JP2022531315A - マルチプレックス化干渉ｒｎａを有する細胞 - Google Patents

Abstract

本出願は、免疫療法の分野、より具体的には養子細胞療法（ＡＣＴ）の分野に関する。ここでは、複数の標的をダウンレギュレートするように設計された複数のｓｈＲＮＡが提案されている。また、ポリヌクレオチド、ｓｈＲＮＡをコードするベクター、およびそのようなｓｈＲＮＡを単独で、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と組み合わせて発現する細胞も提案されている。これらの細胞は、特に免疫療法に用いるのに適している。

Description

本出願は、免疫療法の分野、より詳細には養子細胞療法（ＡＣＴ）の分野に関するものである。ここでは、複数の標的をダウンレギュレートするように設計された、複数のｓｈＲＮＡが提案されている。また、ポリヌクレオチド、ｓｈＲＮＡをコードするベクター、およびそのようなｓｈＲＮＡを単独またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と組み合わせて発現する細胞も提案されている。これらの細胞は、特に免疫療法に用いるのに適している。本発明は、治療を必要とする患者におけるＴ細胞療法の有効性を高める方法を提供する。さらに、これらの細胞を用いて癌などの疾患を治療するストラテジーも提供される。このようなＣＡＲを発現するＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの改変された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）免疫細胞は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病の治療に適しているが、ＣＡＲの特異性に応じて、他の腫瘍も治療することができる。

細胞治療においては、移植片対宿主病を誘発するＴＣＲ成分、宿主対移植片病を誘発するＨＬＡ成分、ストレスリガンド、免疫チェックポイントなど、治療の有益な効果を阻害する可能性のある標的をダウンレギュレートすることがしばしば有利である。しかし、実用上の制約（ベクターの大きさや同時に投与できる分子の数など）、および毒性の問題から、これらの標的を複数同時にダウンレギュレートすることは、しばしば問題となる。

通常、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などの遺伝子改変アプローチが提案されている。しかし、これらのアプローチは通常、永久的かつ非可逆的な変化および／または遺伝子の完全なノックアウトにつながり、標的の不在が生存率の問題または毒性につながる場合には問題となることがある。さらに、永続的な性質は、標的の一過性のダウンレギュレーションのみが望まれる場合には、柔軟性に欠ける。遺伝子改変技術は一般的に非常に煩雑であり、複数の標的を同時にノックダウンするのには理想的ではない。例えば、ＴＡＬＥＮの場合、ノックダウンを実現するためには、標的ごとに別々のヌクレアーゼタンパク質を改変する必要がある。その後、まだ、有効性を評価する必要がある。２つ以上の異なるＴＡＬＥＮを組み合わせることは、理論的には可能であるが、明らかに実用上の欠点がある。つまり、２つのＴＡＬＥＮの組み合わせが有効性に影響を与えるかどうかを確認する必要がある。また、これらは大きなタンパク質であるため、ベクターのサイズが通常制限されるＡＣＴなどで両方を発現させることは現実的ではない。２つを超える標的を検討する場合、これらの障害はすべて深刻になる。Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓは通常、より汎用性の高い解決策であるが、マルチプレックス化（つまり、複数の標的部位を同時に改変すること）は、特に真核生物においては、依然として困難である。その原因としては、ＤＮＡ修復効率の低さ（真核生物の二本鎖切断のＮＨＥＪ修復メカニズムはエラーを起こしやすい）、ＣＲＩＳＰＲで時々見られるオフターゲット効果および染色体再配列、ＣＲＩＳＰＲのマルチプレックス化の一般的な効率の低さ（複数の遺伝子を標的にするとトランスフェクション効率が劇的に低下する）などが挙げられ、効率と特異性の両方に問題がある。さらに、ＤＮＡに直接作用して標的遺伝子を永続的にサイレンシングさせる遺伝子編集アプローチでは、ゲノムの完全性を保証するための堅牢なテストが必要となる一方で、精巧で多段階の製造方法が必要となり、持続性および／または機能性が限られた分化の遅れた細胞または疲弊した細胞ができる可能性がある（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、２０１１年）。このことは、ＡＣＴの文脈では特に重要である。治療効果を得るためには、初期に分化し、疲弊していない細胞が明らかに優れている。

このように、当技術分野では、多段階の製造方法を必要とせず（したがって、製造が比較的容易で、コストが削減できる）、柔軟性（例えば、変更を可逆的にする、ノックダウンの減衰を可能にする（例えば、毒性を避けるため）、ある標的を別の標的に交換するなど）を備えた、標的のマルチプレックス化ノックダウンによる細胞治療を可能にするシステムを提供することが必要とされている。

（概要）
マルチプレックス化ゲノム改変の問題を解決するためには、遺伝子的なノックアウトではなく、ノックダウンの可能性を有するシステムが検討され、これにより、柔軟性が向上する（たとえば、時間的調節が可能になる）。理想的には、これらのシステムは煩雑さが少なく（標的ごとに別々のタンパク質を遺伝子改変する必要がない）、十分な効率と特異性を備えている必要がある。

その解決策の一つとして考えられるのが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。ＲＮＡｉによる遺伝子調整のメカニズムは、植物および動物にいくつか存在する。１つ目は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる低分子ノンコーディングＲＮＡの発現によるものである。ｍｉＲＮＡは、分解のために特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とすることができ、これにより遺伝子サイレンシングが促進される。

遺伝子活性の調節にはマイクロＲＮＡ経路が重要であることから、研究者たちは現在、人工的に設計された分子である低分子抑制ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）がどの程度ＲＮＡｉを媒介するかを研究している。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡなどの標的分子を切断することができ、ｍｉＲＮＡと同様に標的分子を認識するために塩基の相補性に依存する。

ｓｉＲＮＡとして知られている分子のクラスには、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）がある。ｓｈＲＮＡは、センス領域と、センス領域とハイブリダイズできるアンチセンス領域を含む一本鎖の分子である。ｓｈＲＮＡは、センス領域とアンチセンス領域がステムの一部または全部を形成するステムおよびループ構造を形成することができる。ｓｈＲＮＡを使用する利点の１つは、ｓｉＲＮＡが２つの別々の鎖を有する場合には不可能であるが、ｓｈＲＮＡは１つの分子として送達または転写され得ることである。しかし、他のｓｉＲＮＡと同様に、ｓｈＲＮＡも塩基の相補性に基づいてｍＲＮＡを標的とする。

多くの病態、疾患、障害は、複数のタンパク質間の相互作用によって引き起こされる。そのため、研究者たちは、複数のｓｉＲＮＡを細胞または生物に同時に送達する効果的な方法を模索している。

一つの方法として、ベクター技術を用いて、内因性ｍｉＲＮＡ経路でプロセシングされる細胞内でｓｈＲＮＡを発現させる方法がある。しかし、それぞれのｓｈＲＮＡに別々のベクターを使用するのは煩雑である。そのため、複数のｓｈＲＮＡを発現させることができるベクターの利用が検討されている。しかし残念ながら、単一のベクターから複数のｓｈＲＮＡを発現させる場合、いくつかの課題があることが報告されている。研究者が直面した問題の中には、（ａ）ベクターの組み換えのリスクおよびｓｈＲＮＡの発現欠失、（ｂ）マルチプレックスカセットの位置の影響によるｓｈＲＮＡの機能低下、（ｃ）ｓｈＲＮＡクローニングの複雑さ、（ｄ）ＲＮＡｉプロセシングの飽和、（ｅ）細胞毒性、および（ｆ）望ましくないオフターゲット効果、が存在する。

さらに、ｓｉＲＮＡは、ある種の形質転換した哺乳類細胞株において短期的な遺伝子阻害に有効であることが示されているが、初代培養細胞での使用や安定した転写産物のノックダウンでの使用には、より困難が伴う。ノックダウンの有効性は、＜１０％から＞９０％の範囲で大きく変動することが知られており（Ｔａｘｍａｎら、２００６年）、さらなる最適化が必要である。複数の阻害物質を発現させた場合、一般的に有効性は低下するため、このような場合には最適化がさらに重要となる。

したがって、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子を送達するための効率的なカセットおよびベクターを開発する必要性が残されている。一般的な細胞適用には当てはまるが、ＡＣＴの分野ではこの点があまり検討されておらず、これらの細胞における効率的なシステムが強く求められている。

驚くべきことに、本明細書では、ｓｈＲＮＡが細胞内、特に改変された免疫細胞内で上手くマルチプレックス化され得るだけでなく、標的が非常に効率的にダウンレギュレートされ、遺伝子ノックアウトに匹敵することさえあることが示されている（参照：実施例５～８およびＣＲＩＳＰＲとの比較）。

したがって、本発明の目的は、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をコードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）核酸分子を含む、改変された細胞を提供することである。

さらなる実施形態によれば、
・目的のタンパク質をコードする第１外因性核酸分子
・少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をコードする第２核酸分子
を含む、改変された細胞が提供される。

前記改変された細胞は、特に真核細胞であり、より特には改変された哺乳動物細胞であり、より特には改変されたヒト細胞である。特定の実施形態によれば、前記細胞は、改変された免疫細胞である。典型的な免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞、前駆細胞、およびｉＰＳＣ細胞から選択される。

特定の実施形態によれば、前記改変された細胞は、目的のタンパク質をコードする核酸をさらに含む。特に、この目的のタンパク質は、受容体、特にキメラ抗原受容体またはＴＣＲである。キメラ抗原受容体は、任意の標的を対象とすることができ、典型的な例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＰＣ３などが挙げられるが、さらに多くのものが存在し、適切でもある。

特定の実施形態によれば、第１および第２の核酸分子は、例えば、真核生物発現プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、またはウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびセンダイウイルスに由来する）である１つのベクター中に存在する。

少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、ダウンレギュレートされる標的分子の数やマルチプレックス化された分子を共発現させる際の制限に応じて、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、またはそれ以上の分子であり得る。「マルチプレックス」とは、同じ種類の複数の分子をコードするポリヌクレオチドのことで、例えば、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが挙げられる。マルチプレックス内では、同じ種類の分子（例えば、すべてｓｈＲＮＡ）の場合、それらは同一であってもよいし、異なる配列を含んでいてもよい。同じ種類の分子の間には、本明細書に記載されているリンカーのような配列が介在していてもよい。本発明のマルチプレックス化の一例は、複数のタンデムｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックスは、一本鎖であっても、二本鎖であっても、あるいは一本鎖である領域と二本鎖である領域の両方であってもよい。

特定の実施形態によれば、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、１つのプロモーターの制御下にある。通常、このプロモーターは、Ｕ６プロモーターではない。これは、このプロモーターが、特に高レベルの発現において、毒性と関連しているためである。同じ理由で、Ｈ１プロモーター（これはＵ６よりも弱いプロモーターである）、または一般的にＰｏｌ ＩＩＩプロモーター（特定の条件では適していることもあるが）を除外することが、検討され得る。特定の実施形態によれば、前記プロモーターは、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、およびＰｏｌ ＩＩＩプロモーターから選択される。特定の実施形態によれば、前記プロモーターは、天然または合成のＰｏｌ ＩＩプロモーターである。特定の実施形態によると、前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦｌα）プロモーター（コアまたは全長）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、上流にＣＭＶ ＩＶエンハンサーを有する複合ベータ－アクチンプロモーター（ＣＡＧプロモーター）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、インターロイキン－２－プロモーター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ｔＲＮＡプロモーターから選択されるＰｏｌ ＩＩプロモーターである。これらのプロモーターは、ｍＲＮＡの発現を促すポリメラーゼＩＩプロモーターとして最もよく使用されている。

特定の実施形態によると、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、ｓｈＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ分子であり得る。最も特に、それらはｍｉＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡ分子とｍｉＲＮＡ分子の違いは、ｍｉＲＮＡ分子はＤｒｏｓｈａによってプロセシングされるが、従来のｓｈＲＮＡ分子はプロセシングされないことである（これは毒性と関連している。Ｇｒｉｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ ４４１：５３７－５４１（２００６））。

