CN114174512A - 抑制PD-1表达的不对称siRNA - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制PD‑1，即程序性细胞死亡蛋白1(Programmed cell Death protein 1，PD‑1)表达的不对称siRNA及其用途，更具体地涉及一种包括含有与编码PD‑1的mRNA互补的序列的反义链和与所述反义链形成互补键的有义链的不对称siRNA、包括所述不对称siRNA的用于预防或治疗癌症的药物组合物、通过所述siRNA处理而获得的PD‑1的表达受到抑制的免疫细胞以及包括所述免疫细胞的用于治疗癌症的免疫细胞治疗剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制PD-1，即程序性细胞死亡蛋白1(Programmed cell Deathprotein 1，PD-1)表达的不对称siRNA及其用途，更具体地涉及一种包括含有与编码PD-1的mRNA互补的序列的反义链和与所述反义链形成互补键的有义链的不对称siRNA、包括所述不对称siRNA的用于预防或治疗癌症的药物组合物、通过所述siRNA处理而获得的PD-1的表达受到抑制的免疫细胞以及包括所述免疫细胞的用于治疗癌症的免疫细胞治疗剂。本专利申请要求于2019年5月20日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2019-0058805号的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
背景技术
PD-1，即程序性细胞死亡蛋白1(Programmed cell Death protein 1，PD-1)为细胞表面表达的受体之一，具有抑制免疫细胞活性的作用。当在适应性免疫反应中起主要作用的T淋巴细胞被激活时，会诱导PD-1表达。与作为其配体的PD-L1，即程序性死亡配体1和/或PD-L2，即程序性死亡配体2的相互作用导致在T细胞受体(T cell receptor，TCR)处启动的信号传导通路受到抑制，所述T细胞受体从抗原接收刺激信号。这是通过PD-1使用作为磷酸酶的SHP-2来灭活作为TCR的效应分子(effector molecule)的Zap70的方式完成的。
这种PD-1/PD-L的相互作用在正常状态下抑制自身免疫反应的发生，而在病毒感染等疾病状态下，起到防止由于免疫细胞过度激活而对正常组织中的细胞造成无意损伤的作用。因此，PD-1/PD-L在调节免疫检查点中发挥作用。
PD-1通常在大多数免疫细胞上表达，如活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞等，而PD-L1/PD-L2在抗原呈递细胞或基质细胞(stromal cell)的表面上表达。
就癌细胞而言，利用这种免疫抑制机制逃避免疫系统的监视，为癌细胞的生长和渗透创造有利的环境。一种代表性的方法是在癌细胞中过度表达PD-L1并利用PD-1/PD-L1相互作用使T细胞进入无能(anergy)状态。进入无能状态的T细胞不再增殖，不再分泌细胞因子(cytokine)，也不介导细胞毒性反应。通过提供这种PD-L1，癌细胞逃避在免疫系统中发挥重要作用的免疫细胞的免疫作用，并生长和侵入组织，从而导致抑制细胞疗法的有效性。
例如，在一项研究的体内小鼠模型中证实，已表达PD-L1的肿瘤细胞对由细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell)诱导的细胞溶解反应不太敏感，并且致瘤性和侵袭性增加(Iwai，Yoshiko，et al.“Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape fromhost immune system and tumor immunotherapy by PD-L1blockade.”Proceedings ofthe National Academy of Sciences 99.19(2002)：12293-12297)。另外，在某些情况下，证实仅通过PD-L1表达就可以大大降低细胞毒性T细胞的活性(Juneja，Vikram R.，et al.“PD-L1 on tumor cells is sufficient for immune evasion in immunogenic tumorsand inhibits CD8 T cell cytotoxicity.”Journal ofExperimental Medicine(2017)：jem-20160801)。
已进行研究以抑制这些癌细胞的PD-1/PD-L相互作用，研究结果已报道，通过与PD-1或PD-L互补结合的抗体，以竞争性或非竞争性抑制PD-1/PD-L1作用的方式治疗癌症(Rizvi NA，Hellmann MD，Snyder A，Kvistborg P，Makarov V，Havel JJ，et al.(April2015).“Cancer immunology.Mutational landscape determines sensitivity to PD-1blockade in non-small cell lung cancer”.Science.348(6230)：124-128)。
然而，作为这些PD-1/PD-L1抑制性抗体疗法的副作用，已经有报道皮肤毒性(Dermatologic Toxicities)、消化系统疾病、内分泌毒性(Endocrine Toxicities)、肝脏毒性(Hepatic Toxicities)、肺炎、神经系统综合症(Neurologic Syndromes)、眼毒性(Ocular Toxicity)、肾毒性(Renal Toxicity)、胰腺毒性(Pancreatic Toxcities)等(J.Naidoo，et al.“Toxicities of the Anti-PD-1and Anti-PD-L1 Immune CheckpointAntibodies”Annals of Oncology，mdv383.doi：10.1093/annonc/mdv383)。
另一方面，利用RNA干扰(RNA interference)现象治疗疾病可以更安全地治疗疾病，因为使用靶向mRNA并在翻译水平(translational level)上调节基因表达的siRNA。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)由与靶mRNA序列相同的有义链(sense strand)和具有其互补序列的反义链(antisense strand)组成。常规(conventional)siRNA具有19-21bp的短双链体(duplex)，并且从两条链的3'突出2个核苷酸。siRNA进入细胞，附着在靶mRNA上，降解靶mRNA，抑制靶基因的表达。由于可以通过改变寡核苷酸的序列来靶向所有mRNA，因此也可以抑制具有复杂结构的蛋白质的表达，从而可以治疗目前难以治疗的疾病，例如癌症、病毒感染和遗传疾病。但导入细胞内的siRNA可能会产生副作用，例如诱导免疫反应、抑制非靶基因，其中，将siRNA导入细胞的递送系统(delivery system)是开发使用siRNA的治疗剂的最大问题。
siRNA由于磷酸骨架(phosphate backbone)而带负电荷，由于其对带负电荷的细胞膜具有排斥力，因此需要一个递送系统将siRNA引入细胞。作为递送系统的示例，广泛使用通过用具有正电荷的脂质体或聚合物包裹siRNA来抵消负电荷而将siRNA引入细胞的方法。然而，带正电荷的载体可能会引起各种副作用，例如通过附着在带负电荷的细胞膜上而产生不需要的毒性，或通过与细胞中各种类型的蛋白质相互作用来形成不需要的复合体等。另外，由于siRNA被血液中的核酸酶(nuclease)迅速降解，到达靶细胞的siRNA量可能不足以显着降低靶基因的表达。因此需要一种可以将siRNA安全有效地递送到靶细胞中的方法。
为此，本发明人开发了与不对称siRNA结构(asymmetric shorter duplex siRNA，asiRNA)相关的技术(WO 2009/078685)。asiRNA为一种不对称RNAi诱导结构，与19+2结构相比，双螺旋长度更短。这是一种克服siRNA脱靶效应、RNAi机制饱和、Toll样受体3(TLR3)免疫反应等问题的技术，其可以成为开发新的RNAi药物的强大平台。另外，由于添加了化学和结构修饰(chemical，structural modification)，无需单独的递送系统即可自行递送到细胞中，这克服了现有siRNA递送系统的问题，从而可以开发出有效的下一代疗法。
因此，本发明人预测，通过RNA干扰(RNA interference)抑制PD-1的表达，可以破坏癌细胞中PD-L1过表达引起的免疫细胞抑制机制，从而努力发明一种核酸分子，其具有可通过靶向PD-1有效递送到细胞中的细胞内渗透性，并且具有诱导RNA干扰的能力。结果，开发了不对称小干扰RNA(asymmetric shorter duplex small interferencing RNA，asiRNA)，其诱导RNA干扰以抑制靶基因的表达，同时减少脱靶效应。此外，通过对不对称双链核酸分子进行各种化学修饰，证实其在体外无载体的情况下具有优异的靶基因抑制效率，从而完成了本发明。
