JP3904260B2 - ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る、白血病細胞増殖阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルムス(Wilms) 腫瘍は、染色体１１ｐ１３に位置するウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の両対立遺伝子の不活性化により生ずる小児腎腫瘍である(Call KM et al., Cell 60：509, 1990)。ＷＴ１の非コード上流配列 (C.E.Camphellら、Oncogene 9：583-595, 1994)及びイントロンを含むコード領域(D.A.Haberら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88：9618-9622, (1991))はすでに報告されており、腫瘍等の増殖及び分化に関与することが予想される(D.A.Haberら、前掲）。
しかしながら、ＷＴ１が白血病細胞の増殖に関与しており、ＷＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が白血病細胞の増殖を抑制・阻害することは知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、ウイルムス(Wilms) 腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞の増殖阻害剤を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＷＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤を提供する。本発明で使用するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ＷＴ１の転写キャッピング部位に対するもの、翻訳開始領域に対するもの、エクソンに対するものまたはイントロンに対するものなどのＷＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体である。
【０００５】
例えばＷＴ１の転写キャッピング部位を含む領域のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：９で表わされ、またＷＴ１のコード領域のエクソン１〜１０のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：１０〜１９で表わされるが、本発明はこのようなＷＴ１のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を用いる。このアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、通常ＷＴ１のアンチセンスＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖の連続した５〜５０個、好ましくは、９〜３０個の塩基またはＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に結合することができるものであれば、断続的または部分的に相補的な５〜７０個、好ましくは、９〜５０個の塩基から成るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体である。
【０００６】
転写キャッピング部位に対するものとしては、例えば次の塩基配列：５′-AGGGTCGAATGCGGTGGG -3′（配列番号：２）及び５′-TCAAATAAGAGGGGCCGG-３′（配列番号：４）などのものが挙げられる。また、翻訳開始領域に対するものとしては、翻訳開始コドンＡＴＧ並びにその上流及び／又は下流を含む領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が挙げられ、例えば次の塩基配列：５′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-３′（配列番号：６）などが挙げられる。
【０００７】
また、ＷＴ１のコード領域には１０個のエクソンが含まれており、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、これらのエクソンのいずれかに含まれる配列に対するもの、又はスプライシング後に連続するいずれか２個のエクソンにわたる配列に対するものあるいは、連続するイントロンとエクソンにわたる配列に対するもの、全てのイントロン及び３′，５′側非コード領域の配列に対するものである。１例として、第６エクソンに対するものであり、次の塩基配列：５′-CGTTGTGTGGTTATCGCT-３′（配列番号：８）に対するものが挙げられる。
さらに、ＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖と断続的または部分的に相補的な塩基配列を有する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は対応する領域については特に問わないが、これらの中には、ＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を切断する機能を有するリボザイムのようなものも含まれる。
【０００８】
本発明において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の構造は、化１に示したとおりであるが、Ｘは独立して酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）、低級アルキル基あるいは一級アミンまたは二級アミンのいずれでもよい。Ｙは独立して酸素（Ｏ）あるいはイオウ（Ｓ）のいずれでもよい。Ｚは水素または水酸基である。ＢはＺが水素のときアデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシンのいずれかから選ばれ、Ｚが水酸基のときアデニン、グアニン、ウラシルあるいはシトシンのいずれかから選ばれ、主としてＷＴ１をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチドである。Ｒは独立して水素またはジメトキシトリチル基あるいは低級アルキル基である。ｎは７−２８である。
【０００９】
【化１】
【００１０】
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体としては修飾されていないアンチセンスオリゴヌクレオチドだけでなく、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。この様な修飾体として、例えば前述のメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、その他ホスホロチオエート修飾体あるいはホスホロアミデート修飾体等が挙げられる（化２参照）。
【００１１】
【化２】
【００１２】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は次のとおり常法によって得ることができる。
