CN112716943B - Ecca在制备抗肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了ECCA在制备抗肿瘤的药物中的应用。本发明经过实验证明了9‑乙基‑9H‑咔唑‑3‑甲醛(ECCA)在体外和体外均能够抑制黑色素瘤细胞的生长并诱导其凋亡，具有较强的抗黑色素瘤的活性，但对人体的正常组织细胞没有毒副作用，其具有开发成为治疗黑色素瘤的药物的潜力。

Description

ECCA在制备抗肿瘤的药物中的应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及ECCA在制备抗肿瘤的药物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

皮肤恶性黑色素瘤是最危险和最具侵袭性的皮肤癌类型，占皮肤癌相关死亡的75％以上。目前治疗黑色素瘤的策略有手术、化疗、放疗和免疫治疗。然而，对于黑色素瘤晚期患者，大多数传统疗法往往临床效果不佳，主要原因之一是靶向治疗应用的化疗耐药性。因此，迫切需要开发新的治疗方法和无严重副作用的药物来治疗黑色素瘤患者。

40年前发现在肿瘤细胞中肿瘤抑制因子TP53经常发生突变，这不仅使其抗肿瘤功能失效，而且在大多数人类肿瘤中也起到促进肿瘤生长的作用。然而，在人类黑色素瘤中发现了相对较低的p53突变率(低于20％)，该黑色素瘤主要存在致癌BRAF突变。野生型p53可诱导细胞周期阻滞、凋亡和细胞衰老，其激活在黑色素瘤中通常受到抑制，黑色素瘤中激活野生型p53通路已被成功证明可发挥抗肿瘤功能。目前，针对野生型p53治疗各种肿瘤(包括黑色素瘤)的药物已经进行了大量临床试验，尽管其中大多数仍处于I/II期研究。迄今为止，针对p53负性调节因子MDM2或MDMX的研究是p53药物再激活的主要途径，而MDM2或MDMX在基因表达、染色质修饰、DNA复制和线粒体动力学等多种生物学功能的调控中也发挥了重要作用，因此探索对肿瘤细胞p53直接有效的新靶点，而对正常细胞没有或几乎没有影响，将有利于未来的黑色素瘤治疗。

发明内容

本发明提供了化合物9-乙基-9H-咔唑-3-甲醛(9-ethyl-9H-carbazole-3-carbaldehyde，简称ECCA，CAS号7570-45-8)的制药用途，在本发明的研究过程中，发明人发现ECCA在体内和体外对黑色素瘤细胞均具有较强的抑制作用，但对人的正常组织几乎没有明显的毒副作用。

具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。

在本发明的第一方面，本发明提供了ECCA在制备抑制黑色素瘤细胞生长和/或诱导黑色素瘤细胞凋亡的药物或试剂中的应用。

在本发明的实施方式中，所述黑色素瘤细胞包括BRAF突变型黑色素瘤细胞和BRAF野生型黑色素瘤细胞。

在本发明的实施方式中，ECCA在体内和体外均能抑制黑色素瘤细胞生长和/或诱导黑色素瘤细胞凋亡。

在本发明的实施方式中，ECCA的浓度不低于0.1μM，优选不低于0.5μM。

在本发明的实施方式中，本发明验证了ECCA对多种具有不同突变类型的人类黑色素瘤细胞系(Mel-Juso、WM115、A375、M14和UACC62)的作用，结果发现1μM ECCA显著抑制所有黑色素瘤细胞系的生长，无论其是否含有野生型或突变的BRAF基因，并且抑制作用以剂量依赖性的方式发生，然而UACC62细胞对ECCA处理更为敏感，即使浓度低至0.5μM，UACC62细胞的生长也受到明显抑制，在进一步的研究中发现即使在0.5μM的低浓度下，细胞生长早在12小时时就被显著抑制，并且随着时间和浓度的增加，ECCA的生长抑制活性变得更有效。

在另外的一些实施方式中，本发明验证了ECCA对黑色素瘤细胞的选择性细胞毒性，采用ECCA化合物处理正常人原代黑色素细胞，结果发现ECCA在显著抑制黑色素瘤细胞生长的低浓度下对人原代黑色素细胞没有明显的细胞毒性作用。这表明，化合物ECCA能显著抑制黑色素瘤细胞的生长，但在体外不能抑制正常黑色素细胞的生长。

以及，在体内实验中证实了ECCA诱导黑色素瘤细胞凋亡以抑制肿瘤生长，并且在治疗期间小鼠没有发生死亡，并且即使在高剂量ECCA(50mg/kg)下也没有观察到其行为异常，这些结果表明ECCA在小鼠体内没有引起任何明显的健康问题，但明显减少了体内异种移植肿瘤的生长。

在本发明的第二方面，本发明提供了ECCA在制备调控p53信号通路的试剂或药物中的应用；

以及，ECCA制备调控p38-MAPK和JNK的试剂或药物中的应用；

以及，ECCA在制备调控caspase信号通路的试剂或药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，实验发现ECCA增加了黑色素细胞的野生型p53磷酸化(Ser15)蛋白的表达。当敲低或敲除p53时ECCA引起的细胞凋亡和衰老明显降低。在进一步的实施方式中，ECCA可增加p38-MAPK和c-Jun N末端激酶(JNK)的磷酸化蛋白的表达，用p38-MAPK或JNK抑制剂治疗可降低ECCA引起细胞生长的抑制，这一现象与细胞内p53的表达水平有关。结果表明，ECCA通过激活p53通路诱导黑色素瘤细胞凋亡和衰老，从而抑制p53野生型黑色素瘤细胞的生长。

在本发明的第三方面，本发明提供了ECCA在制备抗肿瘤的药物中的应用。

在本发明的实施方式中，所述肿瘤为含野生型p53的肿瘤；优选地，所述肿瘤为黑色素瘤和口腔鳞癌。

在本发明的第四方面，本发明提供了ECCA和BRAF抑制剂的药物组合在制备抗肿瘤药物中的应用。

在本发明的实施方式中，所述肿瘤为含野生型p53的肿瘤；优选地，所述肿瘤为黑色素瘤和口腔鳞癌。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种抗肿瘤的药物组合物或药物制剂，其含有ECCA。

在本发明的实施方式中，所述肿瘤为含野生型p53的肿瘤；优选地，所述肿瘤为黑色素瘤和口腔鳞癌。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种抗肿瘤的药物组合物或药物制剂，其含有ECCA和BRAF抑制剂在本发明的实施方式中，所述肿瘤为含野生型p53的肿瘤；优选地，所述肿瘤为黑色素瘤和口腔鳞癌。

本发明所述“组合物”指包括治疗有效量的规定成分的药物产品，以及直接或间接地由规定量的规定成分的组合产生的任何产品。

以及，本发明提供了一种药物制剂，其包含ECCA、或ECCA和BRAF抑制剂的组合，以及至少一种药学上可接受的辅料或载体。所述载体可以为液体或固体。所述药物制剂可以为口服制剂和肠胃外给药制剂，可以为片剂、丸剂、胶囊或注射剂等等。