本背景技术中所提供的上述信息仅用于理解本发明的背景，并且可以不包括构成本发明所属领域的普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种特异性抑制PD-1，即程序性细胞死亡蛋白1(Programmed cell Death protein 1，PD-1)表达的不对称siRNA(asymmetric shorterduplex siRNA，asiRNA)。
本发明的另一目的在于提供一种包括所述不对称siRNA的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
本发明的再一目的在于提供一种使用所述不对称siRNA抑制PD-1表达的免疫细胞。
本发明的再一目的还在于提供一种包括所述免疫细胞的用于治疗癌症的免疫细胞治疗剂。
技术方案
为了实现所述目的，本发明提供一种不对称siRNA，其特征在于，包括：含有与编码PD-1，即程序性细胞死亡蛋白1(Programmed cell Death protein1，PD-1)的mRNA互补的序列的反义链；和与所述反义链形成互补键的有义链，所述反义链的5'端和有义链的3'端形成平端(blunt end)。
本发明还提供一种包括所述不对称siRNA的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
本发明还提供一种使用所述不对称siRNA抑制PD-1表达的免疫细胞。
本发明还提供一种包括所述免疫细胞的用于治疗癌症的免疫细胞治疗剂。
有益效果
根据本发明，筛选出可通过靶向编码与通过PD-1/PD-L的相互作用免疫细胞的无能性引起的免疫抑制和由此导致的癌症的生长和转移密切相关的免疫细胞的PD-1的mRNA引起RNA干扰效应的不对称siRNA，siRNA在无载体帮助的情况下被引入细胞，通过进行化学修饰使其对核酸酶具有抗性，从而消除由载体引起的细胞毒性，并且通过在体内更有效地抑制基因表达，可以有效地用作癌症的预防或治疗剂。
附图说明
图1为靶向PD-1的不对称siRNA的结构示意图，其由有义链(16mer)和反义链(21mer)组成。
图2为通过以10nM浓度转染不对称siRNA而获得的PD-1 mRNA水平(n＝3)的直方图，其显示基于使用微管蛋白作为管家基因(house keeping gene)的未处理样品(对照组：NT)的表达水平(％)。siOCT4用作阴性对照组(negative control)。
图3为通过以1nM浓度转染不对称siRNA而获得的PD-1 mRNA水平(n＝3)的直方图，其显示基于使用微管蛋白作为管家基因(house keeping gene)的未处理样品(对照组：NT)的表达水平(％)。siOCT4用作阴性对照组(negative control)。
图4为通过转染三种具有良好PD-1表达抑制效果的不对称siRNA(asiPD-1-93、asiPD-1-95、asiPD-1-89)后使用酶联免疫吸附试验(ELISA)得到的PD-1蛋白水平(n＝4)的直方图。
图5为PD-1蛋白水平(n＝3)的蛋白印迹结果照片，其显示针对表3中指定的12种cp-asiRNA的PD-1表达抑制功效。
图6为PD-1蛋白水平(n＝3)的蛋白印迹结果照片，其显示针对表4中指定的11种cp-asiRNA的PD-1表达抑制功效。
图7为PD-1蛋白水平(n＝3)的蛋白印迹结果照片，其显示在表4中指定的11种cp-asiRNA中表现出优异效率的2种类型(cp-asiPD-1-22、cp-asiPD-1-23)的持续时间测试结果(2天至5天)。
图8为在以0.5μM、1μM和3μM浓度处理cp-asiRNA 4天(96时间)后以相对值(average relative light unit)表示荧光素酶发光测量值(n＝3)的直方图，其显示图7中确认的通过cp-asiPD-1-22和cp-asiPD-1-23的PD-1表达抑制而增加的T细胞活性。
图9为在与图8相同的条件下以1μM浓度处理3天后以相对值(average relativelight unit)表示荧光素酶发光测量值(n＝3)的直方图，其显示通过cp-asiPD-1-22和asiPD-1-23的PD-1表达抑制而增加的T细胞活性。
图10为基于未处理样品(对照组：NT)的PD-1 mRNA的表达水平(％)，其显示针对表5中指定的8种不对称siRNA的PD-1表达抑制功效。
图11为PD-1蛋白水平的蛋白印迹结果照片，其显示在表5中指定的8种不对称siRNA中表现出优异效率的6种类型(8-039、8-046、8-048、8-053、8-068和8-070)的PD-1表达抑制功效。
图12为基于未处理样品(对照组：NT)的PD-1 mRNA的表达水平(％)，其显示针对表6中指定的12种cp-asiRNA的PD-1表达抑制功效。
图13为基于未处理样品(对照组：NT)的PD-1 mRNA的表达水平(％)，其显示在表6中指定的12种cp-asiRNA中表现出优异效率的4种类型(cp-8-068-3、8-068-13、8-039-8和8-039-13)的PD-1表达抑制功效。
图14为PD-1蛋白水平的蛋白印迹结果照片，其显示在表6中指定的12种cp-asiRNA中表现出优异效率的4种类型(8-068-3、8-068-13、8-039-8和8-039-13)的PD-1表达抑制功效。
图15为基于未处理样品(对照组：NT)的PD-1 mRNA的表达水平(％)，其显示针对4种cp-asiRNA(8-068-3、8-068-13、8-039-8和8-039-13)的T细胞中PD-1表达抑制功效。
图16为在以1μM和2μM浓度处理cp-asiRNA后基于未处理样品(对照组：NT)以相对值表示荧光素酶发光测量值的直方图，其显示图15中确认的通过cp-asiRNA(8-068-3、8-068-13、8-039-8和8-039-13)的PD-1表达抑制而增加的T细胞活性。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本文所用的命名法与本领域公知和常用的命名法相同。
在本发明的详细描述等中使用的关键术语的定义如下。
“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指一种机制，通过将由具有与靶基因的mRNA同源的序列的链和具有与其互补的序列的链组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞等中来诱导靶基因mRNA的降解，从而抑制靶基因的表达。
“siRNA(small interfering RNA，小干扰RNA)”是指介导序列特异性有效基因表达抑制(基因沉默)的短双链RNA(dsRNA)。
“反义链(antisense strand)”是指指与感兴趣的靶核酸(target nucleic acid)基本或100％互补的多核苷酸，例如可以全部或部分地与信使RNA(mRNA)、非mRNA的RNA序列(例如，microRNA、piwiRNA、tRNA、rRNA和hnRNA)或编码或非编码DNA序列互补。
“有义链(sense strand)”作为具有与靶核酸相同的核酸序列，是指与信使RNA(mRNA)、非mRNA的RNA序列(例如，microRNA、piwiRNA、tRNA、rRNA和hnRNA)或编码或非编码DNA序列完全或部分相同的多核苷酸。
“基因”是应从最广泛的意义上理解的，可以编码结构蛋白或调节蛋白。此时，调节蛋白包括参与转录因子、热休克蛋白或DNA/RNA复制、转录和/或翻译的蛋白。
“PD-1(PD-1)”是Programmed Cell Death protein 1的缩写，属于CD28家族成员的I型跨膜蛋白，人类PD-1基因位于2q37.35染色体上，编码一种约55kD的跨膜蛋白。PD-1广泛表达于活化的T细胞、B细胞、单核细胞和树突细胞的表面，PD-1结构与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)具有30％的同源性，胞内区存在2个酪氨酸残基，分别参与构建N端的一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)和C端的一个免疫受体酪氨酸依赖的转换基序(immunoreceptor tyrosin-basedswitch motif，ITSM)。胞外区由一个IgV样结构域组成，包括多个糖基化位点并被重度糖基化，所述结构域可以与配体结合，从而发挥抑制T细胞活化的功能。PD-L1在多数癌症组织中过量表达，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病和各种泌尿道癌、消化道癌、生殖系统肿瘤等。PD-L1高表达，可以通过抑制RAS和PI3K/AKT信号通路来调控细胞周期检查点的蛋白和细胞增殖相关蛋白表达，最终导致T细胞增殖的抑制。在体外实验和小鼠模型中发现，PD-1/PD-L1信号通路的激活可以诱导特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)调亡，使CTL的细胞毒杀伤效应敏感性下降，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸。
