KR20160114381A

KR20160114381A - CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20160114381A
Application number: KR1020150040812A
Authority: KR
Inventors: 신찬석; 김소영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-24
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2016-10-05
Also published as: KR101708032B1

Abstract

본 발명은 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물 내에 투여하는 단계를 포함하는, 암세포에 대한 세포사멸 증진 방법 및 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항암보조제용 건강기능식품을 제공한다.

Description

CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising CysA5W peptide as effective component}

본 발명은 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물 내에 투여하는 단계를 포함하는, 암세포에 대한 세포사멸 증진 방법 및 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항암보조제용 건강기능식품에 관한 것이다.

최근 펩타이드, 단백질, 핵산 등의 고분자물질을 포함하는 바이오 의약품의 중요성이 점점 부각되고 있다. 그 중 펩타이드는 아미노산의 펩타이드 결합(Peptide bond)으로 연결된 생합성 물질로, 일반 화학약품에 비해 생체 내에서 독성이 낮고, 높은 안정성을 보인다. 일반적으로 펩타이드는 100개의 아미노산 이하로 이루어진 것으로 비교적 작은 크기와 생체막을 잘 통과한다는 장점이 있어, 약품전달물질로 많이 이용되고 있다. 또한 간이나 신장 같은 조직에 축적되지 않기 때문에 면역 반응이 일어나지 않아 부작용이 적은 의약품으로써 펩타이드 신약개발이 활발히 진행되고 있다. 저분자 물질에 비해 큰 분자량을 가지고 있어, 다른 생체 분자들을 특이적으로 강력하게 조절할 수 있다. 진핵 생물체에서 자신의 신체 기능 조절을 위해 여러 종류의 생리활성을 가진 펩타이드를 분비한다. 이를 이용하여 인유두종 바이러스(Human papillomavirus; HPV)의 치료를 위한 펩타이드 백신의 연구 및 개발이 진행 중에 있다. 그 밖에 여러 질병을 치료할 의약품으로써의 역할로 펩타이드가 각광받고 있다. 이러한 펩타이드 중에 알파 나선(α-helix) 구조를 가지는 짧은 길이의 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 스템-루프(Stem-loop) 이차 구조로 이루어진 RNA에 특이적으로 작용할 수 있다는 연구 결과들이 있다. 특히, 스템-루프(Stem-loop)로 이루어진 microRNA에 선택적으로 작용할 수 있다고 알려졌다.

MicroRNA는 일반적으로 18~25개 정도의 뉴클레오타이드(nucleotide)로 이루어지며 생체 내에 존재하여 유전자 발현을 전사 후 수준에서 조절하는 기능을 가진 단일 염기가닥의 작은 RNA 조각을 일컫는다. MicroRNA가 생성되는 과정은 먼저 microRNA 유전자에서 RNA 중합효소 II에 의해 전사되어 primary-miRNA을 생성한 후, RNase III 타입인 Drosha 라는 효소와 그 파트너 단백질들에 의해 약 70 nt 길이의 전구체-miRNA(precursor-miRNA)가 생성된다. Exportin-5라는 단백질에 의해 핵 밖으로 나온 전구체-miRNA는 RNase III 타입인 Dicer에 의해 microRNA duplex가 생성된다. 이 두 가닥의 microRNA duplex는 ARGONAUT 단백질을 포함하는 RNA-induced silencing complex(RISC)에 결합하고 이 중 한 가닥만이 선택되어 표적 유전자의 상보적인 부위에 결합하여 mRNA를 자르거나(mRNA cleavage), 번역 저해(translational inhibition)를 일으켜 표적 유전자의 발현을 억제한다. 수많은 microRNA들이 진핵생물체에 존재하고 있으며, 발생에서의 유전자 발현을 조절할 뿐만 아니라 암, 백혈병 등을 비롯한 여러 질병에서도 microRNA의 중요한 역할이 밝혀지고 있다. 특히, microRNA-29가 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)인 p53을 조절할 수 있다고 알려져 있다.

