KR101987970B1 - 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising inhibitor for expressing or activating of Asparaginyl tRNA synthetase}
본 발명은 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
Hippo 신호경로는 조직의 성장과 세포의 분열을 조절하는 기능을 하는 중요한 세포 신호전달 경로로, 초파리에서부터 인간에 이르기까지 진화적으로 잘 보존되어 있다. 현재까지 최소 35개 이상의 단백질이 Hippo 신호 경로에 관여하는 것으로 알려져 있으며, MST1과 MST2의 핵심 키나아제를 비롯해 LATS1, LATS2, SAV1, MOB1A, MOB1B의 연결단백질, YAP과 TAZ와 같은 전사인자가 그 대표적인 예이다. 특히, YAP과 TAZ는 MST1과 MST2 등에 의해서 인산화될 경우, 핵에서 세포질로 이동하여 단백질이 분해됨으로 활성이 억제되며, 핵 내에서는 TEAD, SMAD와 같은 전사인사들과 상호작용하여 세포증식과 조직성장에 관여하는 다양한 유전자의 발현을 조절하게 된다. 이 가운데, YAP (초파리의 Yorkie) 단백질은 대표적인 발암유전자로 YAP/Yorkie의 과발현 또는 비정상적 활성화는 간, 소화기관, 피부와 심장 등 다양한 조직에서 암세포의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있다. 특히, 초파리 모델에서도 Yorkie의 활성화 및 과발현에 의해 비정상적 조직 성장을 유도하는 것으로 알려져 초파리를 이용한 대표적 암 모델로 활용되고 있다 (Meng et al., Genes & Dev. 30(1):1-17, 2016).
이러한 이유에서 Hippo 신호 경로 붕괴에 의한 암 모델을 활용하여 다양한 항암인자 검색이 이루어지고 있으며, Hippo 신호 경로의 다양한 단백질들이 항암제 개발 타겟으로 가능성이 제시되고 있으며, 이 가운데, 기능적으로 가장 유력한 표적은 YAP/Yorkie와 TAZ로 알려져 있으며, YAP의 이형 접합체 돌연변이에서도 암 억제 효과가 관찰되어, YAP 저해의 부작용이 크지 않을 가능성을 시사한바 있다. 그러나, 전사인자를 대상으로 한 약물 개발에는 많은 어려움이 있는 것으로 알려져, YAP/Yorkie 암 모델을 이용한 다양한 상호작용 단백질을 대상으로 하는 표적 항암제 개발의 필요성이 제시 되어 왔다.
아미노아실-tRNA 합성효소 (Aminoacyl-tRNA synthetase, ARS)는 세포 내 단백질 합성에 필수적인 기능을 수행함과 동시에, 암, 면역질환, 퇴행성 뇌질환 등 다양한 질병의 병인기전에 '단백질 번역 외 기능'에 관여하는 것으로 주목 받고 있다. 아미노아실-tRNA 합성효소는 아미노산 결합 부위와 아미노아실-tRNA 합성효소의 촉매 도메인(catalytic domain)에 새로운 단백질 도메인이 결합함으로써 단백질 번역 외에도 신호 전달에 중요한 역할을 수행하게 된다.
초파리 이상의 고등 진핵 생물에서 고분자 질량의 멀티 tRNA 합성효소 복합체 (multi tRNA synthetase complex, MSC) 는 9개의 tRNA 합성효소와 3개의 스캐폴드 단백질 (MSCp43, MSCp39, MSCp18)로 구성되며, 각각의 스캐폴드 단백질들에 의해 조절되는 아미노아실-tRNA 합성효소는 세포의 이동 및 분화, 면역반응, 조직의 재생, 세포사멸, 노화반응 등 다양한 생체 내 반응을 조절한다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 새로운 항암 표적을 개발하고자 예의 노력한 결과, 인간과 유전자가 잘 보존되어 있고, 유전자 조작 및 돌연변이 제작이 용이한 모델 동물인 초파리 (Drosophila melanogaster)를 이용해 확립된 고형암 모델에서 아미노아실-tRNA 합성효소가 새로운 항암 표적 분자가 될 수 있음을 확인하고, 이를 표적으로 하는 물질의 경우, 암에 대한 치료적 효과를 가지고 올 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 (a) 암이 유발된 분리된 생물학적 시료에 암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 시료에서 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 하나의 양태는 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 저해하는 물질은 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA이고, 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 저해하는 물질은 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 앱타머, 또는 화합물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 "아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)"는 아미노아실-tRNA 합성효소 (Aminoacyl-tRNA synthetase, ARS)의 패밀리 중 하나이다. 이 효소는 글루타메이트, 알라닌 및 아스파테이트의 대사과정과 관련되어 있다. 아스파라기닐 tRNA 합성효소는 다른 이름으로 Asp-AdT, Asp-tRNAAsn 아미도트렌스퍼레이즈 (Asp-tRNAAsn amidotransferase), 아스파틸-tRNAAsn 아미도트렌스퍼레이즈 (aspartyl-tRNAAsn amidotransferase), 및 Asn-tRNAAsn:L-글루타민 아미도-리가아제 (Asn-tRNAAsn:L-glutamine amido-ligase (ADP-forming)) 등으로 불리워지고 있다. 또한, 본 발명에서 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소는 NRS 또는 AsnRN과 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 이들은 서로 혼용될 수 있다.