可使用本领域技术人员公知的技术将本发明的化合物配制成药物组合物或制剂。合适的药用辅料可以是本领域已知的，例如参见2005年版的药用辅料手册(原著第四版)，作者(英)R.C.罗(RaymondCRowe)(美)P.J.舍斯基(PaulJSheskey)。

在本发明的第七方面，本发明提供了一种治疗黑色素瘤的方法，其包括向向受试者施用治疗有效量的ECCA或其组合物或其制剂。

本发明所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。

本发明所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。

相较于现有技术，本发明的优势在于：

p53是主要的肿瘤抑制因子，在许多癌症中存在突变，但在黑色素瘤中高达84％的黑色素瘤细胞含有野生型p53，所以p53被认为是黑色素瘤治疗的理想靶点。本发明评估了9-乙基-9H-咔唑-3-甲醛(ECCA)对黑色素瘤细胞的抗肿瘤活性。ECCA对BRAF突变型和BRAF野生型黑色素瘤细胞均有较强的抑制作用，但对人正常的黑色素细胞的抑制作用不大。体外研究发现ECCA通过增加细胞凋亡来抑制黑色素瘤细胞的生长，而细胞凋亡与caspase活性的上调有关，因此caspase抑制剂可抑制ECCA引起的细胞凋亡。体内实验也证实ECCA通过促进细胞凋亡和减少细胞增殖来抑制黑色素瘤的生长，重要的是对正常组织没有明显的毒性作用。RNA-Seq分析确定了几个ECCA引起的细胞凋亡相关的途径，特别是p53信号通路的激活。生化分析显示，ECCA增加了黑色素细胞的野生型p53磷酸化(Ser15)蛋白的表达。重要的是，当敲低或敲除p53时ECCA引起的细胞凋亡和衰老明显降低。进一步的研究表明，ECCA可增加p38-MAPK和c-Jun N末端激酶(JNK)的磷酸化蛋白的表达，用p38-MAPK或JNK抑制剂治疗可降低ECCA引起细胞生长的抑制，这一现象与细胞内p53的表达水平有关。最后，ECCA与BRAF抑制剂的联合应用显著增强了黑色素瘤细胞的生长抑制。综上所述，ECCA通过激活p53来诱导黑色素瘤细胞凋亡和衰老，从而在不影响正常人黑色素细胞的情况下，显著地、选择性地抑制黑色素瘤细胞的生长，显示了ECCA被研发成为治疗黑色素瘤的新药的潜力。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：

图1:与人原代黑素细胞相比，ECCA选择性地阻止黑色素瘤细胞的生长。(A)以DMSO为对照，用不同浓度的ECCA处理5株黑色素瘤细胞株。48小时后，收集细胞，用CCK8法测定细胞活力。(B)如图所示，用不同浓度的ECCA处理UACC62细胞，以DMSO为对照。在指示的不同时间点收集细胞，并通过CCK8分析细胞活力。(C)用连续浓度的ECCA处理UACC62细胞和人原代黑素细胞。48小时后，收集细胞，用CCK8法测定细胞活力。(D)结晶紫染色显示7天时不同浓度ECCA的细胞集落形成试验的代表性图像。(E)图(D)中细胞集落数量的量化。(F)不同浓度ECCA治疗后24小时EDU(绿色)免疫荧光染色的代表性图像如图所示。DAPI(蓝色)染色显示细胞核。白色箭头表示EDU阳性细胞。比例尺表示(F)中总共500个DAPI阳性细胞中100μm(G)EDU阳性细胞百分比(％)的定量。所有实验均进行3次，误差线代表平均值+标准差；将ECCA处理的细胞与对照组在A、B、E中进行比较时，P值用“*”表示，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.005，F组和G组采用Student's t检验，C组采用方差分析比较。

图2:ECCA诱导细胞凋亡具有时间和剂量依赖性。(A)在0、0.5、1和5μM浓度下用ECCA处理UACC62细胞，并在12小时收集细胞并通过FACs分析细胞凋亡。(B)图(A)中凋亡细胞百分比的量化。(C)用ECCA处理Mel-Juso细胞，浓度分别为0μM和10μM，12h后收集细胞，用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。(D)图(C)中凋亡细胞百分率的定量分析。(E)如图所示，在不同时间点裂解经ECCA处理的UACC62细胞，并对半胱氨酸蛋白酶-8、-9、-3的总蛋白和裂解活化蛋白，以及PARP的磷酸化蛋白和总蛋白进行免疫印迹分析。GAPDH作为一个管家基因被用作装载控制。红色(第一行箭头)、绿色(第二行箭头)、蓝色(第三行箭头)和黑色箭头(第四行箭头)分别表示p-PARP、c-Caspase8、c-Caspase9和c-Caspase3的表达上调。(F)将每个磷酸化蛋白标准化为相应的总蛋白条带后，量化(E)中c-Caspase8、c-Caspase9、c-Caspase3和p-PARP的相对水平，作为对相应对照细胞的相对表达变化，用虚线表示为1。(G)用DMSO(对照组)、10μM z-VAD-FMK、1μM ECCA、z-VAD-FMK(10μM)+ECCA(1μM)、5μM ECCA、z-VAD-FMK(10μM)+ECCA(5μM)处理UACC62细胞，12h收集细胞，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。(H)图(G)中凋亡细胞百分率的定量。所有实验均进行3次，误差线代表平均值+标准差；用Student's t检验比较ECCA处理的细胞与对照组在B、D、F中的差异，P值用“*”表示，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图3:在体内实验中ECCA抑制黑色素瘤生长。(A-B)异种移植UACC62细胞(A)和Mel-Juso(B)并腹腔注射ECCA或PBS(对照)后3周小鼠的代表性图像。(C-D)在(A-B)中从小鼠收集的肿瘤的代表性图像。两组肿瘤平均重量的量化如下图所示。(E)免疫荧光染色检测皮下肿瘤组织中Ki67(绿色)表达的代表性图像。DAPI(蓝色)染色鉴定细胞核。白色箭头表示Ki67阳性细胞。比例尺表示100μm.(F)在(E)中，Ki67阳性细胞百分比(％)的量化在总共500个DAPI阳性细胞中。(G)免疫荧光染色检测皮下肿瘤切片中切割Caspase3(红色)表达的代表性图像。DAPI(蓝色)染色鉴定细胞核。白色箭头表示切割后的Caspase3蛋白阳性细胞。比例尺表示100μm.(H)在(G)中，在总共500个DAPI阳性细胞中，切割的Caspase3阳性细胞百分比(％)的定量。所有实验均进行了3次，误差线代表平均值+标准差；经Student t检验，ECCA治疗组与对照组在C、E、G中比较，P值用“*”表示，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图4:ECCA对UACC62细胞基因表达谱影响的RNA序列分析。(A)火山图显示ECCA组和对照组在4小时和12小时时的DEGs。p值<0.001作为判定DEGs显著性的阈值。红点代表上调的DEGs，蓝点代表下调的DEGs，灰点表示两组之间没有显著变化的转录物。(B)Venn图显示ECCA治疗组和对照组在4小时和12小时的DEG数量。(C)根据每个样本的FPKM值对48个常见DEGs进行基因聚类分析。X轴表示不同的样本，而Y轴表示DEGs。颜色(从蓝色到红色)表示从低到高的DEG表达强度。(D)KEGG途径富集DEGs。X轴显示富集因子；左Y轴显示前20个阳性KEGG路径名称。颜色越深表示q值越小。气泡大小表示度数。(E)通过RT-PCR分析，5μM ECCA处理2、4、6、12小时的UACC62细胞中，由人类364基因标准化的mRNA(p53、p21、GADD45A、GADD45B和PUMA)的相对表达水平。所有实验均进行了3次，误差线代表平均值+标准差；通过Student t检验，将ECCA治疗组与对照组进行比较时，P值用“*”表示，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.005。

