WO2005092393A1 - Wt1遺伝子の発現を抑制するマイクロrnaおよびその利用 - Google Patents

Wt1遺伝子の発現を抑制するマイクロrnaおよびその利用 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a microRNA that suppresses the expression of the WT1 gene and use thereof.
  • the present invention relates to suppression of cell proliferation using the microRNA.
  • WT1 gene is a gene encoding a zinc finger type transcription factor.
  • WT1 has 17 amino acids (17AA) inserted in the 5 'side of the two alternative splicing sites in the WT1 gene and 3 amino acid residues between zinc fingers 3-4
  • isoforms distinguished by.
  • the Wilms tumor gene (WT1 gene) was isolated as a causative gene of childhood renal tumor (Non-patent Documents 1 and 2). This gene has been considered a tumor suppressor gene because it has been found to be defective or mutated in Wilms tumor.
  • Non-patent Documents 3 and 4 Leukemia due to WT1 antisense DNA Cell proliferation is specifically suppressed (Non-patent Document 5), mouse normal myeloid progenitor cells and myeloid progenitor cell line 32D C13 suppresses neutrophil differentiation by forced expression of WT1 gene As a result, it has become clear that it has proliferated (Non-Patent Document 6). These findings indicate that the WT1 gene is involved in leukemogenesis of hematopoietic cells. The present inventors have also reported that the wild type WT1 gene is highly expressed in various solid cancers (Non-patent Document 7-14).
  • Non-patent document 1 Call KM, et al: Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms' tumor locus. Cell 60: 509, 1990
  • Non-Special Terms 2 Gessler M, et al: Homozygous deletion in Wilms tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping. Nature 343 '. 774, 1990
  • Non-Special Terms 3 Inoue K, et al: WTl as a Blood 84: 3071, 1994
  • Non-specialized literature 4 Inoue K, et al: Aberrant overexpression of the Wilms tumor gene (WTl) in human leukemia. new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood 89: 1405, 1997
  • Non-patent document 6 Inoue K, et al: Wilms' tumor gene (WTl) competes with differentiation — inducing signal in hematopoietic progenitor cells. Blood 91: 2969, 1998
  • Non-patent document 7 Oji, Y., Ogawa, H. , Tamaki, H., Oka, Y., Tsuboi, A., Kim, EH, Soma, ⁇ , Tatekawa, ⁇ , Kawakami, M., Asada, M., Kishimoto, ⁇ , and Sugiyama, H. Expression of the Wilms' tumor gene WTl in solid tumors and its involvement in tumor cell growth. Japanese Journal of Cancer Research, 90: 194-204, 1999.
  • Non-Patent Document 8 Oji, ⁇ ⁇ , Miyoshi, S., Maeda, H., Hayashi, S., Tamaki, H., Nakatsuka, S., Yao, M., Takahashi, ⁇ ⁇ , Nakano, ⁇ , Hirabayashi, ⁇ ⁇ , Shintani, ⁇ ⁇ , Oka, ⁇ ⁇ , Tsuboi, A., Hosen, ⁇ ⁇ , Asada, M., Fujioka, ⁇ ⁇ , Murakami, M., Kanato, ⁇ ⁇ ,
  • Non-Patent Document 9 Ueda, ⁇ ⁇ , Oji, ⁇ ⁇ , Naka, ⁇ ⁇ , Nakano, ⁇ ⁇ , Takahashi, ⁇ ⁇ , Koga, S., Asada, M., Ikeba, A., Nakatsuka, S., Abeno, S., Hosen, ⁇ ⁇ , Tomita, ⁇ ⁇ , Aozasa, ⁇ ⁇ , Tamai, ⁇ ⁇ , Myoui, A., Yoshikawa, ⁇ ⁇ , and Sugiyama, H .: Overexpression of the Wilms' tumor gene WTl in human bone and soft-tissue sarcomas. Cancer Science, 94: 271-276, 2003.
  • Non-Patent Document 10 Oji, Y., Inohara, H., Nakazawa, M., Nakano, Y., Akahani, S.,
  • Non-patent literature ll ⁇ ji, ⁇ ⁇ , Miyoshi, ⁇ ⁇ , Koga, S "Nakano, Y" Ando, A "Nakatuska, S. Ikeba, A., Takahashi,., Sakaguchi, ⁇ ⁇ , Yokota, A. , Hosen, ⁇ ⁇ , Ikegame, ⁇ ⁇ , Kawakami, M., Tsuboi, A., Oka, ⁇ ⁇ , Ogawa, ⁇ ⁇ , Aozasa, ⁇ ⁇ , Noguchi, S., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms 'tumor gene WTl in primary thyroid cancer. Cancer Science, 94: 606-611, 2003.
  • Non-Patent Document 12 ⁇ ji, Y., Yamamoto, ⁇ ., Nomura, ⁇ ., Nakano, ⁇ ., Ikeba, A., Nakatsuka, S., Abeno, S., Kiyotoh, ⁇ ⁇ , Jomgeow, ⁇ ⁇ , Sekimoto, M., Nezu, R.,
  • Non-Patent Document 13 Oji, ⁇ ⁇ , Miyoshi, S., Takahashi, ⁇ ⁇ , Koga, S., Nakano, ⁇ ⁇ , Shintani, ⁇ ⁇ , Hirabayashi, ⁇ ⁇ , Matsumura, A., Iuchi, uchi ⁇ , Ito, ⁇ ⁇ , Kishimoto, ⁇ ⁇ , Tsuboi, A., Ikegame, ke ⁇ , Hosen, ⁇ ⁇ , Oka, ⁇ ⁇ , Ogawa, ⁇ ⁇ , Maeda, ⁇ ⁇ , Hayashi, S., Kawase, I., and Sugiyama, H. Absence of mutations in the Wilms' tumor gene WTl in de novo non-small cell lung cancers. Neoplasma, 51: 17-20, 2004.
