KR20240005804A

KR20240005804A - 개선된 조작된 키메라 스캐폴드 및 다중화된 억제성 rna 클러스터

Info

Publication number: KR20240005804A
Application number: KR1020237041081A
Authority: KR
Inventors: 아이탄 브레만; 미하일 스테클로브; 마테오 로시
Original assignee: 셀리아드 온콜로지 에스.에이.
Priority date: 2021-05-04
Filing date: 2022-05-04
Publication date: 2024-01-12
Also published as: GB202106354D0; CA3219755A1; CN117396605A; AU2022269833A1; WO2022233982A1; EP4334449A1; JP2024516283A

Abstract

본 출원은 RNA 간섭 분야, 특히 입양 세포 요법(ACT)과 같은 면역요법에 적용되는 RNA 간섭 분야에 관한 것이다. 본 발명에서는, 다중 표적들을 하향 조절하도록 설계된 다중 shRNA 스캐폴드들의 키메라 클러스터들이 제안된다. 또한, shRNA 및 이러한 shRNA를 발현하는 세포들을 포함하는 벡터들인 폴리뉴클레오티드들이 단독으로 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 관심 단백질과 조합되어 제안된다. 이들 세포들은 면역요법에 사용하기에 특히 적합하다.

Description

개선된 조작된 키메라 스캐폴드 및 다중화된 억제성 RNA 클러스터

본 발명은 RNA 간섭, 더욱 상세하게는 입양 세포 요법(adoptive cell therapy; ACT)과 같은 면역요법에 적용되는 RNA 간섭의 분야에 관한 것이다. 본 발명에서, 다중 표적들(multiple targets)을 하향조절(downregulate)하도록 설계된 다중 shRNA 스캐폴드들의 키메라 클러스터들이 제안된다. 또한, 폴리뉴클레오타이드들, 상기 shRNA들을 포함하는 벡터들 및 이러한 shRNA들을 단독으로 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 관심 단백질과 조합하여 발현하는 세포들도 제안된다.　이들 세포들은 면역요법에 사용하기에 특히 적합하다.

효율적 방식으로 형질도입하기 어려운 세포들에서 다중 표적들을 동시에 하향조절하는 것은 공지된 문제이다.　다중 게놈 엔지니어링 방법은 종종 복잡하다. 다중 게놈 엔지니어링에서 직면하는 문제들을 해결하고자 할 때, 유전자 녹아웃(genetic knockout) 대신에 녹다운 가능성을 제공하는 시스템들을 고려할 수 있으며, 이는 유연성을 더 높일 수 있다(예로서, 시간적 조절이 가능해질 것이다).　이상적으로, 이러한 시스템들은 또한 (각 표적에 대해 별도의 단백질들을 조작할 필요가 없거나, 단일 형질도입 단계에서 하향 조절이 달성될 수 있도록) 덜 복잡하고, 충분히 효율적이고 특이적이어야 한다.

고려될 수 있는 하나의 솔루션은 RNA 간섭(RNAi)이다.　RNAi 유전자 조절의 여러 메커니즘들이 식물들과 동물들에 존재한다.　첫 번째는 마이크로RNA("miRNA")로 불리는 작은 비암호화(non-coding) RNA의 발현을 통한 것이다.　miRNA는 분해를 위해 특정 메신저 RNA("mRNA")들을 표적으로 할 수 있고, 이에 의해 유전자 침묵을 촉진할 수 있다.

유전자 활성의 조절에서 마이크로RNA 경로의 중요성 때문에, 현재 연구자들은 인공적으로 설계된 분자들인 작은 간섭 RNA("siRNA")들이 RNAi를 매개할 수 있는 정도에 대해 연구하고 있다.　siRNA들은 mRNA와 같은 표적 분자의 절단을 유발할 수 있으며, miRNA와 유사하게, 표적 분자를 인식하기 위해 siRNA들은 염기들의 상보성에 의존한다.

siRNA들로 알려진 분자들의 부류 내에는 짧은 헤어핀 RNA("shRNA")가 있다.　shRNA들은 센스 영역 및 상기 센스 영역과 혼성화할 수 있는 안티센스 영역을 포함하는 단일 가닥 분자이다.　shRNA들은 센스 영역 및 안티센스 영역이 줄기의 일부 또는 전체를 형성하는 줄기 및 루프 구조를 형성할 수 있다.　shRNA들을 사용하는 한 가지 이점은, 그들은 단일 단위 또는 다중 구성요소 시스템의 일부로서 통합될 수 있는 개별적 단일 개체로서 전달되거나 전사될 수 있다는 것이고, 이는 siRNA가 분리된 이중 가닥인 경우에는 원칙적으로 가능하지 않다. 그러나, 다른 siRNA들과 마찬가지로, shRNA들도 염기들의 상보성을 기반으로 mRNA를 표적으로 삼는다.

많은 상태, 질병 및 장애들은 복수의 단백질들 사이의 상호 작용 또는 그들 중에서의 상호작용에 의해 유발된다.　따라서, 연구자들은 다중 siRNA들을 세포 또는 유기체 내에 동시에 전달할 수 있는 효과적인 방법들을 찾고 있다.

하나의 전달 옵션은 내인성(endogenous) miRNA 경로를 통해 처리될 세포들 내에서 shRNA들을 발현시키기 위한 벡터 기술의 사용이다.　각각의 shRNA에 대해 별도의 벡터들을 사용하는 것은 복잡할 수 있다. 따라서, 연구자들은 복수의 shRNA들을 발현할 수 있는 벡터들의 사용을 탐구하기 시작하였다.　유감스럽게도, 보고된 문헌은 단일 벡터에서 여러 shRNA들을 발현할 때 해결해야할 몇 가지 문제들을 설명한다.　연구자들이 직면한 문제들은 다음과 같다: (a) 벡터 재조합 및 shRNA 발현 손실의 위험;　(b) 다중 카세트에서의 위치 효과(예로서, 2차 구조의 결과)로 인한 shRNA 기능성 감소;　(c) shRNA 클로닝의 복잡성;　(d) RNAi 처리 포화;　(e) 세포독성;　및 (f) 바람직하지 않은 표적-이탈(off-target) 효과.

또한, siRNA가 특정의 형질전환된 포유동물 세포주에서 단기 유전자 억제에 효과적인 것으로 나타났지만, 1차 세포 배양 또는 안정한 전사체 녹다운에 사용하기에는 더 많은 과제가 있음이 입증되었다.　녹다운 효능은 ＜10% 내지 ＞90% 사이의 범위로 광범위하게 변하는 것으로 알려져 있으므로(예로서, Taxman et al., 2006), 추가의 최적화가 필요하다.　둘 이상의 억제제가 발현되면, 일반적으로 효능이 감소하므로, 그러한 설정에서는 상기한 최적화가 훨씬 더 중요하다.

따라서, 다중화된 RNA 간섭 분자들의 전달을 위한 효율적인 카세트들 및 벡터들을 개발할 필요가 남아 있다.　일반적으로 세포 적용을 위한 것은 사실이지만, ACT 분야에서는 훨씬 덜 연구되어 있으며, 이러한 세포들에서 효율적인 시스템들에 대한 높은 필요성이 있다.

따라서, 다단계 생산 방법을 필요로 하지 않고(따라서 비교적 제조 용이성과 비용 절감을 제공하고), (예를 들어, 변화들이 가변성이게 하고, (예로서, 독성을 피하기 위해) 녹다운의 감쇠 및 하나의 표적에서 다른 표적으로의 교체를 가능하게 하는) 유연성을 제공하는, 표적들의 다중화 녹다운으로 세포 요법을 가능하게 하는 시스템들을 제공할 필요성이 당분야에 존재한다.

놀랍게도, 본 발명에 의해, shRNA가 세포들, 특히 조작된(engineered) 면역 세포들 내에서 성공적으로 다중화될 수 있을 뿐 아니라, miR-17 miRNA 계열(family) 클러스터(즉, miR-17-92 파라로그들 중 하나)의 스캐폴드들, 특히 다중화된 스캐폴드들, 특히 miR-106a~363 클러스터, miR-17~92 클러스터, miR106b-25 클러스터 및 이들의 조합, 특히 이들의 키메라 조합(chimeric combination)에서 발견되는 것과 같은 스캐폴드들을 사용함으로써, 다중 표적들이 또한 매우 효율적으로 하향조절된다는 것이 입증되었다. 상기 키메라 조합은 키메라 클러스터들(상기 3가지의 다른 클러스터들의 스캐폴드들이 새로운 클러스터를 생성하는 데 사용됨) 또는 키메라 스캐폴드들(상기 스캐폴드의 적어도 하부 줄기 부분은 상부 줄기 부분 및/또는 루프 부분과는 다른 miRNA에서 유래함), 또는 상기 둘의 조합일 수 있다.

따라서, 본 발명의 대상들은 다음과 같은 청구항들에서 제공된다:

1. 조작된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 포함하는 핵산 분자로서, 상기 조작된 스캐폴드는 하부 줄기 영역(lower stem region) 및 상부 줄기 영역/루프(loop) 영역을 포함하고, 상기 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역이고, 상기 스캐폴드의 상부 줄기 영역/루프 영역의 적어도 일부는 야생형/천연 서열과 상이하도록 조작된, 핵산 분자.

2. 제1항에 있어서, 상기 조작된 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-l 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, miR-363 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드, miR-25 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되는, 핵산 분자.

3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조작된 스캐폴드는 키메라 스캐폴드이고, 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 상기 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되는, 핵산 분자.

4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자인, 핵산 분자.

5. 상이한 스캐폴드들을 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들을 포함하는 핵산 분자로서, 적어도 2개의 상이한 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역을 갖고;

- 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 키메라 스캐폴드를 가지며, 상기 키메라 스캐폴드에서 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되고; 그리고/또는

- 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들 유래의 스캐폴드들은 상이한 miR-17 계열 클러스터들 유래의 miR-17 계열 스캐폴드인, 핵산 분자.

6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 조작된 면역 세포에서의 발현에 적합한 벡터.

7. 다음을 포함하는 조작된 세포:

o 관심 단백질을 인코딩하는 제1 외인성 핵산 분자, 및

o 조작된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 포함하는 제2 핵산 분자, 여기서 상기 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역이며, 상기 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 야생형/천연 서열과 상이하도록 조작되었다.

8. 다음을 포함하는 조작된 세포:

o 관심 단백질을 인코딩하는 제1 외인성(exogenous) 핵산 분자, 및

o 상이한 스캐폴드들을 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들을 포함하는 제2 핵산 분자, 여기서 적어도 2개의 상이한 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역을 가지고; 그리고

- 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 키메라 스캐폴드를 가지고, 상기 키메라 스캐폴드에서 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되고; 그리고/또는

- 상기 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들로부터의 스캐폴드들은 상이한 miR-17 계열 클러스터들 유래의 miR-17 계열 스캐폴드이다.

9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 조작된 세포는 조작된 면역 세포인, 조작된 세포.

10. 제9항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 줄기 세포, 전구 세포 및 iPSC 세포로부터 선택되는, 조작된 세포.

11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질이 수용체, 특히 키메라 항원 수용체 또는 TCR인, 조작된 세포.

12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 하나의 프로모터의 제어 하에 있는 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들인, 조작된 세포.

13. 제12항에 있어서, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 적어도 3개의 다중화된 RNA 간섭 분자들인, 조작된 세포.

14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제6항에 따른 벡터 또는 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포에 있어서, 적어도 하나의 RNA 간섭 분자에 의해 표적화된 분자는 다음으로부터 선택되는, 핵산 분자, 벡터 또는 조작된 세포: MHC 클래스 I 유전자, MHC 클래스 II 유전자, MHC 보조수용체 유전자(예로서, HLA-F, HLA-G), TCR 사슬, NKBBiL, LTA, TNF, LTB, LST1, NCR3, AIF1, LY6, 열 충격 단백질(예로서, HSPA1L, HSPA1A, HSPA1B), 보체 연쇄반응, 조절 수용체(예로서, NOTCH4), TAP, HLA-DM, H LA-DO, RING1, CD52, CD247, HCP5, B2M, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2 , ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, 2B4, A2AR, BAX, BLIMP1, C160(POLR3A), CBL-B, CCR6, CD7, CD27, CD28, CD38, CD95, CD96, CD123, CD272(BTLA), CD276(일명 B7-H3), CIITA, CTLA4, DGK [DGKA, DGKB, DGKD, DGKE, DKGG, DGKH, DGKI, DGKK, DGKQ, DGKZ], DNMT3A, DR4, DR5, EGR2, FABP4, FABP5, FASN, GMCSF, HPK1, IL-10R [IL10RA, IL10RB], IL2, LAG3(CD223), LFA1, NEAT 1, NFkB(RELA, RELB, NFkB2, NFkB1, REL 포함), NKG2A, NR4A(NR4A1, NR4A2, NR4A3 포함), PD1, PI3KCD, PPP2RD2, PRAS40, RAPTOR, SHIP1, SOATI, SOCS1, T-BET, TCF7(일명 TCF-1), TET2, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TIGIT, TIM3(일명 HAVCR2 또는 CD366), TOX, TOX2, VISTA(일명 VSIR 또는 B7-H5), ZC3H12A(regnase-1 또는 MCPIP로도 알려짐) 및 ZFP36L2.

15. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제6항에 따른 벡터 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포.

16. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제6항에 따른 벡터 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포.

17. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포의 적절한 투여량을 암의 치료가 필요한 대상에게 투여함으로써 적어도 하나의 증상을 개선시키는 것을 포함하는 암 치료 방법.

18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제6항에 따른 벡터에 있어서, 상기 하부 줄기 영역 및/또는 3' 및/또는 5' 측에서 상기 영역에 인접한 최대 10개의 뉴클레오티드가 야생형/천연 서열과 다르도록 조작된, 핵산 분자 또는 벡터.

따라서, 본 발명의 목적은 miR-106a~363 클러스터에 존재하는 스캐폴드 중에서 선택된 스캐폴드, 특히 miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드 및 miR-363 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 특정 구체예들에 따르면, 상기 벡터는 진핵 세포, 특히 면역 세포에서의 발현에 적합하다. 상기 RNA 간섭 분자는 일반적으로 야생형/천연 스캐폴드 서열에는 존재하지 않는 표적 서열도 함유한다. 이는, 일반적으로, 마이크로RNA 스캐폴드의 야생형/천연발생 표적 서열(일반적으로 성숙 서열이라고 함)을 선택된 표적 서열, 예를 들어 표적 단백질을 인코딩하는 mRNA의 서열과 일치하는 표적 서열로 대체함으로써 달성된다. 가장 특히, 상기 표적 서열은 18-23개의 핵산 길이를 갖는다. 상기 표적 서열의 상보성 가닥은 일반적으로 패신저 서열로 지칭된다.

특정 구체예들에 따르면, 하나 이상의 RNA 간섭 분자의 스캐폴드들 중 적어도 하나는 miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, 및 miR-20b 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드이다.　다시 말하면, 이들 특정 구체예들에 따르면, miR-106a~363 클러스터의 처음 3개의 스캐폴드들에 존재하는 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드, 즉 miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, 및 miR-20b 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 인코딩하는 핵산 서열들을 포함하는 벡터들이 제공된다. 예를 들어, 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 miR-106a 스캐폴드를 가질 수 있는 반면, 다른 RNA 간섭 분자들은 독립적으로 선택된 스캐폴드, 예를 들어 miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, 및 miR-363 스캐폴드로부터 독립적으로 선택된 스캐폴드를 가질 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 하나 이상의 RNA 간섭 분자가 상기 벡터 내에 존재할 것이다.　이들 구체예들에 따르면, 상기 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자, 특히 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이다.　따라서, 이들 구체예들에 따르면, miR-106a~363 클러스터, miR-17~92 클러스터 및 miR106b-25 클러스터에 존재하는 것 중에서 선택된 스캐폴드를 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공된다. 특히, 상기 스캐폴드들 중 적어도 하나는 키메라일 것이고(여기서, 상기 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 상기 스캐폴드의 상부 줄기 영역 및/또는 루프 영역과는 다른 miRNA 스캐폴드로부터 유래함), 가장 특히, 상기 스캐폴드의 상부 줄기 영역 및 루프 영역은 miR-17 계열의 스캐폴드에서 유래한다. 대안적인(그러나 배타적이지 않은) 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들은 miR-106a~363 클러스터, miR-17~92 클러스터 및 miR106b-25 클러스터로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 클러스터들로부터의 miR-17 계열 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드를 갖는다. 즉, 상기 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들은 다음의 3 그룹 중 적어도 2 그룹으로부터 선택된다: miR-106a 스캐폴드 및 miR-20b 스캐폴드; miR-17 스캐폴드 및 miR-20a 스캐폴드; miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드.

적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이 존재하는 경우, 이들 2개 이상의 분자는 동일하거나 다른 스캐폴드를 가질 수 있다. 그러나, 특히 3개 이하의 스캐폴드가 동일할 것으로 고려되며, 더욱 특히 2개 이하의 동일한 스캐폴드가 사용되는 것이 고려된다. 이는, 동일한 스캐폴드 서열들 사이의 재조합을 피하기 위한 것이다(실시예 5 참조). 이러한 이유로, 위에서 설명한 바와 같이, 키메라 클러스터들 및/또는 키메라 스캐폴드 서열들을 갖는 클러스터들이 사용되는 것이 특히 고려된다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 벡터 내에 존재하는 스캐폴드들은, miR-106a~363 클러스터, miR-17~92 클러스터 및 miR106b-25 클러스터에 존재하는 15개의 스캐폴드들 중에서 독점적으로 선택된다(즉, miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-l 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드 , miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, miR-363 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드, miR-25 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택된다). 상기에서 개략한 바와 같이, 상기 스캐폴드들은 키메라 스캐폴드들일 수도 있으며, 여기서 하부 줄기 부분은 상기 15개 스캐폴드들 중 하나로부터 선택되고, 상부 줄기 및 루프 부분은 miR-17 계열 스캐폴드로부터 선택된다(즉, miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-93 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드 및 miR-106b 스캐폴드로부터 선택된다). 그러나, 이들은 (재조합을 피하기 위해) 다른 스캐폴드 서열들, 특히 miR-196a2 서열과 같은 다른 관련없는 서열들과 추가로 조합되는 것도 고려된다.

특정 구체예들에 따르면, 스캐폴드 서열은 상기 줄기 영역 내의 불일치(mismatch) 및/또는 돌출(bulge)의 수를 감소시키도록 조작되었을 수 있다. 보다 구체적으로, 사용되는 스캐폴드 서열 중 하나가 miR-18b 스캐폴드인 경우, 상기 스캐폴드는 줄기 영역 내의 불일치 및/또는 돌출의 수를 줄이기 위해 조작되었을 수 있다(야생형/천연 서열과 비교하여 변형됨)(실시예 3 참조).

추가 측면에 따르면, 본 발명에서, 상이한 스캐폴드들을 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조작된 세포가 제공되고, 여기서 적어도 2개의 상이한 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터로부터의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역을 가지며; 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 키메라 스캐폴드를 가지며, 상기 키메라 스캐폴드에서 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되고; 그리고/또는 상기 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들로부터의 스캐폴드들은 상이한 miR-17 계열 클러스터들 유래의 miR-17 계열 스캐폴드이다.

상기 RNA 간섭 분자는 전형적으로 야생형/천연 스캐폴드 서열에 존재하지 않는 표적 서열도 함유한다. 이를 위해, 각각의 miRNA 스캐폴드의 성숙한 서열은 선택된 표적 서열로 대체된다. 상기 표적 서열은 전형적으로 18~23개의 핵산 길이를 갖는다. 상기 표적 서열은 상기 조작된 세포에서 발생하는 서열, 특히 표적의 서열을 지향하는 것이 특히 고려된다. 즉, 상기 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 하향조절되어질 단백질을 인코딩하는 조작된 세포 내의 서열을 (염기쌍 상보성에 의해) 표적화(targeting)하는 서열을 갖는다.

추가의 구체예들에 따르면, 다음을 포함하는 조작된 세포들이 제공된다:

ｏ 관심 단백질을 인코딩하는 제1 외인성 핵산 분자,

ｏ 조작된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 포함하는 제2 핵산 분자, 여기서 상기 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 것이고, 상기 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 야생형/천연 서열과 다르도록 조작되었다.

추가 구체예들에 따르면, 상기 조작된 세포들은 다음을 포함한다:

- 관심 단백질을 인코딩하는 제1 외인성 핵산 분자;

- 상이한 스캐폴드들을 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들을 포함하는 제2 핵산 분자, 여기서, 적어도 2개의 상이한 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역을 가지고; 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 키메라 스캐폴드를 가지며, 상기 키메라 스캐폴드에서 상부 줄기템/루프 영역의 적어도 일부는 상기 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되고; 그리고/또는 상기 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들로부터의 스캐폴드들은 상이한 miR-17 계열 클러스터들 유래의 miR-17 계열 스캐폴드이다.

상기 제1 및 제2 외인성 핵산 분자는 하나의 벡터로서 제공될 수 있음이 이해되어야 한다.　대안적으로, 그들은 별개의 핵산 분자로서 제공될 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 상기 스캐폴드의 야생형/천연 표적 서열과 상이한(즉, miRNA 스캐폴드의 성숙 가닥과 상이한) 스캐폴드 내에 표적 서열을 포함한다.　상기 표적 서열은 전형적으로 18개 내지 23개 뉴클레오티드 길이이다.　특정 구체예들에 따르면, 상기 RNA 간섭 분자는 상기 표적 서열의 염기쌍 상보성을 통해 상기 조작된 세포 내의 표적을 지향한다.

적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이 존재할 경우, 이들 2개 이상의 분자들은 동일하거나 상이한 스캐폴드를 가질 수 있다.　그러나, 3개 이하의 스캐폴드가 동일한 것임이 특히 고려되고, 2개 이하의 동일한 스캐폴드가 사용되는 것이 더욱 특히 고려된다.　이는 동일한 스캐폴드 서열들 간의 재조합을 피하기 위한 것이다(실시예 5 참조).