图5:ECCA激活p53通路诱导黑色素瘤细胞凋亡。(A)在指定浓度和时间用ECCA处理的UACC62细胞中p53磷酸化蛋白和总蛋白的免疫印迹分析。箭头表示磷酸化p53蛋白的表达上调。GAPDH是一种管家基因。(B)将每个磷酸化蛋白用相应的总蛋白标准化后，再与对照组相比得其倍数变化，用虚线表示为1。(C)ECCA作用于A375、Mel-Juso、M14和WM115细胞24h时p53磷酸化和总蛋白的免疫印迹分析。GAPDH是一种管家基因。(D)将每个磷酸化蛋白用相应的总蛋白标准化后，再与对照组相比得其倍数变化，用虚线表示为1。(E)用3个独立的p53siRNAs转染UACC62细胞，转染后48小时用ECCA(5μM)处理。24小时后，收集细胞，用CCK8法进行细胞活力分析。(F)野生型(对照)和p53-ko UACC62细胞用ECCA(5μM)处理，DMSO作为对照，并在24小时时收集细胞以用CCK8分析细胞活力。(G)用ECCA(5μM)或DMSO处理野生型(对照组)和p53-ko-UACC62细胞，12小时后用流式细胞仪分析细胞凋亡。(H)图(G)中凋亡细胞百分率的定量。(I)用5μM ECCA处理野生型和p53-ko-UACC62细胞24小时，然后用SA-βgal染色试剂盒固定和分析细胞以检测衰老细胞(蓝色，白色箭头)。比例尺＝100μm。(J)基于(I)中总共500个细胞的计数对SA-βgal-阳性细胞(蓝色，白色箭头)进行定量。所有实验均进行了3次，误差线代表平均值±标准差；P值用“*”表示，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.005当ECCA治疗组与对照组在(B和D)中进行比较时，p53 siRNA组与siRNA对照组在(E)中进行比较时，并用Student's t检验比较(D，F，J)行所示的相应两组。

图6：ECCA增加p38-MAPK和JNK激酶的磷酸化蛋白水平。(A)ECCA处理UACC62细胞后，用免疫印迹法分析JNK、p38-MAPK和ERK蛋白的磷酸化和总形式。红色(第一行箭头)和蓝色(第二行箭头)箭头分别表示p-JNK和p-p38-MAPK的上调表达。GAPDH是一种管家基因，用于控制负荷。(B，C)在(A)中磷酸化JNK(B)和p38(C)的相对水平的量化，其显示在每个磷酸化蛋白归一化为相应的总蛋白带(JNK或p38)后，与相应对照组的相对折叠变化，用虚线表示为1。(D)免疫印迹分析不同条件(DMSO(对照)、SB202190、JNK-in-8、ECCA、ECCA+SB202190、ECCA+JNK-in-8)处理的UACC62细胞24小时后JNK、p38 MAPK、p53、Caspase9和Caspase3蛋白的磷酸化和总形式。红色(第一行箭头)、蓝色(第二行箭头)和绿色(第三行箭头)箭头表示p-JNK、p-p38-MAPK和p-p53的表达下调，分别。黑色(第四行箭头)和黄色(第五行箭头)箭头表示C-Caspase9和C-Caspase3表达上调。GAPDH是一种管家基因，用于控制负荷。(E-I)在(D)中磷酸化JNK(E)、p38(F)、p53(G)和切割的半胱天冬酶9(H)和半胱天冬酶3(I)的相对水平的定量。(J)用DMSO(对照)、ECCA、ECCA+SB202190、ECCA+JNK-IN-8处理野生型和p53-ko-UACC62细胞。收集治疗后12小时的细胞，用CCK8法测定细胞活力。所有实验均进行了3次，误差条代表平均值±标准差；ECCA治疗组与对照组在B和C中比较时，P值用“*”表示，**表示P<0.01，***表示P<0.005，并将相应的两组进行比较，如(D)行所示，当相应的两组按学生t检验(E-J)中的线所示分组。

图7：ECCA与BRAFV600E抑制剂联合应用显著抑制黑色素瘤细胞生长。(A)四种黑色素瘤细胞系用不同的条件处理：DMSO(对照)、5μM ECCA、1μM PLX4032、5μM ECCA+1μMPLX4032。48小时后，收集细胞，用CCK8法测定细胞活力。(B)用免疫印迹法分析不同条件处理24小时后UACC62和A375细胞中p53和ERK蛋白的磷酸化和总蛋白。(C-D)定量分析(B)中磷酸化p53蛋白(C)和ERK蛋白(D)的相对水平。(E)ECCA和BRAFV600E抑制剂平行靶向两条独立的途径(p53凋亡和ERK增殖)，联合应用抑制黑色素瘤细胞的生长。所有实验均进行了3次，误差代表平均值±标准差；P值用“*”表示，**表示比较(A，C，D)行所示的相应两组时P<0.01。

图8:ECCA的化学结构及黑色素瘤细胞的基因突变状况。(A)ECCA的化学结构。(B)下表显示了黑色素瘤细胞的基因突变状态。

图9:ECCA对小鼠健康没有显著影响。(A)用ECCA或PBS治疗的小鼠平均体重的定量。(B)ECCA治疗后UACC62和Mel-Juso体内肿瘤生长曲线。(C)3周后注射50mg/kg ECCA或PBS(对照组)的小鼠的五个主要器官H&E染色的代表性图像。比例尺代表100μm。

