JP2024516283A - 改善されたキメラ及び改変スカフォールド並びにマルチプレックス阻害ｒｎａのクラスター - Google Patents

改善されたキメラ及び改変スカフォールド並びにマルチプレックス阻害ｒｎａのクラスター Download PDF

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Abstract

本願は、ＲＮＡ干渉の分野に関し、さらに詳細には、養子細胞療法（ＡＣＴ）などの免疫療法で適用されるＲＮＡ干渉に関する。ここでは、複数の標的を下方調節するように設計された複数のｓｈＲＮＡスカフォールドのキメラクラスターが提案されている。また、ポリヌクレオチド、ｓｈＲＮＡを含むベクター、及びかかるｓｈＲＮＡを、単独で、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）若しくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの対象のタンパク質と組み合わせて発現する細胞も提案されている。これらの細胞は、免疫療法での使用に特に適している。

Description

本願は、ＲＮＡ干渉の分野に関し、さらに詳細には、養子細胞療法（ＡＣＴ）などの免疫療法で適用されるＲＮＡ干渉に関する。ここでは、複数の標的を下方調節するように設計された複数のｓｈＲＮＡスカフォールドのキメラクラスターが提案されている。また、ポリヌクレオチド、ｓｈＲＮＡを含むベクター、及びかかるｓｈＲＮＡを、単独で、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）若しくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの対象のタンパク質と組み合わせて発現する細胞も提案されている。これらの細胞は、免疫療法での使用に特に適している。
形質導入が困難な細胞において効率的な方法で複数の標的を同時に下方調節することは既知の問題である。マルチプレックスゲノムエンジニアリング法は多くの場合、面倒である。マルチプレックス化ゲノムエンジニアリングで直面する問題を解決しようとする場合、遺伝子ノックアウトの代わりにノックダウンの可能性を提供するシステムが検討される可能性があり、これにより柔軟性が高まる（例えば、一時的調節が可能になる）。理想的には、これらのシステムはそれほど煩雑ではなく（標的ごとに個別のタンパク質を改変する必要がないように、又は単一の形質導入ステップで下方調節を達成できるように）、充分に効率的かつ特異的である必要がある。
考えられる解決策の一つはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。植物及び動物にはいくつかのＲＮＡｉ遺伝子調節機構が存在する。一つ目は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）と呼ばれる小さな非コーディングＲＮＡの発現によるものである。ｍｉＲＮＡは、特定のメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）を標的として分解でき、それによって遺伝子サイレンシングを促進する。
遺伝子活性の調節におけるｍｉｃｒｏＲＮＡ経路の重要性から、研究者らは現在、人工的に設計された分子である低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）がＲＮＡｉをどの程度媒介できるかを探求している。ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡなどの標的分子の切断を引き起こすことができ、ｍｉＲＮＡと同様に、標的分子を認識するために、ｓｉＲＮＡは塩基の相補性に依存する。
ｓｉＲＮＡとして知られる分子のクラスには、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）が含まれる。ｓｈＲＮＡは、センス領域と、前記センス領域とハイブリダイズできるアンチセンス領域とを含む一本鎖分子である。ｓｈＲＮＡは、ステム及びループ構造を形成でき、前記センス領域と前記アンチセンス領域とが前記ステムの一部又は全部を形成している。ｓｈＲＮＡを使用する利点の一つは、それらが、単一ユニットとして、又は多成分システムの一部としてのいずれかで組み込むことができる個別の単一体として送達又は転写できることであるが、ｓｉＲＮＡが二つの別の鎖を有する場合は、いずれも合理的には不可能である。しかしながら、他のｓｉＲＮＡと同様に、依然として、ｓｈＲＮＡは、塩基の相補性にもとづいてｍＲＮＡを標的とする。
多くの状態、疾患、及び障害は、複数のタンパク質の相互作用によって引き起こされる。その結果、研究者たちは複数のｓｉＲＮＡを細胞や生物に同時に送達する効果的な方法を模索している。
送達オプションの一つは、ｓｈＲＮＡが内因性ｍｉＲＮＡ経路によってプロセッシングされる細胞内でｓｈＲＮＡを発現させるためのベクター技術の使用である。ｓｈＲＮＡごとに別のベクターを使用するのは面倒な可能性がある。その結果、研究者たちは複数のｓｈＲＮＡを発現できるベクターの使用を模索し始めた。残念なことに、報告されている文献には、単一のベクターから複数のｓｈＲＮＡを発現させる場合のいくつかの課題が記載されている。研究者たちが直面している問題には次のようなものがある。（ａ）ベクターの組換えやｓｈＲＮＡ発現の損失のリスク、（ｂ）マルチプレックスカセット中の位置効果によるｓｈＲＮＡの機能低下（例えば二次構造の結果として）、（ｃ）ｓｈＲＮＡクローニングの複雑さ、（ｄ）ＲＮＡｉプロセッシングの飽和、（ｅ）細胞毒性、（ｆ）望ましくないオフターゲット効果。
さらに、ｓｉＲＮＡは、ある種の形質転換された哺乳類細胞株における短期間の遺伝子阻害に有効であることが示されているが、初代細胞培養や安定した転写物のノックダウンに使用することは、より一層困難であることが判明している。ノックダウンの有効性には大きなばらつきがあることが知られており、１０％超から９０％未満の間である（例えばＴａｘｍａｎら、２００６年）ので、さらなる最適化が必要である。典型的には、複数の阻害剤が発現されると有効性が低下するため、このような状況ではこの最適化がなお一層重要になる。
Taxman DJ, Livingstone LR, Zhang J, Conti BJ, locca HA, Williams KL, Lich JD, Ting JP, Reed W. Criteria for effective design, construction, and gene knockdown by shRNA vectors. BMC Biotechnol. 2006 Jan 24;6:7.
そのため、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子を送達するための効率的なカセットやベクターを開発する必要性が残っている。これは細胞用途一般に当てはまるが、ＡＣＴの分野ではあまり研究されておらず、これらの細胞では効率的なシステムに対する必要性が高い。
したがって、当該技術分野では、多段階産生方法を必要としない標的のマルチプレックス化ノックダウンによる細胞治療を可能にし（したがって、製造が比較的容易になり、コストが削減される）、（例えば、変化を可逆的にすることによって、ノックダウンの減衰を可能にする（例えば、毒性を回避するため）、又はあるターゲットを別のターゲットに交換することによって）柔軟性を提供するシステムを提供する必要がある。
（発明の概要）
驚くべきことに、本明細書では、ｍｉＲ－１７ｍｉＲＮＡファミリークラスター（すなわち、ｍｉＲ－１７－９２パラログのうちの一つ）のスカフォールド、特にマルチプレックス化スカフォールド、特に、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター、ｍｉＲ－１７～９２クラスター、ｍｉＲ１０６ｂ－２５クラスター及びそれらの組み合わせ、特にそれらのキメラ組み合わせでみられるようなスカフォールドを使用することによって、ｓｈＲＮＡが、細胞において、特に改変免疫細胞において、うまくマルチプレックス化できるだけでなく、複数の標的も非常に効率的に下方調節されることが証明されている。キメラ組み合わせは、キメラクラスター（これら三つの異なるクラスター由来のスカフォールドを使用して、新しいクラスターを作製する）若しくはキメラスカフォールド（スカフォールドの少なくとも下側ステム部分が、上側ステム及び／又はループ部分とは異なるｍｉＲＮＡ由来である）、又は両者の組み合わせであり得る。
したがって、本発明の目的は、以下の項目で規定される。
１．改変スカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子であって、前記改変スカフォールドは、下側ステム領域と上側ステム／ループ領域とを含み、前記スカフォールドの前記下側ステム領域は、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドのものであり、前記スカフォールドの前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部は、野生型／天然配列とは異なるように改変されている、核酸分子。
２．前記改変スカフォールドの前記下側ステム領域が、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、ｍｉＲ－３６３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、項目１に記載の核酸分子。
３．前記改変スカフォールドがキメラスカフォールドであり、前記上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が、前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、項目１又は２に記載の核酸分子。
４．前記少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子が少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である、項目１～３のいずれか一つに記載の核酸分子。
５．異なるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子であって、前記少なくとも二つの異なるスカフォールドが、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドの下側ステム領域を有し、
少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子が、上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部がｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、キメラスカフォールドを有し、及び／又は、
前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子由来のスカフォールドが、異なるｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドである、核酸分子。
６．項目１～５のいずれか一つに記載の核酸分子を含む、改変免疫細胞における発現に適したベクター。
７．対象のタンパク質をコードする第一外因性核酸分子と、
改変スカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む第二核酸分子であって、前記スカフォールドの下側ステム領域が、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドのものであり、前記スカフォールドの上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が、野生型／天然配列とは異なるように改変されている、第二核酸分子と、を含む、改変細胞。
８．対象のタンパク質をコードする第一外因性核酸分子と、
異なるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む第二核酸分子であって、少なくとも二つの異なるスカフォールドが、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドの下側ステム領域を有する第二核酸分子と、を含み、
少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子が、上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部がｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、キメラスカフォールドを有し、及び／又は、
前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子由来のスカフォールドが、異なるｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドである、
改変細胞。
９．改変免疫細胞である、項目７又は８に記載の改変細胞。
１０．前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、幹細胞、前駆細胞、及びｉＰＳＣ細胞から選択される、項目９に記載の改変免疫細胞。
１１．前記対象のタンパク質が、受容体、特にキメラ抗原受容体又はＴＣＲである、項目７～１０のいずれか一つに記載の改変細胞。
１２．前記少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子が、一つのプロモータの制御下の少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である、項目７～１１のいずれか一つに記載の改変細胞。
１３．前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が少なくとも三つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である、項目１２に記載の改変細胞。
１４．前記少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子によって標的とされる分子が、ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、ＭＨＣ共受容体遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ）、ＴＣＲ鎖、ＮＫＢＢｉＬ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＬＴＢ、ＬＳＴ１、ＮＣＲ３、ＡＩＦ１、ＬＹ６、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ）、補体カスケード、制御受容体（例えば、ＮＯＴＣＨ４）、ＴＡＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＲＩＮＧ１、ＣＤ５２、ＣＤ２４７、ＨＣＰ５、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、２Ｂ４、Ａ２ＡＲ、ＢＡＸ、ＢＬＩＭＰ１、Ｃ１６０（ＰＯＬＲ３Ａ）、ＣＢＬ－Ｂ、ＣＣＲ６、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（ａｋａ Ｂ７－Ｈ３）、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ４、ＤＧＫ［ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＫＧＧ、ＤＧＫＨ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ］、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＧＲ２、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＳＮ、ＧＭＣＳＦ、ＨＰＫ１、ＩＬ－１０Ｒ［ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ］、ＩＬ２、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＬＦＡ１、ＮＥＡＴ１、ＮＦｋＢ（ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＮＦｋＢ２、ＮＦｋＢｌ、ＲＥＬを含む）、ＮＫＧ２Ａ、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３を含む）、ＰＤ１、ＰＩ３ＫＣＤ、ＰＰＰ２ＲＤ２、ＰＲＡＳ４０、ＲＡＰＴＯＲ、ＳＨＩＰ１、ＳＯＡＴ１、ＳＯＣＳ１、Ｔ－ＢＥＴ、ＴＣＦ７（ａｋａ ＴＣＦ－１）、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３（ａｋａ ＨＡＶＣＲ２又はＣＤ３６６）、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、ＶＩＳＴＡ（ａｋａ ＶＳＩＲ又はＢ７－Ｈ５）、ＺＣ３Ｈ１２Ａ（レグナーゼ１又はＭＣＰＩＰとしても知られる）及びＺＦＰ３６Ｌ２から選択される、項目１～５のいずれか一つに記載の核酸分子、項目６に記載のベクター、又は項目７～１３のいずれか一つに記載の改変細胞。
１５．薬剤として使用するための、項目１～５のいずれか一つに記載の核酸分子、項目６に記載のベクター、又は項目７～１４のいずれか一つに記載の改変細胞。
１６．がんの治療で使用するための、項目１～５のいずれか一つに記載の核酸分子、項目６に記載のベクター、又は項目７～１４のいずれか一つに記載の改変細胞。
１７．がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に対して適切な用量の項目７～１４のいずれか一つに記載の細胞を投与し、それによって少なくとも一つの症状を改善することを含む、方法。
１８．前記下側ステム領域及び／又は３´及び／又は５´側からこの領域に隣接する最大１０個のヌクレオチドが野生型／天然配列とは異なるように改変されている、項目１～５のいずれか一つに記載の核酸分子又は項目６に記載のベクター。
したがって、本発明の目的は、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターにおいて存在するものから選択されるスカフォールド、特に、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、及びｍｉＲ－３６３スカフォールドから選択されるスカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸配列を含むベクターを提供することである。特定の実施形態によると、ベクターは、真核細胞、特に免疫細胞における発現に適している。前記ＲＮＡ干渉分子は、典型的には、野生型／天然スカフォールド配列において存在しない標的配列も含む。典型的には、これは、ｍｉｃｒｏＲＮＡスカフォールドにおける前記野生型／自然起源の標的配列（典型的には、成熟配列と呼ばれる）を最適な標的配列、例えば、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列にマッチする標的配列で置換することによって達成される。最も詳細には、前記標的配列は１８～２３核酸の長さを有する。前記標的配列の相補鎖は、典型的には、パッセンジャー配列と呼ばれる。
具体的な実施形態によると、一つ以上のＲＮＡ干渉分子のスカフォールドのうちの少なくとも一つは、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－２０ｂスカフォールドから選択されるスカフォールドである。言い換えると、これらの具体的な実施形態によると、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスターの最初の三つのスカフォールドにおいて存在するものから選択されるスカフォールド、すなわち、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－２０ｂスカフォールドから選択されるスカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子をコードする核酸配列を含むベクターが提供される。例えば、少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子はｍｉＲ－１０６ａスカフォールドを有する可能性があり、一方、他のＲＮＡ干渉分子は、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、及びｍｉＲ－３６３スカフォールドから独立して選択されるスカフォールドなどの、独立して選択されるスカフォールドを有し得る。
特定の実施形態によると、複数のＲＮＡ干渉分子がベクター中に存在するであろう。これらの実施形態によると、少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子は、したがって、少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子であり、特に少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である。したがって、これらの実施形態によると、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター、ｍｉＲ－１７～９２クラスター、及びｍｉＲ１０６ｂ－２５クラスターにおいて存在するものから選択されるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子をコードする核酸配列を含むベクターが提供される。特に、前記スカフォールドのうちの少なくとも一つはキメラ（前記スカフォールドの下側ステム領域は、前記スカフォールドの上側ステム及び／又はループ領域とは異なるｍｉＲＮＡスカフォールド由来である）であり、最も詳細には、前記スカフォールドの前記上側ステム及びループ領域は、ｍｉＲ－１７ファミリーのスカフォールド由来である。別の（ただし、排他的ではない）実施形態によると、前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子は、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター、ｍｉＲ－１７～９２クラスター、及びｍｉＲ１０６ｂ－２５クラスターから選択される少なくとも二つの異なるクラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドから選択されるスカフォールドを有する。言い換えると、前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子は、以下の三つの群：ｍｉＲ－１０６ａスカフォールドとｍｉＲ－２０ｂスカフォールド；ｍｉＲ－１７スカフォールドとｍｉＲ－２０ａスカフォールド；ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールドとｍｉＲ－９３スカフォールドのうちの少なくとも二つから選択されるスカフォールドを有する。
少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が存在する場合、これら二つ以上の分子は同一又は異なるスカフォールドを有し得る。しかしながら、前記スカフォールドのうちの三つ以下が同一であることが特に想定され、なお一層詳細には、二つ以下の同一のスカフォールドを使用することが想定される。これは、同一のスカフォールド配列間の組換えを回避するためである（実施例５を参照）。この理由から、上で概説したように、キメラクラスター及び／又はキメラスカフォールド配列を有するクラスターを使用することが特に想定される。
具体的な実施形態によると、前記ベクターにおいて存在する前記スカフォールドは、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター、ｍｉＲ－１７～９２クラスター、及びｍｉＲ１０６ｂ－２５クラスターにおいて存在する１５のスカフォールドから排他的に選択される（すなわち、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、ｍｉＲ－３６３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される）。上で概説したように、これらはまたキメラスカフォールドであり得、下側ステム部分は、これら１５個のスカフォールドのうちの一つから選択され、上側ステム及びループ部分は、ｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドから選択される（すなわち、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－９３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、及びｍｉＲ－１０６ｂスカフォールドから選択される）。しかしながら、これらを異なるスカフォールド配列、特にｍｉＲ－１９６ａ２配列などの異なる関連のない配列（組換えを回避するため）とさらに組み合わせることも想定される。
特定の実施形態によると、スカフォールド配列は、ステム領域におけるミスマッチ及び／又はバルジの数を減少させるように改変され得る。より詳細には、使用される前記スカフォールド配列のうちの一つがｍｉＲ－１８ｂスカフォールドである場合、前記スカフォールドは、前記ステム領域中のミスマッチ及び／又はバルジの数を減らすように改変され得る（そして、野生型／天然配列と比べて修飾される）（実施例３を参照）。
さらなる態様によると、本明細書では、異なるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子を含む改変細胞であって、前記少なくとも二つの異なるスカフォールドがｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドの下側ステム領域を有し、少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子が、前記上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域のうちの前記少なくとも一部がｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、キメラスカフォールドを有し、及び／又は前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子由来の前記スカフォールドが、異なるｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドである、改変細胞が提供される。
前記ＲＮＡ干渉分子は、典型的には、前記野生型／天然スカフォールド配列において存在しない標的配列も含む。この目的のために、各ｍｉＲＮＡスカフォールドの成熟配列を最適の標的配列で置換する。前記標的配列は、典型的には、１８～２３核酸の長さを有する。前記標的配列は、改変細胞中に存在する配列、特に標的の配列に対するものであることが特に想定される。すなわち、少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子は、下方調節されるタンパク質をコードする改変細胞における配列を（塩基対相補性により）標的とする配列を有する。
