JPH09104629A - ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤 - Google Patents
ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤Info
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- JPH09104629A JPH09104629A JP14481896A JP14481896A JPH09104629A JP H09104629 A JPH09104629 A JP H09104629A JP 14481896 A JP14481896 A JP 14481896A JP 14481896 A JP14481896 A JP 14481896A JP H09104629 A JPH09104629 A JP H09104629A
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- seq
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なタイプの白血病細胞増殖阻害剤を提供
する。 【解決手段】 ウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る
白血病細胞増殖阻害剤。
する。 【解決手段】 ウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る
白血病細胞増殖阻害剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド誘導体を含んで成る、白血病細胞増殖阻害
剤に関する。
ヌクレオチド誘導体を含んで成る、白血病細胞増殖阻害
剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルムス(Wilms) 腫瘍は、染色体１１
ｐ１３に位置するウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の両
対立遺伝子の不活性化により生ずる小児腎腫瘍である(C
all KMet al., Cell 60：509, 1990)。ＷＴ１の非コー
ド上流配列 (C.E.Camphellら、Oncogene 9：583-595, 1
994)及びイントロンを含むコード領域(D.A.Haberら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 88：9618-9622, (1991))はすで
に報告されており、腫瘍等の増殖及び分化に関与するこ
とが予想される(D.A.Haberら、前掲）。しかしながら、
ＷＴ１が白血病細胞の増殖に関与しており、ＷＴ１に対
するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が白血病細
胞の増殖を抑制・阻害することは知られていない。
ｐ１３に位置するウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の両
対立遺伝子の不活性化により生ずる小児腎腫瘍である(C
all KMet al., Cell 60：509, 1990)。ＷＴ１の非コー
ド上流配列 (C.E.Camphellら、Oncogene 9：583-595, 1
994)及びイントロンを含むコード領域(D.A.Haberら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 88：9618-9622, (1991))はすで
に報告されており、腫瘍等の増殖及び分化に関与するこ
とが予想される(D.A.Haberら、前掲）。しかしながら、
ＷＴ１が白血病細胞の増殖に関与しており、ＷＴ１に対
するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が白血病細
胞の増殖を抑制・阻害することは知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ウイ
ルムス(Wilms) 腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞
の増殖阻害剤を提供するものである。
ルムス(Wilms) 腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞
の増殖阻害剤を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＷＴ１に対す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る
白血病細胞増殖阻害剤を提供する。本発明で使用するア
ンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ＷＴ
１の転写キャッピング部位に対するもの、翻訳開始領域
に対するもの、エクソンに対するものまたはイントロン
に対するものなどのＷＴ１に対するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド誘導体である。
るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る
白血病細胞増殖阻害剤を提供する。本発明で使用するア
ンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ＷＴ
１の転写キャッピング部位に対するもの、翻訳開始領域
に対するもの、エクソンに対するものまたはイントロン
に対するものなどのＷＴ１に対するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド誘導体である。
【０００５】例えばＷＴ１の転写キャッピング部位を含
む領域のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：９で表
わされ、またＷＴ１のコード領域のエクソン１〜１０の
センスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：１０〜１９で表
わされるが、本発明はこのようなＷＴ１のセンスＤＮＡ
鎖の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体を用いる。このアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は、通常ＷＴ１のアンチセンスＤＮＡ鎖またはＲ
ＮＡ鎖の連続した５〜５０個、好ましくは、９〜３０個
の塩基またはＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に結合す
ることができるものであれば、断続的または部分的に相
補的な５〜７０個、好ましくは、９〜５０個の塩基から
成るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体である。
む領域のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：９で表
わされ、またＷＴ１のコード領域のエクソン１〜１０の
センスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：１０〜１９で表
わされるが、本発明はこのようなＷＴ１のセンスＤＮＡ
鎖の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体を用いる。このアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は、通常ＷＴ１のアンチセンスＤＮＡ鎖またはＲ
ＮＡ鎖の連続した５〜５０個、好ましくは、９〜３０個
の塩基またはＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に結合す
ることができるものであれば、断続的または部分的に相
補的な５〜７０個、好ましくは、９〜５０個の塩基から
成るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体である。
【０００６】転写キャッピング部位に対するものとして
は、例えば次の塩基配列：５′-AGGGTCGAATGCGGTGGG -
3′（配列番号：２）及び５′-TCAAATAAGAGGGGCCGG-
３′（配列番号：４）などのものが挙げられる。また、
翻訳開始領域に対するものとしては、翻訳開始コドンＡ
ＴＧ並びにその上流及び／又は下流を含む領域に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が挙げられ、例
えば次の塩基配列：５′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-３′（配
列番号：６）などが挙げられる。
は、例えば次の塩基配列：５′-AGGGTCGAATGCGGTGGG -
3′（配列番号：２）及び５′-TCAAATAAGAGGGGCCGG-
３′（配列番号：４）などのものが挙げられる。また、
翻訳開始領域に対するものとしては、翻訳開始コドンＡ
ＴＧ並びにその上流及び／又は下流を含む領域に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が挙げられ、例
えば次の塩基配列：５′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-３′（配
列番号：６）などが挙げられる。
【０００７】また、ＷＴ１のコード領域には１０個のエ
クソンが含まれており、本発明のアンチセンスオリゴヌ
クレオチド誘導体は、これらのエクソンのいずれかに含