상기 조작된 세포들은 특히 진핵 세포들, 보다 특별히는 조작된 포유동물 세포들, 더욱 특별히는 조작된 인간 세포들이다.　특정 구체예들에 따르면, 상기 세포들은 조작된 면역 세포들이다.　전형적인 면역 세포들은 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 줄기 세포, 전구(progenitor) 세포 및 iPSC 세포로부터 선택된다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 조작된 세포들은 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 더 함유한다.　특히, 상기 관심 단백질은 수용체, 특히 키메라 항원 수용체 또는 TCR이다.　키메라 항원 수용체들 또는 조작된 TCR들은 임의의 표적을 지향할 수 있으며, 전형적인 예로는 CD19, CD20, CD22, CD30, BCMA, B7H3, B7H6, NKG2D, HER2, HER3, GPC3, MUC1, MUC16, TAG72가 포함되지만, 더 많은 것들이 존재하고 또한 적합하다. 특정 구체예들에 따르면, 하나 이상의 관심 단백질이 존재할 수 있다.　이러한 경우에, 제2(또는 추가의) 단백질은 수용체일 수 있거나, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 항체, 조직적합성 항원(예로서, HLA-E), 태그, 또는 치료적 가치 또는 진단적 가치를 갖거나 검출할 수 있는 임의의 다른 단백질일 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 진핵생물 발현 플라스미드, 미니서클 DNA, 또는 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 센다이 바이러스에서 유래된) 바이러스 벡터와 같은 하나의 벡터 내에 존재한다.

상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은, 하향조절되어질 표적 분자들의 수와 상기 다중화된 분자들의 동시 발현의 관점에서의 실질적인 고려 사항들에 따라, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 이상의 분자들일 수 있다. 특정 구체예들에 따르면, 적어도 3개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이 사용된다.　추가의 특정 구체예들에 따르면, 상기 적어도 3개의 RNA 간섭 분자들 중 적어도 하나는 miR-106a 스캐폴드 및 miR-20b 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드를 갖는다.　대안적인 구체예들에 따르면, 상기 적어도 3개의 RNA 간섭 분자들 중 적어도 하나는 miR-106a 스캐폴드 및 miR-18b 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드를 갖는다.

특정 구체예들에 따르면, 스캐폴드 서열은 줄기 영역에서 불일치 및/또는 돌출의 수를 감소시키도록 조작된 것일 수 있다.　보다 구체적으로, 사용되는 스캐폴드 서열들 중 하나가 miR-18b 스캐폴드인 경우, 상기 스캐폴드는 상기 줄기 영역에서 불일치 및/또는 돌출의 수를 줄이기 위해 조작된 (그리고 야생형/천연 서열과 비교하여 변형된) 것일 수 있다(실시예 3 참조).

"다중체(multiplex)"는 동일한 유형의 복수의 분자들, 예를 들어, 복수의 siRNA 또는 shRNA 또는 miRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.　다중체 내에서, 분자들이 동일한 유형(예로서, 모두 shRNA)인 경우, 이들은 동일할 수 있거나 상이한 서열들을 포함할 수 있다.　동일한 유형의 분자들 사이에는 본 명세서에 기재된 링커들과 같은 개재 서열(intervening sequence)들이 존재할 수 있다.　본 발명의 다중체의 예는 복수의 탠덤(tandem) miRNA-기반 shRNA들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.　다중체는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 또는 단일 가닥인 영역들과 이중 가닥인 영역들을 모두 가질 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 하나의 프로모터의 제어 하에 있다. 전형적으로, 상기 프로모터는 U6 프로모터는 아니다. 이는, U6 프로모터는 특히 고수준의 발현 시에 독성과 관련되기 때문이다. 동일한 이유로, (U6 보다 더 약한 프로모터인) H1 프로모터들 또는 심지어 일반적인 Pol III 프로모터들(비록 이들이 어떤 조건들에서는 적합할 수 있다 하더라도)을 배제하는 것을 고려할 수 있다. 특별한 구체예들에 따르면, 상기 프로모터는 Pol II 프로모터 및 Pol III 프로모터로부터 선택된다. 특정 구체예들에 따르면, 상기 프로모터는 야생형/천연 또는 합성 Pol II 프로모터이다. 특정 구체예들에 따르면, 상기 프로모터는 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터, 연장인자 1 알파(EF1α) 프로모터(코어 또는 전장(full length)), 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase; PGK) 프로모터, 상류에 CMV IV 인핸서를 갖는 복합체 베타-액틴 프로모터(CAG 프로모터), 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터, 비장 병소 형성 바이러스(SFFV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 인터루킨-2 프로모터, 쥐 줄기세포 바이러스(MSCV) 긴 말단 반복(LTR), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(Gibbon ape leukemia virus; GALV) LTR, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, 및 tRNA 프로모터로부터 선택된 Pol II 프로모터이다. 이들 프로모터들은 mRNA 발현을 일으키기 위해 가장 통상적으로 사용되는 중합효소 II 프로모터들에 속하고, 일반적인 항존(house keeping) 유전자 프로모터들도 사용될 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 shRNA 분자들 또는 miRNA 분자들일 수 있다.　가장 특별히는, 그들은 miRNA 분자들이다.　shRNA 분자들과 miRNA 분자들 간의 차이점은, miRNA 분자들은 드로샤(Drosha)에 의해 처리되지만 통상의 shRNA 분자들은 처리되지 않는다는 것이다(이는 독성과 관련되어 있음, Grimm et al., Nature 441:537-541 (2006)).

특정 구체예들에 따르면, 상기 상이한 miRNA 분자들은 하나의 프로모터의 제어 하에 있다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 다중화된 RNA 간섭 분자들 중 적어도 2개는 동일한 표적을 지향한다.　동일한 표적에 대한 RNA 간섭 분자들은 여전히 다른 스캐폴드 서열 및/또는 다른 표적 서열을 가질 수 있다는 것에 주목해야 한다.　추가의 특정 구체예들에 따르면, 상기 다중화된 RNA 간섭 분자들 중 적어도 2개는 동일한 스캐폴드들을 가지지만 상이한 표적 서열들을 갖는다.　대안적인 특정 구체예들에 따르면, 상기 다중화된 RNA 간섭 분자들 중 적어도 2개는 상이한 스캐폴드들을 가지지만 동일한 표적 서열들을 갖는다.　특정 구체예들에 따르면, 상기 다중화된 RNA 간섭 분자들 중 적어도 2개는 동일하다.

대안적인 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 모두 상이하다.　추가의 특정 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들 모두는 상이한 표적들을 지향한다.　다른 표적들을 지향하는 RNA 간섭 분자들은 여전히 동일한 스캐폴드를 가질 수 있다(그러나 다른 표적 서열을 가짐)는 것에 주목해야 한다.　

상기 조작된 세포에 존재하는 임의의 적합한 분자는 인스턴트(instant) RNA 간섭 분자들에 의해 표적화될 수 있다.　고려되는 표적들의 전형적인 예들은 다음과 같다: MHC 클래스 I 유전자, MHC 클래스 II 유전자, MHC 공동수용체 유전자(예로서, HLA-F, HLA-G), TCR 사슬, CD3 사슬, NKBBiL, LTA, TNF, LTB, LST1, NCR3, AIF1, LY6, 열 충격 단백질(예로서, HSPA1L, HSPA1A, HSPA1B), 상보체 캐스케이드, 조절 수용체들(예로서, NOTCH4), TAP, HLA-DM, HLA-DO, RING1, CD52, CD247, HCP5, B2M, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, 2B4, A2AR, BAX, BLIMP1, C160 (POLR3A) , CBL-B, CCR6, CD7, CD27, CD28, CD38, CD95, CD96, CD123, CD272 (BTLA), CD276 (일명 B7-H3), CIITA, CTLA4, DGK [DGKA, DGKB, DGKD, DGKE, DKGG, DGKH, DGKI, DGKK, DGKQ, DGKZ], DNMT3A, DR4, DR5, EGR2, FABP4, FABP5, FASN, GMCSF, HPK1, IL-10R [IL10RA, IL10RB], IL2, LAG3(CD223), LFA1, NEAT 1, NFkB (RELA, RELB, NFkB2, NFkB1, REL 포함), NKG2A, NR4A (NR4A1, NR4A2, NR4A3 포함), PD1, PI3KCD, PPP2RD2, PRAS40, RAPTOR, SHIP1, SOAT1, SOCS1, T-BET, TCF7(일명 TCF-1), TET2, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TIGIT, TIM3(일명 HAVCR2 또는 CD366), TOX, TOX2, VISTA(일명 VSIR 또는 B7-H5), ZC3H12A(regnase-1 또는 MCPIP로도 알려짐) 및 ZFP36L2.

특히 적합한 구축물(construct)들은 miRNA 기반인 것이 확인되었다.　따라서, 마이크로RNA-기반 shRNA 인코딩 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 세포들이 제공되며, 여기서 상기 마이크로RNA-기반 shRNA 인코딩 영역은 다음을 인코딩하는 서열들을 포함한다:

하나 이상의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열들, 여기서 각각의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열은

ｏ miRNA 스캐폴드 서열,

ｏ 활성(active) 서열 또는 성숙(mature) 서열, 및

ｏ 패신저 서열 또는 스타 서열을 포함하고,

여기서 각각의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열 내에서, 상기 활성 서열은 상기 패신저 서열에 대해 적어도 70% 상보적이다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 활성 서열은 상기 패신저 서열에 대해 적어도 80% 상보적이고, 상기 패신저 서열에 대해 적어도 90% 또는 그 이상 상보적일 수 있다.

특정 이점은 인스턴트 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열들이 다중화될 수 있다는 점이다.　따라서, 다중화된 마이크로RNA-기반 shRNA 인코딩 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 세포들이 제공되며, 여기서 상기 다중화된 마이크로RNA-기반 shRNA 인코딩 영역은 다음을 인코딩하는 서열들을 포함한다:

2개 이상의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열들, 여기서 각각의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열은

ｏ miRNA 스캐폴드 서열,

ｏ 활성 서열 또는 성숙 서열, 및

ｏ 패신저 서열 또는 스타 서열을 포함하고,

여기서 각각의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열에서, 상기 활성 서열은 상기 패신저 서열에 대해 적어도 70% 상보적이다.

각각의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열들의 활성 서열 및 패신저 서열 둘 모두는 전형적으로 18개 내지 40개 뉴클레오티드 길이, 보다 특별히는 18개 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 더욱 특별히는 18개 내지 25개 뉴클레오티드 길이, 가장 특별히는 18개 및 23개 뉴클레오티드 길이이다. 상기 활성 서열은 또한 18개 또는 19개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.　전형적으로, 상기 패신저 서열은 상기 활성 서열과 동일한 길이를 갖지만, 돌출들의 가능한 존재는 그들의 길이가 항상 동일하지는 않다는 것을 의미한다.

전형적으로, 상기 마이크로RNA 스캐폴드 서열들은 링커들에 의해 분리된다.　특정 구체예들에 따르면, 5' 및/또는 3' 링커 서열의 적어도 일부가 각각 그에 대응되는 스캐폴드와 함께 사용된다.

인공 서열들은, 예를 들어, 내인성 miR 서열들이 특정 표적에 대해 조작된 shRNA 서열들로 치환된 야생형/천연발생 스캐폴드들(예로서, miR 클러스터 또는 그의 단편, 예를 들어 miR-106a~363 클러스터)일 수 있고, 또는 내인성 miR 서열들이 특정 표적에 대해 조작된 shRNA 서열들로 치환된 단일 miR 스캐폴드(예로서, miR-20b 스캐폴드)일 수 있고, 또는 2개의 상이한 miRNA 스캐폴드들 유래의 (하부 줄기 영역, 상부 줄기 영역 및 루프 영역과 같은) 요소들, 인공 miR-유사 서열들 또는 이들의 조합을 조합한 키메라 서열들일 수 있다.

상기 조작된 세포는 전형적으로 키메라 항원 수용체 또는 TCR과 같은 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 더 포함하고, 상기 기재된 바와 같은 조작된 면역 세포일 수 있다.

상기 적어도 하나의 RNA 간섭 분자의 발현 또는 상기 다중화된 RNA 간섭 분자들의 공동-발현은 상기 조작된 세포들 내에서 적어도 하나의 유전자, 그러나 전형적으로는 복수의 유전자들의 억제를 초래한다.　이것은 더 큰 치료 효능에 기여할 수 있다.

본 명세서에 기재된 조작된 세포들은 또한 의약으로서 사용하기 위해 제공된다.　특정 구체예들에 따르면, 상기 조작된 세포들은 암의 치료에 사용하기 위해 제공된다.

따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 세포의 적절한 투여량을 암 치료를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 적어도 하나의 증상을 개선시키는, 암을 치료하는 방법들 또한 제공된다.

상기 조작된 세포들은 자가 면역 세포들(환자로부터 얻은 세포들) 또는 동종이계 면역 세포들(다른 대상으로부터 얻은 세포들)일 수 있다.　

도 1: 표적 서열, 상부 줄기, 하부 줄기 및 스캐폴드와 같은 영역들이 표시된, 클러스터화된 스캐폴드들의 개략도.
도 2: 동일한 벡터로부터 CAR 및 다중 shRNA(예로서, 2, 4, 6, 8,...)의 공동 발현을 가능하게 하는 통합 miRNA 스캐폴드가 부재(상단) 또는 존재(하단)하는 CAR 발현 벡터(예로서, CD19, BCMA, B7H3, B7H6, NKG2D, HER2, HER3, GPC3)의 디자인을 나타낸다. LTR: 긴 말단 반복;　프로모터(예로서, EF1a, PGK, SFFV, CAG, ...);　마커 단백질(예로서, 절단된(truncated) CD34, CD19);　다중화된 shRNA들.
도 3: 야생형/천연 mRNA 클러스터들의 사용은 반복 조작된 단일 스캐폴드들과 비교하여 형질도입 효율을 증가시킨다.　T 세포들은 도 2에 도시된 디자인에 따라 CD19 CAR 및 3개 내지 6개의 다중화된 스캐폴드들을 인코딩하는 상이한 벡터들로 형질도입되었다. CD34는 리포터 유전자로 사용되었고, FACS에 의해 측정된 바의 형질도입 후 4일째의 CD34+ T 세포들의 %는 하단 패널에 표시된다.　상단 패널은 동일하지만 정제된 후(정제 컬럼으로부터 용출된 세포들의 양을 상기 정제 컬럼에 로딩된 세포들의 양으로 나눈 것)의 결과를 나타낸다.　1-2: miR-17-92 클러스터로부터의 스캐폴드들, 각각 4개의 스캐폴드들(miR-19a, miR-20a, miR-19bl, miR-92al) 및 3개의 스캐폴드들(miR-19a, miR-20a, miR-19bl);　3-5: miR-106a-363 클러스터로부터의 스캐폴드들, 각각 6(모두), 3(마지막 3개) 및 4(마지막 4개);　6:　106b-25 클러스터의 모든 3개의 스캐폴드들;　7: miR-23a~27a~24-2 클러스터의 모든 3개의 스캐폴드들;　8-9: miR-196a2 스캐폴드 서열의 각각 4 및 3 반복;　10: CD34 태그만을 갖는 모의(mock) 벡터.　상기 구축물들에 포함된 표적 유전자들은 삼중 스캐폴드들에 대해 B2M, CD52 및 CD247이었고, TRAC는 사중 스캐폴드들 내의 추가 유전자였다.　육중(hexaplex) 스캐폴드는 각각의 표적에 대해 2개의 서로 다른 표적 서열들을 사용하여 각각의 표적 유전자를 두 번 표적화하였다.
도 4: FACS에 의한 TCR 발현에 의해 평가된, 23a~27a~24-2 클러스터와 miR-106a-363 클러스터 간의 CD247(CD3zeta)의 녹다운 비교.　1: CD34 태그만 갖는 모의 벡터;　2: miR-23a~27a~24-2 클러스터로부터의 모든 3개의 스캐폴드들(miR-24-2 스캐폴드 내의 CD247 표적 서열);　3-5: miR-106a-363 클러스터로부터의 스캐폴드들, 각각 6(모두), 3(마지막 3개) 및 4(마지막 4개).　CD247 표적 서열은 miR-363 스캐폴드에 있다.　3에서, 추가의 다른 서열이 miR-20b 스캐폴드 내에 포함된다.
도 5: miRNA 106a-363 클러스터 및 도 6에 사용된 구축물들의 디자인을 나타낸다.
도 6: 106a-363miRNA 클러스터 내에 도입된, CD247, B2M 또는 CD52를 표적화하는 3×shRNA들 또는 6×shRNA들과 함께 제2 세대 CD19-지향 CAR, 절단된 CD34 선택마커를 인코딩하는 레토르바이러스 벡터를 이용하여 형질도입된 건강한 공여자로부터의 일차 T 세포들에서의 RNA 발현을 나타낸다.　shRNA가 전혀 포함되지 않은 것(tCD34)을 대조군으로 사용하였다.　형질도입 2일 후에, 세포들을 CD34-특이적 자기 비드들을 사용하여 농축하고, 6일 동안 IL-2(100 lU/mL) 중에서 추가로 증폭시켰다.　CD247, B2M 및 CD52의 mRNA 발현은 항존 유전자로서 사이클로필린을 사용하여 qRT-PCR에 의해 평가되었다.
도 7: 녹다운 수준의 미세조정을 가능하게 하는 다양한 shRNA 표적 서열들의 비교.　모두 CD247을 지향하는 12개의 서로 다른 표적 서열들이 miR-20b 스캐폴드에서 평가되었다.　T 세포들은 활성화 후 12일째(형질도입 후 10일째)에 수확되었다.　TCRab 수준은 FACS에 의해 측정되었다: MFI는 막대 그래프로 도시된다.　모든 shRNA들은 적어도 50% 녹다운을 달성했으며, 일부는 훨씬 더 효율적이었다.
도 8: miR-18b 스캐폴드에서 CD95의 녹다운.　miR-18b 스캐폴드에서 평가된, 모두 CD95를 지향하는 31개의 서로 다른 표적 서열들 중에서 선택된 서열이 도시된다.　T 세포는 활성화 후 16일째(형질도입 후 14일째)에 수확되었다.　CD95 수준은 FACS에 의해 측정되었다: MFI는 막대 그래프로 도시된다.　가장 효율적인 shRNA는 약 30% 녹다운을 달성하였다.
도 9: miR-106a, miR-18b 및 miR-20b 스캐폴드 구조의 비교.　표적 서열(이 경우에는, 길이 20bp) 및 패신저 가닥은 직사각형으로 표시된다.　miR-106a 및 miR-20b는 스캐폴드의 18번 위치(상기 표적 서열의 14번 위치)에서 불일치가 있는 반면, miR-18b의 스캐폴드는 더 크고, 상기 표적 서열의 6번, 11번 및 15번 위치에서 불일치가 있고(각각 화살표 2, 3 및 4로 표시됨), 뿐만 아니라 상기 표적 서열의 1번 및 2번 위치 사이의 패신저 가닥에서 2개의 핵산의 돌출(화살표 1로 표시됨)이 있다.
도 10: miR-18b 스캐폴드의 변형들은 녹다운 효율을 향상시킨다.　도 10a는 miR-18b 스캐폴드에 대해 행해진 변형들을 나타낸다: 돌출의 제거, 개별 불일치의 제거, 및 돌출과 처음 2개의 불일치의 제거.　도 10b는 상기한 miR-18b 스캐폴드들에서 CD95의 녹다운 효과를 나타낸다. 야생형/천연 서열과 비교하여 불일치 또는 돌출이 적은 구축물은 더 높은 녹다운 효율을 달성한다.　녹다운은 도 8에 도시된 바와 같이 측정된다.
도 11: 표적 서열 길이의 평가.　B2M(왼쪽 패널) 및 CD247(오른쪽 패널)에 대한 표적 서열들 모두에 대해, 표적 서열 길이의 효과가 녹다운 효율에 대해 평가되었다.　구축물들은 야생형/천연 스캐폴드 서열이 해당 위치에서 표적 서열과 동일하기 때문에 종종 두 가지 길이(19-20, 21-22 또는 22-23)로 표시된다.　도시된 결과들은 miR-106a 스캐폴드에 대한 것이며, 유사한 결과들이 miR-20b 스캐폴드(도시되지 않음)에 대해 얻어졌다.　클러스터: 관련없는 서열을 갖는 대조군;　추가 대조군으로서 각각 CD247 및 B2M에 대한 표적 서열을 사용하였다.　
도 12a 내지 도 12c: 스캐폴드들의 상이한 순열(permutation)들을 사용한 상이한 유전자들의 동시 녹다운의 평가.　a:　표시된 이중 및 삼중 스캐폴드들에 대한 B2M/HLA(왼쪽 패널) 및 CD247/CD3zeta(오른쪽 패널)의 발현을 보여주는 FACS 데이터.　b: 삼중 스캐폴드들에 대한 CD95의 발현을 포함하는, 패널 A의 FACS 데이터의 MFI.　c: 도시된 구축물에 대한 B2M, CD247 및 CD95의 발현을 나타내는 FACS 데이터의 MFI.
도 13: 스캐폴드들의 변화 및 KD 효능에 대한 그의 영향의 평가. A) shRNA가 없는 4개의 상이한 CAR T 세포들(상단), B2M(miR-106a 스캐폴드 내)와 CD3 zeta(miR-20b 스캐폴드 내)에 대한 이중 shRNA(상단에서 두 번째), 스캐폴드 miR-18b 내에 루프 변이체를 포함하는, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드 및 miR-20b 스캐폴드의 3중체 및 스캐폴드 miR-18b의 상부 줄기/루프 영역이 miR-17의 상부 줄기/루프 영역으로 치환된 유사 3중체(하단)의 유세포 분석 데이터. HLA-I(왼쪽 패널), CD95(가운데)의 발현 또는 TCR 발현(오른쪽 패널)이 표시된다.
도 14: 다중체가 안정적인 마이크로프로세싱을 나타낼 때의 표적 서열 변화의 평가. a) shRNA 없이 형질도입된 BCMA CAR T 세포(상단), CD3zeta와 B2M에 대한 2중체 또는 B2M의 다양한 표적 서열들을 포함하는 3중체(B2M, CD3zeta, CD95)에서의 shRNA 표적들의 유세포 분석 발현. 왼쪽 패널은 HLA 클래스 I의 발현, 중간 패널은 CD95의 발현, 오른쪽 패널은 TCR 발현을 나타낸다. b) shRNA 아암(arm)이 없는 경우에 대한, 각 표적 단백질의 평균 형광 강도의 정규화된 값들.
도 15: 키메라 삼중 스캐폴드에 의해 녹다운된 경우의 다양한 shRNA 표적들의 기능적 평가. a) B2M에 대한 shRNA는 Crispr cas9를 사용한 B2M 녹아웃과 비교하여 NK 매개 사멸로부터 BCMA CAR T 세포를 보호한다. b) B2M에 대한 shRNA는 B2M 녹아웃과 유사한 T 세포 동종인식을 억제한다. c) CD95에 대한 shRNA는 FasL 매개 세포사멸을 방지한다.
도 16: 3개의 상이한 miR17-92 파라로그 클러스터들로부터 유래된 4개의 shRNA 스캐폴드들을 함유하는 키메라 4중체(fourplex) shRNA 클러스터를 사용한 표적 유전자들의 녹다운. a) 4중체 shRNA 구축물의 다이어그램. b) shRNA를 포함하지 않는 BCMA CAR T 세포(상단 히스토그램), 2중체 shRNA(표적 항원: B2M, CD3zeta)와 4중체(B2M, CD28, MICA, CD3zeta 표적들을 포함)를 포함하는 BCMA CAR T의 유세포 분석 발현 프로파일. c) qPCR에 의해 측정된 MICA의 상대적 발현.
도 17: 3개의 상이한 miR17-92 파라로그 클러스터들로부터 유래된 5개의 shRNA 스캐폴드들을 함유하는 키메라 5중체(fiveplex) shRNA 클러스터들을 사용한 표적 유전자들의 녹다운. a) shRNA를 포함하지 않는 BCMA CAR T 세포(상단 히스토그램), 최적화되지 않은 표적 서열 2중체를 갖는 5중체(5중체 1) 및 동일한 최적화된 표적 서열들을 갖지만 그 순서가 다른 2개의 5중체 클러스터들(shRNA 표적 항원: B2M, CD3zeta, CD28, MICA, CD95)의 유세포 분석 발현 프로파일. b) qPCR에 의해 측정된 MICA의 상대적 발현. Fpl,2,3: 5중체 1,2,3. sh 없음(no sh): CAR T는 갖지만 shRNA가 존재하지 않는 구축물.
도 18: 5중체 키메라 구축물을 사용한 표적 유전자들의 녹다운. a) shRNA 5중체의 다이어그램. b) shRNA가 없는 경우(하단 히스토그램), shRNA를 포함하는 3중체(표적: B2M, CD95, CD3zeta) 및 shRNA를 포함하는 5중체(표적: B2M, CD95, CD3zeta, MICA, CD28; 각각 중간 및 상단 히스토그램)를 갖는 경우의 항-BCMA CAR T 세포를 비교하는 유세포 분석 발현. c) 평균 형광 강도를 사용하여 shRNA 아암이 없는 경우에 대해 정규화된 상대적 억제 백분율.
도 19: 6중체(sixplex) 키메라 구축물을 사용한 표적 유전자들의 녹다운. a) shRNA가 없는 경우(하단 히스토그램) 및 shRNA가 포함된 6중체를 갖는 경우(상단 히스토그램)(왼쪽에서부터 오른쪽으로의 표적: CD38, B2M, CD95, CD3zeta, CD28, CD27)의 항-BCMA CAR T 세포를 비교하는 유세포 분석 발현. b) 평균 형광 강도를 사용하여 shRNA 아암이 없는 경우에 대해 정규화된 상대적 억제 백분율.