特定の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡ分子は、１つのプロモーターの制御下にある１つのｍｉＲＮＡスキャフォールドとして提供され得る。

ｍｉＲＮＡマルチプレックス化に特に適したスキャフォールド配列は、ｍｉＲ－３０スキャフォールド配列、ｍｉＲ－１５５スキャフォールド配列、およびｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールド配列である。

通常、ｍｉＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ｍｉＲ－１９６スキャフォールド配列、好ましくはｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールド配列を含む。特定の実施形態によれば、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ分子のすべてが、ｍｉＲ－スキャフォールド配列、好ましくはｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールド配列を含む。同じことが、ｍｉＲ－３０およびｍｉＲ－１５５スキャフォールド配列についても言える。そのような適切なスキャフォールドの例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８８４１２６７号（特にその中の請求項1）に記載されている。単一のスキャフォールドは、ＳＭＡＲＴｖｅｃｔｏｒ^ＴＭ ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ ａｄａｐｔｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ラファイエット、コロラド州、米国）として市販されている。このスキャフォールドの複数のコピーは、縦列反復（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ）で配置され得る（図５参照）。

さらに適切なスキャフォールド配列としては、ｍｉＲ－２６ｂ（ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ）、ｍｉＲ－２０４（ｈｓａ－ｍｉｒ－２０４）、およびｍｉＲ－１２６（ｈｓａ－ｍｉｒ－１２６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１４０－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ、ｈｓａ－ｍｉｒ－７－１、ｈｓａ－ｍｉｒ－７－２、ｈｓａ－ｍｉｒ－７－３、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－３４０、ｈｓａ－ｍｉｒ－１０１、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９ｃ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１９１、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２２、ｈｓａ－ｍｉｒ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉｒ－２１、ｈｓａ－ｍｉｒ－３７８、ｈｓａ－ｍｉｒ－１００、ｈｓａ－ｍｉｒ－１９２、ｈｓａ－ｍｉｒ－３０ｄ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１６、ｈｓａ－ｍｉｒ－４３２、ｈｓａ－ｍｉｒ－７４４、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９ｂ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１３０ａ、またはｈｓａ－ｍｉｒ－１５ａが挙げられる。

代替的（排他的ではない）な実施形態によれば、反復される特定のｍｉＲスキャフォールドを使用して人工的に反復されるスキャフォールドを得るのではなく、真正のポリシストロニックｍｉＲＮＡクラスターまたはその一部が使用され得、ここでは内因性ｍｉＲＮＡが目的のｓｈＲＮＡで置き換えられている。この目的に特に適したｍｉＲスキャフォールドクラスターは、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３、ｍｉＲ－１７～９２、ｍｉＲ－１０６ｂ～２５、およびｍｉＲ－２３ａ～２７ａ～２４－２クラスターであり、最も特に想定されるのは、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターおよびその断片である。なお、ベクターの負荷量を削減するために、そのような天然のクラスターの一部を使用し、すべての配列を使用しないことも具体的に想定される（これは、すべてのｍｉＲＮＡが等間隔ではなく、すべてのリンカー配列が必要とされるわけではないので、特に有用である）。他にも、例えば、細胞内で最も効率的にプロセシングされるｍｉＲＮＡを取るなどの考慮が可能である。例えば、ｍｉＲ－１７～９２クラスターは、（順に）ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌおよびｍｉＲ－９２－１（ｍｉＲ－９２ａｌでもある）から構成されており、特に有用なその断片は、ｍｉＲ－１９ａからｍｉＲ－９２－１までのスキャフォールド配列（すなわち、６つのｍｉＲＮＡのうちの４つ）、またはｍｉＲ－１９ａからｍｉＲ－１９ｂ－ｌまでのスキャフォールド配列（６つのｍｉＲＮＡのうちの３つ）である。同様に、１０６ａ～３６３クラスターは、（順に）ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１８ｂ、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－９２－２（ｍｉＲ－９２ａ２でも可）、およびｍｉＲ－３６３から構成されている。特に有用なその断片は、ｍｉＲ－２０ｂからｍｉＲ－３６３（すなわち、６つのｍｉＲＮＡのうち４つ）までのスキャフォールド配列、またはｍｉＲ－１９ｂ－２からｍｉＲ－３６３（すなわち、６つのｍｉＲＮＡのうち３つ）までのスキャフォールド配列である。また、天然のリンカー配列だけでなく、その断片または人工的なリンカーも使用され得る（ベクターの負荷量を削減するため）。

例えば、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターおよびｍｉＲ－１９６ａ２配列の両方を新規のスキャフォールドに組み合わせて使用することが想定される。

特定の実施形態によれば、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうち少なくとも２つは、同じ標的を対象とする。さらなる特定の実施形態によれば、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子の少なくとも２つは同一である。

代替的な実施形態によれば、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のすべてが異なる。さらなる特定の実施形態によれば、前記少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のすべてが、異なる標的を対象としている。

前記改変された細胞に存在する任意の適切な分子は、即時のＲＮＡ干渉分子の標的となる可能性がある。想定される標的の代表例としては、ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、ＭＨＣコレセプター遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ）、ＴＣＲ鎖、ＣＤ３鎖、ＮＫＢＢｉＬ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＬＴＢ、ＬＳＴ１、ＮＣＲ３、ＡＩＦ１、ＬＹ６、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ）、補体カスケード、調節受容体（例えば、ＮＯＴＣＨ４）、ＴＡＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＲＩＮＧ１、ＣＤ５２、ＣＤ２４７、ＨＣＰ５、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、２Ｂ４、Ａ２ＡＲ、ＢＡＸ、ＢＬＩＭＰ１、Ｃ１６０（ＰＯＬＲ３Ａ）、ＣＢＬ－Ｂ、ＣＣＲ６、ＣＤ７、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＤＧＫ［ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＫＧＧ、ＤＧＫＨ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ］、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＧＲ２、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＳＮ、ＧＭＣＳＦ、ＨＰＫ１、ＩＬ－１０Ｒ［ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ］、ＩＬ２、ＬＦＡ１、ＮＥＡＴ１、ＮＦｋＢ（ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＮＦｋＢ２、ＮＦｋＢｌ、ＲＥＬを含む）、ＮＫＧ２Ａ、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３を含む）、ＰＤ１、ＰＩ３ＫＣＤ、ＰＰＰ２ＲＤ２、ＳＨＩＰ１、ＳＯＡＴ１、ＳＯＣＳ１、Ｔ－ＢＥＴ、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＯＸ、およびＺＦＰ３６Ｌ２が挙げられる。

特に、ｍｉＲＮＡをベースにした適切なコンストラクトが、確認されている。したがって、本発明は、マルチプレックス化マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域を有するポリヌクレオチドを含む改変された細胞が提供され、前記マルチプレックス化マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域は、以下をコードする配列を含む。
２つ以上の人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列であって、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列が、以下を含む、
・ｍｉＲＮＡスキャフォールド配列、
・活性配列または成熟配列、および
・パッセンジャー配列またはスター（ｓｔａｒ）配列であって、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列内で、前記活性配列が前記パッセンジャー配列に少なくとも８０％相補的である、配列。

人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列のそれぞれの前記活性配列および前記パッセンジャー配列の両方は通常、１８～４０ヌクレオチド長、より特に１８～３０ヌクレオチド長、最も特に１９～２５ヌクレオチド長を有する。

通常、これらのマイクロＲＮＡスキャフォールド配列はリンカーによって分離されており、リンカー配列は例えば３０～６０ヌクレオチド長を有し得るが、これより短い長さ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）でも機能する。実際、驚くべきことに、リンカーの長さは重要な役割を果たさず、非常に短くても（１０ヌクレオチド未満）、あるいは存在しなくても、ｓｈＲＮＡの機能を妨げることはないことがわかった。これを図６および図１６に示す。

人工配列は、例えば、内因性ｍｉＲ配列が、特定の標的に対して改変されたｓｈＲＮＡ配列で置換された、天然由来のスキャフォールド（ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターなどのｍｉＲクラスターまたはその断片）であり得、あるいは内因性ｍｉＲ配列が、特定の標的に対して改変されたｓｈＲＮＡ配列で置換された単一のｍｉＲスキャフォールド（ｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールドなど）の反復であり得、あるいは人工ｍｉＲ様配列であるかまたはそれらの組み合わせであり得る。

この改変された細胞は通常、キメラ抗原受容体またはＴＣＲなどの目的のタンパク質をコードする核酸分子をさらに含み、上記のような改変された免疫細胞であり得る。

マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子を共発現させることにより、改変された細胞内で少なくとも１つの遺伝子、典型的には複数の遺伝子が抑制される。これにより、より高い治療効果が期待できる。

本明細書に記載の改変された細胞は、医薬品としての使用のためにも提供される。特定の実施形態によれば、前記改変された細胞は、癌の治療に使用するために提供される。

これは、本明細書に記載されているような適切な量の改変された細胞を、治療を必要としている対象に投与し、それによって少なくとも１つの症状を改善することを含む、癌を治療する方法が提供されているということに等しい。

前記改変された細胞は、自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）免疫細胞（患者から得られた細胞）または同種他家（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）免疫細胞（別の対象から得られた細胞）であってもよい。

