용 면역세포 치료제를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PD-1(Programmed cell Death protein 1)을 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것을 특징으로 하는 비대칭 siRNA를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 비대칭 siRNA를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 비대칭 siRNA로 PD-1의 발현이 억제된 면역세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 면역세포를 포함하는 암의 치료용 면역세포 치료제를 제공한다.
본 발명에 따르면, PD-1/PD-L의 상호작용을 통한 면역세포의 아네르기화에 의한 면역억제 및 이를 통한 암의 성장 및 전이와 밀접한 연관이 있는 면역세포의 PD-1을 코딩하는 mRNA를 표적으로 하여 RNA 간섭 효과를 야기할 수 있는 비대칭 siRNA를 선별하고, 상기 siRNA가 전달체 도움 없이 세포 내로 도입되고 핵산가수분해효소에 대한 저항성을 갖도록 화학적으로 변형시켜 전달체로 인한 세포독성을 제거하고 in vivo에서 보다 효율적인 유전자 발현의 억제를 가능하게 함으로써, 암의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 센스가닥(16mer)과 안티센스가닥(21mer)로 이루어진, PD-1을 표적으로 하는 비대칭 siRNA의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 10nM의 농도로 비대칭 siRNA를 trasnfection하여 얻은 PD-1 mRNA level(n=3)을 나타낸 그래프로, tublin을 house keeping gene으로 하여 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 발현 정도를 %로 나타낸 것이다. siOCT4는 negative control로 사용되었다.
도 3은 1nM의 농도로 비대칭 siRNA를 trasnfection하여 얻은 PD-1 mRNA level(n=3)을 나타낸 그래프로, tublin을 house keeping gene으로 하여 비처리 샘플(대조군: NT)를 기준으로 하여 발현 정도를 %로 나타낸 것이다. siOCT4는 negative control로 사용되었다.
도 4는 PD-1 발현 억제 효능이 좋은 세가지 비대칭 siRNA(asiPD-1-93, asiPD-1-95, asiPD-1-89)를 transfection한 뒤 ELISA를 이용하여 얻은 PD-1 protein level(n=4)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 표 3에 명시된 cp-asiRNA 12종에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, PD-1 protein level(n=3)에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 6은 표 4에 명시된 cp-asiRNA 11종에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, PD-1 protein level(n=3)에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 7은 표 4에 명시된 cp-asiRNA 11종 중에 뛰어난 효율을 보이는 2종(cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23)에 대한 duration test결과(2일-5일)를 나타낸 것으로, PD-1 protein level(n=3)에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 8은 도 7에서 확인 한 cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23의 PD-1 발현 억제를 통한 T 세포 활성 증가를 나타낸 것으로, 0.5μM, 1μM, 3μM의 농도로 cp-asiRNA를 처리한 후 4일(96시간) 뒤에 luciferase luminescence 측정 값(n=3)을 상대적인 값(average relative light unit)으로 나타낸 그래프이다.
도 9는 cp-asiPD-1-22, asiPD-1-23의 PD-1 발현 억제를 통한 T 세포 활성 증가를 나타낸 것으로, 도 8과 같은 조건으로 하여 1μM 농도로 처리한 후 3일 뒤에 luciferase luminescence 측정 값(n=3)을 상대적인 값(average relative light unit)으로 나타낸 그래프이다.
도 10은 표 5에 명시된 asiRNA 8종에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 %로 나타낸 것이다.
도 11은 표 5에 명시된 asiRNA 8종 중에 뛰어난 효율을 보이는 6종(8-039, 8-046, 8-048, 8-053, 8-068, 및 8-070)에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, PD-1 protein level에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 12는 표 6에 명시된 cp-asiRNA 12종에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 %로 나타낸 것이다.
도 13은 표 6에 명시된 cp-asiRNA 12종 중에 뛰어난 효율을 보이는 4종(cp-8-068-3, 8-068-13, 8-039-8, 및 8-039-13)에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 %로 나타낸 것이다.
도 14는 표 6에 명시된 cp-asiRNA 12종 중에 뛰어난 효율을 보이는 4종(8-068-3, 8-068-13, 8-039-8 및 8-039-13)에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, PD-1 protein level에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 15는 cp-asiRNA 4종(8-068-3, 8-068-13, 8-039-8 및 8-039-13)에 대한 T 세포 내 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 %로 나타낸 것이다.
도 16은 도 15에서 확인한 cp-asiRNA인 8-068-3, 8-068-13, 8-039-8, 및 8-039-13의 PD-1 발현 억제를 통한 T 세포 활성 증가를 나타낸 것으로, 1μM, 및 2μM의 농도로 cp-asiRNA를 처리한 후 luciferase luminescence 측정 값을 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 상대적인 값으로 나타낸 것이다.
도 2는 10nM의 농도로 비대칭 siRNA를 trasnfection하여 얻은 PD-1 mRNA level(n=3)을 나타낸 그래프로, tublin을 house keeping gene으로 하여 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 발현 정도를 %로 나타낸 것이다. siOCT4는 negative control로 사용되었다.
도 3은 1nM의 농도로 비대칭 siRNA를 trasnfection하여 얻은 PD-1 mRNA level(n=3)을 나타낸 그래프로, tublin을 house keeping gene으로 하여 비처리 샘플(대조군: NT)를 기준으로 하여 발현 정도를 %로 나타낸 것이다. siOCT4는 negative control로 사용되었다.
도 4는 PD-1 발현 억제 효능이 좋은 세가지 비대칭 siRNA(asiPD-1-93, asiPD-1-95, asiPD-1-89)를 transfection한 뒤 ELISA를 이용하여 얻은 PD-1 protein level(n=4)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 표 3에 명시된 cp-asiRNA 12종에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, PD-1 protein level(n=3)에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 6은 표 4에 명시된 cp-asiRNA 11종에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, PD-1 protein level(n=3)에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 7은 표 4에 명시된 cp-asiRNA 11종 중에 뛰어난 효율을 보이는 2종(cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23)에 대한 duration test결과(2일-5일)를 나타낸 것으로, PD-1 protein level(n=3)에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 8은 도 7에서 확인 한 cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23의 PD-1 발현 억제를 통한 T 세포 활성 증가를 나타낸 것으로, 0.5μM, 1μM, 3μM의 농도로 cp-asiRNA를 처리한 후 4일(96시간) 뒤에 luciferase luminescence 측정 값(n=3)을 상대적인 값(average relative light unit)으로 나타낸 그래프이다.
도 9는 cp-asiPD-1-22, asiPD-1-23의 PD-1 발현 억제를 통한 T 세포 활성 증가를 나타낸 것으로, 도 8과 같은 조건으로 하여 1μM 농도로 처리한 후 3일 뒤에 luciferase luminescence 측정 값(n=3)을 상대적인 값(average relative light unit)으로 나타낸 그래프이다.
도 10은 표 5에 명시된 asiRNA 8종에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 %로 나타낸 것이다.
도 11은 표 5에 명시된 asiRNA 8종 중에 뛰어난 효율을 보이는 6종(8-039, 8-046, 8-048, 8-053, 8-068, 및 8-070)에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, PD-1 protein level에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 12는 표 6에 명시된 cp-asiRNA 12종에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 %로 나타낸 것이다.
도 13은 표 6에 명시된 cp-asiRNA 12종 중에 뛰어난 효율을 보이는 4종(cp-8-068-3, 8-068-13, 8-039-8, 및 8-039-13)에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 %로 나타낸 것이다.
도 14는 표 6에 명시된 cp-asiRNA 12종 중에 뛰어난 효율을 보이는 4종(8-068-3, 8-068-13, 8-039-8 및 8-039-13)에 대한 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, PD-1 protein level에 대한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 15는 cp-asiRNA 4종(8-068-3, 8-068-13, 8-039-8 및 8-039-13)에 대한 T 세포 내 PD-1 발현 억제 효능을 나타낸 것으로, 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 %로 나타낸 것이다.
도 16은 도 15에서 확인한 cp-asiRNA인 8-068-3, 8-068-13, 8-039-8, 및 8-039-13의 PD-1 발현 억제를 통한 T 세포 활성 증가를 나타낸 것으로, 1μM, 및 2μM의 농도로 cp-asiRNA를 처리한 후 luciferase luminescence 측정 값을 비처리 샘플(대조군: NT)을 기준으로 하여 상대적인 값으로 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"RNA 간섭(RNA interference; RNAi)"이란, 목적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)를 세포 등에 도입하여 목적 유전자 mRNA의 분해를 유도함으로써 목적 유전자의 발현을 억제하는 메카니즘을 의미한다.
