CN115887467A - 小分子靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及小分子靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明提供了靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用；所述靶向抑制剂抑制PKM2和ALDH1A3的相互作用。本发明针对肿瘤组织中PKM2被ALDH1A3别构激活的独特机制，首次开发了具有较高特异性的PKM2靶向激活剂和抑制剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及小分子靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术
肿瘤细胞无论在有氧还是缺氧条件下均以糖酵解途径作为糖代谢的主要途径，这一肿瘤细胞中特有的代谢重编程现象被称为Warburg效应。大量研究表明，肿瘤过度激活的糖酵解代谢过程与其快速生长、恶性侵袭与放化疗抵抗等表型密切相关。因此如何靶向该过程开发药物成为肿瘤治疗领域的关键问题。
丙酮酸激酶(pyruvatekinase，PK)是糖酵解过程中最后一个限速酶。作为一种进化上保守的代谢酶，丙酮酸激酶可促进磷酸烯醇式丙酮酸(phospho enolpyruvate，PEP)和二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)之间的不可逆磷酸反应，从而产生磷酸酯和三磷酸腺苷(adenosinetrisphosphate，AT P)。在哺乳动物中，存在4种组织特异性的丙酮酸激酶，分别是PKL、PKR、PKM1和PKM2。PKM2作为其中一种亚型，主要存在于具有高合成代谢要求的高增殖细胞中，尤其是肿瘤和胚胎组织中。此外，目前已发现PKM2在肺癌、乳腺癌等肿瘤组织中过表达，并作为癌细胞代谢的关键调节剂。除此之外，PKM2还可以充当转录共激活剂，促进癌细胞中的基因转录。因此，靶向抑制PKM2活性成为逆转肿瘤代谢重编程作用，从而杀灭肿瘤细胞的关键。
目前商品化的PKM2抑制剂主要来源于天然植物，除对PKM2的抑制作用外，往往还对其他重要靶点产生复杂多变的影响，如紫草醌(shikonin)可通过抑制PKM2减少糖酵解标志物乳酸的产生，但同时也对细胞凋亡过程起到重要调控作用；另外，二甲双胍也被证实可下调PKM2，但其特异性不高。上述抑制剂均未获得临床试验的成功。主要原因在于这些药物大多来源于天然植物，而非针对肿瘤研发。药物作用特异性较差，在抑制PKM2的同时往往对其他重要代谢靶点具有影响，因此难以用于肿瘤靶向治疗。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了小分子靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明针对肿瘤组织中PKM2被ALDH1A3别构激活的独特机制，首次开发了具有较高特异性的PKM2靶向激活剂和抑制剂。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用；所述靶向抑制剂抑制PKM2和ALDH1A3的相互作用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述靶向抑制剂包括：PMK2的抑制剂或PMK2的激活剂。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述抑制剂包括：如式1或式2所示的化合物；所述激活剂包括：如式3或式4所示的化合物；
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述抑制剂降低PKM酶的活性；所述激活剂升高PKM酶的活性。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述抑制剂降低LDH酶的活性；所述激活剂升高LDH酶的活性。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述抑制剂降低细胞内乳酸含量；所述激活剂升高细胞内乳酸含量。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述抑制剂降低细胞的丙酮酸含量。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述抑制剂升高细胞内线粒体膜电位。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述靶向抑制剂的给予量为10mg/kg。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述靶向抑制剂的浓度为10～50μM。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述靶向抑制剂的给予方式包括：注射或口服。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述肿瘤包括脑胶质瘤。
本发明提供了靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用；所述靶向抑制剂抑制PKM2和ALDH1A3的相互作用。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明针对肿瘤组织中PKM2被ALDH1A3别构激活的独特机制，首次开发了具有较高特异性的PKM2靶向激活剂和抑制剂。
(2)本发明提供的靶向抑制剂基于世界上最大的小分子化合物库，通过计算机高通量筛选得到，并经过体内外实验验证，兼顾有效性及特异性，综合评估优于现有商品化药物。
(3)本发明提供的靶向抑制剂，首次提出了其药物结构的药理学活性，具有较强创新性和良好的临床转化前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示原代脑胶质瘤细胞系中ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白的A1和A2结构域发生蛋白互作；其中：A示WesternBlot展示在BNI-20-1-S细胞中，ALDH1A3敲除后(1A3KO6)PKM2蛋白表达升高，再回补ALDH1A3(1A3KO6-RE S)后PKM2蛋白降低；B示WesternBlot展示在BNI-21-1-S细胞中，ALDH1A3敲除后(1A3KO18)PKM2蛋白表达升高，再回补ALDH1A3(1A3KO18-RES)后PKM2蛋白降低；C示PKM2的野生型、Δ1、Δ2、Δ3和Δ4质粒的结构示意图；D示WesternBlot展示在293T细胞中，免疫沉淀(IP)实验证实ALDH1A3野生型分别与PKM2的野生型、Δ2和Δ4三种形式的蛋白存在蛋白互作；E示计算机模拟ALDH1A3与PKM2在脑胶质瘤干细胞中的蛋白互作模式，其中，红色不规则螺旋状为ALDH1A3蛋白；绿色椭圆区域为ALDH1A3蛋白的生物学功能域；灰色为PKM2的N和C结构域；紫色为PKM2的A1和A2结构域；黄色不规则螺旋状为PKM2的B结构域，黄色椭圆区域为PKM2蛋白的生物学功能域；