化１のＸ及びＹがＯ、Ｚが水素又は水酸基であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置（例えばApplied Biosystems社製など）によって容易に合成される。
【００１３】
Ｚが水素であるアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。
例えば、 T.Atkinson, M.Smith, in Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach, ed.M.J.Gait, IRL Press, 35-81 (1984)； M.H.Caruthers, Science, 230, 281 (1985)； A.Kume, M.Fujii, M.Sekine, M.Hata, J.Org.Chem., 49, 2139 (1984)；B.C.Froehler, M.Matteucci, Tetrahedron Lett., 27, 469 (1986)； P.J.Garegg, I.Lindh, T.Regberg, J.Stawinski, R.Stromberg, C.Henrichson, ibid, 27, 4051 (1986)；
B.S.Sproat, M.J.Gait, in Oligonucleotide Synthesis： A Practical Approach, ed.M.J.Gait, IRL Press, 83-115 (1984)； S.L.Beaucage and M.H.Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862 (1981)；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedron Lett., 21, 719-722 (1980)；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, J.Am.Chem.Soc., 103, 3185-3191 (1981)を参照のこと。
【００１４】
Ｘが低級アルコキシ基であるリン酸トリエステル修飾体は、常法、例えば化学合成で得られたオリゴヌクレオチドをトシルクロリドのＤＭＦ／メタノール／２，６−ルチジン溶液で処理することにより得ることができる（Moody H.M., et al., Nucleic Acids Res., 17, 4769-4782 (1989)) 。
Ｘがアルキル基であるアルキルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイトを用いて得ることができる（M.A.Dorman, et.al., Tetrahedron, 40, 95-102 (1984)；K.L.Agarwal and F.Riftina, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)) 。
【００１５】
ＸがＳであるホスホロチオエート修飾体は、常法、例えばイオウを用いた固相合成法(C.A.Stein, et.al., Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221 (1988)) あるいはテトラエチルチウラム ジスルフィドを用いて、固相合成法により得ることができる（H.Vu and B.L.Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008 (1991)) 。
Ｘ, ＹがともにＳであるホスホロジチオエート修飾体は、例えばビスアミダイトをチオアミダイトに変換しイオウを作用させることにより固相合成法により得ることができる（W.K.-D.Brill, et.al., J.Am.Chem.Soc., 111, 2321-2322 (1989))。
【００１６】
Ｘが一級アミンあるいは二級アミンであるホスホロアミデート修飾体は、例えばハイドロジェンホスホネートを一級あるいは二級アミンで処理することにより固相合成法で得ることができる（B.Froehler, et.al. Nucleic Acids Res., 16, 4831-4839 (1988))。あるいは、アミダイトをｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキサイドで酸化しても得ることができる（H.Ozaki, et.al., Tetrahedron Lett., 30, 5899-5902 (1989)) 。
【００１７】
Ｚが水酸基であるアンチセンスオリゴリボヌクレオチドの合成法は、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドに比べて、リボース（糖）に２′−水酸基があるためその保護を行わなければならない点できわめて複雑ではあるが、保護基およびリン酸化方法を適宜選択することによって合成することができる（微生物学基礎講座 ８巻、遺伝子工学、大塚栄子、三浦一伸共著、安藤忠彦、坂口健二編、１９８７年１０月１０日、共立出版株式会社発行参照）。
【００１８】
精製および純度確認は、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行うことができる。分子量の確認は、 Electrospray Ionization Mass Spectrometry又は Fast Atom Bonbardment-Mass Spectrometryで行うことができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、genomic DNA からmatureなmRNAに至るいかなる段階においても作用し、その発現を抑制することによって白血病細胞の増殖を阻害すると考えられる。従って、本願発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは白血病の治療のために有効であると期待される。
【００１９】
さらに本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、後述するとおり、正常な骨髄細胞の増殖を阻害することなく、特異的に白血病細胞の増殖を阻害すると考えられる。したがって、白血病患者の細胞、例えば骨髄細胞または末梢血を体外へ取り出し、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体でin vitro処理して白血病細胞の増殖を阻害しておいて、正常な骨髄細胞だけを再び体内に戻すというような「自家骨髄移植」「自家末梢血幹細胞移植」への応用も可能である。
【００２０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤などの外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法に従って調製することができる。
【００２１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、または血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適応させる。さらに持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポゾーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００２２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態、年齢、性別、体重などに応じて適宜調整し好ましい量を用いることができる。また、その投与方法は、患者の状態、薬剤形態などに応じ、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、直腸投与などの種々の投与方法から適宜好ましい方法を用いることができる。