ｍｉＲＮＡスキャフォールドの長さの最適化。パネルＡ）ＣＤ１９発現で測定した、形質導入されたＴ細胞の割合。異なる長さのｍｉＲＮＡスキャフォールドに組み込んだＣＤ２４７標的ｓｈＲＮＡを導入した細胞の、パネルＢ）ＴＣＲおよびパネルＣ）ＣＤ３Ｅ ＭＦＩを示す。 異なるＣＤ５２標的ｓｈＲＮＡのスクリーニング。パネルＡ）形質導入された（ＣＤ１９＋）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。ＦＳＣ／ＳＳＣ、生存、ＣＤ３＋細胞でゲートされている。パネルＢ）ＣＤ５２ ＭＦＩを、形質導入された（ＣＤ１９＋でゲートされた）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞について示す。パネルＣ）形質導入されたＴ（ＣＤ１９＋ＣＤ３＋）細胞のＣＤ５２発現を示す代表的なヒストグラムを示す。 異なるドナーにおけるＣＤ５２ノックダウンを示し、３体の異なるドナーに由来するＴ細胞のＣＤ５２ ＭＦＩを示す。ＭｏｃｋまたはＣＤ５２ ｓｈＲＮＡ－３発現ベクターで細胞を形質導入した。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのＣＤ５２ノックアウトＴ細胞を生成するためのｇＲＮＡのスクリーニングを示す。左側のパネルには、収集時（８日目）のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のＣＤ５２ＭＦＩが示されている。Ｍｏｃｋ（ｔＣＤ１９）およびｓｈＲＮＡ条件では、ゲーティングはＣＤ１９^＋細胞で実行されたが、他の条件では、ゲーティングはＣＤ３^＋Ｔ細胞で実行された。右のパネルでは、代表的なヒストグラムが、Ｃａｓ９のみの対照と比較した３つの異なるｇＲＮＡのＣＤ５２発現を示している。 ＣＡＲおよび複数のｓｈＲＮＡ（例：２、４、６、８，．．．）を同じベクターから共発現させることができる、ｍｉＲＮＡスキャフォールドをインテグレートしない(上)またはインテグレートした(下)ＣＡＲ発現ベクター(例：ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＰＣ３)のデザインを示す。ＬＴＲ：長い末端反復；プロモーター（例：ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＳＦＦＶ、ＣＡＧ，．．．）；マーカータンパク質（例：切断型のＣＤ３４、ＣＤ１９);マルチプレックス化ｓｈＲＮＡ。 ２つのｍｉＲＮＡ ｓｈＲＮＡを、初代Ｔ細胞でのＢＣＭＡ－ＣＡＲベクターにおいて、同じ発現コンストラクトから発現させた。２つのｓｈＲＮＡ間の異なるスペーサー（マルチプレックス１～５）を用いて、ＣＤ２４７およびＣＤ５２タンパク質のノックダウンに対する効果を評価した。パネルＡ）レポータータンパク質ｔＣＤ３４の発現により測定した形質導入効率、パネルＢ）ＢＣＭＡ－Ｆｃ融合蛋白質で染色した後、抗Ｆｃ ＰＥ結合抗体で染色した際の細胞表面上のＢＣＭＡ ＣＡＲの発現。パネルＣ）ＣＤ２４７を標的としたｓｈＲＮＡによるＴＣＲのＣＤ３ζサブユニットのノックダウンに伴うＴＣＲ発現のダウンレギュレーションの効率を示す読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）としてのＴＣＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、パネルＤ）ＣＤ５２ ＭＦＩを読み出しとして使用してＣＤ５２をダウンレギュレーションする個別のコンストラクトの効率。 パネルＡ）ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）およびパネルＢ）ＣＤ５２のＲＮＡレベルを、示された単一またはマルチプレックス化ｓｈＲＮＡコンストラクトおよびそれぞれの対照で形質導入されたＴ細胞において、ハウスキーピング遺伝子として使用されるＣＹＰＡ ＲＮＡと比較してリアルタイムＰＣＲ分析によって評価した。 スペーサー２またはスペーサー５とマルチプレックス化されたＣＤ２４７、ＣＤ５２、またはＣＤ５２とＣＤ２４７ｓｈＲＮＡの両方を共発現する、ＢＣＭＡＣＡＲで形質導入されたＴＣＲおよびＣＤ５２染色Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリーデータ。対照として、ＲＮＰ Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ ＣＤ５２およびｇＲＮＡ ＣＤ２４７複合体で細胞をヌクレオフェクトした。 表示された単一またはマルチプレックスのｓｈＲＮＡコンストラクトおよびそれぞれの対照で形質導入されたＴ細胞のパネルＡ）ＴＣＲ細胞表面発現およびパネルＢ）ＣＤ５２細胞表面発現のフローサイトメトリー分析。 パネルＡ）異なる発現コンストラクトで形質導入した細胞のＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を、ＢＣＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質で染色し、続いてＰＥ結合抗Ｆｃ抗体およびＡＰＣ結合抗ＣＤ３４抗体で評価した。形質導入した（ＣＤ３４＋）Ｔ細胞について、ＢＣＭＡ－Ｆｃ染色の蛍光強度の中央値を示す。パネルＢ）異なるＢＣＭＡ発現癌細胞株（ＲＰＭＩ－８２２６、Ｕ２６６、ＯＰＭ－２）を、ＣＤ２４７ ｓｈＲＮＡ、ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡ、またはＣＤ２４７ ＣＤ５２マルチプレックス化ｓｈＲＮＡの有無にかかわらず、Ｍｏｃｋ（ｔＣＤ３４）、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞と２４時間共培養した。ＥＬＩＳＡにより上清中のＩＦＮ－γレベルを測定した。 分裂刺激に対するＴ細胞受容体のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能評価法を示す。Ｔ細胞を、濃度を上昇させた抗ＣＤ３Ｅ抗体（クローンＯＫＴ３）の存在下で培養した。２４時間後、上清中のＩＦＮ－γレベルをＥＬＩＳＡで測定した。２人の異なるドナー（ＣＣ１９－１７４およびＣＣ１９－１８４）からの結果が示されている。 抗ＣＤ５２媒介の細胞殺傷に対するＴ細胞の感受性を評価するインビトロ機能アッセイを示す。抗ＣＤ５２抗体としてアレムツズマブを使用した。Ｔ細胞を、５０μｇ／ｍＬのアレムツズマブまたはＩｇＧ対照抗体の存在下で、３０％の補体で処理した。４時間後に生存細胞の数を評価した。 Ｂ２Ｍ、ＤＧＫ、ＣＤ２４７、ＣＤ５２を標的とした４種類のｓｈＲＮＡを、ベクターデザインに示されているように、単一またはマルチプレックスに発現させ、第二世代のＣＤ１９ ＣＡＲと選択マーカーとともに、レンチウイルスバックボーンを用いて形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞におけるＲＮＡ発現を示す。形質導入後７日目にマーカー特異的な磁気ビーズを用いてシングルステップエンリッチメントを行った。ｓｈＲＮＡによる４つの標的の転写発現のダウンレギュレーションをｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。 第２世代のＣＤ１９指向性ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター（１０６ａ－３６３ｍｉＲＮＡクラスターに導入された、ＣＤ２４７、Ｂ２ＭまたはＣＤ５２を標的とする３×ｓｈＲＮＡまたは６×ｓｈＲＮＡとともに、切断型のＣＤ３４選択マーカー）を形質導入した健康なドナーからの初代Ｔ細胞におけるＲＮＡ発現を示している。対照としてｓｈＲＮＡなし（ｔＣＤ３４）を用いた。導入の２日後、ＣＤ３４特異的磁気ビーズを用いて細胞を富化し、さらにＩＬ－２（１００ｌＵ/ｍＬ）で６日間増幅した。ＣＤ２４７、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２のｍＲＮＡ発現を、ハウスキーピング遺伝子としてシクロフィリンを用いてｑＲＴ－ＰＣＲで評価した。 レンチウイルスバックボーンを用いる選択マーカーＣＤ３４（ｔＣＤ３４）とともに、長いリンカー（リンカー１－４１ｂｐ）または最小のリンカー（リンカー２－６ｂｐ）で分離した２つのｓｈＲＮＡで形質導入した、ヒトｉＰＳＣ細胞株ＳＣｉＰＳ－ＲｌにおけるＲＮＡ発現を示す。培地で１ｍｌになるまで希釈したウイルス上清を５０μＩまたは５００μＩ用いて形質導入を行った。形質導入後８日目にＣＤ３４に特異的なＣｌｉｎｉＭＡＣＳ磁性ビーズを用いてシングルステップ富化を行った。続いて、ハウスキーピング遺伝子としてシクロフィリンを用いて、ｑＲＴ－ＰＣＲによりｓｈＲＮＡ標的の転写発現を解析した。棒グラフは、対照としてｓｈＲＮＡを発現していないＳＣｉＰＳ－Ｒｌ細胞（ｔＣＤ３４）を用いた場合の相対的な発現値を示す。リンカー１（４１ｂｐ）：ｃａａｇｔｔｇｇｇｃｔｔｔａａａｇｃｔｔｇｃａｇｇｇｃｃｔｇａｔｇｔｔｇａｇ（配列番号：１）；リンカー２（６ｂｐ－クローニング由来）：ａａｇｃｔｔ（配列番号２）。 レンチウイルスバックボーンを用いる選択マーカーＣＤ３４（ｔＣＤ３４）とともに、長いリンカー（リンカー１－４１ｂｐ）または最小のリンカー（リンカー２－６ｂｐ）のいずれかで分離した２つのｓｈＲＮＡを形質導入した、ヒトｉＰＳＣ細胞株ＳＣｉＰＳ－ＲｌにおけるＲＮＡ発現を示す。形質導入は、５００ｍＩのウイルス上清を１ｍｌの培地に希釈して行った。導入後８日目にＣＤ３４特異的なＣｌｉｎｉＭＡＣＳ磁気ビーズを用いてシングルステップ富化を行った。細胞を、ハウスキーピング遺伝子としてシクロフィリンを用いたｑＲＴ－ＰＣＲによりｓｈＲＮＡ標的の発現について解析した。棒グラフは、対照としてｓｈＲＮＡを発現していないＳＣｉＰＳ－Ｒｌ細胞（ｔＣＤ３４）との相対的な発現値を示す。

（定義）
本発明を特定の実施形態に関して、また特定の図面を参照して説明するが、本発明はこれに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。特許請求の範囲に記載の参照符号は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。記載されている図面は、単に概略を示すものであって限定するものではない。図面では、例示のために、構成要素の大きさが強調されている場合があり、厳密に図示したものではない。本明細書および特許請求の範囲で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が使用されている場合、他の要素またはステップを除外するものではない。不定冠詞または定冠詞が単数形の名詞に言及する際に使用される場合、例えば「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」のように、他の何かが特に明記されていない限り、その名詞の複数形を含む。

さらに、本明細書および特許請求の範囲における「第１」、「第２」、「第３」などの用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順序や時系列を表すものではない。このように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載されている本発明の実施形態は、本明細書に記載または図示されているものとは別の順序で実施可能であることを理解されたい。

以下の用語または定義は、本発明の理解を助けることを目的として提示しているだけである。

本明細書で特に定義されない限り、本明細書で用いられている用語はすべて、本発明の技術分野の当業者が理解するのと同じ意味を有する。当該技術の定義および用語について、実務者は、具体的に下記文献を参照されたい：ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第４版」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）Ａｕｓｕｂｅｌら著「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４まで）」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）。本明細書で提示される定義は、当業者が理解する範囲よりも狭い範囲に解釈されるべきではない。

本明細書で使用される「改変された細胞」は、（自然に発生する突然変異とは対照的に）ヒトの介入によって改変された細胞である。

本明細書で使用される「ヌクレオチド」または「核酸」または「ポリヌクレオチド」と同義の「核酸分子」という用語は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これらは未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡであっても、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。核酸分子には、限定されるものではないが、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖または、より典型的には二本鎖であるか、あるいは一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子である。また、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む３本鎖領域を指す。また、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性のためにまたはその他の理由でバックボーンが修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化された塩基や、イノシンのような異常な塩基が含まれる。「ポリヌクレオチド」は、自然界に存在する化学的、酵素的、または代謝的に修飾されたポリヌクレオチドのほか、ウイルスや細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。また、「ポリヌクレオチド」には、オリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短い核酸鎖も含まれる。

「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスなどのレプリコンであり、セグメントの複製または発現をもたらすために、別の核酸セグメントトが操作可能に挿入され得る。「クローン」とは、有糸分裂によって単一の細胞または共通の祖先から得られた細胞の集団のことである。「細胞株」とは、インビトロで何世代にもわたって安定して成長することができる一次細胞のクローンである。本明細書で提供するいくつかの例では、細胞は、細胞をＤＮＡでトランスフェクトすることによって形質転換される。

本明細書では、「発現する」および「産生する」という用語は同義的に使用され、遺伝子産物の生合成を意味する。これらの用語は、遺伝子をＲＮＡに転写することを包含する。また、これらの用語は、ＲＮＡを１つ以上のポリペプチドに翻訳することを包含し、さらに、自然に発生する転写後および翻訳後の修飾をすべて包含する。

本明細書で使用される「外因性」という用語は、特に細胞または免疫細胞の文脈では、個々の生細胞内に存在して活性化しているが、（内因性因子とは対照的に）その細胞の外に由来する任意の材料を指す。したがって、「外因性核酸分子」とは、典型的には形質導入またはトランスフェクションによって（免疫）細胞に導入された核酸分子を指す。本明細書で使用される「内因性」という用語は、個々の生存細胞に存在し、活性があり、その細胞の内部に由来する（したがって、通常、非形質導入または非トランスフェクションの細胞でも製造される）任意の因子または物質を意味する。

本明細書において「単離された」とは、生物学的成分（核酸、ペプチド、タンパク質など）が、その成分が自然に存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離され、離れて生産され、または精製されたことを意味する。このように「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質には、標準的な精製方法で精製された核酸およびタンパク質が含まれる。「単離された」核酸、ペプチドおよびタンパク質は、組成物の一部であっても、そのような組成物が本来の環境の一部でない場合には、単離され得る。組成物が核酸、ペプチド、またはタンパク質の本来の環境の一部ではない場合、分離されたままとなる。また、この用語は、化学的に合成された核酸だけでなく、宿主細胞での組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質も包含する。

本明細書で遺伝子編集の文脈で用いられる「マルチプレックス化」とは、２つ以上の（すなわち複数の）関連するまたは関連しない標的を同時に標的とすることを指す。本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉分子」とは、標的化されたｍＲＮＡ分子を中和することによって遺伝子の発現または翻訳を阻害するＲＮＡ（またはＲＮＡ様）分子を指す。例としては、ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）またはｍｉＲＮＡ分子が挙げられる。本明細書で使用される「マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子」とは、このように、１つ以上の標的のダウンレギュレーションを同時に行うために同時に存在する２つ以上の分子を指す。通常、マルチプレックス化された分子のそれぞれは、特定の標的を対象とするが、２つの分子は、同じ標的を対象とし得る（同一であり得る）。