암 발생에 중요한 열쇠가 될 수 있는 종양 억제 단백질(tumor suppressor protein) 중 하나인 p53은 세포의 생존 여부를 결정하는 감시인(guardian)의 역할을 한다. DNA 손상, 산화적 스트레스 같은 여러 타입의 스트레스에 빠르게 반응하여 세포주기 정지(cell-cycle arrest) 또는 세포사멸(apoptosis)을 일으킨다. 이러한 기능들이 망가지게 되면 비정상적인 세포 증식을 막지 못하여 암 발생이 일어나게 된다. 실제 연구보고들에 의하면, 암 발생의 절반 이상이 p53 단백질의 이상으로 생긴다. 그렇기 때문에, 암 연구에 있어서 p53은 매우 중요한 단백질로 항암 신약 개발에 가장 중요한 표적 단백질이라 할 수 있다.

지금까지 p53 단백질을 이용한 의약품들이 많이 개발되어 왔고, 대부분 작은 분자(small molecule)로 이루어진 화학약품이다. 앞서 언급했듯이, 기존에 사용되고 있는 의약품들은 독성뿐만 아니라 표적에 대한 특이성이 떨어지므로 부작용들이 많다.

한편, 한국공개특허 제1998-0702283호에서는 'ｐ53 기능을 활성화시키는 사람 ｐ53과 유사한 구조를 갖는 펩티드 및 펩티도미메틱'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0064516호에서는 '마이크로ＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 항암제 및 그 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 81개의 무작위 펩타이드들 중 한 개의 펩타이드가 microRNA-29 패밀리 중 microRNA-29b의 Dicer 작용을 좀 더 효율적으로 만들어 microRNA-29b 전구체에 특이적으로 작용하여 성숙된 microRNA-29b 생성을 증가시키고, 종양 억제 단백질 p53의 안정성을 더 증진시켜 세포사멸을 더 유발한다는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명은 생체 독성이 낮고 세포침투가 용이하며 표적에 대한 특이성이 높은 펩타이드를 기반으로 하여 항암 신약 개발에 새로운 접근방식을 제공할 수 있을 것으로 기대함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CysA5W 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물 내에 투여하는 단계를 포함하는, 암세포에 대한 세포사멸 증진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항암보조제용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 기존에 항암 작용이 있는 의약품과는 달리 특정 펩타이드가microRNA-29b 전구체에 특이적으로 작용하여 그 생성을 증가시키고, 그렇게 생성된 성숙된 microRNA-29b가 종양 억제 단백질인 p53 단백질의 안정성을 증진시켜 세포사멸을 일으킨다는 것을 새롭게 확인함으로써, 생체 독성이 낮고 세포침투가 용이하며 표적에 대한 특이성이 높은 펩타이드를 기반으로 한 새로운 항암 치료제를 제공할 수 있어, 획기적인 발명으로 기대된다.