以下本発明を実施例において詳しく説明する。
【００２３】
【実施例】
合成例１．
以下に使用するオリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号：１〜８）を、自動合成装置（Applied Biosystems) を用いて合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し、エタノール沈澱を３回行い、そしてリン酸緩衝液に懸濁した。
合成したオリゴヌクレオチドは次の通りである。
配列番号：１ 転写キャッピング部位のセンス配列（ＳＥ１）
配列番号：２ 転写キャッピング部位のアンチセンス配列（ＡＳ１）
配列番号：３ 転写キャッピング領域のセンス配列（ＳＥ２）
配列番号：４ 転写キャッピング領域のアンチセンス配列（ＡＳ２）
配列番号：５ 翻訳開始領域のセンス配列（ＳＥ３）
配列番号：６ 翻訳開始領域のアンチセンス配列（ＡＳ３）
配列番号：７ エクソン６のセンス配列（ＳＥ４）
配列番号：８ エクソン６のアンチセンス配列（ＡＳ４）
【００２４】
実施例１．
ＷＴ１発現陽性の白血病細胞株Ｋ５６２を５×１０4 個／ml、１００μｌ／ウエルの量で、平底９６−ウエルプレート内の、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０培地に接種した。各オリゴヌクレオチドを、３連のウエルに、最終濃度が２００μｇ／mlとなるように添加した。２時間のインキュベーションの後、各ウエルに最終濃度が１０％となるようにＦＣＳを添加した。２４時間毎に、前記の量の半分のオリゴヌクレオチドを培養物に添加した。
【００２５】
９６時間培養した後、色素排除法により生存細胞を計数した。対照培養物として、ヌクレオチドを含有しない同じ体積のＰＢＳを添加し、そしてこの対照培養物の細胞数を１００％とした。
この結果を図１に示す。この図から明らかな通り、いずれのアンチセンスオリゴヌクレオチドも、対応するセンスオリゴヌクレオチドに比べて強く細胞の増殖を阻害した。
【００２６】
実施例２．
実施例１と同様の実験を行ったが、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３を種々の濃度で添加した。図２から明らかな通り、センスオリゴヌクレオチド（ＳＥ３）は細胞の増殖をほとんど阻害しなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ３）は濃度依存的に細胞の増殖を阻害した。
【００２７】
実施例３．
実施例１と同様の実験を行ったが、オリゴヌクレオチドＳＥ４及びＡＳ４を種々の濃度で添加した。図３から明らかな通り、センスオリゴヌクレオチド（ＳＥ４）は細胞の増殖をほとんど阻害しなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ４）は濃度依存的に細胞の増殖を阻害した。
【００２８】
実施例４．
実施例１と同様の実験を行った。但し、細胞を、平底２４−ウエルプレート中で２．５×１０4 個／ml、１ml／ウエルの量で培養した。オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３を添加し、２〜５日間に毎日生存細胞数を計数した。結果を図４に示す。図から明らかな通り、センスオリゴヌクレオチドを添加した場合、対照の場合と同様に細胞の増殖が見られたが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した場合、細胞の増殖は抑制された。
【００２９】
実施例５．
実施例１と同様の実験を行った。但し、オリゴヌクレオチドとして、ＳＥ３及びＡＳ３、並びにミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド５′-AGAGAAGAAGGGAACCCC-３′（配列番号：２０）（ＭＰＯ−ＡＳ）及び血液凝固因子Ｖ（ＦＶ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド５′-GCGTGGGCAGCCTGGGAA-３′（配列番号：２１）（ＦＶ−ＡＳ）を用いた。図５から明らかなように、ＡＳ３を用いた場合のみ細胞の増殖が阻害された。
【００３０】
実施例６．
実施例１と同様の実験を行ったが、実験細胞として、ＷＴ１発現陽性細胞株ＨＥＬ及びＴＨＰ−１、並びにＷＴ１発現陰性細胞株Ｕ９３７を用いた。オリゴヌクレオチドとしては、実施例１の場合と同じ８種類を用いた。ＷＴ１発現陽性細胞系ＨＥＬ（図６）又はＴＨＰ−１（図７）を用いた場合には、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより細胞の増殖は阻害された。これに対して、ＷＴ１発現陰性細胞株Ｕ９３７（図８）を用いた場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加しても細胞の増殖は阻害されなかった。
【００３１】
実施例７．
白血病患者及び健康な志願者からの骨髄細胞をヘパリン処理し、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そしてFicoll-Hypaque密度勾配遠心により骨髄単核球細胞を得た。ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng／ml）及びＩＬ−３（１００ユニット／ml）を含むα−ＭＥＭを入れた平底９６−ウエルプレートに、上記の単核細胞を１．５×１０6 個／ml、１００μｌ／ウエルの量でプレートした。オリゴヌクレオチド（ＳＥ３及びＡＳ３）による処理は実施例１と同様にした。
９６時間後、細胞を集め、そしてメチルセルロース培地〔１．２％メチルセルロースα−ＭＥＭ、２０％ＦＣＳ、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng／ml）、Ｇ−ＣＳＦ（１００ng／ml）、ＩＬ−３（１００ユニット／ml）及びＳＣＦ（１０ng／ml）〕にプレートした。培養は３連で行った。１４日目に白血病細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌ）及び顆粒球−マクロファージコロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）を計数した。
【００３２】
図９に白血病患者４名（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）２名、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）２名）からのサンプルでの白血病コロニーの形成を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドによりコロニーの出現が阻害されたことがわかる。図１０には、健康な志願者からのサンプルでの顆粒球マクロファージコロニーの出現を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドによってもコロニーの形成は阻害されなかった。