本明細書で使用される「プロモーター」とは、通常、遺伝子領域に隣接して位置する核酸の制御領域であり、制御された遺伝子の転写のための制御点を提供する。

「マルチプレックス」とは、同じタイプの複数の分子、例えば、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックス内で、分子が同じタイプ（例えば、すべてのｓｈＲＮＡ）である場合、それらは同一であってもよいし、異なる配列から構成されていてもよい。同じ種類の分子の間に、本明細書に記載されているリンカーなどの介在配列が介在していてもよい。本発明のマルチプレックスの例は、複数のタンデムｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックスは、一本鎖であっても、二本鎖であっても、あるいは一本鎖である領域と二本鎖である領域の両方を有していてもよい。

本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、少なくとも、抗原に対して特異性を有する結合部位（例えば、抗体、受容体またはその同族リガンド由来であり得る）と、免疫細胞内でシグナルを伝達し得るシグナル部位（例えば、ＣＤ３ゼータ鎖。他のシグナルまたはコシグナリング部位が使用され得、例えば、ＦｃイプシロンＲｌガンマドメイン、ＣＤ３イプシロンドメイン、最近記載されたＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２シグナルドメイン、またはＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、および共刺激ドメインとしてのＣＤ２からのドメインが使用され得る）を少なくとも有するキメラ受容体（すなわち、異なる供給源からの部位で構成されている）を指す。「キメラＮＫ受容体」とは、結合部位がＮＫ受容体から得られるまたは単離されるＣＡＲである。

本明細書で使用される「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞受容体を指す。養子細胞移入の文脈では、これは通常、改変されたＴＣＲ、すなわち特定の抗原（最も典型的には腫瘍抗原）を認識するように改変されたＴＣＲを意味する。本明細書で使用される「内在性ＴＣＲ」は、非修飾細胞（典型的にはＴ細胞）に内在的に存在するＴＣＲを指す。ＴＣＲは、通常、可変性の高いアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖からなるジスルフィド結合の膜結合型ヘテロ二量体であり、不変のＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現している。ＴＣＲ受容体複合体は、可変ＴＣＲ受容体ａおよびｂ鎖と、ＣＤ３共受容体（ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３６δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖を含む）および２つのＣＤ３ζ鎖（別名ＣＤ２４７分子）とのオクトメリック複合体である。本明細書で使用される「機能的ＴＣＲ」とは、同族リガンドの結合によりシグナルを伝達できるＴＣＲを意味する。通常、同種他家治療では、ＴＣＲ鎖の少なくとも１つをノックアウトまたはノックダウンするなどして、ＴＣＲの機能を低下または損なわせるための改変が行われる。改変された細胞内の内因性ＴＣＲは、改変されていない内因性ＴＣＲを有する細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、あるいは少なくとも９０％のシグナル伝達能力（またはＴ細胞活性化）を保持している場合に機能的であると考えられる。シグナル伝達能力またはＴ細胞活性化を評価するためのアッセイは、当業者に知られており、特にインターフェロンガンマを測定するＥＬＩＳＡが含まれる。代替的な実施形態によれば、ＴＣＲの機能を阻害するような改変が行われていない場合、内在性ＴＣＲは機能的であると考えられる。

本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は、免疫系（適応免疫系または自然免疫系のいずれかであり得る）の一部である細胞を指す。本明細書で使用する免疫細胞は通常、養子細胞移入（自家移入または同種他家移入のいずれか）のために製造された免疫細胞である。多くの異なるタイプの免疫細胞が養子療法に使用され、したがって、本明細書に記載の方法での使用が想定される。免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、リンパ球、樹状細胞、骨髄系細胞、幹細胞、前駆細胞またはｉＰＳＣが挙げられるが、これらに限定されない。後者の３つは、それ自体は免疫細胞ではないが、免疫療法のための養子細胞移入に使用され得る（例えば、Ｊｉａｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４、Ｔｈｅｍｅｌｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１５参照）。通常、製造は幹細胞またはｉＰＳＣから開始されるが（または、免疫細胞からｉＰＳＣへの脱分化ステップから始まってもよい）、製造は、投与前に免疫細胞への分化ステップを伴う。養子移入のための免疫細胞の製造に使用される幹細胞、前駆細胞およびｉＰＳＣ（すなわち、本明細書に記載されているようなＣＡＲで形質導入された幹細胞、前駆細胞およびｉＰＳＣまたはそれらの分化した子孫）は、本明細書において免疫細胞とみなされる。特定の実施形態によれば、本方法で想定される幹細胞は、ヒト胚を破壊するステップを含まない。

特に想定される免疫細胞としては、リンパ球、単球、マクロファージ、および樹状細胞などの白血球が挙げられる。特に想定されるリンパ球としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞などが挙げられるが、特に想定されるのはＴ細胞である。養子移入の場合、免疫細胞は通常、初代細胞（ヒトまたは動物の組織から直接分離され、培養されていないか、短時間しか培養されていない細胞）であり、細胞株（すなわち、長期間にわたって継続的に継代され、均質な遺伝子型および表現型の特性を獲得した細胞）ではないことに留意されたい。特定の実施形態によれば、免疫細胞は、初代細胞（すなわち、ヒトまたは動物の組織から直接単離された細胞であり、培養されていないか、または短時間だけ培養された細胞）であり、細胞株（すなわち、長期間にわたって継続的に継代され、均質な遺伝子型および表現型の特性を獲得した細胞）ではない。代替的な特定の実施形態によれば、前記免疫細胞は、細胞株からの細胞ではない。

本明細書で使用される「マイクロＲＮＡスキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」または「ｍｉＲＮＡスキャフォールド」とは、特定のマイクロＲＮＡプロセシング要件を含む十分に特性化された一次マイクロＲＮＡ配列のことで、ここでＲＮＡ配列が挿入され得る（典型的には、既存のｍｉＲＮＡ配列を、特定の標的を対象とするｓｈＲＮＡと置き換えるため）。ｍｉＲＮＡスキャフォールドの例としては、ＳＭＡＲＴｖｅｃｔｏｒ^ＴＭ ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ ａｄａｐｔｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ラファイエット、コロラド州、米国）、またはｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターなどの天然由来のｍｉＲＮＡクラスターが挙げられる。

「対象」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む、ヒトおよび非ヒトの動物を指す。記載された方法の最も特定の実施形態では、前記対象は、ヒトである。

「治療する」または「治療」という用語は、傷害、病態または状態の軽減または改善における任意の成功または成功の兆候を指し、症状の軽減、寛解、減退または患者にとって状態をより許容できるようにすること、退化または減弱の速度を遅くすること、退化の最終点をいっそう衰弱させないようにすること、対象の身体的または精神的な健康を改善すること、または生存期間を延長することなどの任意の客観的または主観的なパラメータを含む。前記治療は、身体検査、神経学的検査、精神医学的評価など、客観的または主観的なパラメータで評価され得る。

本明細書中で使用されている「養子細胞療法」、「養子細胞移入」、または「ＡＣＴ」という表現は、細胞、最も典型的には免疫細胞を対象（例えば患者）に移入することを意味する。これらの細胞は、対象に由来するもの（自家治療の場合）と、他の個体に由来するもの（同種他家治療の場合）があり得る。この治療法の目的は、免疫の機能と特性を改善することであり、癌免疫療法では、癌に対する免疫反応を高めることである。ＡＣＴにはＴ細胞が最もよく用いられるが、ＮＫ細胞、リンパ球（ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）など）、樹状細胞、および骨髄系細胞など、他の種類の免疫細胞を用いても適用される。

「有効量」または「治療有効量」とは、所望の治療結果を得るために必要な投与量および期間で有効な量を指す。本明細書に記載されている形質転換免疫細胞などの治療有効量の治療薬は、個体の病状、年齢、性別、体重、および治療薬（細胞など）が個人に所望の反応を引き起こす能力などの要因に応じて変化する可能性がある。また、治療有効量とは、治療的に有益な効果が、治療薬の毒性または有害な影響を上回る量のことである。

「移植片対宿主病」（ＧｖＨＤ）とは、同種他家移植後に発生する可能性のある症状のことである。ＧｖＨＤでは、ドナー提供された骨髄、末梢血（幹）細胞、その他の免疫細胞がレシピエントの体を異物とみなし、ドナー提供された細胞が体を攻撃する。Ｔ細胞などのドナーの免疫応答性の免疫細胞がＧｖＨＤの主な要因であることから、ＧｖＨＤを予防する一つのストラテジーとして、これらの免疫応答性の細胞における（ＴＣＲに基づく）シグナル伝達を、例えばＴＣＲ複合体の機能を直接的または間接的に阻害することで低減することが挙げられる。

養子細胞移入（ＡＣＴ）において、ゲノム編集（およびそれに伴うコストと複雑な製造プロセス）を必要とせずに、複数の遺伝子を標的とすることが可能かどうかを評価するために、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をテストすることが決定された。

このアプローチは、内因性ＲＮＡ編集機構によってプロセシングされる特定のベクターからのＲＮＡの転写に基づいており、活性型のｓｈＲＮＡを生成する。このｓｈＲＮＡは、塩基認識により任意のｍＲＮＡを標的とし、その結果、ＤＩＣＥＲ複合体により特定のｍＲＮＡを破壊することができる。標的となったｍＲＮＡが特異的に破壊されることで、関連するタンパク質の発現が抑制される。ＲＮＡオリゴヌクレオチドを任意の標的細胞にトランスフェクションすることで、一過性の遺伝子発現のノックダウンを実現することができるが、所望のｓｈＲＮＡをインテグレートされたベクターで発現させることで、安定した遺伝子発現のノックダウンが可能になる。

ｓｈＲＮＡの発現を成功させるには、ポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーター（Ｈ１、Ｕ６など）と結合し、５’キャップと３’ポリアデニル化を欠いたＲＮＡ種を生成し、ｓｈＲＮＡ二重鎖のプロセシングを可能にすることが重要である。転写されたｓｈＲＮＡは、プロセシングを経て核から放出され、さらにプロセシングを経てＲＮＡ誘導サイレンシング複合（ＲＩＳＣ）複合体に取り込まれ、選択したｍＲＮＡが標的として分解される（Ｍｏｏｒｅら、２０１０）。効果的ではあるものの、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターによる転写の効率性は、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのｓｈＲＮＡの過剰な発現により内因性マイクロＲＮＡ経路が飽和することで、細胞毒性を引き起こす可能性がある（Ｆｏｗｌｅｒら、２０１５）。さらに、単一のベクターによる治療用遺伝子とｓｈＲＮＡの両方の発現は、通常、治療用遺伝子をドライブするポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌｌｌ）プロモーターと目的のｓｈＲＮＡをドライブするＰｏｌｌｌｌプロモーターを採用することによって達成されてきた。これは機能的ではあるが、ベクターのスペースを犠牲にしているため、治療用遺伝子を含む選択肢が少なくなっている（Ｃｈｕｍａｋｏｖら、２０１０；Ｍｏｏｒｅら、２０１０）。

マイクロＲＮＡ（ｍｉｒ）フレームワーク内にｓｈＲＮＡを埋め込むことで、Ｐｏｌ ｌｌプロモーターの制御下でｓｈＲＮＡをプロセシングすることができる（Ｇｉｅｒｉｎｇら、２００８年）。重要なことに、埋め込まれたｓｈＲＮＡの発現レベルが低くなる傾向があり、それによって、Ｕ６プロモーターなどの他のシステムを使用した場合に発現が観察される毒性が回避される（Ｆｏｗｌｅｒら、２０１５年）。実際、肝臓特異的なＰｏｌ ｌｌプロモーターによってドライブされるｓｈＲＮＡを投与されたマウスは、１年超にわたって忍容性の問題を伴わない安定した遺伝子ノックダウンを示した（Ｇｉｅｒｉｎｇら、２００８年）。しかし、これは肝細胞で行われた１つのｓｈＲＮＡについての結果であり、タンパク質レベルでの減少はわずか１５％であった（Ｇｉｅｒｉｎｇら、２００８年）。したがって、複数の標的、特に（操作が難しい）免疫細胞においても、より高い効率を達成できるかどうかは不明である。

