KR101605883B1 - 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 및 항암 보조용 약학적 조성물, 그리고 항암 효과 증진 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상기 PKM2의 발현 또는 활성 억제제는 암세포 내에 존재하는 PKM2를 감소(depletion)시켜서 항암제에 의한 세포사멸(apoptosis)을 촉진하는 효과가 있으므로, 항암제 민감성 증진용 및 항암 보조용 약학적 조성물 및 항암 효과 증진 방법에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 및 항암 보조용 약학적 조성물, 그리고 항암 효과 증진 방법에 관한 것이다.
암을 치료하는 방법은 크게 수술, 방사선 치료, 항암화학요법, 그리고 생물학적 치료법 등으로 나눌 수 있다. 구체적으로, 수술은 광범한 전이를 완전하게 제거할 수 없는 한계가 있으며, 방사선 요법은 방사선을 표적 암세포에 선택적으로 전달할 수 없다는 한계가 있고, 면역요법은 환자에 치명적인 독성을 수반하는 한계가 있다. 위와 같은 한계를 고려하여, 암환자 중 수술이나 방사선치료가 용이하지 않는 환자(전체 암 사례의 약 50%)와, 이미 암이 전이된 환자들은 주로 화학요법으로 치료한다.
항암화학요법에 사용되는 약제의 경우 다양한 종류의 암세포주 및 동물 종양 모델을 이용한 효능평가를 통해 항암효과를 갖는 성분을 분리해내기 위한 노력이 계속되고 있다. 알킬화제인 사이클로포스파미드, 대사 길항제인 메토트랙 세이트, 플루오로우라실, 젬시타빈, 항생 물질인 아드리아마이신, 마이토마이신, 블레오마이신, 식물 유래의 택솔, 빈크리스틴, 에토포사이드, 금속 착물인 시스플라틴 등을 항암치료에 사용하고 있으며 암의 전이 예방에 대한 항암화학요법의 연구도 활발히 진행되어 암의 확산 및 전이 방지에 관여하는 앤지오스타틴(angiostatin) 등이 개발되었다. 이렇듯 항암화학요법제는 점점 더 많이 개발되고 아울러 처치하는 요법도 복잡해지고 있지만 아직까지 만족할만한 효과적인 치료법은 나타나고 있지 않다. 그 이유는 항암제 대부분이 분열이 왕성한 세포의 세포주기를 멈추게 하고 사멸케 하는 메커니즘으로 작동하는데, 이로 인해 암세포 이외에도 정상적으로 분열하는 세포를 공격해서 항암제의 대표적 부작용인 탈모, 식욕부진 그리고 백혈구 감소로 인한 면역력 저하 등이 일어나기 때문이다.
또한, 항암화학요법을 이용한 암치료에 있어서 장애가 되는 요소 중의 하나는 항암제 내성(resistance to anti-cancer agents)이다. 암환자에 대한 항암화학요법이 성공하기 위해서는 정상조직이 살아남을 수 있는 혈중농도에서 환자는 부작용을 감수할 수 있어야 하고 암세포는 살해되어야 하는데, 항암제에 대한 약제내성은 암세포를 죽일 수 있는 혈중농도에 도달할 수 있는 양의 항암제를 투여했음에도 불구하고 암세포가 죽지 않는 경우를 말한다. 항암제내성은 환자 개개에 따라 다를 수 있으며 심지어 같은 조직으로부터 유래된 종양들 사이의 유전적 차이 등을 포함한 다양한 인자들에 의해 유발될 수 있다.
이러한 이유로, 새로운 치료방법(예를 들어, 항혈관형성제, 유전자 요법 등)이 연구되고 있지만, 이들 치료방법에 대한 연구는 아직 초기 단계이다.
따라서, 최근 화학요법이 갖는 이점을 유지하면서, 항암제 내성을 극복하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있는 추세이다. 항암제 내성과 관련된 연구는 다음과 같다. 예를 들면, 미국특허 제5,646,011호, 제5,846,725호, 및 제6,046,044호에서는 시스플라틴 민감 세포에 비교하여 시스플라틴 내성 세포에서 적어도 5배 이상 발현되는 항암제 내성 유전자 염기서열을 확인하고, 이의 합성을 개시하고 있다. 미국특허 제5,942,389호에서는 항암제에 내성을 갖는 유전적 억제제 요소(genetic suppressor elements)를 확인하고, 이를 이용하여 항암제에 대한 내성을 검색하는 방법을 개시하였다. 그러나, 현재까지는 항암제 내성 원인 및 기작, 극복방법에 대해 만족할 만한 결과를 얻지 못하고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 최근 암세포에서 호기적 해당(aerobic glycolysis) 및 대사과정에서의 중요성이 대두되고 있는 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)를 연구하던 끝에, PKM2의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 이용하여 암세포 내의 PKM2을 감소(depletion)시키면 암세포의 항암제에 대한 민감도가 높아지고 이에 암세포의 세포증식이 감소하는 것을 확임함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 암세포의 항암제에 대한 민감도 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 건강기능 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
(1)피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성이 증가된 항암제 내성 세포주를 준비하는 단계;
(2)상기 단계(1)의 세포주에 실험군으로 후보물질을 처리하고, 대조군으로 후보물질을 처리하지 않는 단계; 및
(3)상기 단계(2)의 실험군 및 대조군의 PKM2의 발현 또는 활성을 측정하여, 대조군에 비해 PKM2의 발현 또는 활성을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 내성 억제제 또는 항암제 민감성 증진제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 암세포의 항암제에 대한 민감도 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 건강기능 식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 (1)피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성이 증가된 항암제 내성 세포주를 준비하는 단계;
(2)상기 단계(1)의 세포주에 실험군으로 후보물질을 처리하고, 대조군으로 후보물질을 처리하지 않는 단계; 및
(3)상기 단계(2)의 실험군 및 대조군의 PKM2의 발현 또는 활성을 측정하여, 대조군에 비해 PKM2의 발현 또는 활성을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 내성 억제제 또는 항암제 민감성 증진제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 PKM2(Pyruvate kinase type M2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 및 항암 보조용 약학적 조성물, 그리고 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 암세포의 항암제에 대한 민감도 증진 방법에 관한 것으로, 구체적으로 암세포내의 PKM2의 감소(depletion)가 p53의 46번째 아미노산인 세린(serine)의 인산화를 촉진함으로써, 세포사멸(apoptosis)를 더욱 촉진하여 암세포의 생존율을 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 이용한 세포사멸의 촉진을 통해 항암제 민감성 증진제, 항암 보조제 및 암세포의 항암제에 대한 민감도 증진 방법에 사용될 수 있음을 확인하였다.