さらなる実施形態によると、
対象のタンパク質をコードする第一外因性核酸分子と、
改変スカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む第二核酸分子であって、前記スカフォールドの下側ステム領域がｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドのものであり、前記スカフォールドの上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が、野生型／天然配列とは異なるように改変されている、第二核酸分子と、を含む改変細胞が提供される。
さらなる実施形態によると、前記改変細胞は、
対象のタンパク質をコードする第一外因性核酸分子
異なるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む第二核酸分子であって、前記少なくとも二つの異なるスカフォールドが、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドの下側ステム領域を有し、少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子がキメラスカフォールドを有し、上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が、前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部は、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択され、及び／又は前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子由来の前記スカフォールドは、異なるｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドである、第二核酸分子を含む。
前記第一及び第二の外因性核酸分子は一つのベクターとして提供できることを理解されたい。或いは、別々の核酸分子とし提供することもできる。
特定の実施形態によると、前記少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子は、前記スカフォールドの前記野生型／天然標的配列とは異なる（すなわち、前記ｍｉＲＮＡスカフォールドの成熟鎖とは異なる）スカフォールド内に標的配列を含む。前記標的配列は、典型的には１８～２３ヌクレオチド長である。特定の実施形態によると、前記ＲＮＡ干渉分子は、前記標的配列の塩基対相補性によって改変された細胞中の標的に対して向けられる。
少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が存在する場合、これら二つ以上の分子は、同一か又は異なるスカフォールドを有し得る。しかしながら、前記スカフォールドのうちの三つ以下が同一であることが特に想定され、なお一層詳細には、二つ以下の同一のスカフォールドを使用することが想定される。これは、同一のスカフォールド配列間の組換えを回避するためである（実施例５を参照）。
改変細胞は、特に、真核細胞であり、さらに詳細には、改変哺乳類細胞であり、さらに詳細には、改変ヒト細胞である。特定の実施形態によると、前記細胞は、改変免疫細胞である。典型的な免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、幹細胞、前駆細胞、及びｉＰＳＣ細胞から選択される。
特定の実施形態によると、改変細胞は、対象のタンパク質をコードする核酸をさらに含む。特に、この対象のタンパク質は受容体であり、特に、キメラ抗原受容体又はＴＣＲである。キメラ抗原受容体又は改変ＴＣＲは、任意の標的に対するものであり得、典型例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＡＧ７２が挙げられるが、これら以外にも多くのものが存在し、それらも好適である。特定の実施形態によると、一つ以上の対象のタンパク質が存在し得る。そのような場合、第二の（若しくはさらなる）タンパク質は受容体であり得るか、又は例えば、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、組織適合抗原（例えば、ＨＬＡ－Ｅ）、タグ、或いは治療若しくは診断的価値があるか、又は検出を可能にする任意の他のタンパク質であり得る。
特定の実施形態によると、前記第一及び第二核酸分子は、真核生物発現プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、又はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びセンダイウイルス由来）などの一つのベクター中に存在する。
前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、下方調節される標的分子の数や、前記マルチプレックス化分子を同時発現させる点での実用的考慮点に応じて、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、少なくとも六つ、少なくとも七つ、少なくとも八つ、少なくとも九つ、少なくとも十、又はさらにそれ以上の分子であり得る。特定の実施形態によると、少なくとも三つのマルチプレックス化ＮＡ干渉分子を使用する。さらなる特定の実施形態によると、前記少なくとも三つのＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも一つは、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド及びｍｉＲ－２０ｂスカフォールドから選択されるスカフォールドを有する。別の実施形態によると、前記少なくとも三つのＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも一つは、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド及びｍｉＲ－１８ｂスカフォールドから選択されるスカフォールドを有する。
特定の実施形態によると、スカフォールド配列は、ステム領域におけるミスマッチ及び／又はバルジの数を減少させるように改変され得る。より詳細には、使用される前記スカフォールド配列のうちの一つがｍｉＲ－１８ｂスカフォールドである場合、前記スカフォールドは、前記ステム領域中のミスマッチ及び／又はバルジの数を減らすように改変され得る（そして、野生型／天然配列と比べて修飾される）（実施例３を参照）。
「マルチプレックス」は、同一の種類の複数の分子、例えば複数のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックス内で、分子が同一の種類のもの（例えば、全てｓｈＲＮＡ）である場合、それらは同一であり得るか、又は異なる配列を含み得る。同一の種類の分子間には、本明細書中に記載するリンカーなどの介在配列が存在し得る。本発明のマルチプレックスの一例は、複数のタンデムｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックスは、一本鎖であり得るか、二本鎖であり得るか、又は一本鎖の領域と二本鎖の領域との両方を有し得る。
特定の実施形態によると、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が一つのプロモータの制御下にある。典型的には、このプロモータはＵ６プロモータではない。これは、このプロモータが、特に、高い発現レベルで毒性と関連しているからである。同一の理由で、Ｈ１プロモータ（Ｕ６よりも弱いプロモータ）又はさらにはＰｏｌＩＩＩプロモータ全般（ある特定の条件下では適している可能性があるが）を除外することを検討できる。具体的な実施形態によると、前記プロモータは、ＰｏｌＩＩプロモータ、及びＰｏｌＩＩＩプロモータから選択される。特定の実施形態によると、前記プロモータは、野生型／天然又は合成ＰｏｌＩＩプロモータである。特定の実施形態によると、前記プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ（コア又は完全長）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、上流ＣＭＶ ＩＶエンハンサを有する複合ベータアクチンプロモータ（ＣＡＧプロモータ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモータ、脾限定巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、インターロイキン２プロモータ、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）長い末端反復配列（ＬＴＲ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ＬＴＲ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモータ、及びｔＲＮＡプロモータから選択されるＰｏｌＩＩプロモータである。これらのプロモータは、ｍＲＮＡ発現を駆動するために最も一般的に使用されるポリメラーゼＩＩプロモータの一つであり、一般的なハウスキーピング遺伝子プロモータも同様に使用できる。
特定の実施形態によると、少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、ｓｈＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ分子であり得る。最も詳細には、それらはｍｉＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡ分子とｍｉＲＮＡ分子との違いは、ｍｉＲＮＡ分子がＤｒｏｓｈａによってプロセッシングされるが、従来のｓｈＲＮＡ分子はプロセッシングされないことである（これは毒性と関連している、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４１：５３７－５４１（２００６））。
具体的な実施形態によると、異なるｍｉＲＮＡ分子が一つのプロモータの制御下にある。
特定の実施形態によると、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも二つは、同一の標的に対するものである。なお、同一の標的に対するＲＮＡ干渉分子であっても、異なるスカフォールド配列及び／又は異なる標的配列を有する可能性がある。さらなる具体的な実施形態によると、前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも二つは同一のスカフォールドを有するが、標的配列は異なる。別の具体的な実施形態によると、前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子の内の少なくとも二つは異なるスカフォールドを有するが、標的配列は同一である。具体的な実施形態によると、前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも二つは同一である。
別の実施形態によると、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子はすべて異なる。さらなる具体的な実施形態によると、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子はすべて異なる標的に対するものである。なお、異なる標的に対するＲＮＡ干渉分子であっても、同一のスカフォールドを有する可能性がある（ただし、標的配列は異なる）ことに留意されたい。
改変細胞に存在する任意の好適な分子を本ＲＮＡ干渉分子の標的とすることができる。想定される標的の典型例は以下のものである。ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、ＭＨＣ共受容体遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ）、ＴＣＲ鎖、ＣＤ３鎖、ＮＫＢＢｉＬ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＬＴＢ、ＬＳＴ１、ＮＣＲ３、ＡＩＦ１、ＬＹ６、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ）、補体カスケード、制御受容体（例えば、ＮＯＴＣＨ４）、ＴＡＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＲＩＮＧ１、ＣＤ５２、ＣＤ２４７、ＨＣＰ５、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、２Ｂ４、Ａ２ＡＲ、ＢＡＸ、ＢＬＩＭＰ１、Ｃ１６０（ＰＯＬＲ３Ａ）、ＣＢＬ－Ｂ、ＣＣＲ６、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（ａｋａ Ｂ７－Ｈ３）、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ４、ＤＧＫ［ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＫＧＧ、ＤＧＫＨ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ］、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＧＲ２、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＳＮ、ＧＭＣＳＦ、ＨＰＫ１、ＩＬ－１０Ｒ［ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ］、ＩＬ２、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＬＦＡ１、ＮＥＡＴ１、ＮＦｋＢ（ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＮＦｋＢ２、ＮＦｋＢｌ、ＲＥＬを含む）、ＮＫＧ２Ａ、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３を含む）、ＰＤ１、ＰＩ３ＫＣＤ、ＰＰＰ２ＲＤ２、ＰＲＡＳ４０、ＲＡＰＴＯＲ、ＳＨＩＰ１、ＳＯＡＴ１、ＳＯＣＳ１、Ｔ－ＢＥＴ、ＴＣＦ７（ａｋａ ＴＣＦ－１）、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３（ａｋａ ＨＡＶＣＲ２又はＣＤ３６６）、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、ＶＩＳＴＡ（ａｋａ ＶＳＩＲ又はＢ７－Ｈ５）、ＺＣ３Ｈ１２Ａ（レグナーゼ１又はＭＣＰＩＰとしても知られる）及びＺＦＰ３６Ｌ２。
ｍｉＲＮＡベースである特に好適な構築物が同定されている。したがって、ｍｉｃｒｏＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域を含むポリヌクレオチドを含む改変細胞が提供され、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域は、
一つ以上の人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列をコードする配列を含み、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、
ｍｉＲＮＡスカフォールド配列、
活性又は成熟配列、及び
パッセンジャー又はスター配列を含み、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列内で、前記活性配列は、前記パッセンジャー配列に対して少なくとも７０％相補性である。
特定の実施形態によると、前記活性配列は、前記パッセンジャー配列に対して少なくとも８０％相補性であり、前記パッセンジャー配列に対して少なくとも９０％又はそれ以上相補性であり得る。
特別な利点は、本発明のｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列はマルチプレックス化できることである。したがって、マルチプレックス化ｍｉｃｒｏＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域を含むポリヌクレオチドを含む改変細胞が提供され、前記マルチプレックス化ｍｉｃｒｏＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域は、
二つ以上の人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列をコードする配列を含み、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、
ｍｉＲＮＡスカフォールド配列、
活性又は成熟配列、及び
パッセンジャー又はスター配列を含み、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列内で、前記活性配列は、前記パッセンジャー配列に対して少なくとも７０％相補性である。
前記人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列のそれぞれの前記活性配列及び前記パッセンジャー配列はどちらも、典型的には１８～４０ヌクレオチド長であり、さらに詳細には１８～３０ヌクレオチドであり、さらに詳細には１８～２５ヌクレオチドであり、最も詳細には１８～２３ヌクレオチド長である。前記活性配列はまた、１８又は１９ヌクレオチド長であり得る。典型的には、前記パッセンジャー配列は、前記活性配列と同一の長さを有するが、バルジが存在する可能性は、それらが必ずしも同一の長さであるとは限らないことを意味する。
典型的には、これらのｍｉｃｒｏＲＮＡスカフォールド配列は、リンカーによって分離されている。特定の実施形態によると、５´及び／又は３´リンカー配列の少なくとも一部は、そのそれぞれのスカフォールドと共に使用される。
人工配列は、例えば、内因性ｍｉＲ配列が特定の標的に対して改変されたｓｈＲＮＡ配列で置換されている野生型／天然起源のスカフォールド（例えば、ｍｉＲクラスター又はそのフラグメント、例えば、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター）であり得るか、前記内因性ｍｉＲ配列が特定の標的に対して改変されたｓｈＲＮＡ配列で置換されている単一のｍｉＲスカフォールド（例えば、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールドなど）のリピートであり得るか、二つの異なるｍｉＲＮＡスカフォールド、人工のｍｉＲ様配列、又はそれらの組み合わせ由来の要素（例えば、下側ステム、上側ステム及びループ領域）を組み合わせるキメラ配列であり得る。
この改変細胞は、典型的には、キメラ抗原受容体又はＴＣＲなどの対象のタンパク質をコードする核酸分子をさらに含み、前記のように、改変免疫細胞であり得る。
前記少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子の発現又は前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子の同時発現の結果、改変細胞内の少なくとも一つの遺伝子、典型的には複数の遺伝子が抑制される。これは、より高い治療有効性に貢献し得る。
本明細書中で記載する改変細胞は、薬剤として使用するためにも提供される。特定の実施形態によると、前記改変細胞はがんの前記治療で使用するために提供される。
これは、それを必要とする対象に対して、適切な用量の本明細書中で記載する改変細胞を投与することを含み、それによって少なくとも一つの症状を改善する、がんを治療する方法が提供されるというのと同等である。
前記改変細胞は、自己免疫細胞（患者から得られる細胞）又はアロジェニック免疫細胞（別の対象から得られる細胞）であり得る。
標的配列、上側ステム、下側ステム及びスカフォールドなどの領域を表示した、クラスター化スカフォールドの略図。 ｍｉＲＮＡスカフォールドが組み込まれていない（一番上）又はｍｉＲＮＡスカフォールドが組み込まれた（下）ＣＡＲ発現ベクター（例えば、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＰＣ３）であって、同一のベクター由来のＣＡＲ及び複数のｓｈＲＮＡ（例えば、２、４、６、８、．．．）の同時発現を可能にする設計を示す。ＬＴＲ：長い末端反復配列；プロモータ（例えば、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＳＦＦＶ、ＣＡＧ、．．．）；マーカータンパク質（例えば、切断型ＣＤ３４、ＣＤ１９）；マルチプレックス化ｓｈＲＮＡ。 野生型／天然ｍＲＮＡクラスターの使用は、反復改変単一スカフォールドと比較して、形質導入効率を増大させる。Ｔ細胞を、図２に示す設計によるＣＤ１９ＣＡＲ及び三～六つのマルチプレックス化スカフォールドをコードする異なるベクターで形質導入した。ＣＤ３４をレポータ遺伝子として使用し、ＦＡＣＳで測定した、形質導入後４日目のＣＤ３４＋Ｔ細胞の％を下のパネルに示す。上のパネルは、同一であるが、精製後（精製カラムから溶出された細胞の量を精製カラムにロードされた細胞の量で割ったもの）を示す。１－２：ｍｉＲ－１７－９２クラスターからのスカフォールド、それぞれ四つ（ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１９ｂｌ、ｍｉＲ－９２ａｌ）及び三つのスカフォールド（ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１９ｂｌ）；３－５：ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターからのスカフォールド、それぞれ六つ（全部）、三つ（最後の三つ）及び四つ（最後の四つ）；６：１０６ｂ－２５クラスターからの全ての三つのスカフォールド；７：ｍｉＲ－２３ａ～２７ａ～２４－２クラスターからの全ての三つのスカフォールド；８－９：それぞれ、ｍｉＲ－１９６ａ２スカフォールド配列の四つ及び三つのリピート；１０：ＣＤ３４タグのみを有する偽ベクター。構築物に含まれる標的遺伝子は、トリプレックススカフォールドではＢ２Ｍ、ＣＤ５２及びＣＤ２４７であり、テトラプレックススカフォールドではさらなる遺伝子としてＴＲＡＣであった。ヘキサプレックススカフォールドは、標的ごとに二つの異なる標的配列を使用して、各標的遺伝子を二回標的とした。 ＦＡＣＳでＴＣＲ発現により評価した、２３ａ～２７ａ～２４－２クラスターとｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターとの間のＣＤ２４７（ＣＤ３ゼータ）のノックダウンの比較。１：ＣＤ３４タグのみを有する偽ベクター；２：ｍｉＲ－２３ａ～２７ａ～２４－２クラスター由来の全ての三つのスカフォールド（ｍｉＲ－２４－２スカフォールドにおけるＣＤ２４７標的配列）；３－５：ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスター由来のスカフォールド、それぞれ、六つ（全部）、三つ（最後の３）及び四つ（最後の４）。ＣＤ２４７標的配列はｍｉＲ－３６３スカフォールド中にある；３において、さらなる異なる配列がｍｉＲ－２０ｂスカフォールド中に含まれている。 ｍｉＲＮＡ１０６ａ－３６３クラスター及び図６に使用した構築物の設計を示す。 １０６ａ－３６３ｍｉＲＮＡクラスターに導入された、ＣＤ２４７、Ｂ２Ｍ又はＣＤ５２を標的とする３×ｓｈＲＮＡ又は６×ｓｈＲＮＡと共に、第二世代ＣＤ１９指向性ＣＡＲ、切断型ＣＤ３４選択マーカーをコードするレトロウイルスベクターで形質導入された、健常ドナー由来の初代Ｔ細胞におけるＲＮＡ発現を示す。ｓｈＲＮＡ（ｔＣＤ３４）を対照として使用しなかった。形質導入の二日後、ＣＤ３４特異的磁気ビーズを用いて細胞を濃縮し、ＩＬ－２（１００ｌＵ／ｍＬ）中で六日間さらに増幅した。ＣＤ２４７、Ｂ２Ｍ、及びＣＤ５２のｍＲＮＡ発現を、シクロフィリンをハウスキーピング遺伝子として使用するｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。 ノックダウンレベルの微調整を可能にする様々なｓｈＲＮＡ標的配列の比較。全てＣＤ２４７に対するものである１２の異なる標的配列をｍｉＲ－２０ｂスカフォールドで評価した。Ｔ細胞を活性化後１２日目（形質導入後１０日目）で回収した。ＴＣＲａｂレベルをＦＡＣＳにより測定した：ＭＦＩを棒グラフとして提示する。全てのｓｈＲＮＡが少なくとも５０％のノックダウンを達成し、いくつかははるかにより効率的であった。 ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドにおけるＣＤ９５のノックダウン。３１の異なる標的配列から選択された配列を示し、全てＣＤ９５に対するものであり、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドで評価した。Ｔ細胞を活性化後１６日目（形質導入後１４日目）で回収した。ＣＤ９５レベルはＦＡＣＳによって測定した：ＭＦＩを棒グラフとして提示する。最も効率的なｓｈＲＮＡは約３０％のノックダウンを達成した。 ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１８ｂ及びｍｉＲ－２０ｂスカフォールド構造の比較。標的配列（ここでは、２０ｂｐの長さ）及びパッセンジャー鎖を長方形で示す。ｍｉＲ－１０６ａ及びｍｉＲ－２０ｂは前記スカフォールドの１８位（標的配列の１４位）にミスマッチを有するが、ｍｉＲ－１８ｂの前記スカフォールドの方が大きく、標的配列の６、１１、及び１５位にミスマッチがあり（それぞれ矢印２、３、及び４で示す）、前記標的配列の１位と２位の間のパッセンジャー鎖に二つの核酸のバルジがある（矢印１で示す）。 ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドの修飾はノックダウン効率を向上させる。図１０Ａは、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドに加えられた修飾：バルジの除去、個々のミスマッチの除去、並びにバルジ及び最初の二つのミスマッチの除去を示す。図１０Ｂは、これらのｍｉＲ－１８ｂスカフォールドにおけるＣＤ９５のノックダウンの影響を示す：野生型／天然配列と比較してミスマッチ又はバルジが少ない構築物は、より高いノックダウン効率を達成する。ノックダウンは図８と同様にして測定する。 ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドの修飾はノックダウン効率を向上させる。図１０Ａは、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドに加えられた修飾：バルジの除去、個々のミスマッチの除去、並びにバルジ及び最初の二つのミスマッチの除去を示す。