정의들

본 발명은 특정 구체예들에 관하여 그리고 특정 도면들을 참조하여 설명될 것이지만, 본 발명은 이에 제한되지 않고 청구범위에 의해서만 제한된다.　청구범위의 참조 부호는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.　설명된 도면은 개략도일 뿐이며 제한적인 것은 아니다.　도면들에 있어서, 일부 구성요소들의 크기는 예시를 위해 과장되어 있으며, 원래의 크기로 도시되어 있지 않을 수 있다.　"포함하는"이라는 용어가 발명의 설명 및 청구범위에서 사용되는 경우, 다른 요소들 또는 단계들을 배제하지는 않는다.　단수 명사, 예로서 "하나" 또는 "한개", "상기"를 언급할 때 부정관사 또는 정관사가 사용되는 경우, 이는, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 해당 명사의 복수를 포함한다.

또한, 발명의 설명 및 청구범위에서 제1, 제2, 제3 등의 용어들은 유사한 요소들을 구별하기 위해 사용되며, 반드시 순차적 또는 연대기적 순서를 설명하기 위한 것은 아니다.　그와 같이 사용된 용어들은 적절한 상황 하에서 상호교환 가능하며, 본 명세서에 설명된 본 발명의 구체예들은 본 명세서에서 설명되거나 예시된 것과 다른 순서로 작동할 수 있음을 이해해야 한다.

하기 용어들 또는 정의들은 오로지 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다.

본 명세서에서 특별히 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 의미하는 바와 동일한 의미를 갖는다.　당업자들은 당분야의 정의들 및 용어들에 대해, 특히 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012);　및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(up to Supplement 114), John Wiley 0026# Sons, New York(2016)를 참조하라.　본 명세서에 제공된 정의들은 당 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 것보다 작은 범위를 갖는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 명세서에서 사용된 "조작된 세포"는 (자연 발생적 돌연변이와는 대조적으로) 인간의 개입을 통해 변형된 세포이다.

본 명세서에서 동일한 의미로 사용된 "뉴클레오티드" 또는 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"로 언급되는 용어 "핵산 분자"는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다.　핵산 분자들은 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥과 이중 가닥 영역들의 혼합물인 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥과 이중 가닥 영역들의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 일반적으로 이중 가닥 또는 단일 가닥과 이중 가닥 영역들의 혼합물일 수 있는 DNA와 RNA를 포함하는 하이브리 분자들을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.　또한, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 모두를 포함하는 삼중 가닥 영역들을 의미한다.　또한, 폴리뉴클레오티드라는 용어는, 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA들 또는 RNA들 및 안정성을 위해 또는 다른 이유로 변형된 골격들을 갖는 DNA들 또는 RNA들을 포함한다.　"변형된" 염기들은, 예를 들어 트리틸화 염기들 및 이노신과 같은 특이한 염기들을 포함한다.　다양한 변형들이 DNA 및 RNA에 대해 이루어질 수 있다;　따라서 "폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 자연에서 발견되는 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태들의 폴리뉴클레오티드들뿐만 아니라 바이러스들 및 세포들의 특징인 DNA 및 RNA의 화학적 형태들을 포함한다.　"폴리뉴클레오티드"는 또한 종종 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 비교적 짧은 핵산 사슬을 포함한다.

"벡터"는 플라스미드, 파아지, 코스미드, 또는 바이러스와 같은 레플리콘(replicon)이며, 여기서 다른 핵산 세그먼트가 작동가능하게 삽입되어 상기 세그먼트의 복제 또는 발현을 야기할 수 있다.　"클론"은 유사분열에 의해 단일 세포 또는 공통 조상에서 파생된 세포들의 집단이다.　"세포주"는 여러 세대 동안 시험관 내에서 안정적으로 성장할 수 있는 일차 세포의 클론이다.　본 명세서에서 제공된 일부 실시예들에서, 세포들은 DNA로 상기 세포들을 형질감염시킴으로써 형질전환된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 서열의 관점에서 "상이한(다른)" 또는 "다르다", 특히 "야생형 서열과 상이한"은 해당 서열이 야생형/천연 서열과 비교하여, 핵산의 치환, 삭제 및/또는 삽입 중 어느 하나에 의해 변경된는 것을 의미한다. 특히, 상부 줄기/루프 영역에서의 차이의 관점에서, "상이한" 또는 "다르다"는 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 불일치 또는 돌출이 제거되거나 도입되었음을 의미할 수 있다. 불일치 또는 돌출이 제거되거나 도입되지 않은 경우, 그 관련 길이에 대해, 98% 미만의 서열 동일성, 95% 미만의 서열 동일성, 특히 90% 미만의 서열 동일성을 갖는다면, 해당 서열은 야생형 서열과 다른 것으로 간주된다. 상부 줄기/루프 서열들의 관점에서, 그 관련 길이는 상부 줄기/루프 영역의 길이이다. 상기 상부 줄기/루프 서열이 치환된 키메라 서열의 맥락에서, 비교할 적절한 야생형 서열은 원래의 스캐폴드(즉, 하부 줄기 영역에 상응하는 스캐폴드)의 서열이라는 점이 주목된다. "상이하도록 조작된" 서열은, 전형적으로 보다 바람직한 결과(예를 들어, 표적 서열의 개선된 하향조절 또는 스캐폴드의 개선된 마이크로프로세싱)를 달성하기 위해 의도적으로 변화가 도입되었음을 의미한다.

용어 "발현하다" 및 "생성하다"는 본 명세서에서 동의어로 사용되며, 유전자 산물의 생합성을 의미한다.　이들 용어들은 유전자의 RNA로의 전사를 포함한다.　이들 용어들은 또한 RNA의 하나 이상의 폴리펩타이드로의 번역을 포함하고, 자연적으로 발생하는 모든 전사후 및 번역후 변형들을 추가로 포함한다.

특히 세포들 또는 면역 세포들과 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "외인성"은 개별 살아있는 세포 내에 존재하고 해당 세포 내에서 활성이지만 그 세포 외부에서 기원하는(내인성 인자와 대조적으로) 임의의 물질을 지칭한다.　따라서 "외인성 핵산 분자"라는 문구는 일반적으로 형질도입 또는 형질감염을 통해 상기 (면역) 세포 내에 도입된 핵산 분자를 지칭한다.　본 명세서에 사용된 용어 "내인성"은 개별의 살아있는 세포 내에 존재하고 해당 세포 내에서 활성이고, 그 세포 내부에서 유래하는(따라서 또한 전형적으로 형질도입되지 않거나 형질감염되지 않은 세포에서 제조되는) 임의의 인자 또는 임의의 물질을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 "단리된(isolated)"은 (핵산, 펩타이드 또는 단백질과 같은) 생물학적 성분이, 상기 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 다른 생물학적 성분들 즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA와 RNA, 및 단백질들로부터 실질적으로 분리, 또는 분리 생산, 또는 정제된 것을 의미한다.　따라서, "단리된" 핵산들, 펩타이드들 및 단백질들은 표준 정제 방법들에 의해 정제된 핵산들 및 단백질들을 포함한다.　"단리된" 핵산들, 펩타이드들 및 단백질들은 조성물의 일부일 수 있으며, 그러한 조성물이 상기 핵산, 펩타이드 또는 단백질의 천연 환경의 일부가 아닌 경우에도 여전히 단리될 수 있다.　상기 용어는 또한 화학적으로 합성된 핵산들 뿐 아니라 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산들, 펩타이드들 및 단백질들을 포함한다.

분자 생물학의 맥락에서 본 명세서에서 사용된 "다중화된(multiplexed)"은 2개 이상(즉, 다중)의 관련되거나 관련되지 않은 표적들의 동시 표적화를 지칭한다.　본 명세서에 사용된 용어 "RNA 간섭 분자"는 표적화된 mRNA 분자들을 중화함으로써, 유전자 발현 또는 번역을 억제하는 RNA(또는 RNA-유사) 분자를 지칭한다.　RNA 간섭 분자는 염기쌍 상보성에 의해 표적화된 mRNA 분자를 중화한다: RNA 간섭 분자 내에는 표적화된 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 표적 서열(전형적으로 18-23개 핵산들)이 있다.　예들로는 siRNA(shRNA 포함) 또는 miRNA 분자들이 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 "다중화된 RNA 간섭 분자들"은 하나 이상의 표적의 동시적(concomitant) 하향조절을 위해 동시에 존재하는 둘 이상의 분자들이다. 전형적으로, 다중화된 분자들의 각각은 특정 표적을 지향할 것이지만, 두 분자들이 동일한 표적을 지향할 수 있다(그리고, 동일할 수도 있다).

본 명세서에서 사용된 "프로모터"는 일반적으로 유전자 영역에 인접하여 위치하는 핵산의 조절 영역으로서, 조절된 유전자 전사를 위한 제어점을 제공한다.

"다중체(multiplex)"는 동일한 유형의 복수의 분자들, 예를 들어, 복수의 siRNA 또는 shRNA 또는 miRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.　다중체 내에서, 분자들이 동일한 유형(예로서, 모두 shRNA)인 경우, 이들은 동일하거나 상이한 서열들을 포함할 수 있다.　동일한 유형의 분자들 사이에는, 본 명세서에 기재된 링커들과 같은 개재 서열들이 있을 수 있다.　본 발명의 다중체의 일예는 복수의 miRNA-기반 shRNA들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.　다중체는 단일 가닥 또는 이중 가닥이거나, 단일 가닥인 영역둘과 이중 가닥인 영역들을 모두 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 항원에 대한 특이성을 갖는 결합 모이어티(binding moiety)(예를 들어, 항체, 수용체 또는 이의 동족 리간드로부터 파생될 수 있음) 및 면역 세포에서 신호를 전달할 수 있는 신호전달(signaling) 모이어티(예로서, CD3 제타 사슬. Fc 엡실론 RI 감마 도메인, CD3 엡실론 도메인, 최근에 기술된 DAP10/DAP12 신호전달 도메인, 또는 공동자극 도메인으로서 CD28, 4-1BB, 0X40, ICOS, DAP10, DAP12, CD27 및 CD2 유래의 도메인들과 같은 다른 신호전달 또는 공동신호전달 모이어티들 또한 사용될 수 있음)를 적어도 갖는 키메라 수용체(즉, 서로 다른 소스들 유래의 부분들로 구성됨)를 지칭한다. "키메라 NK 수용체"는 상기 결합 모이어티가 NK 수용체로부터 유래되거나 그로부터 단리된 CAR이다.

본 명세서에서 사용된 "TCR"은 T 세포 수용체를 지칭한다.　이는, 입양 세포 전달의 맥락에서, 일반적으로 조작된 TCR, 즉 특정 항원, 가장 일반적으로 종양 항원을 인식하도록 조작된 TCR을 의미한다.　본 명세서에서 사용된 "내인성 TCR"은 변형되지 않은 세포들(전형적으로 T 세포들) 상에 내인성으로 존재하는 TCR을 지칭한다.　TCR은 일반적으로 불변 CD3 사슬 분자들과의 복합체의 일부로서 발현되는 고도로 가변적인 알파(α) 및 베타(β) 사슬들로 구성된 이황화-결합 막-고정 이종이량체 단백질이다.　TCR 수용체 복합체는 가변 TCR 수용체 α 및 β 사슬들과 CD3 공동-수용체(하나의 CD3γ 사슬, 하나의 CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬들 포함) 및 2개의 CD3ζ 사슬들(CD247 분자라고도 함)의 8량체 복합체이다.　본 명세서에서 사용된 용어 "기능성 TCR"은 그것의 "동족(cognate) 리간드"의 결합에 따라 신호를 전달할 수 있는 TCR을 의미한다.　전형적으로, 동종 요법들의 경우, 예를 들어 TCR 사슬들 중 적어도 하나를 녹아웃 또는 녹다운함으로써 TCR 기능을 감소시키거나 손상시키기 위한 조작이 일어날 것이다.　조작된 세포 내의 내인성 TCR은, 조작되지 않은 내인성 TCR을 갖는 세포와 비교 시, 신호전달 능력(또는 T 세포 활성화)의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 보유하는 경우. 기능성인 것으로 간주된다. 신호전달 능력 또는 T 세포 활성화를 평가하기 위한 분석법들은 당업자에게 알려져 있으며, 특히 인터페론 감마를 측정하는 ELISA를 포함한다. 대안적인 구체예들에 따르면, 내인성 TCR은 TCR 기능을 간섭하기 위한 조작이 전혀 일어나지 않았다면 기능성인 것으로 간주된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "면역 세포들"은 면역계(후성 또는 선천성 면역계일 수 있음)의 일부인 세포들을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 면역 세포들은 일반적으로 입양 세포 전달(자가 전달 또는 동종 전달)을 위해 제조된 면역 세포들이다.　다수의 상이한 유형의 면역 세포들이 입양 요법에 사용되며, 따라서 본 명세서에 기재된 방법들에서 사용이 고려된다.　면역 세포들의 예는 T 세포들, NK 세포들, NKT 세포들, 림프구들, 수지상 세포들, 골수 세포들, 대식세포들, 줄기 세포들, 전구 세포들 또는 iPSC들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.　후자의 3종은 면역 세포 자체는 아니지만, 면역 요법을 위한 입양 세포 전달에 사용될 수 있다(예로서, Jiang et al., Cell Mol Immunol 2014; Themeli et al., Cell Stem Cell 2015 참조).　일반적으로, 상기　제조는 줄기 세포들 또는 iPSC들을 이용하여 시작되지만(또는 면역 세포들로부터 iPSC들로의 역분화 단계로 시작할 수도 있음), 제조공정에는 투여 전에 면역 세포들로의 분화 단계가 수반될 것이다.　입양 전달을 위한 면역 세포들의 제조에 사용되는 줄기 세포들, 전구 세포들 및 iPSC들(즉, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR로 형질도입된 줄기 세포들, 전구 세포들 및 iPSC들 또는 이들의 분화된 자손)은 본 명세서에서 면역 세포로 간주된다.　특정 구체예들에 따르면, 상기 방법들에서 예상되는 줄기 세포들은 인간 배아의 파괴 단계를 포함하지 않는다.　

특히, 고려되는 면역 세포들은 림프구들, 단핵구들, 대식세포들 및 수지상 세포들을 포함하는 백혈구(leukocyte)들을 포함한다.　특히 구상되는 림프구들은 T 세포들, NK 세포들 및 B 세포들을 포함하고, 가장 특별히 구상되는 것은 T 세포들이다.　입양 전달의 맥락에서, 면역 세포들은 일반적으로 1차 세포들(즉, 인간 또는 동물 조직에서 직접 분리된 세포들로서, 미배양 또는 단기간 배양됨)일 것이며, 세포주들(즉, 장기간에 걸쳐 지속적으로 계대되고, 동질의 유전자형 및 표현형 특성들을 획득한 세포들)은 아닐 것이다. 특정 구체예들에 따르면, 1차 세포들(즉, 인간 또는 동물 조직에서 직접 분리된 세포들로서, 미배양 또는 단기간 배양됨)일 것이며, 세포주들(즉, 장기간에 걸쳐 지속적으로 계대되고, 동질의 유전자형 및 표현형 특성들을 획득한 세포들)은 아닐 것이다. 대안적인 특정 구체예들에 따르면, 상기 면역 세포들은 세포주 유래의 세포가 아니다.

본 명세서에서 사용된 "마이크로RNA 스캐폴드", "miRNA 스캐폴드" 또는 심지어 "스캐폴드"는 특정 마이크로RNA 처리 요건들을 포함하는 잘 특성화된 일차 마이크로RNA 서열을 말하며, 여기서 RNA 서열은 (일반적으로 기존 miRNA 서열을 특정 표적을 지향하는 siRNA로 대체하기 위해) 삽입될 수 있다.　마이크로RNA 스캐폴드는 적어도 이중 가닥 상부 줄기 영역(일반적으로 18-23개 뉴클레오티드들)으로 구성되며, 상기 줄기 영역의 양쪽은 유연한 루프 서열에 의해 연결되고, 상기 상부 줄기 영역은 일반적으로 다이서(Dicer)에 의해 처리된다.　전형적으로, 마이크로RNA 스캐폴드는 하부 줄기 영역을 더 포함하고, 선택적으로 5' 및 3' 측면 서열들 또는 기저 세그먼트들을 추가로 포함한다.　가이드 서열 또는 표적 서열은 상부 줄기 영역에 삽입되며 18-23개 뉴클레오티드들의 단일 가닥 서열이다.　상기 표적 서열은 상보적 염기쌍을 통해 표적을 인식하므로, 이 서열은 일반적으로 표적 또는 그의 조절 영역에 존재하는 서열과 동일하다.　본 명세서에서 사용된 "표적" 또는 "표적 단백질"은 하향조절될(즉, 세포 내에서 발현이 감소되어야 할) 분자(전형적으로 단백질이지만 핵산 분자일 수 있음)를 지칭한다.　miRNA는 핵산 수준에서 작동하므로, 그것이 단백질을 지향하더라도, 상기 miRNA 표적 서열은 상기 단백질을 인코딩하는 서열(예로서, mRNA 서열) 또는 (예로서, 3' UTR 영역과 같은) 상기 단백질의 발현을 조절하는 서열과 동일할 것이라는 점에 주목해야 한다.

　miRNA 스캐폴드의 예는, 예를 들어 miR-106a, miR-18b, miR-20b, miR-19b-2, miR-92-2 또는 miR-363과 같은 야생형/천연발생적 miRNA 클러스터들에 존재하는 스캐폴드들, 또는 예를 들어, SMARTvector^TM 마이크로-RNA 적응형 스캐폴드(Horizon Discovery, Lafayette, CO, USA)와 같은 조작된 스캐폴드들을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "miR-106a"는 인간의 유전자 ID 406899에 해당하고, "miR-18b"는 인간의 유전자 ID 574033에 해당하고, "miR-20b"는 인간의 유전자 ID 574032에 해당하며, "miR-19b-2"는 인간의 유전자 ID 406981에 해당하고, "miR-92a-2"라고도 알려진 "miR-92-2"는 인간의 유전자 ID 407049에 해당하고, "miR-363"은 인간의 유전자 ID 574031에 해당한다.