도 1은 81개의 무작위 펩타이드에서 p53 활성으로 인한 세포사멸을 증가시키는 펩타이드를 선별하기 위해 자궁경부암 세포인 HeLa 세포의 생존율을 실험한 결과를 나타낸다. 물을 처리한(mock) 대조구 샘플을 100%로 기준하여 각각의 생존율을 계산하였다. 그 값들을 내림차순으로 정렬한 뒤, 별(*)표로 표시한 9개의 펩타이드를 우선 선별하였다.
도 2는 선별된 9개 펩타이드 중 microRNA-29b와 p53 활성을 증가시키는 펩타이드를 선별하였고, 그것의 아미노산 서열(C)을 나타낸다. (A) 그래프는 Taqman microRNA 분석을 통해 microRNA-29b 양을 측정한 것이고, (B) 그래프는 루시퍼라제 분석(luciferase assay)을 통해 p53 활성을 측정한 것이다.
도 3은 microRNA 생성인자인 Drosha와 Dicer 활성 테스트를 시험관 분석(in vitro processing assay)을 통해, 선별된 CysA5W 펩타이드의 작용을 확인한 결과이다.(A-C) 젤 사진은 Dicer 활성을 나타낸 것이고, (D)는 Drosha 활성을 나타낸 것이다. CysA5W 펩타이드 뿐만 아니라 대조구로써 다른 펩타이드(13Aad-14W, HelixA)도 함께 비교하였고, 처리한 농도와 반응 시간은 도면에 나타내었다. 젤 사진 아래에 나타낸 값은 전체 전구체 microRNA에서 생성된 microRNA의 밴드 강도(band intensity) 비율을 나타낸 것이다. (D)의 아래에 나타낸 값은 전체 primary microRNA에서 생성된 전구체 microRNA 비율을 나타낸 것이다. 각각의 값들은 각 실험에서 실시한 mock control을 1로 기준으로 하여 표준화한(normalized) 것이다.
도 4는 CysA5W 펩타이드가 전구체 microRNA-29b와 Dicer 복합체 형성에 어떠한 작용을 하는지 확인한 실험 결과이다. (A)는 microRNA-29a 전구체와 microRNA-29b 전구체의 이차구조를 나타낸 것이다. 파란색으로 표시된 서열이 passenger strand이며, 빨간색으로 표시된 부분이 guide strand이다. (B)는 젤 쉬프트 분석(gel shift assay) 결과이다. 실험에 이용된 재조합 Dicer의 양은 30 nM이며, 펩타이드 농도는 도 3에서 처리했던 농도와 동일하고, 반응 시간은 20분이다. 젤 사진 아래에 나타낸 값은 전체 전구체 RNA에서 Dicer와 복합체를 이룬 RNA 강도(intensity)의 비율을 나타낸 것이다. 각각의 값들은 CysA5W 펩타이드를 처리하지 않고 Dicer만 존재하였을 때의 값을 1로 각각 기준으로 하여 표준화한 것이다.
도 5는 선별된 CysA5W 펩타이드가 다른 펩타이드들(13Aad-14W, HelixA)과는 달리 p53 단백질을 안정성을 증진시켜 암세포의 세포사멸이 증가한 것을 나타낸 결과이다. (A)는 단백질 생합성을 억제시키는 사이클로헥시마이드(Cycloheximide; CHX)을 처리하여 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)으로 p53 단백질 수준을 확인하였다. GAPDH 단백질은 로딩 대조구(loading control)로써 사용되었다. (B)는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)을 이용한 세포사멸 집단(apoptotic cell population)을 측정할 수 있는 유세포 분류기(Fluorescence-activated cell sorting; FACS)의 분석 결과이다. 50 μM 에토포시드(Etoposide)는 p53에 의한 세포사멸이 잘 일어나는 양성 대조구로써 이용되었다.
도 6은 CysA5W 펩타이드가 다른 암세포인 MCF7 유방암세포에서도 microRNA-29b와 p53 단백질 안정성을 증진시켜 세포사멸이 유발되는 것을 나타낸 결과이다. (A) 그래프는 Taqman microRNA 분석으로 microRNA-29b의 상대 정량을 나타낸 것이고, (B)는 웨스턴 블럿 분석을 통해 p53 단백질 안정성을 확인한 것이다. GAPDH 단백질은 로딩 대조구(loading control)로써 사용되었다. (C)는 프로피디움 요오드화물을 이용한 세포사멸 집단(apoptotic cell population)을 측정할 수 있는 유세포 분리기(FACS)의 분석 결과이다. 50 μM 에토포시드(Etoposide)는 p53에 의한 세포사멸이 잘 일어나는 양성 대조구로써 이용되었다.
도 7은 CysA5W 펩타이드가 p53 활성을 증가시키기 위해 반드시 microRNA-29b 생성을 통해서만 증진시킬 수 있음을 증명한 실험 결과이다. microRNA-29b의 안티센스 RNA에 2'O-메틸화시킨 RNA(항-miR29b)를 제작하여, HeLa와 MCF7 세포에 각각 처리하여 내생의 miR29b(endogenous miR29b)의 수준을 억제시킨 후, CysA5W 펩타이드로 인해 p53 단백질이 안정화되는지 웨스턴 블럿으로 확인하였다. GAPDH 단백질은 로딩 대조구(loading control)로써 사용되었다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CysA5W 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서 용어, "펩타이드(peptide)"란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, microRNA-29b 생성을 증가시키고, 종양 억제 단백질 p53의 안정성을 증진시키는 펩타이드를 의미한다.