本发明的目的主要有两个，一是设计靶向编码PD-1的mRNA的不对称siRNA，通过筛选筛选出最有效抑制PD-1表达的不对称siRNA，二是在没有特定载体的情况下将siRNA传递到细胞中并引入化学修饰以增加对核酸酶的抗性。要穿过由磷脂组成的细胞膜，应该很小或具有疏水性。然而，siRNA由于磷酸骨架(phosphate backbone)带负电荷，因此很难穿透细胞膜。另外，需要通过增加对核酸酶的抗性使其在血清中的寿命更长，确保达到目标的量足以诱导有效的RNAi。因此通过引入化学修饰(chemical modification)，克服了siRNA的传递问题。
在本发明一实施例中，设计了一种靶向PD-1 mRNA的asiRNA，鉴定并筛选出敲除效果(knockdown efficiency)最好的asiRNA。此外，通过引入化学修饰，在不借助载体的情况下，将asiRNA修饰成具有细胞穿透能力和对核酸酶的抗性，从而筛选出能够有效抑制PD-1表达的cp-asiRNA。将以下四种修饰引入到选定的siRNA中，使asiRNA具有细胞穿透能力和对核酸酶的抗性。第一，将胆固醇添加到有义链(sense strand)的3'端，以使siRNA可穿透细胞膜。第二，通过用硫代磷酸酯(phosphorothioate)取代有义链(sense strand)和反义链(antisense strand)的5'端或3'端附近的磷酸骨架(phosphate backbone)，以使siRNA对核酸外切酶具有抗性，可被细胞吸收并在体内提高siRNA的生物利用度。第三，通过用2'-O-甲基修饰糖的2'-OH基团，赋予对核酸酶的抗性，降低siRNA免疫原性，并减少脱靶(off-target)效应。第四，通过用氟修饰糖的2'，为双链双链体(double strand duplex)提供稳定性，增加血清中的稳定性，可以在体外和体内有效地进行沉默(silencing)。通过对siRNA进行上述修饰，siRNA可具有细胞穿透能力，在血清中停留的时间更长，有足够数量的siRNA传递到靶细胞，从而可以更有效地抑制基因。
因此，根据本发明的一方面，涉及一种不对称siRNA，其特征在于，包括：含有与编码PD-1，即程序性细胞死亡蛋白1(Programmed cell Death protein1，PD-1)的mRNA互补的序列的反义链；和与所述反义链形成互补键的有义链，所述反义链的5'端和有义链的3'端形成平端(blunt end)。
本发明中的siRNA为包括具有一般RNAi(RNA干扰)作用的所有物质的概念。因此，不一定限于合成siRNA，也可以适用于在细胞内使用表达载体等表达的siRNA或shRNA。RNAi为Fire研究组于1998年首次在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现的一种细胞内基因调控方法，已知其作用机制为通过导入细胞内的RNA双链中的反义链与靶基因的mRNA互补结合来诱导靶基因降解。其中，合成RNA干扰(siRNA)为“体外”抑制基因表达的方法之一。19-21bp的siRNA理论上可以选择性地抑制几乎所有基因，是一种可以开发为治疗各种基因相关疾病的技术，如癌症、罕见疾病、纤维化和病毒感染。2002年中期，首次尝试在哺乳动物中使用siRNA进行体内治疗，此后人们进行了许多应用研究的尝试。尤其在2018年，作为首个针对hATTR(hereditary transthyretin-mediated)淀粉样变多发性神经病的基于siRNA的RNAi治疗剂，Alnylam Pharmaceuticals的Onpattro获得了美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)的批准，在此之前，其被指定为创新治疗剂或稀有药物。此外，许多全球制药公司正在投资数十亿美元以上来开发RNAi疗法项目，其中包括针对各种难治性疾病的siRNA。然而，现有的RNA治疗剂仍然存在需要克服的障碍：1)缺乏有效的传递系统；2)脱靶效应；3)诱导免疫反应；和4)细胞内RNAi机制饱和。尽管siRNA是直接调节靶基因表达的有效方法，但是由于上述问题，难以使用此类siRNA开发治疗剂。
为了解决这些问题，本发明提供一种不对称siRNA，其包括反义链和与所述反义链互补的有义链，根据本发明的siRNA不引起脱靶效应和RNAi机制饱和等问题，从而可以稳定保持高递送效率，并可有效抑制PD-1靶基因的表达到所需程度。
在本发明的siRNA中，所述有义链的长度可以为15nt至17nt，所述反义链的长度可以为16nt以上。但不限于此，所述反义链的长度可以为16nt至31nt，优选长度可以为19nt至25nt。更优选地，所述有义链的长度可以为16nt，与其互补的反义链的长度可以为19nt、21nt或25nt，但不限于此。所述有义链的3'端和反义链的5'端形成平端(blunt end)。反义链的3'端可以包括例如1nt至16nt的突出端(overhang)。
在本发明一实施例中，为了抑制PD-1表达，设计了36个asiRNA，并在表达PD-1的HeLa-PD-1细胞中证实了mRNA水平和蛋白质水平的抑制。
根据本发明，其特征在于，所述有义链可以选自序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、77、79、81、83、85、87、89和91。优选地，已证实包括选自序列号43、47、49、77和89的有义链和与所述有义链互补的反义链的siRNA具有最好的抑制PD-1表达的效果。
根据本发明，其特征在于，所述反义链可以选自序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、78、80、82、84、86、88、90和92。优选地，其特征在于，所述反义链可以选自序列号44、48、50、78和80。
更优选地，根据本发明的siRNA的有义链为序列号43、47、49、77或89，反义链为序列号44、48、50、78或90。
在本发明中，所述siRNA的有义链或反义链可以包括一个或多个化学修饰。
一般的siRNA由于其磷酸骨架结构而具有高负电荷和高分子量，因此不能通过细胞膜，并且其在血液中迅速降解并被去除，从而很难将足够的RNAi诱导量输送到实际靶位点。目前，对体外递送而言，已经开发了许多利用阳离子脂质(cationic lipids)和阳离子聚合物(cationic polymers)的高效递送方法，而对体内来说，难以像体外递送一样高的siRNA，并且siRNA传递效率因与生物体内存在的各种蛋白质相互作用而降低。
据此，本发明人对不对称siRNA结构进行化学修饰，并开发出一种具有自递送能力的asiRNA结构体(cp-asiRNA)，其无需单独的载体即可有效地进行细胞内递送。
在本发明中，所述有义链或反义链中的化学修饰可以包括以下一种或多种：核苷酸中糖结构的2'碳位的-OH基团被-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、-NH2、-F(氟)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲硫基乙基(methylthioethyl)、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基取代；核苷酸中糖(sugar)结构的氧被硫取代；核苷酸的磷酸酯键被硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)或甲基膦酸酯(methyl phosphonate)修饰；核苷酸被肽核酸(peptidenucleic acid，PNA)、锁核酸(locked nucleic acid，LNA)或未锁核酸(unlocked nucleicacid，UNA)取代；以及磷酸基团(phosphate group)、亲脂性化合物(lipophilic compound)或细胞穿透肽的结合。
在本发明中，所述亲脂性化合物(lipophilic compound)可以选自胆固醇、生育酚、二十二碳六烯酸(DHA)、棕榈酸和具有10个以上的碳原子的长链脂肪酸。优选地，其可以为胆固醇，但不限于此。
具体地，可以包括选自以下的一种或多种修改：有义链或反义链的至少一个以上的核苷酸中糖结构的2'碳位的-OH基团被-OCH3(甲氧基)或-F(氟)取代；有义链或反义链的至少一个以上的核苷酸键被硫代磷酸酯(phosphorothioate)键修饰；将亲脂性化合物与有义链的3'端结合；以及将磷酸基团(phosphate group)与反义链的5'端结合。
根据本发明的siRNA的有义链为选自下表的(a)至(c)中的任意一种，反义链为选自(d)至(o)中的任意一种。
在上表中，*表示硫代磷酸酯键(phosphorothioated bond)，m表示2'-O-甲基(Methyl)，/chol/表示胆固醇。具体地，“*”表示现有的磷酸二酯键(phosphodiester bond)被硫代磷酸酯键取代的形式，“m”表示现有的2'-OH被2'-O-甲基取代的形式。另外，“2'-F-”是指，例如，对2'-FG而言，现有G(鸟嘌呤)的2'-OH被氟取代的形式，“Chol”表示胆固醇添加到3'-末端的形式。1至3个磷酸基团可以进一步结合到所述反义链的5'端。