"siRNA(small interfering RNA; 짧은 간섭 RNA)"란, 서열 특이적으로 효율적인 유전자 발현 억제(gene silencing)를 매개하는 짧은 이중 가닥의 RNA(dsRNA)를 의미한다.
"안티센스 가닥(antisense strand)"이란 관심 있는 목적 핵산(target nucleic acid)에 실질적으로 또는 100% 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 예를 들어 mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g.,microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 상보적일 수 있다.
"센스 가닥(sense strand)"이란 목적 핵산과 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.
"유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다.
"PD-1"이란 Programmed cell Death protein 1의 약칭으로서 CD28 패밀리 구성원의 제I형 막관통 단백질에 속하며, 인간 PD-1 유전자는 2q37.35 염색체에 존재하며, 하나의 약 55kD의 막관통 단백질을 코딩한다. PD-1은 활성화된 T세포, B세포, 단핵세포와 수지상 세포 표면에서 광범위하게 발현되며, PD-1 구조는 CTLA-4와 30%의 상동성을 갖고 있으며, 세포 내 영역에 2개의 티로신 잔기가 존재하며, 각각 N말단의 하나의 면역 수용체 티로신 억제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)와 C말단의 하나의 면역 수용체 티로신 의존성 스위치 모티프(immunoreceptor tyrosin-based switch motif，ITSM)의 구성에 참여한다. 세포 외 영역은 하나의 IgV유사 구조영역으로 조성되며, 다수의 글리코실화 부위를 포함하며 심각히 글리코실화 되며, 상기 구조영역은 리간드에 결합되어, T세포 활성화를 억제시키는 기능을 발휘한다. PD-L1은 다수의 암 조직에서 과량으로 발현되며, NSCLC, 흑색종, 유방암, 신경교종, 림프종, 백혈병, 및 각종 비뇨계암, 소화도암, 생식계 종양 등을 포함한다. PD-L1의 높은 발현은, RAS 및 PI3K/AKT 신호경로의 억제를 통해 세포주기 검출 포인트의 단백질과 세포증식 관련 단백질 발현을 조절함으로써, 최종적으로 T세포 증식의 억제를 초래한다. 체외실험과 마우스 모델에서 PD-1/PD-L1 신호경로의 활성화가 특이적 CTL 아포토시스를 유도하며, CTL의 세포 살상효과의 감수성을 저하시켜 종양세포의 면역 탈출을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 목적은 크게 두가지로 나타낼 수 있는데, 첫째는 PD-1을 코딩하는 mRNA를 타겟으로 하는 비대칭 siRNA를 디자인하고, 스크리닝을 통해 가장 효율적으로 PD-1의 발현을 억제시키는 비대칭 siRNA를 선별하는 것이며, 둘째는 siRNA를 별다른 전달체 없이 세포내로 전달시키고 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 높이기 위해 화학적인 변형을 도입하는 것이다. 인지질로 구성된 세포막을 통과하려면 크기가 작거나 혹은 소수성이어야 한다. 그러나 siRNA는 포스페이트 백본(phosphate backbone)에 의해 음전하를 띄며 그로 인해 세포막을 투과하는데 어려움이 있다. 또한 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 높여 serum에서의 긴 lifetime을 가지게 하여 표적으로 도달되는 양이 효과적인 RNAi를 일으키기에 충분하도록 만들어야 한다. 따라서 화학적 변형(chemical modification)을 도입하여, siRNA의 전달 문제를 극복하였다.
본 발명의 일 실시예에서, PD-1의 mRNA를 타겟으로 하는 asiRNA를 디자인하고 가장 넉다운 효과(knockdown efficiency)가 좋은 asiRNA를 확인하고, 이를 선별하였다. 또한, 화학적 변형(chemical modification)을 도입하여 asiRNA가 전달체의 도움 없이도 세포 관통능을 가지고 핵산가수분해효소에 저항성을 가지도록 변형시켜, PD-1 발현을 효율적으로 억제할 수 있는 cp-asiRNA를 선별하였다. 이 선별된 siRNA에 다음 4가지의 modification을 도입하여 asiRNA가 세포 관통능을 가지고 핵산가수분해효소에 저항성을 가지도록 변형시킨다. 첫째는 sense strand의 3' 말단에 콜레스테롤을 첨가하여 siRNA가 세포막을 투과할 수 있게 해준다. 두 번째는 sense strand와 antisense strand의 5' 말단 또는 3' 말단 가까이의 phosphate backbone을 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하여 핵산외부가수분해 효소에 대한 저항성을 가지며, 세포로의 흡수와 in vivo에서 siRNA의 생물학적 이용을 가능하게 해준다. 세 번째는 당의 2'-OH기를 2`-O-Methyl로 modification하여 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 부여하며 siRNA immunogenicity를 낮추어 주며 off-target 효과를 감소시켜준다. 네 번째는 당의 2'을 fluoro로 modification하여 double strand duplex에 안정성을 부여하며, serum에서의 안정성을 높이고 in vitro와 in vivo에서 효율적인 silencing이 가능하게 한다. siRNA에 위와 같은 modification을 가함으로써 siRNA는 세포 관통능을 갖게 되고, serum에 더욱 오래 머물러 표적 세포로 충분한 양의 siRNA가 전달됨에 따라 보다 효율적인 유전자 억제를 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, PD-1(Programmed cell Death protein 1)을 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것을 특징으로 하는 비대칭 siRNA에 관한 것이다.
본 발명에서의 siRNA는 일반적인 RNAi(RNA interference) 작용을 가지는 모든 물질을 포함하는 개념이다. 따라서, 반드시 합성 siRNA로 제한되지 않고, 세포내에서 발현 벡터 등을 이용하여 발현되는 siRNA나 shRNA에도 적용이 가능하다. RNAi는 1998년 Fire 연구그룹에 의해 Caenorhabditis elegans에서 최초로 발견된 세포 내 유전자 조절 방식으로, 작용 기전은 세포 내로 투입된 RNA 이중 가닥 중 안티센스 가닥이 표적 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 유전자 분해를 유도한다고 알려져 있다. 그 중 synthetic RNA interference(siRNA)는 "in vitro"에서 유전자의 발현을 억제하는 방법 중에 하나이다. 19-21bp의 siRNA는 이론적으로는 거의 모든 유전자에 대한 선택적 억제가 가능하여 암, 희귀질환, 섬유화, 바이러스성 감염 등의 다양한 유전자 관련 질환 치료제로서 개발 가능한 기술이다. 2002년 중반, 포유동물에서 siRNA를 사용한 생체 내 치료를 처음 시도하였으며, 그 이후로 응용 연구에 대한 많은 시도가 있었다. 특히 2018년에는, 앨라일람 파마슈티컬스(Alnylam Pharmaceuticals)의 hATTR(hereditary transthyretin-mediated) 아밀로이드증의 다발성신경병증을 대상으로 하는 최초의 siRNA 기반 RNAi 치료제인 온파트로(Onpattro)가 미국 식품의약국(FDA)과 유럽 의약청(EMA)으로부터 승인을 받은 바 있으며, 그 이전에 혁신치료제, 희귀의약품으로 지정된 바 있다. 그 외 많은 글로벌 제약회사들이 수십억 달러 이상을 투자하여 각종 난치성 질병들과 관련하여 siRNA를 포함하는 RNAi 치료제 프로젝트를 진행중에 있다. 그러나 기존의 RNAi 치료제에는 여전히 1) 효과적인 전달시스템의 부재 2) 오프-타겟 효과 3) 면역반응 유도 4) 세포 내 RNAi 기구 포화와 같은 장벽이 존재하여 극복해야 할 필요성이 있다. 이와 같은 문제들로 인해 siRNA가 표적 유전자의 발현을 직접적으로 조절할 수 있는 효과적인 방법임에도 불구하고 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다.