図１０Ｂは、これらのｍｉＲ－１８ｂスカフォールドにおけるＣＤ９５のノックダウンの影響を示す：野生型／天然配列と比較してミスマッチ又はバルジが少ない構築物は、より高いノックダウン効率を達成する。ノックダウンは図８と同様にして測定する。 標的配列長の評価。Ｂ２Ｍ（左パネル）及びＣＤ２４７（右パネル）に対する標的配列の両方について、ノックダウン効率に対する標的配列長の影響を評価した。野生型／天然スカフォールド配列はその位置での標的配列と同一であるので、構築物は、場合によって、二つの長さ（１９～２０、２１～２２、又は２２～２３）で標識される。示された結果はｍｉＲ－１０６ａスカフォールドについてのものであり、類似の結果がｍｉＲ－２０ｂスカフォールドについて得られた（不図示）。クラスター：無関係な配列を有する対照；追加の対照として、それぞれＣＤ２４７及びＢ２Ｍに対する標的配列を使用した。 図１２Ａ～Ｃ：異なる順列のスカフォールドを使用した、様々な遺伝子の同時ノックダウンの評価。Ａ：表示されたデュープレックス及びトリプレックススカフォールドのＢ２Ｍ／ＨＬＡ（左パネル）及びＣＤ２４７／ＣＤ３ゼータ（右パネル）の発現を示すＦＡＣＳデータ。Ｂ：パネルＡのＦＡＣＳデータのＭＦＩであり、ここではトリプレックススカフォールドのＣＤ９５の発現を含む。Ｃ：表示された構築物のＢ２Ｍ、ＣＤ２４７、及びＣＤ９５の発現を示すＦＡＣＳデータのＭＦＩ。 図１２Ａ～Ｃ：異なる順列のスカフォールドを使用した、様々な遺伝子の同時ノックダウンの評価。Ａ：表示されたデュープレックス及びトリプレックススカフォールドのＢ２Ｍ／ＨＬＡ（左パネル）及びＣＤ２４７／ＣＤ３ゼータ（右パネル）の発現を示すＦＡＣＳデータ。Ｂ：パネルＡのＦＡＣＳデータのＭＦＩであり、ここではトリプレックススカフォールドのＣＤ９５の発現を含む。Ｃ：表示された構築物のＢ２Ｍ、ＣＤ２４７、及びＣＤ９５の発現を示すＦＡＣＳデータのＭＦＩ。 図１２Ａ～Ｃ：異なる順列のスカフォールドを使用した、様々な遺伝子の同時ノックダウンの評価。Ａ：表示されたデュープレックス及びトリプレックススカフォールドのＢ２Ｍ／ＨＬＡ（左パネル）及びＣＤ２４７／ＣＤ３ゼータ（右パネル）の発現を示すＦＡＣＳデータ。Ｂ：パネルＡのＦＡＣＳデータのＭＦＩであり、ここではトリプレックススカフォールドのＣＤ９５の発現を含む。Ｃ：表示された構築物のＢ２Ｍ、ＣＤ２４７、及びＣＤ９５の発現を示すＦＡＣＳデータのＭＦＩ。 スカフォールドの変化及びＫＤ有効性に対するそれらの影響の評価。Ａ）ｓｈＲＮＡを含まない（一番上）、Ｂ２Ｍ（ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド中）及びＣＤ３ゼータ（ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド中）に対するデュープレックスｓｈＲＮＡを含む（上から二番目）、スカフォールドｍｉＲ－１８ｂ中にループ変異体を含むｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１８ｂ、及びｍｉＲ－２０ｂスカフォールドのトリプレックス、並びにスカフォールドｍｉＲ－１８ｂの上側ステム／ループ領域がｍｉＲ－１７の上側ステム／ループ領域で置換された類似のトリプレックス（一番下）を含む四つの異なるＣＡＲ Ｔ細胞のフローサイトメトリーデータ。ＨＬＡ－Ｉの発現（左パネル）、ＣＤ９５（中央）又はＴＣＲ発現（右パネル）を示す。 マルチプレックスが安定なマイクロプロセッシングを示す場合の標的配列変化の評価。Ａ）ｓｈＲＮＡ無しで形質導入されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（一番上）、Ｂ２Ｍの様々な標的配列を含む、ＣＤ３ゼータ及びＢ２Ｍに対するデュープレックス又はトリプレックス（Ｂ２Ｍ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ９５）におけるｓｈＲＮＡ標的のフローサイトメトリー発現。左のパネルはＨＬＡクラスＩの発現を示し、中央のパネルはＣＤ９５の発現、右のパネルはＴＣＲの発現を示す。Ｂ）各標的タンパク質の平均蛍光強度の無ｓｈＲＮＡ群に対して正規化された値。 マルチプレックスが安定なマイクロプロセッシングを示す場合の標的配列変化の評価。Ａ）ｓｈＲＮＡ無しで形質導入されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（一番上）、Ｂ２Ｍの様々な標的配列を含む、ＣＤ３ゼータ及びＢ２Ｍに対するデュープレックス又はトリプレックス（Ｂ２Ｍ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ９５）におけるｓｈＲＮＡ標的のフローサイトメトリー発現。左のパネルはＨＬＡクラスＩの発現を示し、中央のパネルはＣＤ９５の発現、右のパネルはＴＣＲの発現を示す。Ｂ）各標的タンパク質の平均蛍光強度の無ｓｈＲＮＡ群に対して正規化された値。 キメラトリプレックススカフォールドによってノックダウンされた場合の様々なｓｈＲＮＡ標的の機能評価。Ａ）Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡは、Ｃｒｉｓｐｒ ｃａｓ９でのＢ２Ｍノックアウトと比較してＮＫによる殺滅に対してＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を保護する。Ｂ）Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡは、Ｂ２Ｍノックアウトと同様にＴ細胞非自己認識を阻害する。Ｃ）ＣＤ９５に対するｓｈＲＮＡはＦａｓＬによるアポトーシスに対して防御する。 キメラトリプレックススカフォールドによってノックダウンされた場合の様々なｓｈＲＮＡ標的の機能評価。Ａ）Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡは、Ｃｒｉｓｐｒ ｃａｓ９でのＢ２Ｍノックアウトと比較してＮＫによる殺滅に対してＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を保護する。Ｂ）Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡは、Ｂ２Ｍノックアウトと同様にＴ細胞非自己認識を阻害する。Ｃ）ＣＤ９５に対するｓｈＲＮＡはＦａｓＬによるアポトーシスに対して防御する。 キメラトリプレックススカフォールドによってノックダウンされた場合の様々なｓｈＲＮＡ標的の機能評価。Ａ）Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡは、Ｃｒｉｓｐｒ ｃａｓ９でのＢ２Ｍノックアウトと比較してＮＫによる殺滅に対してＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を保護する。Ｂ）Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡは、Ｂ２Ｍノックアウトと同様にＴ細胞非自己認識を阻害する。Ｃ）ＣＤ９５に対するｓｈＲＮＡはＦａｓＬによるアポトーシスに対して防御する。 三つの異なるｍｉＲ１７－９２パラログクラスター由来の四つのｓｈＲＮＡスカフォールドを含むキメラフォープレックスｓｈＲＮＡクラスターを使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）フォープレックスｓｈＲＮＡ構築物の図。Ｂ）ｓｈＲＮＡを含まないＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（一番上のヒストグラム）、デュープレックスｓｈＲＮＡを含むＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ（標的抗原：Ｂ２Ｍ、ＣＤ３ゼータ）及びフォープレックス（標的：Ｂ２Ｍ、ＣＤ２８、ＭＩＣＡ、ＣＤ３ゼータを含む）のフローサイトメトリー発現プロファイル。Ｃ）ｑＰＣＲによって測定されたＭＩＣＡの相対発現。 三つの異なるｍｉＲ１７－９２パラログクラスター由来の四つのｓｈＲＮＡスカフォールドを含むキメラフォープレックスｓｈＲＮＡクラスターを使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）フォープレックスｓｈＲＮＡ構築物の図。Ｂ）ｓｈＲＮＡを含まないＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（一番上のヒストグラム）、デュープレックスｓｈＲＮＡを含むＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ（標的抗原：Ｂ２Ｍ、ＣＤ３ゼータ）及びフォープレックス（標的：Ｂ２Ｍ、ＣＤ２８、ＭＩＣＡ、ＣＤ３ゼータを含む）のフローサイトメトリー発現プロファイル。Ｃ）ｑＰＣＲによって測定されたＭＩＣＡの相対発現。 三つの異なるｍｉＲ１７－９２パラログクラスター由来の四つのｓｈＲＮＡスカフォールドを含むキメラフォープレックスｓｈＲＮＡクラスターを使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）フォープレックスｓｈＲＮＡ構築物の図。Ｂ）ｓｈＲＮＡを含まないＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（一番上のヒストグラム）、デュープレックスｓｈＲＮＡを含むＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ（標的抗原：Ｂ２Ｍ、ＣＤ３ゼータ）及びフォープレックス（標的：Ｂ２Ｍ、ＣＤ２８、ＭＩＣＡ、ＣＤ３ゼータを含む）のフローサイトメトリー発現プロファイル。Ｃ）ｑＰＣＲによって測定されたＭＩＣＡの相対発現。 三つの異なるｍｉＲ１７－９２パラログクラスター由来の五つのｓｈＲＮＡスカフォールドを含むキメラファイブプレックスｓｈＲＮＡクラスターを使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）ｓｈＲＮＡを含まないＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（一番上のヒストグラム）、最適化されていない標的配列デュープレックスを有するファイブプレックスｓｈＲＮＡ（ファイブプレックス１）及び同一の最適化された標的配列を異なる順序で有する二つのファイブプレックスクラスター（ｓｈＲＮＡ標的抗原：Ｂ２Ｍ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＭＩＣＡ、ＣＤ９５）を含むＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔのフローサイトメトリー発現プロファイル。Ｂ）ｑＰＣＲによって測定されたＭＩＣＡの相対発現。Ｆｐ１、２、３：ファイブプレックス１、２、３。Ｎｏ ｓｈ：ＣＡＲ Ｔを有するが、ｓｈＲＮＡは存在しない構築物。 三つの異なるｍｉＲ１７－９２パラログクラスター由来の五つのｓｈＲＮＡスカフォールドを含むキメラファイブプレックスｓｈＲＮＡクラスターを使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）ｓｈＲＮＡを含まないＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（一番上のヒストグラム）、最適化されていない標的配列デュープレックスを有するファイブプレックスｓｈＲＮＡ（ファイブプレックス１）及び同一の最適化された標的配列を異なる順序で有する二つのファイブプレックスクラスター（ｓｈＲＮＡ標的抗原：Ｂ２Ｍ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＭＩＣＡ、ＣＤ９５）を含むＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔのフローサイトメトリー発現プロファイル。Ｂ）ｑＰＣＲによって測定されたＭＩＣＡの相対発現。Ｆｐ１、２、３：ファイブプレックス１、２、３。Ｎｏ ｓｈ：ＣＡＲ Ｔを有するが、ｓｈＲＮＡは存在しない構築物。 ファイブプレックスキメラ構築物を使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）ｓｈＲＮＡファイブプレックスの図。Ｂ）ｓｈＲＮＡを含まない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（下のヒストグラム）、ｓｈＲＮＡを含むトリプレックスを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（標的：Ｂ２Ｍ、ＣＤ９５、ＣＤ３ゼータ）及びｓｈＲＮＡを含むファイブプレックスを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（標的：Ｂ２Ｍ、ＣＤ９５、ＣＤ３ゼータ、ＭＩＣＡ、ＣＤ２８；それぞれ中央及び一番上のヒストグラム）を比較したフローサイトメトリー発現。Ｃ）平均蛍光強度を使用して無ｓｈＲＮＡ群に対して正規化された阻害の相対的パーセンテージ。 ファイブプレックスキメラ構築物を使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）ｓｈＲＮＡファイブプレックスの図。Ｂ）ｓｈＲＮＡを含まない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（下のヒストグラム）、ｓｈＲＮＡを含むトリプレックスを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（標的：Ｂ２Ｍ、ＣＤ９５、ＣＤ３ゼータ）及びｓｈＲＮＡを含むファイブプレックスを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（標的：Ｂ２Ｍ、ＣＤ９５、ＣＤ３ゼータ、ＭＩＣＡ、ＣＤ２８；それぞれ中央及び一番上のヒストグラム）を比較したフローサイトメトリー発現。Ｃ）平均蛍光強度を使用して無ｓｈＲＮＡ群に対して正規化された阻害の相対的パーセンテージ。 ファイブプレックスキメラ構築物を使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）ｓｈＲＮＡファイブプレックスの図。Ｂ）ｓｈＲＮＡを含まない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（下のヒストグラム）、ｓｈＲＮＡを含むトリプレックスを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（標的：Ｂ２Ｍ、ＣＤ９５、ＣＤ３ゼータ）及びｓｈＲＮＡを含むファイブプレックスを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（標的：Ｂ２Ｍ、ＣＤ９５、ＣＤ３ゼータ、ＭＩＣＡ、ＣＤ２８；それぞれ中央及び一番上のヒストグラム）を比較したフローサイトメトリー発現。Ｃ）平均蛍光強度を使用して無ｓｈＲＮＡ群に対して正規化された阻害の相対的パーセンテージ。 シックスプレックスキメラ構築物を使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）ｓｈＲＮＡ（下のヒストグラム）及びｓｈＲＮＡを含むシックスプレックス（上のヒストグラム）を含まない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を比較したフローサイトメトリー発現（標的は左から右へ：ＣＤ３８、Ｂ２Ｍ、ＣＤ９５、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７）。Ｂ）平均蛍光強度を使用して無ｓｈＲＮＡ群に対して正規化された阻害の相対的パーセンテージ。 シックスプレックスキメラ構築物を使用した標的遺伝子のノックダウン。Ａ）ｓｈＲＮＡ（下のヒストグラム）及びｓｈＲＮＡを含むシックスプレックス（上のヒストグラム）を含まない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を比較したフローサイトメトリー発現（標的は左から右へ：ＣＤ３８、Ｂ２Ｍ、ＣＤ９５、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７）。Ｂ）平均蛍光強度を使用して無ｓｈＲＮＡ群に対して正規化された阻害の相対的パーセンテージ。
（発明の詳細な説明）
定義
本発明を、特定の実施形態に関して、ある特定の図面を参照して説明するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲内の任意の参照番号は、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。記載されている図面は概略的なものにすぎず、非限定的である。図中、要素のいくつかのサイズは説明の目的で誇張され、縮尺通りに描かれていない場合がある。本明細書及び特許請求の範囲において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、他の要素又はステップを除外するものではない。例えば、「ａ」又は「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、単数名詞を指すときに不定冠詞又は定冠詞を使用する場合、特に別段の記載が無い限り、その名詞の複数形も含まれる。
さらに、本明細書及び特許請求の範囲における第一、第二、第三などの用語は、類似した要素を区別するために使用し、必ずしも順番や時系列を記載するためではない。このように使用される用語は、適切な状況下では交換可能であり、本明細書で記載する発明の実施形態は、本明細書中で記載又は図示した以外の配列でも動作可能であることを理解されたい。
以下の用語又は定義は、本発明の理解を助けるためだけに提示する。
実践者は、当該技術分野の定義及び用語について、特に、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺１１４まで），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）にあたる。本明細書中で提示する定義は、当業者によって理解されるよりも範囲が狭いと解釈されるべきではない。
本明細書中で使用する「改変細胞」は、（自然起源の変異に対して）人間の介入によって修飾された細胞である。
本明細書中で使用される「ヌクレオチド」又は「核酸」又は「ポリヌクレオチド」とも同義的に称される「核酸分子」という用語は、修飾されていないＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。核酸分子には、限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、又はより典型的には、二本鎖若しくは一本鎖及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、一つ以上の修飾された塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ及び骨格が安定性又は他の理由のために修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡも含む。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化塩基及びイノシンなどの普通ではない塩基が含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡに対して様々な修飾をなすことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に見いだされるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態並びにウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される、比較的短い核酸鎖も包含する。
「ベクター」は、セグメントの複製又は発現をもたらすように別の核酸セグメントを操作可能に挿入することができるプラスミド、ファージ、コスミド、又はウイルスなどのレプリコンである。「クローン」は、有糸分裂によって単一細胞又は共通の祖先から誘導される細胞の集団である。「細胞株」は、数世代にわたってインビトロで安定な成長が可能な初代細胞のクローンである。本明細書中で提示するいくつかの例では、細胞は、細胞をＤＮＡでトランスフェクトすることによって形質転換される。
本明細書中で使用する場合、配列に関して「異なる（ｔｏ ｄｉｆｆｅｒ又はｄｉｆｆｅｒｓ）」、特に「野生型配列とは異なる」とは、核酸の置換、欠失及び／又は挿入のいずれかにより野生型／天然配列と比較して配列が変更されていることを意味する。特に、上側ステム／ループ領域における相違に関して「異なる（ｔｏ ｄｉｆｆｅｒ又はｄｉｆｆｅｒｓ）」とは、前記野生型配列と比較して少なくとも一つのミスマッチ又はバルジが除去又は導入されていることを意味し得る。ミスマッチ又はバルジが除去又は導入されていない場合、配列は、その関連する長さにわたって９８％未満の配列同一性、９５％未満の配列同一性、特に９０％未満の配列同一性を有するならば、前記野生型配列と異なるとみなされる。上側ステム／ループ配列の文脈で、その関連する長さとは、前記上側ステム／ループ領域の長さである。なお、前記上側ステム／ループ配列が置換されているキメラ配列の文脈で、比較するのに適切な野生型配列は、もとのスカフォールド（すなわち、下側ステム領域に対応するスカフォールド）の配列である。「異なるように改変」されている配列とは、典型的にはより望ましい結果（例えば、標的配列の改善された下方調節又はスカフォールドの改善されたマイクロプロセッシング）を達成するために、変化が意図的に導入されていることを意味する。
「発現する」及び「産生する」という用語は、本明細書中では同義語として使用され、遺伝子産物の生合成を指す。これらの用語は遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。これらの用語はまた、ＲＮＡの一つ以上のポリペプチドへの翻訳も包含し、さらにすべての自然起源の転写後及び翻訳後修飾も包含する。
本明細書中で使用される「外因性」という用語は、特に細胞又は免疫細胞の文脈では、個々の生細胞において存在し、かつ活性であるが、（内因性因子とは対照的に）当該細胞外を起源とする任意の物質を指す。「外因性核酸分子」という語句は、したがって、（免疫）細胞に、典型的には形質導入又はトランスフェクションによって導入された核酸分子を指す。本明細書中で使用される「内因性」という用語は、個々の生細胞において存在し、かつ活性であり、当該細胞内部を起源とする（したがって、典型的には、形質導入されていないか又はトランスフェクトされていない細胞においても産生される）任意の因子又は物質を指す。
本明細書中で使用する「単離された」とは、生物学的成分（例えば、核酸、ペプチド又はタンパク質）が、前記成分が自然に存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質から実質的に分離されているか、別に産生されているか、又は精製されていることを意味する。このように「単離された」核酸、ペプチド及びタンパク質には、標準的精製法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。「単離された」核酸、ペプチド及びタンパク質は、組成の一部であり得るが、そのような組成が前記核酸、ペプチド、又はタンパク質の天然の環境の一部でない場合でも、単離されている可能性がある。前記用語は、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸、ペプチド及びタンパク質、並びに化学的に合成された核酸も包含する。
分子生物学の文脈で本明細書において使用される「マルチプレックス化」とは、二つ以上（すなわち、複数の）関連又は無関係標的の同時ターゲティングを指す。本明細書中で使用される「ＲＮＡ干渉分子」という用語は、標的化ｍＲＮＡ分子を中和することによって遺伝子発現又は翻訳を阻害するＲＮＡ（又はＲＮＡ様）分子を指す。ＲＮＡ干渉分子は、塩基対相補性によって標的化ｍＲＮＡ分子を中和する。前記ＲＮＡ干渉分子内には、標的化核酸分子にハイブリダイズできる標的配列（典型的には、１８～２３核酸）がある。例としては、ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）又はｍｉＲＮＡ分子が挙げられる。したがって、本明細書中で使用される「マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子」は、一つ以上の標的の同時下方調節のために同時に存在する二つ以上の分子である。典型的には、前記マルチプレックス化分子のそれぞれは、特定の標的に対するものであるが、二つの分子は同一の標的に対するものであり得る（そしてさらには同一でもあり得る）。
本明細書中で使用される「プロモータ」は、通常、遺伝子領域に隣接して位置する核酸の調節領域であり、調節された遺伝子転写の制御点を提供する。
「マルチプレックス」は、同一の種類の複数の分子、例えば複数のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックス内で、分子が同一の種類のもの（例えば、全てｓｈＲＮＡ）である場合、それらは同一であり得るか、又は異なる配列を含み得る。同一の種類の分子間には、本明細書中に記載するリンカーなどの介在配列が存在し得る。本発明のマルチプレックスの一例は、複数のｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックスは、一本鎖であり得るか、二本鎖であり得るか、又は一本鎖の領域と二本鎖の領域との両方を有し得る。
本明細書中で使用する「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」とは、抗原に対する特異性を有する結合部分（例えば、抗体、受容体又はその同族リガンド由来であり得る）と免疫細胞においてシグナルを伝達することができるシグナル伝達部分（例えば、ＣＤ３ゼータ鎖、ＦｃイプシロンＲｌガンマドメイン、ＣＤ３イプシロンドメイン、最近記載されたＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２シグナリングドメイン、又は同時刺激ドメインとしてのＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、及びＣＤ２からのドメインなどの他のシグナリング又はコシグナリング部分も使用できる）とを少なくとも有するキメラ受容体（すなわち、異なる供給源からの部分で構成される）を指す。「キメラＮＫ受容体」は、結合部分がＮＫ受容体から誘導又は単離されるＣＡＲである。