  • Non-Patent Document 14 ⁇ ji, ⁇ ⁇ , Miyoshi, ⁇ ⁇ , Kiyotoh, ⁇ ⁇ , Koga, S "Nakano, Y” Ando, A "Hosen, ⁇ ⁇ , Tsuboi, A., Kawakami, M., Ikegame, Ka ⁇ , Oka, ⁇ ⁇ , Ogawa, ⁇ ⁇ , Noguchi, S., and Sugiyama, H. Absence of mutations in the Wilms' tumor gene WTl in primary breast cancer. Jpn J Clin Oncol, 34: 74-7, 2004 .
  • Non-Patent Document 15 Experimental Medicine Vol.22 No.4 (March issue) 494-499, 2004
  • Non-patent literature 16 ⁇ ji Y, Suzuki T, Nakano Y, Maruno M, Nakatsuka S, Jomgeow T, Abeno S, i atsumi N, Yokota A, Aoyagi S, Nakazawa T, Ito K, Kanato K, Shirakata T, Nishida S, Hosen N, Kawakami M, Tsuboi A, Oka Y, Aozasa K, Yoshimine T, Sugiyama H: Overexpression of the Wilms' tumor gene WTl in primary astrocytic tumors. Cancer Sci. 95: 822-7, 2004.
  • Non-patent literature 17 ⁇ ji Y, Yano M, Nakano Y, Abeno S, Nakatsuka S, Ikeba A, Yasuda T, Fujiwara Y, Takiguchi S, Yamamoto H, Fujita S, Kanato K, Ito K, Jomgeow T, Kawakami M , Tsuboi A, Shirakata T, Nishida S, Hosen N, Oka Y, Aozasa K,
  • Non-patent literature 18 ⁇ ji Y, Nakamori S, Fujikawa M, Nakatsuka S, Yokota A, Tatsumi N, Abeno S, Ikeba A, Takashima S, Tsujie M, Yamamoto H, Sakon M, Nezu R, Kawano K, Nishida S , Ikegame K, Kawakami M, Tsuboi A, Oka Y, Yoshikawa K, Aozasa K, Monden M, Sugiyama H .: Overexpression of the Wilms' tumor gene WTl in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Sci. 95: 583-7,2004.
  • An object of the present invention is to provide a molecule capable of efficiently suppressing the expression of the WT1 gene and to suppress cell proliferation using the molecule.
  • the present invention provides a microRNA as a molecule that suppresses the expression of the WT1 gene.
  • microRNA that solves the above problems is allowed to act on cancer cells to suppress the expression of WT1.
  • Non-patent Document 15 Non-patent Document 15
  • the present inventors have found that the microRNA targeting the WT1 gene is It was found that not only the expression is suppressed, but also the cell growth inhibitory effect of the cancer cell line is remarkably exhibited.
  • miR115 suppresses the expression of WT1 protein via the virtual target sequence of WTlmRNA, and constructs a vector in which the virtual target sequence is inserted on the 3 'side of GFP protein. This was proved by analyzing the effect of miR115 on the expression of. That is, the present invention relates to cell growth suppression by microRNA targeting WT1, and more specifically, provides the following invention.
  • a cell growth inhibitor containing any of the following (a) force and (c) as an active ingredient
  • Double-stranded RNA comprising RNA complementary to the transcript of the WTl gene and RNA complementary to the RNA
  • FIG. 1 is a view showing complementarity between human miR-115 (SEQ ID NO: 2) and its target region (SEQ ID NO: 1) in WT1 mRNA.
  • FIG. 2 is a graph showing changes over time in the growth inhibitory effect of miR-115 on AZ-521 cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the concentration dependency of the growth inhibitory effect of miR-115 on AZ-521 cells.
  • FIG. 4 is a photograph showing suppression of WT1 protein expression by miR-115.
  • FIG. 5 is a graph showing that miR-115 has blocked the growth-inhibiting effect on AZ-521 cells by forced expression of WT1.
  • FIG. 6 is a diagram showing the structure of a GFP expression vector into which a miR115 virtual target sequence is inserted.
  • FIG. 7 is a diagram showing suppression of GFP protein of miRl 15 via miRl 15 virtual target sequence.
  • microRNAs are small non-coding RNAs that are seen as RNAs that act on mRNA sequences and cause gene silencing.
  • MicroRNA miRNA
  • miRNAs The expression process and function of miRNA are considered as follows. From the gene encoding miRNA, precursor RNA of several tens and hundreds of bases is transcribed. The precursor RNA is processed in the nucleus by ribonuclease into stem-loop RNA called pre-miRNA. The pre-miRNA forms a complex with the transport protein and is transported out of the nucleus, where it is sensed by Dicer to become a mature functional miRNA. Mature miRNA is incorporated into the protein complex miRNP. It is thought that this miRNP complex binds to a partially complementary target mRNA and acts to suppress translation. In addition, it has been reported that miRNAs that have complete complementarity with specific mRNA sequences and function as siRNAs exist. While normal miRNA suppresses gene expression by inhibiting translation, Like siRNA, miRNA is thought to suppress gene expression by sequence-specific cleavage of the target mRNA sequence.
  • the microRNA of the present invention is a single-stranded RNA complementary to a transcription product of the target WT1 gene. Complementary in the present invention does not necessarily mean completely complementary. In the binding of the microRNA of the present invention and the target WT gene transcript, mismatch (corresponding base is not complementary!), Bulge (base corresponding to one strand is V, etc.) A mating part may be included (see Figure 1).
  • the sequence of the transcript of the WT1 gene that is the target of the microRNA of the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit a gene expression suppressing effect by binding to the microRNA.
  • a preferred example of the target sequence is the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of SEQ ID NO: 1 is the site immediately before the stop codon and is common to four isoforms of the WT1 gene.