图10:p53 siRNA和CRISPR-Cas9可有效降低UACC62细胞p53蛋白水平。(A，B)用3个独立的p53 siRNA转染UACC62细胞，转染后48小时收集细胞，用RT-PCR检测p53的表达(A)；72小时后收集细胞进行p53蛋白水平的免疫印迹分析(B)。GAPDH是一种管家基因，p53蛋白水平的定量显示在免疫印迹图下方。(C)携带CRISPR-Cas9的慢病毒与p53小导向RNA(p53-KO)或相应的空载体(对照)一起感染UACC62细胞。感染后48h，用嘌呤霉素筛选细胞48h，收集存活细胞进行p53蛋白免疫印迹分析。GAPDH是一种管家基因。所有实验均进行了3次，误差条代表平均值±标准差；P值用“*”表示，**表示P<0.01，用Student's t检验比较(B)中p53 siRNA组和siRNA对照组。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B，同时存在A和B三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，A/和B，可以表示：单独存在A，单独存在A和B两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本文使用的术语仅用于描述特定实施例，并且不意在限制本申请的示例实施例。如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”以及“该”意在包括复数形式，除非上下文明确指示相反意思。还应当理解术语“包括”、“包括了”、”包含”、和/或“包含了”当在本文中使用时，指定所声明的特征、整数、步骤、操作、单元和/或组件的存在性，并且不排除一个或多个其他特征、数量、步骤、操作、单元、组件和/或他们的组合的存在或增加。

应当理解，尽管在本申请可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本申请范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。

此外，特定特征、结构、功能或特性可以以任何适合的方式组合到一个或多个实施例中。例如，第一实施例可以结合第二实施例，只要与这两个实施例相关联的特定特征、结构、功能或特性不互相排斥。

实验例

1、材料和方法

1.1试剂

通过将化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中制备ECCA储备溶液(50mM)，然后用DMEM培养基稀释，以制备体外研究结果图中所示浓度的工作溶液，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释成浓度为7mM进行体内研究。

1.2细胞系和培养

从成人皮肤组织中分离原代人黑素细胞，并根据文献报道的方法进行分离和培养(Mi,J.et al.A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrinesecretion,enhancing establishment of primary human melanocytes andmelanocyte–keratinocyte co-cultures.Pigment Cell&Melanoma Research 33(2020).)。黑色素瘤细胞系Mel-JUSO、A375和UACC62用DMEM(Thermo Fisher Scientific)：F-12(Thermo Fisher Scientific)培养基进行培养，其中含有10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Thermo Fisher Scientific)。WM115和M14黑色素瘤细胞在含有10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基(Thermo FisherScientific)中培养。所有细胞均在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。

1.3细胞生长试验(CCK-8试验)

使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(Dojindo)测定细胞活力。将每孔2000个黑色素瘤细胞置于96孔板中，并用图中所示浓度的ECCA培养。在所示的不同时间点，向每个孔中添加10μl CCK-8工作溶液，然后将细胞在37℃下培养1.5小时。使用微孔板读取器(SpectrostarNano，BMG Labtech)在450nm波长处记录光密度。

1.4菌落形成试验

将每孔1000个黑色素瘤细胞置于6孔板中培养过夜，每2天用含有不同浓度ECCA的培养基替换细胞培养基，如图所示。在第10天，用PBS清洗细胞两次，然后用4％多聚甲醛溶液(Sigma-Aldrich)固定20分钟，并用0.1％结晶紫(Solarbio Science&Technology)染色。用显微镜计数50个以上的细胞集落。

1.5 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EDU)染色分析

使用EDU试剂盒(RiboBio Co)进行EDU染色分析。简单地说，每孔5x 105个细胞被置于24孔板中过夜生长。第二天，用不同浓度的ECCA处理细胞。24小时后，将50μl EDU工作液添加到培养基中，并在37℃下培养2小时。然后用冰冷的PBS清洗细胞，用4％多聚甲醛固定15分钟，然后在室温下用2mg/ml甘氨酸培养5分钟，并用

488和Hoechst工作液在培养基中染色黑暗30分钟。BX53-DP80荧光显微镜(Olympus)用于染色分析。

1.6定量RT-PCR(qRT-PCR)分析

使用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA，然后溶解在无核酸酶的水中，然后使用纳米滴分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量RNA浓度。使用TakaraPrimeScriptTM RT试剂盒(Takara Bio Inc.)从每个总RNA中反向转录互补DNA。PCR反应用Takara SYBRR Premix Ex TaqTM II(Takara Bio Inc.)和LightCyclerR480II(罗氏诊断公司)进行。在总共20μl的qRT PCR反应中使用每个cDNA的100ng进行扩增。PCR反应在95℃下进行30秒，然后在95℃下进行40个循环5秒，在60℃下进行20秒，并在72℃下以延伸步骤结束15秒。Ct值用于定量，并通过人类管家基因364标准化的2-ΔΔCt方法计算相对mRNA表达水平。所用的PCR引物列于表1。

Gene	Forward Primers	Reverse Primers
			36β4	GCAATGTTGCCAGTGTCTGT	GCCTTGACCTTTTCAGCAAG
p53	AACTGCGGGACGAGACAGA	AGCTTCAAGAGCGACAAGTTTT
			p21	TGTCCGTCAGAACCCATGC	AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC
GADD45A	GAGAGCAGAAGACCGAAAGGA	CAGTGATCGTGCGCTGACT
			GADD45B	TACGAGTCGGCCAAGTTGATG	GGATGAGCGTGAAGTGGATTT
PUMA	GCCAGATTTGTGAGACAAGAGG	CAGGCACCTAATTGGGCTC

1.7病毒产生和感染

p53靶向CRISPR-Cas9质粒和相应的对照质粒由Paolo Dotto博士(MassachusettsGeneral Hospital,Boston,MA,USA)提供。进行慢病毒制备和感染(Wen,J.,Zu,T.,Zhou,Q.,Leng,X.&Wu,X.Y-27632simplifies the isolation procedure of human primaryepidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermalcells.Journal of Tissue Engineering&Regenerative Medicine 26,433-435(2017).)。用脂质体3000(Invitrogen)将慢病毒载体和相应的包装载体(pCMV-VSV-G和psPAX2)转染到HEK293细胞中，并在转染后24、48和72小时收集含病毒培养基。对于UACC62细胞感染，将3X 105细胞接种到100mm细胞培养皿中。第二天，向培养基中加入6ml含有8μg/mlpolybrene的含病毒培养基。培养4-6小时后，去除含病毒的培养基并用正常的DMEM培养基代替。48小时后，用1μg/ml嘌呤霉素筛选感染的黑色素瘤细胞48小时，收集存活细胞进行Western-blot分析，验证p53基因的缺失效率。