本明細書中で使用する「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞受容体を指す。養子細胞移植の文脈で、これは、典型的には、改変ＴＣＲ、すなわち、特定の抗原、最も典型的には腫瘍抗原を認識するように改変されているＴＣＲを指す。本明細書中で使用する「内因性ＴＣＲ」は、非修飾細胞（典型的にはＴ細胞）上に内因的に存在するＴＣＲを指す。前記ＴＣＲは、ジスルフィド結合した膜固定ヘテロダイマータンパク質であり、通常は、インバリアントＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現された可変性の高いアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖とから構成されている。ＴＣＲ受容体複合体は、可変ＴＣＲ受容体α及びβ鎖と、ＣＤ３共受容体（ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び二つのＣＤ３ε鎖を含む）及び二つのＣＤ３ζ鎖（ａｋａ ＣＤ２４７分子）とのオクトマー複合体である。本明細書中で使用される「機能的ＴＣＲ」という用語は、その同族リガンドと結合するとシグナルを伝達することができるＴＣＲを意味する。典型的には、アロジェニック療法では、例えば、前記ＴＣＲ鎖の少なくとも一つをノックアウト又はノックダウンすることにより、改変を行って、前記ＴＣＲ機能を低下又は損なう。改変細胞における内因性ＴＣＲは、改変を行っていない内因性ＴＣＲを有する細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又はさらには少なくとも９０％のシグナリング能力（又はＴ細胞活性化）を保持する場合、機能的であるとみなされる。シグナリング能力又はＴ細胞活性化を評価するためのアッセイは、当業者には公知であり、特に、インターフェロンガンマを測定するＥＬＩＳＡが挙げられる。別の実施形態によると、内因性ＴＣＲは、ＴＣＲ機能を妨害するための改変が行われていない場合、機能的であるとみなされる。
本明細書中で使用する「免疫細胞」という用語は、免疫系（適応又は自然免疫系のいずれかであり得る）の一部である細胞を指す。本明細書中で使用する免疫細胞は、典型的には、養子細胞移植（オートローガスな移植又はアロジェニックな移植のいずれか）のために製造される免疫細胞である。多くの異なる種類の免疫細胞が養子療法のために使用され、したがって、本明細書中で記載する方法での使用が想定される。免疫細胞の例としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、リンパ球、樹状細胞、骨髄細胞、マクロファージ、幹細胞、前駆細胞又はｉＰＳＣが挙げられる。後者の三つはそれ自体では免疫細胞ではないが、免疫療法のための養子細胞移植で使用できる（例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１５を参照）。典型的には、製造は幹細胞若しくはｉＰＳＣから始まるが（又はさらには免疫細胞からｉＰＳＣへの脱分化ステップから始まる場合もある）、製造は、投与前に免疫細胞への分化のステップを必然的に伴う。養子移植のための免疫細胞の製造で使用される幹細胞、前駆細胞及びｉＰＳＣ（すなわち、幹細胞、前駆細胞及びｉＰＳＣ又は本明細書中に記載するＣＡＲで形質導入されるそれらの分化した子孫）は、本明細書では免疫細胞とみなされる。特定の実施形態によると、前記方法で想定される前記幹細胞は、ヒト胚を破壊するステップを含まない。
特に想定される免疫細胞としては、リンパ球、単球、マクロファージ及び樹状細胞を含む白血球細胞（白血球）が挙げられる。特に想定されるリンパ球としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞が挙げられるが、なかでも特に想定されるのはＴ細胞である。養子移植の文脈で、免疫細胞は、典型的には初代細胞（すなわち、ヒト又は動物の組織から直接単離され、培養されていないか、又は短期間しか培養されていない細胞）であり、細胞株（すなわち、長期間にわたって継続的に継代培養され、均質な遺伝子型及び表現型の特性を獲得した細胞）ではないことに注意されたい。具体的な実施形態によると、免疫細胞は、初代細胞（すなわち、ヒト又は動物の組織から直接単離され、培養されていないか、又は短期間しか培養されていない細胞）であり、細胞株（すなわち、長期間にわたって継続的に培養され、均質な遺伝子型及び表現型の特性を獲得した細胞）ではない。別の具体的な実施形態によると、前記免疫細胞は細胞株からの細胞ではない。
本明細書中で使用される「ｍｉｃｒｏＲＮＡスカフォールド」、「ｍｉＲＮＡスカフォールド」又はさらには「スカフォールド」とは、特定のｍｉｃｒｏＲＮＡプロセッシング要件を含む特徴がよく特徴付けられている一次ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列であって、ＲＮＡ配列を挿入できるもの（典型的には、既存のｍｉＲＮＡ配列を特定の標的に対するｓｉＲＮＡで置換するため）を指す。ｍｉｃｒｏＲＮＡスカフォールドは、最小限、（典型的には、１８～２３ヌクレオチドの）二本鎖上側ステム領域で構成され、ステム領域の両側は柔軟なループ配列に接続され、前記上側ステム領域は、典型的には、Ｄｉｃｅｒによってプロセッシングされる。典型的には、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡスカフォールドは下側ステム領域をさらに含み、任意選択的に５´及び３´フランキング配列又は基本セグメントをさらに含んでもよい。ガイド配列又は標的配列は前記上側ステム領域に挿入され、１８～２３ヌクレオチドの一本鎖配列である。前記標的配列は、相補的塩基対形成によりその標的を認識するので、この配列は、典型的には、標的又はその調節領域に存在する配列と同一である。本明細書中で記載する「標的」又は「標的タンパク質」は、下方調節しなければならない（すなわち、細胞ではその発現を低減させなければならない）分子（典型的には、タンパク質であるが、核酸分子であり得る）を指す。なお、ｍｉＲＮＡは核酸レベルで機能するので、タンパク質に対するものであっても、前記ｍｉＲＮＡ標的配列は、前記タンパク質をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）又は前記タンパク質の発現を調節する配列（例えば、３´ＵＴＲ領域など）と同一である。
ｍｉＲＮＡスカフォールドの例としては、例えば、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１８ｂ、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－９２－２又はｍｉＲ－３６３などの野生型／自然起源のｍｉＲＮＡクラスター中に存在するスカフォールド、又はＳＭＡＲＴベクター（商標）ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ適応スカフォールドなどの改変スカフォールド（米国コロラド州ラファイエットのＨｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）が挙げられる。本明細書中で使用される「ｍｉＲ－１０６ａ」は、ヒトのＧｅｎｅ ＩＤ４０６８９９に相当し、「ｍｉＲ－１８ｂ」は、ヒトのＧｅｎｅ ＩＤ５７４０３３に相当し、「ｍｉＲ－２０ｂ」は、ヒトのＧｅｎｅ ＩＤ５７４０３２に相当し、「ｍｉＲ－１９ｂ－２」は、ヒトのＧｅｎｅ ＩＤ４０６９８１に相当し、「ｍｉＲ－９２ａ－２」としても知られる「ｍｉＲ－９２－２」は、ヒトのＧｅｎｅ ＩＤ４０７０４９に相当し、「ｍｉＲ－３６３」は、ヒトのＧｅｎｅ ＩＤ５７４０３１に相当する。
本明細書中で使用される「ｍｉｃｒｏＲＮＡクラスター」又は「ｍｉＲＮＡクラスター」は、一緒に機能するｍｉｃｒｏＲＮＡスカフォールドの集まりを指す。これらは、野生型／自然起源のクラスターであり得るか、又は自然では一緒に見いだされないｍｉＲＮＡスカフォールドの組み合わせであり得る。野生型／自然起源のｍｉｃｒｏＲＮＡクラスターは充分に説明されており、例えば、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター、ｍｉＲ－１７～９２、ｍｉＲ－１０６ｂ～２５、及びｍｉＲ－２３ａ～２７ａ～２４－２クラスターが挙げられる。ｍｉＲＮＡクラスターは、組み合わせられたスカフォールドとみなすことができる。したがって、本明細書中で使用されるクラスター又は「組み合わせられたｍｉＲＮＡスカフォールド」は、一つのプロモータの制御下で機能する複数のｍｉＲＮＡスカフォールドの組み合わせを指す。複数の前記ｍｉＲＮＡスカフォールドは、同一又は異なる可能性があり、同一又は異なる標的タンパク質に対する標的配列を有し、同一の標的の場合、当該標的に対して同一又は異なる標的配列を有する。そのような組み合わせられたスカフォールドは、一つのプロモータの制御下にある場合、「マルチプレックススカフォールド」、「マルチプレックス化スカフォールド」又は「マルチプレックスｍｉＲＮＡスカフォールド」とも称される。場合によっては、スカフォールドの数が決定されると、これを「マルチ」という接頭辞の代わりに使用できる。例えば、「デュープレックススカフォールド」は、二つのスカフォールドが存在することを意味し、「トリプレックススカフォールドは、三つのスカフォールドを有し、「テトラプレックス」又は「クアドルプレックス」は四つ、「ペンタプレックス」は五つ、「ヘキサプレックス」は六つなどである。このように、六つの異なるｍｉＲＮＡスカフォールドを有するｍｉＲＮＡクラスター（例えば、野生型／自然起源のｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスター）は、ヘキサプレックスｍｉＲＮＡスカフォールド又は六つのｍｉＲＮＡのクラスターとみなすことができる。
本明細書中で使用する場合、「ｍｉＲ－１７ファミリークラスター」は、（とりわけ）ｍｉＲ－１７ファミリー由来のスカフォールドを含む三つのパラログｍｉＲＮＡクラスターのうちの一つ：ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター（（順番に）ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、前記ｍｉＲ－９２ａ２スカフォールド、及び前記ｍｉＲ－３６３スカフォールドから構成される）、前記ｍｉＲ－１７～９２クラスター（（順番に）前記ｍｉＲ－１７スカフォールド、前記ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド及びｍｉＲ－９２－１（ｍｉＲ－９２ａｌも）スカフォールドから構成される）、並びにｍｉＲ－１０６ｂ～２５クラスター（（順番に）ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－９３スカフォールド及びｍｉＲ－２５スカフォールドから構成される）である。「ｍｉＲＮＡ－１７ファミリー」又は「ｍｉＲ－１７ファミリー」はシード配列にしたがって分類され、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉｒ－２０ｂ、ｍｉＲ－１０６ｂ及びｍｉＲ－９３を含む。同様に、シード配列にしたがって分類される他のファミリーは「ｍｉＲ－１８ファミリー」（ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１８ｂ）、「ｍｉＲ－１９ファミリー」（ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌ及びｍｉＲ－１９ｂ－２）、並びに「ｍｉＲ－９２ファミリー」（ｍｉＲ－９２ａｌ、ｍｉＲ－９２ａ２、ｍｉＲ－３６３及びｍｉＲ－２５）である。
したがって、「ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のスカフォールド」は、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－９２ａ２スカフォールド、ｍｉＲ－９３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－３６３スカフォールドから選択される任意のスカフォールドである。
一方、本明細書中で使用される「ｍｉＲ－１７ファミリースカフォールド」は、ｍｉＲ－１７ファミリー由来の六つのスカフォールド：ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉｒ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－９３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、及びｍｉＲ－１０６ｂスカフォールドのより限定された群から選択される。
図１は、本明細書中で使用される、上側及び下側ステム領域、標的配列、個々のスカフォールドを表示した、マルチプレックス化スカフォールド配列の概略例を示す。
「対象」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類をはじめとするヒト及び非ヒト動物を指す。記載した方法の最も注目すべき実施形態では、対象はヒトである。
「治療する」又は「治療」という用語は、症状の軽減、寛解、縮小、或いは状態を患者にとってより許容可能にすること、退化若しくは低下を減速させること、退化の最終点の衰弱を低減すること、対象の身体的若しくは精神的健全性を改善すること、又は生存期間を延長することなどの客観的若しくは主観的パラメータを含む、損傷、病状若しくは状態の減弱若しくは改善における成功又は成功の指標を指す。前記治療は、身体検査、神経学的検査、又は精神鑑定の結果を含む客観的又は主観的パラメータによって評価することができる。
本明細書中で使用される「養子細胞療法」、「養子細胞移植」、又は「ＡＣＴ」という語句は、細胞、最も典型的には免疫細胞の対象（例えば、患者）への移植を指す。これらの細胞は、患者（オートローガスな療法の場合）又は別の個人（アロジェニックな治療の場合）由来であり得る。療法の目標は、免疫機能と特性を改善することであり、がん免疫療法では、前記がんに対する免疫応答を高めることである。Ｔ細胞はＡＣＴに対して最もよく使用されるが、ＮＫ細胞、リンパ球（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））、樹状細胞及び骨髄細胞などの他の免疫細胞型も使用して適用される。
「有効量」又は「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投与量及び時間で有効な量を指す。本明細書中で記載する形質転換された免疫細胞などの治療薬の治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、及び体重などの因子、並びに治療薬（細胞など）が個体において所望の応答を惹起する能力に応じて変わり得る。治療有効量は、前記治療薬の任意の毒性又は有害作用よりも治療上有益な効果が上回るものでもある。
「移植片対宿主病」又は「ＧｖＨＤ」という表現は、アロジェニックな移植後に起こり得る状態を指す。ＧｖＨＤでは、提供された骨髄、末梢血（幹）細胞又は他の免疫細胞がレシピエントの身体を異物とみなし、提供された細胞が身体を攻撃する。Ｔ細胞などのドナー免疫適格性免疫細胞がＧｖＨＤの主な要因であるので、ＧｖＨＤを予防する一つの戦略は、例えば、ＴＣＲ複合体の機能を直接的又は間接的に阻害することによって、これらの免疫適格性細胞における（ＴＣＲベースの）シグナリングを減少させることによるものである。
養子細胞移植（ＡＣＴ）の文脈で複数の遺伝子のターゲティングが、ゲノム編集（及びその関連するコストと複雑な製造プロセス）を必要とせず実行可能であるか否かを評価するために、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子を試験することにした。
根本的なアプローチは、内因性ＲＮＡプロセッシング機構によってプロセッシングされて、塩基認識によって最適なｍＲＮＡを標的とすることができる活性なｓｈＲＮＡを生成させ、結果としてＲＩＳＣ複合体により特定のｍＲＮＡを破壊する、特定のベクターからのＲＮＡの転写に基づく。標的とされたｍＲＮＡの特異的破壊の結果、関連するタンパク質の発現が減少する。ＲＮＡオリゴヌクレオチドを最適の標的細胞にトランスフェクトして、遺伝子発現の一過性ノックダウンを達成できるが、組込まれたベクターから所望のｓｈＲＮＡの発現により遺伝子発現の安定なノックダウンが可能になる。
ｓｈＲＮＡの発現の成功は、５´キャップ及び３´ポリアデニル化を欠いたＲＮＡ種を生成させ、前記ｓｈＲＮＡデュープレックスのプロセッシングを可能にするポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）プロモータ（例えば、Ｈ１、Ｕ６）とのカップリングに大きく依存している。転写されると、前記ｓｈＲＮＡはプロセッシングを受け、核から排出され、さらにプロセッシングされ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされて、最適なｍＲＮＡのターゲティング分解をもたらす（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。効果的ではあるが、ＰｏｌＩＩＩプロモータによって駆動される転写の効率は、ＰｏｌＩＩＩプロモータからのｓｈＲＮＡの過度に高い発現による内因性ｍｉｃｒｏＲＮＡ経路の飽和によって細胞毒性をもたらす可能性がある（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。さらに、単一のベクターによる治療遺伝子及びｓｈＲＮＡの両方の発現は、典型的には、治療遺伝子を駆動するポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモータと、対象のｓｈＲＮＡを駆動するＰｏｌＩＩＩプロモータとを採用することによって達成されている。これは機能的であるが、ベクター空間を犠牲にし、したがって、治療遺伝子を含める選択肢が狭まる（Ｃｈｕｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
前記ｓｈＲＮＡをｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉｒ）フレームワーク内に埋め込むことで、前記ｓｈＲＮＡをＰｏｌＩＩプロモータの制御下でプロセッシングすることが可能になる（Ｇｉｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。重要なことに、埋め込まれたｓｈＲＮＡの発現レベルは低くなる傾向があり、それにより、Ｕ６プロモータなどの他のシステムを使用する場合に発現されることが観察される毒性が回避される（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。実際、肝臓特異的ＰｏｌＩＩプロモータによって駆動されるｓｈＲＮＡを投与されたマウスは、一年を超えて、忍容性の問題なく安定な遺伝子ノックダウンを示した（Ｇｉｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。しかしながら、これは、肝臓細胞において行われた一つのｓｈＲＮＡについてのみであり、タンパク質レベルの低下はわずか１５％（Ｇｉｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）であったので、複数の標的について、特に免疫細胞（操作が難しい）において、より高い効率を達成できるか否かは不明である。
驚くべきことに、ｍｉＲ－１７－９２クラスターのパラログであるｍｉＲ１０６ａ～３６３クラスターのエレメントが、標的の下方調節、特にＴ細胞における標的のマルチプレックス化下方調節に驚くほど効率的であるという観察から出発して、本明細書中では、ｍｉＲ－１７ファミリークラスターのスカフォールドに基づいてキメラクラスターを作成することによって、マルチプレックス化下方調節をさらに改善できることを示す。これは、特に、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来の異なるスカフォールドの下側ステム領域上にｍｉＲ－１７ファミリーの上側ステム及びループ領域を組み入れたキメラスカフォールドを利用することによって、及び／又は異なるｍｉＲ－１７パラログ由来のスカフォールド；特に、異なるパラログクラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリー由来のスカフォールドを組み合わせることによって行うことができる。異なる標的に対する複数のｍｉｃｒｏＲＮＡベースのｓｈＲＮＡの発現（例えば、ｍｉＲ１０６ａ～３６３クラスター中に存在する個々のスカフォールドに基づく）は、組換えを示さず、毒性を示さず、同時に複数の標的の効率的な下方調節を達成しながら、Ｔ細胞において実行可能であった。
したがって、本発明の目的は、ｍｉＲＮＡスカフォールドを含む特定の核酸分子と、ベクターと、かかる核酸分子を含む改変細胞とを提供することである。前記核酸分子、ベクター、及び細胞は、典型的には、がんの治療での使用など、薬剤として使用するために提供される。これは、本明細書中で記載する核酸分子、ベクター、又は細胞を、それを必要とする対象に投与し、それによってがんの少なくとも一つの症状を改善することを伴う、がんの治療法が提供されるというのと同等である。
第一の態様によると、改変スカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子であって、前記スカフォールドの下側ステム領域が、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドのものであり、スカフォールドの前記上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が前記野生型／天然配列とは異なるように改変されている、核酸分子が提供される。
ｍｉＲ－１７ファミリークラスターは１５のスカフォールドを含み、したがって、前記改変スカフォールドの前記下側ステム領域は、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、ｍｉＲ－３６３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択されるであろう。
前記上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が前記野生型／天然配列とは異なるように改変されている場合、これは、前記ループ領域のみがこの効果に対して改変されているか、前記上側ステム領域のみがこの効果に対して改変されているか、前記上側ステム領域及び前記ループのいずれか若しくは両方の一部がこの効果に対して改変されているか、又は前記上側ステム及びループ領域の全てが改変されていることを意味し得る。
特定の実施形態によると、本明細書中で開示する前記改変スカフォールドはキメラスカフォールドである。典型的には、それらは、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来の二つのスカフォールド由来のキメラスカフォールドである。特に、前記二つのスカフォールドのうちの少なくとも一つはまた、ｍｉＲ－１７ファミリースカフォールド、すなわち、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択されるものである。最も詳細には、前記キメラスカフォールドは、ｍｉＲ－１７ファミリークラスタースカフォールドから選択される（すなわち、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、ｍｉＲ－３６３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される）下側ステム領域と、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部、特にｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドから選択される（すなわち、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される）前記上側ステム／ループ領域の全てを含む。
したがって、さらなる実施形態では、改変スカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子であって、前記スカフォールドの下側ステム領域は、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、ｍｉＲ－３６３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択されるｍｉＲスカフォールドのものであり、前記スカフォールドの上側ステム及びループ領域は、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択され、前記下側ステム領域由来の前記スカフォールドは、前記上側ステム及びループ領域由来の前記スカフォールドとは異なる、核酸分子が提供される。
前記スカフォールドに加えて、少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子は、典型的には、野生型／天然スカフォールド配列において存在しない標的配列も含むであろう。特に、前記標的配列は、１８～２３核酸の長さ、さらに詳細には１８～２１核酸の長さ、特に１８～２０核酸の長さを有する。
さらなる特定の実施形態によると、少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子は、少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子を含み、そのうちの少なくとも一つは、のスカフォールドを有する。少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が存在する場合、これら二つ以上の分子は、同一か又は異なるスカフォールドを有し得る。原則として、追加のＲＮＡ干渉分子は、野生型／天然又は合成のいずれかの任意の種類の好適なスカフォールドを有し得るが、前記追加のＲＮＡ干渉分子（又は分子）が、ｍｉＲ－１７ファミリークラスターから選択されるスカフォールド、すなわち、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、ｍｉＲ－３６３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択されるスカフォールドを有することが特に想定される。実施例、特に実施例５～８に示すように、そのようなスカフォールドの組み合わせは、マルチプレックス化の成功をもたらすことができる。重要なことに、前記スカフォールドの全てが、野生型／天然配列とは異なるように改変された上側ステム／ループ領域を有する必要があるわけではない。しかしながら、特定の実施形態によると、少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が存在する場合、前記スカフォールドの全てはｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来の下側ステム領域を有する。
記載したように、前記スカフォールドは同一又は異なっている可能性がある。しかしながら、前記スカフォールドのうちの三つ以下が同一であることが特に想定され、なお一層詳細には、二つ以下の同一のスカフォールドを使用することが想定される。これは、同一のスカフォールド配列間、又は前記ｍｉＲＮＡプロセッシングを減少させる他の因子間の組換えを回避するためである（実施例５を参照）。
したがって、さらなる態様によると、異なるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子であって、前記少なくとも二つの異なるスカフォールドが、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドの下側ステム領域を有する核酸分子が提供され、