본 명세서에서 사용된 "마이크로RNA 클러스터" 또는 "miRNA 클러스터"는 함께 기능하는 마이크로RNA 스캐폴드들의 집합체를 지칭한다.　이들은 야생형/천연발생적 클러스터들일 수 있거나, 또는 자연적으로는 함께 발견되지 않는 miRNA 스캐폴드들의 조합일 수 있다. 야생형/천연발생적 마이크로RNA 클러스터들은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 miR-106a~363 클러스터, miR-17~92, miR-106b~25 및 miR-23a~27a~24-2 클러스터를 포함한다.　miRNA 클러스터는 결합된 스캐폴드로 간주될 수 있다.　따라서, 본 명세서에서 사용된 클러스터 또는 "조합된(combined) miRNA 스캐폴드"는 하나의 프로모터의 제어 하에 기능하는 하나 이상의 miRNA 스캐폴드의 조합을 의미한다.　하나 이상의 miRNA 스캐폴드는 동일하거나 다른 표적 단백질들에 대한 표적 서열들과 동일하거나 상이할 수 있고, 동일한 표적들인 경우 해당 표적에 대해 동일하거나 상이한 표적 서열들을 가질 수 있다.　이러한 결합된 스캐폴드는, 하나의 프로모터의 제어 하에 있을 때, "다중체 스캐폴드", "다중화된 스캐폴드" 또는 "다중체 miRNA 스캐폴드"로도 또한 언급된다. 종종, 스캐폴드들의 수가 결정된 경우, 해당 숫자가 '다중(multi)-'이라는 접두사 대신에 시용될 수 있다. 예를 들어, "2중(duplex) 스캐폴드"는 2개의 스캐폴드들이 존재함을 의미하고, "3중(triplex) 스캐폴드"는 3개의 스캐폴드들이 존재함을 의미하며, "4중(tetraplex)" 또는 "사중(quadruplex)"는 4개, "5중(pentaplex)"은 5개, "6중(hexaplex)"은 6개 등을 의미한다.　이러한 방식으로, 6개의 서로 다른 miRNA 스캐폴드들을 갖는 miRNA 클러스터(예로서, 야생형/천연발생적 miR-106a-363 클러스터)는 6중 miRNA 스캐폴드 또는 6개 miRNA들의 클러스터로 간주될 수 있다.　

본 명세서에서 사용된 "miR-17 계열 클러스터"는 (특히) miR-17 계열 유래의 스캐폴드들을 포함하는 다음의 3개의 파라로그 miRNA 클러스터들 중 하나이다: miR-106a~363 클러스터(miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92a2 스캐폴드 및 miR-363 스캐폴드로 (이 순서로) 구성됨), miR-17~92 클러스터(miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-1 스캐폴드 및 miR-92-1(또한 miR-92al) 스캐폴드로 (이 순서로) 구성됨), 및 miR-106b~25 클러스터(miR-106b 스캐폴드, miR-93 스캐폴드 및 miR-25 스캐폴드로 (이 순서로) 구성됨). 상기 "miRNA-17 계열" 또는 "miR-17 계열"은 시드 서열에 따라 그룹화되며, miR-17, miR-20a, miR-106a, mir-20b, miR-106b 및 miR-93을 포함한다. 마찬가지로, 시드 서열에 따라 분류된 다른 계열들은 "miR-18 계열"(miR-18a, miR-18b), "miR-19 계열"(miR-19a, miR-19b-l 및 miR-19b-2), 및 "miR-92 계열"(miR-92a1, miR-92a2, miR-363 및 miR-25)이다.

따라서, "miR-17 계열 클러스터 유래의 스캐폴드"는 miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-19b-1 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-25 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-92a2 스캐폴드, miR-93 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-363 스캐폴드로부터 임의로 선택되는 스캐폴드이다.

본 명세서에서 사용된 "miR-17 계열 스캐폴드"는 miR-17 계열 유래의 다음의 6개 스캐폴드들의 더욱 제한된 그룹으로부터 선택된다: miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, mir-20b 스캐폴드, miR-93 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드 및 miR-106b 스캐폴드.

도 1은 본 명세서에서 사용된 바와 같은 상부 및 하부 줄기 영역들, 표적 서열들, 개별 스캐폴드가 표시된 다중화된 스캐폴드 서열들의 개략적인 예들을 나타낸다.

용어 "대상(subject)"은 인간 및 모든 척추동물, 예를 들어 비인간 영장류, 마우스, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 및 파충류와 같은 포유동물 및 비-포유동물을 포함하는 비-인간 동물들을 지칭한다. 본 명세서에　기재된 방법들의 가장 특별한 구체예들에서, 상기 대상은 인간이다.

용어 "치료하는" 또는 "치료"는, 경감, 완화, 증상의 감소 또는 환자가 해당 상태를 더 견딜 수 있게 하는 것, 퇴행 또는 쇠퇴의 속도를 늦추는 것, 퇴행의 최종점을 덜 쇠약하게 만드는 것, 대상의 신체적 또는 정신적 웰빙을 향상시키는 것, 생존 기간의 연장과 같은 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터를 포함하는, 손상, 병리 또는 상태의 약화 또는 완화의 성공 또는 성공의 지표를 지칭한다. 상기　치료는 다음을 포함하는 객관적 또는 주관적 파라미터들에 의해 평가될 수 있다: 신체 검사, 신경학적 검사 또는 정신과적 평가의 결과들.

본 명세서에서 사용된 "입양 세포 요법", "입양 세포 전달" 또는 "ACT"라는 문구는 대상(예를 들어, 환자)에게 세포들, 가장 전형적으로는 면역 세포들을 전달하는 것을 의미한다.　이들 세포들은 상기 대상(자가 요법의 경우) 또는 다른 개인(동종이계 요법의 경우)으로부터서 유래했을 수 있다. 상기　치료의 목표는 면역 기능 및 특성들을 향상시키는 것이며, 암 면역요법에서는 암에 대한 면역 반응을 높이는 것이다.　T 세포들이 ACT에 가장 자주 사용되지만, NK 세포들, 림프구들(예로서, 종양 침윤 림프구(TIL)들), 수지상 세포들 및 골수 세포들과 같은 다른 면역 세포 유형들을 또한 사용하여 적용된다.　

"유효량" 또는 "치료적 유효량"은,　필요한 투여량에서 필요한 투여기간 동안, 원하는 치료 결과를 얻기 위해 효과적인 양을 의미한다.　본 명세서에 기재된 형질전환된 면역 세포들과 같은 치료제의 치료적 유효량은, 질병 상태, 연령, 성별 및 개인의 체중과 같은 요인들, 및 개별적 대상에서 원하는 반응을 유도하기 위한 (상기 세포들과 같은) 치료제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 해당 치료제의 치료학적으로 유익한 효과들이 상기 치료제의 임의의 독성 또는 유해한 효과들 보다 더 큰 양이다.　

"이식편 대 숙주 질환" 또는 "GvHD"라는 문구는 동종이계 이식 후에 발생할 수 있는 상태를 지칭한다.　GvHD에서, 수여된 골수, 말초혈액(줄기) 세포들 또는 기타 면역 세포들은 수혜자의 신체를 이물질로 인식하여 상기 수여된 세포들이 상기 신체를 공격한다.　T 세포들과 같은 공여자 면역적격 면역 세포들이 GvHD의 주요 동인이기 때문에, GvHD를 예방하는 한 가지 전략은 TCR 복합체의 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 억제함으로써 그러한 면역적격 세포들에서 (TCR 기반) 신호전달을 감소시키는 것이다.

입양 세포 전달(ACT)의 맥락에서 다중 유전자들의 표적화가 게놈 편집(및 관련 비용 및 복잡한 제조 공정)의 필요성 없이 실현 가능한지의 여부를 평가하기 위해, 다중화된 RNA 간섭 분자들을 테스트하기로 결정되었다.

기본 접근법은, 염기 인식을 통해 선택된 mRNA를 표적화할 수 있는 활성 shRNA를 생성하기 위해 내인성 RNA 처리 기계에 의해 처리되는 특정 벡터로부터의 RNA의 전사 및 RISC 복합체에 의한 상기 특정 mRNA의 결과적인 파괴를 기반으로 한다. 상기 표적 mRNA의 특이적 파괴는 결과적으로 관련 단백질의 발현을 감소시킨다.　RNA 올리고뉴클레오티드들은 유전자 발현의 일시적인 녹다운을 달성하기 위해 선택한 표적 세포들 내로 형질감염될 수 있지만, 통합된 벡터로부터 원하는 shRNA의 발현은 유전자 발현의 안정적인 녹다운을 가능하게 한다.

shRNA의 성공적인 발현은, shRNA 이중체의 처리(processing)을 가능하게 하는, 5' 캡 및 3' 폴리아데닐화가 없는 RNA 종들을 생성하는 폴리머라제 Ⅲ(Pol Ⅲ) 프로모터(예로서, H1, U6)와의 결합에 크게 의존해 왔다. 일단 전사되면, 상기 shRNA는 처리, 핵으로부터의 방출, 추가 처리 및 RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 내로의 로딩을 겪게 되어, 선택된 mRNA의 표적화 분해로 이어진다(Moore et al., 2010).　효과적이기는 하지만, Pol Ⅲ 프로모터들에 의해 작동되는 전사의 효율성은 Pol Ⅲ 프로모터들로부터 shRNA의 과도하게 높은 발현으로 인해 내인성 마이크로RNA 경로의 포화를 통해 세포 독성을 유발할 수 있다(Fowler et al., 2016).　더구나,　단일 벡터에 의한 치료 유전자 및 shRNA 둘 모두의 발현은 일반적으로 치료 유전자를 작동시키는 폴리머라제 Ⅱ(Pol Ⅱ) 프로모터 및 관심 shRNA를 작동시키는 Pol Ⅲ 프로모터를 사용하여 달성되었다.　이것은 기능적이기는 하지만, 벡터 공간을 희생해야하므로 치료 유전자들을 포함하기 위한 옵션들이 더 적게 제공된다(Chumakov et al., 2010; Moore et al., 2010).

마이크로RNA(mir) 프레임워크 내에 shRNA를 내장시키면, 상기 shRNA가 Pol Ⅱ 프로모터의 제어 하에 처리될 수 있게 된다(Giering et al., 2008).　중요하게도, 내장된 shRNA의 발현 수준은 더 낮은 경향이 있어서, U6 프로모터와 같은 다른 시스템들을 사용할 때 발현되는 독성이 관찰되는 것을 피할 수 있다(Fowler et al., 2015).　실제로, 간-특이적 Pol Ⅱ 프로모터에 의해 작동되는 shRNA를 수용한 마우스는 1년 이상 동안 내성 문제 없이 안정적인 유전자 녹다운을 보여주었다(Giering et al., 2008).　그러나, 이것은 간 세포들에서 수행된 단지 하나의 shRNA에 대한 것이었고, 단백질 수준의 감소는 15%에 불과했기 때문에(Giering et al., 2008), 하나 이상의 표적에 대해, 특히 (조작하기 더 어려운) 면역 세포들에서 더 높은 효율성이 달성될 수 있는지는 알려져 있지 않다.

놀랍게도, miR-17-92 클러스터의 파라로그(paralog)인 miR106a~363 클러스터의 요소들이 T 세포들에서 표적들의 하향조절, 특히 표적들의 다중화된 하향조절에 놀랍게도 효율적이라는 관찰로부터 시작하여, miR-17 계열 클러스터의 스캐폴드들을 기반으로 하여 키메라 클러스터들을 제조함으로써 다중화된 하향조절이 더욱 개선될 수 있음을 보여준다. 이는, 특히 miR-17 계열 클러스터 유래의 다른 스캐폴드의 하부 줄기 영역에 miR-17 계열의 상부 줄기 영역 및 루프 영역을 통합한 키메라 스캐폴드들을 사용함으로써, 그리고/또는 상이한 miR-17 파라로그들 유래의 스캐폴드들; 특히, 상이한 파라로그 클러스터들 유래의 miR-17 계열로부터의 스캐폴드들을 조합함으로써 수행될 수 있다. 상이한 표적들에 대한 다중 마이크로RNA-기반 shRNA들(예로서, miR106a~363 클러스터에서 발생하는 개별 스캐폴드들을 기반으로 함)의 발현은, 재조합 및 독성의 발생없이, 그리고 동시에 다중 표적들의 효율적인 하향 조절을 달성하면서 T 세포들에서 실현 가능하였다.

따라서, 본 발명의 목적은, miRNA 스캐폴드들을 포함하는 특정의 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 함유하는 벡터들 및 조작된 세포들을 제공하는 것이다. 상기 핵산 분자, 벡터 및 세포는 일반적으로 암 치료에서의 사용과 같은 의약으로 사용하기 위해 제공된다. 따라서, 본 명세서에 기술된 핵산 분자, 벡터 또는 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 암의 적어도 하나의 증상을 개선시키는 것을 수반하는 암 치료 방법도 제공된다.

제1 측면에 따르면, 조작된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 함유하는 핵산 분자가 제공되고, 여기서 상기 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 것이고, 상기 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 야생형/천연 서열과 상이하도록 조작되었다.

상기 miR-17 계열 클러스터에는 15개의 스캐폴드가 포함되어 있으므로, 상기 조작된 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-1 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, miR- 363 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드, miR-25 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택될 것이다.

상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부가 야생형/천연 서열과 다르도록 조작된 경우, 이는 루프 영역만이 그와 같이 조작되었거나, 상기 상부 줄기 영역만이 그와 같이 조작되었거나, 상부 줄기 영역 및 루프 중 하나 또는 둘 모두가 그와 같이 조작되었거나, 또는 상부 줄기와 루프 영역 모두가 조작되었음을 의미할 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 본 명세서에 개시된 조작된 스캐폴드들은 키메라 스캐폴드들이다. 전형적으로, 이들은 miR-17 계열 클러스터 유래의 2개의 스캐폴드들로부터 파생된 키메라 스캐폴드들이다. 특히, 상기 2개의 스캐폴드들 중 적어도 하나는 또한 miR-17 계열 스캐폴드, 즉 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되는 것일 것이다. 가장 특히, 상기 키메라 스캐폴드는 miR-17 계열 클러스터 스캐폴드(즉, miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-1 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, miR-363 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드, miR-25 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택됨)로부터 선택되는 하부 줄기 영역, 및 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부, 특히 miR-17 계열 스캐폴드(즉, miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택됨)로부터 선택되는 상부 줄기/루프 영역의 전부를 포함할 것이다.

따라서, 추가의 일 구체예에서, 조작된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 함유하는 핵산 분자들이 제공되고, 여기서 상기 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-1 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, miR-363 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드, miR-25 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되는 miR 스캐폴드의 것이고, 상기 스캐폴드의 상부 줄기 및 루프 영역은 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되며; 상기 하부 줄기 영역으로부터의 스캐폴드는 상기 상부 줄기 및 루프 영역으로부터의 스캐폴드와는 상이하다.

상기 스캐폴드에 더하여, 상기 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 전형적으로 야생형/천연 스캐폴드 서열에는 존재하지 않는 표적 서열도 함유할 것이다. 특히, 상기 표적 서열은 18~23개 핵산 길이, 보다 특히 18~21개 핵산 길이, 가장 특히 18~20개 핵산 길이를 갖는다.

추가의 특정 구체예들에 따르면, 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 함유하는 핵산 분자는 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들을 함유할 것이며, 그 중 적어도 하나는 위에서 설명한 바와 같은 스캐폴드를 갖는다. 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이 존재하는 경우, 이들 2개 이상의 분자는 동일하거나 다른 스캐폴드를 가질 수 있다. 원칙적으로 추가의 RNA 간섭 분자들은 야생형/천연 또는 합성형인 임의 유형의 적합한 스캐폴드를 가질 수 있지만, 상기 추가의 RNA 간섭 분자(또는 분자들)는 miR-17 계열 클러스터, 즉 miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-1 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, miR-363 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드, miR-25 스캐폴드, 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드를 갖는 것이 특히 고려된다. 하기 실시예, 특히 실시예 5 내지 8에 나타나 있는 바와 같이, 상기한 스캐폴드들의 조합은 성공적인 다중화를 유도할 수 있다. 중요한 것은, 상기 스캐폴드들의 전부가 야생형/천연 서열과 상이하도록 조작된 상부 줄기/루프 영역을 가질 필요는 없다는 것이다. 그러나, 특정 구체예들에 따르면, 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자가 존재할 경우, 상기 스캐폴드들 모두는 miR-17 계열 클러스터 유래의 하부 줄기 영역을 가질 것이다.

상기한 바와 같이, 상기 스캐폴드들은 동일할 수도 있고 다를 수도 있다. 그러나, 특히 3개 이하의 스캐폴드가 동일할 것이 고려되며, 더욱 특히 2개 이하의 동일한 스캐폴드가 사용되는 것이 고려된다. 이는, 동일한 스캐폴드 서열들 간의 재조합이나 miRNA 프로세싱을 감소시키는 다른 요인들을 피하기 위한 것이다(실시예 5 참조).

따라서, 추가 측면에 따르면, 상이한 스캐폴드들을 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자를 함유하는 핵산 분자가 제공되고, 여기서 적어도 2개의 상이한 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터로부터의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역을 갖고; 그리고

- 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 키메라 스캐폴드를 가지며, 상기 키메라 스캐폴드에서 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 상기 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되고;

그리고/또는

- 상기 적어도 2개의 RNA 간섭 분자로부터의 스캐폴드들은 적어도 2개의 다른 miR-17 계열 클러스터들 즉, miR-17 및 miR-20a(miR-17-92 클러스터로부터 유래됨), miR-106a 및 miR-20b(miR-106a-363 클러스터로부터 유래됨), 및 miR-106b 및 miR-93(miR-106b-25 클러스터로부터 유래됨)로 이루어지는 적어도 2개의 다른 그룹들로부터 선택된 적어도 2개의 다른 miR-17 계열 클러스터들 유래의 miR-17 스캐폴드들이다.

다시 말하면, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부가 상기 상부 줄기/루프 영역의 전부인 것이 특히 고려된다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 핵산 분자에 존재하는 상기 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터(선택적으로 추가 조작을 가짐)로부터 전적으로 선택된다. 그러나, 이들은 또한 다른 스캐폴드 서열들, 특히 miR-196a2 서열 및/또는 miR-23a~27a~24-2 클러스터와 같은 다른 관련없는 서열들(재조합을 피하기 위해)과 추가로 조합되는 것도 고려된다.

추가의 특정 구체예들에 따르면, 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 함유하는 상기 핵산 분자는 하나의 프로모터의 제어 하에 있는 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들을 함유할 것이다. 다른 추가의 특정 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 적어도 3개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이다. 또 다른 추가의 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 적어도 4개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이고; 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 적어도 5개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이고; 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 적어도 6개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이다.

특정 구체예들에 따르면, 스캐폴드 서열은 줄기 영역에서 불일치 및/또는 돌출의 수를 감소시키도록 조작될 수 있다.　본 명세서에서 사용된 "불일치"는 상보적 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍이 아닌 염기쌍을 지칭한다.　본 명세서에서 사용된 "돌출"은 핵산 이중체의 한 가닥 내에 위치한 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드(전형적으로 1-5개, 특히 1-3개) 스트레치(stretch)를 의미한다.　보다 구체적으로, 사용되는 상기 스캐폴드 서열들 중 하나가 miR-18b 스캐폴드인 경우, 상기 야생형/천연 서열과 비교하여 변형된) 것일 수 있다(실시예 3 참조).　이는, 일반적으로 패신저 가닥을 표적 가닥에 일치시켜 염기쌍 상보성을 복원함으로써(불일치의 경우), 또는 돌출의 경우에 불필요한 짝지워지지 않은 뉴클레오티드들을 제거함으로써 수행될 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 shRNA 분자들 또는 miRNA 분자들일 수 있다.　가장 특별하게는, 그들은 miRNA 분자들이다.　shRNA 분자들과 miRNA 분자들의 차이점은 miRNA 분자들은 드로샤에 의해 처리되지만, 통상의 shRNA 분자들은 처리되지 않는다는 것이다(이는 독성과 관련되어 있음, Grimm et al., Nature 441:537-541 (2006)).