图2示靶向ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白互作位点的小分子化合物的验证；其中：A示ALDH1A3与PKM2蛋白结合位点靶向小分子物质的高通量筛选平台的构建与参数设置；B示第31号化合物与第34号化合物在低、中、高浓度时对ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白的结合的抑制作用，抑制作用越强绿色荧光越弱；C示WesternBlot展示在293T细胞中，免疫沉淀(IP)实验证实第31号化合物与第34号化合物在低、中、高浓度时对ALDH1A3野生型分别与PKM2野生型蛋白互作的抑制作用；
图3示靶向ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白互作位点的小分子化合物的功能验证；其中：A示柱状图展示了未处理、低浓度DMSO处理、低浓度第31号化合物处理与低浓度第34号化合物处理后的转染ALDH1A3+PKM2混合质粒(ALDH1A3+PKM2)的293T细胞内PKM酶活性；nsp>0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；B示柱状图展示了未处理、低浓度DMSO处理、低浓度第31号化合物处理与低浓度第34号化合物处理后的转染ALDH1A3+PKM2混合质粒(ALDH1A3+PKM2)的293T细胞内丙酮酸含量；nsp>0.05，**p<0.01，***p<0.001；C示柱状图展示了未处理、低浓度DMSO处理、低浓度第31号化合物处理与低浓度第34号化合物处理后的转染ALDH1A3+PKM2混合质粒(ALDH1A3+PKM2)的293T细胞内LDH酶活性；nsp>0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；D示柱状图展示了未处理、低浓度DMSO处理、低浓度第31号化合物处理与低浓度第34号化合物处理后的转染ALDH1A3+PKM2混合质粒(ALDH1A3+PKM2)的293T细胞内乳酸含量；nsp>0.05，****p<0.0001；E左示线粒体膜电位变化的流式；右示柱状图展示了未处理、低浓度DMSO处理、低浓度第31号化合物处理与低浓度第34号化合物处理后的转染ALDH1A3+PKM2混合质粒(ALDH1A3+PKM2)的293T细胞线粒体膜电位下降的水平；nsp>0.05，****p<0.0001；F示CCK-8实验发现在HA细胞系替莫唑胺半数抑制浓度(IC50)比原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)高；G示CCK-8实验发现低浓度第34号化合物处理后原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)、ALDH1A3敲除后的细胞(BNI-20-1-S1A3KO6和BNI-21-1-S1A3KO18)和ALDH1A3敲除后再回补ALDH1A3表达的细胞(BNI-20-1-S1A3KO6-RES和BNI-21-1-S1A3KO18-RES)的替莫唑胺半数抑制浓度(IC50)均较低且无显著差异；
图4示小鼠颅内成瘤模型验证药物疗效；其中：A示胶质瘤干细胞颅内成瘤模型构建过程示意图，活体成像观察到成瘤后分组，分别予不同药物治疗，每周进行一次活体成像评估肿瘤生长情况并进行代谢流实验；B示活体成像显示不同药物治疗组小鼠肿瘤生长情况；C示不同处理组小鼠生存分析；D示不同处理组小鼠体重变化情况；E示不同处理组小鼠肿瘤组织中乳酸和丙酮酸含量；其中：左示乳酸含量，右示丙酮酸含量；F示不同处理组小鼠肿瘤组织中LDH和PKM酶活性检测；其中：左示LDH酶活性检测，右示PKM酶活性检测；
图5示与现有PKM2抑制/激活剂的对比试验；A示HA细胞系中D34与shinokin效果比较；B示BNI-20细胞系中D34与shinokin效果比较；C示BNI-20细胞系中D31与DASA-68效果比较。
具体实施方式
本发明公开了小分子靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明实施例1～实施例12中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白互作通过激活PKM2酶活性改变脑胶质瘤干细胞的糖酵解代谢活性
(1)免疫沉淀和质谱联用(IP-MS)实验方法
蛋白提取：将指数生长期的细胞传代，细胞计数后收集2*106个细胞，使用预冷PBS重悬细胞后4℃、1000转/分钟、离心5min，重复三次清洗细胞。每种细胞加入1mLRIPA蛋白裂解液，冰上裂解30min，收集上清液4℃、13000转/分钟、离心30min，取上清。
IP实验：实验组(1mL蛋白裂解液，5μLproteinA/G琼脂糖珠，5μgAL DH1A3抗体)，IgG组(1mL蛋白裂解液，5μLproteinA/G琼脂糖珠，5μgIgG抗体),实验组与IgG组分别4℃摇床过夜。4℃、1000转/分钟、离心5min，弃上清。预冷PBS重悬细胞后4℃、1000转/分钟、离心5min，重复三次清洗proteinA/G琼脂糖珠。沉淀中加入蛋白上样缓冲液，99℃孵育10min。
SDS-PAGE胶制备：ddH2O清洗制胶板、样品梳，晾干后，按照说明装好制胶板。配制10％分离胶(3mLddH2O，2.1mL1mMTris-HClpH＝8.8,2.8mL30％Acr-Bis，80μL10％SDS；56μL10％AP；6μLTEMED)；将分离胶加入玻璃板后25℃±5℃静置30min；配制浓缩胶(2mLddH2O，400μL1mMTris-HClpH＝6.8,600μL30％Acr-Bi，36μL10％SDS，24μL10％AP，4μLTEMED)；将浓缩胶加入玻璃板后插入样品梳，25℃±5℃静置30min。
SDS-PAGE胶电泳与染色：配制电泳缓冲液，按照说明将制胶板装入电泳系统，拔除样品梳后，加入变性后的蛋白，100V稳定电压电泳45～60min，停止电泳后，取出电泳胶浸泡于染色液，25℃±5℃静置2小时，再将染色后的胶置于脱色液，25℃±5℃摇床脱色处理，30min更换一次脱色液，直至条带清晰。
样品准备：切取特异性条带，超纯水漂洗两次。加入脱色液，脱色30mi n，吸出脱色液，重复2遍，真空冻干。冻干的胶块加入50μL还原液1，55℃温浴1小时。吸出还原液1，冷却至25℃±5℃，加入50μL还原液2，避光放置30min，吸出液体加入吸胀液，10min，吸出吸胀液，加入脱水液1，脱水30min，吸出脱水液1，加入脱水液2，脱水30min，吸出脱水液2，加入10μL酶解工作液，吸胀30min，加入20μL酶解覆盖液，37℃水浴酶解16h，酶解后上清转移至另一新离心管中，加入50μL肽段萃取液于剩下的胶中，37℃水浴30min，5000g离心5min，合并上清，再重复以上操作一次，冻干后待做液质联用。
肽段脱盐：制备C18膜填充柱，将冻干的多肽样品重新溶解于Nano-HP LCBufferA中，活化(40μL甲醇过柱离心1遍，弃掉EP管底部液体，重复2次)，平衡(40μLNano-HPLCBufferA过柱离心1遍，弃掉EP管底部液体，重复2次)，固肽(多肽样品过柱离心1遍，取EP管底部液体再过柱1遍),脱盐(40μLNano-HPLCBufferA过柱离心1遍，弃掉EP管底部液体，重复2次)，洗脱(更换新的EP管，40μLNano-HPLCBufferB过柱离心1遍，收集EP管底部液体，重复1次)，脱盐后含多肽样品的80μLNan o-HPLCBufferB进行冻干。