본 발명에서는 암 모델에서 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 시키는 경우 암 세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 아스파라기닐 tRNA 합성효소를 억제하는 물질은 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, Yorkie 과발현에 의해 암이 유도된 초파리 모델에서 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 억제를 통해 암의 세포분열이 감소하고, 암의 표현형이 회복되는 것이 확인되었다(도 3 및 도 4). 이에 본 발명자들은 아스파라기닐 tRNA 합성효소 발현을 억제하여 암을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 판단하여 본 발명을 개발하게 되었다. 이는 종래 암 관련 분야에서 알려진 바 없는 내용에 해당한다.
본 발명의 용어 "발현을 억제하는 물질"이란 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 감소시키는 물질을 통칭하는 의미로 사용되며, 보다 구체적으로는 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 전사 수준 또는 단백질 수준에서 감소시키는 모든 물질을 포함할 수 있다. 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 억제하는 물질은 아스파라기닐 tRNA 합성효소를 표적으로 하여 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다. 구체적으로, 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드 또는 siRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 억제제는 암의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "올리고 뉴클레오티드"는 수 개 내지 수십 개의 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합(phosphodiester bond)으로 중합되어 형성된 중합체를 의미한다. 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드로의 예로, 구체적으로는 아스파라기닐 tRNA 합성효소에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), 또는 siRNA(small interfering RNA) 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명에서 사용되는 올리고 뉴클레오티드로 보다 구체적으로는 siRNA를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하는 것으로서 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명에서 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드는 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체로서, 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA에 결합하여 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 등을 방해하거나 또는 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 그 밖의 다른 모든 생물학적 기능 또는 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 본 발명의 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA에 상보적으로 결합하여 사용될 수 있다.
상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 아니하나, 구체적으로는 6 내지 80 뉴클레오티드를 가질 수 있고, 보다 구체적으로는 8 내지 60 뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 더욱 구체적으로는 10 내지 40 뉴클레오티드를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 당해 기술 분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 생체 내(in vivo) 에서 합성되거나, 시험관 내(in vitro) 에서 합성되어 생체 내로 투여될 수 있다. 생체 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 다중 클로닝 부위(Multi-cloning site; MCS)의 기원(origin)이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 방법을 들 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 RNA 중합효소 I을 이용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "siRNA"는 RNA 간섭(interference) 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자이다. 보통 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 siRNA는 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용될 수 있다. 이중 가닥의 RNA가 다이서(dicer)에 의해 절단되어 생성될 수 있는 상기 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 해당 mRNA의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 목적상, 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 siRNA는 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다. 상기 siRNA를 제작하는 방법의 비제한적인 예로는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 전사를 이용하여 siRNA를 합성하는 방법, 시험관 내 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 다이서를 이용해 절단하여 제작하는 방법, siRNA 발현 플라스미드 또는 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 또는 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 용어 "활성을 억제하는 물질"은 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로 아스파라기닐 tRNA 합성효소 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 화합물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 아스파라기닐 tRNA 합성효소 단백질에 대한 항원 결합성을 가지며, 이의 활성을 저해하는 것이라면 상기 항체의 단편들도 본 발명의 항체에 포함된다. 또한 키메라성 항체 또는 이중 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체 및 인간 항체 등도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 아스파라기닐 tRNA 합성효소 유전자로부터 발현되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드로를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 억제하는 앱타머는 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
또한, 구체적으로 본 발명에서 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 억제하는 화합물은 티란다마이신 B(tirandamycin B) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 억제하는 화합물은 티란다마이신 B 이외에 WS9326D, 아디포스타틴(adipostatin) A, B, C, D 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으나, 이에 제한 되지 않으며, 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 억제하는 화합물이라면 본 발명의 범주에 제한없이 포함된다.