少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子は、上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部がｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、キメラスカフォールドを有し、及び／又は、
前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子由来の前記スカフォールドが、少なくとも二つの異なるｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来、すなわち、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－２０ａ（ｍｉＲ－１７－９２クラスター）、ｍｉＲ－１０６ａ及びｍｉＲ－２０ｂ（１０６ａ－３６３クラスター由来）、並びにｍｉＲ－１０６ｂ及びｍｉＲ－９３（ｍｉＲ－１０６ｂ－２５クラスター由来）からなる少なくとも二つの異なる群から選択される、ｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドである。
ここでも、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部は前記上側ステム／ループ領域全体であることが特に想定される。
具体的な実施形態によると、前記核酸分子中に存在する前記スカフォールドは、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター（任意選択的にさらに改変されている）から排他的に選択される。しかしながら、これらを異なるスカフォールド配列、特にｍｉＲ－１９６ａ２配列及び／又はｍｉＲ－２３ａ～２７ａ～２４－２クラスターなどの異なる関連のない配列（組換えを回避するため）とさらに組み合わせることも想定される。
さらなる特定の実施形態によると、少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む前記核酸分子は、一つのプロモータの制御下にある少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子を含む。さらなる特定の実施形態によると、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、少なくとも三つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である。さらなる実施形態によると、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、少なくとも四つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子であり、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、少なくとも五つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子であり、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、少なくとも六つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である。
特定の実施形態によると、スカフォールド配列は、ステム領域におけるミスマッチ及び／又はバルジの数を減少させるように改変され得る。本明細書中で使用される「ミスマッチ」は、相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対ではない塩基対を指す。本明細書中で使用される「バルジ」は、核酸二本鎖の一本鎖内に位置するヌクレオチド（典型的には１～５、特に１～３）の不対ストレッチを指す。より詳細には、使用される前記スカフォールド配列のうちの一つがｍｉＲ－１８ｂスカフォールドである場合、前記スカフォールドは、前記ステム領域中のミスマッチ及び／又はバルジの数を減らすように改変され得る（そして、野生型／天然配列と比べて修飾される）（実施例３を参照）。これは、塩基対相補性（ミスマッチの場合）を回復させることによって、典型的には、パッセンジャー鎖を標的鎖とマッチさせることによって、又はバルジの場合は、余分な不対ヌクレオチドを除去することによって、行うことができる。
特定の実施形態によると、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、ｓｈＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ分子であり得る。最も詳細には、それらはｍｉＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡ分子とｍｉＲＮＡ分子との違いは、ｍｉＲＮＡ分子がＤｒｏｓｈａによってプロセッシングされるが、従来のｓｈＲＮＡ分子はプロセッシングされないことである（これは毒性と関連している、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４１：５３７－５４１（２００６））。
特定の実施形態によると、前記ｍｉＲＮＡ分子は一つのプロモータの制御下にある個々のｍｉＲＮＡスカフォールドとして提供することができる。選択された各スカフォールドは、通常、一つのｍｉＲＮＡに対応し（図１）、前記スカフォールドは、反復させるか又は他のスカフォールドと組み合わせて、複数のＲＮＡ干渉分子の発現を得ることができる（図１～２）。しかしながら、反復したり、さらなるスカフォールドと組み合わせたりする場合、典型的には、前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子の全てが一つのプロモータの制御下にあることが想定される（すなわち、個々のスカフォールドを反復させるか、又は別のスカフォールドを追加する場合、プロモータは反復されない）。
ｍｉＲＮＡマルチプレックス化に特に適したスカフォールド配列は、真正多シストロン性ｍｉＲＮＡクラスター又はその一部で見られるものであり、内因性ｍｉＲＮＡ標的配列は対象のｓｈＲＮＡ標的配列で置換されている。この目的に特に適したｍｉＲスカフォールドクラスターは、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３、ｍｉＲ－１７～９２、ｍｉＲ－１０６ｂ～２５、及びｍｉＲ－２３ａ～２７ａ～２４－２クラスターであり、特に想定されるのは、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター及びそのフラグメント（すなわち、一つ以上の個々のスカフォールド）である。注目すべきことは、ベクターペイロードを節約するためには、全配列ではなく、そのような野生型／天然クラスターの一部を使用することも特に想定されることである（これは、全てのｍｉＲＮＡが等間隔であるわけではなく、全てのリンカー配列が必要であり得るわけではないので、特に有用である）。実際、本明細書（実施例５）では、スカフォールドを前記クラスター関連以外で使用することができ、様々な方法で組み合わせることができることが示されている。例えば、細胞中で最も効率的にプロセッシングされる前記ｍｉＲＮＡなど、他の検討事項も考慮できる。例えば、ｍｉＲ－１７～９２クラスターは、（順番に）ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド及びｍｉＲ－９２－１（ｍｉＲ－９２ａｌも）スカフォールドで構成され、前記クラスターの特に有用なフラグメントは、ｍｉＲ－１９ａからｍｉＲ－９２－１まで（すなわち、六つのｍｉＲＮＡのうちの四つ）のスカフォールド配列とそれらのリンカー、又はｍｉＲ－１９ａからｍｉＲ－１９ｂ－ｌまで（六つのｍｉＲＮＡのうちの三つ）のスカフォールド配列である。同様に、１０６ａ～３６３クラスターは、（順番に）ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２（ｍｉＲ－９２ａ２も）スカフォールド及びｍｉＲ－３６３スカフォールドから構成される（図５を参照）。クラスターの特に有用なフラグメントは、ｍｉＲ－１０６ａからｍｉＲ－２０ｂまで（すなわち、六つのｍｉＲＮＡのうちの三つ）（実施例５を参照）、ｍｉＲ－２０ｂからｍｉＲ－３６３まで（すなわち、六つのｍｉＲＮＡのうちの四つ）又はｍｉＲ－１９ｂ－２からｍｉＲ－３６３まで（すなわち、六つのｍｉＲＮＡのうちの三つ）のスカフォールド配列である（図６を参照）。野生型／天然リンカー配列の両方、並びにそれらのフラグメント又は人工リンカー（ここでも、ベクターのペイロードを減少させるため）を使用できる。
ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター由来のｍｉＲＮＡスカフォールドが特に想定されるので、特に想定されるリンカーは、各スカフォールドの５´及び３´の配列である（図１を参照）。リンカー配列は、例えば、スカフォールドの両側に、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐ、１００ｂｐ、９０ｂｐ、８０ｂｐ、７０ｂｐ、６０ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ又はそれ以下であり得る。前記クラスター中で隣接しない二つのスカフォールドを使用する場合（例えば、実施例５のように）、前記リンカーは、当然、前記クラスター中で見られるものと同一ではない。それでも、例えば、前記クラスター中の一つのスカフォールドの３´に存在する３０、６０又は９０ｂｐを使用し、それを次に選択されるスカフォールドの５´の３０、６０、９０ｂｐで構成されるリンカーと融合させて、ハイブリッドリンカーを作製できる。
前記ｍｉＲＮＡスカフォールドは、特に、そのまま、すなわち、前記スカフォールド配列への修飾なしに使用される。特に、下側ステム配列は各ｍｉＲＮＡスカフォールドで見られるものと同一に保たれる。好ましくは、上側ステムにおけるループ配列も変更されないが、これらが主に柔軟な構造であり、前記上側ステム構造が影響を受けない限り、長さや配列を適合させることができることが実験により示されている。好ましくはないが、当業者であれば、そのような修飾されたループを有するスカフォールドが本願の範囲内であることを理解するであろう。前記スカフォールドの前記上側ステム内で、標的配列が見られる。ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターの野生型／天然標的配列は、２２～２３ｂｐ長である。実施例４に示すように、悪影響なしに標的配列の寸法を短くすることができる。標的配列は、１８～２３ｂｐ長であり得、１８～２１ｂｐの配列が特に想定され、１８～２０ｂｐの配列がさらに想定される。より短い配列が必要である場合、１８又は１９ｂｐの標的配列を使用しても問題が無い。
ターゲティングのために明らかなように、前記標的配列は、明らかに前記標的の適応を必要とする前記スカフォールドの一部である。前記ｍｉＲＮＡスカフォールドはその構造にいくつかのミスマッチがあるので、これらのミスマッチが保持されるべきか否かが問題である。実施例３（及び図９）に示すように、ｍｉＲ－１０６ａ及びｍｉＲ－２０ｂの前記標的配列の１４位で見られる前記ミスマッチは、前記標的の下方調節に対してマイナスの影響を及ぼすことなく保持でき、このことは、パッセンジャー鎖がガイド鎖に対して完全に相補的ではないことを意味する。実施例３（及び図１０）にも示すように、複数のミスマッチが存在する場合（例えば、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドにおいて）、パッセンジャー鎖をガイド鎖に対してより相補的にして、より効率的なノックダウンを達成できる（必要な場合）。なお、この修飾は、有意なノックダウンレベルを達成するために必要ではないが、標的配列の６、１１及び１５位でのミスマッチ（スカフォールドのｂｐ２０及び７０、２５及び６５及び２９及び６１に対応する（図９を参照））を除去することでノックダウンが体系的に改善される。同じことが、バルジ（ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドのヌクレオチド７５及び７６）についても言える。パッセンジャー鎖のミスマッチ又はバルジを除去することによって標的及びパッセンジャー鎖の相補性を増大させることで、他のスカフォールドの下方調節も改善される可能性があるが、異なる標的配列を試験すると常に満足できるノックダウンレベルが得られるので、これはまだ必要ではない。
各ＲＮＡ干渉分子は異なる分子を標的とすることができるか、同一の分子を標的とすることができるか、又はそれらの組み合わせである（すなわち、複数のＲＮＡ分子が一つの標的に対して向けられる一方、一つだけのＲＮＡ干渉分子が異なる標的に向けられる）。前記ＲＮＡ干渉分子が同一の標的に対するものである場合、同一の領域を標的にすることができるか、又は異なる領域を標的にすることもできる。言い換えると、前記ＲＮＡ干渉分子は、同一の標的に対するものである場合、同一であっても、そうでなくてもよい。ＲＮＡ干渉分子のそのような組み合わせの例を実施例の項に示す。
したがって、特定の実施形態によると、前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも二つは、同一の標的に対するものである。さらなる特定の実施形態によると、これらの少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子は同一のｍｉＲＮＡスカフォールドを使用する。それらは、同一の標的配列を使用すること（これらの具体的な実施形態によると、前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも二つは同一である）又は異なる標的配列を使用すること（これらの具体的な実施形態によると、前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子のうちの少なくとも二つは同一のスカフォールドを有するが、標的配列は異なる）によって、同一の標的に対するものであり得る。別の実施形態によると、同一の標的に対する前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、異なるｍｉＲＮＡスカフォールド配列を有する。その場合、それらは同一の標的配列を有し得るか、又は同一の標的に対する異なる標的配列を有し得る。
別の実施形態によると、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子はすべて異なる。さらなる具体的な実施形態によると、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子はすべて異なる標的に対するものである。
改変細胞に存在する任意の好適な分子を本ＲＮＡ干渉分子の標的とすることができる。想定される標的の典型例は以下のものである。ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、ＭＨＣ共受容体遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ）、ＴＣＲ鎖、ＮＫＢＢｉＬ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＬＴＢ、ＬＳＴ１、ＮＣＲ３、ＡＩＦ１、ＬＹ６、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ）、補体カスケード、制御受容体（例えば、ＮＯＴＣＨ４）、ＴＡＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＲＩＮＧ１、ＣＤ５２、ＣＤ２４７、ＨＣＰ５、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、２Ｂ４、Ａ２ＡＲ、ＢＡＸ、ＢＬＩＭＰ１、Ｃ１６０（ＰＯＬＲ３Ａ）、ＣＢＬ－Ｂ、ＣＣＲ６、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（ａｋａ Ｂ７－Ｈ３）、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ４、ＤＧＫ［ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＫＧＧ、ＤＧＫＨ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ］、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＧＲ２、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＳＮ、ＧＭＣＳＦ、ＨＰＫ１、ＩＬ－１０Ｒ［ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ］、ＩＬ２、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＬＦＡ１、ＮＥＡＴ１、ＮＦｋＢ（ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＮＦｋＢ２、ＮＦｋＢｌ、ＲＥＬを含む）、ＮＫＧ２Ａ、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３を含む）、ＰＤ１、ＰＩ３ＫＣＤ、ＰＰＰ２ＲＤ２、ＰＲＡＳ４０、ＲＡＰＴＯＲ、ＳＨＩＰ１、ＳＯＡＴ１、ＳＯＣＳ１、Ｔ－ＢＥＴ、ＴＣＦ７（ａｋａ ＴＣＦ－１）、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３（ａｋａ ＨＡＶＣＲ２又はＣＤ３６６）、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、ＶＩＳＴＡ（ａｋａ ＶＳＩＲ又はＢ７－Ｈ５）、ＺＣ３Ｈ１２Ａ（レグナーゼ１又はＭＣＰＩＰとしても知られる）及びＺＦＰ３６Ｌ２。
本発明のさらなる態様によると、前記核酸分子はそのままで使用されないが、好適なベクター、すなわち、細胞における発現を可能にするベクター中に提供される。特定の実施形態によると、前記ベクターは、真核細胞、特に免疫細胞における発現に適している。
このように、本明細書中で記載される核酸分子を含む、改変免疫細胞における発現に適したベクターが提供される。前記核酸分子について開示された特徴の全ては、前記ベクターにも準用される。言い換えると、改変スカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含むベクターが提供され、前記スカフォールドの下側ステム領域は、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドのものであり、前記スカフォールドの上側ステム／ループ領域の少なくとも一部は、天然配列とは異なるように改変されている。さらなる実施形態によると、前記改変スカフォールドの下側ステム領域は、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、ｍｉＲ－３６３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される。さらなる実施形態によると、前記改変スカフォールドはキメラスカフォールドであり、上側ステム／ループ領域の少なくとも一部は、前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部は、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される。
特定の実施形態によると、前記ベクター中に存在する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子は、少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子、特に、少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である。
さらなる特定の実施形態によると、異なるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子を含むベクターが提供され、前記少なくとも二つの異なるスカフォールドは、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドの下側ステム領域を有し、
少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子は、上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部がｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、キメラスカフォールドを有し、及び／又は、
前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子由来の前記スカフォールドが、異なるｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドである。
前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子は、下方調節される標的分子の数や、前記マルチプレックス化分子を同時発現させる点の実用的考慮点に応じて、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、少なくとも六つ、少なくとも七つ、少なくとも八つ、少なくとも九つ、少なくとも十、又はさらにそれ以上の分子であり得る。ｍｉＲ－１７ファミリークラスターは、１５のスカフォールドを有し、スカフォールドは、ノックダウン活性を失うことなく複製することができ（実施例５）、異なるクラスター由来の個々のスカフォールドを組み合わせることができ（実施例７）、したがって、最大１２のスカフォールドを原則としてマルチプレックス化することができるが、実際、より少ない数が使用されることが多い。
「マルチプレックス」は、同一の種類の複数の分子、例えば複数のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックス内で、分子が同一の種類のもの（例えば、全てｓｈＲＮＡ）である場合、それらは同一であり得るか、又は異なる配列を含み得る。同一の種類の分子間には、本明細書中に記載するリンカーなどの介在配列が存在し得る。本発明のマルチプレックスの一例は、複数のタンデムｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。マルチプレックスは、一本鎖であり得るか、二本鎖であり得るか、又は一本鎖である領域と二本鎖である領域との両方を有し得る。
特定の実施形態によると、少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が一つのプロモータの制御下にある。典型的には、複数のＲＮＡ干渉分子が発現される場合、複数コピーのｓｈＲＮＡ－発現カセットを組み込むことによって行われる。これらは、典型的には、同一のプロモータ配列を有し、その結果、反復配列フラグメントを除去する組換え事象が頻繁に起こる。解決策として、典型的には、いくつかの異なるプロモータが発現カセットで使用される（例えば、Ｃｈｕｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。しかしながら、本実施形態によると、プロモータを一つだけ使用することによって組換えが回避される。発現は典型的には低いが、このことは毒性の点で有利である。というのも、ｓｉＲＮＡが多すぎると細胞にとって有毒である可能性があるからである（例えば、内因性ｓｉＲＮＡ経路を妨害することによって）。プロモータを一つだけ使用することは、全てのｓｈＲＮＡが同時制御され、類似のレベルで発現されるというさらなる利点がある。意外なことに、実施例で示すように、有効性が有意に降下することなく、複数のｓｈＲＮＡを一つのプロモータから転写できる。
典型的には、前記ＲＮＡ干渉分子を発現するために使用されるプロモータは、Ｕ６プロモータではない。これは、このプロモータが、特に、高い発現レベルで毒性と関連しているからである。同一の理由で、Ｈ１プロモータ（Ｕ６よりも弱いプロモータ）又はさらにはＰｏｌＩＩＩプロモータ全般（ある特定の条件下では適している可能性があるが）を除外することを検討できる。したがって、具体的な実施形態によると、前記ＲＮＡ干渉分子を発現するために使用される前記プロモータはＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモータではない。ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモータは、時間的及び空間的制御が欠けており、ｍｉＲＮＡ阻害剤の制御された発現が可能でない。対照的に、多くのＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモータによって組織特異的発現が可能になり、誘導性及び抑制性ＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモータの両方が存在する。組織特異的発現は多くの場合、本発明の文脈では必要とされないが（細胞は改変前に選択されるため）、例えば、免疫細胞の特異的プロモータを有することは依然として有利である。というのも、様々なプロモータとのＲＮＡｉ有効性の違いが免疫細胞において特に顕著であったことが示されているためである（Ｌｅｂｂｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。具体的な実施形態によると、前記プロモータは、ＰｏｌＩＩプロモータ、及びＰｏｌＩＩＩプロモータから選択される。特定の実施形態によると、前記プロモータは、天然又は合成ＰｏｌＩＩプロモータである。好適なプロモータとしては、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ（コア又は完全長）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、上流ＣＭＶ ＩＶエンハンサを有する複合ベータアクチンプロモータ（ＣＡＧプロモータ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモータ、脾限定巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、インターロイキン２プロモータ、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）長い末端反復配列（ＬＴＲ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ＬＴＲ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモータ、及びｔＲＮＡプロモータが挙げられる。これらのプロモータは、ｍＲＮＡ発現を駆動するために最もよく使用されるポリメラーゼＩＩプロモータの一つである。
