JP6478416B2

JP6478416B2 - 慢性腎臓病治療用医薬組成物

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Publication number: JP6478416B2
Application number: JP2016512705A
Authority: JP
Inventors: 小野　隆; 隆小野; 勝利山田; 憲人吉村; 俊宏篠崎; 義成我原; 伊藤　裕; 裕伊藤; 修脇野; 武志神田; 一宏長谷川; 素明小松
Original assignee: Keio University; Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Keio University; Shionogi and Co Ltd
Priority date: 2014-04-07
Filing date: 2015-04-06
Publication date: 2019-03-06
Anticipated expiration: 2035-04-06
Also published as: US20170107521A1; WO2015156237A1; US10087449B2; JPWO2015156237A1

Description

本発明は、特定のタンパク質の酵素活性を抑制する又は遺伝子の発現を抑制する物質を含む慢性腎臓病の治療用医薬組成物に関する。具体的には、本発明は、ニコチンアミド-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（以下、ＮＮＭＴともいう）の酵素活性を抑制する又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を含む慢性腎臓病の治療用医薬組成物、並びにＮＮＭＴの酵素活性又は遺伝子の発現の変動に基づく慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法、に関する。

腎機能障害を有する患者が世界的に増え続けており、透析医療を受ける末期腎不全患者数の増加は医療経済上の問題となっている。近年、慢性腎臓病（chronic kidney disease：CKD）という疾患概念が提唱され、その予防・治療の重要性に対する認識が高まっている。慢性腎臓病とは、「尿蛋白陽性などの腎疾患の存在する所見」、もしくは「腎機能低下（糸球体濾過量が60mL/min/1.73m²未満）」が3ヵ月以上続く状態を指す。

慢性腎臓病の発症・進展に、高血圧、糖尿病、脂質代謝異常、喫煙などが危険因子となっており、ライフスタイルの変化によるメタボリックシンドロームの広がりから、今後も患者数の伸びが危惧されている。慢性腎臓病は、末期腎不全の進行リスクであるのみならず、心血管イベントの危険因子であり、心筋梗塞、心不全、脳梗塞および死亡の原因になっている。

慢性腎臓病の予防・治療法としては、生活指導・食事指導に加えて、アンギオテンシン受容体拮抗薬やカルシウム拮抗薬などの降圧療法の治療が行われている。しかし、既存の治療法によって得られる効果は十分とは言えず、より優れた腎機能障害の予防・治療剤が求められている。

慢性腎臓病の病理学的特徴として糸球体硬化や尿細管間質の線維化が挙げられる。末期腎不全の病理像は実質細胞の脱落と線維化が顕著である。慢性腎臓病患者において尿細管間質の線維化を示す患者は、線維化を示さない患者と比較してより腎機能悪化の進行が早いことが知られている。

線維化はあらゆる組織で起こりうるが、その発症の引き金の種類に関わらず、共通した機序で進行しうる。
一方、動物の組織や臓器は、コラーゲン等の線維により構造が維持されているが、組織が何らかの傷害を受けると、コラーゲン産生を伴う創傷治癒の過程により元の組織に修復される。しかしながら、組織が免疫的、化学的、機械的、代謝的、あるいはその他の傷害を複数回にわたって受けたり、その傷害の程度が大きいと、過剰な線維性結合組織の蓄積が生じる場合がある。このような結合組織の蓄積は不可逆的であり、線維が異常に増えてしまうと、組織や臓器が正常な機能を果たさなくなる線維化疾患が引き起こされる。

慢性腎臓病、特に線維化を伴う慢性腎臓病に有効な薬剤は存在せず、創薬ターゲットになりうる新規の線維化亢進因子の同定が望まれるところである。

ＣＫＤ診療ガイド２００９、日本腎臓学会編

本発明の目的は、ＮＮＭＴの酵素活性又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制することで、慢性腎臓病、特に線維化を伴う慢性腎臓病の治療用医薬組成物を提供することである。