본 발명에서의 "티란다마이신 B(tirandamycin B)"는 항진균제로 사용되어 온 약물이며, 또한 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 억제제로 알려져 있다. 상기 티란다마이신 B는 C22H27NO8의 분자식을 가지는 물질로서, 이의 구체적인 구조는 하기에 나타내었다(화학식 1). 한편, 티란다마이신 B는 (3E)-3-{(2E,4E, 6R)-1-하이드록시-6-[(1S,2S,4R,6S,7R,8R)-2-(하이드록시메틸)-1,7-디메틸-5-옥소-3,9,10-트리옥사트리사이클로[4.3.1.0]덱-8-일]-4-메틸-2,4-헵타디엔-1-일리덴}-2,4-피롤리딘디온 [(3E)-3-{(2E,4E,6R)-1-Hydroxy-6-[(1S,2S,4R,6S,7R,8R)
-2-(hydroxymethyl)-1,7-dimethyl-5-oxo-3,9,10-trioxatricyclo[4.3.1.0]dec-8-yl]-4-methyl-2,4-heptadien-1-yliden}-2,4-pyrrolidindion]의 IUPAC 명을 가진다.
[화학식 1]
Figure 112017090556063-pat00001
본 발명의 조성물은 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 및 수화물을 모두 포함하고, 가능한 모든 입체이성체도 포함할 수 있다. 또한, 상기 티란다마이신 B의 용매화물, 수화물 및 입체이성체는 통상적인 방법들을 사용하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로부터 제조할 수 있다.
상기 억제제는 공지된 합성 방법으로 합성하여 사용할 수도 있고, 식물에서 분리 및 정제하여 사용할 수도 있으며, 또는 상업적으로 판매되는 것을 입수하여 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 투여되는 티란다마이신 B(tirandamycin B)의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 제형을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
상기 티란다마이신 B(tirandamycin B)의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 티란다마이신 B(tirandamycin B)에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트 (메실레이트) 및 ρ-톨루엔술포네이트 (토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 티란다마이신 B의 항암효과를 확인하기 위하여 기존에 사용하는 초파리 배지에 티란다마이신 B를 농도 별로 넣어 배지를 제조하고, 초파리 암모델의 눈 표현형을 비교하였다. 그 결과, 20μM 및 50μM 티란다마이신 B를 포함하는 배지에서 사육한 경우, Yorkie에 의한 암 발생이 유의적으로 회복되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 티란다마이신 B 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 암의 예방 또는 치료에 효과를 가짐을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 췌장암세포를 대상으로 티란다마이신 B의 암억제 효과를 검증하기 위해서 췌장암 세포/조직을 면역결핍 마우스에 이식하여 암 조직 성장을 유도한 후, 이를 대상으로 대조군인 젬시타빈과 비교하여 티란다마이신 B의 췌장암 억제 효능을 확인하였다. 그 결과, 환자의 췌장암세포에서 젬시타빈에 비해 암세포의 괴사 및 세포사멸이 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다(도 7).
이를 통해, 티란다마이신 B 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 암의 예방 또는 치료에 효과를 가짐을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제에 따른 세포분열 억제 효과를 확인하게 위하여, Yorkie 과발현에 의해 암이 유도된 초파리 모델에 세포증식 마커인 PH3 (phospho-Histone 3)를 면역염색법을 이용하여 암 모델에서 증가했던 세포분열이 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제에 의해 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 4). 또한, 세포분열 활성 및 세포성장인자 하위 신호인 Akt와 S6K에 대한 항체로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, Yorkie 과발현으로 증가한 Akt 와 S6K 인산화 활성이 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제에 의해 유의적으로 감소함을 확인하였다 (도 5).
이를 통해, 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현 혹은 활성을 억제하는 물질을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물이 암의 예방 및/또는 치료에 효과를 나타낼 것임을 알 수 있었다.
본 발명에서의 "암"은 당업계에 공지된 암이라면 제한 없이 포함하나, 그 예로, 간암, 폐암, 피부암, 신장암, 위암, 대장암, 뇌암, 신경 내분비 암, 유방암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암 등일 수 있다. 또한, 상기 뇌암은 교모세포종을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 암은 구체적으로 췌장암, 뇌암, 대장암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 암을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 암의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 액제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 상기 티란다미이신 B, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 약학 조성물이 암에 대한 예방 또는 치료 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 질환이 발명하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함된다.