  • One of the WT1 gene isoforms is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the target sequence of SEQ ID NO: 1 is present at the 1723 position at position 1739, and the stop codon is also present at the 1738 position at position 1740.
  • the start codon is located from position 391 to position 393.
  • miR-115 was used as a microRNA targeting the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence of miR-115 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • miR-115 was identified by Dreyfoss et al. as one of the microRNAs that form the protein complex miRNP (ribonucleaoprotein) together with the constituent proteins eIF2C, Gemin3, and Gemin4.
  • Gemin3 and Gemin4 are known to form an SMN complex with Gemin2 and Gemin5 together with a protein that causes spinal muscular atrophy, Survival of Motor Neuron (SMN).
  • the number of miR-115 in NCBI GenBank is AF480513.
  • the length of the microRNA of the present invention is not limited as long as it has an effect of suppressing the expression of the WT1 gene, but it is preferably 25 bases or less. More preferred is 14-18 bases, and most preferred is 16 bases.
  • a target sequence can be selected and prepared from the miRNA of the present invention based on the base sequence of the sequence present in the 3'-UTR region.
  • the miRNA of the present invention has a target sequence based on the nucleotide sequence of the WT1 gene transcript. It can be selected and appropriately prepared by a chemical synthesis method or the like.
  • the miRNA of the present invention can be directly administered to a living body.
  • miRNA can be expressed in vivo by administering DNA encoding miRNA in vivo.
  • a viral vector such as a retrovirus, an adenovirus, or Sendai virus
  • a non-viral vector such as a ribosome
  • administration methods include in vivo methods and ex vivo methods.
  • the miRNA of the present invention, the DNA encoding the miRNA, and the vector into which the DNA has been inserted should be used as a cell growth inhibitor, a cell differentiation inducer or a cell death inducer after being mixed with an appropriate compounding agent. Can do. If the drug is introduced into cells using a known transfection reagent, etc., effects such as inhibition of cell growth, induction of cell differentiation, or induction of cell death can be achieved by inhibiting translation of the WT1 transcript or cleaving the WT1 transcript. .
  • Cells that are expected to have the effect of the drug according to the present invention are cells that express the WT1 gene. The WT1 gene is highly expressed in cancer cells.
  • cancer cells that highly express WT1 include human leukemia, colon cancer, lung cancer, breast cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, stomach cancer, thyroid cancer, bone and soft tissue sarcoma, ovarian cancer, Uterine cancer, kidney cancer, knee cancer, or darioblastoma can be exemplified.
  • WT1 does not exert force on normal cells. Therefore, the drug according to the present invention is considered to be effective not only for academic research, but also as a drug for cancer treatment of humans and other mammals, particularly as a drug for cancer treatment targeting the above-listed cancers.
  • the cancer therapeutic drug of the present invention is considered to be effective as a drug that acts specifically on cancer cells and causes little damage to normal cells.
  • a pharmaceutically acceptable compounding agent in the preparation of the medicament of the present invention, can be mixed.
  • Pharmaceutically acceptable compounding agents include, for example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, isotonic agents, binders, disintegrating agents, lubricants. Agents, fluidity promoters, flavoring agents, and the like, but are not limited to these, and other commonly used carriers can be used as appropriate.
  • Examples of the dosage form of the above preparation include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft and hard capsules, film coating agents, pellets, sublingual agents, and pastes as oral preparations. Examples include parenteral preparations such as injections, suppositories, transdermal preparations, ointments, plasters, and liquids for external use. The optimal dosage form can be selected.
  • microRNA (miR) 115 was selected as a candidate from the database (NCBI GenBank), which was likely to serve as a microRNA against the 3'UTR sequence immediately before the stop codon of WT1 mRNA.
  • RNA was synthesized by Japan Bioservice. This was dissolved in RNAse free water at a concentration of 100 ⁇ , dispensed, and stored frozen at ⁇ 80 ° C. until use.
  • the sequence of the synthesized RNA is as follows. mir— 115: 5 '— uga age gga gcu gga a- 3'
  • Gastric cancer cell line AZ-521 cells that highly express WT1 gene were cultured in Dulbecco's Modified Medium (DMEM) containing 10% FBS. Treatment of cells with microRNA after preparing the AZ-521 cells trypsinized in 1.2xl0 5 cells / 2ml, to cells using the RNA (final con 2 ⁇ ⁇ ) the RNAi Fect (QIAGEN) after 24 hours were seeded into 6-well plate Introduced. The number of cells was trypsinized and then calculated using a calculation board.
  • DMEM Dulbecco's Modified Medium
  • AZ-521 cultured and trypsinized in the same manner as in Example 3 above was prepared to 1.2xl0 5 cells / 2 ml, seeded on a 6-well plate, and 24 hours later, in the presence of RNAi Feet (QIAGEN) miR-115 or Treated with Luciferase AS (concentration 2 ⁇ M) for 12 hours.
  • RNAi Feet QIAGEN
  • Luciferase AS concentration 2 ⁇ M
  • WT1 protein in these cells was analyzed by Western Blot.
  • the cells were trypsinized, washed twice with PBS, and then lysed in Laemmieli's SDS sample buffef at a ratio of 10 6 cells / 100 1.
  • Proteins were separated by SDS-PAGE, transferred to PVDF membrane, and blocked with 1% gelatin / TBST. This was reacted with the primary antibody anti WT1 C-19 Ab (Santa Curz Biotechnology 100: 1 dilution) or anti GAPDH Ab (1000: 1 dilution), and then reacted with the ALP-labeled secondary antibody for each to react with BCIP / WT1 and GAPDH proteins were detected using an NBT kit strength writer tester.
  • a vector pcDNAWTlA (+ / +) was prepared by inserting WT1 17AA (+) KTS (+) into an expression vector pcDNA3.1 (Invitrogen) having a CMV promoter.