특정 구체예들에 따르면, miRNA 분자들은 하나의 프로모터의 제어 하에 개별 miRNA 스캐폴드들로서 제공될 수 있다.　선택된 각각의 스캐폴드는 일반적으로 하나의 miRNA에 해당하고(도 1), 그 스캐폴드는 반복되거나 또는 다른 스캐폴드들과 결합되어, 다중 RNA 간섭 분자들의 발현을 얻을 수 있다(도 1 및 도 2).　그러나, 반복되거나 또는 추가 스캐폴드들과 결합할 때, 다중화된 RNA 간섭 분자들 모두가 하나의 프로모터의 제어 하에 있을 것으로 일반적으로 예상된다(즉, 개별 스캐폴드가 반복되거나 다른 스캐폴드가 추가될 때, 상기 프로모터는 반복되지 않음).

miRNA 다중화에 특히 적합한 스캐폴드 서열들은, 내인성 miRNA 표적 서열이 관심 대상의 shRNA 표적 서열로 대체된 진정한 폴리시스트론 miRNA 클러스터 또는 그의 일부에서 발견되는 것들이다.　이를 위해 특히 적합한 miR 스캐폴드 클러스터들은 miR-106a~363, miR-17~92, miR-106b~25 및 miR-23a~27a~24-2 클러스터이다;　가장 특별히 예상되는 것은 miR-106a~363 클러스터 및 이의 단편(즉, 하나 이상의 개별 스캐폴드)이다.　참고로, 벡터 페이로드를 절약하기 위해, 전체 서열이 아닌 그러한 야생형/천연 클러스터들의 일부를 사용하는 것도 구체적으로 예상된다(이는 모든 miRNA가 균등하게 간격을 두지 않고 모든 링커 서열들이 필요하지 않을 수 있기 때문에 특히 유용하다).　실제로,　본 명세서(실시예 5)에서는, 스캐폴드들이 클러스터 컨텍스트의 외부에서 사용될 수 있고 다른 방식으로 결합될 수 있음을 보여준다.　예를 들어, 세포 내에서 가장 효율적으로 처리되는 miRNA들을 사용하는 것과 같은 다른 고려 사항들이 고려될 수 있다.　예를 들어, miR-17~92 클러스터는 miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-l 스캐폴드 및 miR-92-1(또한 miR-92al) 스캐폴드로 구성되고, 상기 클러스터의 특히 유용한 단편들은 링커들을 갖는 miR-19a 내지 miR-92-1(즉, 6개의 miRNA들 중 4개), 또는 miR-19a 내지 miR-19b-l(6개의 miRNA들 중 3개)의 스캐폴드 서열이다.　마찬가지로, 106a~363 클러스터는 (순서대로) miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드,　miR-92-2(또한 miR-92a2) 스캐폴드 및 miR-363 스캐폴드(도 5 참조)로 구성된다.　상기 클러스터의 특히 유용한 단편들은 miR-106a 내지 miR-20b(즉, 6개의 miRNA들 중 3개)(실시예 5 참조), miR-20b 내지 miR-363(즉, 6개의 miRNA들 중 4개) 또는 miR-19b-2 내지 miR-363(즉, 6개의 miRNA들 중 3개)의 스캐폴드 서열들이다(도 6 참조).　(벡터들의 페이로드를 다시 감소시키기 위해) 야생형/천연 링커 서열들 뿐만 아니라 그들의 단편들 또는 합성 링커들 모두 사용될 수 있다.

miR-106a~363 클러스터로부터의 miRNA 스캐폴드들이 특히 고려됨에 따라, 특히 예상되는 링커들은 각각 대응되는 스캐폴드의 5' 및 3' 서열들이다(도 1 참조).　링커 서열들은, 예를 들어 상기 스캐폴드의 양측 상에서, 150bp, 140bp, 130bp, 120bp, 110bp, 100bp, 90bp, 80bp, 70bp, 60bp, 50bp, 40bp, 30bp, 20bp 이하일 수 있다. 상기 클러스터에서 인접하지 않은 2개의 스캐폴드가 사용되는 경우(예로서, 실시예 5에서와 같이), 상기 링커들은 정의상 클러스터들에서 발견되는 것들과 동일하지 않다.　또한, 클러스터 내의 하나의 스캐폴드의 3'에 존재하는 30, 60 또는 90bp를 사용할 수 있고, 이를 그 다음의 선택된 스캐폴드의 5'의 30, 60, 90bp로 구성된 링커에 결합하여 하이브리드 링커를 생성할 수 있다.

상기 miRNA 스캐폴드들은 특히 그대로 사용된다: 즉, 스캐폴드 서열에 대한 변형 없이 사용된다.　특히, 하부 줄기 서열은 각각의 miRNA 스캐폴드에서 발견되는 것과 동일하게 유지될 것이다.　바람직하게는, 상부 줄기의 루프 서열들도 변경되지 않지만, 실험들에 따르면 이들은 주로 유연한 구조이며, 상부 줄기 구조가 영향을 받지 않는 한 길이와 서열이 조정될 수 있다.　바람직하지는 않지만, 당업자는 이러한 변형된 루프들을 갖는 스캐폴드들이 본 발명의 범위 내에 있음을 이해할 것이다.　상기 스캐폴드들의 상부 줄기 내에서 표적 서열이 발견된다.　miR-106a-363 클러스터의 야생형/천연 표적 서열들은 22 내지 23bp 길이이다.　실시예 4에 나타낸 바와 같이, 표적 서열들은 유해한 영향 없이 크기가 단축될 수 있다.　표적 서열들은 18 내지 23bp 길이일 수 있고, 18 내지 21bp의 서열들이 특히 고려되며;　18 내지 20bp의 서열들이 훨씬 더 특별히 고려된다.　더 짧은 서열들이 필요한 경우에는, 18 또는 19bp의 표적 서열들을 사용해도 문제가 없다.

표적화를 위해 명백한 바와 같이, 표적 서열은 명백히 표적에 대한 적응을 필요로 하는 스캐폴드의 일부분이다.　miRNA 스캐폴드들은 그들의 체계 내에 일부 불일치들을 가지므로, 이러한 불일치들을 유지해야만 하는지의 여부가 문제이다.　실시예 3(및 도 9)에서 볼 수 있듯이, miR-106a 및 miR-20b에서 표적 서열의 14번 위치에서 발견된 불일치는 상기 표적의 하향조절에 대한 부정적인 영향 없이 유지될 수 있고, 이는 패신저 가닥이 가이드 가닥에 대해 완전히 상보적이지는 않다는 것을 의미한다.　또한, 실시예 3(및 도 10)에서 볼 수 있듯이, 하나 이상의 불일치가 존재할 경우(예로서, miR-18b 스캐폴드에서), 더 효율적인 녹다운을 달성하기 위해(필요하면), 패신저 가닥은 가이드 가닥에 대해 더욱 상보적으로 되도록 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 상당한 수준의 녹다운을 달성하는 데 필요하지는 않지만, 상기 표적 서열의 6, 11 및 15번 위치(상기 스캐폴드의 bp 20 및 70, 25 및 65 및 29 및 61에 상응함(도 9 참조))에서의 불일치들을 제거함으로써, 녹다운이 전체적으로 개선된다.　돌출(miR-18b 스캐폴드의 뉴클레오티드들 75 및 76)에 대해서도 마찬가지이다.　패신저 가닥의 불일치들 또는 돌출들을 제거함으로써 표적과 패신저 가닥의 상보성을 증대시킬 경우, 다양한 표적 서열들을 테스트하면 항상 만족스러운 녹다운 수준이 얻어지기 때문에, 필요하지는 않더라도 다른 스캐폴드들의 하향 조절도 개선될 것이다.　

각각의 RNA 간섭 분자는 상이한 분자를 표적화할 수 있고, 동일한 분자 또는 이들의 조합을 표적화할 수 있다(즉, 하나 이상의 RNA 분자가 하나의 표적을 지향하는 반면, 단지 하나의 RNA 간섭 분자가 다른 표적을 지향한다).　상기 RNA 간섭 분자들이 동일한 표적을 지향할 경우, 그들은 동일한 영역을 표적으로 할 수도 있고, 다른 영역을 표적으로 할 수도 있다.　즉, 상기 RNA 간섭 분자들이 동일한 표적에 대한 것일 경우, 이들은 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. RNA 간섭 분자들의 그러한 조합의 예들은 실시예 섹션에 나타나 있다.

따라서, 특정 구체예들에 따르면, 상기 다중화된 RNA 간섭 분자들 중 적어도 2개는 동일한 표적에 대해 지시된다.　추가의 특정 구체예들에 따르면, 이들 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들은 동일한 miRNA 스캐폴드들을 사용한다.　이들은 동일한 표적 서열을 사용함으로써(이러한 특정 구체예들에 따르면, 다중화된 RNA 간섭 분자들 중 적어도 2개가 동일함) 또는 상이한 타겟 서열을 사용함으로써(이러한 특정 구체예들에 따르면, 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 동일한 스캐폴드들을 가지지만 표적 서열은 다름) 동일한 표적을 지향할 수 있다.　대안적인 구체예들에 따르면, 동일한 표적을 지향하는 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 상이한 miRNA 스캐폴드 서열을 갖는다.　그 경우, 그들은 동일한 표적 서열을 가질 수 있고, 또는 동일한 표적을 지향하는 상이한 표적 서열을 가질 수 있다.

대안적인 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들 모두는 상이하다.　추가의 특정 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들 모두는 상이한 표적들을 지향한다.

조작된 세포에 존재하는 임의의 적합한 분자는 인스턴트 RNA 간섭 분자들에 의해 표적화될 수 있다.　고려되는 표적들의 전형적인 예는 다음과 같다: MHC 클래스 I 유전자, MHC 클래스 II 유전자, MHC 공동수용체 유전자(예로서, HLA-F, HLA-G), TCR 사슬, NKBBiL, LTA, TNF, LTB, LST1, NCR3, AIF1, LY6, 열 충격 단백질(예로서, HSPA1L, HSPA1A, HSPA1B), 상보체 캐스케이드, 조절 수용체(예로서, NOTCH4), TAP, HLA-DM, HLA-DO, RING1, CD52, CD247, HCP5, B2M, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, 2B4, A2AR, BAX, BLIMP1, C160(POLR3A), CBL-B, CCR6, CD7, CD27, CD28, CD38, CD95, CD96, CD123, CD272(BTLA), CD276(일명 B7-H3), CIITA, CTLA4, DGK [DGKA, DGKB, DGKD, DGKE, DKGG, DGKH, DGKI, DGKK, DGKQ, DGKZ], DNMT3A, DR4, DR5, EGR2, FABP4, FABP5, FASN, GMCSF, HPK1, IL-10R [IL10RA, IL10RB], IL2, LAG3(CD223), LFA1, NEAT 1, NFkB(RELA, RELB, NFkB2, NFkB1, REL 포함), NKG2A, NR4A(NR4A1, NR4A2, NR4A3 포함), PD1, PI3KCD, PPP2RD2, PRAS40, RAPTOR, SHIP1, SOAT1, SOCS1, T-BET, TCF7(일명 TCF-1), TET2, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TIGIT, TIM3(일명 HAVCR2 또는 CD366), TOX, TOX2, VISTA(일명 VSIR 또는 B7-H5), ZC3H12A(regnase-1 또는 MCPIP로도 알려짐) 및 ZFP36L2.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 상기 핵산 분자는 그 자체로 사용되지 않고 적합한 벡터, 즉 세포에서 발현을 허용하는 벡터 내에 제공된다. 특정 구체예들에 따르면, 상기 벡터는 진핵 세포, 특히 면역 세포에서의 발현에 적합하다.

따라서, 조작된 면역 세포에서의 발현에 적합한, 본 명세서에 기술된 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 상기 핵산 분자에 대해 개시된 모든 특징들은 필요한 부분만 수정하여 벡터에 적용된다. 즉, 조작된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 포함하는 벡터들이 제공되며, 여기서 상기 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 계열 클러스터로부터의 miR 스캐폴드의 것이고, 상기 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 천연 서열과 다르게 조작되었다.

추가의 구체예들에 따르면, 상기 조작된 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-1 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, miR-363 스캐폴드, miR-106b 비계, miR-25 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택된다. 추가의 구체예들에 따르면, 상기 조작된 스캐폴드는 키메라 스캐폴드이고, 상기 키메라 스캐폴드에서 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택된다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 벡터에 존재하는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자, 특히 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이다.

추가의 특정 구체예들에 따르면, 상이한 스캐폴드들을 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자를 포함하는 핵산 분자를 함유하는 벡터들이 제공되며, 여기서 적어도 2개의 상이한 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역을 갖는다; 그리고, 여기서

- 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 키메라 스캐폴드를 가지며, 여기서 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되고; 그리고/또는, 여기서

상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은, 하향 조절될 표적 분자의 수 및 다중화된 분자들을 공동 발현하는 관점에서의 실제 고려 사항들에 따라, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 이상의 분자들일 수 있다. 상기 miR-17 계열 클러스터는 15개의 스캐폴드를 가지고, 상기 스캐폴드들은 녹다운 활성의 손실 없이 이중화(duplicated)될 수 있고(실시예 5), 상이한 클러스터들로부터 유래된 개별 스캐폴드들은 조합될 수 있으며(예 7), 실제로는 종종 더 낮은 개수가 사용될 것이지만, 원칙적으로 최대 12개의 스캐폴드들을 다중화할 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자는 하나의 프로모터의 제어 하에 있다. 전형적으로, 하나 이상의 RNA 간섭 분자가 발현되는 경우, 이는 shRNA 발현 카세트의 다중 복사체를 통합함으로써 수행된다. 이들은 일반적으로 동일한 프로모터 서열들을 가지고 있어서, 반복된 서열 단편들을 제거하는 빈번한 재조합 이벤트가 이루어진다. 해결책으로서, 일반적으로 다양한 여러 프로모터들이 발현 카세트 내에 사용된다(예로서, Chumakov et al., 2010). 그러나, 본 발명의 구체예들에 따르면, 단지 하나의 프로모터를 사용함으로써 재조합이 방지된다. 발현은 일반적으로 낮아지지만, siRNA가 너무 많으면 세포에 독성이 있을 수 있기 때문에(예로서, 내인성 siRNA 경로를 방해함으로써), 독성 측면에서 이점이 있다. 단 하나의 프로모터를 사용하면, 모든 shRNA가 유사한 수준으로 공동 조절되고 발현된다는 추가 이점이 있다. 놀랍게도, 실시예들에 나타난 바와 같이, 다중 shRNA는 효능의 상당한 저하 없이 하나의 프로모터로부터 전사될 수 있다.

전형적으로, 상기 RNA 간섭 분자들을 발현하는데 사용되는 상기 프로모터는 U6 프로모터가 아니다. 이는, 이 프로모터가 특히 높은 수준의 발현에서 독성과 연관되어 있기 때문이다. 같은 이유로, H1 프로모터들(U6보다 약한 프로모터들) 또는 일반적으로 Pol III 프로모터들(특정 조건에서는 적합할 수 있을지라도)을 제외하는 것을 고려할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들에 따르면, 상기 RNA 간섭 분자들을 발현하는데 사용되는 상기 프로모터는 RNA Pol III 프로모터가 아니다. RNA Pol III 프로모터는 시간적 및 공간적 제어가 부족하고, miRNA 억제제의 제어된 발현을 허용하지 않는다. 대조적으로, 수많은 RNA Pol II 프로모터는 조직-특이적 발현을 가능하게 하며, 유도성 및 억제성 RNA Pol II 프로모터들이 모두 존재한다. (세포들은 조작 이전에 선택되기 때문에) 비록 조직-특이적 발현이 본 발명의 맥락에서 자주 요구되지는 않더라도, 예를 들어 면역 세포에 대한 특정 프로모터들을 갖는 것은, 다양한 프로모터들에 있어서의 RNAi 효능의 차이가 면역 세포들에서 특히 두드러지기 때문에, 여전히 이점이 있다(Lebbink et al., 2011). 특정 구체예들에 따르면, 상기 프로모터는 Pol II 프로모터 및 Pol III 프로모터로부터 선택된다. 특정 구체예들에 따르면, 상기 프로모터는 천연 또는 합성 Pol II 프로모터이다. 적합한 프로모터에는, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터(코어 또는 전장(full length)), 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 업스트림 CMV IV 인핸서를 갖는 복합 베타-액틴 프로모터(CAG 프로모터), 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터, 비장 초점 형성 바이러스(SFFV) 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 인터루킨-2 프로모터, 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV) 긴 말단 반복(LTR), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GALV) LTR, 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터 및 tRNA 프로모터가 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 이들 프로모터들은 mRNA 발현을 유도하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 폴리머라제 II 프로모터들에 속한다.

본 명세서에 개시된 벡터들은 ACT에 사용되는 세포들에 사용하기에 특히 적합하다. 따라서, 본 발명의 목적은 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조작된 세포들을 제공하는 것이다. 상기 RNA 간섭 분자들은 일반적으로 천연 스캐폴드 서열에는 존재하지 않는 표적 서열도 함유한다. 상기 표적 서열은 전형적으로 18~23개 핵산의 길이를 갖는다. 상기 표적 서열은 상기 조작된 세포들에서 발생하는 서열, 특히 표적의 서열에 대해 지향되는 것이 특히 고려된다. 즉, 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 하향조절되어질 단백질을 인코딩하는 상기 조작된 세포 내의 서열을 (염기쌍 상보성에 의해) 표적화하는 서열, 또는 상기 표적 단백질의 조절 영역들을 갖는다. 이러한 표적들의 예는, MHC 클래스 I 유전자, MHC 클래스 II 유전자, MHC 보조수용체 유전자(예로서, HLA-F, HLA-G), TCR 사슬, NKBBiL, LTA, TNF, LTB, LST1, NCR3, AIF1, LY6, 열 충격 단백질(예로서, HSPA1L, HSPA1A, HSPA1B), 상보체 캐스케이드, 조절 수용체(예로서, NOTCFI4), TAP, HLA-DM, HLA-DO, RING1, CD52, CD247, HCP5 , B2M, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, 2B4, A2AR, BAX, BLIMP1, C160(POLR3A), CBL-B, CCR6, CD7, CD27, CD28, CD38, CD95, CD96, CD123, CD272(BTLA), CD276(일명 B7-H3), CIITA, CTLA4, DGK [DGKA, DGKB, DGKD, DGKE, DKGG, DGKH, DGKI, DGKK, DGKQ, DGKZ], DNMT3A, DR4, DR5, EGR2, FABP4, FABP5, FASN, GMCSF, HPK1, IL-10R [IL10RA, IL10RB], IL2, LAG 3(CD223), LFA1, NEAT 1, NFkB(RELA, RELB, NFkB2, NFkB1, REL 포함), NKG2A, NR4A( NR4A1, NR4A2, NR4A3 포함), PD1, PI3KCD, PPP2RD2, PRAS40, RAPTOR, SHIP1, SOAT1, SOCS1, T-BET, TCF7(일명 TCF-1), TET2, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TIGIT, TIM3(일명 HAVCR2 또는 CD366), TOX, TOX2, VISTA(일명 VSIR 또는 B7-H5), ZC3H12A(regnase-1 또는 MCPIPF로도 알려짐) 및 ZFP36L2.

RNA 간섭 분자 이외에, 상기 벡터는 종종 추가 요소들을 함유할 것이고, 일반적으로 CAR과 같은 관심 단백질을 인코딩하는 핵산도 함유한다. 추가의 특정 구체예들에 따르면, 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들 및 관심 단백질 둘 모두는 하나의 프로모터의 제어 하에 있다. 이는 다시 벡터 로드를 감소시키고(관심 단백질을 발현하는 데 별도의 프로모터가 사용되지 않음), 공동 조절된 발현의 이점을 제공한다. 이는, 예를 들어 상기 관심 단백질이 암을 표적으로 하는 CAR이고, 상기 RNA 간섭 분자들이 종양 근절에 추가적 효과 또는 상승 효과를 갖도록 의도되는 경우, 유리할 수 있다. 유용한 RNA 표적의 예는, CD247, TRAC(둘 모두 TCR 복합체를 하향 조절하여 세포들을 동종이형 치료에 더 적합하게 만듦), B2M(조직적합성을 확장하기 위해), CD52(세포들이 CD52-지정 화학요법에서 생존하도록 만듦), CD95(세포들을 CD95에 의해 유발된 세포 사멸에 둔감하게 만듦), 관문 분자들(예로서, PD-1, PD-L1, CTLA4) 등을 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

상기한 바와 같이, 본 명세서에 기술된 핵산 분자들 및 벡터들은 ACT를 위해 세포들을 조작하는 데 특히 유용하다. 따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조작된 면역 세포들이 제공된다. 상기 핵산 분자들 및 벡터들에 대해 개시된 모든 특징들은 필요한 부분만 변경하여 상기 조작된 세포들에 적용된다.

적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 함유하거나 적어도 2개의 RNA 간섭 분자를 함유하는 세포는 장점들, 특히 치료적 이점들을 가질 수 있다. 상기 RNA 간섭 분자들은 실제로 (과다)발현이 바람직하지 않은 표적들에 대해 지향될 수 있다. 그러나 전형적으로, 본 명세서에서 제공되는 조작된 세포들은 적어도 하나의 관심 단백질을 더 함유할 것이다.

따라서, 다음을 포함하는 조작된 세포가 제공된다:

o 관심 단백질을 인코딩하는 제1 외인성 핵산 분자, 및

o 조작된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 포함하는 제2 핵산 분자, 여기서 상기 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 계열 클러스터로부터의 miR 스캐폴드의 것이고, 상기 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 천연 서열과 상이하도록 조작된 것이다.

추가 구체예들에 따르면, 상기 조작된 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-l 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, miR-363 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드, miR-25 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택된다. 추가의 구체예들에 따르면, 상기 조작된 스캐폴드는 키메라 스캐폴드이고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 상기 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택된다.

추가로, 다음을 포함하는 조작된 세포들이 제공된다:

o 관심 단백질을 인코딩하는 제1 외인성 핵산 분자, 및

o 상이한 스캐폴드들을 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들을 포함하는 제2 핵산 분자, 여기서 적어도 2개의 상이한 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역을 가지고; 그리고,

- 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 키메라 스캐폴드를 가지며, 상기 키메라 스캐폴드에서 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되고; 그리고/또는

- 상기 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들로부터의 상기 스캐폴드들은 상이한 miR-17 계열 클러스터들 유래의 miR-17 패밀리 스캐폴드이다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 조작된 세포들은 조작된 면역 세포들이다. 구체적으로, 상기 면역세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 줄기세포, 전구세포, 및 iPSC 세포 중에서 선택된다.

적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들이 존재하는 경우, 이들 2 이상의 분자들은 동일하거나 상이한 스캐폴드들을 가질 수 있다. 그러나, 특히 3개 이하의 스캐폴드가 동일한 것이 고려되며, 더욱 특히 2개 이하의 동일한 스캐폴드가 사용되는 것이 고려된다. 이는, 동일한 스캐폴드 서열들 간의 재조합을 방지하기 위해, 또는 세포의 miRNA 처리 용량의 과부하를 방지하기 위한 것이다(실시예 5 참조). 동일한 이유로, 동일한 표적에 대한 하나 이상의 표적 서열이 있는 경우, 특히 다른 표적 서열이 사용되거나 동일한 표적 서열이 다른 스캐폴드에서 사용되는 것이 고려된다. 동일한 스캐폴드들 내의 동일한 표적 서열들이 가능하지만, 특히 이는 두 번 이하로 발생하는 것이 고려된다.