驚くべきことに、異なる標的に対する複数のマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ１９６ａ２スキャフォールドまたはｍｉＲ１０６ａ～３６３クラスターをスキャフォールドとして使用したものに基づく）の発現が、組換えを示すことなく、毒性を示すことなく、同時に標的の効率的なダウンレギュレーションを達成しながら、Ｔ細胞において実現可能であることが本明細書に示されている。

このように、ｓｈＲＮＡは細胞内、特に改変された免疫細胞内でうまくマルチプレックス化できるだけでなく、標的は非常に効率的にダウンレギュレーションされ、遺伝子ノックアウトに匹敵するほどである（ＣＲＩＳＰＲとの比較を示す実施例５～８および図８～１２を参照）。

したがって、本発明の目的は、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をコードする核酸分子を含む、改変された細胞を提供することである。

少なくとも２つのＲＮＡ干渉分子を含む細胞は、利点、特に治療上の利点を有し得る。ＲＮＡ干渉分子は、実際、（過剰）発現が望ましくない標的を対象とし得る。しかし、通常、本明細書で提供される改変された細胞は、目的のタンパク質をさらに含む。

さらなる実施形態によれば、
・目的のタンパク質をコードする第１外因性核酸分子、および
・少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をコードする第２核酸分子
を含む改変された細胞が提供される。

任意の追加の目的のタンパク質は、例えば、相加的、支持的、または相乗的な効果を提供することができ、または別の目的のために使用され得る。例えば、目的のタンパク質は、腫瘍を対象にしたＣＡＲであり得、ＲＮＡ干渉分子は、例えば、免疫チェックポイントを標的にしたり、腫瘍標的を直接ダウンレギュレートしたり、腫瘍微小環境を標的にしたりして、腫瘍の機能を妨害し得る。代替的または追加的に、１つ以上のＲＮＡ干渉分子は、治療細胞の持続性を延長するか、またはその他の生理学的反応を変化させる可能性がある（例えば、ＧｖＨＤまたは宿主対移植片反応への干渉）。

対象となるタンパク質は、設定に応じて原則的にどのようなタンパク質でもよい。しかし、一般的には、治療機能を有するタンパク質である。これらには、例えばインターロイキン、サイトカイン、ホルモンなどの分泌される治療用タンパク質が含まれる。しかし、特定の実施形態によれば、目的のタンパク質は分泌されない。典型的には、対象となるタンパク質は受容体である。さらに特定の実施形態によれば、受容体はキメラ抗原受容体またはＴＣＲである。キメラ抗原受容体は、標的細胞の表面に発現している任意の標的を対象とし得、典型的な例としては、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７４、ＣＤ２４８、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ２７９、ＣＤ３１９、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＥＰＨＡ２、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＰＣ３、Ｆｌｔ３、ＤＬＬ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＫＤＲ、ＭＥＴ、ムチン１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＦＯＬＨ１、ＦＡＰ、ＣＡ９、ＦＯＬＲ１、ＲＯＲ１、ＧＤ２、ＰＳＣＡ、ＧＰＮＭＢ、ＣＳＰＧ４、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２などがあるがこれらに限定されず、さらに多くのものが存在し、また適している。ほとんどのＣＡＲはｓｃＦｖベース（すなわち、結合部分は特定の標的を対象とするｓｃＦｖであり、ＣＡＲは通常、標的にちなんで命名される）であるが、いくつかのＣＡＲは受容体ベース（すなわち、結合部分は受容体の一部であり、ＣＡＲは通常、受容体にちなんで命名される）である。後者の例としては、ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲが挙げられる。

改変されたＴＣＲは、細胞内の標的を含む、細胞のあらゆる標的を対象とし得る。細胞表面に存在する上記の標的に加えて、ＴＣＲの典型的な標的には、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＡＦＰ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、ＷＴ１、ｐ５３、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＢＶ、ＴＲＡＩＬ、サイログロブリン、ＫＲＡＳ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＡ－１、ＣＭＶ、およびＣＥＡが含まれるが、これらに限定されない。

目的のさらなるタンパク質が存在するこれらの特定の実施形態によれば、改変された細胞中の第１および第２核酸分子は、典型的には、真核生物発現プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、またはウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびセンダイウイルスに由来する）などの１つのベクター中に存在する。さらなる特定の実施形態によれば、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される。特に後者の場合、ベクター負荷（すなわちコンストラクトの合計サイズ）が重要であり、コンパクトなマルチプレックス化カセットの使用が特に有利である。

前記改変された細胞は、特に真核細胞、より具体的には改変された哺乳動物細胞、より具体的には改変されたヒト細胞である。特定の実施形態によれば、前記細胞は、改変された免疫細胞である。典型的な免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞、前駆細胞、およびｉＰＳＣ細胞から選択される。

前記少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、ダウンレギュレートされる標的分子の数およびマルチプレックス化された分子を共発現させることの制限に応じて、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、またはさらに多くの分子であってもよい。「マルチプレックス」とは、同じ種類の複数の分子をコードするポリヌクレオチドのことで、例えば、複数のｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡなどが挙げられる。マルチプレックス内では、同じ種類の分子（例えば、すべてのｓｈＲＮＡ）の場合、それらは同一であってもよいし、異なる配列から構成されていてもよい。同じ種類の分子の間には、本明細書に記載されているように、リンカーなどの介在配列があってもよい。本発明のマルチプレックス化の一例は、複数のタンデムｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックスは、一本鎖、二本鎖、または一本鎖である領域と二本鎖である領域の両方であってもよい。

特定の実施形態によれば、前記少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、１つのプロモーターの制御下にある。通常、複数のＲＮＡ干渉分子を発現させる場合、これは、複数のコピーのｓｈＲＮＡ発現カセットを組み込むことによって行われる。これらは通常、同一のプロモーター配列を有しており、その結果、反復される配列断片を除去する組換え事象が頻繁に発生する。解決策として、通常、１つの発現カセットに複数の異なるプロモーターが使用される（例えば、Ｃｈｕｍａｋｏｖら、２０１０年）。しかし、本実施形態によれば、１つのプロモーターのみを使用することで、組換えを回避することができる。通常、発現量は低くなるが、ｓｉＲＮＡの量が多すぎると（例えば、内因性ｓｉＲＮＡ経路を妨害することで）細胞に毒性を及ぼす可能性があるため、毒性の面でも利点がある。また、プロモーターを１つだけ使用することで、すべてのｓｈＲＮＡがコレギュレーションされ、同程度のレベルで発現するという利点もある。驚くべきことに、実施例に示すように、複数のｓｈＲＮＡを１つのプロモーターから転写しても、有効性が大きく低下することはない。

さらに特定の実施形態によれば、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子と目的のタンパク質の両方が、１つのプロモーターの制御下にある。これにより、ベクターの負荷が軽減され（目的のタンパク質を発現させるために別のプロモーターが使用されないため）、共調節された（ｃｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ）発現の利点が得られる。これは、例えば、目的のタンパク質が癌を標的とするＣＡＲであり、ＲＮＡ干渉分子が腫瘍根絶において付加的または相乗的な効果をもたらすことを意図している場合に有利である。

通常、ＲＮＡ干渉分子の発現に使用されるプロモーターは、Ｕ６プロモーターではない。これは、このプロモーターが、特に高レベルの発現では毒性と関連しているからである。同じ理由で、Ｈ１プロモーター（これはＵ６よりも弱いプロモーターである）、あるいは一般的にＰｏｌ ＩＩＩプロモーター（特定の条件では適していることもあるが）を除外することを検討することができる。このように、特定の実施形態によれば、抑制分子の発現に使用されるプロモーターは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターではない。ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、時間的および空間的制御を欠いており、ｍｉＲＮＡ阻害剤の制御された発現を可能にしていない。対照的に、多数のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーターは組織特異的な発現を可能にし、誘導性と抑制性の両方のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが存在する。組織特異的な発現は、本発明の文脈ではしばしば必要とされないが（細胞が、改変の前に選択されるため）、様々なプロモーターからのＲＮＡｉ効力の違いが免疫細胞で特に顕著であることが示されている（Ｌｅｂｂｉｎｋら、２０１１年）ことから、例えば免疫細胞に特異的なプロモーターを有することは、やはり利点である。特定の実施形態によれば、プロモーターは、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、およびＰｏｌ ＩＩＩプロモーターから選択される。特定の実施形態によれば、プロモーターは、天然または合成のＰｏｌ ＩＩプロモーターである。適切なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子1α（ＥＦｌａ）プロモーター（コアまたは全長）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、上流にＣＭＶ ＩＶエンハンサーを有する複合βアクチンプロモーター（ＣＡＧプロモーター）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター、インターロイキン２プロモーター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）長末端反復（ＬＴＲ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、およびｔＲＮＡプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、ｍＲＮＡの発現を促すポリメラーゼＩＩプロモーターとして最もよく使用されている。

特定の実施形態によると、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、ｓｈＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ分子であり得る。最も特に、それらはｍｉＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡ分子とｍｉＲＮＡ分子の違いは、ｍｉＲＮＡ分子はＤｒｏｓｈａによってプロセシングされるが、従来のｓｈＲＮＡ分子はプロセシングされないことである（これは毒性と関連している、Ｇｒｉｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ ４４１：５３７－５４１（２００６））。

特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡ分子は、１つのプロモーターの制御下にある１つのｍｉＲＮＡスキャフォールドとして提供され得る。選択されたスキャフォールドが通常１つのｍｉＲＮＡを保持している場合、そのスキャフォールドを反復したり、他のスキャフォールドと組み合わせたりして、複数のＲＮＡ干渉分子の発現を得ることができる。ただし、反復したり、更なるスキャフォールドと組み合わせたりする場合は、通常、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のすべてが１つのプロモーターの制御下にあることが想定される（すなわち、単一のスキャフォールドが反復される場合、プロモーターは反復されない）。

ｍｉＲＮＡマルチプレックス化に特に適したスキャフォールド配列は、ｍｉＲ－３０スキャフォールド配列、ｍｉＲ－１５５スキャフォールド配列、およびｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールド配列である。しかし、特定の実施形態によれば、ｍｉＲ－３０またはｍｉＲ－１５５配列は、使用されない。

通常、ｍｉＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ｍｉＲ－１９６スキャフォールド配列、好ましくはｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールド配列を含む。特定の実施形態によれば、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ分子のすべてが、ｍｉＲ－スキャフォールド配列、好ましくはｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールド配列を含む。同じことが、ｍｉＲ－３０およびｍｉＲ－１５５スキャフォールド配列についても言える。そのような適切なスキャフォールドの例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８８４１２６７号（特にその中の請求項１）に記載されている。単一のスキャフォールドはＳＭＡＲＴｖｅｃｔｏｒ^ＴＭ ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ ａｄａｐｔｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ラファイエット、コロラド州、米国）として市販されている。

さらに適切なスキャフォールド配列としては、ｍｉＲ－２６ｂ（ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ）、ｍｉＲ－２０４（ｈｓａ－ｍｉｒ－２０４）、およびｍｉＲ－１２６（ｈｓａ－ｍｉｒ－１２６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１４０－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ、ｈｓａ－ｍｉｒ－７－１、ｈｓａ－ｍｉｒ－７－２、ｈｓａ－ｍｉｒ－７－３、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－３４０、ｈｓａ－ｍｉｒ－１０１、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９ｃ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１９１、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２２、ｈｓａ－ｍｉｒ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉｒ－２１、ｈｓａ－ｍｉｒ－３７８、ｈｓａ－ｍｉｒ－１００、ｈｓａ－ｍｉｒ－１９２、ｈｓａ－ｍｉｒ－３０ｄ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１６、ｈｓａ－ｍｉｒ－４３２、ｈｓａ－ｍｉｒ－７４４、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９ｂ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１３０ａ、またはｈｓａ－ｍｉｒ－１５ａが挙げられる。