이를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 안티 센스 가닥 및 상기 안티 센스 가닥과 상보적인 센스 가닥을 포함하는 비대칭 siRNA를 제시하며, 본 발명에 따른 siRNA는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화 등의 문제를 일으키지 않아 안정적으로 높은 전달 효율을 유지하면서, 목적하는 정도로 유효하게 PD-1 표적 유전자에 대한 발현을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA는 상기 센스 가닥은 15-17nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥은 16nt 이상의 길이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 안티센스 가닥은 16-31nt의 길이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 19-25nt의 길이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 센스 가닥의 길이는 16nt, 이와 상보적인 안티센스 가닥의 길이는 19nt, 21nt 또는 25nt인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성한다. 안티센스 가닥의 3' 말단은 예를 들어 1-16nt의 오버행(overhang)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, PD-1의 발현을 억제시키기 위하여 36개의 asiRNA를 디자인하였고, PD-1을 발현하는 HeLa-PD-1 cell에서 mRNA level과 protein level의 억제를 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 및 91로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 서열번호 43, 47, 49, 77, 및 89로 구성된 군에서 선택되는 센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA가 PD-1 발현 억제 효과가 가장 좋은 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 및 92로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 44, 48, 50, 78 및 80으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 siRNA의 센스 가닥은 서열번호 43, 47, 49, 77, 또는 89이고, 안티센스 가닥은 서열번호 44, 48, 50, 78, 또는 90이다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
일반적인 siRNA는 포스페이트 백본 구조에 의한 높은 음전하 및 높은 분자량 등의 이유로 세포막을 통과할 수 없고 혈액에서의 빠른 분해 및 제거되어 실제 표적 부위에 RNAi 유도를 위한 충분한 양을 전달하는데 어려움이 있다. 현재 in vitro 전달의 경우 cationic lipids와 cationic polymers들을 이용한 높은 효율의 delivery 방법이 많이 개발되어 있지만, in vivo의 경우에는 in vitro만큼의 높은 효율로 siRNA를 전달하기 어렵고, 생체 내에 존재하는 다양한 단백질들과 상호작용에 의하여 siRNA 전달 효율이 감소하는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 비대칭 siRNA 구조에 화학적 변형을 도입하여 별도의 전달체 없이 효과적이고 세포 내 전달을 할 수 있는 자가 전달능을 가진 asiRNA 구조체(cp-asiRNA)를 개발하였다.
본 발명에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에서 화학적 변형은 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다: 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 산소가 황으로 치환; 뉴클레오티드의 포스페이트 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid)로 치환; 및 인산기(phosphate group), 친유성 화합물(lipophilic compound) 또는 세포 투과성 펩타이드의 결합.
본 발명에 있어서, 상기 친유성 화합물(lipophilic compound)은 콜레스테롤, 토코페롤, 도코헥사엔산(DHA), 팔미트산 및 탄소수 10개 이상의 장쇄지방산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 콜레스테롤인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 중 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -OCH3(methoxy) 또는 -F(불소)로 치환되는 변형; 센스 또는 안티센스 가닥에서 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 변형; 및 센스 가닥의 3' 말단에 친유성 화합물 결합; 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 인산기(phosphate group) 결합;으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA의 센스 가닥은 하기 표의 (a) 내지 (c)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이고, 안티센스 가닥은 (d) 내지 (o)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이다.
상기 표에서 *는 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated bond), m은 2'-O-메틸(Methyl), /chol/은 콜레스테롤을 의미한다. 구체적으로, “*”은 기존의 포스포다이에스터 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 형태를 의미하는 것이며, “m”은 기존의 2'-OH가 2'-O-메틸로 치환된 형태를 의미하는 것이다. 또한, “2'-F-“는 예를 들어, 2'-F-G의 경우, 기존의 G(구아닌)의 2'-OH가 플루오르로 치환된 형태를 의미하는 것이며, “Chol”은 3'-말단에 콜레스테롤이 첨가된 형태를 의미한다. 상기 안티센스 가닥의 5' 말단에 인산기가 한 개 내지 세 개 추가적으로 결합될 수 있다.
바람직하게는, 상기 센스 가닥은 상기 표의 (b)이며, 안티센스 가닥은 상기 표의 (i) 또는 (m)인 것을 특징으로 할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 센스 가닥은 하기 표의 (a) 내지 (c)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 안티센스 가닥은 하기 표의 (d) 내지 (h)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 표에서, *는 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated bond), m은 2'-O-메틸(Methyl), 2'-F-는 2'-플루오르(Fluoro), /chol/은 콜레스테롤, 5`P는 5`-인산기(Phosphate group)를 의미한다.
가장 바람직하게는, 상기 센스 가닥은 상기 표의 (c)이고, 상기 안티센스 가닥은 상기 표의 (g) 또는 (h)인 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는 상기 센스 가닥은 하기 표의 (A) 내지 (D)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이고, 안티센스 가닥은 하기 표의 (E) 내지 (H)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게, 상기 siRNA는 센스 가닥 (A) 및 안티센스 가닥 (E); 센스 가닥 (B) 및 안티센스 가닥 (F); 센스 가닥 (C) 및 안티센스 가닥 (G); 또는 센스 가닥 (D) 및 안티센스 가닥 (H)일 수 있다.
상기 표에서 *는 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated bond), m은 2'-메틸, 2'-F-는 2'-F(불소), /chol/은 콜레스테롤, 5`P는 5`-인산기를 의미할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 siRNA를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종, 비상피 종양, NSCLC, 흑색종, 유방암, 신경교종, 림프종, 백혈병, 비뇨계암, 소화도암, 생식계 종양, refractory classic hodgkin's lymphoma, 전립선암, 전이성 흑색종, 신세포암, 호지킨림프종, 두경부 편평세포암, 요로상피세포암, 난치성 B 세포 전구체 급성림프구성백혈병 및 미만성 거대 B 세포림프종을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, PD-L1으로 대표되는 PD-1 리간드를 발현하는 것으로 알려진 암의 예방 또는 치료용 조성물로 제한없이 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 유효성분인 siRNA 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다.
상기 약학 조성물의 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 siRNA를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 개선 또는 치료방법에 포함되는 구성은 앞서 설명한 발명에 포함되는 구성과 동일하므로, 위 설명은 개선 또는 치료방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 면역세포를 상기 siRNA로 처리하여 수득된 PD-1의 발현이 억제된 면역세포에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "면역세포"는 PD-1을 발현하는 면역반응 관여세포를 의미한다. 바람직하게는, 종양 면역 요법에 사용되는 면역세포인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 면역세포는 자연살해 세포(natural killer cell, NK 세포), CAR-NK 세포(chimeric antigen receptor-modified NK cell), Universal-NK 세포, 세포독성 T 세포(Cytotoxic T lymphocyte, CTL), 종양 침윤 림프구(Tumor infiltrating lymphocyte, TIL), 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC), T 수용체 발현 T 세포(T cell receptor-modified T cells, TCR-T) 및 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(chimeric antigen receptor-modified T cells, CAR-T)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 인간 CD8+ T 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "CAR-T 세포(Chimeric Antigen Recepter-T cell)" 또는 "CAR-NK 세포"란, '키메라 항원 수용체'를 발현하는 T 세포 또는 NK 세포를 뜻한다.
본 발명의 용어 "키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Recepter, CAR)"란 면역 이펙터 세포(effector cell)에서 세포에게 표적 세포 및 세포내 신호 생성을 제공하는 재조합 폴리펩티드 구축물을 의미하는 것이다. CAR는 표적 항원(예: 종양 항원)에 대한 항체-기반 특이성을, 특정 항-종양 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하기 위해 T 세포 또는 NK 세포의 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하는 분자이다.
본 발명의 용어, "키메라"는 상이한 단백질의 일부 또는 상이한 기원의 DNA로 구성되는 것을 의미한다. CAR는 적어도 세포외 결합 도메인(extracellular binding domain), 막횡단 도메인(transmembrane domain), 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함한다.
이러한 면역세포 기반의 종양 면역 요법이 임상에서 성공적으로 사용되었으며, 전무후무한 임상적 효능을 나타낸 바 있다. 면역세포 기반의 종양 면역 요법의 현저한 효과에도 불구하고, 실제 종양의 치료과정에서 여러가지 곤난을 겪으며 문제점이 제기되었는데, 그중 가장 중요한 이유 중의 하나는 상기한 PD-1/PD-L1 억제성 면역관문이며, 이들은 억제 신호 전달과 결부하여 면역세포의 면역활성을 억제함으로써 상기 면역세포 기반의 종양 면역 요법의 효과를 크게 감소시킨다.
이에 본 발명자들은 상기 siRNA로 처리하여 수득된 PD-1 발현이 억제된 면역세포를 개발하여 암세포가 발현하는 PD-리간드와의 억제성 면역관문으로 인한 면역세포 기반의 종양 면역 요법의 효과 감소를 방지하였다.