본 발명에 따른 CysA5W 펩타이드의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 암 예방 또는 치료에 대한 활성을 의미한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 CysA5W 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 암은 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 간암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 담낭암, 구강암, 결장암, 간암, 방광암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 자궁경부암 또는 유방암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 CysA5W 펩타이드는 MicroRNA-29b 생성을 증가시켜 p53 단백질을 안정화시킴으로써 항암 효과를 유발하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 CysA5W 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 CysA5W 펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 CysA5W 펩타이드 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다. 또한 CysA5W 펩타이드의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항암보조제용 건강기능식품에서, 상기 건강 기능성 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 CysA5W 펩타이드를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강 기능성 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항암보조제용 건강기능식품에서, 상기 CysA5W 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항암보조제용 건강기능식품에서, 상기 암은 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 간암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 담낭암, 구강암, 결장암, 간암, 방광암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 자궁경부암 또는 유방암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 CysA5W 펩타이드를 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항암보조제용 건강기능식품에서, 상기 CysA5W 펩타이드는 MicroRNA-29b 생성을 증가시켜 p53 단백질을 안정화시킴으로써 항암 효과를 유발하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

세포 배양

본 실험에서 이용된 세포는 자궁경부암세포인 HeLa와 유방암세포인 MCF7이다. HeLa 세포는 microRNA-29의 발현이 매우 낮아 독시사이클린(doxycycline; dox)에 의해 유도되는 시스템이 구축되어있는 세포주(inducible miR29a/b HeLa)를 이용하였다. 두 세포 모두 DMEM(Welgene) 배지에 10%(v/v) Fetal Bovine Serum(FBS, Welgene)을 첨가한 배지에 넣고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

펩타이드 합성

본 실험에서 이용된 펩타이드는 일반적인 고체상 펩타이드 합성(solid-phase peptide synthesis)을 통해 합성되었다. 합성된 펩타이드의 N-말단에 아세틸화(acetylation) 시킨 후, HPLC(Agilent 1100)로 분리하여 MALDI-TOF/TOF로 확인한 후, 정제하였다.

세포 생존율 측정

본 실험에서 우선 p53 활성으로 인한 세포사멸을 증가시키는 항암 펩타이드를 선별하기 위해 세포 생존율 측정(MTS assay) 실험을 실시하였다. 알파 나선구조를 가지며 16~18개의 무작위 아미노산 서열을 가진 펩타이드 81개를 유도성 miR29a/b HeLa 세포에 독시사이클린(dox)과 함께 처리한 후, 72시간 뒤에 MTS 용액(Promega)을 넣는다. 한 시간 후에 마이크로플레이트 리더(microplate reader) 기계로 490 nm 파장에서 시그널을 검출한다.

정량적 실시간 PCR(Taqman microRNA assay )

본 실험에서 유도성 miR29a/b HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 심고 펩타이드(1 μM)와 독시사이클린(dox)을 처리한 24시간 후에 TriReagent(Ambion) 시약을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. Applied Biosystem 사의 Taqman microRNA assay Kit을 이용하여 microRNA-29b 특이적으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 Taqman microRNA assay kit에 있는 마스터 믹스(master mix)로 PCR 반응을 Light Cycler II 480(Roche) 기계로 수행하여 Ct값을 얻었다. U6 snRNA는 내부 대조구(internal control)로써 이용되었고, microRNA-29b의 발현 값을 U6 발현 값으로 표준화하였다.

p53 활성을 측정할 수 있는 루시퍼라제 분석( luciferase assay )

본 실험에서는 p53 활성을 측정하기 위해 루시퍼라제 유전자 업스트림(upstream)에 13개의 p53-결합 자리가 존재하는 플라스미드(pG13-luciferase plasmid)를 이용하여 실험을 수행하였다. 먼저 유도성 miR29a/b HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 심고, 펩타이드(1μM)와 독시사이클린(dox)을 처리한 3시간 후에 pG13-루시퍼라제 플라스미드(Firefly luciferase)와 Renilla 루시퍼라제 벡터를 함께 세포 안으로 주입시켰다. 24시간 배양 후에 Promega사의 듀얼-루시퍼라제 분석 키트(Dual-luciferase assay kit)로 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 화이어플라이(Firefly) 루시퍼라제(Firefly luciferase) 활성 값을 Renilla 루시퍼라제 활성 값으로 표준화하였다.