本発明者等は、慢性腎臓病の動物モデルにおいて、腎症惹起に伴い変動する分子の探索より、ニコチン酸代謝系の酵素であるＮＮＭＴの遺伝子の腎臓での発現の亢進を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の[１]〜[３４]を提供する。
［１］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を含む、慢性腎臓病の治療用医薬組成物。
［２］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質が核酸である、［１］に記載の医薬組成物。
［３］前記核酸が、siRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はこれらの発現ベクターである［２］に記載の医薬組成物。
［４］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質が抗体である、［１］に記載の医薬組成物。
［５］ＮＮＭＴの酵素活性又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を指標とする、慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法。
［６］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を含む、線維化を伴う慢性腎臓病の治療用医薬組成物。
［７］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質が核酸である、［６］に記載の医薬組成物。
［８］前記核酸が、siRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はこれらの発現ベクターである［７］に記載の医薬組成物。
［９］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質が抗体である、［６］に記載の医薬組成物。
［１０］ＮＮＭＴの酵素活性又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を指標とする、線維化を伴う慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法。
［１１］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を投与する工程を有する慢性腎臓病を治療する方法。
［１２］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質が核酸である、［１１］に記載の方法。
［１３］前記核酸が、siRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はこれらの発現ベクターである［１２］に記載の方法。
［１４］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質が抗体である［１１］に記載の方法。
［１５］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を投与する工程を有する線維化を伴う慢性腎臓病を治療する方法。
［１６］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質が核酸である、［１５］に記載の方法。
［１７］前記核酸が、siRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はこれらの発現ベクターである［１６］に記載の方法。
［１８］ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質が抗体である［１５］に記載の方法。
［１９］慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質。
［２０］慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する核酸又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する核酸。
［２１］慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制するsiRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はこれらの発現ベクター。
［２２］慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する抗体。
［２３］線維化を伴う慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質。
［２４］線維化を伴う慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する核酸又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する核酸。
［２５］線維化を伴う慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制するsiRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はこれらの発現ベクター。
［２６］線維化を伴う慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する抗体。
［２７］慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質の使用。
［２８］慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する核酸又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する核酸の使用。
［２９］慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制するsiRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はこれらの発現ベクター。
［３０］慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する抗体。
［３１］線維化を伴う慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質の使用。
［３２］線維化を伴う慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する核酸又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する核酸の使用。
［３３］線維化を伴う慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制するsiRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はこれらの発現ベクター。
［３４］線維化を伴う慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する抗体。

本発明により、ＮＮＭＴのタンパク質の酵素活性を抑制又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制することで、Collagen type I alpha 1（以下、ＣＯＬ１Ａ１ともいう）、Collagen type III alpha 1（以下、ＣＯＬ３Ａ１ともいう）又は Collagen type IV alpha 1 （以下、ＣＯＬ４Ａ１ともいう）のタンパク質若しくは遺伝子の発現を抑制することが可能であり、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質は慢性腎臓病の治療用医薬組成物の有効成分として用いることが出来る。本発明による医薬組成物は、特定の酵素活性又は遺伝子の発現を特異的に抑制するという新しい作用機序の治療剤を提供するものであり、従来の慢性腎臓病の治療剤に比べて毒性が少ないことを大きな特徴とする。さらに本発明により、ＮＮＭＴの酵素又は遺伝子をターゲットとして用いる、慢性腎臓病の治療用物質をスクリーニングする方法も提供される。

本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いる意味で用いられる。

本発明は、１つの態様において、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を含む、慢性腎臓病、特に線維化を伴う慢性腎臓病の治療用医薬組成物を提供する。
慢性腎臓病とは、「尿蛋白陽性などの腎疾患の存在する所見」、もしくは「腎機能低下（糸球体濾過量が60mL/min/1.73m²未満）」が3ヵ月以上続く状態を指し、慢性腎不全、慢性腎炎、尿細管間質障害、ネフローゼ症候群、多発性のう胞腎、糖尿病性腎症、及び腎硬化症等が含まれる。
また、線維化を伴う慢性腎臓病とは、糸球体硬化や尿細管間質等に線維化の兆候が認められる慢性腎臓病を意味する。