代替的ではあるが排他的ではない実施形態によれば、繰り返される特定のｍｉＲスキャフォールドを使用して人工的に反復されるスキャフォールドを得るのではなく、真のポリシストロニックｍｉＲＮＡクラスターまたはその一部が使用され得、ここでは内因性ｍｉＲＮＡが、目的のｓｈＲＮＡで置き換えられる。この目的に特に適したｍｉＲスキャフォールドクラスターは、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３、ｍｉＲ－１７～９２、ｍｉＲ－１０６ｂ～２５、およびｍｉＲ－２３ａ～２７ａ～２４－２クラスターであり、最も特に想定されるのはｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターおよびその断片である。注目すべきは、ベクターの負荷量を削減するために、そのような天然のクラスターの一部を使用し、すべての配列を使用しないことも具体的に想定されていることである（これは、すべてのｍｉＲＮＡが等間隔ではなく、すべてのリンカー配列が必要とされるわけではないので、特に有用である）。他にも、細胞内で最も効率的にプロセシングされるｍｉＲＮＡを取るなどの考慮が可能である。例えば、ｍｉＲ－１７～９２クラスターは、（順に）ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１９ｂ－１およびｍｉＲ－９２－１（ｍｉＲ－９２ａｌでもある）から構成されており、特に有用なその断片は、ｍｉＲ－１９ａからｍｉＲ－９２－１までのスキャフォールド配列（すなわち、６つのｍｉＲＮＡのうちの４つ）、またはｍｉＲ－１９ａからｍｉＲ－１９ｂ－１までのスキャフォールド配列（６つのｍｉＲＮＡのうちの３つ）である。同様に、１０６ａ～３６３クラスターは、（順に）ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１８ｂ、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－９２－２（ｍｉＲ－９２ａ２も）、およびｍｉＲ－３６３から構成されている。特に有用なその断片は、ｍｉＲ－２０ｂ～ｍｉＲ－３６３（すなわち、６つのｍｉＲＮＡのうち４つ）までのスキャフォールド配列、またはｍｉＲ－１９ｂ－２からｍｉＲ－３６３（すなわち、６つのｍｉＲＮＡのうち３つ）までのスキャフォールド配列である。また、天然のリンカー配列だけでなく、その断片または人工的なリンカーも使用できる（ベクターの負荷量を削減するため）。

例えば、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターとｍｉＲ－１９６ａ２配列の両方を新規のスキャフォールドに組み合わせることができるなど、これらのストラテジーを組み合わせて使用することが想定される。

本明細書で開示する細胞は、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子を含む。これらは、ダウンレギュレートされる必要のある１つ以上の標的（細胞内の標的、またはｓｈＲＮＡが分泌される場合は細胞外の標的のいずれか）を対象とすることができる。各ＲＮＡ干渉分子は、異なる分子を標的にすることも、同じ分子を標的にすることも、それらの組み合わせも可能である（すなわち、１つの標的に対しては２つ以上のＲＮＡ分子を対象とし、異なる標的に対しては１つのＲＮＡ干渉分子のみを対象とする）。ＲＮＡ干渉分子が同じ標的を対象とする場合、それらは同じ領域を対象にすることができ、あるいは異なる領域を対象にすることができる。言い換えれば、同じ標的を対象としている場合、ＲＮＡ干渉分子は同一であってもなくてもよい。このようなＲＮＡ干渉分子の組み合わせの例を実施例９に示す。

このように、特定の実施形態によれば、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子の少なくとも２つは、同じ標的を対象とする。さらなる特定の実施形態によれば、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも２つは同一である。

代替的な実施形態によれば、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のすべてが異なる。さらなる具体的な実施形態によれば、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のすべてが、異なる標的を対象とする。

改変された細胞内に存在する任意の適切な分子は、即時のＲＮＡ干渉分子によって標的とされ得る。想定される標的の代表例としては、ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、ＭＨＣコレセプター遺伝子（ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇなど）、ＴＣＲ鎖、ＣＤ３鎖、ＮＫＢＢｉＬ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＬＴＢ、ＬＳＴ１、ＮＣＲ３、ＡＩＦ１、ＬＹ６、熱ショックタンパク質（ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂなど）、補体カスケード、調節受容体（ＮＯＴＣＨ４など）、ＴＡＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＲＩＮＧ１、ＣＤ５２、ＣＤ２４７、ＨＣＰ５、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、２Ｂ４、Ａ２ＡＲ、ＢＡＸ、ＢＬＩＭＰ１、Ｃ１６０（ＰＯＬＲ３Ａ）、ＣＢＬ－Ｂ、ＣＣＲ６、ＣＤ７、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＤＧＫ［ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＫＧＧ、ＤＧＫＨ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ］、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＧＲ２、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＳＮ、ＧＭＣＳＦ、ＨＰＫ１、ＩＬ－１０Ｒ［ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ］、ＩＬ２、ＬＦＡ１、ＮＥＡＴ１、ＮＦｋＢ（ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＮＦｋＢ２、ＮＦｋＢ１、ＲＥＬを含む）、ＮＫＧ２Ａ、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３を含む）、ＰＤ１、ＰＩ３ＫＣＤ、ＰＰＰ２ＲＤ２、ＳＨＩＰ１、ＳＯＡＴ１、ＳＯＣＳ１、Ｔ－ＢＥＴ、ＴＥＴ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＯＸ、およびＺＦＰ３６Ｌ２が挙げられる。

特に、ｍｉＲＮＡをベースにした適切なコンストラクトが、確認されている。したがって、本発明は、マルチプレックス化マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード領域を有するポリヌクレオチドを含む、改変された細胞が提供され、前記マルチプレックス化マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域は、以下をコードする配列を含む、
２つ以上の人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列であって、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列が、以下を含む、
・ｍｉＲＮＡスキャフォールド配列、
・活性配列または成熟配列、および、
・パッセンジャーまたはスター配列であって、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列内で、前記活性配列が前記パッセンジャー配列に少なくとも８０％相補的である、配列。

人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列のそれぞれの活性配列およびパッセンジャー配列の両方は通常、１８～４０のヌクレオチド長、より特に１８～３０のヌクレオチド長、最も特に１９～２５のヌクレオチド長を有する。

通常、これらのマイクロＲＮＡスキャフォールド配列はリンカーによって分離されており、リンカー配列は例えば３０～６０のヌクレオチド長を有するが、これより短い長さ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）でも機能する。実際、驚くべきことに、リンカーの長さは重要な役割を果たさず、非常に短くても（１０ヌクレオチド未満）、あるいは存在しなくても、ｓｈＲＮＡの機能を妨げることはないことがわかった。これは、例えば、図６および１６に示されている。

人工配列は、例えば、内因性ｍｉＲ配列が、特定の標的に対して改変されたｓｈＲＮＡ配列で置換された天然由来のスキャフォールド（ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターなどのｍｉＲクラスターまたはその断片）であり得、内因性ｍｉＲ配列が、特定の標的に対して改変されたｓｈＲＮＡ配列で置換された単一のｍｉＲスキャフォールド（ｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールドなど）の反復であり得、人工ｍｉＲ様配列であるかまたはそれらの組み合わせであり得る。

この改変された細胞は通常、キメラ抗原受容体またはＴＣＲなどの目的のタンパク質をコードする核酸分子をさらに含み、上記のような改変された免疫細胞であり得る。

マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子を共発現させることにより、改変された細胞内で少なくとも１つの遺伝子、典型的には複数の遺伝子が抑制される。これにより、より高い治療効果が期待できる。

本明細書に記載の改変された細胞は、医薬品としての使用にも提供される。特定の実施形態によれば、前記改変された細胞は、癌の治療に使用するために提供される。治療することができる癌の例示的な種類には、これらに限定されないが、腺癌、副腎皮質癌、肛門癌、星状細胞腫、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、卵管癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膠芽腫、頭頸部癌、カポジ肉腫、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、神経芽腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、腹膜癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、小腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。

特定の実施形態によれば、細胞は、液体または血液の癌の治療のために提供され得る。このような癌の例としては、例えば、白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫（Ｂ細胞リンパ腫（例：ＤＬＢＣＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫を含む）、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）が挙げられる。

これは、本明細書に記載の改変された細胞（すなわち、少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をコードする外因性核酸分子を含み、任意に目的のタンパク質をコードするさらなる核酸分子を含む、改変された細胞）の適切な用量を、それを必要とする対象に投与することを含み、それによって、がんに関連する少なくとも１つの症状を改善する、がんを治療する方法が提供されることと同等である。治療が想定される癌としては、以下に限定されないが、腺癌、副腎皮質癌、肛門癌、星状細胞腫、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、卵管癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膠芽腫、頭頸部癌、カポジ肉腫、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、神経芽腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、腹膜癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、小腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、ウィルムス腫瘍が挙げられる。さらなる特定の実施形態によれば、血液癌を治療する方法が提供され、それを必要とする対象に、本明細書に記載の適切な用量の改変された細胞を投与することにより、癌の少なくとも１つの症状を改善することを含む。

代替的な実施形態によれば、前記細胞は、自己免疫疾患の治療に使用するために提供され得る。治療することができる自己免疫疾患の例示的なタイプとしては、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリッグ病）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、クローン病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、乾癬、乾癬性関節炎、アジソン病、強直性脊椎炎、ベーチェット病、セリアック病、コクサッキー心筋炎、子宮内膜症、線維筋痛症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、川崎病、メニエール病、重症筋無力症、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、潰瘍性大腸炎、血管炎、白斑が挙げられるが、これらに限定されない。

これは、自己免疫疾患を治療する方法が提供され、治療を必要としている対象に、本明細書に記載の適切な用量の改変された細胞を投与し、それによって自己免疫疾患に関連する少なくとも１つの症状を改善すること含むということに等しい。治療することができる例示的な自己免疫疾患は、上記に記載されている。

さらに別の実施形態によれば、前記細胞は、感染症の治療に使用するために提供され得る。「感染症」は、本明細書では、疾患を有する対象または生物の中または上に外部生物（病原体）が存在することによって引き起こされる任意のタイプの疾患を指すために使用される。感染症は、通常、ウイルス、プリオン、細菌、ウイロイドなどの微生物またはマイクロ寄生体によって引き起こされると考えられているが、マクロ大寄生体や真菌などのより大きな生物も感染することがある。感染を引き起こす生物は、本明細書では、「病原体」（病気を引き起こす場合）および「寄生体」（明白な病気が存在しなくても、宿主生物の犠牲の下で利益を得て、それによって宿主生物の生物学的適合性を低下させる場合）と呼ばれ、ウイルス、細菌、真菌、原生生物（ｐｒｏｔｉｓｔｓ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）および原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）（マイクロ寄生体）およびワームなどのマクロ寄生体（例えば、回虫、糸状虫、鉤虫、蟯虫、鞭虫などの線虫類、または条虫や吸虫などの扁虫）だけでなく、マダニやダニなどの外部寄生体を含むがこれらに限定されない。寄生体という用語の中には、宿主生物を殺菌または殺傷する寄生生物、すなわち擬寄生体（ｐａｒａｓｉｔｏｉｄ）が想定されている。特定の実施形態によれば、前記感染症は、微生物またはウイルスの生物によって引き起こされる。