质谱检测与数据库检索：将冻干的多肽样品重新溶解于Nano-HPLC BufferA中。采用Nano-HPLC液相系统EASY-nLC1000进行分离。液相A液为0.1％甲酸-水溶液，B液为0.1％甲酸-乙腈溶液。色谱柱Trapcolumn，100m*20mm(RP-C18,thermoInc.)以100％的A液平衡。样品由自动进样器上样并吸附到Trapcolumn柱上，再经Analysiscolumn，75m*150mm(RP-C18,thermoInc.)色谱柱分离，流速为300nL/min。样本间用空白溶剂30min流动相梯度清洗一次。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用LTQOrbitrap VelosPro质谱仪(ThermoScientific)进行质谱分析。分析时长：60min，检测方式：正离子，喷雾电压：1.8kV，离子传输毛细管温度：250℃，使用前经标准校正液校正，母离子扫描范围：350-1800m/z，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(IDA，InformationDependentAnalysis)，每次全扫描(full scan)后采集最强的10个碎片图谱(MS2scan)，碎裂方式：碰撞诱导解离(CID，collision-induceddissociation)，正态化能量35％,q值0.25,活化时间：30ms，动态排除时间：30s。MS1在M/Z400时分辨率为60,000，MS2在离子阱中为单位质量分辨。一级质谱采用profile模式采集，二级质谱采用centroid方式采集以降低数据文件大小。数据处理采用ProteomeDiscoverer2.3软件(ThermoScientific)进行，数据库为Uniprot-Homo数据库，酶为胰蛋白酶，允许最大漏切位点为2；固定修饰为：Carbamidomethyl(C)；可变修饰为：Acetyl(ProteinN-term)、Deamidated(NQ)、Oxidation(M)；MS容差为±10ppm，MSMS容差为±0.6Da。
(2)免疫共沉淀(CoIP)实验方法
蛋白提取：将指数生长期的细胞传代，细胞计数后收集2×106个细胞，使用预冷PBS重悬细胞后4℃、1000转/分钟、离心5min，重复三次清洗细胞。每种细胞加入1mLRIPA蛋白裂解液，冰上裂解30min，收集上清液4℃、13000转/分钟、离心30min，取上清。
Co-IP实验：各取50μL蛋白裂解液做Input组，实验组(1mL蛋白裂解液，5μLproteinA/G-beads，5μgALDH1A3抗体)，IgG组(1mL蛋白裂解液，5μLproteinA/G-beads，5μgIgG抗体)，实验组与IgG组分别4℃摇床过夜。4℃、1000转/分钟、离心5min，弃上清，预冷PBS重悬细胞后4℃、1000转/分钟、离心5min，重复三次清洗proteinA/G琼脂糖珠。沉淀中加入蛋白上样缓冲液，99℃孵育10min。
SDS-PAGE胶制备：ddH2O清洗制胶板、样品梳，晾干后，按照说明装好制胶板。配制10％分离胶(3mLddH2O，2.1mL1mMTris-HClpH＝8.8,2.8mL30％Acr-Bis，80μL10％SDS；56μL10％AP；6μLTEMED)；将分离胶加入玻璃板后25℃±5℃静置30min；配制浓缩胶(2mLddH2O，400μL1mMTris-HClpH＝6.8,600μL30％Acr-Bi，36μL10％SDS，24μL10％AP，4μLTEMED)；将浓缩胶加入玻璃板后插入样品梳，25℃±5℃静置30min。
SDS-PAGE胶电泳与显影：配制电泳缓冲液，按照说明将制胶板装入电泳系统，拔除样品梳后，加入变性后的蛋白，100V稳定电压电泳90min左右，停止电泳。准备0.45μm孔径的硝酸纤维素膜，浸润于甲醇激活硝酸纤维素膜。装配转膜三明治(海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵)，去除气泡后电转膜90min，5％脱脂奶粉封闭转膜1小时。根据目的蛋白裁剪转膜，加入一抗4℃摇床过夜。TBST洗转膜后，加入二抗，25℃±5℃摇床2小时，加入化学发光液后显影。
如图1所示，基于步骤(1)免疫沉淀和质谱联用(IP-MS)技术在脑胶质瘤干细胞系中筛选了与ALDH1A3蛋白产生特异性结合的蛋白，结果发现在两株干细胞中，ALDH1A3蛋白均与糖酵解关键酶PKM2存在蛋白结合。随后通过步骤(2)免疫共沉淀(CoIP)技术在BNI-20-1-S细胞中，证实ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白存在蛋白互作。为了更进一步证实ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白的互作,在工具细胞293T中分别转染了HA-ALDH1A3质粒、Flag-PKM2质粒和HA-ALDH1A3与Flag-PKM2混合质粒，并对转染的细胞进行免疫沉淀(IP)实验，再次证实ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白存在互作关系。
前期研究证实，PKM2存在5个结构域，分别是N端、A1结构域、B结构域、A2结构域和C端。为了进一步探索ALDH1A3影响PKM2的机制，我们分别构建了PKM2A1结构域缺失突变(PKM2Δ1)、PKM2B结构域缺失突变(PKM2Δ2)、PKM2A2结构域缺失突变(PKM2Δ3)和PKM2C结构域缺失突变(PKM2Δ4)的质粒。在293T细胞中分别转染PKM2野生质粒和上述4种截短突变质粒，随后免疫沉淀(IP)实验证实，ALDH1A3与PKM2A1和A2结构域发生蛋白互作。基于研究结果，通过计算机模拟ALDH1A3与PKM2的蛋白互作模式，结果发现PKM2A1和A2结构域在空间结构中位置相近并且具有生物学功能，ALDH1A3中与PKM2结合的位点远离生物学活性区域。综上所述，在脑胶质瘤干细胞中，ALDH1A3与PKM2具有生物学功能的结构域A1和A2结构域发生蛋白互作，从而影响PKM2的生物学功能。
实施例2ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白互作位点靶向小分子化合物的计算机筛选
靶向药物计算机筛选方法