本明細書の実施例１−５に示す通り、ＮＮＭＴを新規な慢性腎臓病の標的分子として見出した。

本明細書において、「ＮＮＭＴの遺伝子」とは、ＮＮＭＴのタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ヒトＮＮＭＴの遺伝子の塩基配列及びヒトＮＮＭＴのタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトＮＮＭＴの遺伝子の塩基配列およびヒトＮＮＭＴのタンパク質アミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋに登録され（GenBank Accession No. NM_006169.2）、公表されている。
本明細書において、ヒトＮＮＭＴのタンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質において１アミノ酸又は数アミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であって多型性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。ただし、これらの変異体ヒトＮＮＭＴのタンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するものである。
本明細書において、ヒトＮＮＭＴの遺伝子は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列からなる遺伝子のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、例えば前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列からなる遺伝子において１塩基又は数塩基が欠失、置換及び／又は付加された遺伝子であって、多型性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。さらに、「ＮＮＭＴの遺伝子」は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列に対して、８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．７％以上または９９．９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる変異体を含む。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用して決定できる。ただし、これらの変異体遺伝子は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするものである。
ＮＮＭＴは、ＮＮＭＴ/ＰＮＭＴ/ＴＥＭＴファミリーに属している。ＮＮＭＴのタンパク質は、ニコチンアミド、ピリジン、その他類似構造物質のＮメチル化を触媒する酵素である。ニコチン酸代謝系においては、ニコチンアミドにＳ−アデノシルメチオニンのメチル基を転移することにより、メチルニコチンアミドとＳ−アデノシルホモシステインを生成することが知られている（ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｐｏｒｔｓ２００９年第６１巻、７６-８５ページを参照）。
WO2012/123299にはＮＮＭＴのタンパク質の量と慢性閉塞性肺疾患の関係が記載されており、WO2004/071267にはＮＮＭＴのタンパク質の量と大腸がんとの関係が記載されており、WO2012/068463にはＮＮＭＴの酵素活性を抑制すると肥満や代謝異常症を治療できる旨が記載されているが、ＮＮＭＴの酵素活性又は遺伝子の発現変動と慢性腎臓病の治療との関連性については知られていない。

本明細書において、「ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質」とは、ＮＮＭＴのタンパク質が有するＮメチル化を触媒する酵素活性を抑制する物質を意味し、このような物質であれば特に限定されるものではない。かかる物質として、ＮＮＭＴに対する抗体やアンタゴニストなどが例示される。

本明細書において、「ＣＯＬ１Ａ１の遺伝子」とは、ＣＯＬ１Ａ１のタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ＣＯＬ１Ａ１は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ1ａ１と表記されることもある。ヒトＣＯＬ１Ａ１の遺伝子の塩基配列及びヒトＣＯＬ１Ａ１のタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトＣＯＬ１Ａ１の遺伝子の塩基配列およびヒトＣＯＬ１Ａ１のタンパク質アミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋに登録され（GenBank Accession No.NM_000088）、公表されている。
本明細書において、ヒトＣＯＬ１Ａ１のタンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質において１アミノ酸又は数アミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であって多型性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。ただし、これらの変異体ヒトＣＯＬ１Ａ１のタンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するものである。
本明細書において、ヒトＣＯＬ１Ａ１の遺伝子は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列からなる遺伝子のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、例えば前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列からなる遺伝子において１塩基又は数塩基が欠失、置換及び／又は付加された遺伝子であって、多型性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。
ＣＯＬ１Ａ１のタンパク質の過剰な蓄積が腎臓に線維化をもたらすため、ＣＯＬ１Ａ１の遺伝子またはタンパク質の発現抑制による抗線維化作用が、慢性腎不全の進行抑制につながると考えられる（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ２００１年第１５９巻４号、１３１３-１３２１ページを参照）。