본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 대상체에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 도 있다. 구체적인 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피 내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다.
또한, 본 발명에 따른 화합물의 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70kg인 성인환자를 기준으로 할 때 일반적으로 1일 0.01mg 내지 5000mg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
보다 구체적으로, 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 억제하는 물질은 티란다마이신 B(tirandamycin B) 또는 이의 식품적으로 허용 가능한 염인 것인, 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 "아스파라기닐 tRNA 합성효소", "발현을 억제하는 물질", "활성을 억제하는 물질", "티란다마이신 B ", "암" 및 "예방"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 건강기능식품은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 암의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 유용할 수 있다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함거나, 또는 본 발명의 티란다마이신 B 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품의 투여로 암이 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 식품학적으로 허용 가능한 염이란 티란다마이신 B의 생물학적 활성을 훼손시키지 않으면서도 식품에 적용될 수 있는 염의 형태를 말한다.
본 발명의 건강기능식품은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 건강기능식품에서 포함할 수 있는 필수 성분으로 상기 티란다마이신 B 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 건강기능식품은 건강보조식품 및 건강식품 등을 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 암의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 "조성물", "암", "예방", 및 "치료"에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, (a) 암이 유발된 분리된 생물학적 시료에 암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 시료에서 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 또는 이의 활성이 후보 물질이 처리되지 않은 시료에 비해 감소하면 암 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "아스파라기닐 tRNA 합성효소", "발현을 억제하는 물질", "활성을 억제하는 물질" 및 "암"은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "후보 물질(test agent)"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다
본 발명에서 사용되는 용어 "아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현 수준"이란 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 발현 수준 또는 아스파라기닐 tRNA 합성효소 단백질의 발현 수준을 모두 포함하는 개념이며, 본 발명에서 "아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현 수준 측정"은 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 발현 수준 측정 또는 아스파라기닐 tRNA 합성효소 단백질의 발현 수준 측정을 통해 수행될 수 있다.
상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 발현 수준 측정은 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미하는 것으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따를 수 있다. 상기 분석 방법의 비제한적인 예로는 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 노던 블럿(Northern Blot), DNA 칩 등을 들 수 있다.
상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 단백질의 발현 수준 측정은 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 방식으로 수행될 수 있다. 이를 위한 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따를 수 있다. 상기 분석 방법의 비제한적인 예로는 웨스턴 블럿(Western Blot), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로켓 면역 전기 영동(Rocket Immuno Electrophoresis), 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등을 들 수 있다.
상기 mRNA 수준을 측정하는 제제의 예로, 구체적으로는 본 발명의 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 mRNA에 대한 프라이머(primer) 염기쌍, 프로브(probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 등을 들 수 있으며, 상기 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 등의 서열은 본 발명의 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 용이하게 디자인할 수 있다. 또한, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제의 예로, 구체적으로는 항체를 사용할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 항암제로서 사용할 수 있으며, 또한 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 활성을 측정함으로써 암 치료제의 스크리닝에 사용이 가능하다.
도 1는 눈 특이적 프로모터를 이용한 Yorkie 유전자의 암 발생 효과를 나타내는 도이다
도 2는 초파리 암모델에서 20종의 ARS 억제에 의한 유전학적 스크리닝을 수행한 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 Yorkie 과발현에 따른 암발생이 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS) 억제에 의한 암 제어 효과를 나타내는 것이다.
도 4는 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제를 통한 Yorkie 과발현에 따른 세포분열 감소 효과를 나타내는 것이다.
도 5는 Yorkie 과발현에 따른 Akt, S6K 인산화 활성이AsparaginylNRS 억제에 의해 감소하는 결과를 나타내는 것이다.
도 6은 초파리에서 Yorkie 과발현에 따른 암 발생이 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제제인 티란다마이신 B (tirandamycin B) 로 인해 제어됨을 나타내는 것이다.
도 7은 췌장암 환자 세포에서 티란다마이신 B의 암 억제 효과를 나타내는 것이다.
도 8은 뇌암 교모세포종에서 티란다마이신 B의 암 억제 효과를 나타내는 것이다.