PKM2的氨基酸序列从N端到C端的结构域分别为A1、B、A2、C，其中A1和A2结构域能够与ALDH1A3蛋白互作，在A1和A2之间存在一个可结合磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的位点，A2结构域包含别构激动剂的结合位点，C区结构域包含果糖-1、6-二磷酸(FBP)的结合位点。具体来说，参与ATP的氨基酸位点为N75-H78,R120,K207，而参与底物结合的氨基酸为R73,K270,G295,D296,T328。该蛋白存在两个天然突变位点P403和P408，其他有可能参与其功能的氨基酸位点有N70,N106,D113,T114,K433,H464,W482,R489。通过晶体结构1T5A提取其中一个完整的单体结构，经过质子化和结构优化后进行结构分析，发现围绕A1和A2结构域存在四个大小且属性不同的口袋。其中pocket1口袋位于A和B结构域相邻处，该pocket的可容纳192个原子，成药性属性打分值为3.19，包含34个疏水性质的原子，构成该口袋的氨基酸有THR50ILE51GLY52PRO53ARG73LEU74ASN75SER77HIS78GLY79TYR83HIS84THR87ASP113THR114LYS115GLU118ARG120ASP177ASP178GLY179SER205LYS206LYS207GL Y208VAL209ASN210SER243PHE244LYS270GLU272MET291ALA293ARG294GLY295ASP296ILE299ALA327THR328GLN329GLU332ILE335MET360SER362GLY363ALA366LYS367，其中绝大多数参与PK M2功能的氨基酸位点均在此口袋区域，如ATP结合位点(R120、K207)、构象稳定位点(K270)、底物结构位点(R73、K270、G295、D296、T328)，以及金属离子结合部位(N75、S77、D113、T114、D296)和核酸结合部位(N75-H78)等。Pocket2、pocket7、pocket8等口袋位于A结构域和C结构域的附近，其中pocket2口袋可容纳114个原子，成药性属性打分值为2.84，包含31个疏水性质的原子，构成该口袋的氨基酸有THR41ALA42ARG43ASN44THR45GLY46ILE65LYS66SER67GLY68MET69ASN70TYR105ARG106PRO107VAL108ARG376ASN379LEU380ARG383PRO449AL A463HIS464TYR466GLY468ILE469PHE470PRO471VAL472ARG500PHE502，该口袋包含丝氨酸结合位点(N70、R106、H464)，因此若以该口袋为筛选部位的话，需考虑这三个位点。Pocket7口袋可容纳49个原子，成药性属性打分值为0.26，包含22个疏水性质的原子，构成该口袋的氨基酸有PHE26HIS29MET30LEU33LYS311ASN318VAL352LEU353ASP354GLY355ALA388ILE389TYR390HIS391GLN393LEU394ARG467，该口袋未包含参与PKM2功能的关键氨基酸。Pocket8口袋可容纳22个原子，成药性属性打分值为0.06，包含11个疏水性质的原子，构成该口袋的氨基酸有ILE314CYS317ASN318GLY321LYS322PRO323VAL324GLY355ASP357LEU398HIS439ALA442ARG443ARG445TYR466ARG467，该口袋未包含参与PKM2功能的关键氨基酸。使用MOE-sitefinder计算PKM2分子上的结合口袋，并选择处于复合物结合区域的pocket2口袋，我们使用openeye(Release3.2.0.2)的apopdb2receptor工具，以氨基酸R376为中心构建大小为
的对接盒子(Box)，确保其Box包含所有参与复合物形成的氨基酸位点(ARG376ASN379LEU380ARG383)。含有对接盒子信息的PKM2靶点作为对接的Receptor保存于PKM2rereceptor.oeb.gz，以备后续虚拟筛选。本次筛选使用Chemdiv小分子化合物数据库，Chemdiv数据库包含1,535,478个小分子化合物，每个小分子化合物具有骨架多样性。为了保证虚拟筛选过程中小分子全局构象，使用openeye软件中的插件omega对每个小分子化合物生成多构象，平均每个小分子可产生大约50个构象。最终把Chemdiv库中的化合物转化为50,679,311个分子构象，保存于文件confchemdiv.oeb.gz。该虚拟筛选在安装Ubuntukylin15.10操作系统的工作站(CPU:40；Memory:64GB；SSD:512GB)上进行，我们使用虚拟筛选软件FRED对PKM2受体进行虚拟筛选，其中运行参数如-savecomponentscores选择为true，-hitlistsize选择为2000(Chemdiv库)，-dockedmolecu lefile选择保存为sdf格式，其余参数均使用默认参数。受体结构文件为：re definereceptorPKM2.oeb.gz；小分子筛选库为：confchemdiv.oeb.gz和conf Targetmol.oeb.gz。最终对Chemdiv库保留排名前2000个小分子化合物及其打分值、对接模式，保存为文件PKM2ChemdivTop2000.sdf，供后续分析使用。
从Chemdiv数据库中获取与PKM2分子结合能最佳的2000个小分子化合物。它们的结合能(ChemGaussScore(CGS))分布为-14.87到-10.94(打分值越低表示结合能越强)，分子量分布为153Dal至508Dal。Stardrop软件在分析小分子化合物的类药性属性方面具有较好的预测能力。它可用来计算水溶性(logS)、脂水分布系数(logP)、分子量、分子柔性、氢键属性、表面可及性面积(TPSA)、CYP2C9酶降解水平、hERG抑制率指标、口服利用率(HIA)、药物相互作用风险(2D6)等指标，进而我们使用口服非中枢神经系统药物的筛选标准以及亲和力水平对每个小分子进行综合打分。打分结果显示来自Chemdiv的化合物的得分分布范围从最大的0.7996到最小值0.0313。这些小分子的综合打分值和其不同属性(PKM2亲和力、水溶性、脂溶性)的相关性分析，综合分析小分子结构多样性、PKM2亲和力以及综合打分值等，最终我们选择了成药性最佳(每组中得分最好的分子)的4个化合物(如表1所示)，这些化合物均具有较高的靶点亲和性、较好的水溶性(logS)和脂溶性(logP)，这为后续实验提供了基本保证。
实施例1的研究结果表明在原代脑胶质瘤干细胞中ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白A1和A2结构域的蛋白互作，激活了PKM2酶活性，导致糖酵解以非环境依赖的方式异常激活。为了逆转ALDH1A3这一恶性生物学行为，我们拟通过计算机筛选PKM2中与ALDH1A3结合位点的靶向抑制剂。基于前期结果，我们通过FRED软件在Chemdiv分子化合物数据库中筛选与PKM2对接位点结合的小分子化合物，最终得到与PKM2分子结合能最佳的2647个小分子化合物。随后再通过Stardrop软件在分析2647个小分子化合物的类药性属性。根据药物的水溶性(logS)、脂水分布系数(logP)、分子量、分子柔性、氢键属性、表面可及性面积(TPSA)、CYP2C9酶降解水平、hERG抑制率指标、口服利用率(HIA)、药物相互作用风险(2D6)等指标，对2647个小分子进行综合打分。最终根据Chemdiv库的化合物打分函数及重要性权重将2647个小分子物质根据其骨架结构分为178类。随后，再分析178类小分子化合物的综合打分值和其不同药物属性的相关性，最终筛选出4个具有较高的靶点亲和性和成药性的小分子化合物用于后续实验验证。
为了进一步验证所筛选出的小分子化合物对ALDH1A3与PKM2互作的影响，我们使用proteinligandinterfacefingerprint(PLIF)方法分析4个小分子化合物与靶点PKM2的相互作用模式，并绘制4个小分子化合物与PKM2靶点的互作指纹图谱。