  • WT1 17AA (+) KTS (+) was prepared by inserting WT1 17AA (+) KTS (+) into an expression vector pcDNA3.1 (Invitrogen) having a CMV promoter.
  • pcDNA3.1 Invitrogen
  • 2 ⁇ g of vector was Lipofection using Fugene6 (Roche).
  • AZ-521 cells were seeded, and RNA (final concentration 2 ⁇ ⁇ ) was introduced into the cells 24 hours later using RNAiFect (QIAGEN). 24 hours later, 2 g of pcDNA3.1 / WTA (+ / +) or empty vector was Lipofectioned, and after 72 hours, each cell was collected and counted. The number of cells was trypsinized and then calculated using a counting plate.
  • miRl 15 suppresses WT1 protein expression via the WTlmRNA hypothetical target sequence! / ⁇
  • the miRl 15 hypothetical target sequence was inserted 3 'to the GFP protein.
  • a vector was constructed and the effect of miRl 15 on intracellular expression of GFP protein was analyzed.
  • the oligo DNAs that repeat the base sequence (SEQ ID NO: 5) were inserted into the Scal EcoRI site of pEGFP-c3 vector (BD) to construct pEGFP-115TS vector and pEGFP-115mTS vector (FIG. 6).
  • Two types of human miRNA miR-115 5'-UGAAGCGGAGCUGGAA-3 'Let7e: 5 UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGU-3' were synthesized (Japan Bio Service).
  • a cell line expressing EGFP was treated with microRNA.
  • MicroRNA treatment was performed by seeding cells in a 6-well plate the day before and introducing miR-115 and Let7e at a concentration of 2 mg the next day using RNAiFect transfection reagent (QIAGEN). Cells were collected 24 hours later, and the expression level of EGFP was analyzed by the Westamplot method.
  • a microRNA capable of efficiently suppressing the expression of the WT1 gene and a cell growth inhibitor containing the microRNA as an active ingredient are provided. Since the WT1 gene is known to be highly expressed in cancer cells, the cell growth inhibitor of the present invention is particularly useful as a novel anticancer agent. In addition, it has been known that overexpression of WT1 suppresses cell differentiation or apoptosis. From this, it is considered that suppression of WT1 expression by miR115 of the present invention induces cell differentiation or cell death in cancer cells.

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Abstract

　WT1遺伝子のストップコドン近傍を標的とするmiRNAがWT1遺伝子の発現を抑制するのみならず、顕著に癌細胞株の細胞増殖抑制効果を示すことを見出した。

Description

明 細 書
WT1遺伝子の発現を抑制するマイクロ RNAおよびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、 WT1遺伝子の発現を抑制するマイクロ RNAおよびその利用に関する。
特に本発明は、該マイクロ RNAを利用した細胞増殖の抑制に関する。
背景技術
[0002] ウィルムス腫瘍遺伝子 (WT1遺伝子）は、ジンクフィンガー型の転写因子をコードす る遺伝子である。 WT1は、 WT1遺伝子に存在する 2か所の alternative splicing部位の うちの 5'側の部位に挿入された 17個のアミノ酸（17AA)の有無とジンクフィンガー 3 - 4 間の 3アミノ酸残基の有無によって区別される、 4つのアイソフォームの存在が知られ ている。
[0003] ウィルムス腫瘍遺伝子 (WT1遺伝子）は、小児腎腫瘍の原因遺伝子として単離され た (非特許文献 1、 2)。ウィルムス腫瘍でこの遺伝子の欠損や突然変異が見つかつ たこと等から、従来は癌抑制遺伝子と考えられてきた。
[0004] しかし、本発明者らによる数々の報告は、 WT1遺伝子は癌抑制遺伝子というより、 むしろ癌遺伝子様の機能を果たして 、ることを示唆して 、る。変異のな!、野生型 WT1遺伝子がほとんどすべての白血病細胞で高発現され、その発現レベルは白血 病患者の予後と逆相関を示すこと (非特許文献 3、 4)、 WT1アンチセンス DNAにより 白血病細胞の増殖が特異的に抑制されること (非特許文献 5)、マウス正常骨髄系前 駆細胞および骨髄系前駆細胞株 32D C13は WT1遺伝子の強制発現により好中球へ の分ィ匕が抑制され、増殖するようになること (非特許文献 6)、等が明らかとなった。こ れらの知見は、 WT1遺伝子は、造血系細胞の白血病化に関与していることを示すも のである。また本発明者らは、野生型 WT1遺伝子が種々の固形癌においても高発現 して 、ることを報告してきた (非特許文献 7-14)。
[0005] そこで本発明者らは、 WT1遺伝子の発現を効率よく抑制することができれば、腫瘍 特異的分子標的療法の開発につながると考えた。これまでに、 WT1を標的とした腫 瘍特異的分子標的療法の例は知られて!/、な 、。 非特言午文献 1 : Call KM, et al： Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms' tumor locus. Cell 60： 509， 1990
非特言午文献 2 : Gessler M, et al： Homozygous deletion in Wilms tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping. Nature 343 '. 774, 1990 非特言午文献 3： Inoue K， et al： WTl as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood 84： 3071, 1994 非特言午文献 4 : Inoue K， et al： Aberrant overexpression of the Wilms tumor gene (WTl) in human leukemia. Blood 89： 1405, 1997
特言午文献 5 :Yamagami T, Sugiyama Η, Inoue Κ， Ogawa Η, Tatekawa Τ, Hirata Μ, Kudoh Τ， Akiyama Τ， Murakami A, Maekawa T. Growth inhibition of human leukemic cells by WTl (Wilms tumor gene) antisense oligodeoxynucleotides： implications for the involvement of WTl in leukemogenesis. Blood. 1996 Apr l;87(7):2878-84.