도 1a는 췌장암 세포주 Capan-1, MIA PaCa-2 및 BxPc-3의 젬시타빈 처리에 따른 세포생장을 측정한 도이고,
도 1b는 췌장암 세포주 Capan-1, MIA PaCa-2 및 BxPc-3의 PKM2를 녹다운시킨 후 세포생장을 측정한 도이고(shControl : PKM2를 녹다운 시키지 않은 군,shPKM2 : PKM2를 녹다운시킨 군),
도 1c는 MIA PaCa-2 및 BxPc-3 세포주에 대하여, PKM2를 녹다운시킨 (shPKM2)군과 그렇지 않은 군(shControl)의 젬시타빈 치료에 의한 세포생장을 측정한 도이고,
도 2a는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 세포의 생존 세포 및 사멸 세포를 도시한 도이고(suspension cells : 죽은 세포, adherent cells : 생존세포),
도 2b는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 투여된 젬시타빈의 농도에 대한 caspase3 및 caspase7의 활성을 측정한 도이고,
도 2c는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 투여된 젬시타빈의 농도에 대한 cleaved PARP, BAX, β-actin 단백질의 발현수준을 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 측정한 도이고,
도 3a는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 투여된 젬시타빈의 농도에 대한 p53 리포터의 활성을 측정한 도이고(untreated : 젬시타빈 치료하지 않은 군),
도 3b는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 투여된 젬시타빈의 농도에 대한 PKM2, p53, CDKN1A, BAK1, Bcl-xL, β-actin의 발현 수준을 역전사 중합효소 연쇄반응에 의해 측정한 도이고,
도 3c는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, PKM2의 녹다운 여부 및 젬시타빈의 투여량에 따른 p53, 인산화된 p53,β-actin 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블랏을 통해 측정한 도이고(p-p53(s46) : 46번째 세린이 인산화된 p53, p-p53(s20) : 20번째 세린이 인산화된 p53, p-p53(s15) : 15번째 세린이 인산화된 p53),
도 4a는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 세포생장을 측정한 도이고,
도 4b는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 대조군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 생존세포(adherent cells) 및 죽은세포(suspension cells)의 수를 도식화한 도이고,
도 4c는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 대조군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 p53 리포터의 활성을 측정한 도이고,
도 4d는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 대조군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 MYC, p53, 인산화된 p53(46번째 아미노산인 세린이 인산화된 p53), cleaved PARP, β-actin의 발현 수준을 웨스턴 블랏에 의해 측정한 도이고,
도 4e는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 대조군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 PKM2, p53, CDKN1A, BAK1, β-actin의 발현 수준을 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의해 측정한 도이고,
도 5a는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈의 투여 후 시간 경과에 따른 PKM2 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏에 의해 측정한 도이고,
도 5b는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈의 투여 후 시간 경과에 따른 PKM2 및 β-actin의 RNA 발현 수준을 역전사 중합효소 연쇄반응에 의해 측정한 도이고,
도 5c는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈의 투여 후 시간 경과에 따른 핵내의(nu) PKM2, Lamin B 및 ERK1/2 단백질의 발현 수준과 세포질내(cyto)의 PKM2 및 ERK1/2 단백질의 발현수준의 변화를 측정한 도이고,
도 5d는 젬시타빈 내성에 대한 PKM2의 유(좌측)무(우측)에 따른 세포자살의 기작을 도식화한 도이다.
도 1b는 췌장암 세포주 Capan-1, MIA PaCa-2 및 BxPc-3의 PKM2를 녹다운시킨 후 세포생장을 측정한 도이고(shControl : PKM2를 녹다운 시키지 않은 군,shPKM2 : PKM2를 녹다운시킨 군),
도 1c는 MIA PaCa-2 및 BxPc-3 세포주에 대하여, PKM2를 녹다운시킨 (shPKM2)군과 그렇지 않은 군(shControl)의 젬시타빈 치료에 의한 세포생장을 측정한 도이고,
도 2a는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 세포의 생존 세포 및 사멸 세포를 도시한 도이고(suspension cells : 죽은 세포, adherent cells : 생존세포),
도 2b는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 투여된 젬시타빈의 농도에 대한 caspase3 및 caspase7의 활성을 측정한 도이고,
도 2c는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 투여된 젬시타빈의 농도에 대한 cleaved PARP, BAX, β-actin 단백질의 발현수준을 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 측정한 도이고,
도 3a는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 투여된 젬시타빈의 농도에 대한 p53 리포터의 활성을 측정한 도이고(untreated : 젬시타빈 치료하지 않은 군),
도 3b는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 군과 젬시타빈 치료 및 PKM2 녹다운을 병행한 군의 투여된 젬시타빈의 농도에 대한 PKM2, p53, CDKN1A, BAK1, Bcl-xL, β-actin의 발현 수준을 역전사 중합효소 연쇄반응에 의해 측정한 도이고,
도 3c는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, PKM2의 녹다운 여부 및 젬시타빈의 투여량에 따른 p53, 인산화된 p53,β-actin 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블랏을 통해 측정한 도이고(p-p53(s46) : 46번째 세린이 인산화된 p53, p-p53(s20) : 20번째 세린이 인산화된 p53, p-p53(s15) : 15번째 세린이 인산화된 p53),
도 4a는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 세포생장을 측정한 도이고,
도 4b는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 대조군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 생존세포(adherent cells) 및 죽은세포(suspension cells)의 수를 도식화한 도이고,
도 4c는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 대조군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 p53 리포터의 활성을 측정한 도이고,
도 4d는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 대조군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 MYC, p53, 인산화된 p53(46번째 아미노산인 세린이 인산화된 p53), cleaved PARP, β-actin의 발현 수준을 웨스턴 블랏에 의해 측정한 도이고,
도 4e는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 아무런 조치를 취하지 않은 대조군(shControl+Mock), PKM2를 녹다운 시킨 군(shPKM2+Mock) 및 PKM2를 녹다운 시킨 후 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2)를 도입한 군(shPKM2+mPKM2)의 투여된 젬시타빈 농도에 따른 PKM2, p53, CDKN1A, BAK1, β-actin의 발현 수준을 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의해 측정한 도이고,
도 5a는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈의 투여 후 시간 경과에 따른 PKM2 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏에 의해 측정한 도이고,
도 5b는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈의 투여 후 시간 경과에 따른 PKM2 및 β-actin의 RNA 발현 수준을 역전사 중합효소 연쇄반응에 의해 측정한 도이고,
도 5c는 MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈의 투여 후 시간 경과에 따른 핵내의(nu) PKM2, Lamin B 및 ERK1/2 단백질의 발현 수준과 세포질내(cyto)의 PKM2 및 ERK1/2 단백질의 발현수준의 변화를 측정한 도이고,
도 5d는 젬시타빈 내성에 대한 PKM2의 유(좌측)무(우측)에 따른 세포자살의 기작을 도식화한 도이다.