本明細書中で開示するベクターは、ＡＣＴに使用される細胞における使用に特に適している。したがって、本発明の目的の一つは、本明細書中に記載する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子をコードする核酸分子を含む改変細胞を提供することである。前記ＲＮＡ干渉分子はまた、典型的には、天然のスカフォールド配列において存在しない標的配列も含む。前記標的配列は、典型的には、１８～２３核酸の長さを有する。前記標的配列は、改変細胞において存在する配列、特に標的の配列に対するものであることが特に想定される。すなわち、前記少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子は、下方調節されるべきタンパク質をコードする前記改変細胞における配列を（塩基対相補性により）標的とする配列、又は前記標的タンパク質の調節領域を有する。そのような標的の例としては、限定されるものではないが、ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、ＭＨＣ共受容体遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ）、ＴＣＲ鎖、ＮＫＢＢｉＬ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＬＴＢ、ＬＳＴ１、ＮＣＲ３、ＡＩＦ１、ＬＹ６、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ）、補体カスケード、制御受容体（例えば、ＮＯＴＣＨＩ４）、ＴＡＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＲＩＮＧ１、ＣＤ５２、ＣＤ２４７、ＨＣＰ５、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、２Ｂ４、Ａ２ＡＲ、ＢＡＸ、ＢＬ１ＭＰ１、Ｃ１６０（ＰＯＬＲ３Ａ）、ＣＢＬ－Ｂ、ＣＣＲ６、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（ａｋａ Ｂ７－Ｈ３）、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ４、ＤＧＫ［ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＫＧＧ、ＤＧＫＨ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ］、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＧＲ２、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＳＮ、ＧＭＣＳＦ、ＨＰＫ１、ＩＬ－１０Ｒ［ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ］、ＩＬ２、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＬＦＡ１、ＮＥＡＴ１、ＮＦｋＢ（ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＮＦｋＢ２、ＮＦｋＢｌ、ＲＥＬを含む）、ＮＫＧ２Ａ、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３を含む）、ＰＤ１、ＰＩ３ＫＣＤ、ＰＰＰ２ＲＤ２、ＰＲＡＳ４０、ＲＡＰＴＯＲ、ＳＨＩＰ１、ＳＯＡＴ１、ＳＯＣＳ１、Ｔ－ＢＥＴ、ＴＣＦ７（ａｋａ ＴＣＦ－１）、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３（ａｋａ ＨＡＶＣＲ２又はＣＤ３６６）、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、ＶＩＳＴＡ（ａｋａ ＶＳＩＲ又はＢ７－Ｈ５）、ＺＣ３Ｈ１２Ａ（レグナーゼ１又はＭＣＰＩＰとしても知られる）及びＺＦＰ３６Ｌ２が挙げられる。
前記ＲＮＡ干渉分子に加えて、前記ベクターは、多くの場合、さらなる要素を含み、典型的には、ＣＡＲなどの対象のタンパク質をコードする核酸も含む。さらなる特定の実施形態によると、前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子及び対象のタンパク質はどちらも一つのプロモータの制御下にある。これもまた、ベクター負荷を軽減し（対象のタンパク質を発現するために使用される別のプロモータはないので）、同時制御発現の利点をもたらす。これは、例えば、対象のタンパク質ががんを標的とするＣＡＲであり、前記ＲＮＡ干渉分子が腫瘍根絶において相加又は相乗効果を有することを意図される場合に有利であり得る。有用なＲＮＡ標的の例としては（限定されるわけではないが）、ＣＤ２４７、ＴＲＡＣ（どちらもＴＣＲ複合体を下方調節し、アロジェニック療法に対して細胞をより好適にする）、Ｂ２Ｍ（組織適合性を拡大するため）、ＣＤ５２（細胞をＣＤ５２指向性化学療法に耐えられるようにする）、ＣＤ９５（細胞をＣＤ９５誘導細胞死に対して非感受性にする）、チェックポイント分子（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４）、その他多数挙げられる。
前述のように、本明細書中に記載する核酸分子及びベクターは、ＡＣＴのために細胞を改変するために特に有用である。このように、本明細書中で記載する核酸分子又はベクターを含む改変免疫細胞が提供される。核酸分子及びベクターについて開示された特徴はすべて、前記改変細胞にも準用される。
少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含むか、又は少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む細胞は、利点を有し、特に治療上の利点を有し得る。ＲＮＡ干渉分子は、実際、（過剰）発現が望ましくない標的に対して向けることができる。しかしながら、典型的には、本明細書中で提供される前記改変細胞は、少なくとも一つの対象のタンパク質をさらに含む。
したがって、
対象のタンパク質をコードする第一外因性核酸分子と、
改変スカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む第二核酸分子であって、前記スカフォールドの下側ステム領域は、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドのものであり、前記スカフォールドの上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が前記天然配列とは異なるように改変されている、第二核酸分子と
を含む、改変細胞が提供される。
さらなる実施形態によると、前記改変スカフォールドの前記下側ステム領域は、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、ｍｉＲ－３６３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される。さらなる実施形態によると、前記改変スカフォールドはキメラスカフォールドであり、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部は、前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部は、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される。
さらに、
対象のタンパク質をコードする第一外因性核酸分子と、
異なるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む第二核酸分子であって、前記少なくとも二つの異なるスカフォールドが、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドの下側ステム領域を有する第二核酸分子とを含み、
少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子が、上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部がｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、キメラスカフォールドを有し、及び／又は、
前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子由来の前記スカフォールドが、異なるｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドである、核酸分子
を含む改変細胞が提供される。
特定の実施形態によると、前記改変細胞は改変免疫細胞である。特に、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、幹細胞、前駆細胞、及びｉＰＳＣ細胞から選択される。
少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が存在する場合、これら二つ以上の分子は、同一か又は異なるスカフォールドを有し得る。しかしながら、前記スカフォールドのうちの三つ以下が同一であることが特に想定され、特に、二つ以下の同一のスカフォールドを使用することが想定される。これは、同一のスカフォールド配列間の組換え、又は細胞のｍｉＲＮＡプロセッシング能力の過負荷を回避するためである（実施例５を参照）。同一の理由で、同一の標的に対して複数の標的配列が存在する場合、異なるスカフォールドにおいて異なる標的配列を使用するか、又は同一の標的配列を使用するかのいずれかが特に想定される。同一のスカフォールドに同一の標的配列はあり得るが、出現するのは二回以下であることが特に想定される。
任意のさらなる追加の対象のタンパク質は、例えば、相加効果、補助効果、若しくはさらには相乗効果を提供できるか、又は異なる目的で使用できる。例えば、前記対象のタンパク質は、腫瘍に対するＣＡＲであり得、ＲＮＡ干渉分子は、例えば、免疫チェックポイントを標的とすること、腫瘍標的を直接下方調節すること、腫瘍微小環境を標的することによって、腫瘍機能を妨害する可能性がある。代替的又は付加的に、一つ以上の前記ＲＮＡ干渉分子は、治療用細胞の持続を延長し得るか、又は別の方法で生理学的応答を変更し得る（例えば、ＧｖＨＤ又は宿主対移植片反応を妨害する）。
対象のタンパク質は、原則として、状況に応じて任意のタンパク質であり得る。しかしながら、典型的には、これらは治療機能を有するタンパク質である。これらは、例えば、インターロイキン、サイトカイン、又はホルモンなどの分泌型治療用タンパク質を含み得る。しかしながら、特定の実施形態によると、対象の前記タンパク質は分泌されない。治療用タンパク質の代わりに、対象の前記タンパク質は、診断、又は検出など、様々な機能を果たし得る。したがって、対象の前記タンパク質は、タグ又はレポータ遺伝子であり得る。典型的には、対象の前記タンパク質は受容体である。さらなる特定の実施形態によると、前記受容体はキメラ抗原受容体又はＴＣＲである。キメラ抗原受容体は、標的細胞の表面上で発現される任意の標的に対するものであり得、典型例としては、限定されるものではないが、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７４、ＣＤ２４８、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ２７９、ＣＤ３１９、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＥＰＨＡ２、メソセリン、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＰＣ３、Ｆｌｔ３、ＤＬＬ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＫＤＲ、ＭＥＴ、ムチン１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＦＯＬＨ１、ＦＡＰ、ＣＡ９、ＦＯＬＲ１、ＲＯＲ１、ＧＤ２、ＰＳＣＡ、ＧＰＮＭＢ、ＣＳＰＧ４、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２が挙げられるが、さらに多くのものが存在し、また好適である。ほとんどのＣＡＲがｓｃＦｖベースであるが（すなわち、結合部分は特定の標的に対するｓｃＦｖであり、ＣＡＲは典型的には標的にちなんで命名される）、一部のＣＡＲは受容体ベースである（すなわち、結合部分は受容体の一部であり、ＣＡＲは典型的には受容体にちなんで命名される）。後者の一例はＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲである。
改変ＴＣＲは、細胞内標的を含む、細胞の任意の標的に対するものであり得る。細胞表面上に存在する上記標的に加えて、ＴＣＲの典型的な標的としては、限定されるものではないが、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＡＦＰ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、ＷＴ１、ｐ５３、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＢＶ、ＴＲＡＩＬ、サイログロブリン、ＫＲＡＳ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＨＡ－１、ＣＭＶ、及びＣＥＡが挙げられる。
さらなる対象のタンパク質が存在するこれらの特定の実施形態によると、前記改変細胞中の第一及び第二核酸分子は、典型的には、真核生物発現プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、又はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びセンダイウイルス由来）などの一つのベクター中に存在する。さらなる具体的な実施形態によると、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから選択される。特に後者の場合、ベクター負荷（すなわち、構築物の総サイズ）が重要であり、コンパクトなマルチプレックスカセットの使用が特に有利である。
注目すべきは、本明細書中で記載する細胞は、複数の対象のタンパク質：例えば、受容体タンパク質及びレポータタンパク質を含み得る（図２を参照）。或いは、受容体タンパク質、インターロイキン及びタグタンパク質である。
改変細胞は、特に、真核細胞であり、さらに詳細には、改変哺乳類細胞であり、さらに詳細には、改変ヒト細胞である。特定の実施形態によると、細胞は、改変免疫細胞である。典型的な免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、幹細胞、前駆細胞、及びｉＰＳＣ細胞から選択される。
本明細書中で開示する細胞は、典型的には、マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子を含む。これらは、下方調節する必要がある一つ以上の標的（細胞内の標的、又はｓｈＲＮＡが分泌される場合は細胞外の標的のいずれか）に対するものであり得る。
本明細書中で開示される本発明を言い換えると、ｍｉＲＮＡベースである特に好適な構築物が同定されたということになる。したがって、ｍｉｃｒｏＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域を含むポリヌクレオチドを含む改変細胞が提供され、ｍｉｃｒｏＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域は、
一つ以上の人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列をコードする配列を含み、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、
ｍｉＲＮＡスカフォールド配列と、
活性又は成熟配列と、
パッセンジャー又はスター配列とを含み、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列内で、前記活性配列は、前記パッセンジャー配列に対して少なくとも７０％相補性である。
特定の実施形態によると、前記活性配列は、前記パッセンジャー配列に対して少なくとも８０％相補性であり、前記パッセンジャー配列に対して少なくとも９０％又はそれ以上の相補性であり得る。
特別な利点は、本発明のｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列がマルチプレックス化できることである。したがって、マルチプレックス化ｍｉｃｒｏＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域を含むポリヌクレオチドを含む改変細胞が提供され、前記マルチプレックス化ｍｉｃｒｏＲＮＡベースのｓｈＲＮＡコード化領域は、
二つ以上の人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列をコードする配列を含み、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、
ｍｉＲＮＡスカフォールド配列、
活性又は成熟配列、及び
パッセンジャー又はスター配列を含み、各人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列内で、前記活性配列は、前記パッセンジャー配列に対して少なくとも７０％相補性である。
前記ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は特に、ｍｉＲ－１０６ａ配列、ｍｉＲ－１８ｂ配列、ｍｉＲ－２０ｂ配列、ｍｉＲ－１９ｂ－２配列、ｍｉＲ－９２－２配列、及びｍｉＲ－３６３配列から選択される。人工ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列のそれぞれの前記活性配列及び前記パッセンジャー配列はどちらも、典型的には１８～４０ヌクレオチド長であり、さらに詳細には１８～３０ヌクレオチドであり、さらに詳細には１８～２５ヌクレオチドであり、最も詳細には１８～２３ヌクレオチド長である。前記活性配列はまた、１８又は１９ヌクレオチド長であり得る。典型的には、前記パッセンジャー配列は前記活性配列と同一の長さを有するが、バルジが存在する可能性は、それらが必ずしも同一の長さであるとは限らないことを意味する。
典型的には、これらのｍｉｃｒｏＲＮＡスカフォールド配列は、リンカーによって分離されている。ｍｉｃｒｏＲＮＡクラスターにおいて、リンカーは、５００ヌクレオチドまで、４００ヌクレオチドまで、３００ヌクレオチドまで、２００ヌクレオチドまで、１５０ヌクレオチドまで、１００ヌクレオチドまでの長さであり得る。スカフォールド配列をマルチプレックス化する場合、任意の潜在的な制御配列が含まれることを確実にするために十分な長さの天然リンカー配列（前記ｍｉＲＮＡスカフォールド配列の５´及び３´で見られるもの）を使用することが目的であり得る。例えば、前記スカフォールド配列に隣接する５０、１００、又は１５０のヌクレオチドを使用することができる。別の目的は、ベクターのペイロードを減少させ、リンカー長さを減少させることであり得、リンカー配列は、例えば、３０～６０ヌクレオチド長とすることができるが、より短い鎖でも機能する。実際、驚くべきことに、リンカーの長さは不可欠な役割を担うものではなく、非常に短い可能性があるか（１０ヌクレオチド未満）又はさらにはｓｈＲＮＡ機能を妨害することなく存在しない可能性があることが見いだされた。特定の実施形態によると、５´及び／又は３´リンカー配列の少なくとも一部は、そのそれぞれのスカフォールドと共に使用される。少なくとも一部とは、典型的には、５´及び／又は３´リンカー配列の少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１２０ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、又は少なくとも２００ヌクレオチドである。
前記ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は人工配列とみなされる。なぜなら、前記スカフォールド配列が自然起源であり得るとしても、内因性ｍｉＲ配列は特定の標的に対して改変ｓｈＲＮＡ配列で置換されているからである。人工配列は、例えば、前記内因性ｍｉＲ配列が、特定の標的に対して改変されたｓｈＲＮＡ配列で置換されている自然起源のスカフォールド（例えば、ｍｉＲクラスター又はそのフラグメント、例えば、ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター）であり得、前記内因性ｍｉＲ配列が、特定の標的に対して改変されたｓｈＲＮＡ配列で置換されている単一ｍｉＲスカフォールドのリピート（例えば、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールドなど）であり得、人工ｍｉＲ様配列、又はそれらの組み合わせであり得る。
この改変細胞は、典型的には、キメラ抗原受容体又はＴＣＲなどの対象のタンパク質をコードする核酸分子をさらに含み、前記のように、改変免疫細胞であり得る。
前記少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子の発現又は前記マルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子の同時発現の結果、改変細胞内の少なくとも一つの遺伝子、典型的には複数の遺伝子が抑制される。これは、より高い治療有効性に貢献し得る。
本明細書中で記載する改変細胞は、薬剤として使用するためにも提供される。特定の実施形態によると、前記改変細胞はがんの治療で使用するために提供される。治療できるがんの種類の例としては、限定されるものではないが、腺がん、副腎皮質がん、肛門がん、星状細胞腫、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫、眼がん、卵管がん、胃がん、神経膠芽腫、頭頚部がん、カポジ肉腫、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、腹膜がん、咽頭がん、前立腺がん、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、膣がん、及びウィルムス腫瘍が挙げられる。
特定の実施形態によると、前記細胞は、液体又は血液がんの治療のために提供できる。そのようながんの例としては、例えば、白血病（ａ．ｏ．急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む）、リンパ腫（ａ．ｏ．ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、例えば、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、ＤＬＢＣＬを含む）、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、及び小リンパ球性リンパ腫）、多発性骨髄腫又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）が挙げられる。
これは、がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、適切な用量の本明細書中に記載する改変細胞（すなわち、少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をコードする外因性核酸分子を含み、任意選択的に、対象のタンパク質をコードするさらなる核酸分子を含んでもよい、改変細胞）を投与することを含み、それによって前記がんに関連する少なくとも一つの症状を改善する方法が提供されると言うのと同等である。治療に想定されるがんとしては、限定されるものではないが、腺がん、副腎皮質がん、肛門がん、星状細胞腫、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫、眼がん、卵管がん、胃がん、神経膠芽腫、頭頚部がん、カポジ肉腫、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、腹膜がん、咽頭がん、前立腺がん、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、膣がん、及びウィルムス腫瘍が挙げられる。さらなる特定の実施形態によると、血液がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、適切な用量の本明細書中に記載する改変細胞を投与することを含み、それによって前記がんの少なくとも一つの症状を改善する方法が提供される。
別の実施形態によると、前記細胞は、自己免疫疾患の治療で使用するために提供できる。治療できる自己免疫疾患の種類の例としては、限定されるものではないが、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルー・ゲーリッグ病）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、クローン病、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、アジソン病、強直性脊椎炎、ベーチェット病、セリアック病、コクサッキー心筋炎、子宮内膜症、線維筋痛症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、川崎病、メニエール病、重症筋無力症、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、潰瘍性大腸炎、血管炎及び白斑が挙げられる。
これは、自己免疫疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、適切な用量の本明細書中に記載する改変細胞を投与することを含み、それによって前記自己免疫疾患に関連する少なくとも一つの症状を改善する方法が提供されるというのと同等である。治療できる自己免疫疾患の例は前述した。
さらに別の実施形態によると、前記細胞は、感染性疾患の治療で使用するために提供できる。「感染性疾患」は、本明細書では、前記疾患を有する対象又は生物の中又は上に外部生物（病原体）が存在することによって引き起こされる任意の種類の疾患を指すために使用される。感染は、通常、ウイルス、プリオン、細菌、及びウイロイドのような微生物又は寄生微生物によって引き起こされると考えられているが、大寄生虫及び真菌のようなより大きな生物も感染する可能性がある。感染を引き起こし得る前記生物は、本明細書中では「病原体」（疾患を引き起こす場合）及び「寄生虫」（宿主生物を犠牲にして恩恵を受け、それによって、明らかな疾患が存在していなくても、宿主生物の生物学的適応度が低下する場合）と称し、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原生生物（例えば、マラリア原虫、フィトフトラ）及び原虫（例えば、マラリア原虫、エントアメーバ、ジアルジア、トキソプラズマ、クリプトスポリジウム、トリコモナス、リーシュマニア、トリパノソーマ）（寄生微生物）及び大寄生虫、例えば、寄生虫（ｗｏｒｍ）（例えば、回虫、フィラリア、鉤虫、蟯虫及び鞭虫のような線虫、又は条虫及び吸虫のような扁平動物）だけでなく、マダニ及びダニなどの外寄生生物が挙げられる。捕食寄生者、すなわち、前記宿主生物を殺滅する寄生性生物は、寄生虫という用語に含まれると考えられる。特定の実施形態によると、感染性疾患は、微生物又はウイルス生物によって引き起こされる。