시험관 내 Dicer 또는 Drosha 프로세싱 분석( Dicer or Drosha processing assay )

본 실험에서 선별된 CysA5W 펩타이드가 microRNA 생성과정에서 어떤 단계에서 영향을 미치는지 알아보기 위해 시험관 분석(in vitro processing assay)를 수행하였다. 이 실험을 수행하기 위해 primary microRNA와 microRNA 전구체를 합성하였다. Primary microRNA는 일반적인 시험관 내 전사(in vitro transcription) 방법으로 합성하였는데, primary microRNA-29b 서열을 포함한 게놈 DNA 부위를 PCR로 증폭시킨 후, T7 프로모터가 포함되어 있는 벡터에 클로닝하였다. 이때 이용된 프라이머들은 다음과 같다: 정방향 프라이머, 5'-CTTTTCCTTTCTAGGTTGTCTTGGG-3'(서열번호 2), 역방향 프라이머, 5'-AAGGGGTCAGCTACATGTGA-3'(서열번호 3). 클로닝된 플라스미드를 선형(linear)으로 만들어 준 후, T7 RNA 폴리머라제와 NTP mix(각각 10 mM ATP, GTP, CTP 및 1 mM UTP), [α-³²P]UTP을 사용하여 37℃에서 3시간 반응시켰다. 그 후, 12% 우레아-폴리아크릴아미드 겔(urea-PAGE) 상에서 전기영동 하여 primary microRNA-29b 전사체를 분리 정제하였다. MicroRNAs 전구체들은 두 가닥의 단일 가닥 RNA을 바이오니어사에서 합성하여, 한가닥의 RNA로 연결(ligation)시켰다. 그 후, T4 Polynucleotide kinase(Takara)와 [γ-³²P]ATP을 이용하여 5' 말단 라벨링을 하였다. 12% 우레아-PAGE 상에서 전기 영동하여 microRNA 전구체들을 분리 정제하였다.

다음, 본 발명에서 이용된 Dicer와 Drosha는 IP(immunoprecipitation) 방법을 통해 얻어내었다. Flag tag으로 연결되어 있는 Dicer 또는 Drosha 단백질을 세포 내에서 과발현시킨 후, 세포 용해 버퍼(20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1%(v/v) Triton X-100)를 넣고 음파처리(sonication)로 세포질을 깨서 세포 용해물을 얻어내었다. 그 후, anti-Flag bead(anti-Flag M2 affinity gel)을 이용하여 4℃에서 한 시간 동안 IP(immunoprecipitation)하였다. 세포 용해 버퍼로 3번, 버퍼 D(20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 200 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 20%(v/v) Glycerol, 1 mM DTT)로 4번 세척한 후, 시험관 내 Dicer 분석 실험(in vitro Dicer processing assay)을 수행하였다. 그리고 Drosha는 세포 용해 버퍼(20 mM Tris-Cl at pH8.0, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA)로 7번 세척 후, 시험관 내 Drosha 분석 실험(in vitro Drosha processing assay)을 실시하였다. 시험관 내 Dicer 반응은 총 10 ㎕에서 20 mM MgCl₂ 1 ㎕, 20 mM DTT 0.5 ㎕, ³²P-labeled 전구체 RNAs 0.5 ㎕, Dicer-IP 5㎕에 펩타이드(CysA5W, 13Aad-14W, HelixA)와 함께 37℃에서 반응시켰다. 그렇게 반응시킨 RNA들을 12% 우레아-PAGE 상에서 전기 영동하여 분리시킨 후, 이미지 필름에 노출시킨 뒤 BAS-2500(Fuji) 기계로 시그널을 검출하였다. 시험관 내 Drosha 반응은 총 10 ㎕에서 64 mM MgCl₂ 1 ㎕, ³²P-labeled primary microRNA-29b 0.5 ㎕, Drosha-IP 5㎕에 펩타이드(CysA5W, 13Aad-14W, HelixA)와 함께 37℃에서 반응시켰다. 그렇게 반응시킨 RNA들을 10% 우레아-PAGE 상에서 전기영동하여 분리시킨 후, 이미지 필름에 노출시킨 뒤 BAS-2500(Fuji) 기계로 시그널을 검출하였다.