이하, 본 발명에서 사용된 용어를 설명한다.
본 발명에 사용된 용어 "발현 억제제"란, PKM2의 발현을 억제할 수 있는 임의의 물질을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "활성 억제제"란, PKM2의 활성을 억제할 수 있는 임의의 물질을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "세포자살(apoptosis)" 이란, 우리 몸 안에 입력되어 있는 생체 프로그램으로 비정상 세포, 손상된 세포, 노화된 세포가 스스로 자살해 사멸하는 메커니즘을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "항암제"란, 통상 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 화학요법제의 총칭이다.
본 발명에 사용된 용어 "siRNA"는 그 표적 유전자의 RNA에 대해서 RNAi 현상을 유도할 수 있는 10 내지 40 염기쌍을 갖는 이중 가닥 RNA, 바람직하게는 15 내지 30의 염기쌍을 갖는 이중 가닥 RNA, 더 바람직하게는 20 내지 22 염기쌍을 갖는 이중 가닥의 RNA를 의미한다. 이러한 siRNA는 블런트(blunt) 말단을 갖거나 돌출(overhang) 말단을 가질 수 있으며, 돌출 말단을 가질 경우 그것은 3'말단과 '5말단 모두에서 가능하다. 바람직하게는 3'말단이 돌출된 경우이다. 돌출된 말단의 염기수는 1 내지 5, 바람직하게는 2 내지 3 염기일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "shRNA"는 2 내지 10 염기의 루프(loop) 영역을 갖는 헤어핀 구조의 이중 가닥 RNA를 말한다. 이러한 루프 영역의 염기는 당업계에 공지된 것들을 사용할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. US A 99(8): 5515-5520, 2002; Nature Biotechnology 20: 505-508, 2002; Nature Biotechnology 20 : 500-505, 2002; Nat Cell Biol. 5:489-490, 2003; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002). shRNA의 이중 가닥 부분은 상기 siRNA와 동일하게 구성할 수 있으므로 siRNA와 관련한 설명이 그대로 적용된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 발현 또는 활성 억제제는, PKM2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA, 및 shRNA 또는 PKM2 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체일 수 있으나 이에 한정되지 않고, 당업자에 알려진 모든 공지의 방법을 통해 이루어질 수 있다.
상기 항암제는 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 니무스틴(Nimustine), 젬시타빈(Gemcitabine), 파이브에프유(5-Fluorouracil, 5-FU), 테가후르우라실(UFT), 독소루빈(Doxorubin), 에피루비신(Epirubicin), 미토마이신(mitomycin) , 플레오마이신(phleomycin), 파클리탁셀(Paclitaxel) , 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(Oxaliplatin) , 이리노테칸(Irinotecan), 에토포시드(etoposide), 액시티닙(Axitinib), 타세바(Tarceva), 카무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustin), 스트렙토조토신(streptozotocin), 프리드니손(prednisone) 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 PKM2의 발현 또는 활성 억제제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏일 수 있고, 구체적으로 0.001 ~ 1 g/kg일 수 있으며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 신경보호를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 PKM2는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 발현 또는 활성 억제제는 세포핵내(nuclear) 또는 세포질내(cytoplasmic)의 PKM2을 감소시키는 것을 특징으로 하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물을 제공하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 상기 발현 또는 활성 억제제는 P53의 인산화를 촉진하는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 상기 인산화는 p53의 46번째 아미노산인 세린(serine 46) 위치에서 일어나는 것을 특징으로 하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 항암제는 간암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암의 치료에 사용되는 항암제인, 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물을 제공하며, 상기 기재된 외에 당업자에 알려진 모든 공지의 항암제를 포함한다.
또한, 본 발명은 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 암세포의 항암제에 대한 민감도 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 건강기능 식품을 제공하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
(1)피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성이 증가된 항암제 내성 세포주를 준비하는 단계;
(2)상기 단계(1)의 세포주에 실험군으로 후보물질을 처리하고, 대조군으로 후보물질을 처리하지 않는 단계; 및
(3)상기 단계(2)의 실험군 및 대조군의 PKM2의 발현 또는 활성을 측정하여, 대조군에 비해 PKM2의 발현 또는 활성을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 내성 억제제 또는 항암제 민감성 증진제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 PKM2가 암(췌장암)세포의 항암제(젬시타빈, gemcitabine)에 대한 내성의 표적인지 확인하기 위하여, 췌장암 세포주 Capan-1 , MIA PaCa-2 및 BxPC3에 대하여 젬시타빈을 처리한 후, 각 세포주의 세포 생장(growth)를 측정한 결과, MIA PaCa-2 및 BxPC3 세포주는 Capan-2에 비하여 10배 정도의 내성이 있음을 확인하였고(도 1A),
암세포내 위치한 PKM2을 shRNA 처리를 통해 PKM2를 녹다운(knock-down)시킨 결과, MIA PaCa-2 및 BxPC3 세포주에서는 shRNA를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 크게 저하된 세포성장을 나타냄을 확인하였으며(도 1B),
젬시타빈으로 치료한 세포주 MIA PaCa-2 및 BxPC3의 PKM2를 shPKM2에 의해 녹다운 시킨 후 세포증식을 측정한 결과, 젬시타빈의 농도가 0.1μM 이상일 때, 유의적으로 PKM2 녹다운 하지 않은 세포주(대조군)에 비하여 세포증식이 크게 감소함을 확인함으로써(도 1C), 암치료에 PKM2 녹다운이 젬시타민 투여와 시너지 효과를 가질 수 있음을 확인하였고, PKM2가 젬시타빈에 대한 내성이 생긴 암 세포의 표적이 될 수 있음을 확인 할 수 있었다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, PKM2의 녹다운이 젬시타빈 유도된(gemcitabine-induced) 세포의 세포자살(apoptosis)을 증가시키는지 확인하기 위하여, MIA PaCa-2 세포주에 대하여, 젬시타빈 치료만을 한 대조군과 젬시타빈 치료와 PKM2 녹다운을 병행한 세포주의 세포증식을 측정한 결과, 젬시타빈만 처리한 세포주에 비하여 PKM2를 녹다운을 병행한 세포주에서 죽은 세포(suspend cell)가 증가함을 확인함으로써, PKM2의 감소(depletion)에 의하여 젬시타빈 유도된 세포의 젬시타빈에 대한 내성의 기작이 억제되었음을 알 수 있었고(도 2A),