1.8蛋白质印迹分析

为了制备全细胞蛋白提取物，用冰冷PBS洗涤细胞两次，然后用含有1％苯甲基磺酰氟(PMSF)和1％磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液在4℃下裂解30分钟，然后在12000r.p.m.下在4℃下离心10分钟并收集上清液。使用BCA蛋白质定量试剂盒(Solarbio)测定蛋白质浓度。在10％SDS-PAGE凝胶(Beyotime)上分离每道20μg蛋白质，然后按照制造商的方案电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)上。在含有0.05％吐温-20(TBST)的Tris缓冲盐水中用5％牛血清白蛋白封闭膜，然后在4℃温和摇动器上与下文所述的特异性一级抗体一起培养过夜。第二天，用TBST洗涤3次，每次10分钟后，在室温下与适当的二级抗体在缓冲液中孵育2小时。最后，用增强化学发光试剂(milipore)进行检测，并用图像J分析法对免疫反应条带进行定量分析。

使用以下一级和二级抗体：Caspase3(CST，9662)，切割Caspase3(CST，9664)，Caspase8(CST，8592)，Caspase9(Abcam，ab202068)，PARP(Proteintech，13371-1-AP)，p53(Abcam，ab26)，p-p53(CST，9284)，p38-MAPK(CST，8690)，p-p38-MAPK(CST，4511)，JNK(CST，9252)，p-JNK(CST，#ERK1/2(CST，#4695)，p-ERK1/2(CST，#4370)，HRP抗小鼠(CST，#7076)，HRP抗兔(CST，#7074)。

1.9流式细胞术

UACC62细胞以3x105细胞/孔的密度接种于6孔板中。用含有ECCA的培养液孵育12小时后，用冷PBS洗涤细胞两次，然后收集细胞并在室温下在含有5μl Annexin V-FITC和10μl PI(BD Biosciences)的500μl结合缓冲液中避光培养10分钟，然后使用流式细胞仪(FACS Calibur，BD Biosciences)进行分析。

1.10 siRNA转染

进行siRNA转染(Chang,F.et al.ROCK inhibitor enhances the growth andmigration of BRAF-mutant skin melanoma cells.Cancer Sci 109,3428-3437,doi:10.1111/cas.13786(2018).)。简而言之，使用脂质体3000以20nM的最终浓度用siRNA p53或干扰siRNA(对照)转染UACC62细胞。72小时后，收集细胞进行RT-PCR分析和westernblot分析。

使用的siRNA寡核苷酸序列如下：

p53-634:Sense 5’-GCUGUGGGUUGAUUCCACATT-3’,

Anti-sense 5’-UGUGGAAUCAACCCACAGCTT-3’

p53-805:Sense 5’-GCGUGUGGAGUAUUUGGAUTT-3’,

Anti-sense 5’-AUCCAAAUACUCCACACGCTT-3’

p53-1048:Sense 5’-GCGCACAGAGGAAGAGAAUTT-3’,

Anti-sense 5’-AUUCUCUUCCUCUGUGCGCTT-3’

1.11RNA序列分析

用Trizol试剂提取经不同条件和时间处理的UACC62细胞的总RNA，转录后用BGISEQ-500系统进行RNA序列分析。基因表达量以FPKM(每千碱基转录物的片段数/100万个片段图)计算。log2(Fold change)>1和Q<0.001的基因被认为是差异表达基因(DEGs)。在DEGs的基础上进行了火山图、Venn图、基因聚类分析和KEGG(京都基因和基因组百科全书)路径分析。RNA-Seq数据已提交给SRA(NIH Sequence Read Archive)数据库，SRA登录号为PRJNA611509。

1.12体内肿瘤异种移植试验

将8周龄雌性裸鼠(北京潍通利华实验动物技术有限公司)随机分为两组：对照组(N＝6，仅PBS)和ECCA治疗组(N＝6，10mg/kg ECCA)。如Chang,F.et al.ROCK inhibitorenhances the growth and migration of BRAF-mutant skin melanoma cells.CancerSci 109,3428-3437,doi:10.1111/cas.13786(2018).所述，将1×10⁶个UACC62细胞皮下注射到每只小鼠的背部皮肤中，每只小鼠有4个注射部位。每只小鼠每天腹腔注射PBS或ECCA，连续3周。每3天用卡尺测量一次肿瘤大小，用V＝π/6×L×W×H公式计算肿瘤体积。每周测量3次小鼠体重。3周后处死小鼠，收集肿瘤并称重。

1.13组织学和免疫荧光分析

将肿瘤组织包埋于OCT中冷冻。利用冰冻切片机制作10μm冰冻切片进行组织学分析。免疫荧光染色方法根据文献中所述(Wen,J.,Li,X.,Leng,X.,Xu,X.&Wu,X.An advancedmouse model for human skin wound healing.Exp Dermatol 26,433-435,doi:10.1111/exd.13258(2017).)。简单地说，将每个切片固定在固定液中孵育15分钟，然后在4℃下与一级抗体孵育过夜。第二天，切片用PBS洗涤3次并与二级抗体孵育抗体在室温黑暗中。1小时后，用DAPI(Abcam)固定切片。BX53-DP80免疫荧光显微镜(Olympus)用于染色分析。使用以下一级和二级抗体：裂解Caspase3(CST，#9664)、Ki67(Abcam，#15580)、DyLight488山羊抗小鼠IgG(H+L)和DyLight594山羊抗兔IgG(H+L)。

1.14细胞衰老检测

将含有或不含有p53缺失的黑色素瘤细胞与5μM ECCA在6孔板中孵育。24h后，用4％甲醛固定细胞。使用衰老半乳糖苷酶染色试剂盒(Beyotime，上海，中国)测定衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-gal)。对每组随机选取的5个场的图像进行分析。每组500个细胞进行分析，数据通过三个独立实验进行分析。

1.15统计分析

使用GraphPad Prism 7(Graph Pad软件公司)进行统计分析，数据以平均值±平均值标准误差(SEM)表示。所有实验至少进行三次。两组比较采用Student t检验，两组以上比较采用单因素或双因素方差分析。统计分析的P值如图所示。

2、结果

2.1ECCA能显著抑制人黑色素瘤细胞的生长，但对体外培养的人原代黑色素细胞几乎没有影响

ECCA(化学结构如图8A)，影响黑色素瘤细胞生长，本实验例选择了多种具有不同类型突变的人类黑色素瘤细胞系(Mel-Juso、WM115、A375、M14和UACC62，每个细胞系的详细突变状态如图8B所示，用不同浓度的ECCA处理。在治疗后48小时测量细胞存活率，结果发现1μM ECCA显著抑制所有黑色素瘤细胞系的生长，无论其是否含有野生型或突变的BRAF基因，并且抑制作用以剂量依赖性的方式发生(图1A)，然而UACC62细胞对ECCA处理更为敏感，即使浓度低至0.5μM，UACC62细胞的生长也受到明显抑制，这使得本实验例对ECCA处理对该细胞系的作用进行了更深入的研究。用低浓度ECCA处理UACC62细胞，观察细胞在4～48h不同时间点的生长情况。实验发现即使在0.5μM的低浓度下，细胞生长早在12小时时就被显著抑制(图1B)，并且随着时间和浓度的增加，ECCA的生长抑制活性变得更有效。为了进一步确定ECCA对黑色素瘤细胞的选择性细胞毒性，本实验例用这种化合物处理正常人原代黑色素细胞，结果发现ECCA在显著抑制UACC62细胞生长的低浓度下对人原代黑色素细胞没有明显的细胞毒性作用(图1C)。为了进一步测试ECCA对黑色素瘤细胞生长的影响，我们进行了集落形成实验(图1D，E)和EDU染色(图1F，G)以评估细胞增殖。图1D、E显示在0.5μM ECCA下形成的菌落数量显著减少，并且在该浓度下，EDU阳性细胞的百分比也显著降低。