선택적인 추가의 관심 단백질은, 예를 들어 부가적, 지지적 또는 심지어 상승적 효과를 제공할 수 있거나, 다른 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 관심 단백질은 종양에 대해 지향된 CAR일 수 있고, 상기 RNA 간섭 분자는, 예를 들어 면역관문을 표적으로 삼고, 종양 표적을 직접 하향조절하며, 종양 미세환경을 표적으로 함으로써 종양 기능을 방해할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 하나 이상의 상기 RNA 간섭 분자는 치료 세포들의 지속성을 연장할 수 있거나, 또는 생리학적 반응을 변경(예로서, GvHD 또는 숙주 대 이식편 반응을 방해)할 수 있다.

관심 단백질은 설정에 따라 원칙적으로 임의의 단백질일 수 있다. 그러나 일반적으로, 이들은 치료 기능을 가진 단백질이다. 이들 단백질에는, 예를 들어 인터루킨, 사이토카인 또는 호르몬과 같은 분비된 치료 단백질이 포함될 수 있다. 그러나, 특정 구체예들에 따르면, 상기 관심 단백질은 분비되지 않는다. 치료용 단백질 대신에, 상기 관심 단백질은, 예를 들어 진단 또는 검출과 같은 다른 기능을 수행할 수 있다. 따라서, 상기 관심 단백질은 태그 또는 리포터 유전자일 수 있다. 일반적으로, 상기 관심 단백질은 수용체이다. 추가의 특정 구체예들에 따르면, 상기 수용체는 키메라 항원 수용체 또는 TCR이다. 키메라 항원 수용체는 표적 세포의 표면에 발현된 임의의 표적에 대해 지향될 수 있으며, 전형적인 예로는 CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CD56, CD70, CD123, CD133, CD138, CD171, CD174, CD248, CD274, CD276, CD279, CD319, CD326, CD340, BCMA, B7H3, B7H6, CEACAM5, EGFRvIII, EPHA2, 메조텔린, NKG2D, HER2, HER3, GPC3, Flt3, DLL3, IL1RAP, KDR, MET, 뮤신 1, IL13Ra2, FOLH1, FAP, CA9, FOLR1, ROR1, GD2, PSCA, GPNMB, CSPG4, ULBP1, ULBP2가 포함되지만, 많은 다른 종류들이 존재하고, 그들 역시 적합하다. 대부분의 CAR들은 scFv-기반(즉, 결합 부분은 특정 표적에 대해 지향된 scFv이고, 상기 CAR은 일반적으로 표적의 이름을 따서 명명됨)이지만, 일부 CAR들은 수용체-기반(즉, 결합 부분이 수용체의 일부이고, 상기 CAR은 일반적으로 수용체의 이름을 따서 명명됨)이다. 후자의 예는 NKG2D-CAR이다.

조작된 TCR들은, 세포내 표적들을 포함하여, 세포의 임의의 표적에 대해 지향될 수 있다. 세포 표면에 존재하는 위에 열거된 표적들 외에도, TCR의 전형적인 표적들로는 NY-ESO-1, PRAME, AFP, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, gplOO, MART-1, 티로시나제, WT1, p53, HPV-E6, HPV-E7, HBV, TRAIL, 티로글로불린, KRAS, HERV-E, HA-1, CMV 및 CEA가 포함되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

추가의 관심 단백질이 존재하는, 이들 특정 구체예들에 따르면, 상기 조작된 세포 내의 제1 및 제2 핵산 분자는 전형적으로, 예를 들어 진핵생물 발현 플라스미드, 미니서클 DNA 또는 바이러스 벡터(예로서, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 센다이 바이러스로부터 유래)와 같은 하나의 벡터 내에 존재한다. 추가의 특정 구체예들에 따르면, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로부터 선택된다. 특히, 후자의 경우, 벡터 로드(즉, 구축물의 전체 크기)가 중요하며, 컴팩트 다중체 카세트(compact multiplex cassette)들을 사용하는 것이 특히 유리하다.

주목할 점은, 본 명세서에 기술된 상기 세포들은 하나 보다 많은 수의 관심 단백질을 포함할 수 있다는 것이다: 예를 들어, 수용체 단백질 및 리포터 단백질(도 2 참조), 또는 수용체 단백질, 인터루킨 및 태그 단백질.

상기 조작된 세포는, 특히 진핵 세포, 더욱 특히 조작된 포유동물 세포, 더욱 특히 조작된 인간 세포이다. 특정 구체예들에 따르면, 상기 세포는 조작된 면역 세포이다. 전형적인 면역세포는 T세포, NK세포, NKT세포, 대식세포, 줄기세포, 전구세포, 및 iPSC 세포로부터 선택된다.

본 명세서에 개시된 상기 세포들은 전형적으로 다중화된 RNA 간섭 분자들을 함유한다. 이들은 하향 조절이 필요한 하나 이상의 표적(세포 내 표적, 또는 shRNA가 분비되는 경우 세포 외부의 표적)에 대해 지향될 수 있다.

본 명세서에 개시된 본 발명을 표현하는 대안적인 방식은 miRNA 기반인 특히 적합한 구축물들이 확인되었다는 것이다.　따라서, 마이크로RNA-기반 shRNA 인코딩 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 세포들이 제공되며, 여기서 상기 마이크로RNA-기반 shRNA 인코딩 영역은 다음을 인코딩하는 서열들을 포함한다:

하나 이상의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오타이드 서열들로서, 각각의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열은,

ｏ miRNA 스캐폴드 서열,

ｏ 활성 서열 또는 성숙 서열, 및

ｏ 패신저 서열 또는 스타 서열을 포함하고, 여기서 각각의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열 내에서, 상기 활성 서열은 상기 패신저 서열에 대해 적어도 70% 상보적이다.

특정 이점은 인스턴트 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열들이 다중화될 수 있다는 것이다.　따라서, 다중화된 마이크로RNA-기반 shRNA 인코딩 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 세포들이 제공되며, 여기서 상기 다중화된 마이크로RNA-기반 shRNA 인코딩 영역은 다음을 인코딩하는 서열들을 포함한다:

2개 이상의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열들, 여기서 각각의 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열은,

ｏ miRNA 스캐폴드 서열,

ｏ 활성 서열 또는 성숙 서열, 및

특히, 상기 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열들은 miR-106a 서열, miR-18b 서열, miR-20b 서열, miR-19b-2 서열, miR-92-2 서열 및 miR-363 서열로부터 선택된다. 상기 인공 miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열들의 각각의 활성 서열 및 패신저 서열 모두는 전형적으로 18 내지 40개 뉴클레오티드 길이이고, 보다 특별하게는 18 내지 30개 뉴클레오티드, 더욱 특별하게는 18 내지 25개 뉴클레오티드, 가장 특별하게는 18 내지 23개 뉴클레오티드 길이이다. 또한, 상기 활성 서열은 18개 또는 19개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 돌출들의 가능한 존재는 상기 패신저 서열과 상기 활성 서열이 항상 동일한 길이인 것은 아니라는 것을 의미하지만, 전형적으로, 상기 패신저 서열은 상기 활성 서열과 동일한 길이를 갖는다.

전형적으로, 이러한 마이크로RNA 스캐폴드 서열들은 링커들에 의해 분리된다.　마이크로RNA 클러스터들에서 링커들은 다음의 길이일 수 있다: 최대 500개 뉴클레오티드, 최대 400개 뉴클레오티드, 최대 300개 뉴클레오티드, 최대 200개 뉴클레오티드, 최대 150개 뉴클레오티드, 최대 100개 뉴클레오티드.　스캐폴드 서열들을 다중화할 때, 목적은 임의의 잠재적인 조절 서열이 포함되도록 하기 위해 충분한 길이의 천연 링커 서열들(상기 miRNA 스캐폴드 서열의 5' 및 3'에서 발견된 서열들)을 사용하는 것일 수 있다.　예를 들어, 스캐폴드 서열 옆에 50, 100 또는 150개의 뉴클레오티드를 사용할 수 있다.　대안적인 목적은 벡터 페이로드를 줄이고 링커 길이를 줄이는 것일 수 있으며, 따라서 링커 서열들은, 더 짧은 스트레치도 작동하지만, 예를 들어 30개 내지 60개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.　실제로,　놀랍게도 링커의 길이는 중요한 역할을 하지 않으며, shRNA 기능을 간섭함이 없이 매우 짧거나(10개 미만의 뉴클레오티드) 심지어 없을 수도 있다는 것이 발견되었다.　특정 구체예들에 따르면, 5' 및/또는 3' 링커 서열의 적어도 일부는 각각에 대응되는 스캐폴드와 함께 사용된다.　상기 적어도 일부는 전형적으로 5' 및/또는 3' 링커 서열의 적어도 10개의 뉴클레오티드, 적어도 20개의 뉴클레오티드, 적어도 30개의 뉴클레오티드, 적어도 40개의 뉴클레오티드, 적어도 50개의 뉴클레오티드, 적어도 60개의 뉴클레오티드, 적어도 70개의 뉴클레오티드, 적어도 80개의 뉴클레오티드, 적어도 90개의 뉴클레오티드, 적어도 100개의 뉴클레오티드, 적어도 120개의 뉴클레오티드, 적어도 150개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 200개의 뉴클레오티드이다.

miRNA-기반 shRNA 뉴클레오티드 서열들은 인공 서열로 간주되는데, 그 이유는 상기 스캐폴드 서열이 자연적으로 발생하더라도 내인성 miR 서열들이 특정 표적에 대해 조작된 shRNA 서열들로 대체되었기 때문이다.　인공 서열들은, 예를 들어 내인성 miR 서열들이 특정 표적에 대해 조작된 shRNA 서열들로 대체된 천연발생 스캐폴드들(예로서, miR-106a~363 클러스터와 같은 miR 클러스터 또는 이의 단편), 내인성 miR 서열들이 특정 표적에 대해 조작된 shRNA 서열들로 대체된 단일 miR 스캐폴드(예로서, miR-20b 스캐폴드)의 반복물, 인공 miR-유사 서열들, 또는 이들의 조합일 수 있다.

이 조작된 세포는 전형적으로 키메라 항원 수용체 또는 TCR과 같은 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하고, 상기 기재된 바와 같이 조작된 면역 세포일 수 있다.　

적어도 하나의 RNA 간섭 분자의 발현 또는 다중화된 RNA 간섭 분자들의 공동-발현은 상기 조작된 세포들 내에서 적어도 하나의 유전자, 그러나 전형적으로는 복수의 유전자들의 억제를 초래한다.　이것은 더 큰 치료 효능에 기여할 수 있다.

본 명세서에 기재된 조작된 세포들은 또한 의약으로서 사용하기 위해 제공된다.　특정 구체예들에 따르면, 상기 조작된 세포들은 암 치료에 사용하기 위해 제공된다.　치료될 수 있는 암의 예시적인 유형은, 선암종, 부신피질 암종, 항문암, 성상세포종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 유잉 육종, 안암, 나팔관암, 위암(gastric cancer), 교모세포종, 두경부암, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 신경모세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 복막암, 인두암, 전립선암, 신장세포암종, 망막아세포종, 횡문근육종, 육종, 피부암, 소장암, 위암(stomach cancer), 고환암, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 질암, 및 윌름스 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 세포들은 액체암 또는 혈액암의 치료를 위해 제공될 수 있다.　이러한 암들의 예는, 예를 들어 백혈병(급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL) 등 포함), 림프종(호지킨 림프종, 및 B-세포 림프종(예로서, DLBCL), T 세포 림프종, 버킷 림프종, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종 및 소림프구성 림프종과 같은 비호지킨 림프종 등), 다발성 골수종 또는 골수이형성 증후군(MDS)을 포함한다.

따라서, 암을 치료하는 방법들이 제공되며, 상기 방법들은 적절한 투여량의 본 명세서에 기재된 조작된 세포들(즉, 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들을 인코딩하는 외인성 핵산 분자, 및 선택적으로 관심 단백질을 인코딩하는 추가의 핵산 분자를 포함하는 조작된 세포들)을 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 해당 암과 관련된 적어도 하나의 증상을 개선한다.　치료를 위해 예상되는 암에는 선암, 부신피질암, 항문암, 성상세포종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 유잉 육종, 안암, 나팔관암, 위암, 교모세포종, 두경부암,　카포시육종, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 신경모세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 복막암, 인두암, 전립선암, 신장세포암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 피부암, 소장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 질암, 및 윌름스 종양을 포함하나, 이들에 제한되지는 않는다.　추가의 특정 구체예들에 따르면, 혈액암을 치료하는 방법들이 제공되며, 이 방법들은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 세포들의 적절한 투여량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 상기 암의 적어도 하나의 증상을 개선하는 것을 포함한다.　

대안적인 구체예들에 따르면, 자가면역 질환들의 치료에 사용하기 위해 상기 세포들이 제공될 수 있다.　치료될 수 있는 자가면역 질환들의 예시적인 유형은 류마티스 관절염(RA), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환(IBD), 다발성 경화증(MS), 제1형 진성 당뇨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS 또는 루게릭병), 척수성 근위축증(SMA), 크론병, 길랭-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 건선, 건선성 관절염, 애디슨병, 강직성 척추염, 베체트병, 체강내막염, 자궁근막염, 섬유근육통, 그레이브스병, 하시모토갑상선염, 가와사키병, 메니에르병, 중증근무력증, 유육종, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혈소판감소성 자반병(TTP), 궤양성 대장염, 혈관염 및 백반증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

따라서, 자가면역 질환을 치료하는 방법들이 제공되며, 상기 방법들은, 본 명세서에 기재된 조작된 세포들의 적절한 투여량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 자가면역 질환과 관련된 적어도 하나의 증상을 개선하는 것을 포함한다. 치료될 수 있는 예시적인 자가면역 질환들은 위에 열거되어 있다.

또 다른 구체예들에 따르면, 상기 세포들은 감염성 질병의 치료에 사용하기 위해 제공될 수 있다.　"감염성 질병"은 해당 질병이 있는 대상 또는 유기체 내부 또는 그 위의 외부 유기체(병원체)의 존재에 의해 야기되는 임의 유형의 질병을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.　감염은 일반적으로 미생물들 또는 바이러스, 프리온, 박테리아 및 바이로이드와 같은 미세 기생충들에 의해 유발되는 것으로 여겨지지만, 거대 기생충 및 균류와 같은 더 큰 유기체들도 감염을 유발할 수 있다.　감염을 일으킬 수 있는 유기체들은, 본 명세서에서 "병원체(pathogens)"(질병을 일으키는 경우) 및 "기생충"(숙주 유기체를 희생하여 이익을 얻음으로써, 존재하는 명백한 질병없이도 숙주 유기체의 생물학적 적합성을 감소시키는 경우)으로 언급되며, 바이러스,　박테리아, 균류, 원생생물(예로서, 말라리아원충, 감자역병균) 및 원생동물(예로서, 말라리아원충, 이질아메바, 편모충, 톡소플라스마, 와포자충(Cryptosporidium), 트리코모나스(Trichomonas), 리슈마니아(Leishmania), 파동편모충(Trypanosoma))(미세 기생충들) 및 벌레들(예로서, 회충, 사상충, 구충, 요충, 및 조충 및 흡충과 같은 편충류 또는 편형동물) 뿐만 아니라 진드기 및 집먼지 진드기와 같은 외부 기생충을 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.　기생충류, 즉 숙주 유기체를 살균하거나 죽이는 기생충 유기체들은 기생충이라는 용어 내에 포함된다.　특정 구체예들에 따르면, 상기 감염성 질병은 미생물 또는 바이러스 유기체에 의해 유발된다.　

본 명세서에 사용된 "미생물 유기체"는 그람 양성 박테리아(예로서, 스타필로코커스 종, 엔테로코커스 종, 바실러스 종), 그람 음성 박테리아(예로서, 에스케리키아 종, 예르시니아 종), 스피로헤타(예로서, 트레포네마 팔라듐과 같은 트레포네마, 렙토스피라 종, 보렐리아 버그도르페리와 같은 보렐리아 종), 몰리쿠트(즉, 미코플라스마 종과 같은 세포벽이 없는 박테리아), 산- 내성 박테리아(예로서, 미코박테리움 튜버쿨로섬과 같은 미코박테리움 종, 노르카디아 종)와 같은 박테리아를 지칭할 수 있다.　"미생물 유기체"는 또한 진균류(예를 들어 효모 및 곰팡이, 예로서, 칸디다 종, 아스퍼질러스 종, 콕시디오이데스 종, 크립토코커스 종, 히스토플라스마 종, 뉴모시스티스 종 또는 트리코피톤 종), 원생동물(예로서, 플라스모디움 종, 엔타모에바 종, 지아르디아 종, 톡소플라스마 종, 크립토스포리디움 종, 트리코모나스 종, 리슈마니아 종, 트리파노소마 종) 및 고세균을 포함한다.　본 발명의 방법들로 치료될 수 있는 감염성 질병을 유발하는 미생물 유기체들의 추가 예들은, 황색 포도구균(메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA) 포함), 엔테로코커스 종(반코마이신 내성 장구균(VRE), 병원내 감염 병원균 엔테로코커스 페칼리스 포함), 바실러스 서브틸리스, B. 세레우스, 리스테리아 모노사이토겐, 살모넬라 종, 레지오넬라 뉴모필라와 같은 식품 병원체를 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 동등하게 사용되는 "바이러스 유기체" 또는 "바이러스"는 유기체들의 살아있는 세포들 내부에서만 복제될 수 있는 작은 감염원들이다.　이들은 dsDNA 바이러스(예로서, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스), ssDNA 바이러스(예로서, 파르보바이러스), dsRNA 바이러스(예로서, 레오바이러스), (+)ssRNA 바이러스(예로서, 피코르나바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스), (-)ssRNA 바이러스(예로서, 오르토믹소바이러스, 랍도바이러스), ssRNA-RT(역전사) 바이러스, 즉 수명 주기에서 DNA 중간체를 갖는 (+) 센스 RNA가 있는 바이러스, (예로서, 레트로바이러스), 및 dsDNA-RT 바이러스(예로서, 헤파드나바이러스)를 포함한다.　인간 대상자들을 감염시킬 수도 있는 바이러스의 예들은, 아데노바이러스, 아스트로바이러스, 헤파드나바이러스(예로서, B형 간염 바이러스), 헤르페스바이러스(예로서, 단순 헤르페스 바이러스 1형,　단순 헤르페스 바이러스 2형, 인간 거대세포 바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 로세올로바이러스), 파포바바이러스(예로서, 인간 파필로마 바이러스 및 인간 폴리오마 바이러스), 폭스바이러스(예로서, 바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 스몰폭스 바이러스), 아레나바이러스, 부니아바이러스, 칼시바이러스, 코로나바이러스(예로서, SARS 코로나바이러스, MERS 코로나바이러스, SARS-CoV-2 코로나바이러스(COVID-19의 병인원)), 필로바이러스(예로서, 에볼라 바이러스, 마르버그 바이러스), 플라비바이러스(예로서, 황열 바이러스, 웨스턴 닐레 바이러스, 뎅구열 바이러스, C형 간염 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뇌염 바이러스), 오르토믹소바이러스(예로서, 인플루엔자 A형 바이러스, 인플루엔자 B형 바이러스 및 인플루엔자 C형 바이러스), 파라믹소바이러스(예로서, 파라인플루엔자 바이러스, 루불라바이러스(볼거리), 모르빌리바이러스(홍역), 인간 호흡기 세포융합 바이러스와 같은 뉴모바리어스), 피코르나바이러스(예로서, 폴리오바이러스, 라이노바이러스, 콕사키 A 바이러스, 콕사키 B 바이러스, A형 간염 바이러스, 에코바이러스 및 엔테로바이러스), 레오바이러스, 레트로바이러스(예로서, 인간 면역결핍 바이러스 및 인간 T 림프영양 바이러스(HTLV)와 같은 렌티바이러스), 랍도바이러스(예로서, 광견병 바이러스) 또는 토가바이러스(예로서, 풍진 바이러스)를 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예들에 따르면, 치료될 상기 감염성 질병은 HIV가 아니다.　대안적인 구체예들에 따르면, 치료될 상기 감염성 질병은 레트로바이러스에 의해 유발된 질병이 아니다.　대안적인 구체예들에 따르면, 치료될 상기 감염성 질병은 바이러스성 질병이 아니다.　

또한, 감염성 질병을 치료하는 방법들이 제공되고, 상기 방법들은 감염성 질병의 치료가 필요한 대상에게 적절한 용량의 본 명세서에 기재된 조작된 세포들(즉, 2개 이상의 다중화된 RNA 간섭 분자들을 인코딩하는 외인성 핵산 분자, 및 선택적으로 관심 단백질을 인코딩하는 추가의 핵산 분자를 포함하는 조작된 세포들)을 투여함으로써, 적어도 하나의 증상을 개선하는 것을 포함한다.　특히 예상되는 미생물성 또는 바이러스성 감염 질병들은 위에 열거된 병원체들에 의해 유발되는 질병들이다.

의약으로서의 사용을 위해 제공되는 상기 세포들은 동종이계 요법에서 사용하기 위해 제공될 수 있고,　즉, 동종이계 ACT가 치료 옵션으로서 고려되는 치료에 사용하기 위해 제공된다(여기서, 다른 대상으로부터의 세포들이 이를 필요로 하는 대상에게 제공됨).　특정 구체예들에 따르면, 동종이계 요법에서, 상기 RNA 간섭 분자들 중 적어도 하나는 TCR을 지향(가장 구체적으로는, TCR 복합체의 서브유닛을 지향)할 것이다.　대안적 구체예들에 따르면, 상기 세포들은 자가 요법, 특히 자가 ACT 요법(즉, 환자로부터 수득된 세포들을 사용)에 사용하기 위해 제공된다.