PKM2를 녹다운 시킨 세포주에 젬시타빈을 처리한 후, caspase3, caspase7의 활성(activity) 및 세포자살의 마커 단백질(apoptotic marker proteins)인 cleaved PARP(cleaved procyclic acidic repetitive protein) 및 BAX의 수준을 측정한 결과 PKM2를 녹다운 시키지 않은 대조군에 비하여 모두 증가하였음을 확인함으로써, PKM2의 녹다운이 젬시타빈 유도된 암세포의 세포자살을 증가시킴을 알 수 있었다(도 2B 및 도 2C).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, PKM2의 감소(depletion)가 젬시타빈 유도된 p53의 활성을 통해 세포사멸을 증가시키는 것인지 확인하기 위하여, PKM2 녹다운시킨 세포주에 p53 루시퍼라아제 리포터 벡터(luciferase repoter vector)를 형질전환시킨 후 측정한 결과, PKM2를 녹다운시키지 않은 세포주에 비하여 루시퍼라아제 활성이 증가했음을 확인하였고(도 3A),
상기 세포주에서, CDKN1A, BAK1, Bcl-xL의 발현 수준을 측정하고, p53 mRNA 및 p53 단백질의 수준을 측정한 결과, PKM2를 녹다운시킨 세포주에서는 CDKN1A 및 BAK1의 수준이 증가하고, Bcl-xL의 수준은 감소하였으며, p53 mRNA 및 p53 단백질의 수준은 변화없음을 확인함으로써, 젬시타빈이 p53의 전사활성(trasncriptional activity)을 변화시킴을 알 수 있었고(도 3B),
p53 단백질의 인산화 프로필(phosphorylation profile)을 p53의 15번째, 20번째, 46번째 세린 인산화 단백질의 항체를 이용하여 웨스턴 블랏(western blot)한 결과, p53의 46번째 세린의 인산화가 증가함을 확인함으로써(도 3C), PKM2 감소는 젬시타빈 유도된 p53의 활성 증가를 통하여 세포사멸을 촉진함을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 PKM2가 젬시타빈 유도된 세포자살을 방해하는지 확인하기위하여, 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2, mPKM2) 발현 벡터를 PKM2 녹다운 암세포주에 도입한 결과, 세포증식이 증가함을 확인함으로써, PKM2가 암세포의 성장에 영향을 미침을 알 수 있었고(도 4A),
젬시타빈 유도된 p53의 활성에 PKM2가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 mPKM2를 PKM2 녹다운시킨 세포주에 도입한 결과 p53의 활성이 감소하고, p53의 46번째 세린(serine)의 인산화 및 PARP cleavage가 감소하고, CDKN1A 및 BAK1 유전자가 감소함을 확인함으로써(도 4A 내지 도 4E), PKM2가 p53의 활성을 감소시킴을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 젬시타빈이 세포내 PKM2의 발현양에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 젬시타빈 치료한 세포주에서 웨스턴 블랏 또는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통하여 PKM2의 RNA 및 단백질 수준을 측정한 결과, 변화가 없음을 확인함으로써, 젬시타빈의 처리가 세포내 PKM2의 발현에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(도 2A 및 2B).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 젬시타빈에 의한 PKM2의 핵위치(nuclear localization of PKM2)의 조절여부를 확인하기 위하여, 세포질(cytoplasmic) 및 핵내(nuclear)의 PKM2 단백질의 양을 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 결과, 핵의 PKM2가 감소한 반면, 세포질의 PKM2는 변화없음을 확인함으로써, 핵에 존재하는 PKM2가 젬시타빈 유도된 세포자살 신호(apoptotic signal)을 방해함을 알 수 있었다(도 2C).
이하, 본 발명을 하기 실시에에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
통계처리
실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, Student's t-test로 분석하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
<실시예 1> 세포의 배양
모든 세포주는 America Type Culture Collecetion(ATCC)에서 구입하였다. MIA PaCa-2 인간 췌장암 세포주는 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco, Carlsbad, CA), 2.5% horse serum 및 1% antibiotic-antimycotic mixture(Gibco)를 보충한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다.
BxPC-3 인간 췌장암 세포주는 10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic mixture를 보충한 RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute 1640)에서 배양하였다.
Capan-1 인간 췌장암 세포주는 20% FBS, 1% antibiotic-antimycotic mixture를 보충한 IMDM에서 배양하였다.
<실시예 2> 총 RNA의 추출 및 단백질의 분리
총 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 트라이졸(Trizol, invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 추출하였다.
구체적으로 각각의 세포 실험군 샘플을 마이크로 튜브로 옮긴 후 트라이졸 1 ml을 넣고 균질화 시킨 후 클로로폼(chloroform) 200 ul을 넣고 약 15초간 잘 섞어준 후, 상온에서 5분간 방치하였다. 그 후 센트리퓨지(centrifuge)를 이용하여 5분간 12,000 rpm에서 회전 후, 상등액만을 취하여 새로운 튜브에 옮긴 후 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 섞어준 후 상온에서 5분간 방치하였다. 그 후 센트리퓨지를 이용하여 10분간 12,000 rpm으로 회전시킨 후 이소프로판올을 제거하였다. 75% 에탄올 1 ml을 각각 넣어준 후 센트리퓨지를 이용하여 10분간 12,000 rpm에서 원심분리 후 에탄올을 제거하였다. 그 후 5분간 상온에서 건조시킨 후 RNAase 프리워터(RNAase free water)로 RNA 펠렛(RNA pellet)을 녹였다.
역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription polymerase reaction, RT-PCR)에 사용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.
| PKM2 |
Forward | 5'-CCGCCGCCTGGCGCCCATTA-3' | 서열번호2 |
| Reverse | 5'-CGGTCAGCACAATGACCACATC-3' | 서열번호3 | |
| β-actin |
Forward | 5'-CTGGAGAAGAGCTACGAGCT-3' | 서열번호4 |
| Reverse | 5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGA-3' | 서열번호5 | |
| CDKN1A |
Forward | 5'-GACACCACTGGAGGGTGACT-3' | 서열번호6 |
| Reverse | 5'-CAGGTCCACATGGTCTTCCT-3' | 서열번호7 | |
| BAK1 |
Forward | 5'-TTTTCCGCAGCTACGTTTTT-3' | 서열번호8 |
| Reverse | 5'-GGTGGCAATCTTGGTGAAGT-3' | 서열번호9 | |
| p53 |
Forward | 5'-CCCAAGCAATGGATGATTTGA-3' | 서열번호10 |
| Reverse | 5'-GGCATTCTGGGAGCTTCATCT-3' | 서열번호11 | |
| Bcl-xL |
Forward | 5'-TGCATTGTTCCCATAGAGTTCCA-3' | 서열번호12 |
| Reverse | 5'-CCTGAATGACCACCTAGAGCCTT-3' | 서열번호13 | |
| CNT1-F |
Forward | 5'-GTTGATTGCAGCCTCTGTGA-3' | 서열번호14 |
| Reverse | 5'-CAGCAGCTCAGCTACCACTG-3' | 서열번호15 | |
| ENT-F |
Forward | 5'-CAGAAAGTGCCTTCGGCTAC-3' | 서열번호16 |
| Reverse | 5'-GGCCCAACCAGTCAAAGATA-3' | 서열번호17 |
세포는 phosphate inhibitor cocktail(Roche. Diagnostics Co., Mannheim, Germany) 및 단백질 분해 억제제(protease inhibitor cocktail(Roche))를 포함하는 radio-immuniprecipitation assa buffer(RIPA; 50mM Tris, ph 7.5, 150mM NaCL, 1% NP-40, 1mM ethylenediaminetetraacetic acid)를 사용하여 세포 실험군과 혼합하여 균질화 후 얼음 위에서 30분간 방치하여 용해하였다.