综上，我们最终从Chemdiv数据库中筛选出4个从理论上具有靶向PKM2与ALDH1A3互作位点的化合物，这些化合物临近ALDH1A3-PKM2复合物的互作面附近，它们很可能影响复合物的形成。我们对这些化合物的结构、互作模式以及骨架进行详细讨论和分析，它们具有结构上的多样性、良好的溶解性、合适的具有口服类药性属性以及具有规律性的互作模式。
这些化合物和靶点的相互作用及其干预复合物形成的功能可通过后续实验验证。
表1Chemdiv库
实施例3ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白互作位点靶向小分子化合物的体外验证
(1)高通量小分子化合物筛选平台的构建与验证
将指数生长期的293T细胞传代，将细胞按照10000个细胞/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO2的条件下培养24小时后，分别加入ALDH1A3-mKateVenusN155、PKM2-EBFP2-VenusC155、ALDH1A3-VenusN155和PKM2-VenusC155质粒，转染3天后使用荧光显微镜进行观察拍照，结果显示转染ALDH1A3-mKate-VenusN155的细胞，使用蓝色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显蓝色荧光，使用红色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞具有红色荧光，使用绿色荧光进行镜下拍照，100ms曝光时间时，细胞无明显绿色荧光。转染PKM2-EBFP2-VenusC155的细胞，使用蓝色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞具有蓝色荧光，使用红色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显红色荧光，使用绿色荧光进行镜下拍照，100ms曝光时间时，细胞无明显绿色荧光。ALDH1A3-VenusN155的细胞，使用蓝色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显蓝色荧光，使用红色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显红色荧光，使用绿色荧光进行镜下拍照，100ms曝光时间时，细胞无明显绿色荧光。转染PKM2-VenusC155的细胞，使用蓝色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显蓝色荧光，使用红色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显红色荧光，使用绿色荧光进行镜下拍照，100ms曝光时间时，细胞无明显绿色荧光。分别加入PKM2-VenusC155+ALDH1A3-mKate-VenusN155、PKM2-EBFP2-VenusC155+ALDH1A3-VenusN155、ALDH1A3-mKate-VenusN155+PK M2-EBFP2-VenusC155和ALDH1A3-VenusN155+PKM2-VenusC155，转染3天后使用荧光显微镜进行观察拍照，结果显示转染PKM2-VenusC155+ALDH1A3-mKate-VenusN155的细胞，使用蓝色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显蓝色荧光，使用红色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞具有红色荧光，使用绿色荧光进行镜下拍照，100ms曝光时间时，细胞具有绿色荧光。转染PKM2-EBFP2-VenusC155+ALDH1A3-VenusN155的细胞，使用蓝色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞具有蓝色荧光，使用红色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显红色荧光，使用绿色荧光进行镜下拍照，100ms曝光时间时，细胞具有绿色荧光。ALDH1A3-mKate-VenusN155+PKM2-EBFP2-VenusC155的细胞，使用蓝色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞具有蓝色荧光，使用红色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞具有红色荧光，使用绿色荧光进行镜下拍照，100ms曝光时间时，细胞具有绿色荧光。转染ALDH1A3-VenusN155+PKM2-VenusC155的细胞，使用蓝色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显蓝色荧光，使用红色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞无明显红色荧光，使用绿色荧光进行镜下拍照，100ms曝光时间时，细胞具有绿色荧光。因此证实高通量小分子化合物筛选平台的构建符合预期。
(2)高通量小分子化合物筛选与结果统计
将指数生长期的293T细胞传代，将细胞按照10000个细胞/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO2的条件下培养24小时后，加入PKM2-VenusC155+ALDH1A3-mKate-VenusN155质粒，转染3天后使用荧光显微镜进行观察拍照，使用蓝色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞具有蓝色荧光，使用红色荧光进行镜下拍照，50ms曝光时间时，细胞具有红色荧光，使用绿色荧光进行镜下拍照，100ms曝光时间时，细胞具有绿色荧光。每孔分别加入10uM、30uM和50uM的DMSO、第31号化合物和第34号化合物，每组设置三个重复孔，作用24小时后，再次进行显微镜及荧光显微镜观察与拍照，根据细胞形态与细胞数评估化合物毒性，毒性评分为低(2)、中(1)、高(0)三个等级。根据绿色荧光比例与荧光强弱评估化合物的作用效果，作用效果评分为低(0)、中(1)、高(2)三个等级。总评分为毒性评分与作用效果评分之和，使用该评分标准分别对10μM、30μM和50μM浓度下的化合物进行评分。最终选取多次重复实验中，在10μM、30μM和50μM浓度下评分均为4的化合物作为候选小分子化合物。
如图2和表2所示，通过实施例2的计算机筛选计的方法，共筛选出4个潜在的PKM2中与ALDH1A3结合位点的靶向小分子物质，为了提高实验验证的效率，我们首先在步骤(1)构建了ALDH1A3与PKM2蛋白结合位点靶向小分子物质的高通量筛选平台。随后通过一系列前期预实验在步骤(2)确定了靶向小分子物质高通量筛选平台的实验参数。基于该筛选平台，将94个小分子物质分别以低浓度(10μM)、中浓度(30μM)和高浓度(50μM)三种浓度梯度用于实验验证。随后对每个小分子物质进行有效性与安全性打分，经过多次筛选验证，最终发现第31号、第34号、第44号、第77号化合物在低、中、高浓度中均能有效抑制ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白的结合，同时在低、中、高浓度中对正常细胞无明显毒性。随后，在转入ALDH1A3+PKM2混合质粒293T细胞中，分别加入低浓度(10μM)、中浓度(30μM)和高浓度(50μM)的第31号化合物与第34号化合物，作用12小时后进行IP实验。