【００３３】
実施例８．
２４−ウエルプレート中で、５×１０4 細胞／ウエルのＫ５６２細胞（Ａ）又はＡＭＬを有する患者からの新鮮な白血病細胞（Ｂ）に、ランダムオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドＡＳ１、オリゴヌクレオチドＡＳ２又はオリゴヌクレオチドＡＳ３を２００μｇ／mlの濃度で添加し、さらに２４時間毎に１００μｇ／mlの濃度で添加した。オリゴヌクレオチドによる最初の処理から４日後に細胞を収得し、ＰＢＳにより洗浄し、そしてLaemliのサンプル緩衝液により細胞溶解した。
【００３４】
２×１０4 個の細胞からの各細胞溶解物を５分間煮沸し、そして次に７．５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル中の各レーンに適用した。電気泳動の後、蛋白質をインモビロン(Immobilon) ポリビニリデンジフルオリド・フィルター（Millipore Corp. MA、米国）に移行させた。このフィルターを、合成ポリペプチド（アミノ酸位置１７７−１９２；Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln （配列番号：２２）に対する抗−ＷＴ１ポリクローナル抗体によりプローブし、そして次にホースラディッシュパーオキシダーゼ−結合抗−免疫グロブリン抗体（Amersham, Little Chalfont 、英国）により処理した。洗浄後、フィルターを検出試薬（Amersham, Little Chalfont 、英国）に１時間浸漬し、そして１〜５分間オートラジオグラフ処理した。
【００３５】
ＴＢＳＴ（０．０５％ Tween 20 を含有するTris−緩衝液）により２回洗浄した後、フィルターを抗−アクチンモノクローナル抗体（Oncogene Science Inc., NY 、米国）によりプローブし、そして上記のようにしてオートラジオグラフ処理した。
ＷＴ１蛋白質及びアクチンに対応するバンドの密度をデンシトメーターＣＳ−９０００（シミズ、京都）により測定し、そしてＷＴ１／アクチン比を計算した。
【００３６】
結果を図１１のＡ及びＢに示す。この図において、レーン１はランダムオリゴヌクレオチドを添加した場合、レーン２はオリゴヌクレオチドＡＳ３を添加した場合、レーン３はオリゴヌクレオチドＡＳ１を添加した場合、そしてレーン４はオリゴヌクレオチドＡＳ２を添加した場合の結果を示す。この図のＡはＫ５６２細胞を用いた場合、そしてＢはＡＭＬを有する患者からの新鮮な白血病細胞を用いた場合の結果を示す。
【００３７】
Ａから明らかなように、Ｋ５６２細胞の培地にＷＴ１オリゴヌクレオチドを添加した場合、ＷＴ１蛋白質のレベルが有意に低下した。他方、対照としてのランダムオリゴヌクレオチドはＷＴ１蛋白質レベルに影響を与えなかった。また、Ｂから明らかなように、ＷＴ１オリゴヌクレオチドをＡＭＬを有する患者から新たに単離した白血病細胞の培地に添加した場合、ＷＴ１蛋白質レベルが有意に低下した。これらの結果は、ＷＴ１アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＷＴ１蛋白質レベルの低下を介して白血病細胞の増殖を特異的に阻害したことを明瞭に示している。
以上の通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは白血病細胞の増殖の阻害のために有効であり、従って新規な白血病治療剤として期待される。
【００３８】
【配列表】
【００３９】
【００４０】
【００４１】
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に対するオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図２】図２は、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３の濃度と、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖との関連を示すグラフである。
【図３】図３は、オリゴヌクレオチドＳＥ４及びＡＳ４の濃度と、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３が白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に及ぼす効果を経時的に示すグラフである。
【図５】図５は、種々のオリゴヌクレオチドが白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、ＷＴ１発現陽性の白血病細胞株ＨＥＬの増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図７】図７は、ＷＴ１発現陽性の白血病細胞株ＴＨＰ−１の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＷＴ１発現陰性の悪性リンパ腫細胞株Ｕ９３７の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図９】図９は、白血病患者由来の骨髄単核球細胞からの白血病細胞コロニーの形成に対するオリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３の効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、健康な志願者由来の骨髄単核球細胞からの顆粒球マクロファージコロニーの形成に対するオリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３の効果を示すグラフである。
【図１１】図１１において、ＡはＫ５６２細胞の培養液に種々のＷＴ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した場合に細胞中のＷＴ１蛋白質のレベルが低下したことを示す電気泳動図の図面代用写真であり、ＢはＡＭＬを有する患者からの新鮮な白血病細胞にＷＴ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した場合に細胞中のＷＴ１蛋白質のレベルが低下したことを示す電気泳動図の図面に代る写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る、白血病細胞増殖阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルムス(Wilms) 腫瘍は、染色体１１ｐ１３に位置するウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の両対立遺伝子の不活性化により生ずる小児腎腫瘍である(Call KM et al., Cell 60：509, 1990)。ＷＴ１の非コード上流配列 (C.E.Camphellら、Oncogene 9：583-595, 1994)及びイントロンを含むコード領域(D.A.Haberら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88：9618-9622, (1991))はすでに報告されており、腫瘍等の増殖及び分化に関与することが予想される(D.A.Haberら、前掲）。