본 발명의 일 실시예에서, PD-1을 발현하는 Effector T cell에 cp-asiRNA를 처리하였을 때 PD-L1 발현 세포가 존재하는 환경에서도 좋은 활성 회복효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이에 비추어 NK 세포, CAR-NK 세포, CAR-T, TCR-T등 상기한 면역세포 중 어느 하나에 대하여 siRNA로 PD-1 발현을 억제시키는 경우에도 면역세포의 활성 회복을 예상할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PD-1의 발현이 억제된 면역세포를 포함하는 암의 면역세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 용어, "면역세포 치료제"란 수지상세포(dendritic cell), 자연 살해 세포(natural killer cell), T 세포 등 면역세포를 이용하여 체내의 면역반응을 활성화시켜 질병을 치료할 목적으로 사용되는 의약품이다. 면역세포 치료제는 주로 암 치료를 적응증으로 개발되고 있으며, 환자에게 직접 면역세포를 투여하여 면역 기능을 활성화하여, 치료 효과를 얻기 때문에 기존의 암 치료에 이용되는 수술 요법, 항암제나 방사선 치료와는 차별화되는 치료 기전 및 효능으로, 바이오 신약의 주요한 부분을 차지하고 있다.
면역세포 치료제는 사용하는 면역세포 및 제조 공정에서 세포 내로 도입하는 유전자의 특징에 따라 수지상 면역조절 세포치료제, 자연살해 세포(natural killer cell, NK 세포), CAR-NK 세포(chimeric antigen receptor-modified NK cell), Universal-NK 세포, 림포카인 활성세포(lymphokine activated killer, LAK), 종양 침윤 T 세포(tumor-infiltrating T lymphocytle, TIL), T 수용체 발현 T 세포(T cell receptor-modified T cells, TCR-T), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(chimeric antigen receptor-modified T cells, CAR-T)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 유방암, 다발성 골수종, 비상피 종양, NSCLC, 흑색종, 신경교종, 림프종, 백혈병, 비뇨계암, 소화도암 및 생식계 종양. refractory classic hodgkin's lymphoma, 전립선암, 전이성 흑색종, 신세포암, 호지킨림프종, 두경부 편평세포암, 요로상피세포암, 난치성 B 세포 전구체 급성림프구성백혈병 및 미만성 거대 B 세포림프종을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, PD-L1으로 대표되는 PD-1 리간드를 발현하는 것으로 알려진 암의 면역 세포치료제로 제한없이 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: PD-1을 표적으로 하는 RNAi 유도 이중 가닥 핵산 분자 36종 스크리닝
1.1. HeLa-PD-1 세포주에서의 PD-1 발현 확인
asiRNA를 디자인하고 이들의 PD-1 mRNA 발현 억제 효과를 검증하기 이전에 HeLa-PD-1 세포주에서의 PD-1의 발현을 PCR과 ELISA를 사용하여 확인하였다. HeLa-PD-1은 HeLa(ATCC)에 PD-1의 mRNA를 코딩하는 플라스미드를 transfection한 뒤, selection marker인 hygromycin B(Gold Biotechnology Inc)를 이용하여 선별한 cell line으로 안정적으로 PD-1을 과발현 하는 것을 특징이라 할 수 있다. 이는 PD-1이 항상 발현되는 단백질이 아닌, 자극에서 의해서만 transcription이 유도되는 한계를 극복하고 원활한 스크리닝을 가능하게 한다.
1.2. 표적 PD-1 유전자 선정 및 36종의 asiRNA 디자인 및 제작
PD-1을 표적으로 하는 고 효율의 RNAi 간섭을 유도하는 이중 가닥의 핵산 분자를 확보하기 위해 PD-1 유전자에 대한 표적서열선정 후 asiRNA를 디자인하였다. asiRNA 구조는 일반적으로 알려진 siRNA와 비교하여 서로 다른 secondary structure, GC contents(%), 5' end stability difference 등을 가지고 있어 일반적인 siRNA 디자인 프로그램을 사용하여 asiRNA의 염기 서열을 디자인하는 경우 최적화된 asiRNA의 디자인이 다소 어려울 수 있다. 따라서 본 발명의 후보 asiRNA 디자인은 다음과 같은 방법으로 진행하였다.
NCBI database 검색을 통해 PD-1 유전자 정보를 획득하였다(mRNA accession number: NM_005018.2). 동물실험을 고려하여 mouse와 공통표적을 가지는 염기 서열 기준으로 homology 100%를 보이는 염기 서열을 우선 선발한 후 antisense strand에서 seed region(5' 기준 2번-8번 염기서열 부분)을 제외한 부분에서 mismatch를 허용하는 염기 서열 또한 추가로 선발하여 총 36종의 asiRNA를 디자인 후 OliX Pharmaceuticals, Inc.(Korea)에서 10nmole scale로 합성하였다. 디자인된 36종의 asiRNA의 염기서열은 표 1과 같다. 상기 asiRNA는 5x siRNA duplex(바이오니아)에 알맞은 농도로 희석하여, 95℃ 5분, 37℃ 1시간 incubation 과정을 거쳐 annealing 하였고, 12% Polyacrylamide Gel Electrophoresis(PAGE) 후 ChemiDoc UV transilluminator(Biorad)를 통해 QC를 하였다. 스크리닝된 36종의 asiRNA 염기서열은 하기 표 1과 같다.
[표 1]
1.3. 36종의 asiRNA의 PD-1 mRNA 발현 억제효과 확인
mRNA 수준에서 유전자 억제 효율을 확인하기 위해, 선정한 36종의 asiRNA를 이용하여 HeLa-PD-1 세포 주에 10nM과 1nM의 농도로 transfection한 후 qRT-PCR을 수행하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 측정하였다.
구체적으로, HeLa-PD-1 세포를 100mm cell culture dish에서 10% fetal bovine serum(Gibco), 0.2g/L hygromycin B를 첨가한 Dulbecco's modificed Eagle's medium(Gibco)에서 배양하였다. Transfection 하기 24시간 이전에 배양한 HeLa-PD-1 세포를 12-well plate에 seeding 하였다. 이후 RNAimax(Invitrogen)을 이용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜에 기초하여 1nM 또는 10nM의 36종의 asiRNA(표 1)를 transfection하였다. 24시간 뒤, Tri-RNA reagent(FAVORGEN)를 이용해 total RNA를 추출한 다음 500ng의 RNA를 cDNA 합성에 사용하였다. cDNA는 High-capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 합성하였다. 이후 합성된 cDNA는 StepOne real-time PCR system(Applied Biosystems)를 이용하여 qRT-PCR을 진행하였다. 표 2의 primer 및 SYBR green PCR master Mix(Applied Biosystems)를 이용하여 non-treated sample(NT) 대비 asiRNA transfection sample의 PD-1 발현량을 퍼센트로 환산하였다(도 2(10nM), 도 3(1nM)). Housekeeping gene으로 Tublin을 이용하였다(표 2).
[표 2]
상기 실험은 독립적으로 3회 수행되었으며, PD-1 mRNA를 표적으로 하는 36종의 서열에 대한 asiRNA의 유전자억제 효율을 도 2(10nM) 및 도 3(1nM)에 나타내었다. 해당값은 독립적인 실험의 평균±표준 편차 값을 나타낸다. 총 36개의 염기 서열에 대한 스트리닝 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 25종이 10nM의 농도에서 PD-1 mRNA의 발현을 50% 이상 억제한 것으로 확인되었다. 농도를 1nM로 감소시켰을 때에는, 도 3에 나타난 바와 같이 총 36개의 염기 서열 중 14개의 서열이 50% 이상의 효율로 PD-1 mRNA의 발현을 억제한 것으로 확인되었다. 특히, 80% 이상의 유전자 억제 효율을 모이는 asiRNA에 대한 IC50 측정 결과, asiPD-1-93과 asiPD-1-95가 가장 낮은 IC50를 갖는 것으로 확인되었다. 이중 chemical modification과 self-delivery 실험을 위한 후보군으로 asiPD-1-89도 포함하여 선정하였다.
1.4. asiRNA 3종의 PD-1 protein level 정량을 통한 단백질 발현 억제효과 확인
36종의 asiRNA screening 결과를 통해 80% 이상 유전자 억제 효율을 보인 aiRNA에서 가장 효율이 좋은 2종(asiPD-1-93, asiPD-1-95)및 추가적으로 asiPD-1-89를 선별하여 1nM 농도에서 transfection 후 Human programmed Death 1(PD-1) ELISA kit(Mybiosoure)를 통해 PD-1 protein level을 확인하였다.