本明細書中で使用される「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、グラム陽性菌（例えば、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、バチルス属）、グラム陰性菌、（例えば、エシェリキア属、エルシニア属）、スピロヘータ（例えば、トレポネーマ・パラジウムなどのトレポネーマ属、レプトスピラ属、ボレリア・ブルグドルフェリなどのボレリア属）、モリキュート（すなわち、マイコプラズマ属などの細胞壁の無い細菌）、酸耐性菌（例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシスなどのマイコバクテリウム属、ノカルジア属）などの細菌を指す場合がある。「微生物（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）は、真菌（例えば、酵母及びカビ、例えば、カンジダ属、アスペルギルス属、コクシジオイデス属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、ニューモシスティス属又はトリコフィトン属）、原虫（例えば、プラスモジウム属、エントアメーバ属、ジアルジア属、トキソプラズマ属、クリプトスポリジウム属、トリコモナス属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属）及び古細菌も包含する。本方法で治療できる感染性疾患を引き起こす微生物のさらなる例としては、限定されるものではないが、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む）、エンテロコッカス属（バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、院内病原体大便連鎖球菌を含む）、食品病原体、例えば、枯草菌、セレウス菌、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ属、及びレジオネラ・ニューモニエが挙げられる。
「ウイルス生物」又は「ウイルス」は、本明細書中では同等として使用されているが、生物の生細胞の内部でのみ複製できる小さな感染病原体である。それらには、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、ｓｓＤＮＡウイルス（例えば、パルボウイルス）、ｄｓＲＮＡウイルス（例えば、レオウイルス）、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス、コロナウイルス）、（－）ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス）、ｓｓＲＮＡ－ＲＴ（逆転写）ウイルス、すなわち、ライフサイクルにおけるＤＮＡ中間体を有する（＋）センスＲＮＡを有するウイルス（例えば、レトロウイルス）、及びｄｓＤＮＡ－ＲＴウイルス（例えば、ヘパドナウイルス）が含まれる。ヒト対象に感染しも得るウイルスの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス、アストロウイルス、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ロゼオロウイルス）、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス及びヒトポリオーマウイルス）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス）、アレナウイルス、ブニアウイルス、カルシウイルス、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９の病原体））、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス、マーブルグウイルス）、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、マダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、脳炎ウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス及びＣ型インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎）、モルビリウイルス（麻疹）、ニューモウイルス、例えば、ヒトＲＳウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーＡウイルス、コクサッキーＢウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エコウイルス及びエンテロウイルス）、レオウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス及びヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ））、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）又はトガウイルス（例えば、風疹ウイルス）が挙げられる。特定の実施形態によると、治療される前記感染性疾患はＨＩＶではない。別の実施形態によると、治療される前記感染性疾患はレトロウイルスによって引き起こされる疾患ではない。別の実施形態によると、治療される前記感染性疾患はウイルス性疾患ではない。
これは、感染性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、適切な用量の本明細書中に記載する改変細胞（すなわち、二つ以上のマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子をコードする外因性核酸分子を含み、任意選択的に、対象のタンパク質をコードするさらなる核酸分子を含んでもよい、改変細胞）を投与することを含み、それによって少なくとも一つの症状を改善する方法が提供されると言うのと同等である。特に想定される微生物又はウイルス感染性疾患は、の病原体によって引き起こされるものである。
薬剤として使用するために提供されるこれらの細胞は、アロジェニック療法で使用するために提供できる。すなわち、それらは、アロジェニックＡＣＴが考えられる治療の選択肢である治療（別の対象由来の細胞がそれを必要とする対象に対して提供される）で使用するために提供される。具体的な実施形態によると、アロジェニック療法では、前記ＲＮＡ干渉分子の少なくとも一つは、ＴＣＲに対して（最も詳細には、前記ＴＣＲ複合体のサブユニットに対して）向けられる。別の実施形態によると、これらの細胞は、オートローガス療法、特に、オートロジー（ａｕｔｏｌｏｇｉｅｓ）ＡＣＴ療法で（すなわち、患者から得られた細胞を）使用するために提供される。
特定の実施形態、特定の構成、並びに材料及び／又は分子を、本発明による細胞及び方法について本明細書中で議論してきたが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更及び修飾をなすことができることを理解されたい。重要なことに、様々なベクターの実施形態で検討したベクターのバリエーションは、改変細胞にも適用され（ベクターはそのような細胞における発現に適しているため）、逆もまた同様である。前記細胞の様々な実施形態は、典型的には、前記細胞においてコードされる前記ベクターに関連づけられる。以下の実施例は、特定の実施形態をよりよく説明するために提供され、本願を限定するものとみなすべきではない。本願は特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例１．マルチプレックス化の最適化
ＤＲＯＳＨＡ複合体による、転写されたＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡの効率的プロセッシングは、効率的標的ノックダウンのために極めて重要である。我々の以前のデータから、ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡはＣＡＲコード化ベクターと効率的に同時発現することができ、前記ベクターからｍｉＲＮＡ機構によってプロセッシングできることが示された。さらに、同一のベクターから複数のｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ（例えば、２、４、６、８．．．）を同時発現できるＣＡＲ発現ベクターを生成させることが望ましい（図２）。しかしながら、以前の研究では、複数のｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡの同時発現はｓｈＲＮＡ活性の損失を招くことが示された。したがって、単一の発現ベクターからの複数の標的をノックダウンするために、効率的なｍｉＲＮＡプロセッシングが重要である。
最適なマルチプレックス化を達成し、組換えを回避するためには、単一のｍｉＲＮＡスカフォールドをマルチプレックス化するのではなく、自然起源のｍｉＲＮＡクラスターから始めるのが最善であるという仮説を立てた。自然起源のｍｉＲＮＡクラスターは、サイズと存在するスカフォールドの数が著しく異なる。目標は、ベクターをクローニングするためにマルチプレックス化ｍｉＲＮＡスカフォールドを使用することであるので、スカフォールドの数に対するサイズの割合が期待できるクラスターを特定することを試みた。特定された１３のクラスターを表１に記載する。
Figure 2024516283000002
表１ 名称、染色体上の位置、サイズ、コード配列又は非コード配列内の位置、及び鎖の配向を表示したｍｉｃｒｏ－ＲＮＡクラスターの同定。Ｎはクラスター中に存在するｍｉｃｒｏＲＮＡスカフォールドの数を示す、サイズ／Ｎはこれら二列の除算であり、前記クラスター内に散在する配列（リンカー＋その他）を有するｍｉＲＮＡスカフォールドの平均サイズを示す。淡灰色の網掛け：Ｔ細胞における高発現。
これらのクラスターのうちの二つ（濃灰色の網掛け、表１）は、サイズがどの程度異なり得るかを示す例示目的のために含める。これらのクラスターは８５０００ｂｐを超え、クローニングには大きすぎるので、直ちに除外された。クラスターのサイズ及び前記クラスター中に存在するｍｉＲＮＡの数に基づいて、最も有望なクラスターを選択した（表１のＮ）。平均的ｍｉＲＮＡスカフォールド＋リンカー配列を知るために、総サイズだけでなく、ｍｉＲＮＡスカフォールドの数で割ったサイズを評価した。第一のカットオフとして、サイズ／Ｎが２５０より低いクラスターを選択した。これによって充分なクラスターが得られ、目標は改変免疫細胞中でベクターを発現させることであったので、Ｔ細胞などの免疫細胞において高度に発現されるクラスターに焦点を当てることにした。これにより、四つのクラスター（淡灰色の網掛け、表１）が優先順位付けされ、全てが免疫細胞において高度に発現され、総サイズは１０００ｂｐ未満であった。さらに、それらは全て少なくとも三つのｍｉＲＮＡスカフォールド（Ｎが少なくとも３のクラスターは、２より多いｍｉＲＮＡのマルチプレックス化を可能にできる）を含み、スカフォールド当たりの平均サイズが２００ｂｐ未満であり、そのため、クローニングに非常に適していた（表１を参照）。ｍｉＲ１７－９２クラスター、ｍｉＲ１０６ａ－３６３クラスター、ｍｉＲ１０６ｂ－２５クラスター（三つのパラロガスｍｉｃｒｏＲＮＡクラスター）及びｍｉＲ２３ａ～２７ａ～２４－２クラスター。
１．１ マルチプレックス化に適したｍｉＲＮＡクラスターの選択
四つのｍｉＲＮＡクラスターがｓｈＲＮＡのマルチプレックス化発現に適しているか否かを評価するために、健常なドナー由来の初代Ｔ細胞を、選択されたクラスターに導入された様々なｓｈＲＮＡと共に、切断型ＣＤ３４選択マーカーである第二世代のＣＤ１９指向性ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入することにした。同一の数のｓｈＲＮＡの比較と、クラスターの切断の効果を可能にするために、ｍｉＲ１７－９２クラスター及びｍｉＲ１０６ａ－３６３クラスターのフラグメントも使用した。前記フラグメントは、他の二つのクラスターに存在する三つのｍｉＲＮＡスカフォールドとの比較を可能にするために、クラスターの三つ又は四つの連続したｍｉＲＮＡスカフォールドであった。そのようなベクターの概略設計を図２に示す。
ＣＤ２４７、Ｂ２Ｍ及びＣＤ５２を標的とする三つの同一のｓｈＲＮＡ標的配列を比較のために使用した。四つのｍｉＲＮＡスカフォールドを使用した場合、ＴＲＡＣがさらに標的とされた。六つのｍｉＲＮＡスカフォールドについて、三つの標的は２回標的とされたが、標的配列は異なっていた。対照として、反復合成ｓｈＲＮＡスカフォールド、単一ｓｈＲＮＡノックダウンについて優れ、またマルチプレックス化ノックダウンにも適していることが以前に示されているｍｉＲ１９６ａ２スカフォールドを使用した（ＷＯ２０２０／２２１９３９）。この対照は三つ及び四つのｓｈＲＮＡと共に使用された。
構築物のサイズが異なるにもかかわらず、ベクター力価は存在するｓｈＲＮＡの量によってごくわずかしか影響を受けなかった（データは不掲載）。しかしながら、図３に示すように、全ての群において、天然のｍｉＲＮＡクラスター由来の様々なスカフォールドを使用すると、同一スカフォールドの反復使用と比較して、形質導入効率が増加する（ここでは、ｍｉＲ－１９６ａ２スカフォールド）。
形質導入から回収までのＴ細胞の倍数増加は、構築物間で有意な差はなかった（クラスター化スカフォールド間でも、クラスター化スカフォールドと反復単一スカフォールドとの間でもなかった）。しかしながら、ノックダウン効率は構築物間で異なっていた。全てのクラスターはある程度までノックダウンを達成したが、クラスター化スカフォールド間には明らかな差があり、ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスター由来のスカフォールドが最良かつ最も一貫したノックダウンを達成し、ｍｉＲ２３ａ～２７ａ～２４－２クラスターのスカフォールドが最も効果が低かった。図４では、ｍｉＲ２３ａ～２７ａ～２４－２クラスター化スカフォールド、又はｍｉＲ１０６ａ－３６３クラスター化スカフォールド若しくはそのフラグメントにおける、ｓｈＲＮＡ無しの対照、又はｓｈＲＮＡ有のＴＣＲ発現を比較する一例を示す。完全スカフォールドで観察されたノックダウンの増加は、ＣＤ２４７がこの構築物で２回標的化されているという事実によって説明できる。これらの実験の結果として、ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターのスカフォールドをさらなる評価のために選択した。
実施例２．ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターのスカフォールドを使用したマルチプレックス化
最大六つのｓｈＲＮＡのマルチプレックス化の実現可能性を形質導入するのが困難な一次免疫細胞で評価した。これを評価するために、初代Ｔ細胞を、ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターに導入されたＣＤ２４７、β２ｍ及びＣＤ５２を標的とする３×ｓｈＲＮＡ又は６×ｓｈＲＮＡのいずれかを含む第二世代ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。ベクターの設計を図５に示す。
簡単に説明すると、健常なドナー由来の初代Ｔ細胞を、第二世代ＣＤ１９指向性ＣＡＲ、切断型ＣＤ３４選択マーカーと、１０６ａ－３６３ｍｉＲＮＡクラスターの最後の三つのｍｉＲ（ｍｉＲ－１９ｂ２、ｍｉＲ－９２ａ２、及びｍｉＲ－３６３）に導入されたＣＤ２４７、Ｂ２Ｍ及びＣＤ５２を標的とする三つのｓｈＲＮＡ、又は前記クラスターの六つのｍｉＲスカフォールド中の同一の三つの遺伝子を標的とする六つのｓｈＲＮＡ（この場合、ＣＤ２４７を標的とする二つのｓｈＲＮＡは異なっていた）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。簡潔には、６－ｐｌｅｘ、３－ｐｌｅｘ又は対照としてｓｈＲＮＡ無し（ｔＣＤ３４）として発現させたｓｈＲＮＡ。形質導入の２日後、ＣＤ３４特異的磁気ビーズを用いて細胞を濃縮し、さらにＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）で６日間増幅した。ＣＤ２４７、Ｂ２Ｍ、及びＣＤ５２のｍＲＮＡ発現を、シクロフィリンをハウスキーピング遺伝子として使用するｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。
結果を図６に示す。マルチプレックス化ｓｈＲＮＡは、全ての標的遺伝子に対して効率的なＲＮＡノックダウンレベルをもたらした。六つのマルチプレックス化ｓｈＲＮＡ（各タンパク質標的に対して二つのｓｈＲＮＡ）を組み込むことで、三つのマルチプレックス化ｓｈＲＮＡ（各タンパク質標的に対して一つのｓｈＲＮＡ）と比べてより高いＲＮＡノックダウンレベルが得られた（図６）。
実施例３ ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターの個々のスカフォールドの最適化
最初のデータがすでに有望であり、ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスター由来のスカフォールドを使用するとマルチプレックス化を達成できることを示していたが、個々のスカフォールドを修飾して、選択された標的のノックダウンを改善できるか否かを調べるためにさらなる研究が行われた。天然のスカフォールドはすでにノックダウンに対応するように進化的に選択圧下にあったことは当然であるので（下側及び上側ステム領域が進化によって少なくとも部分的に最適化されていたことを意味する）、様々な標的配列はまだ最適化されていなかったので、標的下方調節を改善するためにまず評価することにした。第一例では、同一の標的タンパク質を選択した。
各ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡのプロセッシング能力がクラスター中の他のものに依存し、影響を受ける可能性があることは以前に記載されているので（Ｂｏｆｉｌｌ－Ｄｅ Ｒｏｓ ａｎｄ Ｇｕ，２０１６）、クラスター全体の一部として様々な標的配列を有するが、他のスカフォールド配列では無関係な配列を有するスカフォールドを試験することにした（標的下方調節に影響を及ぼさない）。
ｍｉＲ－２０ｂスカフォールドにおけるＣＤ２４７の下方調節の結果を図７に示す。最初のスカフォールド配列がすでに約５０％の下方調節をもたらした。試験した他の標的配列もすべて標的のノックダウンに成功したが、５０％をはるかに超えるノックダウンを達成したものもあった。言い換えると、標的配列を選択することによって、最大限有効なノックダウンを達成でき、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールドのさらなる改変は必要なかった。
Ｂ２Ｍ標的に対して様々な配列を使用して、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド配列についても同様の結果が得られた（データは不掲載）。効果が特定の標的配列－スカフォールドの組み合わせに関連していることを除外するために、Ｂ２Ｍ標的配列もｍｉＲ－２０ｂスカフォールドで試験した。ノックダウン効率の点で若干ばらつきはあったが、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールドにおいて最高のノックダウンを達成した三つの標的配列は、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールドで使用した場合にも最高のノックダウンを達成した。このことは、有効な標的配列が特定されると、それはスカフォールド全体に亘って使用できることを意味する。
ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドについて、ＣＤ９５に対するｓｈＲＮＡの最適化を行った。しかしながら、３１の標的配列を試験した後、達成された最良のノックダウンは約３０％であった（図８を参照）。このノックダウンは無視できるものではないが、他のスカフォールドについて一貫して得られる７５％を超えるノックダウンよりはかなり効果が低かった。ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドをｍｉＲ－１０６ａ又はｍｉＲ－２０ｂのスカフォールドと比較すると（図９）、このスカフォールドが標的配列／上側ステム領域でより多くのミスマッチを含み（３対１）、また上側ステムの末端付近でバルジを含むことは明らかである。他のスカフォールド配列で高いノックダウンが達成されたので、ミスマッチの数を減少させること及び／又はバルジを除去することで、ノックダウン効率が向上する可能性があるという仮説を立てた。
評価した五つの異なる構築物を図１０Ａに示し、結果を図１０Ｂに示す。驚くべきことに、ミスマッチ又はバルジを一つでも欠失させることで、ノックダウン効率が大幅に向上する。ｍｉＲ－１０６ａ又はｍｉＲ－２０ｂスカフォールドでも同様に起こる一つのミスマッチだけを保持すると、ノックダウン効率が同一の標的配列について約３０％から６０％超まで増加する。したがって、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド配列はそのまま使用できるが、ミスマッチ又はバルジの数を減らすことでノックダウン効率を有意に増大させることができる。本発明におけるさらなる例として、１５～１６位でのバルジと２０及び２５位でのミスマッチが除去されているが、２９位でのミスマッチが保持されている構築物２８．５を使用する。注目すべきは、標的配列がマッチする必要があるので、ミスマッチの除去はパッセンジャー配列を適応させることによることである。
実施例４ 標的配列長の評価
ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターで見られる天然の標的配列は、典型的にはかなり長い（２２～２３ｂｐ）。これらを短縮できるか否かを評価するために、様々な長さの標的配列（一つはＣＤ２４７に対するものであり、もう一つはＢ２Ｍに対するものである）をスカフォールドに挿入し、ノックダウン効率について評価した。配列の短縮は、標的配列の３´末端のヌクレオチドを、天然のスカフォールドで見られるヌクレオチドで置換することによって行った。ｍｉＲ－１０６ａスカフォールドの結果を図１１に示す。１８ｂｐまでの短い配列でも最大長さと同様に機能し、場合によってはより良好に機能することがわかる。ｍｉＲ－２０ｂスカフォールドについても同様の結果が得られた（不図示）。ほとんどの実験について、２０ｂｐの標的配列を用いて実験することとした（図９に示す通り）。
実施例５ クラスター関連外の個々のスカフォールドの組み合わせの評価
ｍｉＲＮＡクラスターでは、多くのフランキング配列決定因子並びに他のクラスターの存在が、下方調節を達成するためには重要であると考えられることが一般に認められている。しかしながら、我々の以前の実験では、このことは常に当てはまるわけではないことが示された。
実際、二つの同時発現されるｓｈＲＮＡの活性を最適化するために、我々は以前に、サイズだけでなく、二つのｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ間のリンカーの配列、またｍｉＲＮＡスカフォールドも、ｓｈＲＮＡ活性に影響を及ぼすという仮説を立てた。ｓｈＲＮＡプロセッシングを最適化するために、二つの標的遺伝子、ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）及びＣＤ５２のノックダウンに対する様々なｓｈＲＮＡリンカーの影響を評価した。０～９２ｂｐのリンカーを使用したが、他の構築物と比較してＴＣＲに対して若干低いノックダウン活性（ＣＤ５２に対してはそうではない）を示した、二つのヘアピン間にスペーサを欠く構築物は別として、リンカーはノックダウン有効性に影響を及ぼさないようであった。重要なことに、リンカーのない構築物でも、両ｓｈＲＮＡの発現を減少させるのに充分機能した（データは不掲載）。これらの実験はｍｉＲ－１９６ａ２スカフォールドを用いて実施したが、最初の実験では、ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターのリンカーも有意に減少できることが示された。
個々のスカフォールドのプロセッシング能力及び活性がクラスター中の他のものの存在によって影響を受けるか否かを評価するために、スカフォールドを異なる順列で試験することにした。この目的のために、非連続スカフォールド（クラスター中の隣接するスカフォールドの影響を排除するため）：ｍｉＲ－１０６ａ及びｍｉＲ－２０ｂを選択した。さらに、クラスター中の六つのｍｉＲＮＡスカフォールドすべてを使用するのではなく、デュープレックス及びトリプレックスを作製した（実施例２とは対照的に）。ｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター中の最初の三つのスカフォールドに対応するｍｉＲ－１０６ａ－ｍｉＲ－１８ｂ－ｍｉＲ－２０ｂトリプレックスも作製して、クラスター関連効果があるか否かを評価した。デュープレックスの場合、標的とされる遺伝子はＢ２Ｍ及びＣＤ２４７であった。トリプレックスの場合、ＣＤ９５を追加した。
まとめると、以下の構築物を作製した。
デュープレックス：
ｍｉＲ－１０６ａ（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）
ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）－ｍｉＲ－１０６ａ（Ｂ２Ｍを標的とする）
ｍｉＲ－２０ｂ（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）
ｍｉＲ－１０６ａ（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－１０６ａ（ＣＤ２４７を標的とする）
トリプレックス：
ｍｉＲ－２０ｂ（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ９５を標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）
ｍｉＲ－１０６ａ（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－１０６ａ（ＣＤ９５を標的とする）－ｍｉＲ－１０６ａ（ＣＤ２４７を標的とする）
ｍｉＲ－１０６ａ（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－１８ｂ（ＣＤ９５を標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）
結果を図１２Ａ～Ｃに示す。図１２に示すように、評価したデュープレックスはすべて、ＣＤ２４７及びＢ２Ｍの両方を下方調節するのに非常に効率的であった。特にＣＤ２４７ノックダウンは非常に効率的であることが示され、かろうじて検出可能なレベルのＣＤ３Ｚが得られた。Ｂ２Ｍは非常に多いので、ノックダウンは完全ではないと予想されたが、Ｂ２Ｍレベルの８０％を超える減少が一貫して達成された。驚くべきことに、下方調節のレベルは、デュープレックス中のスカフォールドの順番に関係なく同一である。