综合这些数据表明，化合物ECCA能显著抑制黑色素瘤细胞的生长，但在体外不能抑制正常黑色素细胞的生长。

2.2 ECCA体外诱导黑色素瘤细胞的细胞凋亡

为了阐明ECCA诱导细胞毒性的机制，本实验例还评估了ECCA对黑色素瘤细胞死亡的影响。首先研究ECCA是否促进黑色素瘤细胞凋亡，这是大多数抗肿瘤药物诱导癌细胞死亡的关键类型。首先，用流式细胞仪分析ECCA治疗12h后的细胞凋亡情况。ECCA能显著增加UACC62细胞凋亡的比例，且呈浓度依赖性。与对照组(3.8±3.1％)相比，在0.5μM、1μM和5μM剂量下，UACC62细胞的凋亡率分别增加到10.3±1.7％、25±4.8％和43.6±2.8％(图2A、B)。ECCA诱导的黑色素瘤细胞凋亡进一步被含有突变NRAS和野生型BRAF基因的Mel-Juso细胞证实(图2C-D)。与图1A中生长测定的观察结果一致，与UACC62细胞相比，Mel-Juso细胞对ECCA处理的敏感性较低，但在10μM ECCA处理下细胞发生显著凋亡。凋亡的诱导通常涉及半胱天冬酶(caspase)途径的激活。结果发现，5μM ECCA处理后12小时，切割的caspase3(黑色箭头，第四行箭头)及其靶蛋白聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)(红色箭头，第一行箭头)的水平增加，切割的caspase8(绿色箭头，第二行箭头)和切割的caspase9(蓝色箭头，第三行箭头)的水平也增加(图2E，F)。结果表明，ECCA能激活caspase通路诱导黑色素瘤细胞凋亡。为了进一步证实半胱天冬酶参与ECCA诱导的细胞凋亡，用广谱半胱天冬酶抑制剂(z-VAD-FMK)在10μM下预处理细胞2小时后添加ECCA。用z-VAD-FMK预处理可显著阻断细胞凋亡，在1μM和5μM剂量下分别为11.4±1.7％和25±4.8％，以及20.2±1.5％和43.6±2.8％(图2G，H)。综上所述，ECCA处理可显著促进黑色素瘤细胞凋亡。

2.3 ECCA在体内抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡

为了探索ECCA在体内是否也抑制黑色素瘤细胞的生长，本实验例将UACC62或Mel-Juso细胞皮下注射到裸鼠背部皮肤中。给每只小鼠注射4次，每次注射1×10⁶个细胞，然后每天给UACC62异种移植小鼠腹腔注射10mg/kg ECCA或给Mel-Juso异种移植小鼠腹腔注射50mg/kg ECCA，PBS仅作为对照组。每三天测量一次肿瘤体积大小，结果发现ECCA显著抑制肿瘤生长(图3A-B，图9A)。三周后，处死小鼠，收集并称重形成的肿瘤。观察到，经ECCA处理的小鼠中形成了更小的肿瘤，并且经ECCA处理的平均肿瘤重量显著降低，抑制率约为55％(图3C-D)。对肿瘤组织进行Ki67染色结果显示，在ECCA治疗的肿瘤中，增殖细胞明显减少，40±5.2％，而在PBS治疗的肿瘤中，增殖细胞为70±4.5％(图3E，F)，这一结果也支持ECCA可抑制了肿瘤的体内生长。为了证实ECCA也能够诱导黑色素瘤细胞凋亡，对切割的caspase3进行染色，染色显示肿瘤细胞凋亡显著增加，ECCA治疗组为36±2.6％，对照组为2±0.6％(图3G，H)。这些体内数据结果也证实了ECCA诱导黑色素瘤细胞凋亡以抑制肿瘤生长的结果。

在治疗期间小鼠没有发生死亡，并且即使在高剂量ECCA(50mg/kg)下也没有观察到其行为异常，例如慢性惊厥、厌食、嗜睡和/或毛发皱褶。ECCA治疗组小鼠生长与对照组相同，体重无明显变化(图9B)。所有小鼠解剖后，用苏木精-伊红(H&E)染色法检测心、肝、脾、肺、肾五大脏器，ECCA治疗后未见明显病理损伤。图9C)。综上所述，这些结果表明ECCA在小鼠体内没有引起任何明显的健康问题，但明显减少了体内异种移植肿瘤的生长。

2.4 RNA-seq分析显示ECCA激活p53信号通路

为了进一步探讨ECCA诱导黑色素瘤细胞凋亡的可能分子机制，本实验例利用RNA-seq分析了ECCA治疗后早期(4小时和12小时)UACC62细胞的整体转录组变化。对照组和5μMECCA处理的细胞在4小时时共鉴定出72个上调基因和20个下调基因，共计92个有统计学意义的差异基因(DEGs)(图4A，左图)。此外，在12小时时，在对照细胞和5μM ECCA处理的细胞之间发现251个上调基因和191个下调基因，总计442DEGs(图4A，右图)。在所有DEG中，48个出现在两个时间点(图4B)，对其进行了基因聚类分析，如图4C所示。此外，对富集的KEGG途径进行了分析，图4D显示了两组之间48种DEG中涉及的前20条途径。该分析表明，p53信号途径和凋亡途径是两种最显著富集的途径ECCA治疗组。通过RNA-seq分析确定的在细胞凋亡调节中起关键作用的p53途径的激活通过qRT-PCR分析得到进一步验证，qRT-PCR分析显示，经ECCA治疗后，p53及其下游靶基因p21、GADD45A、GADD45B和PUMA的表达增加(图4E)。总之，这些结果表明ECCA主要通过激活p53信号通路诱导黑色素瘤细胞凋亡。