구체적으로, HeLa-PD-1 세포를 100mm cell culture dish에서 10% fetal bovine serum(Gibco), 0.2g/L hygromycin B를 첨가한 Dulbecco's modificed Eagle's medium(Gibco)에서 배양하였다. Transfection 하기 24시간 이전에 배양한 HeLa-PD-1 세포를 12-well plate에 seeding 하였다. 이후 RNAimax(Invitrogen)을 이용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜에 기초하여 3종의 asiRNA(asiPD-1-89, asiPD-1-93, asiPD-1-95) 1nM를 transfection하였다. Transfection 후 24시간 뒤 미디어를 새로운 미디어로 바꾸어 주었고, 48시간째에는 다시 12-well plate로 계대 배양(passage)을 했다. 이후 96시간째에 하베스트(harvest)를 진행하여 5X RIPA(자체 제작) 버퍼를 이용하여 cell lysate를 만들었다. BCA assay(Pierce)를 통하여 정량한 후 Human Programmed Death 1(PD-1) ELISA kit(Mybiosource)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 PD-1 protein level을 확인하였다.
상기 실험은 독립적으로 4회 수행되었으며, 선정된 후보군 3종에 대한 PD-1 protein level(% of control)을 도 4에 나타내었다. 가장 높은 유전자 억제 효율을 보인 asiPD-1-93 및 asiPD-1-95는 대조군(NT) 대비 20% 이하의 PD-1 protein level을 나타내었고, asiPD-1-89 또한 약 40%의 PD-1 protein level을 나타내었는 바, 각 후보군이 높은 PD-1 발현 억제 효율을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: PD-1을 표적으로하는 세포 관통능(cell-penetrating ability) 있는 RNAi 유도 비대칭적 이중 가닥 핵산분자(cp-asiRNA)의 스크리닝
2.1. 세포 관통능(cell-penetrating ability)을 갖는 12종의 cp-asiRNA의 디자인 및 제작
PD-1을 표적으로 하는 3종의 후보 asiRNA(asiPD-1-89, asiPD-1-93, asiPD-1-95)에, 세포로의 침투를 촉진하고 RNA구조의 안정성에 도움이 되는 chemical modification을 선정하여 두단계에 거쳐 변형을 적용하였다. 첫 번째로 진행된 cheical modification에는 16nt인 센스 가닥의 3' 말단에 존재하는 뉴클레오티드에 콜레스테롤을 컨쥬게이션하는 것과 이로부터 5' 방향으로 존재하는 3개의 포스페이트 백본을 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하였으며, 센스 가닥의 16개 뉴클레오티드 중 8개의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기를 -O-메틸기로 치환하였다. 또한 안티센스 가닥은 19nt 혹은 25nt의 길이로 구성되어 있으며, 2nt 내지는 11nt 개의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기를 -O-메틸기로 치환하였고, 3' 말단 방향에 존재하는 4개의 뉴클레오티드의 포스페이트 백본을 포스포로티오에이트(phosphrothioate)로 치환하여 12종의 cp-asiRNA를 디자인하였다. 이렇게 디자인된 12종의 cp-asiRNA 염기 서열은 표 3과 같다. cp-asiPD-1-1 내지 cp-asiPD-1-5는 표 1의 asiPD-1-95를 기반으로 디자인되었고, cp-asiPD-1-6 내지 cp-asiPD-1-10은 표 1의 asiPD-1-93를 기반으로 디자인되었으며, cp-asiPD-1-11 내지 cp-asiPD-1-12는 표 1의 asiPD-1-89를 기반으로 디자인되었다. 이렇게 디자인된 12종의 cp-asiRNA는 OptiMEM(Gipco)에 알맞은 농도로 희석하여, 95℃ 5분, 37℃ 1시간 incubation 과정을 거쳐 annealing 하였고, 12% Polyacrylamide Gel Electrophoresis(PAGE) 후 ChemiDoc UV transilluminator(Biorad)를 통해 QC를 하였다.
[표 3]
2.2. cp-asiRNA 12종에 대한 독성 검증 및 세포 침투능 과 PD-1 발현 억제 효능의 protein 수준에서의 검증
Protein 수준에서 유전자 억제 효율을 확인하기 위해 1μM의 농도로 cp-asiRNA를 Treatment한 뒤 24시간 후에 cp-asiRNA가 야기하는 독성을 확인하였으며, Treatment 96시간 후에 PD-1 단백질의 발현 정도를 측정하였다.
구체적으로, 먼저, HeLa-PD-1 세포를 100mm petri dish에 10% fetal bovine serum(Gibco), 0.2g/L hygromycin B(Gold Biotechnology Inc)를 첨가한 Dulbecco's modificed Eagle's medium(Gibco)에서 배양하였다. Treatment 하기 24시간 전에 배양한 HeLa-PD-1 세포를 12-well plate에 seeding 하였다. Seeding이후 별도의 전달체 없이 1μM의 농도로 12종의 cp-asiRNA를 treatment하였다.
독성 확인을 위해 Treatment 24시간 후에 cp-asiRNA가 야기하는 독성을 확인하였으며, 24시간째에 미디어를 새 미디어로 바꿔주고 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS, Gibco)에 녹인 MTT(Sigma-Aldrich)를 최종 농도가 5mg/ml이 되도록 넣어주었다. 37℃에서 2시간 동안 incubation한 다음, solution을 모두 제거하고 DMSO(Sigma-Aldrich)를 첨가한 뒤 다시 37℃에서 10분동안 incubation 한 다음 570nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 제작한 cp-asiRNA가 유발하는 세포독성이 없음을 확인하였다.
PD-1 단백질 발현 측정을 위해, Treatment 96시간 후에 상기 cell을 하베스트(harvest)하여 cell lysaate를 얻었다. Thermo Scientific Pierece BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific)을 사용하여 정량한뒤, 웨스턴 블롯을 하여 PD-1 protein level을 확인하였다. 1차 항체로 Anti-PD1 antibody(Abcam)을 사용하였고 2차 항체로는 Goat anti-Rabbit igG H&L(HRP)(Abcam)을 사용하였다.
상기 protein level 확인은 독립적으로 세번 진행되었으며, 도 5는 이를 대표할 수 있는 결과이다. 실험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 총 12종의 cp-asiRNA 중 7종이 단백질 수준에서의 유전자 발현 억제 효과를 확인할 수 있었다. asiRNA와 달리 chemical modification이 있는 cp-asiRNA의 경우, 전달체 없이도 treatment 만으로 좋은 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: PD-1을 표적으로하는 세포 관통능(cell-penetrating ability)이 있는 RNAi 유도 비대칭적 이중 가닥 핵산분자(cp-asiRNA)의 스크리닝
3.1. cp-asiPD-1-6 내지 cp-asiPD-1-10에 추가적으로 화학적 변형시킨 11종의 cp-asiRNA 디자인 및 제작
도 5에서 효과를 확인한 12종의 cp-asiRNA중 가장 낮은 PD-1 protein발현 정도를 보인 7종 중, asiPD-1-93에 chemical modification을 추가한 cp-asiPD-1-6 내지 cp-asiPD-1-10에 chemical modification을 추가로 도입하였다. 이 때 추가된 modification에는 안티센스 가닥의 5' 말단에 위치한 뉴클레오티드에 포스페이트를 컨쥬게이션 하거나, 두 가닥 모두에 있어서, 10개 내지는 12개의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기를 -O-플로오르기로 치환하거나 -O-메틸기(methoxy)로 치환하였다, 총 11개의 cp-asiRNA를 추가로 디자인 및 제작하였고, 그 염기서열은 표 4와 같다.
[표 4]
3.2. 추가 제작된 cp-asiRNA 11종에 대한 독성 검증 및 세포 침투능과 PD-1 발현 억제 효능의 protein 수준에서의 검증
상기 실시예 2.2에서 와 같은 방법으로 11종의 추가 제작된 cp-asiRNA의 독성 검증 및 세포 침투능 과 PD-1 발현 억제 효능의 protein 수준에서의 검증을 진행하였다. 상기 실험은 독립적으로 3회 실시되었으며, 도 6은 이를 대표할 수 있는 결과이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 도 6에서 알 수 있듯이 단백질 수준에서 유전자 발현 억제 효율은 cp-asiPD-1-22와 cp-asiPD-1-23이 가장 탁월한 것으로 확인되었다.
실시예 4: cp-asiRNA 2종(cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23)에 대한 duration test
실시예 3에서 나타난 바와 같이 가장 좋은 PD-1 발현 억제 효능을 보인 cp-asiPD-1-22 및 cp-asiPD-1-23에 화학적 변형에 따른 효과 지속 능력 증가 확인을 위해 duration test를 진행하였다. asiPD-1-93이 대조군으로 사용되었으며, cp-asiPIN1은 PD-1이 아닌 다른 유전자를 타깃으로 하는 cp-asiRNA로 negative control로 사용하였다.