しかしながら、ＷＴ１が白血病細胞の増殖に関与しており、ＷＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が白血病細胞の増殖を抑制・阻害することは知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、ウイルムス(Wilms) 腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞の増殖阻害剤を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＷＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤を提供する。本発明で使用するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ＷＴ１の転写キャッピング部位に対するもの、翻訳開始領域に対するもの、エクソンに対するものまたはイントロンに対するものなどのＷＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体である。
【０００５】
例えばＷＴ１の転写キャッピング部位を含む領域のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：９で表わされ、またＷＴ１のコード領域のエクソン１〜１０のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：１０〜１９で表わされるが、本発明はこのようなＷＴ１のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を用いる。このアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、通常ＷＴ１のアンチセンスＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖の連続した５〜５０個、好ましくは、９〜３０個の塩基またはＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に結合することができるものであれば、断続的または部分的に相補的な５〜７０個、好ましくは、９〜５０個の塩基から成るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体である。
【０００６】
転写キャッピング部位に対するものとしては、例えば次の塩基配列：５′-AGGGTCGAATGCGGTGGG -3′（配列番号：２）及び５′-TCAAATAAGAGGGGCCGG-３′（配列番号：４）などのものが挙げられる。また、翻訳開始領域に対するものとしては、翻訳開始コドンＡＴＧ並びにその上流及び／又は下流を含む領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が挙げられ、例えば次の塩基配列：５′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-３′（配列番号：６）などが挙げられる。
【０００７】
また、ＷＴ１のコード領域には１０個のエクソンが含まれており、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、これらのエクソンのいずれかに含まれる配列に対するもの、又はスプライシング後に連続するいずれか２個のエクソンにわたる配列に対するものあるいは、連続するイントロンとエクソンにわたる配列に対するもの、全てのイントロン及び３′，５′側非コード領域の配列に対するものである。１例として、第６エクソンに対するものであり、次の塩基配列：５′-CGTTGTGTGGTTATCGCT-３′（配列番号：８）に対するものが挙げられる。
さらに、ＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖と断続的または部分的に相補的な塩基配列を有する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は対応する領域については特に問わないが、これらの中には、ＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を切断する機能を有するリボザイムのようなものも含まれる。
【０００８】
本発明において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の構造は、化１に示したとおりであるが、Ｘは独立して酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）、低級アルキル基あるいは一級アミンまたは二級アミンのいずれでもよい。Ｙは独立して酸素（Ｏ）あるいはイオウ（Ｓ）のいずれでもよい。Ｚは水素または水酸基である。ＢはＺが水素のときアデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシンのいずれかから選ばれ、Ｚが水酸基のときアデニン、グアニン、ウラシルあるいはシトシンのいずれかから選ばれ、主としてＷＴ１をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチドである。Ｒは独立して水素またはジメトキシトリチル基あるいは低級アルキル基である。ｎは７−２８である。
【０００９】
【化１】
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体としては修飾されていないアンチセンスオリゴヌクレオチドだけでなく、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。この様な修飾体として、例えば前述のメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、その他ホスホロチオエート修飾体あるいはホスホロアミデート修飾体等が挙げられる（化２参照）。
【００１１】
【化２】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は次のとおり常法によって得ることができる。
化１のＸ及びＹがＯ、Ｚが水素又は水酸基であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置（例えばApplied Biosystems社製など）によって容易に合成される。
【００１３】
Ｚが水素であるアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。
例えば、 T.Atkinson, M.Smith, in Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach, ed.M.J.Gait, IRL Press, 35-81 (1984)； M.H.Caruthers, Science, 230, 281 (1985)； A.Kume, M.Fujii, M.Sekine, M.Hata, J.Org.Chem., 49, 2139 (1984)；B.C.Froehler, M.Matteucci, Tetrahedron Lett., 27, 469 (1986)； P.J.Garegg, I.Lindh, T.Regberg, J.Stawinski, R.Stromberg, C.Henrichson, ibid, 27, 4051 (1986)；