도 9는 대장암세포에서 티란다마이신 B의 암 억제 효과를 나타내는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 초파리 유전형, 암 모델 확립 및 배양법
초파리는 블루밍턴 스톡 센터 (Bloomington stock center)에서 분양을 받아 실험하였다. 모든 초파리 실험은 25℃를 유지한 상태에서 사육하였으며, 초파리 눈에 특이적으로 유전자 발현을 유도할 수 있는 GMR-gal4 프로모터 라인 및 UAS-yorkieWT (정상 yorkie 발현), UAS-yorkieS168A (활성화된 yorkie 돌연변이를 발현) 라인과 교배를 통해 yorkie 유전자를 과발현 시킬 수 있는 GMR>ykiWT 와 GMR>ykiS168A 의 초파리 암 모델 라인을 확립하였다.
이를 대상으로 초파리에 존재하는 20종의 아미노아실 tRNA 합성효소 (aminoacyl tRNA synthetase, ARS) 억제에 따른 암 제어 효과를 확인하기 위해 비엔나 드로소필라 RNAi 스톡 센터 (Vienna Drosophila RNAi stock center, VDRC)에서 분양 받은 20종의 UAS-ARS RNAi 들과 초파리 암 모델 GMR>ykiS168A 과 각각 교배하여 그 자손의 표현형을 분석하였다. 초파리 암 제어 효과는 초파리 눈을 해부실체현미경 하에서 분석하였다.
그 결과, 눈 특이적 GMR-gal4 프로모터를 이용하여 ykiWT 과 구성적으로 yorkie를 발현하는 형태 인 ykiS168A 를 과발현 시켰을 때 세포증식으로 인해 암 표현형 (tumor phenotype)이 생기는 것을 확인하였고 초파리 암 모델을 확립하였다 (도 1).
실시예 2. 면역염색법
특히, 초파리 암 모델에서 암제어 효과가 뚜렷하게 나타나는 아스파라기닐 tRNA 합성효소 RNAi 라인은 비엔나 초파리 스탁 센터에서 분양 받아서 사용하였으며, 비엔나 초파리 스탁센터의 RNAi 초파리 라인은 일반적으로 300-400 뉴클레오티드의 안티센스와 센스 서열의 역반복 (inverted repeats) 구조를 PCR 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 후 초파리 Gal4/UAS에 의해 발현시킬 수 있는 pUAST 벡터의 다중클로닝 사이트 (multi-cloning site)에 클로닝한 후 P element 형질전환 법을 통해 제작하였다. 구체적으로, 아스파라기닐 tRNA 합성효소 RNAi에 사용된 서열은 아래의 388 뉴클레오티드를 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다.
아스파라기닐 tRNA 합성효소 RNAi 서열은 하기와 같다:
AGGCGGAGGA TGCGGAGAAG CGCCAGCAGA ATCTGGAGGA TGCTCGAAAG GTGAAGATCT CGGAGGATCC CAGTCTGCCG GTGGCCCGGA AAATTCGAAT CTACGAGGGC ACTGCCAACC GCGACTCGCG TGTCAAGGTC TACGGTTGGG TGCATCGTCT GCGTCGTCAG GGCAAGTCCC TGATCTTCAT AACACTGCGC GACGGCACCG GTTTCCTGCA GTGCGTGCTA AACGATCAGC TCTGCCAGAC CTACGATGCG CTCACCCTGA GCACGGAAAG CTCTGTAGTC CTGTTCGGTA CCCTGAAACT AGTTCCAGAA GGAAAGACGG CGCCGGGAGG GCATGAACTG AACGTGGACT ACTGGGAGCT GATTGGTCTG GCTCCGCC(서열번호 1).
상기 서열을 Gal4/UAS 시스템을 통해 과발현할 경우, 388 뉴클레오티드 역반복서열은 초파리 개체 내에서 RNA 절단 효소인 다이서(Dicer)에 의해서 21 내지 25 뉴클레오티드의 활성화된 siRNA를 생산하여, 목적 유전자인 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 저해할 것으로 예상된다.
초파리 암 모델에서 AsnRS-RNAi (asn-Ri와 혼용됨)의 암 제어 효과를 확인하기 위해서 암 조직의 세포증식 마커인 포스포-히스톤 H3 (PH3)의 변화를 관찰하였다. 이를 위해 PH3 특이적인 항체를 이용한 면역염색법을 수행하였다. 구체적으로는 초파리 3령기 유충의 눈 성체반(eye imaginal disc) 를 PBS에서 해부하여 4% PFA (paraformaldehyde)에서 고정 시킨 후, 4% BSA(bovine serum albumin)를 이용해 블록킹을 수행하였다. 항-PH3 (1:200, Santa Cruz) 1차 항체를 4℃에서 밤샘 배양을 한 후, Alexa 594 2차 항체로 다시 밤샘 배양을 시켰다. UAS-ykiWT, UAS-ykiS168A 에 GFP가 표지 되어있어 yki가 발현되는 부분에 GFP 발현을 확인할 수 있었다. 형광 염색된 조직을 관찰하기 위해 형광 공초점 현미경 (fluorescence confocal microscope, Olympus)을 통해 조직 사진을 촬영하였다.