优选地，所述有义链可以为上表的(b)，反义链可以为上表的(i)或(m)。
更具体地，所述有义链可以为选自下表的(a)至(c)中的任意一种，所述反义链可以为选自下表的(d)至(h)中的任意一种。
在上表中，*表示硫代磷酸酯键(phosphorothioated bond)，m表示2'-O-甲基(Methyl)、2'-F-为2'-氟(Fluoro)，/chol/表示胆固醇，5'P表示5'-磷酸基团(Phosphategroup)。
最优选地，所述有义链可以为上表的(c)，所述反义链可以为上表的(g)或(h)。
优选地，所述有义链可以为选自下表的(A)至(D)中的任意一种，反义链可以为选自下表的(E)至(H)中的任意一种，更优选地，所述siRNA可以为有义链(A)和反义链(E)；有义链(B)和反义链(F)；有义链(C)和反义链(G)；或有义链(D)和反义链(H)。
在上表中，*可以表示硫代磷酸酯键(phosphorothioated bond)，m可以表示2'-甲基，2'-F-可以表示2'-F(氟)，/chol/可以表示胆固醇，5'P可以表示5'-磷酸基团。
本发明的另一方面涉及一种包括所述siRNA的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
在本发明中，所述癌症可以包括但不限于多发性骨髓瘤、非上皮性肿瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、泌尿道癌、消化道癌、生殖系统肿瘤、难治性经典霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、转移性黑色素瘤、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮细胞癌、难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤，作为已知表达以PD-L1为代表的PD-1配体的用于预防或治疗癌症的组合物，其可以不受限制地使用。
除了活性成分siRNA之外，还可以通过包括一种以上的药学上可接受的载体来制备所述药物组合物。药学上可接受的载体应该与本发明的活性成分相容，可以通过与盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇和其成分中的一种或两种以上的成分混合使用，可以根据需要加入其他常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。另外，可以另外加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂和润滑剂以形成可注射剂型，例如水溶液、悬浮液、乳液等。尤其，优选以冻干(lyophilized)形式的剂型配置来提供。冻干剂型的制备可以采用本发明所属领域公知的方法，并可以加入冻干稳定剂。
本领域技术人员可以根据患者的症状和疾病的严重程度来确定给予所述药物组合物的方法。另外，可以配制成各种形式，例如粉剂、片剂、胶囊剂、液体剂、注射剂、软膏剂、糖浆剂等，并且可以使用单位剂量或多剂量容器提供，例如密封的安瓿和瓶子等。
本发明的药物组合物可以口服或非口服给药。根据本发明的组合物的给药途径不限于此，但例如可以为口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、肠内、舌下或局部给药。根据本发明的组合物的剂量根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、方法、排泄率或疾病的严重程度而变化，本领域普通技术人员可以很容易地确定。另外，为了进行临床给药，可以使用已知技术将本发明的组合物配制成合适的剂型。
本发明的另一方面涉及一种预防或治疗癌症的方法，其包括向个体施用所述siRNA。根据本发明的改进或治疗方法中包括的配置与上述本发明中包括的配置相同，从而以上描述同样适用于改进或治疗方法。
本发明的另一方面涉及一种通过用所述siRNA处理免疫细胞而获得的PD-1表达受到抑制的免疫细胞。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与表达PD-1的免疫反应的细胞。优选地，其可以为用于肿瘤免疫治疗的免疫细胞，但不限于此。
在本发明中，所述免疫细胞可以选自自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)、嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(chimeric antigen receptor-modified NKcell，CAR-NK细胞)、通用自然杀伤细胞(Universal-NK细胞)、细胞毒性淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)、肿瘤浸润性T淋巴细胞(Tumor infiltratinglymphocyte，TIL)、外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)、T细胞受体修饰的T细胞(T cell receptor-modified T cells，TCR-T)和嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CAR-T)。优选地，其可以为人CD8+T细胞，但不限于此。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T细胞)”或“嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK细胞)”是指表达“嵌合抗原受体”的T细胞或NK细胞。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Recepter，CAR)”是指向免疫效应细胞(effector cell)中的细胞提供靶细胞和细胞内信号产生的重组多肽构建物。嵌合抗原受体为一种与T细胞或NK细胞的受体-激活细胞内结构域结合以产生嵌合蛋白的分子，所述嵌合蛋白对靶抗原(例如，肿瘤抗原)表现出基于抗体的特异性、特异性抗肿瘤细胞免疫活性。
如本文所用，术语“嵌合”是指由一些不同蛋白质或不同来源的DNA组成的。嵌合抗原受体至少包括胞外结合域(extracellular binding domain)、跨膜域(transmembranedomain)和胞内信号域(intracellular signaling domain)。
这种基于免疫细胞的肿瘤免疫疗法已成功应用于临床，并显示出前所未有的临床疗效。尽管基于免疫细胞的肿瘤免疫疗法效果显着，但在实际肿瘤治疗过程中也提出了各种困难，其中最重要的原因之一就是PD-1/PD-L1抑制性免疫检查点，其通过与抑制性信号传导结合来抑制免疫细胞的免疫活性，从而大大降低了所述基于免疫细胞的肿瘤免疫疗法的效果。
因此，本发明人开发了通过用所述siRNA治疗而获得的PD-1表达受到抑制的免疫细胞，并且防止了基于免疫细胞的肿瘤免疫疗法的效果因癌细胞表达的PD-配体的抑制性免疫检查点而降低。
在本发明一实施例中，当使用cp-asiRNA对表达PD-1的效应T细胞进行处理时，可以证实即使在存在PD-L1表达细胞的环境中，也表现出优异的活性恢复效果。据此，即使对于所述任何一种免疫细胞，例如NK细胞、嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞、嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)和T细胞受体修饰的T细胞(TCR-T)等使用siRNA抑制PD-1表达，也可以预期免疫细胞活性的恢复。
本发明另一方面涉及一种包括所述PD-1表达受到抑制的免疫细胞的癌症的免疫细胞治疗剂。
如本文所用，术语“免疫细胞治疗剂”是指一种用于通过使用诸如树突细胞(dendritic cell)、自然杀伤细胞(natural killer cell)和T细胞等的免疫细胞激活体内免疫反应来治疗疾病的药物。正在开发的免疫细胞治疗剂主要靶向癌症治疗作为适应证，其通过将免疫细胞直接施用于患者来激活免疫功能以获得治疗效果，并且具有区别于现有用于癌症治疗的手术疗法、抗癌剂和放射疗法的治疗机制和功效，从而在生物药物中占据主要地位。
根据使用的免疫细胞和制备过程中引入细胞内的基因的特性，免疫细胞治疗剂可以包括但不限于树突免疫调节细胞治疗剂、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)、嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(chimeric antigen receptor-modified NKcell)、通用自然杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer，LAK)、肿瘤浸润性T淋巴细胞(tumor-infiltrating T lymphocytle，TIL)、T细胞受体修饰的T细胞(T cell receptor-modified T cells，TCR-T)和嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CAR-T)。