용해성 있는 세포 용해물은 1000g에서 10분동안 원심분리하여 수득하였다.
<실시예 3> 췌장암 세포의 젬시타빈(Gemcitabine)에 대한 내성(chemoresistance) 확인
<실시예 3-1> Capan-1, MIA PaCa-2 및 BxPC-3 췌장암 세포주의 젬시타빈에 대한 감수성(sensitivity) 확인
췌장암 세포에서 항암제인 젬시타빈(순도>98%, Sigma Aldrich(St. Louis, MO))에 대한 감수성 또는 내성을 확인하기 위해, Cell Titer Blue(CTB) 시약(Promega, Madison, WI)으로 상기 세가지 세포주에서 세포증식(cell proliferation)을 측정하였다.
구체적으로, Capan-1, MIA PaCa-2 및 BxPC-3로 구성된 췌장암 세포주들에 대하여 젬시타빈을 처리하지 않은 군, 0.1μM의 젬시타빈을 처리한 군, 1μM의 젬시타빈을 처리한 군으로 나누어 37℃, 5% CO2환경에서 배양한 후, 20μl의 Cell Titer Blue 시약(promega, Madison, WI)으로 0시간부터 72시간까지 24시간 단위로 처리하여 1시간 배양 후 흡광도 590nm에서 세포증식을 측정하였다
그 결과, MIA PaCa-2 및 BxPC3 췌장암 세포주는 젬시타빈 처리에 불구하고 세포증식에 중요한 영향을 미치지 않은 반면(Capan-1 세포주보다 적어도 10배 이상의 내성을 지님), Capan-1 췌장암 세포주는 젬시타빈 처리에 의해 상기 MIA PaCa-2 및 BxPC3에 비하여 세포 성장을 크게 억제한 것을 확인하여, Capan-1 세포주는 MIA PaCa-2 및 BxPC3에 비하여 젬시타빈 감수성이 뛰어나며, MIA PaCa-2 및 BxPC3 세포주는 젬시타빈에 대한 내성이 있음을 알 수 있었다(도 1A).
<실시예 3-2> 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 녹다운(knock-down)시 췌장암 세포의 감수성 비교
본 발명자들은, 췌장암 세포에서 PKM2의 녹다운시 세포증식에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 상기 <실시예 3-1>의 췌장암 세포주(Capan-1, MIA PaCa-2 및 BxPC-3)에 대하여, 각각 PKM2를 녹다운 시킨 군과 그렇지 않은 군으로 나누어 세포증식을 측정하였다.
구체적으로, PKM2의 녹다운에 필요한 PKM2 녹다운 렌티바이러스 벡터(PKM2 knock-down lentiviral vector(Gipz-shPKM2)) 및 렌티바이러스 패키징 벡터(lentivirus packaging vector)를 Open Biosystems(Huntsville, AL)로부터 구입하였고, PKM2 바이러스 입자(PKM2 viral particles)를 준비하기 위하여 HEK293T 세포가 바이러스 벡터(viral vector) 및 패키징 백터(packaging vector)에 의하여 도입(transfected)되었고, 그 후 48시간 동안 배양하였다. 바이러스 입자는 0.45nm 아세트산 나트륨 실린지 필터(sodium acetate syringe filter)로 여과하여 얻을 수 있었다. 상기 바이러스 입자는 8μg/ml의 폴리브렌(polybrene)(Millipore, Billerica, MIA)와 혼합한 후 배지에 60% 분주된 MIA PaCA-2, BxPC-3, Capan-1 세포주에 감염시켜 PKM2를 녹다운시켰다.
이 후, 상기 PKM2를 녹다운시킨 세포주 군과 녹다운시키지 않은 세포주 군의 세포증식을 상기 <실시예 3-1>에 기재된 방법에 의하여 측정하였다.
그 결과, Capan-1 세포주에서는 PKM2의 녹다운 여부에 의해 세포증식이 영향을 받지 않은 반면(8%의 성장저하), MIA PaCa-2 및 BxPC-3 세포주는 PKM2를 녹다운에 의해 세포증식이 크게 줄어드는 것(45% 이상의 성장저하)을 확인한 결과, PKM2의 녹다운이 젬시타빈에 대한 내성이 있는 세포인 MIA PaCa-2 및 BxPC-3 세포주의 세포증식을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 1B).
<실시예 3-3> 젬시타빈의 투여 및 PKM2 녹다운의 시너지 효과 확인
본 발명자들은, 항암제 젬시타빈의 투여와 PKM2 녹다운을 암세포에 동시에 가할 경우, 세포증식에 미치는 효과를 확인하기 위하여 MIA PaCa-2 및 BxPC-3 세포주에 대하여 PKM2를 녹다운 시킨 군과 그렇지 않은 군으로 나누어, 다른양의 젬시타빈을 투여하고 세포증식을 측정하였다.
구체적으로, MIA PaCa-2 및 BxPC-3 세포주를 각각 96웰 플레이트에 분주한 후 상기 <실시예 3-2>의 방법에 의하여 PKM2를 녹다운 시킨 군과 PKM2를 녹다운 시키지 않은 군으로 나누어, 두 군에 대하여, 젬시타빈을 0, 0.01, 0.1, 1μM을 투여하고 48시간 후 CTB assay 키트를 사용하여 세포증식을 측정하였다.
그 결과, 투여한 젬시타빈이 0.1μM 이상인 경우 유의적으로 PKM2를 녹다운 시킨 군에서 크게 저하된 세포증식을 확인할 수 있었으며, 이는 PKM2의 녹다운과 젬시타빈 투여의 병행에 의해, 췌장암 세포의 세포증식 저해에 대한 시너지 효과가 발생함을 할 수 있었다(도 1C).