구체적으로, HeLa-PD-1 세포를 100mm cell culture dish에서 10% fetal bovine serum(Gibco), 0.2g/L hygromycin B를 첨가한 Dulbecco's modificed Eagle's medium(Gibco)에서 배양하였다. Transfection 하기 24시간 이전에 배양한 HeLa-PD-1 세포를 12-well plate에 seeding 하였다. Seeding 24시간 이후 RNAimax(Invitrogen)을 이용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜에 기초하여 asiRNA(asiPD-1-93)를 transfection하였고, cp-asiPD-1-22 및 cp-asiPD-1-23은 별도의 전달체없이 treatment 하였다. 그 이후 실시예 2.2 에서와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 통하여 PD-1 protein level을 확인하였다(도 7). 상기 실험은 독립적으로 세번 수행되었으며 도 7은 이를 대표할 수 있는 사진이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 가장 효율이 좋았던 22번의 유전자 발현 억제 효과는 treatment 이후 2일차에서 3일차 사이에 단백질 수준에서 확인되기 시작하여 4일차에 유지되고, 이후 타깃 유전자인 PD-1의 발현이 회복되기 시작하는 것으로 확인되었다. 따라서 22번 cp-asiPD-1의 경우 asiPD-1과 23번 cp-asiPD-1 보다 더 오랫동안 그 효과가 유지되는 것으로 확인되었다.
실시예 5: cp-asiRNA 2종(cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23)의 T cell 활성화능에 대한 Functional assay
도 7의 cp-asiRNA 2종(cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23)을 사용한 PD-1 유전자 발현 억제가 T 세포의 활성 증가로 이어지는지 확인하였다. cp-asiRNA 2종(cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23) 및 asiPD-1-93을 사용하였으며, 효과의 확인을 위해 현재 시판중인 PD-1 blocking antibody인 Nivolumab도 함께 사용하였고, cp-asiPIN1은 PD-1이 아닌 다른 유전자를 타깃으로 하는 cp-asiRNA로 negative control로 사용하였다. 해당 실험의 원리는, 항원 제시 세포 표면의 MHC 분자와 결합한 항원을 T 세포가 TCR을 통해 인식하였을 때 그 결과 중에 하나로 NFAT의 발현이 촉진됨을 이용한 것이다. PD-1이 발현된 경우, TCR이 자극하는 신호전달체계를 방해하게 되어 결과적으로 NFAT의 발현이 저해된다. 따라서 NFAT이 발현될 시 luciferase가 발현되도록 유전자 조작을 거친 Effector cell(T cell)을 사용하여, PD-1의 활성 억제 혹은 발현 감소의 효과를 정량적으로 확인할 수 있게 만들어진 PD-1/PD-L1 Blockade Bioassays(Promega)를 사용하였다.
5.1. cp-asiRNA 2종(cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23)의 T cell 활성화능에 대한 Functional assay(96시간)
구체적으로, PD-1을 발현하는 Effector cell에 3μM, 1μM, 0.5μM의 농도로 asiPD-1-93을 실시예 1.3과 동일한 방법으로 처리하고, 동일한 농도의 cp-asiPD-1-22 및 cp-asiPD-1-23 또한 실시예 2.2와 동일한 방법으로 처리하였다. 처리 후 96시간 이후에 PD-L1 cell과 6시간 동안 co-incubation한 다음, luminescence를 측정하여 non-treated sample(NT) 대비 각 샘플의 luminescence 측정값을 상대적인 값(average relative light unit; RLU)으로 나타내었다. 이러한 측정은 PD-1/PD-L1 Blockade Bioassays(Promega)를 사용하였으며 제조사에서 제시하는 프로토콜에 의하여 진행되었다. 양성 대조군으로 사용된 Nivolumab은 1μg/mL의 농도로 사용되었다. 상기 실험은 독립적으로 3번 실시되었으며, 도 8은 각 실험의 평균±표준편차 값을 나타낸다.
도 8에서 나타난 바와 같이, T 세포 활성 회복에 있어서 cp-asiPD-1-22는 현재 시판중인 PD-1 항체인 Nivolumab과 비슷하거나 그 보다 좋은 효과를 확인했다.
5.2. cp-aiRNA 2종(cp-asiPD-1-22, cp-asiPD-1-23)의 T cell 활성화능에 대한 Functional assay(72시간)
실시예 4(도 7)에서 확인한 바와 같이 cp-asiPD-1-22의 단백질 수준에서의 유전자 발현 효율이 3일(72시간)에서 4일(96시간) 이후까지 지속되는 것을 확인하였고, 실시예 5.1(도 8)에서 확인한 바와 같이 cp-asiPD-1-22의 T 세포 활성화능이 가장 뛰어나고, 1μM 농도에서 T세포 활성이 가장 많이 증가하는 것으로 확인되어 실시예 5.1과 같은 방법의 functional assay를 72시간의 조건에서 독립적으로 3번 반복하여 실험하였다. 도 9는 상기 실험의 non-treated sample(NT) 대비 각 샘플의 luminescence 측정값을 상대적인 값(average relative light unit; RLU)으로 나타낸 것이다.
도 9에서 나타난 바와 같이, Nivolumab이 야기하는 T 세포 활성 회복에 비해 cp-asiPD-1 22번의 효과가 2배 정도 좋으며, 이 차이가 통계적으로 유의미하다는 것을 T-검정을 통한 p-value를 통해 확인할 수 있었다.
실시예 6: PD-1을 표적으로 하는 RNAi 유도 이중 가닥 핵산 분자 8종 스크리닝
6.1. 8종의 asiRNA 디자인 및 제작
본 실시예에서는 실시예 1.2와 동일한 방법으로 PD-1을 표적으로 하는 RNAi 유도 이중 가닥 핵산 분자를 디자인 및 제작하였다. 상기 핵산 분자는 16nt의 sense strand 및 19nt의 Antisense strand로 이루어져 있으며, 스크리닝된 8종의 asiRNA 염기서열과 표적 영역은 하기 표 5와 같다.
[표 5]
6.2. PD-1 mRNA 발현 억제 효과 확인
본 실시예에서는 mRNA 수준에서 유전자 억제 효율을 확인하기 위해, 8종의 asiRNA를 이용하여 실시예 1.3과 동일한 방법으로 HeLa-PD-1 세포주에 1nM의 농도로 transfection 한 후 qRT-PCR을 수행하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 측정하였다. 구체적으로, HeLa-PD-1 세포를 12-well plate에 seeding한지 24시간 후, RNAimax(Thermo)를 이용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜을 따라 1 nM 농도로 asiRNA를 transfection 하였다. Transfection 24시간 후에 Tri-RNA reagent(FAVORGEN)을 이용하여 RNA를 추출하고 High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이후, qRT-PCR을 통하여 asiRNA의 PD-1 발현 억제 효능을 mRNA 수준에서 평가하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 RNAi 유도 이중 가닥 핵산 분자 모두는 PD-1 mRNA의 발현을 감소시킴을 확인하였다.
6.3. PD-1 단백질 발현 억제효과 확인
본 실시예에서는 실시예 6.2의 결과를 통해 약 70% 이상 유전자 억제 효율을 보인 asiRNA(8-039, 8-046, 8-048, 8-053, 8-068, 및 8-070)를 HeLa-PD-1 세포 주에 transfection 한 뒤, 이로부터 48시간 후 수득한 세포를 대상으로 실시예 1.4와 동일한 방법으로 asiRNA의 PD-1 발현 억제 효능을 단백질 수준에서 평가하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 RNAi 유도 이중 가닥 핵산 분자 모두는 PD-1 단백질의 발현을 감소시킴을 확인하였다.
실시예 7: PD-1을 표적으로하는 세포 관통능이 있는 RNAi 유도 비대칭적 이중 가닥 핵산분자(cp-asiRNA)의 스크리닝
7.1. 8-039 및 8-068에 추가적으로 화학적 변형시킨 12종의 cp-asiRNA 디자인 및 제작
상기 실시예 6에서 효과를 확인한 8종의 asiRNA 중 우수한 PD-1 발현 억제 효능을 보인, 8-068 및 8-039에 대하여 실시예 3.1과 동일한 방식으로 chemical modification을 도입하였다. 총 12종의 cp-asiRNA를 추가로 디자인 및 제작하였고, 그 염기서열은 표 6과 같다.