2.5 ECCA通过激活p53通路诱导黑色素瘤细胞凋亡

肿瘤抑制因子p53是一种参与诱导细胞凋亡的关键蛋白，被认为是治疗各种癌症，尤其是黑色素瘤的一个有潜力的靶点，因为80％以上的黑色素瘤含有野生型p53基因。为了研究ECCA是否确实通过激活p53途径诱导黑色素瘤细胞凋亡，本实验例分析了Ser15处p53的磷酸化状态，该状态已被证明是磷酸化的，因为在化学抗肿瘤试剂诱导的细胞凋亡中在Ser15处磷酸化的磷酸化蛋白常常表达增加。结果发现，在用5μM ECCA治疗后6小时，Ser15处磷酸化的p53表达水平显著增加，并且在用较低浓度(0.5μM)的ECCA治疗后24小时，在含有野生型p53基因的UACC62细胞上也显著增加(图5A，B，箭头)。ECCA处理后Ser15处p53磷酸化水平的增加在其他具有野生型p53的黑色素瘤细胞中得到证实：Mel-Juso、A375和WM115细胞，但在具有突变型p53的M14细胞中没有得到证实(图5C、D)。为了进一步确定ECCA对UACC62细胞死亡的抑制作用是否主要依赖于p53的激活，本实验例利用siRNA技术在UACC62细胞中敲低p53，并通过RT-PCR和westernblot分析证实了p53的敲低效率(图10A、B)。很明显，p53的敲低抵消了ECCA对黑色素瘤细胞生长的抑制作用(图5E)。为了进一步证实p53的作用，我们利用CRISPR-Cas9介导的p53缺失技术建立了一个p53缺失的UACC62细胞系(p53-ko)，并通过westernblot分析证实了p53蛋白的缺失(图10C)。与野生型p53的对照细胞相比，ECCA处理后24小时p53-ko细胞的活力显著增加(图5F)。FACS分析显示，与对照组相比，在用5μM ECCA治疗12小时后，p53-ko组的凋亡细胞百分比显著降低(图5G，H)。

p53的激活已被证明可诱导细胞周期停滞、凋亡和衰老。基于以上研究，本实验例认为ECCA可以通过激活p53来诱导黑色素瘤细胞的衰老，并通过β-gal染色实验发现ECCA显著诱导黑色素瘤细胞衰老，并且ECCA处理后p53-ko细胞中的衰老诱导显著降低(图5I-J)。综上所述，这些结果表明ECCA通过激活p53通路诱导黑色素瘤细胞凋亡和衰老，从而抑制p53野生型黑色素瘤细胞的生长。

2.6ECCA显著增加p38-MAPK和JNK激酶的磷酸化，激活黑色素瘤细胞中的p53通路

本实验例还探讨了ECCA如何激活黑色素瘤细胞中的p53通路。本领域一般技术人员知晓哺乳动物丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)包括p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、应激活化蛋白激酶[SAPK/c-Jun N末端激酶(JNK)]和细胞外信号调节激酶(ERK)，在某些化学试剂诱导的细胞凋亡过程中参与p53的调节(Virginie,L.et al.Lupulone triggers p38MAPK-controlled activation of p53 and of the TRAIL receptor apoptotic pathwayin human colon cancer-derived metastatic cells.Oncology reports 26,109-114(2011)；Yong-Won,K.,Shugo,U.,Masaya,U.,Junji,Y.&Hiroshi,M.Mechanism of p53-dependent apoptosis induced by 3-methylcholanthrene:involvement of p53phosphorylation and p38 MAPK.The Journal of biological chemistry 277,1837-1844(2002))。已经证明MAP激酶可以直接在Ser15位置出磷酸化p53以激活它，并且p53的核易位也可以通过MAPK途径调节(She,Q.,Chen,N.&Dong,Z.ERKs and p38 kinasephosphorylate p53protein at serine 15in response to UV radiation.The Journalof biological chemistry 275,20444-20449(2000)；Smitha,K.et al.Selectiveactivation of p38mitogen-activated protein kinase in dopaminergic neurons ofsubstantia nigra leads to nuclear translocation of p53 in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice.The Journal of neuroscience:theofficial journal of the Society for Neuroscience 28,12500-12509(2008)；Chouinard,N.,Valerie,K.,Rouabhia,M.&Huot,J.UVB-mediated activation of p38mitogen-activated protein kinase enhances resistance of normal humankeratinocytes to apoptosis by stabilizing cytoplasmic p53.The Biochemicaljournal 365,133-145(2002))。重要的是，MAPK信号通路被鉴定为富含ECCA处理的黑色素瘤细胞的顶级富集KEGG通路之一(图4D)。在这方面，本实验例使用针对MAPKs的磷光体特异性抗体通过westernblot分析来监测MAP激酶家族的激活。ECCA所有MAPK的磷酸化水平，尤其是JNK(红色箭头，第一行箭头)和p38-MAPK(蓝色箭头，第二行箭头)的磷酸化水平(图6A，B)。值得注意的是，6小时是1μM ECCA可诱导p38-MAPK的磷酸化，0.5μM ECCA可诱导JNK的磷酸化，以上过程均早于p53通路的激活(图6A-C)。为了证实p38-MAPK和JNK在ECCA处理的黑色素瘤细胞中参与p53的激活，本实验例用特异性激酶抑制剂来治疗黑色素瘤细胞。SB202190和JNK-IN-8分别是p38MAPK和JNK的特异性抑制剂，显著抑制p53蛋白的激活以及Caspase途径(图6D-H)。对于细胞生长，SB202190和JNK-IN-8处理后ECCA对黑色素瘤细胞的抑制率降低约20％(图6H)。相比之下，与SB202190或JNK-In-8与ECCA共同处理的p53-ko细胞与仅ECCA处理相比，其细胞生长抑制没有显著差异(图6H)。这些结果提示ECCA通过诱导p38-MAPK和JNK活化来激活p53通路，从而抑制黑色素瘤细胞的生长。

2.7ECCA与BRAF^V600E抑制剂联合应用可显著抑制黑色素瘤细胞的生长。

激活p53可促进细胞凋亡，与抑制细胞增殖的BRAF抑制剂结合，可通过靶向两种快速途径有效治疗黑色素瘤，因此，本实验例检测了ECCA与BRAF^V600E抑制剂(PLX4302)的联合是否增强了对黑色素瘤细胞生长的抑制作用。4种p53野生型黑色素瘤细胞(Mel-Juso、WM115、A375和UACC62)分别用ECCA单独或PLX4032单独或联合ECCA和PLX4032处理。与之前的报道一致，BRAF^V600E抑制剂特异性地抑制BRAFV600E突变黑色素瘤细胞(UACC62和A375)，但是在没有BRAFV600E表达的情况下对黑色素瘤细胞的生长没有显著影响(Mel-Juso，WM115)(图7A)；ECCA可以抑制所有4种黑色素瘤细胞系的生长(图7A)，并且两种化合物的组合更加明显抑制表达BRAF^V600E的黑色素瘤细胞的生长(图7A)。Western-blot分析证实，单独使用PLX4032或PLX4302与ECCA联合使用(而非单独使用ECCA)可显著降低ERK的活性，单独使用ECCA或ECCA与PLX4302联合使用(而非单独使用PLX4302)可增加A375和UACC62细胞的p53的活性(图7B-D)。综上所述，这些数据表明ECCA和BRAF抑制剂的组合可以靶向两种快速途径(凋亡和增殖)，以增强BRAF^V600E表达的黑色素瘤细胞的生长抑制(图7E)。