본 발명에 사용된 AsnRS RNAi 프라이머 서열은 하기 표1에 나타내었다.
< PCR 프라이머 서열>
명칭 프라이머 염기서열 서열번호
AsnRS RNAi 정방향 CGCGAATTCAGGCGGAGGATGCGGAGAAG 2
역방향 GCGTCTAGAGGCGGAGCCAGACCAATCAG 3
실시예 3. 웨스턴 블롯
초파리 암모델에서 암세포 분열 시에 특이적으로 증가하는 신호전달 과정인 Akt단백질의 인산화 및 S6K 단백질의 인산화 정도를 분석하기 위하여 웨스턴 블롯 법을 이용하였다.
초파리 암모델 및 AsnRS-RNAi 가 교배된 성체 초파리의 머리를 따로 분리하여 딘백질 추출 용액인 RIPA 완충용액 (Cell signaling)을 사용하여 용해 시킨 후 단백질을 추출하였다. 인산화된 Akt와 S6K를 검출하기 위해서 포스포 -Akt (1:1000, Cell signaling), 포스포-S6K (1:1000, Cell signaling), β-액틴 (1:3000, Abcam) 1차 항체를 사용하여 밤샘 배양을 시킨 후 다시 2차 항체인 항-래빗 IgG (Santa Cruz) 와 항-마우스 IgG (Santa Cruz)를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 2차 항체에 접합되어 있는 홀스 레디쉬 페록시다제(Horse Radish Peroxidase) 활성을 이용하여, ECL 형광 시약의 발색 정도를 chemi-luminescence 이미지 분석장치에서 정량하여 인산화된 단백질의 양을 측정하였다.
실시예 4. 티란다마이신 B 항암효과 확인
아스파라기닐 tRNA 합성효소에 대한 특이적인 억제인자로 알려진 티란다마이신 B (ChemFaces, China)를 DMSO에 녹인 후 10 mM 농도의 원액을 제조한 후, 기존에 사용하는 초파리 배지에 농도 별로 티란다마이신 B가 포함된 배지를 제조하였다. 0.05%의 DMSO 만 포함된 배지를 음성 대조군으로 사용하여, 음성 대조군 배지에서 사육한 초파리 암 모델의 눈 표현형을 기준으로 20 μM과 50 μM 농도의 triandamycin B가 함유된 배지에서 사육된 초파리 눈 표현형을 비교하여 암억제 효과를 검증하였다.
실시예 5. 인간 췌장암 세포주에서 티란다마이신 B 의 항암 효능 검증
티란다마이신 B 의 항암 효능을 검증하기 위해 4명의 췌장암 환자에서 각각 적출한 암 조직을 면역결핍 마우스에 이식하여 제작한 PDX (patient derived xenograft, 환자유래이종이식)를 제작한 후, PDX 마우스에서 다시 적출한 환자 유래 세포주를 이용하여 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제인자의 암 세포 증식 억제 및 세포사멸 유도 활성을 확인 하였다. 이를 위해 각 각의 췌장암 세포를 96 well 세포배양 용기의 단일 well에 각각 10만개의 세포를 분주 한 후, 24시간 세포배양액에서 배양 한 후, 20 μM과 50 μM 농도의 티란다마이신 B가 함유된 배지에서 48시간 추가 배양 한 후 세포 사멸 유도를 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 음성 대조군으로는 DMSO 0.05%를 사용하였으며, 양성 대조군으로 췌장암 환자 치료를 위해 현재 임상에서 사용되는 항암제인 젬시타빈(Gemcitabin)을 사용하여 비교하였다.
티란다마이신 B가 48시간 처리된 암세포를 트립신을 처리하여 세포를 회수 한 후, 세포 사멸을 인식하는 아넥신(Annexin)-V 와 7-AAD 항체로 세포를 염색 한 후, 유세포 분석기를 이용하여 세포사멸능을 분석하였다.