[표 6]
7.2. PD-1 mRNA 발현 억제효과 확인
본 실시예에서는 mRNA 수준에서 유전자 억제 효율을 확인하기 위해, 12종의 cp-asiRNA를 이용하여 HeLa-PD-1 세포주에 1 μM의 농도로 처리한 후 qRT-PCR을 수행하여 PD-1 mRNA의 발현 정도를 측정하였다. 구체적으로, HeLa-PD-1 세포를 12-well plate에 seeding한지 24시간 후, 별도의 전달체 없이 cp-asiRNA를 처리하였다. 처리 24시간 후에 Tri-RNA reagent(FAVORGEN)을 이용하여 RNA를 추출하고 High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이후, qRT-PCR을 통하여 cp-asiRNA의 PD-1 발현 억제 효능을 mRNA 수준에서 평가하였다. 또한, 상기 12종의 cp-asiRNA 중 4종, 즉, 8-068-3, 8-068-13, 8-039-8, 및 8-039-13을 선정하여, HeLa-PD-1 세포주에 1 μM 또는 2 μM의 농도로 처리한 후 재차 PD-1 발현 억제 효능을 mRNA 수준에서 평가하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 세포 관통능이 있는 RNAi 유도 이중 가닥 핵산 분자들 중 8-068-2, 8-068-3, 8-068-5, 8-068-7, 8-068-8, 8-068-13, 8-068-15, 8-039-3, 및 8-039-13은 PD-1 mRNA의 발현을 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 이들 중에서도 8-068-3, 8-068-13, 8-039-3, 및 8-039-13의 발현 억제 효능은 현저하였다.
7.3. PD-1 mRNA 단백질 발현 억제효과 확인
본 실시예에서는 실시예 7.1의 결과를 통해 우수한 유전자 억제 효율을 보인 4종의 cp-asiRNA를 HeLa-PD-1 세포 주에 처리한 후, 이로부터 24시간 인큐베이션 후 수득한 세포를 대상으로 실시예 1.4와 동일한 방법으로 cp-asiRNA의 PD-1 발현 억제 효능을 단백질 수준에서 평가하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 세포 관통능이 있는 RNAi 유도 이중 가닥 핵산 분자 모두(8-068-3, 8-068-13, 8-039-8, 및 8-039-13)는 PD-1 단백질의 발현을 감소시킴을 확인하였다.
실시예 8: cp-asiRNA 의 T cell 활성화능에 대한 Functional assay
본 실시예에서는 실시예 7에서 효과를 확인한 cp-asiRNA 중 우수한 PD-1 발현 억제 효능을 보인, 8-068-3, 8-068-13, 8-039-8, 및 8-039-13을 T 세포에 처리한 경우, PD-1 유전자 발현 억제가 T 세포의 활성 증가로 이어지는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, frozen human T cell(Stem Cell Technologies으로부터 구입), 18-20 시간 동안 T 세포를 다시 회복시켰다. 이후, 2 % human serum을 포함한 CTS OpTmizer (Thermo)에서 상기 회복된 human T cell에 CD3/Cd28 magnetic beads(Dynabeads)와 200 IU의 IL-2를 처리하여 72시간 동안 T 세포를 활성화시켰다. 12-well plate에서 20,000개의 활성화된 T 세포에 cp-asiRNA를 72시간 동안 처리한 후, Tri-RNA reagent(FAVORGEN)을 이용하여 RNA를 추출하고 High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이후, qRT-PCR을 통하여 상기와 같이 처리된 T 세포의 PD-1 발현 억제 효능을 mRNA 수준에서 평가하였다.
이후, luciferase가 발현되도록 유전자 조작을 거친 Effector cell(T cell)을 사용하여, PD-1의 활성 억제 혹은 발현 감소의 효과를 정량적으로 확인하고자 Promega bioassay kit (catalogue no: J4011)를 이용하여 PD-1 blockade assay를 수행하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 상기 세포 관통능이 있는 RNAi 유도 이중 가닥 핵산 분자 모두(8-068-3, 8-068-13, 8-039-8, 및 8-039-13)는 T 세포 내 PD-1 mRNA의 발현을 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 비처리군 (NT)의 T 세포 활성 회복에 비해 세포 관통능이 있는 RNAi 유도 이중 가닥 핵산 분자가 처리된 군은 약 3배 가량 발현 억제 효능이 우수함을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> OliX Pharmaceuticals, Inc.
<120> Asymmetric siRNA Inhibiting Expression of PD-1
<130> PN131281
<150> KR 2019-0058805
<151> 2019-05-20
<160> 92
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 1
cuguggggcc aucucc 16
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 2
ggagauggcc ccacagaggu a 21
<210> 3
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 3
ucuguggggc caucuc 16
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 4
gagauggccc cacagaggua g 21
<210> 5
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 5
ccuucaccug cagcuu 16
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 6
aagcugcagg ugaagguggc g 21
<210> 7
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 7
accuucaccu gcagcu 16
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 8
agcugcaggu gaagguggcg u 21
<210> 9
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 9
caccuucacc ugcagc 16
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 10
gcugcaggug aagguggcgu u 21
<210> 11
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 11
cucugugggg ccaucu 16
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 12
agauggcccc acagagguag g 21
<210> 13
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 13
ccucuguggg gccauc 16
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 14
gauggcccca cagagguagg u 21
<210> 15
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 15
accucugugg ggccau 16
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 16
auggccccac agagguaggu g 21
<210> 17
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 17
ccaccuucac cugcag 16
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 18
cugcagguga agguggcguu g 21
<210> 19
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 19
gccccagcaa ccagac 16
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 20
gucugguugc uggggcucau g 21
<210> 21
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 21
agccccagca accaga 16
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 22
ucugguugcu ggggcucaug c 21
<210> 23
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 23
ggcaccuacc ucugug 16
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 24
cacagaggua ggugccgcug u 21
<210> 25
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 25
cggcaccuac cucugu 16
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 26
acagagguag gugccgcugu c 21
<210> 27
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 27
gcggcaccua ccucug 16
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 28
cagagguagg ugccgcuguc a 21
<210> 29
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 29
agcggcaccu accucu 16
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 30
agagguaggu gccgcuguca u 21
<210> 31
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 31
cgugacuucc acauga 16
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 32
ucauguggaa gucacgcccg u 21
<210> 33
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 33
gggcgugacu uccaca 16
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 34
uguggaaguc acgcccguug g 21
<210> 35
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 35
acuaugggga gcugga 16
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 36
uccagcuccc cauaguccac a 21
<210> 37
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 37
gacacugcuc uuggcc 16
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 38
ggccaagagc aguguccauc c 21
<210> 39
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 39
gccaccuuca ccugca 16
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 40
ugcaggugaa gguggcguug u 21
<210> 41
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 41
cgccaccuuc accugc 16
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 42
gcaggugaag guggcguugu c 21
<210> 43
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 43
caugagcccc agcaac 16
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 44
guugcugggg cucaugcggu a 21
<210> 45
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 45
gcaugagccc cagcaa 16
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 46
uugcuggggc ucaugcggua c 21
<210> 47
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 47
agggugacag agagaa 16
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 48
uucucucugu cacccugagc u 21
<210> 49
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 49
cagggugaca gagaga 16
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 50
ucucucuguc acccugagcu c 21
<210> 51
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 51
ucagggugac agagag 16
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 52
cucucuguca cccugagcuc u 21
<210> 53
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 53
gacuaugggg agcugg 16
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 54
ccagcucccc auaguccaca g 21
<210> 55
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 55
aguggcgaga gaagac 16
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 56
gucuucucuc gccacuggaa a 21
<210> 57
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 57
caguggcgag agaaga 16
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 58
ucuucucucg ccacuggaaa u 21
<210> 59
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 59
ccaguggcga gagaag 16
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 60
cuucucucgc cacuggaaau c 21
<210> 61
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 61
uccaguggcg agagaa 16
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 62
uucucucgcc acuggaaauc c 21
<210> 63
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 63
ucugcagacc cuccac 16
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 64
guggaggguc ugcagaacac u 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 65
gcctggctcc tattgtccct c 21
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 66
caggugaagg uggcguuguc c 21
<210> 67
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 67
aacgccaccu ucaccu 16
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 68
aggugaaggu ggcguugucc c 21
<210> 69
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 69
uucugcagac ccucca 16
<210> 70
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 70
uggagggucu gcagaacacu g 21
<210> 71
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 71
ggacuauggg gagcug 16
<210> 72
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 72
cagcucccca uaguccacag a 21
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Foward Primer (Housekeeping gene Tublin)
<400> 73
gaccaagcgt accatccagt 20
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer (Housekeeping gene Tublin)
<400> 74
acgtttggca tacatcagg 19
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Foward Primer (PD-1 mRNA qPCR primer)
<400> 75
ccctggtggt tggtgtcgt 19
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer (PD-1 mRNA qPCR primer)
<400> 76
gcctggctcc tattgtccct c 21
<210> 77
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 77
cuaaacuggu accgca 16
<210> 78
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 78
ugcgguacca guuuagcac 19
<210> 79
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 79
ggagagcuuc gugcua 16
<210> 80
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 80
uagcacgaag cucuccgau 19
<210> 81
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 81
cggagagcuu cgugcu 16
<210> 82
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 82
agcacgaagc ucuccgaug 19
<210> 83
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 83
ucugggcggu gcuaca 16
<210> 84
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 84
uguagcaccg cccagacga 19
<210> 85
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 85
cgcagaucaa agagag 16
<210> 86
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 86
cucucuuuga ucugcgccu 19
<210> 87
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 87
gcagaucaaa gagagc 16
<210> 88
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 88
gcucucuuug aucugcgcc 19
<210> 89
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 89
ggaguaugcc accauu 16
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 90
aaugguggca uacuccguc 19
<210> 91
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 91
ccauugucuu uccuag 16
<210> 92
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 92
cuaggaaaga caauggugg 19
Claims (21)
- PD-1(Programmed cell Death protein 1)을 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 서열번호 78의 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 서열번호 77의 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것을 특징으로 하는, siRNA.