전구체 microRNA -29b와 Dicer 복합체 형성 실험인 겔 쉬프트 분석( gel shift assay )

본 실험에서 CysA5W 펩타이드가 전구체 microRNA-29b와 Dicer 단백질의 복합체에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 겔 쉬프트 분석을 실시하였다. 이 실험에 이용된 전구체 microRNA는 앞서 언급했듯이 5'-말단 라벨링을 통해 준비되었고, Dicer 단백질은 재조합 Dicer로 실험에 사용되었다. 분석 반응은 30 nM 재조합 Dicer, ~0.2 nM의 ³²P-labeled 전구체 microRNA-29a와 microRNA-29b, 1 ㎍ BSA(Takara), 1 mM DTT, 결합 버퍼(20 mm HEPES, pH7.4, 50 mM KCl, 0.5 mM EDTA, 10%(v/v) Glycerol)와 CysA5W 펩타이드를 넣고 30℃에서 반응시켰다. 그 후 반응물들을 6% non-denaturing PAGE에 분리하여 이미지 필름에 노출시킨 뒤 BAS-2500(Fuji) 기계로 시그널을 검출하였다.

p53 단백질 안정성을 확인하는 웨스턴 블럿 실험

본 실험에서 microRNA-29b가 표적으로 하는 암 발생에 중요한 열쇠가 되는 p53 단백질의 활성을 확인하기 위해 단백질 양을 확인할 수 있는 웨스턴 블럿 실험을 실시하였다. 유도성 miR29a/b HeLa 또는 MCF7 세포를 60 mm 디쉬에 심고, 펩타이드(CysA5W, 13Aad-14W, HelixA)를 1 μM을 처리하였다. 24 시간 후에 PBS로 세포를 모았다. RIPA 버퍼로 총 단백질을 뽑아 10% SDS-PAGE 젤에 전기영동으로 분리하여, PVDF 막(Millipore)에 옮겼다. 0.1%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(PBS-T)에 5%(w/v) 스킴 밀크(BD)로 만든 것으로 블럭킹하고, 산타크루즈사의 항-p53 마우스 항체(anti-p53 mouse antibody)를 1%(w/v) BSA에 담아 결합시켰다. Jackson 사의 항-마우스 IgG HRP-콘쥬케이트 항체(Donkey anti-mouse antibody)를 이차로 붙였다. ECL 용액(Thermo Scientific)으로 반응시켜 X-레이 필름에 노출시킨 후 밴드를 확인하였다. 로딩 대조구로써 항-GAPDH 마우스 항체(anti-GAPDH mouse antibody)가 이용되었고, 동일한 이차항체로 실험을 진행하여 단백질을 검출하였다.

세포사멸 집단( Apoptotic cell population )을 측정할 수 있는 FACS(Fluorescence-activated cell sorting )

본 실험에서 CysA5W 펩타이드로 인해 p53 활성이 증가되어 세포사멸이 높게 유도되는지 확인하기 위해 세포사멸 집단(apoptotic cell population)을 측정할 수 있는 FACS를 수행하였다. 유도성 miR29a/b HeLa 또는 MCF7 세포를 100 mm 디쉬에 심고, 1 μM의 펩타이드(CysA5W, 13Aad-14W, HelixA)와 양성 대조구인 50 μM 에토포시드(Sigma)를 각각 처리하고 48시간 후에 PBS로 세포를 모았다. 70%(v/v) 에탄올로 4℃에서 16시간 세포 고정을 시킨 후, 프로피디움 요오드화물(50 ㎍/ml)과 RNase A(5 ㎍/ml)를 처리하여 세포 염색을 시켰다. 염색된 세포들을 FACS AriaII(Becton Dickinson) 기계로 DNA 함량을 분석하였고, FlowJo 소프트웨어를 이용하여 그래프로 나타내었다.

내생의 microRNA -29b 발현을 억제시키기 위해 안티센스 microRNA -29b을 이용한 세포주입( transfection ) 실험

본 실험에서 사용된 안티센스 microRNA-29b는 Bioneer 사에서 합성하였고, 2'-O-메틸화한 RNA(anti-miR29b)로 microRNA-29b 수준을 감소시키고자 하였다. 먼저 유도성 miR29a/b HeLa 또는 MCF7 세포를 60 mm 디쉬에 심고, 1 μM CysA5W 처리와 동시에 항-miR29b(anti-miR29b) 또는 대조구로써 이용된 항-siGFP(anti-siGFP)를 각각 세포 안에 리포펙타민 2000(Lipofectamine, Invitrogen)으로 주입시켰다. 24시간 동안 배양한 후, 총 RNA을 분리 정제하여 Taqman microRNA 분석을 실시하거나 단백질을 뽑아 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 이 실험에 이용된 항-RNA의 서열은 다음과 같다: 항-miR29b, 5'-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3'(서열번호 4), 항-siGFP, 5'-AACAUCGCCAUCUAAUUCA-3'(서열번호 5).