本明細書において、「ＣＯＬ３Ａ１の遺伝子」とは、ＣＯＬ３Ａ１のタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ＣＯＬ３Ａ１は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ３ａ１と表記されることもある。ヒトＣＯＬ３Ａ１の遺伝子の塩基配列及びヒトＣＯＬ３Ａ１のタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトＣＯＬ３Ａ１の遺伝子の塩基配列およびヒトＣＯＬ３Ａ１タンパク質アミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋに登録され（GenBank Accession No.NM_000090）、公表されている。
本明細書において、ヒトＣＯＬ３Ａ１のタンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質において１アミノ酸又は数アミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であって多型性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。ただし、これらの変異体ヒトＣＯＬ３Ａ１タンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するものである。
本明細書において、ヒトＣＯＬ３Ａ１の遺伝子は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列からなる遺伝子のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、例えば前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列からなる遺伝子において１塩基又は数塩基が欠失、置換及び／又は付加された遺伝子であって、多型性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。
ＣＯＬ３Ａ１のタンパク質の過剰な蓄積が腎臓に線維化をもたらすため、ＣＯＬ３Ａ１の遺伝子またはタンパク質の発現抑制による抗線維化作用が、慢性腎不全の進行抑制につながると考えられる（ＮｅｐｈｒｏｌＤｉａｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ１９９７年第１２巻、１８８３-１８８９ページを参照）。

本明細書において、「ＣＯＬ４Ａ１の遺伝子」とは、ＣＯＬ４Ａ１のタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ＣＯＬ４Ａ１は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ４ａ１と表記されることもある。ヒトＣＯＬ４Ａ１の遺伝子の塩基配列及びヒトＣＯＬ４Ａ１のタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトＣＯＬ４Ａ１の遺伝子の塩基配列およびヒトＣＯＬ４Ａ１のタンパク質アミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋに登録され（GenBank Accession No.NM_001845）、公表されている。
本明細書において、ヒトＣＯＬ４Ａ１のタンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質において１アミノ酸又は数アミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であって多型性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。ただし、これらの変異体ヒトＣＯＬ4Ａ１タンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するものである。
本明細書において、ヒトＣＯＬ４Ａ１の遺伝子は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列からなる遺伝子のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、例えば前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列からなる遺伝子において１塩基又は数塩基が欠失、置換及び／又は付加された遺伝子であって、多型性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。
ＣＯＬ４Ａ１のタンパク質の過剰な蓄積が腎臓に線維化をもたらすため、ＣＯＬ４Ａ１の遺伝子またはタンパク質の発現抑制による抗線維化作用が、慢性腎不全の進行抑制につながると考えられる（ＪＣｌｉｎＬａｂＡｎａｌ１９９８年第１２巻、３７８−３８２ページを参照）。

本明細書において、「遺伝子の発現を抑制する物質」とは、標的遺伝子のmRNAの転写を抑制する物質、転写されたmRNAを分解する物質、またはmRNAからのタンパク質の翻訳を抑制する物質であれば特に限定されるものでない。かかる物質として、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロRNA若しくはリボザイム又はこれらの発現ベクターなどが例示される。其の中でも、siRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその発現ベクターが好ましく、特にsiRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。「遺伝子の発現を抑制する物質」としては、上記のほか、タンパク質やペプチド、あるいは他の小分子も含まれる。

本明細書において、「siRNA」とは、約１５〜約４０塩基からなる二本鎖RNA部分を有するRNA分子であり、前記siRNAのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のmRNAを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるsiRNAは、ＮＮＭＴ遺伝子のmRNA中の連続したRNA配列と相同な配列からなるセンスRNA鎖と、該センスRNA配列に相補的な配列からなるアンチセンスRNA鎖とからなる二本鎖RNA部分を含んでなるRNAである。かかるsiRNAおよび後述の変異体siRNAの設計および製造は当業者の技量の範囲内である。