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非特許文献 8 : Oji， Υ·， Miyoshi, S.， Maeda, H.， Hayashi, S.， Tamaki, H.， Nakatsuka, S.， Yao, M., Takahashi, Ε·， Nakano, Υ·， Hirabayashi, Η·， Shintani, Υ·， Oka, Υ·， Tsuboi, A., Hosen, Ν·， Asada, M., Fujioka, Τ·， Murakami, M., Kanato, Κ·，
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非特許文献 l l :〇ji， Υ·， Miyoshi, Υ·， Koga, S" Nakano, Y" Ando, A" Nakatuska, S. Ikeba, A., Takahashi, .， Sakaguchi, Ν·， Yokota, A., Hosen, Ν·， Ikegame, Κ·， Kawakami, M., Tsuboi, A., Oka, Υ·， Ogawa, Η·， Aozasa, Κ·， Noguchi, S.， and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms' tumor gene WTl in primary thyroid cancer. Cancer Science, 94: 606 - 611， 2003.
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非特許文献 13 : Oji， Υ·， Miyoshi, S.， Takahashi, Ε·， Koga, S.， Nakano, Υ·， Shintani, Υ·， Hirabayashi, Η·， Matsumura, A., Iuchi, Κ·， Ito, Κ·， Kishimoto, Υ·， Tsuboi, A., Ikegame, Κ·， Hosen, Ν·， Oka, Υ·， Ogawa, Η·， Maeda, Η·， Hayashi, S.， Kawase, I., and Sugiyama, H. Absence of mutations in the Wilms' tumor gene WTl in de novo non-small cell lung cancers. Neoplasma, 51: 17—20， 2004.
非特許文献 14 :〇ji， Υ·， Miyoshi, Υ·， Kiyotoh, Ε·， Koga, S" Nakano, Y" Ando, A" Hosen, Ν·， Tsuboi, A., Kawakami, M., Ikegame, Κ·， Oka, Υ·， Ogawa, Η·， Noguchi, S.， and Sugiyama, H. Absence of mutations in the Wilms' tumor gene WTl in primary breast cancer. Jpn J Clin Oncol, 34:74-7, 2004. 非特許文献 15 :実験医学 Vol.22 No.4 (3月号） 494-499, 2004
非特許文献 16 :〇ji Y, Suzuki T， Nakano Y， Maruno M, Nakatsuka S， Jomgeow T， Abeno S， iつ atsumi N， Yokota A, Aoyagi S， Nakazawa T， Ito K， Kanato K， Shirakata T， Nishida S， Hosen N， Kawakami M, Tsuboi A, Oka Y， Aozasa K， Yoshimine T， Sugiyama H： Overexpression of the Wilms' tumor gene WTl in primary astrocytic tumors. Cancer Sci. 95:822-7,2004.
非特許文献 17 :〇ji Y， Yano M, Nakano Y， Abeno S， Nakatsuka S， Ikeba A, Yasuda T， Fujiwara Y， Takiguchi S， Yamamoto H， Fujita S， Kanato K， Ito K， Jomgeow T， Kawakami M, Tsuboi A, Shirakata T， Nishida S， Hosen N， Oka Y， Aozasa K，
Monden M, Sugiyama H.： Overexpression of the Wilms' tumor gene WTl in esophageal cancer. Anticancer Res. 24:3103 - 8， 2004.
非特許文献 18 :〇ji Y， Nakamori S, Fujikawa M, Nakatsuka S, Yokota A, Tatsumi N， Abeno S， Ikeba A, Takashima S， Tsujie M, Yamamoto H， Sakon M, Nezu R， Kawano K， Nishida S， Ikegame K， Kawakami M, Tsuboi A, Oka Y， Yoshikawa K， Aozasa K， Monden M, Sugiyama H.： Overexpression of the Wilms' tumor gene WTl in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Sci. 95:583 - 7,2004.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、 WT1遺伝子の発現を効率的に抑制することができる分子を提供すると 供に、該分子を利用して細胞増殖を抑制することを課題とする。 WT1遺伝子の発現 を抑制する分子として、特に本発明は、マイクロ RNAを提供する。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記課題を解決すベぐマイクロ RNAを癌細胞に作用させて WT1の 発現を抑制することを考えた。 WTl mRNAの配列に対しマイクロ RNAとして働きうる可 能性のあるマイクロ RNAをデータベースから検索し、候補として microRNA (miR) 115 を選択した。マイクロ RNAは、標的 mRNAと不完全にしか結合しないため、標的を同 定することは現在の技術状況下において容易ではない (非特許文献 15)。しかし、鋭 意努力の結果、本発明者らは WT1遺伝子を標的とするマイクロ RNAが WT1遺伝子の 発現を抑制するのみならず、顕著に癌細胞株の細胞増殖抑制効果を示すことを見 出した。また、 miR115が WTlmRNAの仮想標的配列を介して WT1タンパク質の発 現を抑制して 、ることを、 GFPタンパクの 3'側に仮想標的配列を挿入したベクターを 構築し、 GFPタンパクの細胞内での発現に対する miR115の効果を解析することによ り証明した。すなわち、本発明は WT1を標的とするマイクロ RNAによる細胞増殖抑制 に関し、より具体的には、下記の発明を提供するものである。