在本发明中，所述癌症可以包括但不限于乳腺癌、多发性骨髓瘤、非上皮性肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、泌尿道癌、消化道癌、生殖系统肿瘤、难治性经典霍奇金淋巴瘤(refractory classic hodgkin's lymphoma)、前列腺癌、转移性黑色素瘤、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮细胞癌、难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤，作为已知表达以PD-L1为代表的PD-1配体的癌症的免疫细胞治疗剂，其可以不受限制地使用。
下面将通过实施例更详细地描述本发明。对于本领域的普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于举例说明本发明，本发明的范围不应被解释为受这些实施例的限制。
实施例1：靶向PD-1的36种RNAi诱导双链核酸分子的筛选
1.1.HeLa-PD-1细胞系中PD-1表达的确认
在设计asiRNA并验证其对PD-1 mRNA表达的抑制效果之前，使用聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)确认了HeLa-PD-1细胞系中PD-1的表达。HeLa-PD-1的特征可以在于，在将编码PD-1 mRNA的质粒转染到HeLa(ATCC)后，通过使用用选择标记(selection marker)潮霉素B(hygromycin B，Gold Biotechnology Inc)筛选的细胞系来稳定过表达PD-1。这克服转录仅由刺激而不是由始终表达PD-1的蛋白质诱导的限制，并可以顺利地进行筛选。
1.2.靶向PD-1基因的筛选及36种asiRNA的设计与制备
为了获得靶向PD-1的可诱导高效RNAi干扰的双链核酸分子，在对PD-1基因进行靶序列选择后设计了asiRNA。与众所周知的siRNA相比，asiRNA结构具有相互不同的二级结构(secondary structure)、GC含量(％)、5'端稳定性差异(5'end stability difference)等，从而当使用常规siRNA设计程序来设计asiRNA的碱基序列时，设计优化的asiRNA可能会有些困难。因此本发明的候选asiRNA的设计如下进行。
通过NCBI数据库检索而获得PD-1基因信息(mRNA登录号：NM_005018.2)。考虑到动物实验，首先基于与小鼠具有共同靶点的碱基序列选择显示100％同源性的碱基序列，然后在除种子区(基于5'的2-8碱基序列)外的反义链中，还额外选择允许错配(mismatch)的碱基序列以设计总共36个asiRNA，然后在OliX Pharmaceuticals,Inc.(韩国)以10nmole规模合成。所设计的36种asiRNA的碱基序列见表1。将所述asiRNA在5x siRNA双链体(Bioneer)中稀释到合适的浓度，通过在95℃下5分钟和在37℃下培养1小时的过程进行退火，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后，通过ChemiDoc紫外线透视仪(Biorad)进行QC。所筛选的36种asiRNA的碱基序列见下表1。
【表1】
1.3、36种asiRNA对PD-1 mRNA表达的抑制效果确认
为了在mRNA水平确认基因抑制效率，使用所选的36种asiRNA以10nM和1nM的浓度转染HeLa-PD-1细胞系后，进行qRT-PCR以测量PD-1mRNA的表达水平。
具体地，将HeLa-PD-1细胞在向100mm细胞培养皿添加10％胎牛血清(Gibco)和0.2g/L潮霉素B(hygromycin B)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modifiedEagle's Medium，Gibco)中培养。将转染前24小时培养的HeLa-PD-1细胞接种到12孔板中。然后，根据制造商提供的方案，使用RNAimax(Invitrogen)转染1nM或10nM的36种asiRNA(表1)。24小时后，用Tri-RNA试剂(FAVORGEN)提取总RNA，然后将500ng的RNA用于cDNA的合成。根据制造商的方案，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)来合成cDNA。然后，使用StepOne实时PCR系统(Applied Biosystems)对合成的cDNA进行qRT-PCR。使用表2的引物和SYBR绿色PCR主混合物(Applied Biosystems)，将针对未处理样品(NT)的asiRNA转染样品的PD-1表达量转换为百分比(图2(10nM)、图3(1nM))。微管蛋白用作管家基因(表2)。
【表2】
所述实验独立进行了3次，asiRNA对靶向PD-1 mRNA的36种序列的基因抑制效率如图2(10nM)和图3(1nM)所示。该值代表独立实验的平均值±标准差值。对总共36种碱基序列进行筛选的结果，如图2所示，确认了25种在10nM浓度下抑制50％以上的PD-1 mRNA的表达。当将浓度降低至1nM时，如图3所示，确认了总共36种碱基序列中的14种序列以50％或更高的效率抑制PD-1 mRNA表达。尤其，根据针对基因抑制效率为80％以上的asiRNA进行的IC50测量结果，确认了asiPD-1-93和asiPD-1-95的IC50最低。其中，作为化学修饰和自递送(self-delivery)实验的候选组，还选择了asiPD-1-89。
1.4.通过量化3种asiRNA的PD-1蛋白水平来确认蛋白表达抑制效果
通过对36种asiRNA的筛选结果，在基因抑制效率为80％以上的aiRNA中选择两种最有效的类型(asiPD-1-93、asiPD-1-95)，另外还选择asiPD-1-89，以1nM浓度进行转染后，通过人类程序性死亡1(PD-1)酶联免疫吸附试验试剂盒(Mybiosoure)确认了PD-1蛋白水平。
具体地，将HeLa-PD-1细胞在向100mm细胞培养皿添加10％胎牛血清(Gibco)和0.2g/L潮霉素B(hygromycin B)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modifiedEagle's Medium，Gibco)中培养。将转染前24小时培养的HeLa-PD-1细胞接种到12孔板中。然后，根据制造商提供的方案，使用RNAimax(Invitrogen)转染了1nM的3种asiRNA(asiPD-1-89、asiPD-1-93、asiPD-1-95)。转染24小时后将培养基更换为新培养基，48小时后再次用12孔板传代(passage)。96小时后，使用5X RIPA(自制)缓冲液进行收获(harvest)以制备细胞裂解液。通过BCA测定(Pierce)定量后，根据制造商的方案，使用人类程序性死亡1(PD-1)酶联免疫吸附试验试剂盒(Mybiosoure)确认了PD-1蛋白水平。
实验独立进行四次，对3种选定候选组的PD-1蛋白水平(对照组的％)如图4所示。与对照组(NT)相比，基因抑制效率最高的asiPD-1-93和asiPD-1-95显示出20％以下的PD-1蛋白水平，asiPD-1-89也显示出约40％的PD-1蛋白水平，从而可确认各候选组均具有较高的PD-1表达抑制效率。
实施例2：具有靶向PD-1的细胞穿透能力(cell-penetrating ability)的RNAi诱导不对称双链核酸分子(cp-asiRNA)的筛选
2.1.12种具有细胞穿透能力(cell-penetrating ability)的cp-asiRNA的设计与
制备
对于靶向PD-1的三种候选asiRNA(asiPD-1-89、asiPD-1-93和asiPD-1-95)，选择促进细胞渗透和有助于RNA结构的稳定性的化学修饰，并分两步应用修饰。在第一化学修饰中，将胆固醇与存在于16nt有义链3'端的核苷酸缀合，从此在5'方向存在的3个磷酸骨架用硫代磷酸酯(phosphorothioate)取代，有义链的16个核苷酸中8个核苷酸的核糖2'位置的羟基用-O-甲基取代。另外，反义链的长度为19nt或25nt，2nt至11nt的核苷酸的核糖2'位置的羟基用-O-甲基取代，在3'端方向存在的4个核苷酸的磷酸骨架用硫代磷酸酯(phosphrothioate)取代，从而设计了12种cp-asiRNA。如此设计的12种cp-asiRNA的碱基序列见表3。cp-asiPD-1-1至cp-asiPD-1-5是基于表1中asiPD-1-95设计的，cp-asiPD-1-6至cp-asiPD-1-10是基于表1中asiPD-1-93设计的，cp-asiPD-1-11至cp-asiPD-1-12是基于表1中asiPD-1-89设计的。将如此设计的12种cp-asiRNA在OptiMEM(Gipco)中稀释到合适的浓度，通过在95℃下5分钟和在37℃下培养1小时的过程进行退火，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后，通过ChemiDoc紫外线透视仪(Biorad)进行QC。