B.S.Sproat, M.J.Gait, in Oligonucleotide Synthesis： A Practical Approach, ed.M.J.Gait, IRL Press, 83-115 (1984)； S.L.Beaucage and M.H.Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862 (1981)；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedron Lett., 21, 719-722 (1980)；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, J.Am.Chem.Soc., 103, 3185-3191 (1981)を参照のこと。
【００１４】
Ｘが低級アルコキシ基であるリン酸トリエステル修飾体は、常法、例えば化学合成で得られたオリゴヌクレオチドをトシルクロリドのＤＭＦ／メタノール／２，６−ルチジン溶液で処理することにより得ることができる（Moody H.M., et al., Nucleic Acids Res., 17, 4769-4782 (1989)) 。
Ｘがアルキル基であるアルキルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイトを用いて得ることができる（M.A.Dorman, et.al., Tetrahedron, 40, 95-102 (1984)；K.L.Agarwal and F.Riftina, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)) 。
【００１５】
ＸがＳであるホスホロチオエート修飾体は、常法、例えばイオウを用いた固相合成法(C.A.Stein, et.al., Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221 (1988)) あるいはテトラエチルチウラム ジスルフィドを用いて、固相合成法により得ることができる（H.Vu and B.L.Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008 (1991)) 。
Ｘ, ＹがともにＳであるホスホロジチオエート修飾体は、例えばビスアミダイトをチオアミダイトに変換しイオウを作用させることにより固相合成法により得ることができる（W.K.-D.Brill, et.al., J.Am.Chem.Soc., 111, 2321-2322 (1989))。
【００１６】
Ｘが一級アミンあるいは二級アミンであるホスホロアミデート修飾体は、例えばハイドロジェンホスホネートを一級あるいは二級アミンで処理することにより固相合成法で得ることができる（B.Froehler, et.al. Nucleic Acids Res., 16, 4831-4839 (1988))。あるいは、アミダイトをｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキサイドで酸化しても得ることができる（H.Ozaki, et.al., Tetrahedron Lett., 30, 5899-5902 (1989)) 。
【００１７】
Ｚが水酸基であるアンチセンスオリゴリボヌクレオチドの合成法は、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドに比べて、リボース（糖）に２′−水酸基があるためその保護を行わなければならない点できわめて複雑ではあるが、保護基およびリン酸化方法を適宜選択することによって合成することができる（微生物学基礎講座 ８巻、遺伝子工学、大塚栄子、三浦一伸共著、安藤忠彦、坂口健二編、１９８７年１０月１０日、共立出版株式会社発行参照）。
【００１８】
精製および純度確認は、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行うことができる。分子量の確認は、 Electrospray Ionization Mass Spectrometry又は Fast Atom Bonbardment-Mass Spectrometryで行うことができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、genomic DNA からmatureなmRNAに至るいかなる段階においても作用し、その発現を抑制することによって白血病細胞の増殖を阻害すると考えられる。従って、本願発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは白血病の治療のために有効であると期待される。
【００１９】
さらに本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、後述するとおり、正常な骨髄細胞の増殖を阻害することなく、特異的に白血病細胞の増殖を阻害すると考えられる。したがって、白血病患者の細胞、例えば骨髄細胞または末梢血を体外へ取り出し、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体でin vitro処理して白血病細胞の増殖を阻害しておいて、正常な骨髄細胞だけを再び体内に戻すというような「自家骨髄移植」「自家末梢血幹細胞移植」への応用も可能である。
【００２０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤などの外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法に従って調製することができる。
【００２１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、または血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適応させる。さらに持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポゾーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００２２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態、年齢、性別、体重などに応じて適宜調整し好ましい量を用いることができる。また、その投与方法は、患者の状態、薬剤形態などに応じ、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、直腸投与などの種々の投与方法から適宜好ましい方法を用いることができる。
以下本発明を実施例において詳しく説明する。
【００２３】
【実施例】
合成例１．
以下に使用するオリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号：１〜８）を、自動合成装置（Applied Biosystems) を用いて合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し、エタノール沈澱を３回行い、そしてリン酸緩衝液に懸濁した。
合成したオリゴヌクレオチドは次の通りである。