同一のｓｈＲＮＡをマルチプレックス化する場合、組換えにより問題が生じ、発現がはるかに低くなり、最終的にノックダウンレベルが低くなることはよく知られている。これがまさに、異なるスカフォールドの組み合わせを評価する理由であった。それでも、これが現実に実現可能か否かを調べるために、二つ及び三つの同一のスカフォールドを試験した。同一のスカフォールドを有するデュープレックスの全て、及びｍｉＲ－２０ｂトリプレックススカフォールドは、異なるスカフォールドを有する二本鎖又はトリプレックスに匹敵する形質導入レベルを達成し、いずれも１５％超であった。しかしながら、ｍｉＲ－１０６ａトリプレックススカフォールドは非常に低い形質導入レベル（２％未満）をもたらし、それ以上は評価しなかった。ｍｉＲ－２０ｂスカフォールドのデュープレックスは、非同一スカフォールドを有するデュープレックスと同一のレベルの標的のノックダウンを達成した（図１２Ａ～Ｂ）。ｍｉＲ－１０６ａスカフォールドのデュープレックスはＣＤ３Ｚについて同一の下方調節を達成したが、Ｂ２Ｍノックダウンでは若干効果が低いが、レベルが約５０％減少し、これらのスカフォールドを複製することができ、依然として高いノックダウンを達成できることを示す（図１２Ｃ）。驚くべきことに、ｍｉＲ－２０ｂトリプレックススカフォールドは三つの異なるスカフォールドを有するトリプレックスに匹敵するノックダウンレベルを達成したが、三つの異なるスカフォールドを使用する方が各標的遺伝子について若干良好なノックダウンが得られ、このことは、有効性が幾分失われていることを示している（図１２Ａ～Ｂ）。三つの異なるｍｉＲＮＡスカフォールドを有するトリプレックススカフォールドは、デュープレックスと同一の標的の下方調節を達成する。さらに、ＣＤ９５は５０％を超えて下方調節され（図１２Ｂ～Ｃ）、このことは、クラスター状況で使用した場合のこの標的配列の結果と一致する（図１０Ｂ）。
これらの実験は、スカフォールドはクラスターの関連外で独立して充分に使用できることを示している。スカフォールドの順序は所望のノックダウンを達成するためには重要ではないようであり、ノックダウンを達成するためにはすべてのクラスターのスカフォールドが存在する必要はない。実際、単一のスカフォールドで充分であり、活性を失うことなく複製できる。ｍｉＲ－２０ｂをトリプレックスとして使用できることが示されたが、これは、異なるスカフォールドを使用するよりもわずかに効率が低いようである。それでも、ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターには六つの異なるスカフォールド配列があり、これらは効果を失うことなく複製できることを考慮すると、最大１２の標的のマルチプレックス化下方調節が原則として実現可能である。
実施例６ キメラスカフォールドを作製することによる個々のスカフォールドの最適化
個々のスカフォールドにおけるミスマッチ又はバルジの除去の代わりとして（実施例３を参照）、ミスマッチ及び／又はバルジ（例えばｍｉＲ－１８ｂ）を有する個々のスカフォールドのノックダウン効率は、ミスマッチを除去することによってスカフォールドを変異させることによるだけでなく、上側ステム／ループ領域を、高いノックダウン効率を有するスカフォールドのものと置換することによっても向上させることができるのは当然であると考えられた。実際、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド又はｍｉＲ－２０ｂスカフォールドのいずれかの上側ステム／ループ領域を使用して、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールドの上側ステム／ループ領域を置換した場合、選択された標的のノックダウン効率が有意に増加した（データは不掲載）。三つのｍｉＲ－１７パラログクラスター内にはいくつかの保存されたスカフォールドがあるので、これを他のスカフォールド配列についても評価することにした。結果から、実際、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉｒ－２０ｂ又はｍｉＲ－１７スカフォールドに類似したミスマッチ及びバルジがほとんどないスカフォールドを使用できることが示された。すなわち、ｍｉＲ－１７ファミリー由来のスカフォールド（ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールド）の上側ステム／ループ領域を、ｍｉＲ１０６ａ－３６３、ｍｉＲ１７－９２、ｍｉＲ１０６ｂ－２５クラスターのいずれかのスカフォールドの下側ステムと融合させて、ノックダウン効率を維持又は増加させることができた。例として、図１３はノックダウン有効性に対するスカフォールドの変化の影響を示す。この目的のために、四つの異なる構築物を試験した。ｓｈＲＮＡのないＣＡＲ Ｔだけを含む負の対照、及びｓｈＲＮＡを有する三つのＣＡＲ Ｔ細胞：ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド（Ｂ２Ｍを標的とする）及びｍｉＲ－２０ｂスカフォールド（ＣＤ２４７を標的とする）を有する一つのデュープレックス、ｍｉＲ－１８のループ領域が変更されているｍｉＲ－１０６ａスカフォールド（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド（ＣＤ９５を標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド（ＣＤ２４７を標的とする）を有するトリプレックス（実施例３を参照）、及びスカフォールドｍｉＲ－１８ｂの上側ステム／ループ領域がｍｉＲ－１７スカフォールドの上側ステム／ループ領域で置換されている、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド（ＣＤ９５を標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド（ＣＤ２４７を標的とする）を有するトリプレックス。図１３に見られるように、ＨＬＡ－Ｉ及びＴＣＲのノックダウンは三つの構築物全てで達成され、ＣＤ９５のノックダウンはトリプレックス構築物で達成される。しかしながら、キメラスカフォールド構築物は、より高い程度のＣＤ９５のノックダウンを達成した。同時に、ＣＤ９５を標的とするスカフォールドにおける変化も、スカフォールド及び標的配列のどちらも変化しないまま、ＨＬＡ－Ｉの発現の変化を誘導することが判明し（図１３、左パネル）、したがって、クラスターのマイクロプロセッシングの変化を示している。
これをさらに最適化するために、後者の構築物のスカフォールド配列（すなわち、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド（ＣＤ９５を標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド（ＣＤ２４７を標的とする）を有するトリプレックス、スカフォールドｍｉＲ－１８ｂの上側ステム／ループ領域はｍｉＲ－１７スカフォールドの上側ステム／ループ領域で置換されていた）を保持することによって、マイクロプロセッシングを一定に保つことにした。マイクロプロセッシングが標的配列に依存しないことを確実にするために、Ｂ２Ｍに対するさまざまな標的配列を評価した。結果を図１４に示す。トリプレックススカフォールドにおける四つの異なるＢ２Ｍ標的配列を、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド（Ｂ２Ｍを標的とする）及びｍｉＲ－２０ｂスカフォールド（ＣＤ２４７を標的とする）を有するデュープレックス並びにｓｈＲＮＡの無いＣＡＲ Ｔ細胞を含む負の対照に対して試験した。全てのトリプレックス構築物は、三つの標的全ての良好なノックダウンを達成した（図１４Ａ、Ｂ）。ＨＬＡ－Ｉ発現は、異なる標的配列のために多少のばらつきを示すが、他の二つの標的のノックダウンは一定のままであった。試験した四つの配列はすべて、ＴＣＲノックダウンを維持しつつ、少なくとも５０％のノックダウンを達成し、さらにＣＤ９５の高いノックダウンを達成した。
配列のノックダウンによって機能的結果も得られるか否かをチェックするために、トリプレックススカフォールドでさらに形質導入したＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて様々な機能的アッセイを実施した。結果を図１５に示す。養子Ｔ細胞のＢ２Ｍを標的とすることにより、ＨＬＡ－Ｉが下方調節され、それによって、Ｔ細胞非自己認識が阻害され、宿主対移植片反応が防止されるはずである。しかしながら、ＨＬＡが完全に枯渇すると、細胞はＮＫによる細胞殺滅のプレイとなり、このために、遺伝子編集細胞療法は典型的にはＨＬＡ－Ｅの同時発現を必要とするのである。ＨＬＡ－Ｉが下方調節されるが、細胞がＮＫによる細胞溶解によって完全に除去されるほどではないので、Ｂ２Ｍのノックダウンはこの点では有益であると推測した。図１５Ａに示すように、細胞をＮＫ細胞と同時培養した場合、トリプレックスｓｈＲＮＡスカフォールドで達成されるＢ２Ｍの下方調節により、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞がＮＫによる殺滅から保護される。比較として、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９でＢ２ＭがノックアウトされたＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔを使用し、アロジェニックＮＫ細胞で完全に溶解させた。重要なことに、図１５Ｂに示すように、Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡは、Ｂ２Ｍノックアウトと同様にＴ細胞非自己認識を阻害し、ｓｈＲＮＡのないＣＡＲでの５０％に対して、細胞の８０％が生存したままである。最後に、ＣＤ９５（Ｆａｓ受容体）に対するｓｈＲＮＡの影響を試験するために、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＦａｓリガンドと共にインキュベートした。図１５Ｃに見られるように、ＣＤ９５に対するｓｈＲＮＡ（トリプレックススカフォールドにおいて）はＦａｓＬを介したアポトーシスに対して防御する。
これらの結果は、キメラスカフォールドがクラスターに含まれる場合にｓｈＲＮＡをうまくマルチプレックス化できることを示す。
実施例７ キメラクラスターを作成することによるクラスターの最適化
ｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドの上側ステム及びループ領域は、ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスターのノックダウン効率を最適化するのに有益であることが証明されたので、ｍｉＲ－１７ファミリーのスカフォールドのみを用いてマルチプレックス化クラスターを作成できるか否かを評価した。この目的のために、三つの異なるｍｉＲ１７－９２パラログクラスター由来の四つのｓｈＲＮＡスカフォールド：ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスター由来のｍｉＲ－１０６ａ及びｍｉＲ－２０ｂ；ｍｉＲ－１０６ｂ－２５クラスター由来のｍｉＲ－９３並びにｍｉＲ－１７－９２クラスター由来のｍｉＲ－２０ａを含むフォープレックスｓｈＲＮＡクラスターを設計した。標的遺伝子は、ｍｉＲ－１０６ａ中のＢ２Ｍ、ｍｉＲ－２０ｂ中のＣＤ３ゼータ（前記の通り）、ｍｉＲ－９３中のＭＩＣＡ（ＮＫＧ２Ｄリガンド）及びｍｉＲ－２０ａ中のＣＤ２８であった。構築物の略図を図１６Ａに示す。野生型／天然のフランキング配列をリンカーとして使用し（実施例５を参照）、変更されたマイクロプロセッシングのリスクを最小限にするために、スカフォールド間に追加の制限部位を挿入しなかった。ノックダウンを、ｓｈＲＮＡの無い負の対照並びに同一のｍｉＲ－１０６ａスカフォールド（Ｂ２Ｍを標的とする）及びｍｉＲ－２０ｂスカフォールド（ＣＤ２４７を標的とする）のデュープレックスと比較した。図１６Ｂ、左及び右のパネルに示すように、ＴＣＲ及びＨＬＡクラスＩのノックダウンはデュープレックス及びフォープレックス構築物で類似している。さらに、フォープレックスは、ＣＤ２８の発現のノックダウン（図１６Ｂ、中央パネル）、及びＭＩＣＡの発現のノックダウン（図１６Ｃ）に成功する。したがって、スカフォールドの関連（したがって、プロセッシング）は野生型クラスターと比べて変化しているが、ｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドを組み合わせてマルチプレックスノックダウンを達成できることは明らかである。さらに、達成された高レベルのノックダウンによって示されるように、これは組換えに遭遇しない。
これをさらに裏付けるために、さらなるスカフォールドを追加することにした。図１６Ａに示すフォープレックススカフォールドにｍｉＲ－１７スカフォールドを添加することによってファイブプレックススカフォールドを作製した。このスカフォールドの標的配列はＣＤ９５であった。
このファイブプレックススカフォールドを、二つの他のファイブプレックススカフォールド：標的配列が同一のままであるが、二つ（ＭＩＣＡ及びＣＤ２８）は位置効果を評価するためにスカフォールドから交換したもの、及び異なる無関係なスカフォールドについて最適化された、異なるＢ２Ｍ及びＣＤ３ゼータ配列を使用したものと比較した。無関係なスカフォールドのマイクロプロセッシングは異なる可能性があるので、最適化されていない配列の使用が有効な戦略であるか否かをチェックしようとした。
ファイブプレックス１：ｍｉＲ－１０６ａ（最適化されていない配列を有するＢ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（最適化されていない配列を有するＣＤ２４７を標的とする）－ｍｉＲ－９３ｂ（ＣＤ２８を標的とする）－ｍｉＲ－２０ａ（ＭＩＣＡを標的とする）－ｍｉＲ－１７（ＣＤ９５を標的とする）
ファイブプレックス２：ｍｉＲ－１０６ａ（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）－ｍｉＲ－９３ｂ（ＣＤ２８を標的とする）－ｍｉＲ－２０ａ（ＭＩＣＡを標的とする）－ｍｉＲ－１７（ＣＤ９５を標的とする）
ファイブプレックス３：ｍｉＲ－１０６ａ（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）－ｍｉＲ－９３ｂ（ＭＩＣＡを標的とする）－ｍｉＲ－２０ａ（ＣＤ２８を標的とする）－ｍｉＲ－１７（ＣＤ９５を標的とする）
結果を図１７に示す。ファイブプレックス２及び３は５つの標的遺伝子すべてにおいてノックダウンを達成し（図１７Ａ及びＢ）、これは、クラスターのノックダウン又はマイクロプロセッシングに影響を及ぼすことなく、関連するスカフォールド内で標的配列を切り替えることができることを示している。しかしながら、これは、関連するスカフォールドを最適化した標的配列にのみ当てはまるようである。ＴＣＲのノックダウンは、ファイブプレックス１ではあまり効率的ではなく、ＨＬＡ－Ｉのノックダウンはほとんど存在しない。さらに、これらの四つの標的に使用したスカフォールド及び配列がファイブプレックス２及び３におけるものと同一であったにもかかわらず、ＣＤ９５及びＣＤ２８のノックダウンは効率が低いようであり（図１７Ａ）、ＭＩＣＡのノックダウンも成功しない（図１７Ｂ）。これは、また、複数の配列のノックダウンに影響を及ぼすマイクロプロセッシングの変化を示す（図１３も参照）。したがって、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のスカフォールドで機能する配列は、マルチプレックス状況においても、ｍｉＲ－１７ファミリー由来の様々なスカフォールドで使用できる。しかしながら、他のスカフォールドで使用できる配列をｍｉＲ－１７ファミリークラスターで自動的に使用することはできない。
実施例８ キメラクラスターをキメラスカフォールドと組み合わせることによるクラスターの最適化
実施例６及び７に示すように、最適マルチプレックス化の結果は、次善のスカフォールドをｍｉＲ－１７ファミリー上側ステム／ループ領域でキメラにすることによって（実施例６）又は様々なｍｉＲ－１７－９２パラログクラスター由来のいくつかのｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドと組み合わせることによって（実施例７）修飾される場合に達成される。次に、これらの二つの戦略を組み合わせて、さらに高いマルチプレックス化を達成できるか否かを評価した。
まず、以下のようなファイブプレックスキメラ構築物を設計した。
ｍｉＲ－１０６ａ（Ｂ２Ｍを標的とする）－最適化ｍｉＲ－１８ｂ（ＣＤ９５を標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）－ｍｉＲ－９３ｂ（ＭＩＣＡを標的とする）－ｍｉＲ－１７（ＣＤ２８を標的とする）由来の上側ステム／ループ領域を有するキメラｍｉＲ－９２ａ２。図１８Ａ中のスキームを参照。
本質的に、これは、ｍｉＲ－９２ａ２由来の下側ステム並びにｍｉＲ－１７由来の上側ステム及びループを有するさらなるキメラスカフォールド（ｍｉＲ－１０６ａ－３６３クラスター由来のスカフォールド）を有する、ｍｉＲ－９３ｂスカフォールドと融合させた（実施例７で行った通り）実施例６で記載したトリプレックス構築物である。
このファイブプレックス構築物をトリプレックス構築物（ｍｉＲ－１０６ａ（Ｂ２Ｍを標的とする）－最適化ｍｉＲ－１８ｂ（ＣＤ９５を標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）のみからなる）と比較した場合、ファイブプレックスは、標的遺伝子のノックダウンを達成するのに少なくともトリプレックスと同等に効率的であることがわかる。図１８Ｂの上及び中央のヒストグラムは、下の対照ヒストグラムと比較して明らかな減少を示す。図１８Ｃは図１８Ｂと同一であるが、相対的ＭＦＩとしての結果を示す。トリプレックスは、三つの標的遺伝子のノックダウンに成功し、ファイブプレックスは、五つの遺伝子を全て同程度に下方調節する。
最後に、さらなるキメラスカフォールドを追加することによって、今回はｍｉＲ－３６３下側ステム並びにｍｉＲ－２０ａ上側ステム及びループを使用してシックスプレックスクラスターを設計した。
設計は以下のとおりである。
ｍｉＲ－１０６ａ（ＣＤ３８を標的とする）－最適化されたｍｉＲ－１８ｂ（ＣＤ９５を標的とする）－ｍｉＲ－２０ｂ（ＣＤ２４７を標的とする）－ｍｉＲ－９３ｂ（Ｂ２Ｍを標的とする）－ｍｉＲ－１７由来の上側ステム／ループ領域を有するキメラｍｉＲ－９２ａ２（ＣＤ２８を標的とする）－ｍｉＲ－２０ａ由来の上側ステム／ループ領域を有するキメラｍｉＲ－３６３（ＣＤ２７を標的とする）。
見てわかるように、Ｂ２Ｍ標的配列は、異なる隣接してないスカフォールドで試験した。図１９Ａに示すように、六つの遺伝子すべてが、ｓｈＲＮＡのない対照と比較してノックダウンされた。図１９Ｂは、図１９Ａと同一であるが、相対的ＭＦＩとしての結果を示す。Ｂ２Ｍを除いて、すべての標的は５０％を超えるノックダウンを達成し、おそらくは当該標的が多いという事実によると思われる。
ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲＮＡスカフォールドを使用する場合のマルチプレックス化ノックダウン、ｍｉＲ－１７ファミリースカフォールド由来の上側ステム／ループ領域を使用してキメラスカフォールドを作製することにより、及び／又はキメラクラスターを作製し、異なるパラログクラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドを使用することにより、さらに改善できるノックダウンを一貫して示した。
本発明は、本明細書に単なる例として記載された特定の詳細に限定されるものではなく、本発明の範囲内で様々な修正及び変更が可能であることが認識されるであろう。
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Claims (15)

  1. 改変スカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子であって、前記改変スカフォールドは、下側ステム領域と上側ステム／ループ領域とを含み、前記スカフォールドの前記下側ステム領域は、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドのものであり、前記スカフォールドの前記上側ステム／ループ領域の少なくとも一部は、野生型配列と異なるように改変されている、核酸分子。
  2. 前記改変スカフォールドの前記下側ステム領域が、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－１８ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－ｌスカフォールド、ｍｉＲ－９２－１スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－１８ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１９ｂ－２スカフォールド、ｍｉＲ－９２－２スカフォールド、ｍｉＲ－３６３スカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、ｍｉＲ－２５スカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記改変スカフォールドがキメラスカフォールドであり、前記上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が、前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来のものではなく、前記上側ステム／ループ領域のうちの前記少なくとも一部が、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、請求項１又は２に記載の核酸分子。
  4. 前記少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子が少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 異なるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む核酸分子であって、前記少なくとも二つの異なるスカフォールドがｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドの下側ステム領域を有し、
    少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子がキメラスカフォールドを有し、
    前記上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が、前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、
    前記上側ステム／ループ領域の前記少なくとも一部が、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択され、及び／又は、
    前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子由来の前記スカフォールドが、異なるｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドである、核酸分子。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む改変免疫細胞における発現に適したベクター。
  7. 対象のタンパク質をコードする第一外因性核酸分子と、
    改変スカフォールドを有する少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子を含む第二核酸分子と、
    を含む改変細胞であって、前記スカフォールドの下側ステム領域が、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドのものであり、前記スカフォールドの上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が、野生型配列とは異なるように改変されている、改変細胞。
  8. 対象のタンパク質をコードする第一外因性核酸分子と、
    異なるスカフォールドを有する少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子を含む第二核酸分子と、を含む改変細胞であって、前記少なくとも二つの異なるスカフォールドが、ｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲスカフォールドの下側ステム領域を有し、
    少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子は、上側ステム／ループ領域のうちの少なくとも一部が、前記下側ステム領域と同一のｍｉＲスカフォールド由来ではなく、前記上側ステム／ループ領域の前記少なくとも一部が、ｍｉＲ－１７スカフォールド、ｍｉＲ－２０ａスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ａスカフォールド、ｍｉＲ－２０ｂスカフォールド、ｍｉＲ－１０６ｂスカフォールド、及びｍｉＲ－９３スカフォールドから選択される、キメラスカフォールド、を有し、及び／又は、
    前記少なくとも二つのＲＮＡ干渉分子由来の前記スカフォールドが、異なるｍｉＲ－１７ファミリークラスター由来のｍｉＲ－１７ファミリースカフォールドである、改変細胞。
  9. 改変免疫細胞である、請求項７又は８に記載の改変細胞。
  10. 前記改変免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、幹細胞、前駆細胞、及びｉＰＳＣ細胞から選択される、請求項９に記載の改変細胞。
  11. 前記対象のタンパク質が、受容体、特に、キメラ抗原受容体又はＴＣＲである、請求項７～１０のいずれか一項に記載の改変細胞。
  12. 前記少なくとも一つのＲＮＡ干渉分子が、一つのプロモータの制御下にある少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である、請求項７～１１のいずれか一項に記載の改変細胞。
  13. 前記少なくとも二つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子が少なくとも三つのマルチプレックス化ＲＮＡ干渉分子である、請求項１２に記載の改変細胞。
  14. 薬剤として使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項６に記載のベクター、又は請求項７～１３のいずれか一項に記載の改変細胞。
  15. がんの治療で使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項６に記載のベクター、又は請求項７～１３のいずれか一項に記載の改変細胞。
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