二本鎖RNA部分の長さは、塩基として、約１５〜約４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１８〜２３塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’末端が突き出したタイプが好ましい。センスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１〜３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するsiRNAは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、RNAを構成する塩基あるいはDNAを構成する塩基のいずれであってもよい。

さらに、上記siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方において１〜数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入及び／又は付加されているsiRNAもまた、本発明の慢性腎臓病の治療用医薬組成物に用いることができる。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４塩基、さらに好ましくは１〜３塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’末端のオーバーハング部分の塩基数を０〜３個としたもの、３’末端のオーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加または欠失により上記センスRNA鎖とアンチセンスRNA鎖の長さが１〜３塩基異なるもの、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体siRNAにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖がハイブリダイゼーションしうること、ならびにこれらの変異体siRNAが変異を有しないsiRNAとほぼ同程度の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。

さらに、該siRNAは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA（Short hairpin RNA；shRNA）であってもよい。shRNAは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖RNA、該センス鎖RNAに相補的な配列からなるアンチセンス鎖RNA及びその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むRNAであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖RNA部分を形成する。

siRNAは、臨床使用の際には、いわゆるoff−target効果を示さないことが望ましい。off−target効果とは、標的遺伝子以外に、使用したsiRNAに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。off−target効果を避けるために、候補siRNAについて、予めDNAマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、NCBI（National Center for Biotechnology Information）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補siRNAの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、off−target効果を避けることが可能である。

本発明のsiRNAを作製するには、化学合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖RNAを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列を組み込んだ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖RNAやアンチセンス鎖RNAをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖RNA、該センス鎖RNAに相補的な配列からなるアンチセンス鎖RNA及びその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するshRNAを発現させることにより、所望の二本鎖RNAを作製することもできる。

siRNAは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、siRNAを構成する核酸の一部がDNAであっても良い。また、siRNAは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、siRNAを構成する核酸の全体又はその一部が修飾された核酸であってもよい。
修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）及び／又はヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（abasic）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。前記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；及び他の複素環塩基等が挙げられる。
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。

本発明の二本鎖siRNAに含まれる核酸配列としては、例えば、配列表の配列番号２に記載の配列をセンス鎖、配列番号３に記載の配列をアンチセンス鎖として、用いることができる。

標的遺伝子のmRNAに対して相補的なオリゴヌクレオチドを「アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼び、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とする遺伝子（mRNA）と二本鎖を形成することによりmRNAの働きを抑制する。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」には、標的となる遺伝子（mRNA）と完全に相補的であるもののみならず、mRNAと安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。適当な修飾を施すことにより、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内で分解されにくくなり、より安定して標的遺伝子の発現を阻害できるようになる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、Ｓ−オリゴ型（ホスホロチオエート型）、Ｃ−５チアゾール型、Ｄ−オリゴ型（ホスホジエステル型）、Ｍ−オリゴ型（メチルフォスフォネイト型）、ペプチド核酸型、リン酸ジエステル結合型、Ｃ−５プロピニルピリミジン型、２−Ｏ−プロピルリボース、２'−メトキシエトキシリボース型等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されているものでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性、RNAへの親和性に特に優れている。リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓ−オリゴ型等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（又はその誘導体）は常法によって合成することができ、例えば、市販のDNA合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などがある。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる核酸配列としては、例えば、配列表の配列番号４に記載の配列または配列番号５に記載の配列を用いることができる。

「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴDNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いる。具体的には、リボザイムは、標的遺伝子をコードするmRNAまたは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得る。リボザイムで最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２００１年第２９巻１３号：２７８０−２７８８ページ参照）。

マイクロRNA（「miRNA」といわれる）は、タンパク質をコードしない低分子RNAであり、マイクロRNAは、標的mRNA上の相補部位に結合することによって遺伝子発現を制御する機能を有する分子である。