【表3】
2.2.针对12种cp-asiRNA的毒性验证和在蛋白质水平上细胞渗透性和PD-1表达抑
制功效的验证
为了确认在蛋白质水平上的基因抑制效率，以1μM浓度处理cp-asiRNA24小时后，确认了由cp-asiRNA引起的毒性，并在处理96小时后测量了PD-1蛋白的表达水平。
具体地，首先将HeLa-PD-1细胞在向100mm培养皿(petri dish)添加10％胎牛血清(Gibco)和0.2g/L潮霉素B(hygromycin B，Gold Biotechnology Inc)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's Medium，Gibco)中培养。将处理前24小时培养的HeLa-PD-1细胞接种到12孔板中。接种后，在不存在单独载体的情况下，以1μM的浓度处理12种cp-asiRNA。
为了确认毒性，处理24小时后确认了由cp-asiRNA引起的毒性，24小时后将培养基更换为新培养基，加入溶解在杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's Phosphate-BufferedSaline，DPBS(Gibco))中的MTT(Sigma-Aldrich)，使其终浓度为5mg/ml。在37℃培养2小时后，除去所有溶液，加入DMSO(Sigma-Aldrich)后，再次在37℃培养10分钟后，测量了570nm处的吸光度。结果证实，制备的cp-asiRNA不诱导细胞毒性。
为了测量PD-1蛋白表达，在处理96小时后收获所述细胞以获得细胞裂解液。使用Thermo Scientific Pierece BCA蛋白质检测试剂盒(Thermo Scientific)定量后，通过蛋白印迹确认了PD-1蛋白质水平。将抗PD1抗体(Abcam)用作一抗，将山羊抗兔igG H&L(HRP)(Abcam)用作二抗。
所述蛋白质水平独立检查了3次，图5为其代表性的结果。实验结果如图5所示，可以在12种cp-asiRNA中的7种中确认了蛋白质水平上的基因表达抑制效果。与asiRNA不同的是，对经过化学修饰的cp-asiRNA而言，可以确认即使没有载体，只有处理也能显示出优异的效果。
实施例3：具有靶向PD-1的细胞穿透能力(cell-penetrating ability)的RNAi诱导不对称双链核酸分子(cp-asiRNA)的筛选
3.1.11种对cp-asiPD-1-6至cp-asiPD-1-10进行进一步化学修饰的cp-asiRNA的
设计和制备
对于图5中确认效果的12种cp-asiRNA中PD-1蛋白表达水平最低的7种，进一步将化学修饰引入到cp-asiPD-1-6至cp-asiPD-1-10，其中所述cp-asiPD-1-6至cp-asiPD-1-10为在asiPD-1-93上进一步进行化学修饰的。此时，进一步进行的修饰包括：将磷酸与位于反义链5'端的核苷酸结合；或在两条链中，将10个至12个核苷酸的核糖的2'位置的羟基用-O-氟基团取代或用-O-甲基基团(甲氧基)取代。总共设计和制备了11个cp-asiRNA，其碱基序列见表4。
【表4】
3.2.针对额外制备的11种cp-asiRNA的毒性验证和在蛋白质水平上细胞渗透性和
PD-1表达抑制功效的验证
以与所述实施例2.2相同的方式，进行了针对额外制备的11种cp-asiRNA的毒性验证和在蛋白质水平上细胞渗透性和PD-1表达抑制功效的验证。所述实验独立进行3次，图6为其代表性的结果。如图6所示，从图6可以看出，cp-asiPD-1-22和cp-asiPD-1-23在蛋白质水平上具有最优异的基因表达抑制效率。
实施例4：针对两种cp-asiRNA(cp-asiPD-1-22、cp-asiPD-1-23)的持续时间测试
如实施例3所示，为了确认由化学修饰引起的维持效果的能力增加，对显示出最优异的PD-1表达抑制效果的cp-asiPD-1-22和cp-asiPD-1-23进行了持续时间测试。asiPD-1-93用作对照，cp-asiPIN1用作阴性对照，其作为靶向除PD-1之外的基因的cp-asiRNA。
具体地，将HeLa-PD-1细胞在向100mm细胞培养皿添加10％胎牛血清(Gibco)和0.2g/L潮霉素B(hygromycin B)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modifiedEagle's Medium，Gibco)中培养。将转染前24小时培养的HeLa-PD-1细胞接种到12孔板中。接种24小时后，根据制造商提供的方案，使用RNAimax(Invitrogen)转染asiRNA(asiPD-1-93)，将cp-asiPD-1-22和cp-asiPD-1-23在没有单独载体的情况下进行处理。此后，以与实施例2.2相同的方式，通过蛋白印迹确认了PD-1蛋白水平(图7)。所述实验独立进行3次，图7为其代表性的照片。
如图7所示，已经确认，效率最优异的22号的基因表达抑制效果在处理后第2天和第3天之间在蛋白质水平上开始得到确认并维持到第4天，然后靶基因PD-1的表达开始恢复。因此确认了与asiPD-1和23号cp-asiPD-1相比，22号cp-asiPD-1的效果维持时间更长。
实施例5：针对两种cp-asiRNA(cp-asiPD-1-22、cp-asiPD-1-23)的T细胞激活能力的功能测定
确认了使用图7中2种cp-asiRNA(cp-asiPD-1-22、cp-asiPD-1-23)的基因表达抑制效率基因表达抑制是否引起T细胞活性增加。使用了2种cp-asiRNA(cp-asiPD-1-22、cp-asiPD-1-23)和asiPD-1-93，为了确认效果，还使用了目前市售的PD-1阻断抗体Nivolumab，cp-asiPIN1用作阴性对照，其作为靶向除PD-1之外的基因的cp-asiRNA。该实验采用以下原理：当T细胞通过TCR识别与抗原呈递细胞表面的MHC分子结合的抗原时，促进NFAT表达作为结果之一。当PD-1表达时，会干扰由TCR刺激的信号传导系统，从而导致NFAT表达的抑制。因此，当NFAT表达时，使用了经过基因改造以在表达NFAT时表达荧光素酶(luciferase)的效应细胞(T细胞)，并且使用了PD-1/PD-L1阻断生物测定(Promega)，其可以定量确认PD-1的活性抑制或表达降低的效果。
5.1.针对两种cp-asiRNA(cp-asiPD-1-22、cp-asiPD-1-23)的T细胞激活能力的功
能测定(96小时)
具体地，表达PD-1的效应细胞以与实施例1.3相同的方法用3μM、1μM和0.5μM浓度的asiPD-1-93处理，相同浓度的cp-asiPD-1-22和cp-asiPD-1-23也以与实施例2.2相同的方法处理。处理96小时后，与PD-L1细胞共培养6小时，然后测量发光，将每个样品与未处理样品(NT)相比的发光测量值表示为相对值(average relative light unit，RLU)。这些测量通过使用PD-1/PD-L阻断生物测定(Promega)和制造商建议的方案进行。用作阳性对照的Nivolumab以1μg/mL的浓度使用。所述实验独立进行3次，图8显示了每个实验的平均值±标准偏差值。
如图8所示，在恢复T细胞活性方面，cp-asiPD-1-22证实了与目前市售的PD-1抗体Nivolumab相似或更好的效果。
5.2.针对两种cp-aiRNA(cp-asiPD-1-22、cp-asiPD-1-23)的T细胞激活能力的功
能测定(72小时)
如实施例4(图7)所确认，cp-asiPD-1-22在蛋白水平上的基因表达效率从3天(72小时)到4天(96小时)后持续存在，如实施例5.1(图8)所确认，cp-asiPD-1-22的T细胞激活能力最优异，浓度为1μM时T细胞活性增加最多，从而在72小时的条件下独立重复与实施例5.1相同方法的功能测定3次。图9为以相对值(average relative light unit，RLU)表示与所述实验的未处理样品(NT)相比的各样品的发光测定值的图。
如图9所示，22号cp-asiPD-1的效果比Nivolumab引起的T细胞活性恢复效果高约2倍，可以通过T检验的p-值来确认这种差异的统计显着性。
实施例6：靶向PD-1的8种RNAi诱导双链核酸分子的筛选
6.1.8种asiRNA的设计与制备
在本实施例中，以与实施例1.2相同的方法设计和制备靶向PD-1的RNAi诱导双链核酸分子。所述核酸分子由16nt的有义链和19nt的反义链组成，筛选出的8种asiRNA碱基序列和靶区见下表5。
【表5】
6.2、PD-1 mRNA表达抑制效果的确认