실험예 1. 초파리 암모델에서 ARS 억제에 의한 유전학적 스크리닝
확립된 초파리 암 모델 GMR>ykiS168A와 초파리에서 20종의 ARS를 억제하는 각각의 RNA 간섭을 교배하여 유전학적 스크리닝을 수행하고 그에 따른 암 제어효과를 분석하였다.
그 결과, 아스파라기닌 tRNA 합성효소 (NRS 또는 AsnRS)를 비롯한 GRS (Glycine tRNA synthetase), VRS (Valine tRNA synthetase)를 억제시킨 초파리 모델 (도 2에서 각각 GMR>ykiS168A/asn, GMR>ykiS168A/gly, 및 GMR>ykiS168A/val에 해당) 등에서 유의하게 암 제어 효과를 보이는 것으로 확인되었다 (도 2).
실험예 2. 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제에 따른 암제어 효과
스크리닝한 20종의 ARS 가운데, 아스파라기닐 tRNA 합성효소를 RNAi interference를 이용하여 억제시킬 경우 (도 3의 B, B', B''), Yorkie 과발현에 의해 암이 유도되는 표현형 (도 3의 A, A', A'')이 상당히 회복되는 것을 확인하였다 (도 3). 정상 초파리 눈의 표현형 (도 3의 A, GMR-gal4)는 세포의 크기가 일정한 약 800개의 단안이 정교하게 배열되어 있는데 반해, Yorkie 과발현의 경우, 세포증식에 의해 초파리 눈이 부풀어 오르는 암 표현형 (도 3의 A'와 A'')이 나타나는 것으로 확인되었다. 이때, Yorkie 유전자와 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 억제하는 RNAi 라인과 함께 발현시킬 경우, 암 표현형이 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다 (도 3의 B'와 B'').
실험예 3. 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제에 따른 세포분열 억제 효과
눈 특이적 프로모터인 GMR-gal4를 이용하여 yorkie 유전자가 과발현된 초파리 3령기 유충의 눈 성체반에서 세포증식 마커인 PH3 (phospho-Histone 3)의 변화를 확인하기 위해 항-PH3 항체를 이용한 면역염색법을 통해 확인하였다.
그 결과 암 모델에서 증가했던 세포분열이 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제에 의해 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다 (도 4).
실험예 4. 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제에 따른 Akt , S6K 인산화 억제 효과
세포분열 활성 및 세포성장인자 하위 신호인 Akt와 S6K에 대한 항체로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, Yorkie 과발현으로 증가한 Akt 와 S6K 인산화 활성이 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제에 의해 유의적으로 감소함을 확인하였다 (도 5).
실험예 5. 티란다마이신 B의 항암 효과
AsnRS 특이적인 억제인자로 알려진 티란다마이신 B (ChemFaces)를 DMSO에 녹인 후, 기존에 사용하는 초파리 배지에 농도별로 넣어 티란다마이신 B가 포함된 배지를 제조하였다. 제작된 배지에서 사육한 초파리 암모델의 눈 표현형을 비교 분석하여 티란다마이신 B의 암억제 효과를 검증하였다. 그 결과, 20μM 및 50μM 티란다마이신 B를 포함하는 배지에서 사육한 경우, Yorkie에 의한 암 발생이 유의적으로 회복되는 것을 확인하였다 (도 6).
실험예 6. 인간 췌장암 세포주에서 티란다마이신 B 의 항암 효능 검증
초파리 모델에서 확인된 티란다마이신 B의 암억제 효과를 인간 췌장암세포를 대상으로 효능을 검증하기 위해서, PDX (Patient-derived tumor xenograft) 마우스 모델을 이용하였다. 4명의 환자로부터 분리한 췌장암 세포/조직을 면역결핍 마우스에 이식하여 암 조직 성장을 유도한 후, PDX 마우스에서 분리된 암조직을 초대 배양하여 환자 유래 암세포를 확보하였다. 이를 대상으로 본 연구에서 확인된 티란다마이신 B의 췌장암 억제 효능을 확인하였으며, 췌장암 치료를 위해 실제 임상에서 광범위하게 사용되는 1차 항암제인 젬시타빈의 효능과 비교 분석하였다. 췌장암 세포의 성장/사멸은 세포괴사 (necrosis) 및 세포사멸 (apoptosis) 마커를 이용한 세포 분획법 (FASC analysis)를 이용하였다.