结果显示，第31号、第34号、第44号、第77号化合物在低浓度(10μM)、中浓度(30μM)和高浓度(50μM)时均能有效抑制ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白的结合。
其中第31号化合物代号D287-0141，分子量320.80，结构式：
第34号化合物代号D490-0119，分子量409.56，结构式：
其中，第44号化合物代号D4075-4632，分子量277.29，结构式：
第77号化合物代号Y020-4149，分子量339.33，结构式：
表2药筛结果统计
表2对应图2B的数据。
实施例4ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白互作位点靶向小分子化合物能够逆转互作引起的糖酵解异常激活
如图3、表3～表7所示，实施例3研究发现第31号化合物与第34号化合物能够有效抑制ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白互作，然而药物的作用仍需进一步验证。在转入ALDH1A3+PKM2混合质粒293T细胞中，分别不做处理或加入10μMDMSO、10μM第31号化合物与10μM第34号化合物。
利用PKM酶活性检测试剂盒(Abcam，ab83432)检测不同物质处理后的293T细胞内PKM的活性结果发现与转染空载体质粒的293T细胞相比，转染ALDH1A3+PKM2混合质粒的293T细胞内PKM酶活性显著升高，低浓度DMSO处理后细胞的PKM酶活性无显著变化，与DMSO处理后的细胞相比，第31号化合物处理后的细胞PKM酶活性显著升高而第34号化合物处理后的细胞PKM酶活性显著降低。
利用细胞内丙酮酸含量检测试剂盒(Abcam，ab65331)检测不同物质处理后的293T细胞内丙酮酸含量，结果发现与转染空载体质粒的293T细胞相比，转染ALDH1A3+PKM2混合质粒的293T细胞内丙酮酸含量显著升高，低浓度DMSO处理或第31号化合物后细胞的丙酮酸含量无显著变化，与DMS O处理后的细胞相比，第34号化合物处理后的细胞丙酮酸含量显著降低。
利用LDH酶活性检测试剂盒(Abcam，ab102526)检测不同物质处理后的293T细胞内LDH的活性，结果发现与转染空载体质粒的293T细胞相比，转染ALDH1A3+PKM2混合质粒的293T细胞内LDH酶活性显著升高，低浓度DMSO处理后细胞的LDH酶活性无显著变化，与DMSO处理后的细胞相比，第31号化合物处理后的细胞LDH酶活性显著升高而第34号化合物处理后的细胞LDH酶活性显著降低。
利用细胞内乳酸含量检测试剂盒(Abcam，ab65331)检测不同物质处理后的293T细胞内乳酸含量，结果发现与转染空载体质粒的293T细胞相比，转染ALDH1A3+PKM2混合质粒的293T细胞内乳酸含量显著升高，低浓度DMSO处理后细胞内乳酸含量无显著变化，与DMSO处理后的细胞相比，第31号化合物处理后细胞内乳酸含量显著升高而第34号化合物处理后细胞内乳酸含量显著降低。
利用细胞内线粒体膜电位测试剂盒(Beyotime，C2006)检测不同物质处理后的293T细胞内丙酮酸含量，结果发现与转染空载体质粒的293T细胞相比，转染ALDH1A3+PKM2混合质粒的293T细胞内线粒体膜电位显著降低，低浓度DMSO处理或第31号化合物后细胞内线粒体膜电位无显著变化，与DMSO处理后的细胞相比，第34号化合物处理后细胞内线粒体膜电位显著升高(图3E)。
由此可见，第31号化合物能够有效抑制ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白互作，同时发挥激活PKM2活性的生物学功能，而第34号化合物能够有效抑制PKM2活性从而逆转ALDH1A3蛋白与PKM2蛋白互作引起的糖酵解通路的异常激活。
为了进一步验证第34号化合物的安全性，我们分别检测了其在星形细胞(HA)与原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)的IC50。结果显示，原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)对第34号化合物的敏感性显著较星形细胞(HA)高。这可能与原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)中糖酵解代谢异常激活有关。为了验证第34号化合物对替莫唑胺化疗敏感性的影响，在第34号化合物处理的原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)中，检测替莫唑胺IC50。结果显示，与第34号化合物未处理的细胞相比，第34号化合物处理后的原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)替莫唑胺IC50显著降低，重要的是，ALDH1A3敲除后的两株细胞(BNI-20-1-S1A3KO6与BNI-21-1-S1A3KO18)和ALD H1A3敲除后再回补ALDH1A3表达的两株细胞(BNI-20-1-S1A3KO6-RES与BNI-21-1-S1A3KO18-RES)均对替莫唑胺化疗敏感一致。研究结果表明，低浓度第34号化合物对星形细胞无明显细胞毒性，与替莫唑胺联用能够显著增加脑胶质瘤干细胞对替莫唑胺的敏感性。
表3
表3对应图3A的数据。
表4
表4对应图3B的数据。
表5
表5对应图3C的数据。
表6
表6对应图3D的数据。
表7
表7对应图3F的数据。
实施例5小鼠颅内成瘤模型验证药物疗效
为了进一步验证实施例3获得的化合物的药效结果，我们通过在小鼠颅内注射患者来源的胶质瘤干细胞系(BNI-20-1)构建原位异种移植成瘤模型。每周进行一次活体成像观测肿瘤生长情况。成功成瘤的小鼠被随机分为nc组、D34治疗组、TMZ治疗组和D34、TMZ联合治疗组，nc组每次腹腔注射100μL溶剂，TMZ组每次腹腔注射10mg/kg替莫唑胺，D34治疗组每次腹腔注射10mg/kgD34，联合治疗组每次腹腔注射10mg/kg替莫唑胺+10mg/kgD34，每7天一个周期，每周期连续治疗5天。
如图4、表8～表13所示，结果表明，与对照组相比，D34-919组肿瘤生长明显减慢，与替莫唑胺组相近，两药联用组肿瘤生长速度最慢，部分肿瘤生长明显受到抑制。生存分析表明，D34-919与替莫唑胺联用可以显著延长小鼠生存，而D34-919单药治疗与替莫唑胺单药治疗组生存未显示出显著差异。代谢分析表明，经过D34-919治疗后小鼠肿瘤组织中乳酸和丙酮酸含量显著下降，LDH和PKM酶活性被明显抑制。这些结果通过体内实验证实了D34-919对胶质瘤生长的抑制作用及其与替莫唑胺联合治疗的潜力。
表8
表8对应图4C的数据。
表9小鼠体重
表9对应图4D的数据。
表10小鼠丙酮酸
| NC-DMSO | Drug34 | |
| 4400 | 590 | |
| 2490 | 450 | |