3、讨论

尽管包括免疫治疗在内的一些先进治疗黑色素瘤的方法被报道和应用，但是黑色素瘤患者的治疗仍然是一个重大的挑战。在这项研究中，本发明证明了ECCA在体外和体内显著阻断BRAF突变和野生型黑色素瘤细胞的生长。重要的是，ECCA对正常人原代黑色素细胞的细胞毒性较低，给予ECCA(50mg/kg)对小鼠健康无明显影响，但能抑制异种移植黑色素瘤的生长。这些数据支持ECCA成为治疗黑色素瘤药物的潜力。

为了了解ECCA如何抑制黑色素瘤生长，本发明研究了ECCA是否诱导黑色素瘤细胞凋亡，这是预防癌症进展的关键靶点。事实上，本发明发现ECCA对黑色素瘤细胞生长的抑制作用与细胞凋亡水平的增加有关，Annexin/PI染色揭示了这一点，并通过分析诱导凋亡的半胱氨酸蛋白酶级联反应得到证实。caspase抑制剂z-VAD-FMK显著降低ECCA诱导的细胞凋亡，进一步支持ECCA以caspase依赖的方式诱导黑色素瘤细胞凋亡。重要的是，ECCA对细胞凋亡的诱导作用在体内也得到了证实。

为了进一步探索ECCA诱导黑色素瘤细胞凋亡的分子机制，RNA-seq分析显示，在ECCA处理的黑色素瘤细胞中，p53途径是最活跃和最重要的途径，p53下游靶基因p21、GADD45、PUMA的表达也在ECCA处理黑色素瘤细胞后表达显著增加。在生理条件下，p53维持在一个低表达水平，主要通过p53-MDM2复合物的负反馈进行调节，其中累积的p53激活MDM2蛋白的表达，MDM2结合到p53的转录激活域以抑制其转录活性。研究表明，在细胞应激下，p53的翻译后修饰在其稳定和激活中起着重要作用，包括磷酸化和乙酰化。在本发明的研究中，ECCA治疗后，野生型p53的黑色素瘤细胞Ser15处p53磷酸化显著增加，这可能导致p53转录活性的增加和p53蛋白的积累。同时本发明人观察到黑色素瘤细胞的衰老增加，进一步支持ECCA在黑色素瘤细胞中激活野生型p53。对于p53突变型细胞，ECCA不激活p53通路，这可能解释了野生型p53的黑色素瘤细胞(UACC62、Mel-Juso、A375、WM115)比突变型p53细胞(M14)对ECCA更敏感的原因。为了进一步检测ECCA诱导的黑色素瘤细胞凋亡是否依赖于p53的激活，本发明利用siRNA技术和CRISPR-Cas9介导的p53缺失阻断了黑色素瘤细胞中p53的表达，发现p53的低表达明显降低了黑色素瘤细胞对ECCA的敏感性。因此，本发明提出ECCA主要激活p53通路，进而增强caspase通路诱导黑色素瘤细胞凋亡。考虑到p53缺失或z-VAD-FMK治疗并不能完全消除黑色素瘤细胞凋亡，ECCA也能抑制p53突变黑色素瘤细胞的生长，尽管p53突变的细胞与野生型细胞相比不太敏感，因此，不能排除其他p53非依赖和/或caspase非依赖的通路可能参与ECCA诱导的细胞死亡，这需要进一步的研究。

最后，本发明研究了ECCA如何调控p53通路。研究表明，在细胞应激刺激下，p53蛋白被上游激酶磷酸化和激活，包括MAP激酶。RNA-seq分析证实MAPK通路在ECCA处理的细胞中富集。事实上，ECCA处理增加了p38和JNK激酶的活性，p38-MAPK和JNK的磷酸化增加出现的时间早于p53的磷酸化。已有研究表明p38-MAPK和JNK激酶在Ser15处磷酸化p53蛋白，导致p53的累积和随后的细胞凋亡诱导。ECCA与p38-MAPK或JNK激酶抑制剂联合治疗可降低ECCA对野生型p53黑色素瘤细胞生长的抑制作用，但对p53-ko细胞则无此作用。由于p53已被证明调节其自身的转录，因此p53通路的激活也可能导致ECCA处理细胞中p53 mRNA或蛋白水平的增加。因此，本发明得出结论，ECCA可能通过调节MAPK途径来激活触发黑色素瘤细胞凋亡的p53途径，然而，进一步的研究将有助于研究ECCA是否也参与调节p53与MDM2或MDMX的相互作用，MDMX通常抑制黑色素瘤细胞中p53的激活。

大多数人黑色素瘤(>80％)含有野生型p53，p53处于失活状态，野生型p53激活的恢复通过诱导细胞周期阻滞、凋亡和衰老发挥重要的抗肿瘤作用。对于传统的化学疗法，诸如Vemurafenib(PLX4032)、Encorafenib等BRAF抑制剂或诸如cobimetinib、trametinib和binimeinib等MEK抑制剂主要通过阻断下游ERK1/2活性来抑制细胞增殖来治疗黑色素瘤。因此，p53与BRAF抑制剂结合的再激活被认为是黑色素瘤治疗中一种非常有潜力的平行策略。本发明证明了ECCA显著激活p53通路以阻断BRAF突变和野生型黑色素瘤细胞的生长，并且ECCA与BRAF抑制剂的联合应用明显抑制了黑色素瘤细胞的生长(图7)。在本发明研究中，抑制细胞凋亡并不能完全挽救黑色素瘤细胞的生长，提示ECCA的抗肿瘤活性还与其他机制有关。因此，进一步研究ECCA在黑色素瘤细胞DNA损伤、细胞周期阻滞等机制中的作用也将是一个有意义的课题。此外，修饰ECCA的结构对进一步提高其抗肿瘤活性和特异性具有重要意义。

综上所述，本发明证明了化合物ECCA能显著激活p53通路抑制黑色素瘤细胞的生长，而对原代黑色素细胞几乎没有影响，为临床上与其他药物(如BRAF抑制剂)平行治疗黑色素瘤提供了一种新的药物开发潜力。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (2)

1.ECCA在制备抑制黑色素瘤细胞生长和/或诱导黑色素瘤细胞凋亡的药物或试剂中的应用，所述黑色素瘤细胞包括BRAF突变型黑色素瘤细胞和BRAF野生型黑色素瘤细胞。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物或试剂还含有BRAF抑制剂。

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