まれる配列に対するもの、又はスプライシング後に連続
するいずれか２個のエクソンにわたる配列に対するもの
あるいは、連続するイントロンとエクソンにわたる配列
に対するもの、全てのイントロン及び３′，５′側非コ
ード領域の配列に対するものである。１例として、第６
エクソンに対するものであり、次の塩基配列：５′-CGT
TGTGTGGTTATCGCT-３′（配列番号：８）に対するものが
挙げられる。さらに、ＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖
と断続的または部分的に相補的な塩基配列を有する本発
明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は対応する
領域については特に問わないが、これらの中には、ＷＴ
１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を切断する機能を有するリ
ボザイムのようなものも含まれる。
クソンが含まれており、本発明のアンチセンスオリゴヌ
クレオチド誘導体は、これらのエクソンのいずれかに含
まれる配列に対するもの、又はスプライシング後に連続
するいずれか２個のエクソンにわたる配列に対するもの
あるいは、連続するイントロンとエクソンにわたる配列
に対するもの、全てのイントロン及び３′，５′側非コ
ード領域の配列に対するものである。１例として、第６
エクソンに対するものであり、次の塩基配列：５′-CGT
TGTGTGGTTATCGCT-３′（配列番号：８）に対するものが
挙げられる。さらに、ＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖
と断続的または部分的に相補的な塩基配列を有する本発
明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は対応する
領域については特に問わないが、これらの中には、ＷＴ
１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を切断する機能を有するリ
ボザイムのようなものも含まれる。
【０００８】本発明において使用されるアンチセンスオ
リゴヌクレオチド誘導体の構造は、化１に示したとおり
であるが、Ｘは独立して酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）、低
級アルキル基あるいは一級アミンまたは二級アミンのい
ずれでもよい。Ｙは独立して酸素（Ｏ）あるいはイオウ
（Ｓ）のいずれでもよい。Ｚは水素または水酸基であ
る。ＢはＺが水素のときアデニン、グアニン、チミン、
あるいはシトシンのいずれかから選ばれ、Ｚが水酸基の
ときアデニン、グアニン、ウラシルあるいはシトシンの
いずれかから選ばれ、主としてＷＴ１をコードするＤＮ
Ａ又はｍＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチドである。Ｒ
は独立して水素またはジメトキシトリチル基あるいは低
級アルキル基である。ｎは７−２８である。
リゴヌクレオチド誘導体の構造は、化１に示したとおり
であるが、Ｘは独立して酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）、低
級アルキル基あるいは一級アミンまたは二級アミンのい
ずれでもよい。Ｙは独立して酸素（Ｏ）あるいはイオウ
（Ｓ）のいずれでもよい。Ｚは水素または水酸基であ
る。ＢはＺが水素のときアデニン、グアニン、チミン、
あるいはシトシンのいずれかから選ばれ、Ｚが水酸基の
ときアデニン、グアニン、ウラシルあるいはシトシンの
いずれかから選ばれ、主としてＷＴ１をコードするＤＮ
Ａ又はｍＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチドである。Ｒ
は独立して水素またはジメトキシトリチル基あるいは低
級アルキル基である。ｎは７−２８である。
【０００９】
【化１】
【００１０】好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体としては修飾されていないアンチセンスオリゴヌ
クレオチドだけでなく、修飾されたアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドでもよい。この様な修飾体として、例えば
前述のメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型
のような低級アルキルホスホネート修飾体、その他ホス
ホロチオエート修飾体あるいはホスホロアミデート修飾
体等が挙げられる（化２参照）。
誘導体としては修飾されていないアンチセンスオリゴヌ
クレオチドだけでなく、修飾されたアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドでもよい。この様な修飾体として、例えば
前述のメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型
のような低級アルキルホスホネート修飾体、その他ホス
ホロチオエート修飾体あるいはホスホロアミデート修飾
体等が挙げられる（化２参照）。
【００１１】
【化２】
【００１２】これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は次のとおり常法によって得ることができる。化
１のＸ及びＹがＯ、Ｚが水素又は水酸基であるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置（例え
ばApplied Biosystems社製など）によって容易に合成さ
れる。
誘導体は次のとおり常法によって得ることができる。化
１のＸ及びＹがＯ、Ｚが水素又は水酸基であるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置（例え
ばApplied Biosystems社製など）によって容易に合成さ
れる。
【００１３】Ｚが水素であるアンチセンスオリゴデオキ
シリボヌクレオチドの合成法はホスホロアミダイトを用
いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた
固相合成法などで得ることができる。例えば、 T.Atkin
son, M.Smith, in Oligonucleotide Synthesis：A Prac
tical Approach, ed.M.J.Gait, IRL Press, 35-81 (198
4)； M.H.Caruthers, Science, 230, 281 (1985)； A.K
ume, M.Fujii, M.Sekine, M.Hata, J.Org.Chem., 49,21
39 (1984)；B.C.Froehler, M.Matteucci, Tetrahedron
Lett., 27, 469 (1986)； P.J.Garegg, I.Lindh, T.Reg
berg, J.Stawinski, R.Stromberg, C.Henrichson, ibi
d, 27, 4051 (1986)；B.S.Sproat, M.J.Gait, in Oligo
nucleotide Synthesis： A Practical Approach, ed.M.
J.Gait, IRL Press, 83-115 (1984)； S.L.Beaucage an
d M.H.Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862
(1981)；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedr
on Lett., 21, 719-722 (1980)；M.D.Matteucci and M.
H.Caruthers, J.Am.Chem.Soc., 103, 3185-3191 (1981)
を参照のこと。
シリボヌクレオチドの合成法はホスホロアミダイトを用
いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた
固相合成法などで得ることができる。例えば、 T.Atkin
son, M.Smith, in Oligonucleotide Synthesis：A Prac
tical Approach, ed.M.J.Gait, IRL Press, 35-81 (198
4)； M.H.Caruthers, Science, 230, 281 (1985)； A.K
ume, M.Fujii, M.Sekine, M.Hata, J.Org.Chem., 49,21
39 (1984)；B.C.Froehler, M.Matteucci, Tetrahedron
Lett., 27, 469 (1986)； P.J.Garegg, I.Lindh, T.Reg
berg, J.Stawinski, R.Stromberg, C.Henrichson, ibi
d, 27, 4051 (1986)；B.S.Sproat, M.J.Gait, in Oligo
nucleotide Synthesis： A Practical Approach, ed.M.
J.Gait, IRL Press, 83-115 (1984)； S.L.Beaucage an
d M.H.Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862
(1981)；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedr
on Lett., 21, 719-722 (1980)；M.D.Matteucci and M.
H.Caruthers, J.Am.Chem.Soc., 103, 3185-3191 (1981)
を参照のこと。
【００１４】Ｘが低級アルコキシ基であるリン酸トリエ
ステル修飾体は、常法、例えば化学合成で得られたオリ
ゴヌクレオチドをトシルクロリドのＤＭＦ／メタノール
／２，６−ルチジン溶液で処理することにより得ること
ができる（Moody H.M., et al., Nucleic Acids Res.,
17, 4769-4782 (1989)) 。Ｘがアルキル基であるアルキ
ルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイ
トを用いて得ることができる（M.A.Dorman, et.al., Te
trahedron, 40, 95-102 (1984)；K.L.Agarwal and F.Ri
ftina, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)) 。
ステル修飾体は、常法、例えば化学合成で得られたオリ
ゴヌクレオチドをトシルクロリドのＤＭＦ／メタノール
／２，６−ルチジン溶液で処理することにより得ること
ができる（Moody H.M., et al., Nucleic Acids Res.,
17, 4769-4782 (1989)) 。Ｘがアルキル基であるアルキ
ルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイ
トを用いて得ることができる（M.A.Dorman, et.al., Te
trahedron, 40, 95-102 (1984)；K.L.Agarwal and F.Ri
ftina, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)) 。
【００１５】ＸがＳであるホスホロチオエート修飾体
は、常法、例えばイオウを用いた固相合成法(C.A.Stei
n, et.al., Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221 (198
8)) あるいはテトラエチルチウラム ジスルフィドを用
いて、固相合成法により得ることができる（H.Vu and
B.L.Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008
(1991)) 。Ｘ, ＹがともにＳであるホスホロジチオエ
ート修飾体は、例えばビスアミダイトをチオアミダイト
に変換しイオウを作用させることにより固相合成法によ
り得ることができる（W.K.-D.Brill, et.al., J.Am.Che
m.Soc., 111, 2321-2322 (1989))。
は、常法、例えばイオウを用いた固相合成法(C.A.Stei
n, et.al., Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221 (198
8)) あるいはテトラエチルチウラム ジスルフィドを用
いて、固相合成法により得ることができる（H.Vu and
B.L.Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008
(1991)) 。Ｘ, ＹがともにＳであるホスホロジチオエ
ート修飾体は、例えばビスアミダイトをチオアミダイト
に変換しイオウを作用させることにより固相合成法によ
り得ることができる（W.K.-D.Brill, et.al., J.Am.Che
m.Soc., 111, 2321-2322 (1989))。
【００１６】Ｘが一級アミンあるいは二級アミンである
ホスホロアミデート修飾体は、例えばハイドロジェンホ
スホネートを一級あるいは二級アミンで処理することに
より固相合成法で得ることができる（B.Froehler, et.a
l. Nucleic Acids Res., 16,4831-4839 (1988))。ある
いは、アミダイトをｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキ
サイドで酸化しても得ることができる（H.Ozaki, et.a
l., Tetrahedron Lett., 30, 5899-5902 (1989)) 。
ホスホロアミデート修飾体は、例えばハイドロジェンホ
スホネートを一級あるいは二級アミンで処理することに
より固相合成法で得ることができる（B.Froehler, et.a
l. Nucleic Acids Res., 16,4831-4839 (1988))。ある
いは、アミダイトをｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキ
サイドで酸化しても得ることができる（H.Ozaki, et.a
l., Tetrahedron Lett., 30, 5899-5902 (1989)) 。
【００１７】Ｚが水酸基であるアンチセンスオリゴリボ
ヌクレオチドの合成法は、アンチセンスオリゴデオキシ
リボヌクレオチドに比べて、リボース（糖）に２′−水
酸基があるためその保護を行わなければならない点でき
わめて複雑ではあるが、保護基およびリン酸化方法を適
宜選択することによって合成することができる（微生物
学基礎講座 ８巻、遺伝子工学、大塚栄子、三浦一伸共
著、安藤忠彦、坂口健二編、１９８７年１０月１０日、
共立出版株式会社発行参照）。
ヌクレオチドの合成法は、アンチセンスオリゴデオキシ
リボヌクレオチドに比べて、リボース（糖）に２′−水
酸基があるためその保護を行わなければならない点でき
わめて複雑ではあるが、保護基およびリン酸化方法を適
宜選択することによって合成することができる（微生物
学基礎講座 ８巻、遺伝子工学、大塚栄子、三浦一伸共
著、安藤忠彦、坂口健二編、１９８７年１０月１０日、
共立出版株式会社発行参照）。
【００１８】精製および純度確認は、高速液体クロマト
グラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行うこ
とができる。分子量の確認は、 Electrospray Ionizati
on Mass Spectrometry又は Fast Atom Bonbardment-Mas
s Spectrometryで行うことができる。本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド誘導体は、genomic DNA からma
tureなmRNAに至るいかなる段階においても作用し、その
発現を抑制することによって白血病細胞の増殖を阻害す
ると考えられる。従って、本願発明のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは白血病の治療のために有効であると期
待される。
グラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行うこ
とができる。分子量の確認は、 Electrospray Ionizati
on Mass Spectrometry又は Fast Atom Bonbardment-Mas
s Spectrometryで行うことができる。本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド誘導体は、genomic DNA からma
tureなmRNAに至るいかなる段階においても作用し、その
発現を抑制することによって白血病細胞の増殖を阻害す
ると考えられる。従って、本願発明のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは白血病の治療のために有効であると期
待される。
【００１９】さらに本発明のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド誘導体は、後述するとおり、正常な骨髄細胞の増
殖を阻害することなく、特異的に白血病細胞の増殖を阻
害すると考えられる。したがって、白血病患者の細胞、
例えば骨髄細胞または末梢血を体外へ取り出し、本発明
のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体でin vitro処
理して白血病細胞の増殖を阻害しておいて、正常な骨髄
細胞だけを再び体内に戻すというような「自家骨髄移
植」「自家末梢血幹細胞移植」への応用も可能である。
オチド誘導体は、後述するとおり、正常な骨髄細胞の増
殖を阻害することなく、特異的に白血病細胞の増殖を阻
害すると考えられる。したがって、白血病患者の細胞、
例えば骨髄細胞または末梢血を体外へ取り出し、本発明
のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体でin vitro処
理して白血病細胞の増殖を阻害しておいて、正常な骨髄
細胞だけを再び体内に戻すというような「自家骨髄移
植」「自家末梢血幹細胞移植」への応用も可能である。
【００２０】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和し
て塗布剤、パップ剤などの外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、
安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆
粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液
剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができ
る。これらは常法に従って調製することができる。
誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和し
て塗布剤、パップ剤などの外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、
安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆
粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液
剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができ
る。これらは常法に従って調製することができる。
【００２１】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は患者の患部に直接適用するか、または血管内に
投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者
に適応させる。さらに持続性、膜透過性を高めるアンチ
センス封入素材を用いることもできる。例えば、リポゾ
ーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、
リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
誘導体は患者の患部に直接適用するか、または血管内に
投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者
に適応させる。さらに持続性、膜透過性を高めるアンチ
センス封入素材を用いることもできる。例えば、リポゾ
ーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、
リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００２２】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体の投与量は、患者の状態、年齢、性別、体重など
に応じて適宜調整し好ましい量を用いることができる。
また、その投与方法は、患者の状態、薬剤形態などに応
じ、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮
下投与、静脈内投与、動脈内投与、直腸投与などの種々
の投与方法から適宜好ましい方法を用いることができ
る。以下本発明を実施例において詳しく説明する。
誘導体の投与量は、患者の状態、年齢、性別、体重など
に応じて適宜調整し好ましい量を用いることができる。
また、その投与方法は、患者の状態、薬剤形態などに応
じ、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮
下投与、静脈内投与、動脈内投与、直腸投与などの種々
の投与方法から適宜好ましい方法を用いることができ
る。以下本発明を実施例において詳しく説明する。
【００２３】
【実施例】合成例１ ．以下に使用するオリゴデオキシリボヌクレオ
チド（配列番号：１〜８）を、自動合成装置（Applied
Biosystems) を用いて合成し、高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製し、エタノール沈澱を３回行い、そして
リン酸緩衝液に懸濁した。合成したオリゴヌクレオチド
は次の通りである。 配列番号：１ 転写キャッピング部位のセンス配列（Ｓ
Ｅ１） 配列番号：２ 転写キャッピング部位のアンチセンス配
列（ＡＳ１） 配列番号：３ 転写キャッピング領域のセンス配列（Ｓ
Ｅ２） 配列番号：４ 転写キャッピング領域のアンチセンス配
列（ＡＳ２） 配列番号：５ 翻訳開始領域のセンス配列（ＳＥ３） 配列番号：６ 翻訳開始領域のアンチセンス配列（ＡＳ
３） 配列番号：７ エクソン６のセンス配列（ＳＥ４） 配列番号：８ エクソン６のアンチセンス配列（ＡＳ
４）
チド（配列番号：１〜８）を、自動合成装置（Applied
Biosystems) を用いて合成し、高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製し、エタノール沈澱を３回行い、そして
リン酸緩衝液に懸濁した。合成したオリゴヌクレオチド
は次の通りである。 配列番号：１ 転写キャッピング部位のセンス配列（Ｓ
Ｅ１） 配列番号：２ 転写キャッピング部位のアンチセンス配
列（ＡＳ１） 配列番号：３ 転写キャッピング領域のセンス配列（Ｓ
Ｅ２） 配列番号：４ 転写キャッピング領域のアンチセンス配
列（ＡＳ２） 配列番号：５ 翻訳開始領域のセンス配列（ＳＥ３） 配列番号：６ 翻訳開始領域のアンチセンス配列（ＡＳ
３） 配列番号：７ エクソン６のセンス配列（ＳＥ４） 配列番号：８ エクソン６のアンチセンス配列（ＡＳ
４）
【００２４】実施例１．ＷＴ１発現陽性の白血病細胞株
Ｋ５６２を５×１０4 個／ml、１００μｌ／ウエルの量
で、平底９６−ウエルプレート内の、ウシ胎児血清（Ｆ
ＣＳ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０培地に接種した。
各オリゴヌクレオチドを、３連のウエルに、最終濃度が
２００μｇ／mlとなるように添加した。２時間のインキ
ュベーションの後、各ウエルに最終濃度が１０％となる
ようにＦＣＳを添加した。２４時間毎に、前記の量の半
分のオリゴヌクレオチドを培養物に添加した。
Ｋ５６２を５×１０4 個／ml、１００μｌ／ウエルの量
で、平底９６−ウエルプレート内の、ウシ胎児血清（Ｆ
ＣＳ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０培地に接種した。
各オリゴヌクレオチドを、３連のウエルに、最終濃度が
２００μｇ／mlとなるように添加した。２時間のインキ
ュベーションの後、各ウエルに最終濃度が１０％となる
ようにＦＣＳを添加した。２４時間毎に、前記の量の半
分のオリゴヌクレオチドを培養物に添加した。
【００２５】９６時間培養した後、色素排除法により生
存細胞を計数した。対照培養物として、ヌクレオチドを
含有しない同じ体積のＰＢＳを添加し、そしてこの対照
培養物の細胞数を１００％とした。この結果を図１に示
す。この図から明らかな通り、いずれのアンチセンスオ
リゴヌクレオチドも、対応するセンスオリゴヌクレオチ
ドに比べて強く細胞の増殖を阻害した。
存細胞を計数した。対照培養物として、ヌクレオチドを
含有しない同じ体積のＰＢＳを添加し、そしてこの対照
培養物の細胞数を１００％とした。この結果を図１に示
す。この図から明らかな通り、いずれのアンチセンスオ
リゴヌクレオチドも、対応するセンスオリゴヌクレオチ
ドに比べて強く細胞の増殖を阻害した。
【００２６】実施例２．実施例１と同様の実験を行った
が、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３を種々の濃度
で添加した。図２から明らかな通り、センスオリゴヌク
レオチド（ＳＥ３）は細胞の増殖をほとんど阻害しなか
ったが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ３）は
濃度依存的に細胞の増殖を阻害した。
が、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３を種々の濃度
で添加した。図２から明らかな通り、センスオリゴヌク
レオチド（ＳＥ３）は細胞の増殖をほとんど阻害しなか
ったが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ３）は
濃度依存的に細胞の増殖を阻害した。
【００２７】実施例３．実施例１と同様の実験を行った
が、オリゴヌクレオチドＳＥ４及びＡＳ４を種々の濃度
で添加した。図３から明らかな通り、センスオリゴヌク
レオチド（ＳＥ４）は細胞の増殖をほとんど阻害しなか
ったが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ４）は
濃度依存的に細胞の増殖を阻害した。
が、オリゴヌクレオチドＳＥ４及びＡＳ４を種々の濃度
で添加した。図３から明らかな通り、センスオリゴヌク
レオチド（ＳＥ４）は細胞の増殖をほとんど阻害しなか
ったが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ４）は
濃度依存的に細胞の増殖を阻害した。
【００２８】実施例４．実施例１と同様の実験を行っ
た。但し、細胞を、平底２４−ウエルプレート中で２．
５×１０4 個／ml、１ml／ウエルの量で培養した。オリ
ゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３を添加し、２〜５日間
に毎日生存細胞数を計数した。結果を図４に示す。図か
ら明らかな通り、センスオリゴヌクレオチドを添加した
場合、対照の場合と同様に細胞の増殖が見られたが、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した場合、細胞の
増殖は抑制された。
た。但し、細胞を、平底２４−ウエルプレート中で２．
５×１０4 個／ml、１ml／ウエルの量で培養した。オリ
ゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３を添加し、２〜５日間
に毎日生存細胞数を計数した。結果を図４に示す。図か
ら明らかな通り、センスオリゴヌクレオチドを添加した
場合、対照の場合と同様に細胞の増殖が見られたが、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した場合、細胞の
増殖は抑制された。
【００２９】実施例５．実施例１と同様の実験を行っ
た。但し、オリゴヌクレオチドとして、ＳＥ３及びＡＳ
３、並びにミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）遺伝子に
対するアンチセンスオリゴヌクレオチド５′-AGAGAAGAA
GGGAACCCC-３′（配列番号：２０）（ＭＰＯ−ＡＳ）及
び血液凝固因子Ｖ（ＦＶ）に対するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド５′-GCGTGGGCAGCCTGGGAA-３′（配列番
号：２１）（ＦＶ−ＡＳ）を用いた。図５から明らかな
ように、ＡＳ３を用いた場合のみ細胞の増殖が阻害され
た。
た。但し、オリゴヌクレオチドとして、ＳＥ３及びＡＳ
３、並びにミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）遺伝子に
対するアンチセンスオリゴヌクレオチド５′-AGAGAAGAA
GGGAACCCC-３′（配列番号：２０）（ＭＰＯ−ＡＳ）及
び血液凝固因子Ｖ（ＦＶ）に対するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド５′-GCGTGGGCAGCCTGGGAA-３′（配列番
号：２１）（ＦＶ−ＡＳ）を用いた。図５から明らかな
ように、ＡＳ３を用いた場合のみ細胞の増殖が阻害され
た。
【００３０】実施例６．実施例１と同様の実験を行った
が、実験細胞として、ＷＴ１発現陽性細胞株ＨＥＬ及び
ＴＨＰ−１、並びにＷＴ１発現陰性細胞株Ｕ９３７を用
いた。オリゴヌクレオチドとしては、実施例１の場合と
同じ８種類を用いた。ＷＴ１発現陽性細胞系ＨＥＬ（図
６）又はＴＨＰ−１（図７）を用いた場合には、アンチ
センスオリゴヌクレオチドにより細胞の増殖は阻害され
た。これに対して、ＷＴ１発現陰性細胞株Ｕ９３７（図
８）を用いた場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドを
添加しても細胞の増殖は阻害されなかった。
が、実験細胞として、ＷＴ１発現陽性細胞株ＨＥＬ及び
ＴＨＰ−１、並びにＷＴ１発現陰性細胞株Ｕ９３７を用
いた。オリゴヌクレオチドとしては、実施例１の場合と
同じ８種類を用いた。ＷＴ１発現陽性細胞系ＨＥＬ（図
６）又はＴＨＰ−１（図７）を用いた場合には、アンチ
センスオリゴヌクレオチドにより細胞の増殖は阻害され
た。これに対して、ＷＴ１発現陰性細胞株Ｕ９３７（図
８）を用いた場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドを
添加しても細胞の増殖は阻害されなかった。
【００３１】実施例７．白血病患者及び健康な志願者か
らの骨髄細胞をヘパリン処理し、ＲＰＭＩ１６４０培地
に懸濁し、そしてFicoll-Hypaque密度勾配遠心により骨
髄単核球細胞を得た。ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng／ml）及
びＩＬ−３（１００ユニット／ml）を含むα−ＭＥＭを
入れた平底９６−ウエルプレートに、上記の単核細胞を
１．５×１０6 個／ml、１００μｌ／ウエルの量でプレ
ートした。オリゴヌクレオチド（ＳＥ３及びＡＳ３）に
よる処理は実施例１と同様にした。９６時間後、細胞を
集め、そしてメチルセルロース培地〔１．２％メチルセ
ルロースα−ＭＥＭ、２０％ＦＣＳ、ＧＭ−ＣＳＦ（１
００ng／ml）、Ｇ−ＣＳＦ（１００ng／ml）、ＩＬ−３
（１００ユニット／ml）及びＳＣＦ（１０ng／ml）〕に
プレートした。培養は３連で行った。１４日目に白血病
細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌ）及び顆粒球−マクロファー
ジコロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）を計数した。
らの骨髄細胞をヘパリン処理し、ＲＰＭＩ１６４０培地
に懸濁し、そしてFicoll-Hypaque密度勾配遠心により骨
髄単核球細胞を得た。ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng／ml）及
びＩＬ−３（１００ユニット／ml）を含むα−ＭＥＭを
入れた平底９６−ウエルプレートに、上記の単核細胞を
１．５×１０6 個／ml、１００μｌ／ウエルの量でプレ
ートした。オリゴヌクレオチド（ＳＥ３及びＡＳ３）に
よる処理は実施例１と同様にした。９６時間後、細胞を
集め、そしてメチルセルロース培地〔１．２％メチルセ
ルロースα−ＭＥＭ、２０％ＦＣＳ、ＧＭ−ＣＳＦ（１
００ng／ml）、Ｇ−ＣＳＦ（１００ng／ml）、ＩＬ−３
（１００ユニット／ml）及びＳＣＦ（１０ng／ml）〕に
プレートした。培養は３連で行った。１４日目に白血病
細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌ）及び顆粒球−マクロファー
ジコロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）を計数した。
【００３２】図９に白血病患者４名（急性骨髄性白血病
（ＡＭＬ）２名、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）２名）か
らのサンプルでの白血病コロニーの形成を示す。アンチ
センスオリゴヌクレオチドによりコロニーの出現が阻害
されたことがわかる。図１０には、健康な志願者からの
サンプルでの顆粒球マクロファージコロニーの出現を示
す。アンチセンスオリゴヌクレオチドによってもコロニ
ーの形成は阻害されなかった。
（ＡＭＬ）２名、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）２名）か
らのサンプルでの白血病コロニーの形成を示す。アンチ
センスオリゴヌクレオチドによりコロニーの出現が阻害
されたことがわかる。図１０には、健康な志願者からの
サンプルでの顆粒球マクロファージコロニーの出現を示
す。アンチセンスオリゴヌクレオチドによってもコロニ
ーの形成は阻害されなかった。
【００３３】実施例８．２４−ウエルプレート中で、５
×１０4 細胞／ウエルのＫ５６２細胞（Ａ）又はＡＭＬ
を有する患者からの新鮮な白血病細胞（Ｂ）に、ランダ
ムオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドＡＳ１、オ
リゴヌクレオチドＡＳ２又はオリゴヌクレオチドＡＳ３
を２００μｇ／mlの濃度で添加し、さらに２４時間毎に
１００μｇ／mlの濃度で添加した。オリゴヌクレオチド
による最初の処理から４日後に細胞を収得し、ＰＢＳに
より洗浄し、そしてLaemliのサンプル緩衝液により細胞
溶解した。
×１０4 細胞／ウエルのＫ５６２細胞（Ａ）又はＡＭＬ
を有する患者からの新鮮な白血病細胞（Ｂ）に、ランダ
ムオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドＡＳ１、オ
リゴヌクレオチドＡＳ２又はオリゴヌクレオチドＡＳ３
を２００μｇ／mlの濃度で添加し、さらに２４時間毎に
１００μｇ／mlの濃度で添加した。オリゴヌクレオチド
による最初の処理から４日後に細胞を収得し、ＰＢＳに
より洗浄し、そしてLaemliのサンプル緩衝液により細胞
溶解した。
【００３４】２×１０4 個の細胞からの各細胞溶解物を
５分間煮沸し、そして次に７．５％ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル中の各レーンに適用し
た。電気泳動の後、蛋白質をインモビロン(Immobilon)
ポリビニリデンジフルオリド・フィルター（Millipore
Corp. MA、米国）に移行させた。このフィルターを、合
成ポリペプチド（アミノ酸位置１７７−１９２；Lys Hi
s Glu Asp Pro Met GlyGln Gln Gly Ser Leu Gly Glu G
ln Gln （配列番号：２２）に対する抗−ＷＴ１ポリク
ローナル抗体によりプローブし、そして次にホースラデ
ィッシュパーオキシダーゼ−結合抗−免疫グロブリン抗
体（Amersham, Little Chalfont 、英国）により処理し
た。洗浄後、フィルターを検出試薬（Amersham, Little
Chalfont、英国）に１時間浸漬し、そして１〜５分間
オートラジオグラフ処理した。
５分間煮沸し、そして次に７．５％ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル中の各レーンに適用し
た。電気泳動の後、蛋白質をインモビロン(Immobilon)
ポリビニリデンジフルオリド・フィルター（Millipore
Corp. MA、米国）に移行させた。このフィルターを、合
成ポリペプチド（アミノ酸位置１７７−１９２；Lys Hi
s Glu Asp Pro Met GlyGln Gln Gly Ser Leu Gly Glu G
ln Gln （配列番号：２２）に対する抗−ＷＴ１ポリク
ローナル抗体によりプローブし、そして次にホースラデ
ィッシュパーオキシダーゼ−結合抗−免疫グロブリン抗
体（Amersham, Little Chalfont 、英国）により処理し
た。洗浄後、フィルターを検出試薬（Amersham, Little
Chalfont、英国）に１時間浸漬し、そして１〜５分間
オートラジオグラフ処理した。
【００３５】ＴＢＳＴ（０．０５％ Tween 20 を含有す
るTris−緩衝液）により２回洗浄した後、フィルターを
抗−アクチンモノクローナル抗体（Oncogene Science I
nc.,NY 、米国）によりプローブし、そして上記のよう
にしてオートラジオグラフ処理した。ＷＴ１蛋白質及び
アクチンに対応するバンドの密度をデンシトメーターＣ
Ｓ−９０００（シミズ、京都）により測定し、そしてＷ
Ｔ１／アクチン比を計算した。
るTris−緩衝液）により２回洗浄した後、フィルターを
抗−アクチンモノクローナル抗体（Oncogene Science I
nc.,NY 、米国）によりプローブし、そして上記のよう
にしてオートラジオグラフ処理した。ＷＴ１蛋白質及び
アクチンに対応するバンドの密度をデンシトメーターＣ
Ｓ−９０００（シミズ、京都）により測定し、そしてＷ
Ｔ１／アクチン比を計算した。
【００３６】結果を図１１のＡ及びＢに示す。この図に
おいて、レーン１はランダムオリゴヌクレオチドを添加
した場合、レーン２はオリゴヌクレオチドＡＳ３を添加
した場合、レーン３はオリゴヌクレオチドＡＳ１を添加
した場合、そしてレーン４はオリゴヌクレオチドＡＳ２
を添加した場合の結果を示す。この図のＡはＫ５６２細
胞を用いた場合、そしてＢはＡＭＬを有する患者からの
新鮮な白血病細胞を用いた場合の結果を示す。
おいて、レーン１はランダムオリゴヌクレオチドを添加
した場合、レーン２はオリゴヌクレオチドＡＳ３を添加
した場合、レーン３はオリゴヌクレオチドＡＳ１を添加
した場合、そしてレーン４はオリゴヌクレオチドＡＳ２
を添加した場合の結果を示す。この図のＡはＫ５６２細
胞を用いた場合、そしてＢはＡＭＬを有する患者からの
新鮮な白血病細胞を用いた場合の結果を示す。
【００３７】Ａから明らかなように、Ｋ５６２細胞の培
地にＷＴ１オリゴヌクレオチドを添加した場合、ＷＴ１
蛋白質のレベルが有意に低下した。他方、対照としての
ランダムオリゴヌクレオチドはＷＴ１蛋白質レベルに影
響を与えなかった。また、Ｂから明らかなように、ＷＴ
１オリゴヌクレオチドをＡＭＬを有する患者から新たに
単離した白血病細胞の培地に添加した場合、ＷＴ１蛋白
質レベルが有意に低下した。これらの結果は、ＷＴ１ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＷＴ１蛋白質レベル
の低下を介して白血病細胞の増殖を特異的に阻害したこ
とを明瞭に示している。以上の通り、本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは白血病細胞の増殖の阻害のた
めに有効であり、従って新規な白血病治療剤として期待
される。
地にＷＴ１オリゴヌクレオチドを添加した場合、ＷＴ１
蛋白質のレベルが有意に低下した。他方、対照としての
ランダムオリゴヌクレオチドはＷＴ１蛋白質レベルに影
響を与えなかった。また、Ｂから明らかなように、ＷＴ
１オリゴヌクレオチドをＡＭＬを有する患者から新たに
単離した白血病細胞の培地に添加した場合、ＷＴ１蛋白
質レベルが有意に低下した。これらの結果は、ＷＴ１ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＷＴ１蛋白質レベル
の低下を介して白血病細胞の増殖を特異的に阻害したこ
とを明瞭に示している。以上の通り、本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは白血病細胞の増殖の阻害のた
めに有効であり、従って新規な白血病治療剤として期待
される。
【００３８】
配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCCACCGCAT TCGACCCT 18
【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGGGTCGAAT GCGGTGGG 18
【００４０】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCGGCCCCTC TTATTTGA 18
【００４１】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCAAATAAGA GGGGCCGG 18
【００４２】配列番号：５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGCAAATGG GCTCCGAC 18
【００４３】配列番号：６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTCGGAGCCC ATTTGCTG 18
【００４４】配列番号：７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGCGATAACC ACACAACG 18
【００４５】配列番号：８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CGTTGTGTGG TTATCGCT 18
【００４６】配列番号：９ 配列の長さ：１２７２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGGTATCCTC GACCAGGGCC ACAGGCAGTG CTCGGCGGAG TGGCTCCAGG AGTTACCCGC 60 TCCCTGCCGG GCTTCGTATC CAAACCCTCC CCTTCACCCC TCCTCCCCAA ACTGGGCGCC 120 AGGATGCTCC GGCCGGAATA TACGCAGGCT TTGGGCGTTT GCCAAGGGTT TTCTTCCCTC 180 CTAAACTAGC CGCTGTTTTC CCGGCTTAAC CGTAGAAGAA TTAGATATTC CTCACTGGAA 240 AGGGAAACTA AGTGCTGCTG ACTCCAATTT TAGGTAGGCG GCAACCGCCT TCCGCCTGGC 300 GCAAACCTCA CCAAGTAAAC AACTACTAGC CGATCGAAAT ACGCCCGGCT TATAACTGGT 360 GCAACTCCCG GCCACCCAAC TGAGGGACGT TCGCTTTCAG TCCCGACCTC TGGAACCCAC 420 AAAGGGCCAC CTCTTTCCCC AGTGACCCCA AGATCATGGC CACTCCCCTA CCCGACAGTT 480 CTAGAGCAAG AGCCAGACTC AAGGGTGCAA AGCAAGGGTA TACGCTTCTT TGAAGCTTGA 540 CTGAGTTCTT TCTGCGCTTT CCTGAAGTTC CCGCCCTCTT GGAGCCTACC TGCCCCTCCC 600 TCCAAACCAC TCTTTTAGAT TAACAACCCC ATCTCTACTC CCACCGCATT CGACCCTGCC 660 CGGACTCACT GCTACTGAAC GGACTCTCCA GTGAGACGAG GCTCCCACAC TGGCGAAGGC 720 AAGAAGGGGA GGTGGGGGGA GGGTTGTGCC ACACCGGCCA GCTGAGAGCG CGTGTTGGGT 780 TGAAGAGGAG GGTGTCTCCG AGAGGGACGC TCCCTCGGAC CCGCCCTCAC CCCAGCTGCG 840 AGGGCGCCCC CAAGGAGCAG CGCGCGCTGC CTGGCCGGGC TTGGGCTGCT GAGTGAATGG 900 AGCGGCCGAG CCTCCTGGCT CCTCCTCTTC CCCGCGCCGC CGGCCCCTCT TATTTGAGCT 960 TTGGGAAGCT GAGGGCAGCC AGGCAGCTGG GGTAAGGAGT TCAAGGCAGC GCCCACACCC 1020 GGGGGCTCTC CGCAACCCGA CCGCCTGTCG CTCCCCCACT TCCCGCCCTC CCTCCCACCT 1080 ACTCATTCAC CCACCCACCC ACCCAGAGCC GGGACGGCAG CCCAGGCGCC CGGGCCCCGC 1140 CGTCTCCTCG CCGCGATCCT GGACTTCCTC TTGCTGCAGG ACCCGGCTTC CACGTGTGTC 1200 CCGGAGCCGG CGTCTCAGCA CACGCTCCGC TCCGGGCCTG GGTGCCTACA GCAGCCAGAG 1260 CAGCAGGGAG TC 1272
【００４７】配列番号：１０ 配列の長さ：４５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン１の一部分 配列 TCTGAGCCTC AGCAAATGGG CTCCGACGTG CGGGACCTGA ACGCGCTGCT GCCCGCCGTC 60 CCCTCCCTGG GTGGCGGCGG CGGCTGTGCC CTGCCTGTGA GCGGCGCGGC GCAGTGGGCG 120 CCGGTGCTGG ACTTTGCGCC CCCGGGCGCT TCGGCTTACG GGTCGTTGGG CGGCCCCGCG 180 CCGCCACCGG CTCCGCCGCC ACCCCCGCCG CCGCCGCCTC ACTCCTTCAT CAAACAGGAG 240 CCGAGCTGGG GCGGCGCGGA GCCGCACGAG GAGCAGTGCC TGAGCGCCTT CACTGTCCAC 300 TTTTCCGGCC AGTTCACTGG CACAGCCGGA GCCTGTCGCT ACGGGCCCTT CGGTCCTCCT 360 CCGCCCAGCC AGGCGTCATC CGGCCAGGCC AGGATGTTTC CTAACGCGCC CTACCTGCCC 420 AGCTGCCTCG AGAGCCAGCC CGCTATTCGC AATCAGG 457
【００４８】配列番号：１１ 配列の長さ：１２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン２ 配列 GTTACAGCAC GGTCACCTTC GACGGGACGC CCAGCTACGG TCACACGCCC TCGCACCATG 60 CGGCGCAGTT CCCCAACCAC TCATTCAAGC ATGAGGATCC CATGGGCCAG CAGGGCTCGC 120 TGG 123
【００４９】配列番号：１２ 配列の長さ：１０３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン３ 配列 GTGAGCAGCA GTACTCGGTG CCGCCCCCGG TCTATGGCTG CCACACCCCC ACCGACAGCT 60 GCACCGGCAG CCAGGCTTTG CTGCTGAGGA CGCCCTACAG CAG 103
【００５０】配列番号：１３ 配列の長さ：７８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン４ 配列 TGACAATTTA TACCAAATGA CATCCCAGCT TGAATGCATG ACCTGGAATC AGATGAACTT 60 AGGAGCCACC TTAAAGGG 78
【００５１】配列番号：１４ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン５ 配列 AGTTGCTGCT GGGAGCTCCA GCTCAGTGAA ATGGACAGAA GGGCAGAGCA A 51
【００５２】配列番号：１５ 配列の長さ：９７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン６ 配列 CCACAGCACA GGGTACGAGA GCGATAACCA CACAACGCCC ATCCTCTGCG GAGCCCAATA 60 CAGAATACAC ACGCACGGTG TCTTCAGAGG CATTCAG 97
【００５３】配列番号：１６ 配列の長さ：１５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン７ 配列 GATGTGCGAC GTGTGCCTGG AGTAGCCCCG ACTCTTGTAC GGTCGGCATC TGAGACCAGT 60 GAGAAACGCC CCTTCATGTG TGCTTACCCA GGCTGCAATA AGAGATATTT TAAGCTGTCC 120 CACTTACAGA TGCACAGCAG GAAGCACACT G 151
【００５４】配列番号：１７ 配列の長さ：９０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン８ 配列 GTGAGAAACC ATACCAGTGT GACTTCAAGG ACTGTGAACG AAGGTTTTCT CGTTCAGACC 60 AGCTCAAAAG ACACCAAAGG AGACATACAG 90
【００５５】配列番号：１８ 配列の長さ：９３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン９ 配列 GTGTGAAACC ATTCCAGTGT AAAACTTGTC AGCGAAAGTT CTCCCGGTCC GACCACCTGA 60 AGACCCACAC CAGGACTCAT ACAGGTAAAA CAA 93
【００５６】配列番号：１９ 配列の長さ：１５８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＷＴ１遺伝子のエクソン１０の一部分 配列 GTGAAAAGCC CTTCAGCTGT CGGTGGCCAA GTTGTCAGAA AAAGTTTGCC CGGTCAGATG 60 AATTAGTCCG CCATCACAAC ATGCATCAGA GAAACATGAC CAAACTCCAG CTGGCGCTTT 120 GAGGGGTCTC CCTCGGGGAC CGTTCAGTGT CCCAGGCA 158
【００５７】配列番号：２０ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGAGAAGAAG GGAACCCC
【００５８】配列番号：２１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCGTGGGCAG CCTGGGAA
【００５９】配列番号：２２ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：合成ペプチド 配列 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln 5 10 15
【図１】図１は、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に対する
オリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
オリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図２】図２は、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３
の濃度と、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖との関連を示す
グラフである。
の濃度と、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖との関連を示す
グラフである。
【図３】図３は、オリゴヌクレオチドＳＥ４及びＡＳ４
の濃度と、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖との関係を示す
グラフである。
の濃度と、白血病細胞株Ｋ５６２の増殖との関係を示す
グラフである。
【図４】図４は、オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３
が白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に及ぼす効果を経時的に
示すグラフである。
が白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に及ぼす効果を経時的に
示すグラフである。
【図５】図５は、種々のオリゴヌクレオチドが白血病細
胞株Ｋ５６２の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
胞株Ｋ５６２の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、ＷＴ１発現陽性の白血病細胞株ＨＥＬ
の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効果を
示すグラフである。
の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効果を
示すグラフである。
【図７】図７は、ＷＴ１発現陽性の白血病細胞株ＴＨＰ
−１の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効
果を示すグラフである。
−１の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻害効
果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＷＴ１発現陰性の悪性リンパ腫細胞株
Ｕ９３７の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻
害効果を示すグラフである。
Ｕ９３７の増殖に対する種々のオリゴヌクレオチドの阻
害効果を示すグラフである。
【図９】図９は、白血病患者由来の骨髄単核球細胞から
の白血病細胞コロニーの形成に対するオリゴヌクレオチ
ドＳＥ３及びＡＳ３の効果を示すグラフである。
の白血病細胞コロニーの形成に対するオリゴヌクレオチ
ドＳＥ３及びＡＳ３の効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、健康な志願者由来の骨髄単核球細
胞からの顆粒球マクロファージコロニーの形成に対する
オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３の効果を示すグラ
フである。
胞からの顆粒球マクロファージコロニーの形成に対する
オリゴヌクレオチドＳＥ３及びＡＳ３の効果を示すグラ
フである。
【図１１】図１１において、ＡはＫ５６２細胞の培養液
に種々のＷＴ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加
した場合に細胞中のＷＴ１蛋白質のレベルが低下したこ
とを示す電気泳動図の図面代用写真であり、ＢはＡＭＬ
を有する患者からの新鮮な白血病細胞にＷＴ１アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを添加した場合に細胞中のＷＴ
１蛋白質のレベルが低下したことを示す電気泳動図の図
面に代る写真である。
に種々のＷＴ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加
した場合に細胞中のＷＴ１蛋白質のレベルが低下したこ
とを示す電気泳動図の図面代用写真であり、ＢはＡＭＬ
を有する患者からの新鮮な白血病細胞にＷＴ１アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを添加した場合に細胞中のＷＴ
１蛋白質のレベルが低下したことを示す電気泳動図の図
面に代る写真である。
Claims (8)
- 【請求項１】 ウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る
白血病細胞増殖阻害剤。 - 【請求項２】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体が、ウイルムス腫瘍遺伝子の転写キャッピング部位
の連続する少なくとも９個のヌクレオチドに対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の
白血病細胞増殖阻害剤。 - 【請求項３】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体が、次の塩基配列： ５′-AGGGTCGAATGCGGTGGG-３′（配列番号：２）又は ５′-TCAAATAAGAGGGGCCGG-３′（配列番号：４） を有する、請求項２に記載の白血病細胞増殖阻害剤。 - 【請求項４】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体が、ウイルムス腫瘍遺伝子の翻訳開始領域の連続す
る少なくとも９個のヌクレオチドに対するアンチセンス
オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の白血病細
胞増殖阻害剤。 - 【請求項５】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド
が、次の塩基配列： ５′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-３′（配列番号：６） を有する、請求項４に記載の白血病細胞増殖阻害剤。 - 【請求項６】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体が、ウイルムス腫瘍遺伝子のエクソン中の連続する
少なくとも９個のヌクレオチドに対応するアンチセンス
オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の白血病細
胞増殖阻害剤。 - 【請求項７】 前記エクソンが第６エクソンである、請
求項６に記載の白血病細胞増殖阻害剤。 - 【請求項８】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体が、次の塩基配列： ５′-CGTTGTGTGGTTATCGCT-３′（配列番号：８） を有する、請求項７に記載の白血病細胞増殖阻害剤。
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|---|---|---|---|
| JP14481896A JP3904260B2 (ja) | 1995-06-01 | 1996-05-16 | ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤 |
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|---|---|---|---|
| JP7-156672 | 1995-06-01 | ||
| JP15667295 | 1995-06-01 | ||
| JP14481896A JP3904260B2 (ja) | 1995-06-01 | 1996-05-16 | ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP3904260B2 JP3904260B2 (ja) | 2007-04-11 |
Family
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| JP14481896A Expired - Fee Related JP3904260B2 (ja) | 1995-06-01 | 1996-05-16 | ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤 |
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| EP1004319A1 (en) * | 1997-07-16 | 2000-05-31 | Haruo Sugiyama | Remedies for solid tumor containing wilms' tumor gene (wt1) expression inhibitors |
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-
1996
- 1996-05-16 JP JP14481896A patent/JP3904260B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
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