본 발명에 따른 세포들 및 방법들에 대한 특정 구체예들, 특정 구성들 및 물질들 및/또는 분자들이 본 명세서에서 논의되었지만, 본 발명의 범위 및 기술사상을 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에 있어서 다양한 변경 또는 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 중요하게는, 다양한 벡터 구체예들에서 논의된 바와 같은 벡터들의 변이들은 본 발명의 조작된 세포들에도 적용되고(벡터들이 그러한 세포들에서의 발현에 적합하기 때문), 그 반대도 마찬가지이다: 상기 세포들의 다양한 구체예들은 전형적으로 상기 세포들 내에서 인코딩된 상기 벡터들에 연결된다.　하기의 실시예들은 특정 구체예들을 더 잘 설명하기 위해 제공되고, 이들 실시예들은 적용을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 출원은 청구범위에 의해서만 제한된다.　

실시예들

실시예 1. 다중화의 최적화

드로샤 복합체에 의한, 전사된 RNA로부터의 miRNA의 효율적인 처리는 효율적인 표적 녹다운을 위한 핵심이다.　본 발명자들의 이전 데이터는 miRNA 기반 shRNA들이 CAR-인코딩 벡터와 효율적으로 공동 발현되고, 상기 벡터로부터 miRNA 시스템에 의해 처리될 수 있음을 보여주었다.　상기한 동일한 벡터로부터 다중 miRNA 기반 shRNA들(예로서, 2, 4, 6, 8개 ...)을 공동 발현할 수 있는 CAR 발현 벡터를 생성하는 것이 더 바람직할 것이다(도 2).　그러나, 이전 연구들에서는 다중 miRNA 기반 shRNA들의 공동 발현이 shRNA 활성의 손실을 초래한다는 것을 보여주었다.　따라서, 단일 발현 벡터로부터 다중 표적들을 녹다운하기 위해서는 효율적인 miRNA 처리가 중요하다.

최적의 다중화를 달성하고 재조합을 피하기 위해서는, 단일 miRNA 스캐폴드를 다중화하기 보다는 자연 발생 miRNA 클러스터들에서 시작하는 것이 최선일 수 있다고 가정하였다.　자연적으로 발생하는 miRNA 클러스들은 존재하는 스캐폴드들의 크기와 수가 서로 상당히 다르다.　목표는 벡터들을 클로닝하기 위해 다중화된 miRNA 스캐폴드들을 사용하는 것이므로, 스캐폴드들의 수에 대한 크기의 비율이 유망한 클러스터들을 식별하는 것을 고려하였다.　식별된 클러스터들 중 13개가 표 1에 나열되어 있다.

표 1. 명칭, 염색체 위치, 크기, 코딩 또는 비-코딩 서열들 내의 위치, 및 가닥 배향이 표시된 마이크로-RNA 클러스터들의 확인. N은 해당 클러스터 내에 존재하는 마이크로RNA 스캐폴드들의 수를 나타낸다; 크기/N은 해당 두 컬럼들의 나눈 값으로서, 해당 클러스터 내에 배치된 서열들(링커들 + 기타)을 갖는 miRNA 스캐폴드의 평균 크기의 표시를 나타낸다. 밝은 회색 음영: T 세포들 내에서의 높은 발현.

상기한 클러스터들 중 2개(진한 회색 음영, 표 1)는 크기가 얼마나 다양할 수 있는지를 보여주기 위해 예시적 목적으로 포함된다.　이들 클러스터들은 85000bp 이상이며, 클로닝하기에 너무 커서 즉시 제외될 수 있다.　가장 유망한 클러스터들은 클러스터들 내에 존재하는 miRNA들의 크기와 수(표 1의 N)에 근거하여 선택되었다.　전체 크기만을 평가하는 대신에, miRNA 스캐폴드 수로 나눈 크기를 평가하여, 평균 miRNA 스캐폴드 + 링커 서열들에 대한 아이디어를 얻었다.　첫 번째 컷오프로서 크기/N이 250보다 작은 클러스터들이 선택되었다.　이를 통해 충분한 클러스터들을 수득하고 조작된 면역 세포들에서 벡터들을 발현시키는 것이 목표였기 때문에, T 세포들과 같은 면역 세포들에서 고도로 발현되는 클러스터들에 집중하기로 결정하였다.　이에 의해, 4개의 클러스터들(밝은 회색 음영,　표 1)을 우선순위로 하였고, 이들은 모두 면역 세포들 내에서 고도로 발현되며, 총 크기는 1000bp 미만이다.　더욱이, 그들은 모두 적어도 3개의 miRNA 스캐폴드들을 포함하고(N이 적어도 3인 클러스터들은 2개 초과의 miRNA들의 다중화를 허용할 것으로 예상됨), 스캐폴드 당 평균 크기가 200bp 미만이어서 클로닝에 매우 적합하였다(표 1 참조): miR17-92 클러스터, miR106a-363 클러스터, miR106b-25 클러스터(3개의 유사한 마이크로RNA 클러스터들) 및 miR23a~27a~24-2 클러스터.

1.1 다중화에 적합한 miRNA 클러스터의 선택

상기한 4개의 miRNA 클러스터들이 shRNA들의 다중 발현에 적합한지 여부를 평가하기 위해, 선택된 클러스터들 내에 도입된 2세대 CD19-지향 CAR, 절단된 CD34 선택 마커 및 서로 다른 shRNA들을 인코딩하는 레트로바이러스 벡터들을 사용하여 건강한 공여자로부터의 일차 T 세포들을 형질도입하기로 결정하였다. 동일한 수의 shRNA들 및 클러스터의 절단 효과를 비교하기 위해, miR17-92 클러스터 및 miR106a-363 클러스터의 단편들도 사용하였다.　상기 단편들은 상기 클러스터의 3개 또는 4개의 연속적인 miRNA 스캐폴드들이었으며, 다른 두 클러스터들에 존재하는 3개의 miRNA 스캐폴드들과 비교될 수 있었다.　이러한 벡터들의 도식적 설계는 도 2에 도시되어 있다.

CD247, B2M 및 CD52를 표적화하는, 3개의 동일한 shRNA 표적 서열들이 비교를 위해 사용되었다. 4개의 miRNA 스캐폴드들이 사용된 경우, TRAC가 추가적으로 표적화되었다. 6개의 miRNA 스캐폴드들에 대해, 다른 표적 서열들을 이용하여 3개의 표적들이 두번 표적화되었다. 대조군으로서, 반복된 합성 shRNA 스캐폴드인 miR196a2 스캐폴드가 사용되었고, 이는 다중화된 녹다운에 적합할 뿐 아니라 단일 shRNA에 대해서도 우수한 것으로 이미 알려졌다(WO2020/221939). 이 대조군은 3개 및 4개 shRNA들과 함께 사용되었다.

구축물들의 상이한 크기에도 불구하고, 벡터 역가들은 존재하는 shRNA들의 양에 의해 단지 약간만 영향을 받았다(데이터는 나타내지 않음).　그러나, 모든 그룹에서 천연 miRNA 클러스터들로부터의 상이한 스캐폴드들을 사용함으로써, 도 3에 도시된 바와 같이, 반복된 동일한 스캐폴드들(여기서는, miR-196a2 스캐폴드)에 비해 형질도입 효율이 증가한다.

형질도입에서 수확까지의 T 세포 배수 증가는 구축물들 간에(클러스터된 스캐폴드들 사이 및 클러스터된 스캐폴드들과 상기 반복된 단일 스캐폴드들 사이에도) 유의하게 다르지 않았다.　그러나, 녹다운 효율은 구축물들 간에 차이가 있었다.　모든 클러스터들이 어느 정도 녹다운을 달성했지만, 클러스터된 스캐폴드들 간에는 분명한 차이가 있었는데, miR-106a-363 클러스터로부터의 스캐폴드들이 가장 일관되고 최상의 녹다운을 달성한 반면, miR23a~27a~24-2 클러스터의 스캐폴드들은 가장 효과적이지 않았다.　도 4에서, shRNA가 없는 대조군, 또는 miR23a~27a~24-2 클러스터된 스캐폴드 또는 miR106a-363 클러스터된 스캐폴드 또는 이의 단편 내에 shRNA가 있는 대조군의 TCR 발현을 비교하는 예를 보여준다.　전체 스캐폴드에서 관찰된 증가된 녹다운은 CD247이 이 구축물에서 두 번 표적화된다는 사실로 설명할 수 있다.　이러한 실험의 결과로, miR-106a-363 클러스터의 스캐폴드들이 추가 평가를 위해 선택되었다.

실시예 2. miR-106a-363 클러스터의 스캐폴드를 이용한 다중화

최대 6개까지의 shRNA들을 다중화하는 가능성을 형질도입하기 어려운 1차 면역 세포들에서 평가하였다.　이를 평가하기 위해, 1차 T 세포들은 miR-106a-363 클러스터에 도입된 CD247, β2m 및 CD52를 표적으로 하는 3 × shRNA들 또는 6 × shRNA들을 포함하는 2세대 CD19 CAR을 인코딩하는 레트로바이러스 벡터들로 형질도입되었다. 상기　벡터의 디자인은 도 5에 도시되어 있다.

간단히 설명하면, 건강한 공여자의 1차 T 세포들은, 106a-363miRNA 클러스터의 마지막 3개의 miR들(miR-19b2, miR-92a2 및 miR-363), 또는 상기 클러스터의 6개 miR 스캐폴드들 내의 동일한 3개 유전자들을 표적으로 하는 6개의 shRNA들(이 경우, CD247을 표적으로 하는 2개의 shRNA들은 서로 다름) 내에 도입된, CD247, B2M 및 CD52를 표적으로 하는 3개의 shRNA들과 함께 2세대 CD19-지향 CAR, 절단된 CD34 선택 마커를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터들을 이용하여 형질도입되었다.　간단하게는, shRNA들은 대조군으로서 6중체, 3중체 또는 shRNA 없는 것(tCD34)으로 발현되었다.　형질도입 2일 후, 세포들을 CD34-특이적 자기 비드를 사용하여 농축하고, 6일 동안 IL-2(100 IU/mL) 내에서 추가로 증폭시켰다.　CD247, B2M 및 CD52의 mRNA 발현은 항존 유전자로서 사이클로필린을 사용하여 qRT-PCR에 의해 평가되었다.

결과를 도 6에 나타내었다. 다중화된 shRNA들은 모든 표적 유전자들에 대해 효율적인 RNA 녹다운 수준을 산출하였다.　6개의 다중화된 shRNA들(각각의 단백질 표적에 대한 2개의 shRNA들)의 통합은 3개의 다중화된 shRNA들(각각의 단백질 표적에 대한 하나의 shRNA)에 비해 더 높은 RNA 녹다운 수준을 나타내었다(도 6).

실시예 3. miR-106a-363 클러스터의 개별 스캐폴드의 최적화

초기 데이터가 이미 유망하고, miR-106a-363 클러스터의 스캐폴드들이 사용될 때 다중화가 달성될 수 있음을 보여주었지만, 개별 스캐폴드들이 선택된 표적의 녹다운을 개선하기 위해 변형될 수 있는지 여부를 확인하기 위해 추가 연구들이 수행되었다.　천연 스캐폴드가 이미 녹다운을 수용하기 위해 진화적 선택 압력을 받고 있기 때문에(하부 및 상부 줄기 영역들이 진화에 의해 적어도 부분적으로 최적화되었음을 의미함), 먼저 표적 하향조절을 향상시키기 위해, 아직 최적화되지 않은 다양한 표적 서열들을 평가하기로 결정하였다. 먼저, 동일한 표적 단백질들이 선택되었다.

각각의 miRNA/shRNA의 처리능력(processivity)은 상기 클러스터 내의 다른 것들의 처리능력에 의존하고 영향을 받을 수 있다고 기존에 보고되었으므로(Bofill-De Ros and Gu, 2016), 전체 클러스터의 일부로서 상이한 표적 서열들을 가지지만 (표적 하향 조절에 영향을 미치지 않기 위해) 다른 스캐폴드 서열들에는 관련 없는 서열들을 갖는 스캐폴드들을 테스트하기로 결정하였다.

miR-20b 스캐폴드에서의 CD247의 하향조절에 대한 결과를 도 7에 나타내었다. 초기 스캐폴드 서열은 이미 약 50% 하향조절을 초래하였다.　테스트한 다른 모든 표적 서열들도 표적을 성공적으로 녹다운시켰지만, 일부는 50% 이상의 녹다운을 달성하였다.　즉, 표적 서열을 선택함으로써 최대한 효과적인 녹다운을 달성할 수 있으므로, miR-20b 스캐폴드의 추가 조작은 필요하지 않았다.

B2M 표적에 대해 상이한 서열들을 사용하여 miR-106a 스캐폴드 서열에 대해 유사한 결과를 얻었다(데이터는 나타내지 않음).　효과가 특정 표적 서열 - 스캐폴드 조합과 관련되는 것을 배제하기 위해, B2M 표적 서열들도 miR-20b 스캐폴드에서 테스트되었다.　녹다운 효율의 측면에서 약간의 차이가 있었지만, miR-106a 스캐폴드에서 가장 높은 녹다운을 달성하는 3개의 표적 서열들도 miR-20b 스캐폴드에서 사용될 때 가장 높은 녹다운을 달성하였다.　이는, 효과적인 표적 서열이 식별되면, 스캐폴드 전반에 걸쳐 사용될 수 있음을 의미한다.

miR-18b 스캐폴드의 경우, CD95에 대한 shRNA의 최적화가 착수되었다.　그러나, 31개의 표적 서열들을 테스트한 후 달성된 최상의 녹다운은 약 30%였다(도 8 참조).　이 녹다운은 무시할 수 없지만, 다른 스캐폴드들에 대해 일관되게 얻은 75% 이상의 녹다운보다 훨씬 덜 효과적이다.　miR-18b 스캐폴드를 miR-106a 또는 miR-20b의 스캐폴드와 비교하면(도 9), 이 스캐폴드는 표적 서열/상부 줄기 영역에서 더 많은 불일치(3 대 1) 및 상부 줄기의 말단 근처에 돌출을 포함하고 있음이 분명하다. 다른 스캐폴드 서열들에 의해 높은 녹다운이 달성되기 때문에, 불일치 수의 감소 및/또는 돌출의 제거는 녹다운 효율성을 잠재적으로 향상시킬 수 있다고 가정하였다.

평가된 5개의 상이한 구축물들을 도 10a에 나타내었고, 그 결과를 도 10b에 나타내었다.　놀랍게도, 단지 하나의 불일치 또는 돌출을 삭제함으로써 녹다운 효율성이 획기적으로 향상된다.　miR-106a 또는 miR-20b 스캐폴드에서도 발생하는 하나의 불일치만 유지하면, 동일한 표적 서열에 대해 녹다운 효율이 약 30%에서 60% 이상으로 증가한다.　따라서, miR-18b 스캐폴드 서열을 그대로 사용할 수 있지만, 불일치 또는 돌출의 수를 줄임으로써 녹다운 효율을 크게 증가시킬 수 있다. 추가의 실시예들을 위해, 15-16 위치의 돌출 및 20과 25 위치의 불일치가 제거된 반면 29 위치의 불일치는 유지된 구축물 28.5가 사용된다. 주목할 점은, 표적 서열이 일치될 필요가 있기 때문에, 상기 불일치들의 제거는 패신저 서열을 조정함으로써 수행되는 것이다.

실시예 4. 표적 서열 길이의 평가

miR-106a-363 클러스터에서 발견되는 천연 표적 서열은 일반적으로 상당히 길다(22-23bp).　이들이 단축될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 상이한 길이의 표적 서열들(하나는 CD247를 지향하고, 하나는 B2M을 지향함)을 상기 스캐폴드에 삽입하고, 녹다운 효율을 평가하였다.　상기 서열의 단축은 상기 표적 서열의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드를 천연 스캐폴드에서 발견되는 뉴클레오티드로 대체함으로써 수행되었다.　miR-106a 스캐폴드에 대한 결과는 도 11에 나타내었다. 18bp까지의 짧은 서열들이 최대 길이와 마찬가지로 잘 작동하고, 심지어 더 좋을 수도 있음을 알 수 있다.　miR-20b 스캐폴드(도시되지 않음)에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다.　대부분의 실험들에서, (도 9에 나타낸 바와 같은) 20bp의 표적 서열로 작업하기로 결정하였다.

실시예 5. 클러스터 컨텍스트 외부의 개별 스캐폴드들의 조합의 평가

miRNA 클러스터들에서, 많은 측면 서열 결정인자들 및 다른 클러스터들의 존재가 하향조절을 달성하는 데 중요한 것으로 여겨진다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다.　그러나, 본 발명자들에 의한 초기 실험들은 이것이 항상 그런 것은 아님을 보여주었다.　

실제로, 2개의 공동 발현된 shRNA들의 활성을 최적화하기 위해, 본 발명자들은 크기뿐만 아니라 2개의 miRNA-기반 shRNA들 사이의 링커의 서열과 상기 miRNA 스캐폴드가 shRNA 활성에 영향을 미칠 것이라고 이미 가정하였다.　shRNA 처리를 최적화하기 위해, 본 발명자들은 CD247(CD3ζ) 및 CD52의 두 표적 유전자들의 녹다운에 대한 상이한 shRNA 링커들의 영향을 평가하였다.　다른 구축물들에 비해 TCR에 대해(CD52에 대해서는 아님) 약간 더 낮은 녹다운 활성을 나타낸, 헤어핀들 사이에 스페이서가 없는 구축물을 제외하고, 0 내지 92bp의 링커들이 사용되었고, 상기 링커는 녹다운 효능에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.　중요하게도, 링커가 없는 구축물도 두 shRNA들에 대한 발현을 감소시키는 데 여전히 매우 잘 작동하였다(데이터는 표시되지 않음).　이러한 실험들은 miR-196a2 스캐폴드로 수행되었지만, 초기 실험들에서는 miR-106a-363 클러스터의 링커들도 상당히 감소될 수 있음을 나타내었다.

개별 스캐폴드들의 처리능력 및 활성이 클러스터에 있는 다른 스캐폴드의 존재에 의해 영향을 받는지 여부를 평가하기 위해, 다른 순열로 상기 스캐폴드들을 테스트하기로 결정하였다.　이를 위해, (상기 클러스터 내에서 이웃 스캐폴드들의 영향을 제거하기 위해) 비연속 스캐폴드들을 선택하였다: miR-106a 및 miR-20b.　또한, 상기 클러스터 내의 6개의 miRNA 스캐폴드들을 모두 사용하는 대신에, 이중체들 및 삼중체들을 생성하였다(실시예 2와 반대).　클러스터 컨텍스트 효과가 있었는지 여부를 평가하기 위해, miR-106a - miR-18b - miR-20b 삼중체도 생성되었으며, 이는 miR-106a~363 클러스터의 처음 3개의 스캐폴드들에 해당한다. 이중체들의 경우, 표적화된 유전자들은 B2M 및 CD247이었다.　삼중체들의 경우, CD95가 추가되었다.

요약하면, 하기의 구축물들이 제조되었다:

이중체들:

miR-106a(B2Mㅇ 표적화) - miR-20b(CD247 표적화)

miR-20b(CD247 표적화) - miR-106a(B2M 표적화)

miR-20b(B2M 표적화) - miR-20b(CD247 표적화)

miR-106a(B2M 표적화) - miR-106a(CD247 표적화)

삼중체들:

miR-20b(B2M 표적화) - miR-20b(CD95 표적화) - miR-20b(CD247 표적화)

miR-106a(B2M 표적화) - miR-106a(CD95 표적화) - miR-106a(CD247 표적화)

miR-106a(B2M 표적화) - miR-18b(CD95 표적화) - miR-20b(CD247 표적화)

결과들을 도 12a 내지 도 12c에 나타내었다. 도 12에 도시된 바와 같이, 평가된 모든 이중체들은 CD247 및 B2M 둘 모두를 하향조절하는데 매우 효율적이었다.　특히, CD247 녹다운은 매우 효율적인 것으로 판명되어, CD3Z는 거의 검출할 수 없는 수준으로 되었다.　B2M이 훨씬 더 풍부하기 때문에 녹다운이 완료될 것으로 예상되지 않았으나, 일관되게 B2M 수준이 80% 이상 감소되는 결과가 달성되었다.　놀랍게도, 하향 조절 수준은 이중체에서의 스캐폴드들의 순서에 관계없이 동일하다.

동일한 shRNA들을 다중화할 때, 재조합이 문제가 되어 훨씬 더 낮은 발현 및 궁극적으로 더 낮은 녹다운 수준을 초래한다는 것이 잘 알려져 있다.　이것이 바로 상이한 스캐폴드들의 조합을 평가하는 이유였다.　그럼에도 불구하고, 2개 및 3개의 동일한 스캐폴드들을 테스트하여 이것이 실제로 가능한지를 확인하였다.　동일한 스캐폴드들을 가진 모든 이중체들 및 miR-20b 삼중체 스캐폴드는 다른 스캐폴드들을 가진 이중체 또는 삼중체에 필적하는 형질도입 수준을 달성했으며, 모두 15% 이상이었다.　그러나, miR-106a 삼중 스캐폴드는 매우 낮은 형질도입 수준(2% 미만)을 나타내었으며, 더 이상 평가되지 않았다.　miR-20b 스캐폴드들의 이중체들은 동일하지 않은 스캐폴드들을 갖는 이중체들과 동일한 수준의 표적들에 대한 녹다운을 달성하였다(도 12a 및 도 12b).　miR-106a 스캐폴드의 이중체들은 CD3Z에 대해 동일한 하향 조절을 달성했지만, B2M 녹다운에서는 그 수준이 약 50%까지 감소하였으나, 약간 덜 효과적이었고, 이는 이러한 스캐폴드들은 복제될 수 있고 여전히 높은 녹다운을 달성할 수 있음을 나타낸다(도 12c).　놀랍게도, miR-20b 삼중체 스캐폴드는 세 가지 다른 스캐폴드들을 갖는 삼중체에 필적하는 녹다운 수준을 달성했지만, 세 가지 다른 스캐폴드들을 사용하면 각각의 표적 유전자에 대해 약간 더 나은 녹다운이 수득되어, 일부 효능 손실이 있음을 나타낸다(도 12a 및 도 12b).　3개의 서로 다른 miRNA 스캐폴드들을 갖는 삼중체 스캐폴드는 이중체들과 동일한 표적 하향조절을 달성한다.　또한, CD95는 50% 이상 하향 조절되고(도 12b 및 도 12c), 이는 클러스터 셋팅에 사용되는 경우 해당 표적에 대한 상기 결과들과 유사하다.