실시예 1. p53 활성으로 인한 세포사멸을 증진시키는 펩타이드 1차 선별

본 실험에서 알파 나선 구조를 가지는 81개의 다른 펩타이드에서 p53 활성으로 인한 세포사멸을 증진시킬 수 있는 펩타이드를 선별하기 위해 세포 생존율 실험을 실시하였다. 독시사이클린에 의해 microRNA-29 발현이 유도되는 시스템이 구축된 HeLa 세포(inducible miR29a/b HeLa)에 펩타이드를 각각 처리한 후, 72시간이 지난 뒤 MTS 분석을 통해 세포생존율을 측정하였다. 생존율이 가장 낮은 9개의 후보 펩타이드를 우선적으로 선별하였다(도 1).

실시예 2. 1차 선별된 9개 펩타이드 중 microRNA -29b와 p53 활성을 증가시키는 2차 펩타이드 선별

우선적으로 선별된 9개의 후보 펩타이드 중 microRNA-29b와 p53 활성을 모두 증가시키는 펩타이드를 선별하기 위해 Taqman microRNA 분석(도 2A)과 p53 루시퍼라제 분석(도 2B)을 수행하였다. 각 실험에서 공통적으로 선별된 펩타이드는 CysA5W로, 그 서열은 도 2C에 나타내었다.

실시예 3. 선별된 CysA5W 펩타이드가 전구체 microRNA -29b에서 Dicer 활성을 증진시켜 성숙된 microRNA -29b의 생성을 촉진시켰다.

본 실험에서는 선별된 CysA5W 펩타이드가 microRNA 생성과정에서 어떤 기작으로 작용하는지 알아보기 위해, 시험관내 분석(in vitro processing assay)을 수행하였다. MicroRNA 생성과정에 중요한 역할을 하는 두 단백질(Drosha와 Dicer)의 작용을 확인하고자 하였다. 먼저 Drosha 작용에서 CysA5W 펩타이드가 다른 펩타이드(13Aad-14W, HelixA)와 mock control 결과와 유사함을 확인하였다(도 3D). 이 결과로 볼 때, CysA5W 펩타이드는 Drosha 활성과 무관함을 알 수 있다. 다음 Dicer 작용에서 CysA5W 펩타이드의 영향을 알아보았다(도 3A-C). MicroRNA-29a 또는 let-7a과는 달리 microRNA-29b에서만 CysA5W 펩타이드가 존재할 때, Dicer 활성이 증가함을 보였다(도 3A-C). 이 결과들로 보아 CysA5W 펩타이드는 특이적으로 전구체 microRNA-29b의 Dicer 작용만 증진시킴을 알 수 있다.

실시예 4. 선별된 CysA5W 펩타이드가 전구체 microRNA -29b와 Dicer 복합체를 좀 더 효율적으로 형성하도록 도움주었다 .

CysA5W 펩타이드가 특이적으로 전구체 microRNA-29b에 대한 Dicer processing이 어떤 메커니즘으로 작용하는지 알아보기 위해 젤 쉬프트 분석(gel shift assay)을 수행하였다. 서열이 거의 유사한 전구체 microRNA-29a와 전구체 microRNA-29b를 비교하였을 때, 이차 구조에서 루프(loop) 부분은 유사하지만 스템(stem) 부분에서 차이를 보였다(도 4A). 이러한 차이로 CysA5W 펩타이드가 선택적으로 전구체 microRNA-29b에 작용하여 Dicer와 복합체를 좀 더 효율적으로 형성되도록 도움을 준다는 것을 알 수 있었다(도 4B).

실시예 5. 선별된 CysA5W 펩타이드가 다른 펩타이드와는 달리 p53 단백질의 안정성을 증진시켜 세포사멸을 높게 유발시켰다.