本明細書で使用される「微生物」としては、細菌、例えばグラム陽性細菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、グラム陰性細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属）、スピロヘータ（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍなどのＴｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉなどのＢｏｒｒｅｌｉａ属）、モリキューテス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属などの細胞壁を持たない細菌）、耐酸性細菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｕｍなどのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属など）が挙げられる。「微生物」には、真菌（酵母やカビなど、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ属、またはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属など）、原生動物（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ属、Ｇｉａｒｄｉａ属、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ属、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属）および古細菌（ａｒｃｈａｅ）が挙げられる。即時の（ｉｎｓｔａｎｔ）方法で治療することができる感染症を引き起こす微生物のさらなる例としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、院内病原体Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓを含む）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ.ｃｅｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａなどの食物病原体が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で同等の意味で用いている「ウイルス生物」または「ウイルス」は、生物の生細胞内でのみ複製可能な小さな感染因子である。それらには、ｄｓＤＮＡウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスなど）、ｓｓＤＮＡウイルス（パルボウイルスなど）、ｄｓＲＮＡウイルス（レオウイルスなど）、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（ピコルナウイルス、トガウイルス、コロナウイルスなど）、（－）ｓｓＲＮＡウイルス（オルトミクソウイルス、ラブドウイルスなど）、ｓｓＲＮＡ－ＲＴ（逆転写）ウイルス、すなわち、（＋）センスＲＮＡとＤＮＡをライフサイクルの中間に有するウイルス（例えば、レトロウイルス）、ｄｓＤＮＡ－ＲＴウイルス（例えば、ヘパドナウイルス）が挙げられる。ヒトに感染し得るウイルスの例としては、アデノウイルス、アストロウイルス、ヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルスなど）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ロゼオロウイルス）、パポバウイルス（例えば、ヒトヘルぺスウイルス、およびヒトポリオーマウイルス）、ポックスウイルス（例：バリオラウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス）、アレナウイルス、ブニアウイルス（ｂｕｎｉａｖｉｒｕｓ）、カルシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９の病因物質））、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、脳炎ウイルス）、オルトミクソウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（おたふく風邪）、モルビリウイルス（はしか）、肺炎ウイルス（ヒトＲＳウイルスなど）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーＡウイルス、コクサッキーＢウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エコーウイルス、およびエンテロウイルスなど）、レオウイルス、レトロウイルス（ヒト免疫不全ウイルスおよびヒトＴリンパ球向性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）ウイルス（ＨＴＬＶ）などのレンチウイルスなど）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルスなど）、またはトガウイルス（風疹ウイルスなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、治療すべき感染症は、ＨＩＶではない。代替実施形態によれば、治療すべき感染症は、レトロウイルスによって引き起こされる疾患ではない。代替的な実施形態によれば、治療すべき感染症は、ウイルス性疾患ではない。

これは、本明細書に記載の適切な用量の改変された細胞（すなわち、２つ以上のマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をコードする外因性核酸分子を含み、任意に目的のタンパク質をコードするさらなる核酸分子を含む、改変された細胞）を、それを必要とする対象に投与し、それによって少なくとも１つの症状を改善することを含む、感染症の治療方法が提供されるということに等しい。特に想定される微生物性またはウイルス性の感染症は、上記の病原体によって引き起こされるものである。

医薬品として使用するために提供されるこれらの細胞は、同種他家療法に使用するために提供され得る。すなわち、これらの細胞は、同種他家ＡＣＴが治療の選択肢と考えられる治療において使用するために提供される（別の対象からの細胞が、それを必要とする対象に提供される）。特定の実施形態によれば、同種他家療法において、ＲＮＡ干渉分子の少なくとも１つは、ＴＣＲを（最も特に、ＴＣＲ複合体のサブユニットを）対象とするであろう。別の実施形態によれば、これらの細胞は、自家療法、特に自家ＡＣＴ療法（すなわち、患者から得られた細胞を用いた療法）に使用するために提供される。

本発明による細胞および方法について、特定の実施形態、特定の構成、ならびに物質および／または分子を本明細書で説明したが、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、形態および詳細において様々な変更や変形が可能であることを理解されたい。以下の実施例は、特定の実施形態をさらに説明するために提供されるものであり、本願を限定解釈するものではない。本願は、特許請求の範囲によってのみ限定される。

実施例１．ＴＣＲのダウンレギュレーションにおけるｍｉＲＮＡスキャフォールドの長さの評価
同一のウイルス発現ベクター内で様々なｓｈＲＮＡのマルチプレックス化を成功させるには、ｍｉＲＮＡベースのスキャフォールドをできるだけ小さくする必要がある。これにより、ベクター全体のサイズに大きな影響を与えることなく、複数のｓｈＲＮＡを組み合わせることができる。短縮されたｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡスキャフォールドでも標的のノックダウンが効率的かどうかを評価するために、ｍｉＲＮＡ－１９６ａ２スキャフォールド（ＳＭＡＲＴｖｅｃｔｏｒ^ＴＭ ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ ａｄａｐｔｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ラファイエット、コロラド州、米国）から以前に同定されたＣＤ２４７（ＴＣＲサブユニット）標的ｓｈＲＮＡを発現させたところ、新しいコンストラクトのｍｉＲＮＡスキャフォールドの長さが異なった。元のコンストラクトは２６３の核酸を有し、短縮された２つのコンストラクトはそれぞれ１５０の核酸または１１１の核酸を使用した。切断型の（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＣＤ１９マーカーによって示されるように、すべてのウイルスベクターは、程度の差はあるものの初代Ｔ細胞を形質導入することができ（図１）。しかし、ＴＣＲまたはＣＤ３Ｅタンパク質のノックダウンの程度は、３つのコンストラクトすべてで同等であった。これは、最小のｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡスキャフォールドでも、長いｍｉＲＮＡスキャフォールドと同程度にＴＣＲ／ＣＤ３複合体の発現を抑えることができることを示している。

実施例２.様々なＣ５２標的ｓｈＲＮＡのスクリーニング
様々なＣＤ５２標的ｓｈＲＮＡの効率を比較するために、以前ＣＤ２４７で使用したものと同一のバックボーン構造を使用し、ｓｈＲＮＡの標的配列のみを交換し、ＣＤ２４７標的配列の代わりにＣＤ５２標的配列を配置した。レトロウイルスベクターを用いて初代Ｔ細胞にｓｈＲＮＡを導入し、切断型のＣＤ１９（ｔＣＤ１９）マーカーで追跡することができた。レトロウイルスベクターのｍｉＲＮＡスキャフォールドに、様々なＣＤ５２標的ｓｈＲＮＡをクローニングした。ＣＤ５２のノックダウンの程度は、細胞培養の８日目に評価した。すべてのコンストラクトは、ＣＤ１９の発現によって測定されるように、初代Ｔ細胞を形質導入することができた（図２）。しかし、ＣＤ５２のノックダウンの程度は、試験した４つのｓｈＲＮＡで異なっていた。ＣＤ５２の発現をノックダウンすることを考えると、ｓｈＲＮＡ－３が最も効率的であり、次いでｓｈＲＮＡ－１とｓｈＲＮＡ－２であった。対照的に、ｓｈＲＮＡ－４はＣＤ５２発現の減少を示さなかった（図２）。

このｓｈＲＮＡのノックダウン効率が、異なるドナー間で異なるかどうかを評価するために、３体の異なるドナーのＴ細胞をＭｏｃｋコンストラクトまたはＣＤ５２ ｓｈＲＮＡ－３を発現させたコンストラクトで形質導入した（図３）。３体のドナーすべてにおいて、ｓｈＲＮＡ－３はＣＤ５２の有意かつ一貫したノックダウンを示し（図３）、同定されたｓｈＲＮＡにより、ＣＤ５２の一貫しドナーに依存しないノックダウンがもたらされることが示された。

実施例３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＣＤ５２ノックアウトのためのｇＲＮＡのスクリーニング
ＣＤ５２および／またはＴＣＲ／ＣＤ３複合体の発現抑制のための陽性対照を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いてそれぞれのノックアウトＴ細胞を生成した。ＣＤ５２欠損Ｔ細胞を効率的に生成するものを特定するために、様々なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計し、評価した（図４）。３つのｇＲＮＡのうち２つはＣＤ５２ノックアウト細胞を生成することができ（図４でＣＤ５２．１．ＡＡと示されているｇＲＮＡ－１、および図４でＣＤ５２．２．ＡＥと示されているｇＲＮＡ－３）、ＣＤ５２ｇＲＮＡ－１ではＣＤ５２欠損細胞の頻度がわずかに高かった。

実施例４．標的ノックダウンに対するｍｉＲＮＡスペーサーの効果
ＤＲＯＳＨＡ複合体による、転写されたＲＮＡからのｍｉＲＮＡの効率的なプロセシングは、効率的な標的ノックダウンにとって重要である。以前のデータでは、ｍｉＲＮＡをベースにしたｓｈＲＮＡは、ＣＡＲをコードするベクターと効率的に共発現し、ベクターからｍｉＲＮＡ機構によってプロセシングされることが明らかになっている。さらに、複数のｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ（例：２、４、６、８．．．）を同じベクターから共発現できるＣＡＲ発現ベクターを生成することが望ましい（図５）。しかし、これまでの研究で、複数のｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡを共発現させると、ｓｈＲＮＡの活性が失われることが示されている。このように、単一の発現ベクターから複数の標的をノックダウンするためには、効率的なｍｉＲＮＡのプロセシングが重要である。

共発現させた２つのｓｈＲＮＡの活性を最適化するために、サイズだけでなく、２つのｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ間のリンカーの配列やｍｉＲＮＡのスキャフォールドがｓｈＲＮＡの活性に影響するという仮説を立てた。ｓｈＲＮＡのプロセシングを最適化するために、様々なｓｈＲＮＡリンカーが２つの標的遺伝子ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）とＣＤ５２のノックダウンに与える影響を評価した。天然のヒトｍｉＲ－１７－９２クラスターに由来するスペーサー配列をもとに、５つの異なるスペーサーを設計した。この５つの異なるスペーサーを、ＢＣＭＡ ＣＡＲのコンテキストにおいてＣＤ２４７とＣＤ５２のｓｈＲＮＡの間にクローニングした。対照としてｔＣＤ３４(Ｍｏｃｋ)とＢＣＭＡ－ＣＤ２４７ｓｈＲＮＡベクターを用いて、異なるコンストラクトでＴ細胞を形質導入した結果を図６に示す。マルチプレックス１は、ｌｌｌｂｐ ＣＤ２４７ ｓｈＲＮＡとｌｌｌｂｐ ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡの間にスペーサーを含まない。マルチプレックス２は、ｍｉＲ－１７－９２クラスターにおけるｍｉＲ－１７とｍｉＲ－１８ａの間にある４３ｂｐの自然発生的なスペーサーを含んでいた。マルチプレックス３には、ｍｉＲ－１７－９２クラスターにおけるｍｉＲ－１９ａとｍｉＲ－２０ａの間のスペーサー領域に相当する９２ｂｐのスペーサーが含まれている。マルチプレックス４には、ｍｉＲ－１７－９２クラスターにおけるｍｉＲ－２０ａとｍｉＲ－１９ｂｌの間のスペーサー領域に対応する５６ｂｐのスペーサーが含まれている。マルチプレックス５は、２９ｂｐのランダムなＴＡリッチスペーサー領域を含んでいる。ｓｈＲＮＡを含むすべてのコンストラクトは、収集時に低いながらも同等の形質導入効率を示した。また、ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現は、複数のｓｈＲＮＡの発現によってわずかに影響を受けるだけであった（図６）。ＣＤ５２およびＴＣＲのノックダウンを評価したところ、すべてのコンストラクトが同等のレベルでＴＣＲおよびＣＤ５２の発現を低下させることができることが示された。２つのヘアピンの間にスペーサーがない最初のマルチプレックスコンストラクトだけが、他のコンストラクトと比較してＴＣＲに対するノックダウン活性（ＣＤ５２に対するノックダウン活性はない）がわずかに低かったが、それでも発現を非常によく減少させることができた（図６）。

実施例５．マルチプレックス化および単一のｓｈＲＮＡの比較
次に、２つのｓｈＲＮＡをマルチプレックス化した場合の効果と、ＣＤ２４７とＣＤ５２の単一ｓｈＲＮＡを発現させた場合の効果を直接比較することを目的とした。ＲＮＡ発現解析では、マルチプレックス化ｓｈＲＮＡは、それぞれの単一のｓｈＲＮＡと同様にＣＤ５２またはＣＤ２４７を効率的にダウンレギュレートすることがわかった（図７)。