| 1980 | 740 | |
| mean | 2956.666667 | 593.3333333 |
表10对应图4E右的数据。
表11小鼠乳酸
| NC-DMSO | Drug34 | |
| 25611.72161 | 10703.2967 | |
| 25391.94139 | 9384.615385 | |
| 25106.22711 | 9333.333333 | |
| mean | 25369.96337 | 9807.081806 |
表11对应图4E左的数据。
表12小鼠LDH酶活性
| NC-DMSO | Drug34 | |
| 65.13513514 | 27.18468468 | |
| 69.05405405 | 29.27927928 | |
| 70.51801802 | 30.27027027 | |
| mean | 68.23573574 | 28.91141141 |
表12对应图4F左的数据。
表13小鼠PKM酶活性
| NC-DMSO | Drug34 | |
| 195.3333333 | 63.77777778 | |
| 173.5555556 | 109.5555556 | |
| 203.1111111 | 79.5555556 | |
| mean | 190.6666667 | 84.29629633 |
表13对应图4F右的数据。
实施例6与现有PKM2抑制/激活剂的对比试验
实施例5结果显示，PKM2抑制剂D34可以通过占据相应位点，抑制PKM2的别构激活，从而特异性抑制肿瘤中的PKM2活性。为了验证上述药物与现有药物对PKM2活性的影响是否相同，我们在正常星形细胞系HA、胶质瘤干细胞系BNI-20中分别使用浓度为10μM的不同药物治疗后，检测细胞中PK的酶活性。
如图5和表14所示，结果表明，现有的PKM2抑制剂shinokin(C.I.75535，Selleck)和D34可显著抑制胶质瘤干细胞中的PK活性，但D34仅使胶质瘤干细胞中的PK活性恢复至正常细胞水平，而shinokin则显著抑制PK活性，因此，相比于shinokin，D34对正常细胞糖酵解速率影响较小，能在发挥抗肿瘤作用的同时兼具安全性。
在胶质瘤干细胞系BNI-20中分别使用10μMPKM2激动剂DASA-58和10μMD31处理，2h后检测PK活性。结果显示，相比于DASA-58，D31能更有效地激活PK活性。
表14
表14对应图5的数据。
实施例7D44和D77与相应对比例比较对HA、BNI-20细胞PKM2酶活性的影响
实验结果如表15所示，为了对比D44和D77药物和现有药物对PKM2活性的影响，我们在正常星形细胞系HA、胶质瘤干细胞系BNI-20中分别使用浓度为10μM的不同药物治疗后，检测细胞中PK的酶活性。
如表15所示，结果表明，现有的PKM2抑制剂shinokin(C.I.75535，Se lleck)和D77可显著抑制胶质瘤干细胞中的PK活性，但D77仅使胶质瘤干细胞中的PK活性恢复至正常细胞水平，而shinokin则显著抑制PK活性，因此，相比于shinokin，D77对正常细胞糖酵解速率影响较小，能在发挥抗肿瘤作用的同时兼具安全性。
在胶质瘤干细胞系BNI-20中分别使用10μMPKM2激动剂DASA-58和10μMD44处理，2h后检测PK活性。结果显示，相比于DASA-58，D44能更有效地激活PK活性。
表15D44和D77与相应对比例比较对HA、BNI-20细胞PKM2酶活性的影响
实施例8D77对HA、BNI-20、BNI-21细胞的IC50
为了进一步验证第77号化合物的安全性，我们分别检测了其在星形细胞(HA)与原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)的IC50。实验结果如表16所示，原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)对第77号化合物的敏感性显著较星形细胞(HA)高。这可能与原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)中糖酵解代谢异常激活有关。为了验证第77号化合物对替莫唑胺化疗敏感性的影响，在第77号化合物处理的原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)中，检测替莫唑胺IC50。结果显示，与第77号化合物未处理的细胞相比，第77号化合物处理后的原代脑胶质瘤干细胞系(BNI-20-1-S和BNI-21-1-S)替莫唑胺IC50显著降低，重要的是，ALDH1A3敲除后的两株细胞(BNI-20-1-S1A3KO6与BNI-21-1-S1A3KO18)和ALDH1A3敲除后再回补ALDH1A3表达的两株细胞(BNI-20-1-S1A3KO6-RES与BNI-21-1-S1A3KO18-RES)均对替莫唑胺化疗敏感一致。研究结果表明，低浓度第77号化合物对星形细胞无明显细胞毒性，与替莫唑胺联用能够显著增加脑胶质瘤干细胞对替莫唑胺的敏感性。
表16D77对HA、BNI-20、BNI-21细胞的IC50
实施例9D44和D77对双转染质粒的293T细胞LDH酶活性的影响
利用LDH酶活性检测试剂盒(Abcam，ab102526)检测不同物质处理后的293T细胞内LDH的活性，实验结果如表17所示，发现与转染空载体质粒的293T细胞相比，转染ALDH1A3+PKM2混合质粒的293T细胞内LDH酶活性显著升高，低浓度DMSO处理后细胞的LDH酶活性无显著变化，与DMSO处理后的细胞相比，第44号化合物处理后的细胞LDH酶活性显著升高而第77号化合物处理后的细胞LDH酶活性显著降低。
表17对双转染质粒的293T细胞LDH酶活性的影响
| MEAN | ||||
| NC | 549.3811202 | 534.1293036 | 535.4893382 | 539.6665874 |
| ALDH1A3+PKM2 | 1784.585129 | 1692.183566 | 1743.802261 | 1740.190319 |
| ALDH1A3+PKM2+DMSO | 1699.670607 | 1703.611214 | 1675.831563 | 1693.037795 |
| ALDH1A3+PKM2+Drug44 | 2037.161305 | 2023.763915 | 1939.637739 | 2000.187653 |
| ALDH1A3+PKM2+Drug77 | 432.2565129 | 434.817739 | 392.4589651 | 419.8444057 |
实施例10D44和D77对双转染质粒的293T细胞PKM2酶活性的影响
利用PKM酶活性检测试剂盒(Abcam，ab83432)检测不同物质处理后的293T细胞内PKM的活性，实验结果如表18所示，发现与转染空载体质粒的293T细胞相比，转染ALDH1A3+PKM2混合质粒的293T细胞内PKM酶活性显著升高，低浓度DMSO处理后细胞的PKM酶活性无显著变化，与DMSO处理后的细胞相比，第44号化合物处理后的细胞PKM酶活性显著升高而第77号化合物处理后的细胞PKM酶活性显著降低。
表18对双转染质粒的293T细胞PKM2酶活性的影响
实施例11D44和D77对双转染质粒的293T细胞丙酮酸浓度的影响