<실시예 4> 췌장암 세포에서 PKM2의 녹다운과 젬시타빈 유도된 세포자살과의 상관관계 확인
<실시예 4-1> PKM2의 녹다운이 젬시타빈 치료된 췌장암 세포에 미치는 영향 확인
본 발명자들은, PKM2를 감소시키는 것이 젬시타빈 치료된 췌장암 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 젬시타빈만을 투여한 암세포군과 젬시타빈을 투여하고 PKM2를 녹다운시킨 군으로 나누어, 각각 세포증식을 측정하였다.
구체적으로, MIA PaCa-2 세포주를 상기 <실시예 3-2>의 방법에 의해 PKM2를 녹다운 시킨 군과 PKM2를 녹다운 시키지 않은 군으로 나누어, 12-웰 플레이트에 분주하고 각각 젬시타빈을 0, 0.1, 1μM 씩 투여한 후 48시간 후, 셀 개수 측정방법으로 부유 세포(suspension cells) 즉, 죽은 세포의 수를 히모사이토메터(hemocytometer)를 이용하여 측정한 결과 PKM2를 녹다운 시킨 군에서 그렇지 않은 군보다 많은 부유 세포가 측정되었고(도 2A 상단), 이와 마찬가지로 부착세포(adherent cells, 생존세포)는 PKM2를 녹다운시킨 군에서 크게 감소함을 확인한 결과(도 2A 하단), 젬시타빈 유도된 세포의 내성의 기전이 PKM2의 감소(depletion)에 의하여 방해받았음을 알 수 있었다.
<실시예 4-2> PKM2의 녹다운에 의해 증가된 세포의 죽음과 세포자살과의 관계 확인
본 발명자들은, 상기 <실시예 4-1>에서 확인된 증가된 세포의 죽음이 세포자살(apooptosis)에 의한 것인지 확인하기 위하여, caspase3 및 caspase 7의 활성, cleaved PARP 및 BAX의 단백질 발현 수준을 측정하였다.
구체적으로, caspase3 및 caspase7의 활성은 상기 <실시예 3-2>의 방법으로 PKM2를 녹다운 시킨 MIA PaCa-2 세포주를 black 96 웰-플레이트에 분주하고, 0, 0.1, 1μM의 젬시타빈을 투여한 후 48시간이 경과한 후, 100μl Apo-ONE™ Homogeneous caspase-3/7 Reagent(Caspase substrate Z-DEVE-R110(100X)), Apo-ONE™ Homogeneous caspase-3/7 buffer(Promega, Madison, WI)을 각 세포 실험군에 첨가 후 상온에서 1시간 방치시킨 후, 499nm의 자외선을 조사하고, 521nm의 자외선을 검출하여 caspase 3/7의 활성도를 측정할 수 있었다.
그 결과, PKM2를 녹다운시킨 군에서 caspase3 및 caspase7의 활성이 증가함을 알 수 있었다(도 2B).
또한, 각각의 실험군에서 cleaved PARP 및 BAX 단백질의 수준을 측정하기 위하여, PKM2 녹다운 또는 대조군 세포에 젬시타빈을 처리한 샘플을 리파 버퍼(RIPA buffer)로 용해시킨 후 브레드포트(bradford)로 단백질 정량하여 10% 아크릴라마이드 젤(acrylamide gel)에 로딩하였다. 그 후 아크릴라마이드 젤에서 NC 멤브레인(Nitro Cellulose Membrane)으로 트랜스퍼(transfer)하였으며, 5% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간 블로킹(blocking) 후, PKM2, cleaved PARP, BAX 및 로딩컨트롤(loading control)로서 β-actin의 각각의 항체(Cell signaling Technology(Beveryl,MA))를 이용하여 웨스턴 블랏(western-blot)한 결과 세포사멸 마커 단백질인 cleaved PARP 및 BAX가 PKM2를 녹다운시킨 군에서 더 많이 검출되는 것을 확인하였다(도 2C).
그 결과, PKM2의 녹다운은 젬시타빈 유도된 세포의 세포자살을 촉진함을 알 수 있었다.
<실시예 5> PKM2의 감소(depletion)와 젬시타빈 유도된 p53의 활성과의 상관관계 확인
<실시예 5-1> p53의 활성 확인
본 발명자들은, PKM2의 감소에 의해 증가된 세포자살이 p53의 활성증가에 의한 것인지 확인하기 위하여, 루시퍼라아제 에세이(luciferase assay)를 통해 p53의 활성을 측정하였다.
구체적으로, 일시적 주입법(Transient trasnfection)은 Lipofectimine™(Invitrogen) 및 EnhaverQ(JBI, Daegu, KOREA)를 사용함으로써 실행되었고, 파이어플라이 루시퍼라아제(firefly luciferase)/레닐라(Renilla) 활성을 측정하기 위한 assay는 제조사(Promega)의 프로토콜에 의해 수행되었다. p53 리포터 플라스미드(p53 reporter plasmid) 250ng과 대조군 벡터(internal control vector, 9pCMV-Renilla) 50ng으로 도입되었고, 이후 24시간 동안 배양되었다. β-actin은 로딩 컨트롤로서 사용되었다. 세포들은 젬시타빈에 의하여 48시간 동안 치료되었으며, Promega lysis buffer를 사용함으로써 얻을 수 있었다. 루시퍼라아제의 활성은 reporter assay system(Promega)에 제공된 기질(substrate)를 사용함으로써 측정되었다.
그 결과, p53 reporter의 활성은 PKM2를 녹다운시킨 군에서 증가됨을 확인할 수 있었고(도 3A), 결국 PKM2의 감소에 의해 젬시타빈 유도된 p53의 활성을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
<실시예 5-2> 젬시타빈 치료와 p53의 활성과의 관계 확인
본 발명자들은, p53의 활성 증가의 원인을 확인하기 위하여, PKM2, p53, CDKN1A, BAK1, Bcl-xL, β-actin(로딩컨트롤)의 발현수준을 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 측정하였다.
구체적으로, PKM2 녹다운 또는 대조군 세포에 젬시타빈을 처리한 세포 실험군에서 RNA를 추출하여 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였고, 각각의 유전자 발현 측정용 프라이머(primer)를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다.
상기 결과, p53은 PKM2의 녹다운 여부와 관계 없이 변화없었으며, PKM2의 녹다운에 의해 p53의 타겟 유전자인 CDKN1A 및 BAK1의 발현 수준은 증가한 반면, Bcl-xL의 발현 수준은 감소하였다(도 3B).
그 결과, p53의 활성 증가는 p53 자체의 발현양 증가에 의한 것이 아닌 p53의 타겟 유전자의 활성증가에 의한 것이며, p53의 전사활성(translational activity) 증가는 젬시타빈에 의한 것임을 알 수 있었다.