配列番号：１ 転写キャッピング部位のセンス配列（ＳＥ１）
配列番号：２ 転写キャッピング部位のアンチセンス配列（ＡＳ１）
配列番号：３ 転写キャッピング領域のセンス配列（ＳＥ２）
配列番号：４ 転写キャッピング領域のアンチセンス配列（ＡＳ２）
配列番号：５ 翻訳開始領域のセンス配列（ＳＥ３）
配列番号：６ 翻訳開始領域のアンチセンス配列（ＡＳ３）
配列番号：７ エクソン６のセンス配列（ＳＥ４）
配列番号：８ エクソン６のアンチセンス配列（ＡＳ４）
【００２４】
実施例１．
ＷＴ１発現陽性の白血病細胞株Ｋ５６２を５×１０4 個／ml、１００μｌ／ウエルの量で、平底９６−ウエルプレート内の、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０培地に接種した。各オリゴヌクレオチドを、３連のウエルに、最終濃度が２００μｇ／mlとなるように添加した。２時間のインキュベーションの後、各ウエルに最終濃度が１０％となるようにＦＣＳを添加した。２４時間毎に、前記の量の半分のオリゴヌクレオチドを培養物に添加した。
【００２５】
９６時間培養した後、色素排除法により生存細胞を計数した。対照培養物として、ヌクレオチドを含有しない同じ体積のＰＢＳを添加し、そしてこの対照培養物の細胞数を１００％とした。
この結果を図１に示す。この図から明らかな通り、いずれのアンチセンスオリゴヌクレオチドも、対応するセンスオリゴヌクレオチドに比べて強く細胞の増殖を阻害した。
【００２６】
実施例２．
実施例１と同様の実験を行ったが、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３を種々の濃度で添加した。図２から明らかな通り、センスオリゴヌクレオチド（ＳＥ３）は細胞の増殖をほとんど阻害しなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ３）は濃度依存的に細胞の増殖を阻害した。
【００２７】
実施例３．
実施例１と同様の実験を行ったが、オリゴヌクレオチドＳＥ４及びＡＳ４を種々の濃度で添加した。図３から明らかな通り、センスオリゴヌクレオチド（ＳＥ４）は細胞の増殖をほとんど阻害しなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ４）は濃度依存的に細胞の増殖を阻害した。
【００２８】
実施例４．
実施例１と同様の実験を行った。但し、細胞を、平底２４−ウエルプレート中で２．５×１０4 個／ml、１ml／ウエルの量で培養した。オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３を添加し、２〜５日間に毎日生存細胞数を計数した。結果を図４に示す。図から明らかな通り、センスオリゴヌクレオチドを添加した場合、対照の場合と同様に細胞の増殖が見られたが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した場合、細胞の増殖は抑制された。
【００２９】
実施例５．
実施例１と同様の実験を行った。但し、オリゴヌクレオチドとして、ＳＥ３及びＡＳ３、並びにミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド５′-AGAGAAGAAGGGAACCCC-３′（配列番号：２０）（ＭＰＯ−ＡＳ）及び血液凝固因子Ｖ（ＦＶ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド５′-GCGTGGGCAGCCTGGGAA-３′（配列番号：２１）（ＦＶ−ＡＳ）を用いた。図５から明らかなように、ＡＳ３を用いた場合のみ細胞の増殖が阻害された。
【００３０】
実施例６．
実施例１と同様の実験を行ったが、実験細胞として、ＷＴ１発現陽性細胞株ＨＥＬ及びＴＨＰ−１、並びにＷＴ１発現陰性細胞株Ｕ９３７を用いた。オリゴヌクレオチドとしては、実施例１の場合と同じ８種類を用いた。ＷＴ１発現陽性細胞系ＨＥＬ（図６）又はＴＨＰ−１（図７）を用いた場合には、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより細胞の増殖は阻害された。これに対して、ＷＴ１発現陰性細胞株Ｕ９３７（図８）を用いた場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加しても細胞の増殖は阻害されなかった。
【００３１】
実施例７．
白血病患者及び健康な志願者からの骨髄細胞をヘパリン処理し、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そしてFicoll-Hypaque密度勾配遠心により骨髄単核球細胞を得た。ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng／ml）及びＩＬ−３（１００ユニット／ml）を含むα−ＭＥＭを入れた平底９６−ウエルプレートに、上記の単核細胞を１．５×１０6 個／ml、１００μｌ／ウエルの量でプレートした。オリゴヌクレオチド（ＳＥ３及びＡＳ３）による処理は実施例１と同様にした。
９６時間後、細胞を集め、そしてメチルセルロース培地〔１．２％メチルセルロースα−ＭＥＭ、２０％ＦＣＳ、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng／ml）、Ｇ−ＣＳＦ（１００ng／ml）、ＩＬ−３（１００ユニット／ml）及びＳＣＦ（１０ng／ml）〕にプレートした。培養は３連で行った。１４日目に白血病細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌ）及び顆粒球−マクロファージコロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）を計数した。
【００３２】
図９に白血病患者４名（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）２名、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）２名）からのサンプルでの白血病コロニーの形成を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドによりコロニーの出現が阻害されたことがわかる。図１０には、健康な志願者からのサンプルでの顆粒球マクロファージコロニーの出現を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドによってもコロニーの形成は阻害されなかった。
【００３３】
実施例８．
２４−ウエルプレート中で、５×１０4 細胞／ウエルのＫ５６２細胞（Ａ）又はＡＭＬを有する患者からの新鮮な白血病細胞（Ｂ）に、ランダムオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドＡＳ１、オリゴヌクレオチドＡＳ２又はオリゴヌクレオチドＡＳ３を２００μｇ／mlの濃度で添加し、さらに２４時間毎に１００μｇ／mlの濃度で添加した。オリゴヌクレオチドによる最初の処理から４日後に細胞を収得し、ＰＢＳにより洗浄し、そしてLaemliのサンプル緩衝液により細胞溶解した。
【００３４】