利用细胞内丙酮酸含量检测试剂盒(Abcam，ab65331)检测不同物质处理后的293T细胞内丙酮酸含量，实验结果如表19所示，发现与转染空载体质粒的293T细胞相比，转染ALDH1A3+PKM2混合质粒的293T细胞内丙酮酸含量显著升高，低浓度DMSO处理或第44号化合物后细胞的丙酮酸含量无显著变化，与DMSO处理后的细胞相比，第77号化合物处理后的细胞丙酮酸含量显著降低。
表19对双转染质粒的293T细胞丙酮酸浓度的影响
| mean | ||||
| NC | 117.146868 | 132.5912624 | 131.9339705 | 127.2240336 |
| ALDH1A3+PKM2 | 212.030946 | 207.7591102 | 202.50146 | 207.4305054 |
| ALDH1A3+PKM2+DMSO | 201.844258 | 200.0369467 | 201.3513508 | 201.0775185 |
| ALDH1A3+PKM2+Drug44 | 212.030946 | 201.0227498 | 202.172859 | 205.0755183 |
| ALDH1A3+PKM2+Drug77 | 140.9131416 | 102.6226598 | 118.8720206 | 120.8026073 |
实施例12D44和D77对双转染质粒的293T细胞乳酸浓度的影响
利用细胞内乳酸含量检测试剂盒(Abcam，ab65331)检测不同物质处理后的293T细胞内乳酸含量，实验结果如表20所示，发现与转染空载体质粒的293T细胞相比，转染ALDH1A3+PKM2混合质粒的293T细胞内乳酸含量显著升高，低浓度DMSO处理后细胞内乳酸含量无显著变化，与DMSO处理后的细胞相比，第44号化合物处理后细胞内乳酸含量显著升高而第77号化合物处理后细胞内乳酸含量显著降低。
表20对双转染质粒的293T细胞乳酸浓度的影响
| mean | |||||
| NC | 414.8610183 | 390.7086573 | 389.7228879 | 398.9237392 | 398.5540757 |
| ALDH1A3+PKM2 | 960.5880761 | 983.0480761 | 966.3386247 | 893.2245063 | 950.7998208 |
| ALDH1A3+PKM2+DMSO | 967.5708852 | 1010.453548 | 964.5313095 | 988.601463 | 982.7893014 |
| ALDH1A3+PKM2+Drug44 | 1949.600293 | 2196.545281 | 2100.757571 | 1715.470812 | 1990.593489 |
| ALDH1A3+PKM2+Drug77 | 394.0768837 | 416.8326262 | 349.6333577 | 472.2021946 | 408.1862655 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用；所述靶向抑制剂抑制PKM2和ALDH1A3的相互作用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向抑制剂包括：PMK2的抑制剂或PMK2的激活剂。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括：如式1或式2所示的化合物；所述激活剂包括：如式3或式4所示的化合物；
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述抑制剂降低PKM酶的活性；所述激活剂升高PKM酶的活性。
5.如权利要求2至4任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制剂降低LDH酶的活性；所述激活剂升高LDH酶的活性。
6.如权利要求2至5任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制剂降低细胞内乳酸含量；所述激活剂升高细胞内乳酸含量。
7.如权利要求2至6任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制剂降低细胞的丙酮酸含量。
8.如权利要求书2至7任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制剂升高细胞内线粒体膜电位。
9.如权利要求1至8任一项所述的应用，其特征在于，所述靶向抑制剂的给予量为10mg/kg动物体重。
10.如权利要求1至9任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括脑胶质瘤。
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| CN202211693691.9A CN115887467A (zh) | 2022-12-28 | 2022-12-28 | 小分子靶向抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150145588A (ko) * | 2014-06-20 | 2015-12-30 | 한국생명공학연구원 | 피루브산 키나아제 엠투(Pyruvate kinase type M2, PKM2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 약학적 조성물 |
| CN112156095A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-01-01 | 兰州大学 | M2型丙酮酸激酶小分子激活剂及其应用 |
| US20210186925A1 (en) * | 2017-11-07 | 2021-06-24 | First Affiliated Hospital Third Military Medical University Chinese People's Liberation Army P.R Of | Applications Of YD1701 In Preparation Of Drugs For Treating ALDH1A3 High-Expression Tumors |
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2022
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|---|
| HYENGOYAN, A. P.等: "Hindered internal rotation about a C-N bond in some trisubstituted 1, 3, 5-triazines", CHEMISTRY OF HETEROCYCLIC COMPOUNDS, vol. 41, no. 8, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 1059 - 1061, XP019276423 * |
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