<실시예 5-3> PKM2의 감소와 젬시타빈 유도된 p53 활성 증가의 원인 확인
본 발명자들은 p53의 활성 증가가 p53 단백질의 인산화(phosphorylation)증가에 의한 것인지 확인하기 위하여, p53의 15번째 세린(serine), 20번째 세린 및 46번째 세린이 인산화된 p53 단백질의 항체를 이용하여, 상기 <실시예 3-2>의 방법에 의해 PKM2를 녹다운시킨 군과 그렇지 않은 군에 대하여 0,0.1,1μM의 젬시타빈을 처리하고 48시간 후 웨스턴 블랏한 결과 46번째 세린이 인산화된 p53이 크게 증가함을 알 수 있었고(도 3C), 이는 PKM2의 감소는 젬시타빈 유도된 세포자살에 있어서, p53의 46번째 세린의 인산화를 촉진함으로써, p53의 활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> PKM2와 젬시타빈 유도된 세포자살과의 관계 확인
본 발명자들은 PKM2와 젬시타빈 유도된 세포자살과의 관계를 확인하기 위해, 마우스 유래 PKM2(mouse ortholog of PKM2, mPKM2)발현 벡터를 PKM2 세포에 도입하여 암세포의 세포증식을 확인하였다.
구체적으로, 마우스 유래 PKM2의 코딩 서열(coding sequence)는 NIH/3T3 마우스 세포의 전체 RNA의 역전사로부터 얻은 cDNA의 증폭(PCR)에 의하여 얻었다. 상기 증폭된 코딩 서열은 Myc-6xHis-tagged mPKM2를 생산하기 위하여 pcDNA3.1-myc/His plasmid에 연결되었고, 안정형질전환체(stable transformants)를 위하여, 각각 pcDNA3.1-mPKM2-myc/His 또는 대조군 pcDNA3.1-myc/His 벡터가 Lipofectamine™(Invitrogen, Grand Island, NY)를 사용하여 PKM2가 녹다운된 MIA PaCa-2 세포에 도입되었다. 세포증식을 측정하기 위하여 각각의 셀 개수를 측정하여 96-웰 플레이트에 동일 개수의 세포를 분주하고 24시간 배양한 후, 20μl의 Cell Titer Blue 시약(promega, Madison, WI)을 0시간부터 72시간까지 24시간 단위로 처리하여 1시간 배양 후 흡광도 590nm에서 세포증식을 측정하였다.
그 결과, 감소하였던 세포증식이 다시 증가하는 것을 확인할 수 있었고(도 4A), 이는 PKM2가 암세포의 성장에 영향을 미침을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 상기 PKM2를 녹다운시킨 세포(shPKM2+Mock), PKM2를 녹다운시킨 후 마우스 유래 PKM2를 도입시킨 세포(shPKM2+mPKM2) 및 아무런 처리를 하지 않은 세포(shControl+Mock)에 대해 젬시타빈 1μM 처리하고 48시간 후 세포증식을 측정한 결과, PKM2를 녹다운 시킨 후 다시 PKM2를 도입한 군은 젬시타빈에 대하여 감수성이 감소하여, 생존한 세포수가 증가함을 확인하였고(도 4B), 이에 젬시타빈 유도된 세포자살에 PKM2는 약물 내성과 관계있음을 알 수 있었다.
아울러, 젬시타빈 유도된 p53의 활성에 PKM2의 영향을 확인하기 위하여, 상기 <실시예 5-2> 내지 <실시예 5-3>에 의해 p53의 활성 및 p53의 인산화, cleaved PARP의 수준, CDKN1A 및 BAK1의 수준을 측정한 결과,
PKM2를 제거한 후 다시 마우스 도래 PKM2를 도입시킨 세포(shPKM2+mPKM2)는 p53의 활성이 감소하며, p53 자체의 발현양은 변화없으며, p53의 46번째 아미노산 세린의 인산화는 감소하며, cleaved PARP, CDKN1A 및 BAK1의 발현양도 감소함을 확인할 수 있었다(도 4D 및 4E). 그 결과 PKM2는 젬시타빈 유도된 세포자살을 방해함을 알 수 있었다.
<실시예 7> 젬시타빈에 의한 PKM2의 핵위치(nuclear localization)의 조절
<실시예 7-1> 젬시타빈 투여와 PKM2의 발현과의 관계 확인
본 발명자들은, 젬시타빈의 투여에 의해 PKM2의 발현양이 감소하는지 확인하기 위하여, 췌장암 세포주에 젬시타빈을 투여하고, 시간 경과에 따른 PKM2 RNA 및 PKM2 단백질의 수준을 측정하였다.
구체적으로, MIA PaCa-2 세포주에 1μM의 젬시타빈을 투여한 후 0시간 부터 12시간의 경과까지 3시간 단위로 PKM2의 단백질 수준을 웨스턴 블랏을 통해 측정한 결과, PKM2 단백질의 수준은 변화가 없음을 확인 할 수 있었다(도 5A)
또한, PKM2의 발현수준을 역전사 중합효소 연쇄 반응(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 통해 측정하였다. 젬시타빈을 0시간부터 12시간의 경과까지 3시간 간격으로 처리한 세포 실험군에서 RNA를 추출하여 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였고 PKM2 유전자 발현 측정용 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 시간의 경과에 따라 PKM2의 RNA 수준 역시 변화가 없음을 확인할 수 있었다(도 5A).
결국, 젬시타빈의 투여는 PKM2의 발현과는 관계가 없음을 확인 할 수 있었다.
<실시예 7-2> 젬시타빈에 의한 암세포내 PKM2의 세포내 이동(intracellular trafficking)조절 확인
본 발명자들은, 젬시타빈이 암세포내의 PKM2의 세포내 이동을 조절하는지 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏을 통해 세포질내(cytoplasmic) 및 핵의(nuclear) PKM2를 측정하였다.
구체적으로, MIA PaCa-2세포에 1μM의 젬시타빈 0시간부터 12시간의 경과까지 3시간의 간격으로 처리한 세포 실험군에서 세포질 및 핵 단백질 분리키트(Thermo, Rockford, IL)를 이용하여 샘플링한 후, 브레드포트(bradford)로 단백질 정량하여 10% 아크릴라마이드 젤(acrylamide)에 로딩하였다. 그 후, 아크릴라마이드 젤에서 NC 멤브레인(NitroCellulose Membrane)으로 트랜스퍼(transfer)하였으며, 5% 탈지유(skim milk)로 상온에서 블로킹(blocking) 후 PKM2, LaminB(로딩컨트롤) 및 ERK1/2(로딩컨트롤)의 항체를 이용(Santa Cruz Biotechnology(Santa cruz, CA))하여, 핵 및 세포질내 각각에서 PKM2, LaminB, ERK1/2에 대하여 시간의 경과에 따라 웨스턴 블랏을 수행한 결과 핵의 PKM2은 시간 경과에 따라 변화가 없는 반면, 세포질내의 PKM2는 감소함을 확인한 결과, 핵의 PKM2가 젬시타빈 유도된 세포자살 신호(signal)을 방해함을 알 수 있었다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Pharmaceutical composition for enhancing sensitivity to
anticancer drugs comprising expression or activity inhibitor of
PKM2 as an active ingredient
<130> 2014p-04-034
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 531
<212> PRT
<213> Homo sapiens pyruvate kinase, muscle (PKM), transcript variant 1
<400> 1
Met Ser Lys Pro His Ser Glu Ala Gly Thr Ala Phe Ile Gln Thr Gln
1 5 10 15
Gln Leu His Ala Ala Met Ala Asp Thr Phe Leu Glu His Met Cys Arg
20 25 30
Leu Asp Ile Asp Ser Pro Pro Ile Thr Ala Arg Asn Thr Gly Ile Ile
35 40 45
Cys Thr Ile Gly Pro Ala Ser Arg Ser Val Glu Thr Leu Lys Glu Met
50 55 60
Ile Lys Ser Gly Met Asn Val Ala Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Thr
65 70 75 80
His Glu Tyr His Ala Glu Thr Ile Lys Asn Val Arg Thr Ala Thr Glu
85 90 95
Ser Phe Ala Ser Asp Pro Ile Leu Tyr Arg Pro Val Ala Val Ala Leu
100 105 110
Asp Thr Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Gly Leu Ile Lys Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Glu Val Glu Leu Lys Lys Gly Ala Thr Leu Lys Ile Thr Leu
130 135 140
Asp Asn Ala Tyr Met Glu Lys Cys Asp Glu Asn Ile Leu Trp Leu Asp
145 150 155 160
Tyr Lys Asn Ile Cys Lys Val Val Glu Val Gly Ser Lys Ile Tyr Val
165 170 175
Asp Asp Gly Leu Ile Ser Leu Gln Val Lys Gln Lys Gly Ala Asp Phe
180 185 190
Leu Val Thr Glu Val Glu Asn Gly Gly Ser Leu Gly Ser Lys Lys Gly
195 200 205
Val Asn Leu Pro Gly Ala Ala Val Asp Leu Pro Ala Val Ser Glu Lys
210 215 220
Asp Ile Gln Asp Leu Lys Phe Gly Val Glu Gln Asp Val Asp Met Val
225 230 235 240
Phe Ala Ser Phe Ile Arg Lys Ala Ser Asp Val His Glu Val Arg Lys
245 250 255
Val Leu Gly Glu Lys Gly Lys Asn Ile Lys Ile Ile Ser Lys Ile Glu
260 265 270
Asn His Glu Gly Val Arg Arg Phe Asp Glu Ile Leu Glu Ala Ser Asp
275 280 285
Gly Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Ile Glu Ile Pro Ala Glu
290 295 300
Lys Val Phe Leu Ala Gln Lys Met Met Ile Gly Arg Cys Asn Arg Ala
305 310 315 320
Gly Lys Pro Val Ile Cys Ala Thr Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Lys
325 330 335
Lys Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Gly Ser Asp Val Ala Asn Ala Val
340 345 350
Leu Asp Gly Ala Asp Cys Ile Met Leu Ser Gly Glu Thr Ala Lys Gly
355 360 365
Asp Tyr Pro Leu Glu Ala Val Arg Met Gln His Leu Ile Ala Arg Glu
370 375 380
Ala Glu Ala Ala Ile Tyr His Leu Gln Leu Phe Glu Glu Leu Arg Arg
385 390 395 400
Leu Ala Pro Ile Thr Ser Asp Pro Thr Glu Ala Thr Ala Val Gly Ala
405 410 415
Val Glu Ala Ser Phe Lys Cys Cys Ser Gly Ala Ile Ile Val Leu Thr
420 425 430
Lys Ser Gly Arg Ser Ala His Gln Val Ala Arg Tyr Arg Pro Arg Ala
435 440 445
Pro Ile Ile Ala Val Thr Arg Asn Pro Gln Thr Ala Arg Gln Ala His
450 455 460
Leu Tyr Arg Gly Ile Phe Pro Val Leu Cys Lys Asp Pro Val Gln Glu
465 470 475 480
Ala Trp Ala Glu Asp Val Asp Leu Arg Val Asn Phe Ala Met Asn Val
485 490 495
Gly Lys Ala Arg Gly Phe Phe Lys Lys Gly Asp Val Val Ile Val Leu
500 505 510
Thr Gly Trp Arg Pro Gly Ser Gly Phe Thr Asn Thr Met Arg Val Val
515 520 525
Pro Val Pro
530
Claims (13)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 유전자에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA, shRNA, 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 젬시타빈(Gemcitabine)에 대한 항암 민감성 증진용 약학적 조성물.
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- 제 1항에 있어서, 상기 PKM2의 발현 또는 활성 억제제는 세포핵내 또는 세포질내의 PKM2 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 젬시타빈(Gemcitabine)에 대한 항암 민감성 증진용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 PKM2의 발현 또는 활성 억제제는 p53의 인산화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 젬시타빈(Gemcitabine)에 대한 항암 민감성 증진용 약학적 조성물.
- 제 7항에 있어서, 상기 인산화는 p53의 46번째 아미노산인 세린(serine 46) 위치에서 일어나는 것을 특징으로 하는 젬시타빈(Gemcitabine)에 대한 항암 민감성 증진용 약학적 조성물.
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- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 유전자에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 PKM2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 젬시타빈(Gemcitabine)에 대한 항암 보조용 건강기능 식품.
- (1)피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성이 증가된 항암제 내성 세포주를 준비하는 단계;
(2)상기 단계(1)의 세포주에 실험군으로 후보물질을 처리하고, 대조군으로 후보물질을 처리하지 않는 단계; 및
(3)상기 단계(2)의 실험군 및 대조군의 PKM2의 발현 또는 활성을 측정하여, 대조군에 비해 PKM2의 발현 또는 활성을 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 젬시타빈(Gemcitabine)에 대한 항암 보조제의 스크리닝 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020140075785A KR101605883B1 (ko) | 2014-06-20 | 2014-06-20 | 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물 |
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| KR20150145588A KR20150145588A (ko) | 2015-12-30 |
| KR101605883B1 true KR101605883B1 (ko) | 2016-03-23 |
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| KR1020140075785A KR101605883B1 (ko) | 2014-06-20 | 2014-06-20 | 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물 |
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-
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Cancer science, Vol. 101, No. 6, pp. 1447-1453, 2010* |
| 아미노산서열(2012)* |
Also Published As
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| KR20150145588A (ko) | 2015-12-30 |
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