２×１０4 個の細胞からの各細胞溶解物を５分間煮沸し、そして次に７．５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル中の各レーンに適用した。電気泳動の後、蛋白質をインモビロン(Immobilon) ポリビニリデンジフルオリド・フィルター（Millipore Corp. MA、米国）に移行させた。このフィルターを、合成ポリペプチド（アミノ酸位置１７７−１９２；Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln （配列番号：２２）に対する抗−ＷＴ１ポリクローナル抗体によりプローブし、そして次にホースラディッシュパーオキシダーゼ−結合抗−免疫グロブリン抗体（Amersham, Little Chalfont 、英国）により処理した。洗浄後、フィルターを検出試薬（Amersham, Little Chalfont 、英国）に１時間浸漬し、そして１〜５分間オートラジオグラフ処理した。
【００３５】
ＴＢＳＴ（０．０５％ Tween 20 を含有するTris−緩衝液）により２回洗浄した後、フィルターを抗−アクチンモノクローナル抗体（Oncogene Science Inc., NY 、米国）によりプローブし、そして上記のようにしてオートラジオグラフ処理した。
ＷＴ１蛋白質及びアクチンに対応するバンドの密度をデンシトメーターＣＳ−９０００（シミズ、京都）により測定し、そしてＷＴ１／アクチン比を計算した。
【００３６】
結果を図１１のＡ及びＢに示す。この図において、レーン１はランダムオリゴヌクレオチドを添加した場合、レーン２はオリゴヌクレオチドＡＳ３を添加した場合、レーン３はオリゴヌクレオチドＡＳ１を添加した場合、そしてレーン４はオリゴヌクレオチドＡＳ２を添加した場合の結果を示す。この図のＡはＫ５６２細胞を用いた場合、そしてＢはＡＭＬを有する患者からの新鮮な白血病細胞を用いた場合の結果を示す。
【００３７】
Ａから明らかなように、Ｋ５６２細胞の培地にＷＴ１オリゴヌクレオチドを添加した場合、ＷＴ１蛋白質のレベルが有意に低下した。他方、対照としてのランダムオリゴヌクレオチドはＷＴ１蛋白質レベルに影響を与えなかった。また、Ｂから明らかなように、ＷＴ１オリゴヌクレオチドをＡＭＬを有する患者から新たに単離した白血病細胞の培地に添加した場合、ＷＴ１蛋白質レベルが有意に低下した。これらの結果は、ＷＴ１アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＷＴ１蛋白質レベルの低下を介して白血病細胞の増殖を特異的に阻害したことを明瞭に示している。
以上の通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは白血病細胞の増殖の阻害のために有効であり、従って新規な白血病治療剤として期待される。
【００３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に対するオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図２】図２は、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３の濃度と、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖との関連を示すグラフである。
【図３】図３は、オリゴヌクレオチドＳＥ４及びＡＳ４の濃度と、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３が白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に及ぼす効果を経時的に示すグラフである。
【図５】図５は、種々のオリゴヌクレオチドが白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、ＷＴ１発現陽性の白血病細胞株ＨＥＬの増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図７】図７は、ＷＴ１発現陽性の白血病細胞株ＴＨＰ−１の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＷＴ１発現陰性の悪性リンパ腫細胞株Ｕ９３７の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図９】図９は、白血病患者由来の骨髄単核球細胞からの白血病細胞コロニーの形成に対するオリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３の効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、健康な志願者由来の骨髄単核球細胞からの顆粒球マクロファージコロニーの形成に対するオリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３の効果を示すグラフである。
【図１１】図１１において、ＡはＫ５６２細胞の培養液に種々のＷＴ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した場合に細胞中のＷＴ１蛋白質のレベルが低下したことを示す電気泳動図の図面代用写真であり、ＢはＡＭＬを有する患者からの新鮮な白血病細胞にＷＴ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した場合に細胞中のＷＴ１蛋白質のレベルが低下したことを示す電気泳動図の図面に代る写真である。
Claims (4)
- Wilms'腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体であって、下記のヌクレオチド配列：
5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3' （配列番号：２）
5'-TCAAATAAGAGGGGCCGG-3' （配列番号：４）
5'-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3' （配列番号：６）又は
5'-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3' （配列番号：８）
において少なくとも９個の連続するヌクレオチドを含んでなり且つ９〜30ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチド誘導体を含んでなる、白血病細胞に対する増殖阻害剤。 - 前記オリゴヌクレオチド誘導体が、下記のヌクレオチド配列：
5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3' （配列番号：２）
5'-TCAAATAAGAGGGGCCGG-3' （配列番号：４）
を有する、請求項１に記載の白血病細胞に対する増殖阻害剤。 - 前記オリゴヌクレオチド誘導体が、下記のヌクレオチド配列：
5'-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3' （配列番号：６）
を有する、請求項１に記載の白血病細胞に対する増殖阻害剤。 - 前記オリゴヌクレオチド誘導体が、下記のヌクレオチド配列：
5'-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3' （配列番号：８）
を有する、請求項１に記載の白血病細胞に対する増殖阻害剤。
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