- 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA:
(a) 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3, -OCH3, -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸, -O-프로필, -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환;
(b) 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 산소가 황으로 치환;
(c) 뉴클레오티드의 포스페이트 백본이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형;
(d) 뉴클레오티드가 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid)로 치환; 및
(e) 인산기(phosphate group), 친유성 화합물(lipophilic compound) 또는 세포 투과성 펩타이드의 결합.
- 제2항에 있어서, 상기 친유성 화합물은 콜레스테롤, 토코페롤, 도코헥사엔산(DHA), 팔미트산, 및 탄소수 10개 이상의 장쇄지방산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 siRNA.
- 제2항에 있어서, (a) 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 중 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -OCH3 또는 -F로 치환되는 변형;
(b) 센스 또는 안티센스 가닥에서 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변형;
(c) 센스 가닥의 3' 말단에 콜레스테롤 결합; 및
(d) 안티센스 가닥의 5' 말단에 인산기 결합;으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA.
- 제4항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 하기 표에서 선택되는 것으로, 상기 센스가닥 및 안티센스 가닥의 조합은,
ⅰ) 번호 1의 센스 가닥과 번호 4의 안티센스 가닥의 조합;
ⅱ) 번호 2의 센스 가닥과 번호 4의 안티센스 가닥의 조합;
ⅲ) 번호 3의 센스 가닥과 번호 4의 안티센스 가닥의 조합;
ⅳ) 번호 3의 센스 가닥과 번호 5의 안티센스 가닥의 조합; 또는
ⅴ) 번호 3의 센스 가닥과 번호 6의 안티센스 가닥의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 siRNA:
(상기 서열에서 *는 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated bond), m은 2'-메틸, 2'-F-는 2'-F(불소), /chol/은 콜레스테롤, 5`P는 5`-인산기를 의미함).
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종, 비상피 종양, NSCLC, 흑색종, 유방암, 신경교종, 림프종, 백혈병, 비뇨계암, 소화도암, 생식계 종양, refractory classic hodgkin's lymphoma, 전립선암, 전이성 흑색종, 신세포암, 호지킨림프종, 두경부 편평세포암, 요로상피세포암, 난치성 B 세포 전구체 급성림프구성백혈병 및 미만성 거대 B 세포림프종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190058805 | 2019-05-20 | ||
| KR20190058805 | 2019-05-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200133681A KR20200133681A (ko) | 2020-11-30 |
| KR102397455B1 true KR102397455B1 (ko) | 2022-05-13 |
Family
ID=73458342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200060495A KR102397455B1 (ko) | 2019-05-20 | 2020-05-20 | PD-1의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220380774A1 (ko) |
| EP (1) | EP3974531A4 (ko) |
| KR (1) | KR102397455B1 (ko) |
| CN (1) | CN114174512A (ko) |
| WO (1) | WO2020235936A1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100949791B1 (ko) | 2007-12-18 | 2010-03-30 | 이동기 | 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도 |
| KR101312568B1 (ko) | 2009-06-29 | 2013-09-30 | 샤프 가부시키가이샤 | 유기ｅｌ 소자용 밀봉막, 유기ｅｌ 소자 및 유기ｅｌ 디스플레이 |
| KR101328568B1 (ko) | 2010-10-22 | 2013-11-13 | 성균관대학교산학협력단 | Ｒｎａ 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060134787A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-22 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended siRNA |
| DK2853597T3 (en) * | 2012-05-22 | 2019-04-08 | Olix Pharmaceuticals Inc | RNA INTERFERENCE-INducing NUCLEIC ACID MOLECULES WITH CELL PENETENING EQUIPMENT AND USE THEREOF |
| US10934550B2 (en) * | 2013-12-02 | 2021-03-02 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Immunotherapy of cancer |
| EP3411481A4 (en) * | 2016-02-02 | 2020-02-26 | Olix Pharmaceuticals, Inc. | TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH ANGIOGENESIS USING ANGPT2 AND PDGFB TARGETED RNA COMPLEXES |
| CN107523569B (zh) * | 2016-06-21 | 2024-02-06 | 上海吉倍生物技术有限公司 | Pdcd1基因的用途及其相关药物 |
| CN107058315B (zh) * | 2016-12-08 | 2019-11-08 | 上海优卡迪生物医药科技有限公司 | 敲减人PD-1的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用 |
| KR102016092B1 (ko) | 2017-11-22 | 2019-08-30 | (주)두드림 | 천연 추출물과 세포 배양액을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물 |
-
2020
- 2020-05-20 CN CN202080052529.1A patent/CN114174512A/zh active Pending
- 2020-05-20 WO PCT/KR2020/006610 patent/WO2020235936A1/ko unknown
- 2020-05-20 KR KR1020200060495A patent/KR102397455B1/ko active IP Right Grant
- 2020-05-20 US US17/612,845 patent/US20220380774A1/en active Pending
- 2020-05-20 EP EP20809923.4A patent/EP3974531A4/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100949791B1 (ko) | 2007-12-18 | 2010-03-30 | 이동기 | 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도 |
| KR101312568B1 (ko) | 2009-06-29 | 2013-09-30 | 샤프 가부시키가이샤 | 유기ｅｌ 소자용 밀봉막, 유기ｅｌ 소자 및 유기ｅｌ 디스플레이 |
| KR101328568B1 (ko) | 2010-10-22 | 2013-11-13 | 성균관대학교산학협력단 | Ｒｎａ 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Molecular Therapy,제26권,6호,1482-1493면 (2018.04.13.) 1부.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3974531A1 (en) | 2022-03-30 |
| CN114174512A (zh) | 2022-03-11 |
| EP3974531A4 (en) | 2024-01-10 |
| WO2020235936A1 (ko) | 2020-11-26 |
| US20220380774A1 (en) | 2022-12-01 |
| KR20200133681A (ko) | 2020-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210348166A1 (en) | Immunotherapy of cancer | |
| KR101718297B1 (ko) | Ｈｓｆ1-관련 질환을 치료하기 위한 유기 조성물 | |
| EP3498844A1 (en) | Peptide nucleic acid complex having improved cell permeability and pharmaceutical composition comprising same | |
| US20230348855A1 (en) | Reducing fratricide of immune cells expressing nkg2d-based receptors | |
| KR101252799B1 (ko) | ｃ-Ｍｅｔ의 발현을 저해하는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함하는 항암 조성물 | |
| US20080287383A1 (en) | Nucleic acid compounds for inhibiting erbb gene expression and uses thereof | |
| CA2675967A1 (en) | Nucleic acid constructs and methods for specific silencing of h19 | |
| US20110136233A1 (en) | Nucleic acid compounds for inhibiting plk1 gene expression and uses thereof | |
| US20100112687A1 (en) | Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof | |
| KR101390966B1 (ko) | Ｈｉｆｌａ의 발현을 저해하는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함하는 항암 조성물 | |
| JP2007530431A (ja) | 膵臓癌を治療するための組成物および方法 | |
| US20100055782A1 (en) | Nucleic acid compounds for inhibiting myc gene expression and uses thereof | |
| WO2005092393A1 (ja) | Wt1遺伝子の発現を抑制するマイクロrnaおよびその利用 | |
| KR102397455B1 (ko) | PD-1의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA | |
| IL305634A (en) | RNAI conjugates and their uses | |
| US20110092575A1 (en) | Sirna of human osteopontin | |
| WO2023080159A1 (ja) | リガンド結合核酸複合体 | |
| WO2024190329A1 (ja) | 組成物およびその利用 | |
| JP2008142011A (ja) | オステオポンチンｓｉＲＮＡ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |