JP2007530519A - 癌を治療するための材料および方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
Galili, N., Davis, R. J., Fredericks, W. J., Mukhopadhyay, S., Rauscher, F. J., 3rd, Emanuel, B. S., Rovera, G., and Barr, F. G., Nat Genet, 5: 230-235, 1993. Shapiro, D. N., Sublett, J. E., Li, B., Downing, J. R., and Naeve, C. W., Cancer Res, 53: 5108-5112, 1993. Davis, R. J., D'Cruz, C. M., Lovell, M. A., Biegel, J. A., and Barr, F. G., Cancer Res, 54: 2869-2872, 1994. Gordon, A. T., Brinkschmidt, C., Anderson, J., Coleman, N., Dockhorn-Dworniczak, B., Pritchard-Jones, K., and Shipley, J., Genes Chromosomes.Cancer, 28: 220-226, 2000. Bridge, J. A., Liu, J., Qualman, S. J., Suijkerbuijk, R., Wenger, G., Zhang, J., Wan, X., Baker, K. S., Sorensen, P., and Barr, F. G., Genes Chromosomes Cancer, 33: 310-321, 2002. Menghi-Sartorio, S., Mandahl, N., Mertens, F., Picci, P., and Knuutila, S., Cytometry, 46: 79-84, 2001. Pandita, A., Zielenska, M., Thorner, P., Bayani, J., Godbout, R., Greenberg, M., and Squire, J. A., Neoplasia, 1: 262-275, 1999. Bridge, J. A., Liu, J., Weibolt, V., Baker, K. S., Perry, D., Kruger, R., Qualman, S., Barr, F., Sorensen, P., Triche, T., and Suijkerbuijk, R., Genes Chromosomes.Cancer, 27: 337-344, 2000. Weber-Hall, S., Anderson, J., McManus, A., Abe, S., Nojima, T., Pinkerton, R., Pritchard-Jones, K., and Shipley, J., Cancer Res, 56: 3220-3224, 1996. Roberts, I., Gordon, A., Wang, R., Pritchard-Jones, K., Shipley, J., and Coleman, N., Cytogenet Cell Genet, 95: 134-142, 2001. Wang, R., Titley, J. C., Lu, Y. J., Summersgill, B. M., Bridge, J. A., Fisher, C., and Shipley, J., Mod Pathol, 16: 778-785, 2003. Larramendy, M. L., Tarkkanen, M., Blomqvist, C., Virolainen, M., Wiklund, T., Asko-Seljavaara, S., Elomaa, I., and Knuutila, S., Am J Pathol, 151: 1153-1161, 1997. Yu, W., Inoue, J., Imoto, I., Matsuo, Y., Karpas, A., and Inazawa, J., J Hum Genet, 48: 331-335, 2003. Ojopi, E. P., Rogatto, S. R., Caldeira, J. R., Barbieri-Neto, J., and Squire, J. A., Genes Chromosomes Cancer, 30: 25-31, 2001. Schmidt, H., Wurl, P., Taubert, H., Meye, A., Bache, M., Holzhausen, H. J., and Hinze, R., Genes Chromosomes Cancer, 25: 205-211, 1999. Weber, R. G., Sabel, M., Reifenberger, J., Sommer, C., Oberstrass, J., Reifenberger, G., Kiessling, M., and Cremer, T., Oncogene, 13: 983-994, 1996. Reardon, D. A., Jenkins, J. J., Sublett, J. E., Burger, P. C., and Kun, L. K., Pediatr Neurosurg, 32: 187-191, 2000. Naumann, S., Reutzel, D., Speicher, M., and Decker, H. J., Leuk Res, 25: 313-322, 2001. Lu, Y. J., Williamson, D., Clark, J., Wang, R., Tiffin, N., Skelton, L., Gordon, T., Williams, R., Allan, B., Jackman, A., Cooper, C., Pritchard-Jones, K., and Shipley, J., Proc Natl Acad Sci U S A, 98: 9197-9202, 2001. Lu, Y. J., Williamson, D., Wang, R., Summersgill, B., Rodriguez, S., Rogers, S., Pritchard-Jones, K., Campbell, C., and Shipley, J., Genes Chromosomes Cancer, 38: 207-214, 2003.
上記のように、胞巣型RMSおよび多数の他の癌タイプにおいて13q31の増幅が観察されている。Yuら(13)はさらに、GPC5遺伝子が、13q31−32のアンプリコンを有するリンパ腫細胞株において、該アンプリコンを欠く細胞株と比較して過剰発現していることを示している。この著者らは、GPC5が、13q31−32の増幅されたリンパ腫の病原性にある役割を果たしうると予想したが、これについての何の証拠も与えなかった。腫瘍細胞が遺伝的に不安定であることは周知であり、形質転換後に染色体内増幅などの遺伝的異常を獲得しがちである。それ故に、観察された増幅を形質転換後に獲得したか、または、形質転換過程に単純に関わらないものである可能性がある。従って、今までの文献にはGPC5が正常または異常な細胞増殖に何らかの役割を果たすという証明はない。
(i) GPC5タンパク質を1種以上の候補物質と接触させるステップ;
(ii) GPC5タンパク質と結合する能力に基づいて1種以上の候補物質を選択するステップ;
(iii)1種以上の選択された該候補物質を標的細胞と接触させるステップ;および
(iv) 選択された該候補物質の該細胞の増殖に対する効果を測定するステップ
を含む、上記方法を提供する。
図1:2種類の原発性RMSサンプルおよび細胞株K562中の増幅された13q31−q32領域にわたるBACを用いたFISHの結果である。増幅の最小限領域は、セントロメア末端のRP11-51a2により、および増幅を示さないテロメア末端のGPC6 Taqmanにより規定される。それ故に、最小限増幅の領域はGPC5遺伝子の両側にはみ出すが、隣接するテロメア遺伝子GPC6まで到達していない。GPC5のセントロメア側の近位に位置する遺伝子C13ORF25Aは、リンパ腫に関係があると示唆されている(33)。
図2A:正常な筋肉と比較してのGPC5発現の対数分布である;左(胎児型)、右(胞巣型)。
図2B:正常な筋肉と比較した横紋筋肉腫でのC13ORF25Aの発現を示す。「A」とマークしたバーはC13ORF25Aのゲノム増幅を示すサンプルである。
図3は、K562細胞における、GPC5 mRNAレベルおよび細胞生存に対するGPC5アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す。パネルAは13種の代表的なGPC5標的化オリゴヌクレオチドについてのデータを、対照オリゴヌクレオチド15770と比較して示す。パネルBおよびCは活性オリゴヌクレオチドの1つ(276107)についての用量−反応曲線を、276124と称する別の対照オリゴヌクレオチドと比較して示す。
図4Aは、18件の前立腺癌サンプルおよび6件の良性前立腺過形成サンプルにおけるGPC5 mRNA発現のレベルを、正常前立腺と比較して示す。図4Bは、前立腺癌と良性前立腺過形成との間のGPC5発現の全体的相違を示す。
図5Aは、乳癌サンプルにおけるGPC5 mRNA発現を、正常な乳房生検組織と比較して示す。図5Bは、44件の乳房腫瘍のサンプル中のGPC5を過剰発現するステージ1、2または3の腫瘍の数を、正常乳房組織と比較して示す。
図6は、K562細胞において、処理後24時間および48時間両方の、WT1およびGPC5 mRNAレベルに対するWT1アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示し、WT1がGPC5発現を調節することを示唆している。
図7は、ドセタキソールを用いて処理したPC3M腫瘍における、WT1およびGPC5 mRNA両者のアップレギュレーションを示す。
図8は、RMS細胞株T91−95におけるGPC5過剰発現の効果を示す。A:5種類のGPC5過剰発現コロニーと5種類の模擬トランスフェクション対照コロニーとの間の増殖の差。B:GPC5過剰発現コロニーと対照コロニーとの間のTaqManアッセイにより測定したGPC5発現の差。C:In vitro翻訳についてのウェスタンブロット;レーン1:水(陰性対照)、レーン2:pCMV−TNT−GPC5(63Kda)、レーン3:ルシフェラーゼ(61Kda陽性対照)。タンパク質はビオチン標識リジン残基を取り込むように翻訳させた。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよび適当な比色試薬を用いて発色した。
グリピカン
グリピカンは細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)分子であって、該分子はヘパラン硫酸(HS)グリコサミノグリカン鎖を保持し、かつGPIアンカーを介して細胞膜に連結されたタンパク質コアから構成される。総説については、PerrimonおよびBernfield (2000) Nature 404: 725-728ならびにSelleck (1999) Am J Hum Genet 64: 372-377を参照されたい。
用語「癌細胞」は、本明細書を通して、in vivoで生じた癌および腫瘍由来の細胞ならびに連続培養に適合させた実験用細胞株をはじめとするいずれかの形質転換細胞を意味するために使用される。かかる細胞株は典型的には、無限のin vitro複製能力、接触阻害の消失、動物において腫瘍を形成する能力などの特徴を示す。これらの細胞株は元々は癌に由来するものでも、または実験室で形質転換されたものでもよい。
用語「GPC5アンタゴニスト」は2種の異なるクラスの作用物質を包含する。
本発明のほとんどの態様において、GPC5結合物質とは、GPC5コアタンパク質および/またはそれに関連するヘパラン硫酸鎖と結合することができる作用物質を意味する。しかし、本発明のいくつかの態様、例えば、以下に記載の診断方法においては、GPC5をコードする核酸、および特にはGPC5プレmRNA、mRNA、またはそれらに由来するcDNAと結合することができる作用物質もまた、GPC5結合物質であるとみなすことができる。
GPC5の結合物質は、GPC5アンタゴニストおよび標的化物質として有用であるとともに、生物学的サンプル中のGPC5の存在を検出するためにも用いることができる。これには本発明の範囲内でいくつもの応用がある。
GPC5アンタゴニストおよび結合物質は医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、上記物質のうちの1つに加えて、当業者に周知の製薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定化剤またはその他の材料を含んでもよい。かかる材料は無毒でなければならず、また活性成分の有効性を妨害してはならない。担体その他の材料の厳密な性質は、投与経路(例えば経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路または局所適用)に依存しうる。
GPC5発現(例えば、アンチセンス、RNAi、siRNAまたはリボザイム分子)のモジュレーター(アンタゴニスト)をコードする核酸は遺伝子治療の方法に利用することができる。かかる核酸を発現できる構築物をレシピエントの細胞中にいずれかの好適な方法により導入して、対応する配列を細胞内に発現させることができる。
患者サンプルおよび細胞株
サンプルは、RMSと診断されたthe Royal Marsden NHS Trustからの患者、または最初の診断の時点でUKCCSG(United Kingdom Children's Cancer Study Group)センターに参加している患者から収集した。さらに、22件のサンプルをthe University hospital in Leuven、Belgiumで収集し、また2件のサンプルをUniversity hospital Dusseldorfから収集した。サンプルを瞬間凍結し、サンプルに近接して採取した材料について高い腫瘍含量を確認した。RMSの病理学的診断は、大多数の事例でMMT研究の病理学評価委員会(the pathological review committee of the MMT studies)により行った。病理学の中央評価が得られない事例では、形態学および免疫組織化学を試験してRMSの病理学的特徴を確認した。ARMSの診断は、いずれかの胞巣型病巣がARMS分類するのに十分であるという現行の組織病理学的判定基準と一致するものとした。大多数の腫瘍の臨床データはUKCCSGデータセンター(Leicester, UK)から取得し、その他のデータは参加病院から直接収集した。21歳未満の患者だけを生存分析に用いた。大多数の患者は、SIOP(Societe Internationale de Oncologie Paediatrique)MMT89(悪性間葉腫瘍)プロトコールまたは密接に関連したMMT95およびMMT98プロトコールを用いて治療した。数人の患者は、MMTプロトコールと比較しうる局所的治療プロトコールを用いて治療した。乳癌および前立腺癌患者由来の腫瘍サンプルは、取り出した後に瞬間凍結した。DNAとRNAを以前に記載されているようにサンプルから抽出した(20)。K562 c1.6細胞(親の赤白血病のサブクローン)は、Adrian Newland教授およびDr Xu-Rong Jiang(The London Hospital Medical College, UK)から好意の提供を受け、そしてトランスフェクション研究に用いたRMS細胞株T91-95は、Jaclyn Biegel(Children's Hospital of Philadelphia)からの寄贈品であった。
以前のRMSに関する研究からのデータには、ゲノム不均衡に対する比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)分析(n=127)(4〜10)(未発表データ)および染色体レベルの示差的発現についての比較発現配列ハイブリダイゼーション(CESH)データ(n=45)(19、20)が含まれる。これらのデータを本明細書で用いて、13q31−q32における、筋肉と比較して示差的発現を伴うゲノム変化を比較した。
間期蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を以前に記載されている通り実施した(21)。本発明者らは、2つのARMS原発性サンプルおよび13q31−32アンプリコンを有するK562細胞株からのタッチプレップ(touch preps)を用いた。13q31−32領域にまたがるBAC(細菌人工染色体)クローンはSanger Centreから入手したが、これにはRP11-51a2、RP11-16n13、RP11-121J7、RP11-215m7、RP11-57f10、RP11-169i15、RP11-210-3が含まれた。
GPC5およびGPC6のゲノムおよびmRNAコピーの量を測定するために、5セットのプライマーとプローブを設計した(表1を参照)。全てのプライマーとプローブは、Applied BiosystemsのTaqMan(登録商標)標準条件に従って設計した。プライマーとプローブは、GPC5のゲノムコピーを検出するために、GPC5遺伝子のイントロン2内に設計した。GPC6のコピーを検出するために、プライマーとプローブをエクソン3内に設計した。異数性を補正するために遺伝子GJB2を内在性対照として選んだ。GJB2は腫瘍形成に関わることはないと考えられ、かつRMSにおいて改変されることが少ない13番染色体の領域(13q11)に位置する遺伝子である。プライマーとプローブをエクソン1内に設計した。
全ての統計学的検定は、SPSS10.0パッケージを用いて実施し、かつ5%有意水準で検定した。無病生存期間(failure free survival)は、診断から再発、進行、死亡またはもし問題がなければ最後の接触の日までの期間として定義した。死亡までの期間は、診断から死亡まで、またはもし問題がなければ最後の接触の日までの期間として定義した。
WT1を定量するためのプライマー対とプローブを、Primer Expressプログラム(Applied Biosystems)を用いて、推奨されたガイドラインに従い、上記の通り設計した:WT1-フォワードプライマー、5’-TACCCAGGCTGCAATAAGAGATATTTTAAG-3’、リバースプライマー、5’-CCTTTGGTGTCTTTTGAGCTGGTC-3’、およびプローブ、5’-CACTGGTGAGAAACCATACCAGTGTGACTTCAAGGACT-3’。それぞれのアッセイサンプルを3回ずつ上記のように分析し、そして遺伝子発現レベルの測定を促進するために多重化したが、ここで該測定は、GAPDH(in vivo腫瘍サンプル)または18sリボソームRNA発現(リボソームRNA対照試薬、Applied Biosystems)(in vitro細胞株サンプル)との比較において、標準曲線法を用いて行った。
GPC5に対する市販抗体が存在しないので、特注のポリクローナル抗体をエピトープペプチドH2N−CKSYTQRVVGNGIKAQ−COOH(16aa)に対して、2匹のウサギを免疫感作することにより生起した(Eurogentec, Belgiumが実施した)。5mgのエピトープペプチドを8mlのSulfoLinkカップリングゲル(Pierce Biotechnology, IL)に固定し、これを用いて最高抗体力価を有するウサギからの最終採血血清をアフィニティー精製した。抗体特異性はウェスタンブロットにより確認し、これは、2μLのGPC5 in vitro翻訳反応および対照として2μLのルシフェラーゼin vitro翻訳反応を用いて以前に記載されたように実施した(22)。正しいサイズの単一の明確なバンドをGPC5に対して得た。細胞株から、MEM-PER抽出試薬(Pierce Biotechnology, IL)を用いて膜タンパク質を抽出し、YM-30フィルター(Millipore)を用いて限外濾過して界面活性剤を除き、そしてタンパク質濃度をBCAアッセイキット(Pierce Biotechnology, IL)を用いて測定した。
2’-O-メトキシエチル(2’-MOE)領域につないだ8個の2’-デオキシ無修飾糖残基の中央ウインドウと、完全にチオアート化された骨格から成る20merの2’-MOEキメラオリゴヌクレオチドを、Isis Pharmaceuticals Inc.によって以前に記載のように合成した(Baker, B. F., Lot, S. S., Condon, T. P., Cheng-Flournoy, S., Lesnik, E. A., Sasmor, H. M.,およびBennett, C. F. (1997) J Biol Chem 272, 11994-12000)。全長mRNA産物全体にわたり予想されるアクセス可能なGPC5 mRNA配列を標的化する20種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを得て、K562細胞において活性についてスクリーニングした。マウスc-rafキナーゼを標的化するISIS 15770、配列5’-ATGCATTCTGCCCCCAAGGA-3’、5-10-5ギャップマー(gapmer)をこのスクリーニングの対照に用いた。特定した2種の活性化合物はISIS 276107、配列5’-CAGCCCCCTGACAGCTCCCA-3’およびISIS 276119 配列5’-CCATCTGCAGCAGCTAATTC-3’であった。また、対照としてISIS 276124、配列5’-TGGATTTGCTTTACATCACT-3’も用いた。
アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチドをPBSに溶解し、低電圧エレクトロポレーションによりK562細胞中に導入した:40μlの適当に希釈したASOを360μlの細胞懸濁液(2×107細胞/ml)と併せ、そして細胞をPulse Controller Plusキャパシタンスエクステンダー・アクセサリーモジュールを備えたBio-Rad Gene Pulser(登録商標)IIエレクトロポレーションシステム(Bio-Rad Laboratories Ltd, Hemel Hempstead, Herts, UK)により300Vおよび静電容量値1000μFにてエレクトロポレーションし、そして完全培地を用いて10mlに希釈した。それぞれのサンプルから、細胞の適当な重複アリコートを完全培地で連続希釈して細胞毒性の評価を行う一方、残りの細胞を37℃にて24時間インキュベートし、RNAを抽出してGPC5および/またはWT1発現レベルを定量した。
本アッセイにおいては、処理後に細胞を軟寒天中の懸濁状態で低密度にて増殖させる。形成される各コロニーは単一生存細胞に由来する。希釈した細胞の2mlアリコートを、20%FCSおよび0.2%Noble寒天(DIFCO Laboratories, Detroit, Michigan)を添加した3mlの培地を含有するポリスチレンチューブ(Elkay Products (UK) Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK)に加え、そして37℃にてインキュベートし、14日後に32個以上の細胞を含有するコロニーを数えた。薬物処理後に形成されたコロニーの数を、模擬(sham)エレクトロポレーション後に得た数または対照スクランブルオリゴヌクレオチドと比較し、対照処理%として表した。複数の別々の実験において、対照プレーティング効率は、典型的にはプレーティングした800〜1600個の細胞について22〜38%の範囲にあった。さらに、希釈系列(約103〜104細胞/ml)からの細胞を平行して3〜5日間、懸濁培養液中で増殖させて細胞毒性を確認した。
ヒトGPC5の全コード領域を含有するImageクローン5744533を、ATCC(American Type Culture Collection at LGC Promochem, UK)から得た。コード領域をXpand高フィデリティーPCRキット(Roche, Switzerland)およびプライマーを用いて増幅し、インフレームのkozak配列を5’末端に含有する産物を生成した(表1を参照)。この産物をベクターpCR4-TOPO(Invitrogen, CA)中にTAクローニングし、配列をApplied Biosystems Big Dye配列決定キットバージョン1および377 ABI Prism配列決定マシンを用いて確認した。該インサートをEcoRIを用いて制限消化し、EcoRI消化したベクターpCMV-TnT(Promega, UK)中にT4 DNAリガーゼ(Invitrogen, CA)を用いて再ライゲーションした。精製したpCMV-TnT-GPC5と対照であるT7-ルシフェラーゼプラスミドを、ビオチン標識したリジンを含むPromegaのQuick coupled TnT T7 in vitro翻訳システム(Promega, UK)を用いて製造業者の指示書に従いin vitro翻訳した。産物をSDS-PAGEにより分離し、Immoblion-P PVDF膜(Millipore, UK)上にブロットし、そしてストレプトアビジン-アルカリホスファターゼおよびウェスタンブルー比色基質(Promega, UK)を用いて製造業者の指示書に従い発色させた。
安定してトランスフェクトした細胞の増殖特性を評価するために、代謝酵素であるヘキソサミニダーゼの、p−ニトロフェノール−N−アセチル−β−D−グルコサミニドを分解して着色産物を生成する能力に基づく方法を、以前に記載された通り使用して細胞数を測定した(23)。
CGHデータとCESHデータとの比較
文献で利用しうる全てのCGHデータのメタ分析は、領域13q31−32がARMSの21/87(25%)およびERMSの9/40(22%)で増加していることを示した。ARMSの5/87(6%)がこの領域を増幅していることが明らかになった(4〜10)(未発表データ)。ある領域の総体的な示差的発現を領域基準で検出するCESH分析は、ARMSの7/27(26%)およびERMSの4/19(21%)が、正常筋肉と比較して13q31−32からの過剰発現を示すことを明らかにした。CGHデータとCESHデータが同じサンプルから利用しうる場合では、13q31−32に増加のあるサンプルの大部分(7/8(88%))は領域13q31−32からの過剰発現をも示していた。さらに、3件のサンプルは、CGHによる明らかな増加なしに該領域からの過剰発現を示した。
13q31−32にマッピングされるBACを用いて、2つの原発性RMSサンプルおよび細胞株K562での増幅領域を、13番染色体の物理的マップ(32で構築された)における約3.8Mb長(約88,200K〜約91,900K)の13q31−32の領域に位置付けることが可能であった(図1参照)。この増幅領域のうちの2Mbは両方のRMSサンプルにおいて最高コピー数を有し、かつこの2Mb区間は遺伝子GPC5(グリピカン5)を含有する。約2Mb長のGPC5は、ヒトゲノムにおいて現在のところ2番目に大きい遺伝子である(24)。K562での増幅レベルは、GPC5のテロメア側にある次のアノテーション付き遺伝子であるGPC6の手前で低くなりそして停止するようである。GPC5に加えて、この増幅領域内の唯一の他のキュレートされた(curated)遺伝子は偽遺伝子であり(www.ncbi.nlm.nih.gov/locuslink)、最近同定されたC13ORF25である(33)。Yuらによる5件のリンパ腫サンプルにおける13q31−q32増幅のFISHマッピングは、同じ領域にわたるがGPC5のセントロメア側に余分な1Mbがつながった最小限の増幅を明らかにした(13)。
RMSと診断された102個体(そのうち45人はARMS、51人はERMS、そして5人は特定できないRMS(RMS−NOS)であった)から採取した原発性腫瘍サンプルにおいてGPC5のゲノム数を測定した。102人のRMSのうちの13人(13%)、サブタイプ別ではARMSの7/45(16%)、ERMSの6/51(12%)は正常DNAと比較して1.5倍を越えるGPC5コピーの増加を示す。最大の増幅は、正常なゲノムDNAより約90倍大きいゲノムコピーを示す。このデータは、データを利用しうるサンプルに対するCGHおよびFISHデータと一致した(4)。ARMSとERMSにおけるゲノムコピー数の間に有意差はなかった。GPC5コピーの増加した全サンプルのGPC6コピー数を測定し、ゲノムコピー数の増加がないことを示した。
GPC5コピーのゲノム増加は主に、より年少の小児で発生するようである。21歳未満の付随年齢データを有する83件のサンプルのうち、増幅のある13件の全サンプルは0〜10歳齢であったが、増幅のないサンプルのうち42件が0〜10歳齢で、残りの28件は10〜21歳齢であった。GPC5のゲノムコピーの増加がある患者と腫瘍のゲノムコピーの増加のない患者の診断時年齢には、有意な不均一性が存在する:尤度比=8.332、n=83、p=0.0038。GPC5発現またはGPC5増幅と、進行度、ステージ、致死期間または無病生存期間との間に有意差は観察されない。
20種のGPC5を標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドを、GPC5レベルおよび細胞生存の両方を有意に低下させる能力についてスクリーニングした。2種の活性化合物、ISIS 276107およびISIS 276119をこの一次スクリーニングにおいて特定した;これらはGPC5レベルを対照レベルの30%未満に低下させ、かつ細胞生存を80%より大きく低下させた(図3A)。これらの結果を、このスクリーニングからのGPC5レベルと細胞生存の両方に影響を与えない2種の他の典型的なASOと比較した。予備的なものであるが、これらのデータはGPC5発現のダウンレギュレーションと細胞生存度の低下との相関を示唆する。
上記の横紋筋肉腫サンプルに対するのと同じアッセイを、前立腺サンプルに対して行った;但し、発現は正常な筋肉cDNAの代わりに、市販の正常な前立腺RNAプールから合成した正常な前立腺cDNAと比較して測定した。
いくつかのサンプルに対して、本発明者らは既に以前のTaqMan研究から得たMYCNの発現についての情報を有していた(データは示していない)。PAX/FOXO1A転座が確認されたERMSおよびARMSにおいて、GPC5の発現はMYCNの発現と有意な相関のあることを見出した:それぞれSpearmanのρ=0.497、n=38、p=0.002およびSpearmanのρ=0.399、n=26、p=0.043。
以前に行ったWT1に対するASOを用いたK562細胞処理後の遺伝子プロファイル研究により、GPC5を推定上にWT1標的遺伝子として同定した(原稿作成中)。WT1アンチセンス処理後と、WT1発現低下と相関するGPC5発現のダウンレギュレーションを独立した実験で確認した(図6を参照)。同様に、予備的なin vivo研究により、WT1アンチセンスを用いて処理した胸腺欠損ヌードマウスにおいて、皮下移植片として増殖させたPC3M前立腺癌細胞におけるGPC5のダウンレギュレーションを実証した:ASWT1エクソン5マウス中のWT1発現レベルの50%減少はGPC5発現の30%減少に反映された(データは示していない)。GPC5はそのプロモーター領域に2つのWT1コンセンサス結合部位を有するので、GPC5のWT1による直接転写調節は起こりうる。
GPC5の過剰発現が発癌性を与えうるかを試験する目的で、GPC5を構成的に発現させるためにGPC5構築物をCMV(サイトメガロウイルス)プロモーターの制御下においた。この構築物をin vitro翻訳により試験して、適当なサイズのタンパク質(63Kd)を産生することがわかった(図8Cを参照)。RMS細胞株T91-95を安定的にトランスフェクトし、健常なコロニーを拾った。T91-95は、GPC5とMYCNの両方を正常な筋肉と同様なレベルで発現するRMS細胞株である。GPC5をトランスフェクトしたコロニー5個と空ベクター対照をトランスフェクトしたコロニー5個を無作為に選択して細胞増殖アッセイを行った。
本発明者らのデータは、RMSの発生におけるGPC5遺伝子(細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン)の潜在的役割を支持しかつ特徴付けるものである。従来のデータの分析によって、GPC5遺伝子を保持する13q31−32領域に対応する示差的過剰発現は、胞巣型および胎児型サブタイプの両方で、該領域を増幅する事例においておよび増幅がないいくつかの事例においても見出されることが示された。このデータはGPC5コピー数および発現の定量分析結果に反映されており、併せて、GPC5の過剰発現が両方のサブタイプのRMSの病原性に重要であることを示唆する。該データはまた、ゲノム増幅以外のメカニズムによりアップレギュレーションされる遺伝子発現とも矛盾しない。
Claims (41)
- 細胞をGPC5アンタゴニストまたはGPC5結合物質と接触させるステップを含む、標的細胞の増殖を阻害する方法。
- 前記標的細胞がGPC5を不適当に発現しているか、または過剰発現している、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞がWT1を不適当に発現しているか、または過剰発現している、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞が癌細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌が、横紋筋肉腫、リンパ腫、非小細胞性肺癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、神経グリア腫瘍、頭頸部の扁平上皮癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、骨もしくは軟組織の悪性線維性組織球腫、メラノーマ、中皮腫、甲状腺癌、肺癌、精巣癌または卵巣癌である、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が、13q31での染色体内アンプリコンを有していない、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合物質が、GPC5コアタンパク質および/またはそれに随伴するヘパラン硫酸鎖に結合するものである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合物質が抗体またはペプチドである、請求項7に記載の方法。
- 細胞を治療薬と接触させるステップをさらに含む、請求項7または8に記載の方法。
- 前記治療薬が結合物質に随伴しているものである、請求項9に記載の方法。
- 前記治療薬が結合物質に結合することができるものである、請求項9に記載の方法。
- 前記治療薬が、細胞毒性分子、酵素作用により細胞毒性分子へと変換可能な前駆体分子、免疫系の細胞もしくは分子、またはウイルスベクターを含んでなる、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GPC5アンタゴニストが、細胞表面で機能的GPC5の発現を阻害するものである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GPC5アンタゴニストが、GPC5 mRNAまたはプレmRNAの配列に相補的な核酸配列を含んでなる、請求項13に記載の方法。
- 前記GPC5アンタゴニストが、アンチセンスRNA、RNAiもしくはsiRNAのようなdsRNA、またはリボザイムを含んでなる、請求項14に記載の方法。
- 前記GPC5アンタゴニストがGPC5タンパク質の活性を阻害するものである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GPC5アンタゴニストが抗体またはペプチドである、請求項16に記載の方法。
- 細胞を治療薬と接触させるステップをさらに含んでなる、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GPC5アンタゴニストが、治療薬に対する細胞の感受性を増大させるものである、請求項18に記載の方法。
- GPC5アンタゴニストもしくは結合物質を用いた治療に対する癌の感受性を測定するための方法であって、該癌由来の細胞でのGPC5および/もしくはWT1の発現の存在、非存在またはレベルを決定するステップを含む、上記方法。
- 前記癌由来の細胞における13q31での染色体内増幅の存在、非存在または程度を決定するステップをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- GPC5アンタゴニストもしくは結合物質を用いた治療に対する癌の感受性を測定するための方法であって、13q31での染色体内増幅の存在、非存在または程度を決定するステップを含む、上記方法。
- 前記癌由来の細胞でのGPC5および/もしくはWT1の発現の存在、非存在またはレベルを決定するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 前記癌が、横紋筋肉腫、リンパ腫、非小細胞性肺癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、神経グリア腫瘍、頭頸部の扁平上皮癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、骨もしくは軟組織の悪性線維性組織球腫、メラノーマ、中皮腫、甲状腺癌、肺癌、精巣癌または卵巣癌である、請求項20〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 患者体内で循環中のGPC5の存在、非存在またはレベルを決定するステップを含む、患者における癌の存在のスクリーニング方法。
- 患者由来のサンプルにおいて循環中のGPC5の存在、非存在またはレベルを決定するステップを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記サンプルが血液、血清または血漿である、請求項26に記載の方法。
- 前記サンプルをGPC5結合物質と接触させるステップを含む、請求項26または27に記載の方法。
- 前記癌が、横紋筋肉腫、リンパ腫、非小細胞性肺癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、神経グリア腫瘍、頭頸部の扁平上皮癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、骨もしくは軟組織の悪性線維性組織球腫、メラノーマ、中皮腫、甲状腺癌、肺癌、精巣癌または卵巣癌である、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 標的細胞の増殖を阻害することが可能な作用物質のスクリーニング方法であって、以下のステップ:
(i) GPC5タンパク質を1種以上の候補物質と接触させるステップ;
(ii) GPC5タンパク質に結合する能力に基づいて1種以上の候補物質を選択するステップ;
(iii) 1種以上の選択された該候補物質を標的細胞と接触させるステップ;および
(iv) 選択された該物質の、該細胞の増殖に対する効果を測定するステップ
を含む、上記方法。 - 前記細胞がGPC5を不適当に発現しているか、または過剰発現している、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞が癌細胞である、請求項30または31に記載の方法。
- 前記癌が、横紋筋肉腫、リンパ腫、非小細胞性肺癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、神経グリア腫瘍、頭頸部の扁平上皮癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、骨もしくは軟組織の悪性線維性組織球腫、メラノーマ、中皮腫、甲状腺癌、肺癌、精巣癌または卵巣癌である、請求項32に記載の方法。
- 患者由来の乳房腫瘍でのGPC5発現レベルに基づいて該患者に対する予後診断をするステップを含む、乳癌患者の予後を決定する方法。
- 患者由来の乳癌細胞を含有するサンプルを用いてin vitroでGPC5の発現の存在、非存在または程度を決定するステップを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記サンプルをGPC5結合物質と接触させることを含む、請求項35に記載の方法。
- 癌の細胞でのGPC5発現を測定するステップを含む、GPC5を発現することが予め明らかになっている癌に対する治療の成功をモニタリングするための方法。
- 前記癌の細胞をGPC5結合物質と接触させるステップを含む、請求項37に記載の方法。
- 患者由来の癌細胞を含有するサンプルを用いてin vitroで行うものである、請求項38に記載の方法。
- 得られた結果を、治療前および/または治療の初期段階で同一患者について行った同等なアッセイの結果と比較するステップを含む、請求項37〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌の細胞中のGPC5発現レベルを測定するステップ、あるいはGPC5を発現もしくは過剰発現している細胞の数または密度を測定するステップを含む、請求項37〜40のいずれか1項に記載の方法。
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