[1] 以下の (a)力も (c)の 、ずれかを有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤
(a) WTl遺伝子の転写産物に相補的な一本鎖 RNA
(b) (a)の RNAをコードする DNA
(c) (b)の DNAが挿入されたベクター
[2] 一本鎖 RNA力 WT1遺伝子の転写産物における配列番号： 1に記載の塩基配 列に相補的である、 [1]に記載の細胞増殖抑制剤
[3] 一本鎖 RNA力 配列番号： 2に記載の塩基配列力もなる RNAである、 [1]または [ 2]に記載の細胞増殖抑制剤
[4] 以下の (a)から (c)の ヽずれかを有効成分として含有する細胞分化誘導剤また は細胞死誘導剤。
(a) WTl遺伝子の転写産物に相補的な RNAと該 RNAに相補的な RNAとを含む二重 鎖 RNA
(b) (a)の二重鎖 RNAをコードする DNA
(c) (b)の DNAが挿入されたベクター
[5] 一本鎖 RNA力 WT1遺伝子の転写産物における配列番号： 1に記載の塩基配 列に相補的である、 [4]に記載の薬剤。
[6] 一本鎖 RNA力 配列番号： 2に記載の塩基配列力もなる RNAである、 [4]または [ 5]に記載の薬剤。
図面の簡単な説明
[図 1]ヒト miR-115 (配列番号： 2)と WT1 mRNAにおけるその標的領域（配列番号： 1) との相補性を示す図である。
[図 2]miR-115による AZ-521細胞に対する増殖抑制効果の経時的変化を示す図であ る。
[図 3]miR-115による AZ-521細胞に対する増殖抑制効果の濃度依存性を示す図であ る。
[図 4]miR- 115による WT1タンパク質発現抑制を示す写真である。
[図 5]WT1の強制発現により miR-115の AZ-521細胞に対する増殖抑制効果がブロッ クされたことを示す図である。
[図 6]miR115仮想標的配列を挿入した GFP発現ベクターの構造を示す図である。
[図 7]miRl 15仮想標的配列を介した miRl 15の GFPタンパク質の抑制を示す図である 発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明は、 WT1遺伝子転写産物に結合するマイクロ RNAに関する。一般的にマイ クロ RNAは、小さな non-coding RNAで、 mRNA配列に作用して遺伝子サイレンシング を引き起こす RNAとして捉えられている。マイクロ RNA (miRNA)は、 1993年 Amborosら のグループによって最初に報告された。 Amborosらは、線虫の lin-4という Non-coding RNA力 ¾n-14あるいは lin-28と!、う遺伝子の発現を、 3'-UTR領域に結合することによ り、翻訳段階で抑制することを報告した。その後、線虫の miRNAとして 21塩基力 なる let-7が報告された。 let-7に関する研究からは、一種類の miRNAが複数の標的 mRNA を制御している可能性があることが示唆されている。現在では miRNAが動植物に広く 分布して 、ることがわかっており、 300種類以上が報告されて 、る。
[0011] miRNAの発現過程と機能は以下のように考えられている。 miRNAをコードする遺伝 子から、数十力 数百塩基の前駆体 RNAが転写される。前駆体 RNAは、核内でリボヌ クレアーゼによって pre-miRNAと呼ばれるステムループ型 RNAにプロセシングされる 。 pre-miRNAは輸送タンパク質と複合体を形成して核外に輸送された後、 Dicerによ つてプロセンシングされ、成熟した機能性の miRNAとなる。成熟した miRNAはタンパク 質複合体 miRNPに取り込まれる。この miRNP複合体が部分的に相補性を有する標的 mRNAと結合して翻訳抑制に働くと考えられている。また miRNAの中には、特定の mRNA配列と完全な相補性を持ち、 siRNAとして機能する miRNAが存在することが報 告されている。通常の miRNAが翻訳阻害により遺伝子発現を抑制するのに対し、この miRNAは siRNAと同様に標的 mRNA配列を配列特異的切断によって遺伝子発現を抑 制すると考えられている。
[0012] 本発明のマイクロ RNAは、標的である WT1遺伝子の転写産物と相補的な一本鎖 RNAである。本発明における相補的とは、必ずしも完全に相補的であることを意味し ない。本発明のマイクロ RNAと標的である WT遺伝子の転写産物との結合において、 ミスマッチ (対応する塩基が相補的でな!、)、バルジ (一方の鎖に対応する塩基がな V、)などにより不対合部分が含まれて 、てもよ 、（図 1参照)。
[0013] 本発明のマイクロ RNAの標的となる WT1遺伝子の転写産物の配列は、マイクロ RNA が結合することにより遺伝子発現抑制効果を示しうる限り、特に制限はない。標的配 列の好ましい一例としては、配列番号： 1の配列を挙げることができる。配列番号： 1の 配列は、ストップコドン直前の部位で、 WT1遺伝子 4種のアイソフォームに共通である 。 WT1遺伝子のァイソフォームの一つを配列番号： 3に示した。配列番号： 1の標的配 列は、配列番号: 3に示した WT1遺伝子配列中では第 1723位力 第 1739位に存在し 、ストップコドンは第 1738位力も第 1740位に存在する。なお、開始コドンは第 391位か ら第 393位に存在する。
[0014] 本実施例においては、配列番号： 1に記載の塩基配列を標的とするマイクロ RNAと して miR-115を用いた。 miR-115の塩基配列を、配列番号： 2に示す。 miR-115は、 Dreyfossらによって、構成タンパク質 eIF2C,Gemin3,Gemin4、と共にタンパク質複合 体 miRNP(ribonucleaoprotein)を形成するマイクロ RNAの一つとして同定された。 Gemin3,Gemin4は、 Gemin2,Gemin5と共に脊髄性筋萎縮症の原因タンパク質 Survival of Motor Neuron (SMN)と SMN複合体を形成することが知られている。 NCBI GenBankでの miR- 115の番号は AF480513である。
[0015] 本発明のマイクロ RNAは、 WT1遺伝子の発現を抑制する効果を有する限り、その長 さを問わないが、好ましくは 25塩基以下である。より好ましくは 14-18塩基、最も好まし くは 16塩基である。
[0016] 本発明の miRNAから 3'-UTR領域に存在する配列の塩基配列を基に標的となる配 列を選択し、調製することができる。
本発明の miRNAは、 WT1遺伝子の転写産物の塩基配列を基に標的となる配列を 選択し、化学的合成方法等によって、適宜調製することができる。
[0017] 本発明の miRNAは、そのまま生体に投与することもできる。また、 miRNAをコードす る DNAを生体内に投与して、生体内で miRNAを発現させることもできる。生体内で miRNAを発現させる場合には、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイ ルスなどのウィルスベクターやリボソームなどの非ウィルスベクターを利用することが できる。投与方法としては、例えば in vivo法および ex vivo法を挙げることができる。
[0018] 本発明の miRNA、該 miRNAをコードする DNA、該 DNAが挿入されたベクターは、適 宜配合剤と混合して細胞増殖抑制剤、細胞分化誘導剤または細胞死誘導剤として 使用することができる。該薬剤を公知トランスフエクシヨン試薬等を用いて細胞に導入 すれば、 WT1転写物の翻訳阻害、または WT1転写物の切断によって細胞増殖抑制 、細胞分化誘導、または細胞死誘導等の効果を発現できる。本発明による薬剤の効 果が期待される細胞は、 WT1遺伝子を発現する細胞である。癌細胞には WT1遺伝子 が高発現している。 WT1が高発現する癌細胞の例として、具体的には、ヒトの白血病 、大腸癌、肺癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、胃癌、甲状腺癌、骨および軟 部肉腫、卵巣癌、子宮癌、腎癌、膝癌、またはダリオブラストーマを例示することがで きる。一方、正常細胞には WT1はごくわず力し力発現しない。したがって、本発明に よる薬剤は、学術研究用としてのみならず、ヒトおよびその他の哺乳動物の癌治療用 医薬品、特に上記に列挙した癌を対象とする癌治療用医薬品として有効と考えられ る。本発明の癌治療用医薬品は、癌細胞に特異的に働き、正常細胞の損傷が少な い医薬品として有効と考えられる。
[0019] 本発明の薬剤の調製においては、薬学上許容される配合剤を混合することができ る。薬学上許容される配合剤として、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、 保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促 進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使 用することができる。上記製剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉 末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟 '硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ぺ レット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬 膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた 最適の剤型を選ぶことができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0020] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
[0021] [実施例 1] microRNAの選択
WT1 mRNAの stop codon直前から 3'UTRの配列に対し microRNAとして働きうる可 能性のある microRNAをデータベース（NCBI GenBank)から検索し、候補として microRNA (miR) 115を選択した。
[0022] [実施例 2] microRNAの調製
RNAを日本バイオサービスに依頼し合成した。これを 100 μ Μの濃度で RNAse free waterに溶解して分注し、使用するまで- 80°Cで凍結保存した。合成した RNAの配列 を以下に己す。 mir— 115: 5' — uga age gga gcu gga a- 3' (酉己歹幡 ： 2)
Lucifer as e AS 5' — ucg aag uau ucc gcg uac guu -3' (酉己列番号： 4)。
[0023] [実施例 3] miR- 115による AZ- 521細胞の増殖抑制
WT1遺伝子を高発現する gastric cancer cell line AZ— 521細胞を FBS10%含 Dulbecco's Modified Medium (DMEM)中で培養した。 microRNAによる細胞の処理は 、トリプシナイズした AZ- 521細胞を 1.2xl05 cells/2mlに調製後、 6well plateにまき 24 時間後に RNA(final con 2 μ Μ)を RNAi Fect(QIAGEN)を用いて細胞に導入した。細 胞数はトリプシナイズした後、算定板を用いて算定した。
[0024] AZ- 521細胞を miR- 115 (final conc.2 μ Μ)で処理すると、コントロールの RNAで処理 したときに比べ有意に AZ-521細胞の増殖を抑制した（図 2)。次に miR-115の濃度を 0.5, 1.0および 2.0 μ Μに変え 48時間処理し、 miR-115の細胞増殖抑制効果を解析し たところ、この効果は miR-115の濃度に依存して 、た（図 3)。
[0025] [実施例 4] miR-115による WT1タンパクの発現抑制
上記実施例 3と同様に培養、トリプシナイズした AZ-521を 1.2xl05cells/2mlに調製後 6well plateにまき、 24時間後に RNAi Feet (QIAGEN)存在下で miR- 115または Luciferase AS (濃度 2 μ M)で 12時間処理した。
[0026] これらの細胞における WT1タンパクの発現を Western Blotで解析した。細胞をトリプ シナイズし PBSにて 2回洗浄後、 106cells/100 1の割合で Laemmieli's SDS sample buffefに溶解した。タンパクを SDS-PAGEにより分離した後 PVDF膜に転写、 1 % gelatin/TBSTでブロッキングした。これを 1次抗体 anti WT1 C- 19 Ab (Santa Curz Biotechnology 100: 1希釈)または anti GAPDH Ab (1000: 1希釈)と反応させた後、それ ぞれに対する ALP標識 2次抗体を反応させ BCIP/NBT kitけ力ライテスタ)を用いて WT1及び GAPDHタンパクを検出した。
結果を図 4に示す。 miR-115処理により細胞内でのタンパクの発現が効率よく抑制 されていた。
[0027] [実施例 5] WT1の強制発現による miR-115の効果の抑制
miR-115が WT1特異的に AZ-521細胞の増殖を抑制しているかどうかを確認するた め、 WT1を強制発現させた AZ-521細胞を miR-115で処理し、 WT1発現抑制効果を 検討した。