在本实施例中，为了在mRNA水平确认基因抑制效率，使用8种asiRNA与实施例1.3相同的方法以1nM的浓度转染HeLa-PD-1细胞系后，进行qRT-PCR以测量PD-1 mRNA的表达水平。具体地，将HeLa-PD-1细胞接种到12孔板24小时后，根据制造商提供的方案，使用RNAimax(Thermo)以1nM的浓度转染asiRNA。转染24小时后，使用Tri-RNA试剂(FAVORGEN)提取RNA，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)合成cDNA。此后，通过qRT-PCR在mRNA水平上评估了asiRNA的PD-1表达抑制功效。
结果，如图10所确认，所有RNAi诱导双链核酸分子都降低PD-1 mRNA的表达。
6.3.PD-1蛋白表达抑制效果的确认
在本实施例中，将实施例6.2结果中显示约70％以上的基因抑制效率的asiRNA(8-039、8-046、8-048、8-053、8-068和8-070)转染到HeLa-PD-1细胞系后，对于48小时后获得的细胞，以与实施例1.4相同的方法，在蛋白质水平上评估了asiRNA的PD-1表达抑制功效。
结果，如图11所确认，所有RNAi诱导双链核酸分子都降低PD-1蛋白的表达。
实施例7：具有靶向PD-1的细胞穿透能力的RNAi诱导不对称双链核酸分子(cp-asiRNA)的筛选
7.1.对8-039和8-068进一步进行化学修饰的12种cp-asiRNA的设计和制备
对于所述实施例8中确认效果的6种asiRNA中显示出优异的PD-1表达抑制功效的8-068和8-039，以与实施例3.1相同的方法引入化学改性。进一步设计和制造了总共12种cp-asiRNA，其碱基序列见表6。
【表6】
7.2.PD-1 mRNA表达抑制效果的确认
在本实施例中，为了在mRNA水平确认基因抑制效率，使用12种cp-asiRNA以1μM的浓度处理HeLa-PD-1细胞系后，进行qRT-PCR以测量PD-1 mRNA的表达水平。具体地，在12孔板中接种HeLa-PD-1细胞24小时后，将cp-asiRNA在没有单独载体的情况下进行处理。处理24小时后，使用Tri-RNA试剂(FAVORGEN)提取RNA，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems)合成cDNA。此后，通过qRT-PCR在mRNA水平上评估了cp-asiRNA的PD-1表达抑制功效。另外，从所述12种cp-asiRNA中选出4种，即8-068-3、8-068-13、8-039-8和8-039-13，将HeLa-PD-1细胞系用1μM或2μM浓度处理后，再次在mRNA水平上评价了PD-1表达抑制功效。
结果，如图12所确认，在所述具有细胞穿透能力的RNAi诱导双链核酸分子中，8-068-2、8-068-3、8-068-5、8-068-7、8-068-8、8-068-13、8-068-15、8-039-3和8-039-13降低PD-1 mRNA的表达。此外，如图13所示，其中的8-068-3、8-068-13、8-039-3和8-039-13的表达抑制功效显着。
7.3.PD-1 mRNA蛋白表达抑制效果的确认
在本实施例中，用实施例7.1结果中显示优异的基因抑制效率的4种cp-asiRNA处理HeLa-PD-1细胞系后，对于从此培养24小时后获得的细胞，以与实施例1.4相同的方法在蛋白质水平上评估了cp-asiRNA的PD-1表达抑制功效。
结果，如图14所确认，所有具有细胞穿透能力的RNAi诱导双链核酸分子(8-068-3、8-068-13、8-039-8和8-039-13)降低PD-1蛋白表达。
实施例8：针对cp-asiRNA的T细胞激活能力的功能测定
在本实施例中，在用实施例7中确认效果的cp-asiRNA中显示出优异的PD-1表达抑制功效的8-068-3、8-068-13、8-039-8和8-039-13处理T细胞的情况下，确认了PD-1基因表达抑制是否引起T细胞活性增加。具体地，冷冻的人类T细胞(购自Stem CellTechnologies)在18小时至20小时恢复T细胞。然后，在含有2％人血清的CTS OpTmizer(Thermo)中，用CD3/Cd28磁珠(Dynabeads)和200IU IL-2处理所述恢复的人类T细胞以激活T细胞72小时。用cp-asiRNA在12孔板中对20,000个活化的T细胞处理72小时后，使用Tri-RNA试剂(FAVORGEN)提取RNA，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)合成cDNA。此后，通过qRT-PCR在mRNA水平上评估了上述处理的T细胞的PD-1表达抑制功效。
然后，使用经过基因改造以表达荧光素酶的效应细胞(T细胞)，并且使用了Promega生物检测试剂盒(货号：J4011)，其可以定量确认PD-1的活性抑制或表达降低的效果。
结果，如图15所确认，所有具有细胞穿透能力的RNAi诱导双链核酸分子(8-068-3、8-068-13、8-039-8和8-039-13)降低T细胞中PD-1 mRNA的表达。另外，如图16所确认，与未处理组(NT)的T细胞活性恢复相比，经具有细胞穿透能力的RNAi诱导双链核酸分子处理的组的表达抑制功效优异约3倍。
以上对本发明内容的具体部分进行了详细的描述，对于本领域普通技术人员来说，这些具体描述仅为优选实施例而已，本发明的范围并不因此而受到限制。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物来限定。
序列表（SEQUENCE LISTING）
<110> 奥利克斯医药有限公司
<120> 抑制PD-1表达的不对称siRNA
<130> 2120823KR08
<150> KR 2019-0058805
<151> 2019-05-20
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 57
caguggcgag agaaga 16
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 58
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<213> Artificial Sequence
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<400> 59
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
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<220>
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<220>
<223> siRNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> siRNA
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> siRNA
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<212> RNA
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<223> siRNA
<400> 72
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Foward Primer (Housekeeping gene Tublin)
<400> 73
gaccaagcgt accatccagt 20
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<220>
<223> Reverse Primer (Housekeeping gene Tublin)
<400> 74
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Foward Primer (PD-1 mRNA qPCR primer)
<400> 75
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<212> DNA
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<220>
<223> Reverse Primer (PD-1 mRNA qPCR primer)
<400> 76
gcctggctcc tattgtccct c 21
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 77
cuaaacuggu accgca 16
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<400> 78
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<400> 79
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 80