일반적으로 p53 단백질은 매우 불안정하기 때문에 CysA5W 펩타이드가 존재하였을 때 어떻게 영향을 받는지 확인해 보기 위해, 단백질 생합성을 억제시키는 사이클로헥사마이드(Cycloheximide, CHX)을 이용하여 p53 단백질 안정성을 테스트 하였다. 단백질은 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였다. 도 5A에서 보면, 다른 펩타이드(13Aad-14W, HelixA)와는 달리 CysA5W 펩타이드를 처리하였을 때에 p53 단백질은 안정화되었다. 이 결과를 기반으로 CysA5W 펩타이드가 세포사멸을 더 많이 유발시키는지 확인해 보기 위해 FACS 실험을 실시하였다. 그 결과, CysA5W 펩타이드를 처리한 샘플에서 양성 대조구로써 이용된 에토포시드와 비슷하게 높은 세포사멸 집단(apoptotic cell population)이 측정되었다(도 5B).

실시예 6. CysA5W 펩타이드가 다른 암세포인 MCF7 에서도 microRNA -29b와 p53 단백질 활성을 모두 증진시켜 세포사멸을 유도하였다.

CysA5W 펩타이드가 HeLa 세포뿐만 아니라 다른 암세포주인 유방암세포 MCF7에서도 microRNA-29b와 p53 단백질 안정성을 모두 증진시켜 세포사멸을 유도하는지 확인하였다(도 6). 그 결과, CysA5W 펩타이드가 존재할 때 microRNA-29b 생성이 증가되고(도 6A), p53 단백질도 안정화되었다(도 6B). 더불어 세포사멸 집단도 증가함을 확인할 수 있었다(도 6C).

실시예 7. CysA5W 펩타이드는 microRNA -29b 생성을 통해서 p53 단백질을 안정화시킬 수 있음을 확인하였다.

본 실험에서 CysA5W 펩타이드가 microRNA-29b 생성을 증진시킴으로써 p53 활성에 영향을 주는 것인지 아닌지 확인하기 위해 내생의 microRNA-29b 수준을 억제시켜 p53 단백질 양상을 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 유도성 miR29a/b HeLa 또는 MCF7 세포에 CysA5W 펩타이드를 처리하고, 항-miR29b를 주입시켰다. 24시간 후, 총 RNA을 뽑아 Taqman microRNA 분석을 수행하여 microRNA-29b 수준을 확인하였다(도 7A). 그 결과 대조구로써 이용된 항-siGFP를 처리한 샘플과 비교하였을 때, 성공적으로 microRNA-29b가 억제된 것을 확인할 수 있었다(도 7A). 다음, p53 단백질의 안정성 양상을 테스트해 본 결과, CysA5W 펩타이드가 존재하여도 microRNA-29b 생성이 제대로 이루어지지 않았을 때 다른 대조구 샘플들과 유사하게 p53 단백질이 분해된다는 것을 알 수 있었다(도 7B). 이를 통해, CysA5W 펩타이드는 microRNA-29b의 생성을 통해서 p53 단백질을 안정화시킬 수 있음을 확인하였다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising CysA5W peptide as effective component <130> PN14358 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CysA5W peptide <400> 1 Cys Lys Lys Leu Leu Trp Leu Cys Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cttttccttt ctaggttgtc ttggg 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaggggtcag ctacatgtga 20 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR29b <400> 4 aacacugauu ucaaauggug cua 23 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-siGFP <400> 5 aacaucgcca ucuaauuca 19

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CysA5W 펩타이드.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 암은 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 간암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 담낭암, 구강암, 결장암, 간암, 방광암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 CysA5W 펩타이드는 MicroRNA-29b 생성을 증가시켜 p53 단백질을 안정화시킴으로써 항암 효과를 유발하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물 내에 투여하는 단계를 포함하는, 암세포에 대한 세포사멸 증진 방법.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CysA5W 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항암보조제용 건강기능식품.
제6항에 있어서, 상기 암은 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 간암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 담낭암, 구강암, 결장암, 간암, 방광암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암보조제용 건강기능식품.
제6항에 있어서, 상기 CysA5W 펩타이드는 MicroRNA-29b 생성을 증가시켜 p53 단백질을 안정화시킴으로써 항암 효과를 유발하는 것을 특징으로 하는 항암보조제용 건강기능식품.