그 결과, 2군의 환자 췌장암세포에서는 젬시타빈에 비해 암세포의 괴사 및 세포사멸을 유의적으로 증가시키는 것으로 나타났으며, 2군의 환자에서는 젬시타빈과 유사하거나 낮은 효과를 보였다. 따라서, 췌장암 환자의 발암요인의 유전적 배경에 따라서 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제인자인 티란다마이신 B가 효과적으로 암을 억제할 수 있음을 확인하였다 (도 7).
실험예 7. 인간 뇌암 교모세포종에서 티란다마이신 B의 항암 효능 검증
티란다마이신 B의 다른 암종의 항암 효능을 검증하기 위해 인간 뇌암으로부터 확립된 U87 교모세포종 (glioblastoma)을 배양한 후, 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제인자 티란다마이신 B의 암 세포 증식 억제 활성을 로슈사의 WTS 세포 증식 분석 키트(cell proliferation assay kit)를 이용하여 확인하였다. 이를 위해 각 U87 세포를 96 웰 세포배양 용기의 단일 웰에 각각 10만개의 세포를 분주한 후, 24 시간동안 세포배양액에서 배양한 후, 10μM 농도의 티란다마이신 B가 함유된 배지에서 48시간 추가 배양한 후 세포 증식 활성을 분석하였다. 음성 대조군으로는 DMSO 0.05%를 사용하였다.
그 결과, 티란다마이신 B가 처리된 U87 암세포의 세포증식이 24시간과 48시간에서 각각 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다 (도 8).
실험예 8. 마우스 대장암 세포에서 티란다마이신 B의 항암 효능 검증
티란다마이신 B의 다른 암종의 항암 효능을 검증하기 위해 마우스 대장암 세포인 colon26 세포주를 배양한 후, 아스파라기닐 tRNA 합성효소 억제인자 티란다마이신 B의 암 세포 증식 억제 활성을 로슈사의 WTS 세포 증식 분석 키트 를 이용하여 확인하였다. 이를 위해 각 colon26 세포를 96 웰 세포배양 용기의 단일 웰에 각각 10만개의 세포를 분주한 후, 24 시간동안 세포배양액에서 배양한 후, 10μM 농도의 티란다마이신 B가 함유된 배지에서 72시간 추가 배양한 후 세포 증식 활성을 분석하였다. 음성 대조군으로는 DMSO 0.05%를 사용하였다.
그 결과, 티란다마이신 B가 처리된 colon26 암세포의 세포증식이 24시간, 48시간, 72시간에서 각각 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 9).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising inhibitor for expressing or activating of Asparaginyl tRNA synthetase <130> KPA160792-KR-P1 <150> 10-2016-0119426 <151> 2016-09-19 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 388 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asparaginyl tRNA synthetase RNAi <400> 1 aggcggagga tgcggagaag cgccagcaga atctggagga tgctcgaaag gtgaagatct 60 cggaggatcc cagtctgccg gtggcccgga aaattcgaat ctacgagggc actgccaacc 120 gcgactcgcg tgtcaaggtc tacggttggg tgcatcgtct gcgtcgtcag ggcaagtccc 180 tgatcttcat aacactgcgc gacggcaccg gtttcctgca gtgcgtgcta aacgatcagc 240 tctgccagac ctacgatgcg ctcaccctga gcacggaaag ctctgtagtc ctgttcggta 300 ccctgaaact agttccagaa ggaaagacgg cgccgggagg gcatgaactg aacgtggact 360 actgggagct gattggtctg gctccgcc 388 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer for AsnRS RNAi <400> 2 cgcgaattca ggcggaggat gcggagaag 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for AsnRS RNAi <400> 3 gcgtctagag gcggagccag accaatcag 29

Claims (9)

  1. 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 억제하는 물질은 티란다마이신 B(tirandamycin B) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 발현을 저해하는 물질은 아스파라기닐 tRNA 합성효소 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA이고,
    상기 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 저해하는 물질은 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 활성을 억제하는 항체 또는 화합물인 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 암은 간암, 폐암, 피부암, 신장암, 위암, 대장암, 뇌암, 신경 내분비 암, 유방암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암인 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제, 캡슐제, 환제, 정제 또는 좌제의 형태로 제형인 것인, 약학적 조성물.
  7. 티란다마이신 B(tirandamycin B) 또는 이의 식품적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. (a) 암이 유발된 분리된 생물학적 시료에 암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보 물질이 처리된 시료에서 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는,
    암 치료제의 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 아스파라기닐 tRNA 합성효소의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 또는 이의 활성이 후보 물질이 처리되지 않은 시료에 비해 감소하면 암 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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