이러한 실험들은 상기 스캐폴드들이 클러스터의 컨텍스트 외부에서 독립적으로 매우 잘 사용될 수 있음을 보여준다.　상기 스캐폴드들의 순서는 원하는 녹다운을 달성하는 데 중요하지 않은 것으로 보이며, 상기 클러스터의 모든 스캐폴드들이 녹다운을 달성하기 위해 존재할 필요는 없다.　실제로, 단일 스캐폴드로 충분하며, 활성 손실 없이 클로닝될 수 있다.　miR-20b를 삼중체로 사용할 수 있는 것으로 나타났지만, 다른 스캐폴드들을 사용하는 것보다 효율성이 약간 떨어지는 것 같다.　그러나, miR-106a-363 클러스터 내의 6개의 서로 다른 스캐폴드 서열들이 있고, 효과 손실 없이 클로닝될 수 있다는 점을 고려하면, 최대 12개의 표적들의 다중 하향 조절이 원칙적으로 가능하다.

실시예 6. 키메라 지지체 제작을 통한 개별 지지체의 최적화

개별 스캐폴드들의 불일치 또는 돌출을 제거하는 것(실시예 3 참조)의 대안으로서, 불일치 및/또는 돌출(예로서, miR-18b)들이 있는 개별 스캐폴드들의 녹다운 효율은, 단지 해당 스캐폴드를 돌연변이시키는 것뿐 아니라 불일치를 제거하고, 상부 줄기/루프 영역을 녹다운 효율이 높은 스캐폴드의 해당 영역으로 치환함으로써 개선될 수도 있다고 합리적으로 추론되었다. 실제로, miR-106a 스캐폴드 또는 miR-20b 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역을 사용하여 miR-18b 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역을 치환하면, 선택된 표적의 녹다운 효율이 크게 증가하였다(데이터는 표시되지 않음). 3개의 miR-17 파라로그 클러스터들 내에 보존된 여러 개의 스캐폴드들이 있으므로, 다른 스캐폴드 서열들에 대해서도 이를 평가하기로 결정하였다. 결과는, 실제로 miR-106a, mir-20b 또는 miR-17 스캐폴드와 유사한 불일치 및 돌출이 거의 없는 스캐폴드들이 실제로 사용될 수 있음을 보여주었다. 즉, miR-17 계열 유래의 스캐폴드(miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드)의 상부 줄기/루프 영역은 miR106a-363, miR17-92, 또는 miR106b-25 클러스터 내의 스캐폴드의 하부 줄기에 융합되어 녹다운 효율을 유지하거나 증가시킬 수 있다. 예로서, 도 13은 녹다운 효능에 대한 상기 스캐폴드들에서의 변화 효과를 보여준다. 이를 위해, 다음의 4개의상이한 구축물들이 테스트되었다: shRNA가 없는 CAR T만 포함하는 음성 대조군 및 shRNA가 있는 3개의 CAR T 세포들: miR-106a 스캐폴드(B2M 표적화)와 miR-20b 스캐폴드(CD247 표적화)를 갖는 하나의 2중체, miR-106a 스캐폴드(B2M 표적화) - miR-18b 스캐폴드(CD95 표적화) - miR-20b 스캐폴드(CD247 표적화)를 갖는 3중체, 여기서 miR-18의 루프 영역은 변경됨(실시예 3 참조), 및 miR-106a 스캐폴드(B2M 표적화) - miR-18b 스캐폴드(CD95 표적화) - miR-20b 스캐폴드(CD247 표적화)를 갖는 3중체, 여기서 스캐폴드 miR-18b의 상부 줄기/루프 영역은 miR-17 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역으로 치환됨. 도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, HLA-I 및 TCR의 녹다운은 3가지 구축물 모두에서 달성되고, CD95의 녹다운은 3중체 구축물들에서 달성된다. 그러나, 상기 키메라 스캐폴드 구축물은 CD95에 대해 더 높은 수준의 녹다운을 달성하였다. 동시에, CD95를 표적으로 하는 스캐폴드에서의 변화는 HLA-I의 발현의 변화도 유도하는 반면(도 13, 왼쪽 패널), 스캐폴드와 표적 서열은 모두 변경되지 않은 채로 유지되고, 이로써 상기 클러스터의 마이크로프로세싱에서의 변화들을 보여줌을 나타낸다.

이를 더 최적화하기 위해, 후자의 구축물의 스캐폴드 서열들을 유지함으로써 마이크로프로세싱을 일정하게 유지하기로 결정하였다(즉, miR-106a 스캐폴드(B2M 표적화) - miR-18b 스캐폴드(CD95 표적화) - miR-20b 스캐폴드(CD247 표적화), 여기서 스캐폴드 miR-18b의 상부 줄기/루프 영역은 miR-17 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역으로 치환되었다). 상기 마이크로프로세싱이 표적 서열에 의존하지 않는 것을 확인하기 위해, B2M에 대한 다양한 표적 서열들을 평가하였다. 결과는 도 14에 나타낸다. 3중체 스캐폴드에 있는 4개의 상이한 B2M 표적 서열들을 miR-106a 스캐폴드(B2M 표적화)와 miR-20b 스캐폴드(CD247 표적화)를 갖는 2중체 및 shRNA가 없는 CAR T 세포들을 함유하는 음성 대조군에 대해 테스트하였다. 모든 3중체 구축물들은 3가지 표적 모두에 대해 우수한 녹다운을 달성하였다(도 14a, 도 14b). HLA-I 발현은 상이한 표적 서열들로 인해 약간의 가변성을 나타내지만, 다른 두 표적들의 녹다운은 일정하게 유지되었다. 테스트된 4개 서열들 모두 최소 50%의 녹다운을 달성하는 동시에 TCR 녹다운을 유지하면서 추가로 CD95의 높은 녹다운을 달성하였다.

상기 서열의 녹다운이 또한 기능적 결과를 산출하는지 여부를 확인하기 위해, 3중체 스캐폴드로 추가로 형질도입된 BCMA CAR T 세포들을 사용하여 다양한 기능적 분석을 수행하였다. 결과는 도 15에 나타낸다. 입양 T 세포에서 B2M을 표적화함으로써 HLA-I은 하향조절되어야 하며, 이에 따라 T 세포 동종인식을 억제하고, 숙주 대 이식편 반응을 예방해야 한다. 그러나, HLA가 완전히 고갈되면, 세포들은 NK 매개성 세포 사멸의 먹이가 되며, 이것이 유전자 편집 세포 치료법이 일반적으로 HLA-E의 공동 발현을 요구하는 이유이다. 이와 관련하여, 본 발명자들은, HLA-I이 하향조절되지만 NK 매개성 세포용해에 의해 세포들이 완전히 제거되는 정도는 아니기 때문에, B2M의 녹다운은 유익한 것으로 입증될 것이라고 가정하였다. 도 15a에 도시된 바와 같이, 세포들이 NK 세포들과 공동배양되었을 때, 3중체 shRNA 스캐폴드에서 달성된 B2M의 하향조절은 NK 매개성 사멸로부터 BCMA CAR T 세포를 보호한다. 비교로서, Crispr/Cas9를 포함하는 B2M 녹아웃을 갖는 BCMA CAR-T를 사용하였는데, 동종 이계 NK 세포들에 의해 완전히 용해되었다. 중요하게도, 도 15b에 도시된 바와 같이, B2M에 대한 shRNA는 B2M 녹아웃과 유사하게 T 세포 동종인식을 억제하여, shRNA가 없는 CAR의 경우에 50%의 세포가 생존한 것에 비해 80%의 세포가 생존한다. 마지막으로, CD95(Fas 수용체)에 대한 shRNA의 효과를 테스트하기 위해, 세포들을 100ng/ml Fas 리간드와 함께 배양하였다. 도 15c에서 볼 수 있듯이, CD95에 대한 shRNA(3중체 스캐폴드 내)는 FasL 매개성 세포사멸을 방지한다.

이러한 결과들은 키메라 스캐폴드가 클러스터에 포함될 때 shRNA가 성공적으로 다중화될 수 있음을 보여준다.

실시예 7. 키메라 클러스터를 만들어 클러스터의 최적화

miR-17 계열 스캐폴드의 상부 줄기 영역 및 루프 영역은 miR-106a-363 클러스터의 녹다운 효율을 최적화하는 데 유익한 것으로 입증되었으므로, miR-17 계열의 스캐폴드들만을 사용하여 다중 클러스터를 생성할 수 있는지 여부를 평가하였다. 이를 위해, 3개의 상이한 miR17-92 파라로그 클러스터들로부터 유래된 4개의 shRNA 스캐폴드들을 포함하는 4중체 shRNA 클러스터가 설계되었다: miR-106a-363 클러스터 유래의 miR-106a 및 miR-20b; miR-106b-25 클러스터 유래의 miR-93 및 miR-17-92 클러스터 유래의 miR-20a. 표적 유전자들은 miR-106a의 B2M, (상기한 바와 같은) miR-20b의 CD3 zeta, miR-93의 MICA(NKG2D 리간드) 및 miR-20a의 CD28이었다. 상기 구축물의 도식적 묘사가 도 16a에 제시되어 있다. 본 발명자들은 야생형/천연적 측면 서열들을 링커로 사용하였고(실시예 5 참조), 변경된 마이크로프로세싱의 위험을 최소화하기 위해 상기 스캐폴드들 사이에 추가 제한 부위가 삽입되지 않았다. 녹다운은 shRNA가 없는 음성 대조군과 동일한 miR-106a 스캐폴드(B2M 표적화) 및 miR-20b 스캐폴드(CD247 표적화)의 이중체와 비교되었다. 도 16b의 왼쪽 패널 및 오른쪽 패널에 도시된 바와 같이, TCR 및 HLA 클래스 I의 녹다운은 이중체 구축물 및 사중체 구축물에서 유사하다. 또한, 상기 사중체는 CD28의 발현을 녹다운하고(도 16b, 중간 패널), MICA의 발현을 녹다운(도 16c)하는데 성공하였다. 따라서, 상기 스캐폴드들의 컨텍스트(및 프로세싱)가 야생형 클러스터에 비해 변경되었지만, 다중 녹다운을 달성하기 위해 miR-17 계열 스캐폴드들을 조합할 수 있다는 것은 분명하다. 더욱이, 이는 달성된 높은 수준의 녹다운에 의해 입증된 바와 같이, 재조합없이 이루어진다.

이를 더욱 확증하기 위해, 추가의 스캐폴드를 추가하기로 결정하였다. 도 16a에 도시된 4중체 스캐폴드에 miR-17 스캐폴드를 추가함으로써 5중체 스캐폴드를 생성하였다. 이 스캐폴드의 표적 서열은 CD95였다.

상기 5중체 스캐폴드는 다음의 2개의 다른 5중체 스캐폴드들과 비교되었다: 하나는 표적 서열은 동일하게 유지되었지만 위치 효과를 평가하기 위해 2개(MICA 및 CD28)가 스캐폴드에서 교환되었고, 다른 하나는 관련없는 다른 스캐폴드에 대해 최적화된 다른 B2M 및 CD3 제타 서열이 사용되었다. 관련없는 스캐폴드들에 대한 마이크로프로세싱은 다를 수 있으므로, 최적화되지 않은 서열을 사용하는 것이 유효한 전략인지의 여부를 확인하고 싶었다.

5중체 1: miR-106a(최적화되지 않은 서열로 B2M 표적화) - miR-20b(최적화되지 않은 서열로 CD247 표적화) - miR-93b(CD28 표적화) - miR-20a(MICA 표적화) - miR-17(CD95 표적화)

5중체 2: miR-106a(B2M 표적화) - miR-20b(CD247 표적화) - miR-93b(CD28 표적화) - miR-20a(MICA 표적화) - miR-17(CD95 표적화)

5중체 3: miR-106a(B2M 표적화) - miR-20b(CD247 표적화) - miR-93b(MICA 표적화) - miR-20a(CD28 표적화) - miR-17(CD95 표적화)

결과는 도 17에 도시된다. 5중체 2 및 3은 5개 표적 유전자 모두의 녹다운을 달성하고(도 17a 및 도 17b), 이는 클러스터의 녹다운 또는 마이크로프로세싱에 영향을 주지 않고 관련 스캐폴드들 내에서 표적 서열들이 스위칭될 수 있음을 나타낸다. 그러나, 이는 관련 스캐폴드들에 최적화된 표적 서열들에만 해당되는 것으로 보인다. TCR의 녹다운은 5중체 1에서 덜 효율적이며, HLA-I의 녹다운은 거의 존재하지 않는다. 더욱이, 비록 이들 4개 표적들에 대해 사용된 스캐폴드들 및 서열들이 5중체 2 및 3의 것과 동일하더라도, CD95 및 CD28의 녹다운도 덜 효율적으로 나타나고(도 17a), MICA의 녹다운은 성공적이지 않다(도 17b). 이는, 다중 서열들의 녹다운에 영향을 미치는 마이크로프로세싱에서의 변화를 시사한다(도 13 참조). 따라서, miR-17 계열 클러스터의 스캐폴드에서 작동하는 서열은 다중 설정(multiplex setting)에서도 miR-17 계열 유래의 다른 스캐폴드들에서 사용될 수 있다. 그러나, 다른 스캐폴드들에서 사용할 수 있는 서열들은 miR-17 계열 클러스터에서 자동적으로 사용될 수는 없다.

실시예 8. 키메라 클러스터들과 키메라 스캐폴드들의 조합에 의한 클러스터의 최적화

실시예 6 및 실시예 7에 나타난 바와 같이, 최적의 다중화 결과는, 최적이 아닌(suboptimal) 스캐폴드들을 miR-17 계열 상부 줄기/루프 영역과 함께 키메라로 만들거나(실시예 6), 다른 miR-17-92 파라로그 클러스터들 유래의 여러 miR-17 계열 스캐폴드들을 조합(실시예 7)함으로써, 상기 최적이 아닌 스캐폴드들을 변형시킬 때 달성된다. 다음으로, 상기 두 가지 전략을 결합하여 훨씬 더 높은 다중화를 달성할 수 있는지 여부를 평가하였다.

먼저, 5중체 키메라 구축물이 다음과 같이 설계되었다:

miR-106a(B2M 표적화) - 최적화된 miR-18b(CD95 표적화) - miR-20b(CD247 표적화) - miR-93b(MICA 표적화) - miR-17 유래의 상부 줄기/루프 영역을 갖는 키메라 miR-92a2(CD28 표적화). 도 18a의 구조 참조.

본질적으로, 상기 구축물은 miR-92a2(miR-106a-363 클러스터 유래의 스캐폴드) 유래의 하부 줄기 및 miR-17 유래의 상부 줄기 및 루프를 갖는 추가의 키메라 스캐폴드와 함께 miR-93b 스캐폴드에 융합된(실시예 7에서 수행된 바와 같음) 실시예 6에 기재된 3중체 구축물이다.

상기 5중체 구축물을 3중체 구축물(miR-106a(B2M 표적화) - 최적화된 miR-18b(CD95 표적화) - miR-20b(CD247 표적화)로만 구성됨)과 비교했을 때, 상기 5중체가 표적 유전자들의 녹다운을 달성하는 데 있어서 적어도 상기 3중체만큼 효율적이라는 것을 알 수 있다. 도 18b의 상단 및 중간 히스토그램은 하단의 대조군 히스토그램에 비해 뚜렷한 감소를 보여준다. 도 18c는 도 18b와 동일한 결과를 보여주되, 상대적 MFI로 도시된다. 상기 3중체는 3개의 표적 유전자들을 성공적으로 녹다운시키고, 상기 5중체는 5개의 유전자들을 모두 비슷한 정도로 하향 조절시킨다.

마지막으로, miR-363 하부 줄기 및 miR-20a 상부 줄기 및 루프를 갖는 추가의 키메라 스캐폴드를 추가하여 6중체 클러스터를 설계하였다.

상기 설계는 다음과 같다:

miR-106a(CD38 표적화) - 최적화된 miR-18b(CD95 표적화) - miR-20b(CD247 표적화) - miR-93b(B2M 표적화) - miR-17 유래의 상부 줄기/루프 영역을 갖는 키메라 miR-92a2(CD28 표적화) - miR-20a 유래의 상부 줄기/루프 영역을 갖는 키메라 miR-363(CD27 표적화).

B2M 표적화 서열은 인접하지 않은 다른 스캐폴드에서 테스트되었다. 도 19a에 도시된 바와 같이, shRNA가 없는 대조군과 비교하여 6개 유전자들 모두 녹다운되었다. 도 19b는 도 19a와 동일한 결과를 보여주되, 상대적 MFI로 도시된다. B2M을 제외한 모든 표적들은 50% 이상의 녹다운을 달성했는데, B2M은 아마도 아주 많이 존재함으로 인해 그 정도의 녹다운이 달성되지 않았을 것이다.

본 발명자들은, miR-17 계열 클러스터 유래의 miRNA 스캐폴드들을 사용할 경우 다중화된 녹다운이 일어나고, miR-17 계열 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역을 사용하여 키메라 스캐폴드를 만듦으로써; 그리고/또는 상이한 파라로그 클러스터들 유래의 miR-17 계열 스캐폴드들을 사용하여 키메라 클러스터를 만듦으로써 녹다운이 더 개선될 수 있음을 일관되게 보여주었다.

본 발명은 단지 예로서 주어진 본 명세서에 설명된 특정 세부사항들에 제한되지 않으며, 본 발명의 범위 내에서 다양한 수정 및 변경이 가능하다는 것이 인식될 것이다.

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Claims

조작된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 포함하는 핵산 분자로서, 상기 조작된 스캐폴드는 하부 줄기 영역 및 상부 줄기 영역/루프 영역을 포함하고, 상기 조작된 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 것이고, 상기 조작된 스캐폴드의 상부 줄기 영역/루프 영역의 적어도 일부는 야생형 서열과 상이하도록 조작된, 핵산 분자.
제1항에 있어서,
상기 조작된 스캐폴드의 상기 하부 줄기 영역은 miR-17 스캐폴드, miR-18a 스캐폴드, miR-19a 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-19b-l 스캐폴드, miR-92-1 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-18b 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-19b-2 스캐폴드, miR-92-2 스캐폴드, miR-363 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드, miR-25 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되는, 핵산 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조작된 스캐폴드는 키메라 스캐폴드이고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 상기 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되는, 핵산 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자인, 핵산 분자.
상이한 스캐폴드들을 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들을 포함하는 핵산 분자로서, 적어도 2개의 상이한 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역을 갖고;
- 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 키메라 스캐폴드를 가지며,
상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 상기 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고,
상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되고; 그리고/또는
- 상기 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들로부터의 상기 스캐폴드들은 상이한 miR-17 계열 클러스터들 유래의 miR-17 계열 스캐폴드인, 핵산 분자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 조작된 면역 세포에서의 발현에 적합한 벡터.
다음을 포함하는 조작된 세포:
o 관심 단백질을 인코딩하는 제1 외인성 핵산 분자, 및
o 조작된 스캐폴드를 갖는 적어도 하나의 RNA 간섭 분자를 포함하는 제2 핵산 분자로서, 상기 조작된 스캐폴드의 하부 줄기 영역은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 것이고, 상기 조작된 스캐폴드의 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 야생형 서열과 상이하도록 조작된 제2 핵산 분자.
다음을 포함하는 조작된 세포:
o 관심 단백질을 인코딩하는 제1 외인성 핵산 분자, 및
o 상이한 스캐폴드들을 갖는 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들을 포함하는 제2 핵산 분자로서, 적어도 2개의 상이한 스캐폴드들은 miR-17 계열 클러스터 유래의 miR 스캐폴드의 하부 줄기 영역을 가지고;
- 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 키메라 스캐폴드를 가지고, 상기 키메라 스캐폴드에서 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 하부 줄기 영역과 동일한 miR 스캐폴드로부터 유래되지 않고, 상기 상부 줄기/루프 영역의 적어도 일부는 miR-17 스캐폴드, miR-20a 스캐폴드, miR-106a 스캐폴드, miR-20b 스캐폴드, miR-106b 스캐폴드 및 miR-93 스캐폴드로부터 선택되고; 그리고/또는
- 상기 적어도 2개의 RNA 간섭 분자들로부터의 스캐폴드들은 상이한 miR-17 계열 클러스터들 유래의 miR-17 계열 스캐폴드인, 제2 핵산 분자.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 조작된 세포는 조작된 면역 세포인, 조작된 세포.
제9항에 있어서,
상기 조작된 면역 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 줄기 세포, 전구 세포 및 iPSC 세포로부터 선택되는, 조작된 세포.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 관심 단백질은 수용체, 특히 키메라 항원 수용체 또는 TCR인, 조작된 세포.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 RNA 간섭 분자는 하나의 프로모터의 제어 하에 있는 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들인, 조작된 세포.
제12항에 있어서,
상기 적어도 2개의 다중화된 RNA 간섭 분자들은 적어도 3개의 다중화된 RNA 간섭 분자들인, 조작된 세포.
의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제6항에 따른 벡터 또는 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포.
암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제6항에 따른 벡터 또는 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포.