別の対照として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、２つの異なるｇＲＮＡを用いてＣＤ５２とＣＤ２４７を同時に標的にした。収集時に、ＣＤ２４７ ｓｈＲＮＡまたはｇＲＮＡを含む細胞は、さらなる分析の前にＴＣＲ陽性細胞を枯渇させた。ＴＣＲおよびＣＤ５２の発現をフローサイトメトリーで評価し、単一またはマルチプレックスのｓｈＲＮＡを形質導入した細胞のタンパク質発現を比較した（図８および９）。単一のＣＤ２４７ ｓｈＲＮＡは、ＴＣＲの発現を減少させることができた（図８および９）。ＴＣＲ表面発現の減少は、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９を介したＣＤ２４７のノックアウトと同等であった。同様に、単一のＣＤ５２ ｓｈＲＮＡは、ＣＤ５２の発現を減少させることができた（図８および９）。異なるリンカーを有する２つのマルチプレックス化ｓｈＲＮＡコンストラクト（実施例４参照）は、いずれも単一のｓｈＲＮＡと同程度のＴＣＲノックダウンを示した。同様に、ＣＤ５２の発現は、単一またはマルチプレックス化ｓｈＲＮＡコンストラクトによって、同じ程度に減少した（図８および９）。

実施例６.ＣＡＲの発現および細胞の分化能
ＣＡＲの発現および機能性に対する１つまたは複数のｓｈＲＮＡの共発現の影響を評価するために、ＢＣＭＡ－ＣＡＲの発現をフローサイトメトリーで評価した。細胞をＢＣＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質で染色し、続いて二次ＰＥ結合抗体で染色した。図１０に示すように、ＣＡＲの発現はすべてのグループで同様であったことから、これらのマルチプレックス化ｓｈＲＮＡはＣＡＲの発現レベルに影響を与えていないことがわかった。さらに、ＢＣＭＡ陽性の癌細胞株であるＲＰＭＩ－８２２６、ＯＰＭ－２、Ｕ２２６に対するＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞の機能的活性を評価した（図１０）。この目的のために、上清中のＩＦＮγレベルを評価する前に、Ｔ細胞を癌細胞と２４時間共培養した。Ｔ細胞単独ではＩＦＮγを産生しなかったが、ＢＣＭＡを発現した癌細胞と共培養すると、すべてのグループのＴ細胞で同等のＩＦＮγ産生が見られた。このように、１つまたは複数のｓｈＲＮＡを共発現させても、ＣＡＲの発現、または癌細胞株に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的活性には影響しない。

実施例７．マイトジェン性刺激に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的反応
次に、マイトジェン性ＴＣＲ刺激に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の反応性を評価した。この目的のために、Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３）の濃度を増加させて刺激し、２４時間後にＩＦＮγ産生を測定した。Ｍｏｃｋを形質導入した細胞は、ＯＫＴ３の活性化後に高レベルのＩＦＮγを産生した。同様に、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを単独で、またはＣＤ５２ ｓｈＲＮＡと組み合わせて共発現させても、ＴＣＲ活性化刺激に反応するＴ細胞の能力は低下しなかった。しかし、ＣＤ２４７ ｓｈＲＮＡを単独で、またはマルチプレックスに共発現させると、ＴＣＲの機能的応答がＣＩＲＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＣＤ２４７ゲノム編集対照細胞のレベルまで著しく低下した（図１１）。このように、マルチプレックス化ｓｈＲＮＡは、単一ｓｈＲＮＡ対照細胞やゲノム編集したＴ細胞と同様に、ＴＣＲの機能を阻害するのに有効である。

実施例８.ＣＤ５２の機能的阻害
次のステップとして、単一またはマルチプレックス化ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡの発現が、抗ＣＤ５２抗体の存在下でのＴ細胞の補体依存性死滅にどのように影響するかを評価することを目的とした。この目的のために、Ｔ細胞を抗ＣＤ５２抗体（アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ））または対照ＩｇＧ抗体の存在下で補体と一緒に培養した。４時間後、細胞数を測定した。ＭｏｃｋおよびＢＣＭＡ－ＣＡＲを形質導入したＴ細胞は、アレムツズマブの存在下で補体系によって効率的に標的とされた（図１２）。しかし、単一およびマルチプレックス化ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡはいずれも、ＣＤ５２を介した死滅を防ぐことができた。

実施例９.２つを超える標的のマルチプレックス化
次に、４つのｓｈＲＮＡをマルチプレックス化することの実現可能性を評価した。これを評価するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞に、β２ｍ、ＤＧＫ、ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）、ＣＤ５２を標的とする単一またはマルチプレックス化したｓｈＲＮＡと、レンチウイルスバックボーンを使用し反復ｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールドを使用する第２世代ＣＤ１９ＣＡＲおよび選択マーカーを形質導入した。導入後７日目にマーカー特異的な磁気ビーズを用いてシングルステップ富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を行った。細胞を、ｑＲＴ－ＰＣＲによるｓｈＲＮＡ標的の発現について分析した。ｓｈＲＮＡを介した４つの標的の転写発現のダウンレギュレーションは、マルチプレックスとそれぞれの単一ｓｈＲＮＡの間で同等であった（図１３）。

Ｊｕｒｋａｔ細胞の次に、初代Ｔ細胞を、ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターに導入されたＣＤ２４７、β２ｍおよびＣＤ５２を標的とする３×ｓｈＲＮＡまたは６×ｓｈＲＮＡのいずれかを含む第２世代ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した（図１４）。簡潔に言うと、健康なドナーからの初代Ｔ細胞を、第２世代のＣＤ１９指向性ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターと、１０６ａ－３６３ｍｉＲＮＡクラスターの最後の３つのｍｉＲ（ｍｉＲ－１９ｂ２、ｍｉＲ－９２ａ２、ｍｉＲ－３６３）に導入されたＣＤ２４７、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２を標的とする３ｓｈＲＮＡ、またはクラスターの６つのｍｉＲスキャフォールドの中の同じ３つの遺伝子を標的とする６ｓｈＲＮＡ（この場合、ＣＤ２４７を標的とする２つのｓｈＲＮＡは異なる）とともに、切断型のＣＤ３４選択マーカーを形質導入した。簡潔に言うと、ｓｈＲＮＡは６－プレックス、３－プレックス、または対照としてｓｈＲＮＡなし（ｔＣＤ３４）で発現させた。導入２日後、ＣＤ３４特異的磁気ビーズを用いて細胞を富化し、さらにＩＬ－２（１００ｌＵ／ｍＬ）で６日間増幅した。ＣＤ２４７、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２のｍＲＮＡ発現を、ハウスキーピング遺伝子としてシクロフィリンを用いてｑＲＴ－ＰＣＲで評価した。

マルチプレックス化したｓｈＲＮＡは、すべての標的遺伝子に対して効率的なＲＮＡノックダウンレベルをもたらした。６つのマルチプレックス化ｓｈＲＮＡ（各タンパク質標的に対して２つのｓｈＲＮＡ）を組み込んだ場合、３つのマルチプレックス化ｓｈＲＮＡ（各タンパク質標的に対して１つのｓｈＲＮＡ）と比較して、より高いＲＮＡノックダウンレベルが得られた（図１４）。

実施例１０．ｉＰＳＣ細胞における標的のマルチプレックスノックダウン
他の免疫細胞におけるマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のノックダウンを調査するために、次にマルチプレックス化をｉＰＳ細胞で評価した。長い（４１ｂｐ）または最小（６ｂｐ）リンカーのいずれかによって分離された２つのｓｈＲＮＡ（β２ｍおよびＤＧＫａに対して）が、ヒトｉＰＳＣ細胞株ＳＣｉＰＳ－Ｒ１で発現された。形質導入は、５０μｌまたは５００μｌのウイルス上清を用いて行った。マルチプレックス化したｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡなしで形質導入された細胞と比較した場合、リンカーのサイズや使用したウイルス上清の量に関係なく、効率的なＲＮＡノックダウンレベルをもたらした（図１５、図１６）。

Claims (20)

1. 目的のタンパク質をコードする第１外因性核酸分子、および、
   少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をコードする第２核酸分子、を含む、改変された細胞。
2. 改変された免疫細胞である、請求項１に記載の改変された細胞。
3. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞、前駆細胞、およびｉＰＳＣ細胞から選択される、請求項１または２に記載の改変された細胞。
4. 前記目的のタンパク質が、受容体、特にキメラ抗原受容体またはＴＣＲである、請求項１から３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
5. 第１および第２核酸分子が、例えば、真核生物発現プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、またはウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびセンダイウイルスに由来する）である１つのベクター中に存在する、請求項１から４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
6. 前記少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が、１つのプロモーターの制御下にある、請求項１から５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
7. 前記プロモーターが、Ｕ６プロモーターではない、請求項６に記載の改変された細胞。
8. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＥＦｌαプロモーター（コアまたは全長）、ＰＧＫプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＵｂＣプロモーター、ＳＦＦＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＩＬ２－プロモーター、ＭＳＣＶ ＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、ＧＡＬＶ ＬＴＲおよびｔＲＮＡプロモーターから選択されるＰｏｌ ＩＩプロモーターである、請求項６に記載の改変された細胞。
9. 前記少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が、ｍｉＲＮＡ分子である、請求項１から８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
10. 前記ｍｉＲＮＡ分子が、１つのプロモーターの制御化にある１つのｍｉＲＮＡスキャフォールドである、請求項９に記載の改変された細胞。
11. 前記ｍｉＲＮＡ分子の少なくとも１つが、ｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールド配列、またはｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターからのスキャフォールド配列を含む、請求項９に記載の改変された細胞。
12. 前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ分子のすべてが、ｍｉＲ－スキャフォールド配列、好ましくはｍｉＲ－１９６ａ２スキャフォールド配列またはｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターからのスキャフォールド配列を含む、請求項１１に記載の改変された細胞。
13. 前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうち少なくとも２つが、同じ標的を対象としている、請求項１から１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
14. 前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも２つが同一である、請求項１３に記載の改変された細胞。
15. 前記少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のすべてが、異なっている、請求項１から１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
16. 前記少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のすべてが、異なる標的を対象としている、請求項１５に記載の改変された細胞。
17. 前記少なくとも２つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子によって標的とされる分子が、ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、ＭＨＣコレセプター遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ）、ＴＣＲ鎖、ＮＫＢＢｉＬ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＬＴＢ、ＬＳＴ１、ＮＣＲ３、ＡＩＦ１、ＬＹ６、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ）、補体カスケード、調節受容体（例えば、ＮＯＴＣＨ４）、ＴＡＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＲＩＮＧ１、ＣＤ５２、ＣＤ２４７、ＨＣＰ５、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、２Ｂ４、Ａ２ＡＲ、ＢＡＸ、ＢＬＩＭＰ１、Ｃ１６０（ＰＯＬＲ３Ａ）、ＣＢＬ－Ｂ、ＣＣＲ６、ＣＤ７、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＤＧＫ［ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＫＧＧ、ＤＧＫＨ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ］、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＧＲ２、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＳＮ、ＧＭＣＳＦ、ＨＰＫ１、ＩＬ－１０Ｒ［ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ］、ＩＬ２、ＬＦＡ１、ＮＥＡＴ１、ＮＦｋＢ（ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＮＦｋＢ２、ＮＦｋＢｌ、ＲＥＬを含む）、ＮＫＧ２Ａ、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３を含む）、ＰＤ１、ＰＩ３ＫＣＤ、ＰＰＰ２ＲＤ２、ＳＨＩＰ１、ＳＯＡＴ１、ＳＯＣＳ１、Ｔ－ＢＥＴ、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＯＸ、およびＺＦＰ３６Ｌ２から選択される、請求項１から１６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
18. 医薬品として使用するための、請求項１から１７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
19. 癌の治療に使用するための、請求項１から１８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
20. 請求項１から１７のいずれか１項に記載の適切な用量の細胞を、それを必要とする対象に投与することにより、少なくとも１つの症状を改善することを含む、癌を治療するための方法。

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