uagcacgaag cucuccgau 19
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<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 81
cggagagcuu cgugcu 16
<210> 82
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 82
agcacgaagc ucuccgaug 19
<210> 83
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 83
ucugggcggu gcuaca 16
<210> 84
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 84
uguagcaccg cccagacga 19
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 85
cgcagaucaa agagag 16
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 86
cucucuuuga ucugcgccu 19
<210> 87
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 87
gcagaucaaa gagagc 16
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<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 88
gcucucuuug aucugcgcc 19
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<212> RNA
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ggaguaugcc accauu 16
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<212> RNA
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<220>
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aaugguggca uacuccguc 19
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<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 91
ccauugucuu uccuag 16
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<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 92
cuaggaaaga caauggugg 19
Claims (21)
1.一种siRNA，其特征在于，包括：含有与编码PD-1，即程序性细胞死亡蛋白1的mRNA互补的序列的反义链；和与所述反义链形成互补键的有义链，所述反义链的5'端和所述有义链的3'端形成平端。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述有义链的长度为15nt至17nt，所述反义链的长度为16nt以上。
3.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述反义链的长度为16nt至31nt。
4.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述反义链的长度为19nt至25nt。
5.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述有义链选自序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、77、79、81、83、85、87、89和91。
6.根据权利要求5所述的siRNA，其特征在于，所述有义链选自序列号43、47、49、77和89。
7.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述反义链选自序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、78、80、82、84、86、88、90和92。
8.根据权利要求7所述的siRNA，其特征在于，所述反义链选自序列号44、48、50、78和90。
9.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述有义链或所述反义链包括一种或多种选自以下(a)至(e)中的化学修饰：
(a)核苷酸中糖结构的2'碳位的-OH基团被-CH3、-OCH3、-NH2、-F(氟)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲硫基乙基、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基取代；
(b)核苷酸中糖结构的氧被硫取代；
(c)核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或甲基膦酸酯修饰；
(d)核苷酸被肽核酸PNA、锁核酸LNA或未锁核酸UNA取代；以及
(e)磷酸基团、亲脂性化合物或细胞穿透肽的结合。
10.根据权利要求9所述的siRNA，其特征在于，所述亲脂性化合物选自胆固醇、生育酚、二十二碳六烯酸DHA、棕榈酸和10个以上的碳原子的长链脂肪酸。
11.根据权利要求9所述的siRNA，其特征在于，包括一种或多种选自以下(a)至(d)中的化学修饰：
(a)有义链或反义链的至少一个以上的核苷酸中糖结构的2'碳位的-OH基团被-OCH3或-F取代的修饰；
(b)有义链或反义链的至少一个以上的核苷酸键被硫代磷酸酯键修饰；
(c)将胆固醇与有义链的3'端结合；以及
(d)将磷酸基团与反义链的5'端结合。
12.根据权利要求11所述的siRNA，其特征在于，所述有义链为选自下表的(a)至(c)中的任意一种，
反义链为选自下表的(d)至(o)中的任意一种：
13.根据权利要求12所述的siRNA，其特征在于，所述有义链为上表的(b)，反义链为选自上表的(i)至(m)中的任意一种，并且在所述反义链的5'端结合有磷酸基团。
14.根据权利要求11所述的siRNA，其特征在于，所述有义链为选自下表的(a)至(c)中的任意一种，
所述反义链为选自下表的(d)至(h)中的任意一种：
15.根据权利要求14所述的siRNA，其特征在于，所述有义链为上表的(c)，所述反义链为上表的(g)或(h)。
16.根据权利要求11所述的siRNA，其特征在于，所述有义链为选自下表的(A)至(D)中的任意一种，
所述反义链为选自下表的(E)至(H)中的任意一种：
17.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括权利要求1至16中任一项所述的siRNA。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症选自多发性骨髓瘤、非上皮性肿瘤、非小细胞肺癌NSCLC、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、泌尿道癌、消化道癌、生殖系统肿瘤、难治性经典霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、转移性黑色素瘤、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮细胞癌、难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。
19.一种PD-1的表达受到抑制的免疫细胞，其特征在于，其为通过用权利要求1至16中任一项的siRNA处理免疫细胞而获得的免疫细胞。
20.根据权利要求19所述的PD-1的表达受到抑制的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞选自自然杀伤细胞，即NK细胞、CAR-NK细胞，即嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞、通用自然杀伤细胞、肿瘤浸润性T淋巴细胞TIL、外周血单核细胞PBMC、T细胞受体修饰的T细胞TCR-T和嵌合抗原受体修饰的T细胞CAR-T。
21.一种用于治疗癌症的免疫细胞治疗剂，其包括权利要求19所述的PD-1的表达受到抑制的免疫细胞。
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