強制発現用として、 CMVプロモーターを持つ発現ベクター pcDNA3.1 (Invitrogen) に WT1 17AA (+) KTS (+)を挿入したベクター pcDNAWTlA(+/+)を作製した。 AZ-521 細胞への導入は vector 2 μ gを Fugene6 (Roche)を用いて Lipofectionした。
[0028] AZ- 521細胞をまき、 24時間後に RNA (終濃度 2 μ Μ)を RNAiFect (QIAGEN)を用い て細胞に導入した。 24時間後に pcDNA3.1/WTA( +/+)または empty vector 2 gを Lipofectionし 72時間後にそれぞれの細胞を回収し算定した。細胞数はトリプシナイズ した後、算定板を用いて算定した。
[0029] pcDNA3.1/WTA(+/+)を導入した細胞にお!、て empty vectorを導入した細胞に比 較して有意に miR-115の細胞増殖抑制効果が抑制されて 、た（図 5)。これらの結果 は miR-115が特異的に WT1タンパクの発現を抑制することにより AZ-521細胞の増殖 を抑制していることを示す。
[0030] [実施例 6] miR115仮想標的配列を介した miR115の GFPタンパク質の抑制
miRl 15が WTlmRNAの仮想標的配列を介して WT1タンパクの発現を抑制して!/ヽ ることを証明するために、 GFPタンパクの 3'側に miRl 15の仮想標的配列を挿入した ベクターを構築し、 GFPタンパクの細胞内での発現に対する miRl 15の効果を解析し た。
[0031] まず、 WT1遺伝子の終止コドン上流 17塩基（ 2072nt - 2088nt、配列番号： 1 )の配 列 (miRl 15の仮想標的配列）を 3回繰り返すオリゴ DNA、またその 5ケ所に変異をもた せた塩基配列（配列番号： 5)を 5回繰り返すオリゴ DNAをそれぞれ pEGFP-c3 vector (BD)の Scal EcoRIサイトに挿入し、 pEGFP- 115TS vector, pEGFP- 115mTS vectorを 構築した (図 6)。
次に、この 2種類のベクター（pEGFP- 115TS vector, pEGFP- 115mTS)を制限酵素 Alw44Iにて切断しリニアにした後、 エレクト口ポレーシヨン法にて AZ-521胃癌細胞に 導入した。 G418を含む選択培地で 2週間以上培養した後、 FACS解析により EGFPを 過剰発現する細胞株をそれぞれ榭立した (AG115TS AG115mTS)
[0032] 2種類の human miRNA miR- 115 : 5' - UGAAGCGGAGCUGGAA- 3' Let7e : 5 UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGU -3'を合成し (Japan Bio Service) EGFPを発現す る細胞株に対し、 microRNA処理を行った。 microRNA処理は、前日に 6 well plateに 細胞を蒔き、翌日 2 Μの濃度の miR- 115、および Let7eを RNAiFect transfection reagent ( QIAGEN )を用いて導入することで行った。 24時間後に細胞を回収し、ゥェ スタンプロット法により EGFPの発現レベルを解析した。
ウェスタンブロット解析は、以下の方法で行った。 miR-115あるいはコントロールとして 使用した Let7eで処理した細胞を SDS sample bufferに溶解し、タンパクを SDS-PAGE にて分離後、 PVDFメンブレンに転写した。 1次抗体に抗 GFPモノクローナル抗体（ Santa Cruz Biotechnology)、抗 GAPDH抗体 (Chemicon)を、 2次抗体に ALP conjugated antimouse饥 '体 (Santa Cruz Biotechnology)を用 ヽて BCIP— NBTゃット【こ て発色した。
[0033] 以上の結果、 miRl 15仮想標的配列（WT1遺伝子の終止コドン上流 17塩基（ 2072nt - 2088nt )の 3回繰り返し配列を挿入した GFPベクターを AZ-521細胞に発現させた AG115TS細胞においては、 miRl 15処理により GFPタンパクの発現が低下したが、 let7e処理では GFPタンパクの発現は変化しないことが明ら力となった。 miRl 15仮想 標的配列の 5ケ所に変異をもたせ、 5回繰り返した塩基配列を挿入した GFPベクター を、 AZ— 521細胞に発現させた AG115mTS細胞においては、 miR115処理によっても GFPタンパクの発現は低下しな 、ことが明ら力となった（図 7)。これらの結果より、 miR115は仮想標的配列を介してタンパク質の発現を抑制することが明ら力となった。 産業上の利用可能性
本発明によって、 WT1遺伝子の発現を効率的に抑制することができるマイクロ RNA および該マイクロ RNAを有効成分とする細胞増殖抑制剤が提供された。 WT1遺伝子 は、癌細胞に高発現することが知られていることから、本発明の細胞増殖抑制剤は、 新規抗癌剤として特に有用である。また、これまでに WT1の過剰発現が、細胞の分 化を抑制、またはアポトーシスを抑制することが知られている。このことより、本発明の miR115による WT1の発現抑制は、癌細胞において細胞分化の誘導、または細胞死 の誘導を引き起こすものと考えられる。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の（a)から (c)のいずれかを有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤。
(a) WTl遺伝子の転写産物に相補的な一本鎖 RNA
(b) (a)の RNAをコードする DNA
(c) (b)の DNAが挿入されたベクター
[2] 一本鎖 RNA力 WT1遺伝子の転写産物における配列番号： 1に記載の塩基配列に 相補的である、請求項 1に記載の細胞増殖抑制剤。
[3] 一本鎖 RNA力 配列番号： 2に記載の塩基配列力もなる RNAである、請求項 1または
2に記載の細胞増殖抑制剤
[4] 以下の（a)から (c)の ヽずれかを有効成分として含有する細胞分化誘導剤または細 胞死誘導剤。
(a) WTl遺伝子の転写産物に相補的な RNAと該 RNAに相補的な RNAとを含む二重 鎖 RNA
(b) (a)の二重鎖 RNAをコードする DNA
(c) (b)の DNAが挿入されたベクター
[5] 一本鎖 RNA力 WT1遺伝子の転写産物における配列番号： 1に記載の塩基配列に 相補的である、請求項 4に記載の薬剤。
[6] 一本鎖 RNA力 配列番号： 2に記載の塩基配列力もなる RNAである、請求項 4または
5に記載の薬剤。
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