標的遺伝子の発現を抑制する物質は、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロRNA又はリボザイムなどの核酸分子および、該核酸分子をコードする発現ベクターでもよい。当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）などが挙げられる。
発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。

本発明の発現ベクターとしては、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロRNA又はリボザイムの発現ベクターが例示されるが、其の中でも、siRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現ベクターが好ましい。

本発明において、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。

本発明の医薬組成物は、単一のＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分としてもよいし、複数の物質を有効成分としても良い。例えば、本発明の医薬組成物がsiRNAである場合には、１種またはそれ以上のsiRNAを有効成分としてもよい。

本発明の医薬組成物の治療の対象である疾患は、慢性腎臓病、特に線維化を伴う慢性腎臓病である。
慢性腎臓病とは、「尿蛋白陽性などの腎疾患の存在する所見」、もしくは「腎機能低下（糸球体濾過量が60mL/min/1.73m²未満）」が3ヵ月以上続く状態を指し、慢性腎不全、慢性糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、ネフローゼ症候群、多発性のう胞腎、糖尿病性腎症、及び腎硬化症等が含まれる。
また、線維化を伴う慢性腎臓病とは、糸球体硬化や尿細管間質等に線維化の兆候が認められる慢性腎臓病を意味する。

本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用することができる。

本発明の医薬組成物は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
添加物は、本発明の医薬組成物の剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等として、または適当な剤形により投与が可能である。非経口投与の場合は、経肺剤形（例えばネブライザーなどを用いたもの）、経鼻投与剤形、経皮投与剤形（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤形等が挙げられる。注射剤形の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。

標的遺伝子の発現を抑制する物質がsiRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロRNA若しくはリボザイムなどの核酸分子、又は該核酸分子をコードする発現ベクターである場合は、リポソームなどのリン脂質小胞体に当該発現抑制物質を導入し、その小胞体を本発明の医薬組成物とすることも可能である。

本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤形、腎機能、肝機能によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１μｇ〜１００μｇである。但し、上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明は、さらなる態様において、
（１）ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を投与する工程を有する慢性腎臓病を治療する方法、
（２）ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を投与する工程を有する線維化を伴う慢性腎臓病を治療する方法、
（３）慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質、
（４）線維化を伴う慢性腎臓病の治療に用いられる、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質、
（５）慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質の使用、
（６）線維化を伴う慢性腎臓病の治療剤の製造のための、ＮＮＭＴの酵素活性を抑制する物質又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質の使用、を提供する。

本発明は、もう１つの態様において、
ＮＮＭＴの酵素活性又はＮＮＭＴの遺伝子の発現を指標とする、慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法を提供する。

スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。

一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、
（１）ＮＮＭＴのタンパク質に対する基質、被験物質及び
１：配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
２：配列番号１で表されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Ｎメチル化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させたポリペプチドのＮメチル化を触媒する酵素活性を、被験物質を接触させないポリペプチドのＮメチル化を触媒する酵素活性と比較する工程、及び
（３）被験物質を接触させたポリペプチドのＮメチル化を触媒する酵素活性が、被験物質を接触させないポリペプチドのＮメチル化を触媒する酵素活性と比較して低下している場合に、被験物質を慢性腎臓病の治療物質として選択する工程を含む、
慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法である。

上記方法の工程（１）における、ＮＮＭＴのタンパク質に対する基質としては、例えば、ニコチンアミド、ピリジンなどを挙げることができる。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、単離されたポリペプチド及び細胞、組織の破砕液中のポリペプチドを含む。

上記方法の工程（２）では、先ず、ポリペプチドのＮメチル化を触媒する酵素活性が測定される。酵素活性の測定は、用いた基質の種類などを考慮し、公知の方法により行われ得る。例えば、基質として、ニコチンアミドを用いた場合には、生成物であるメチルニコチンアミドの量を公知の方法（ＪｏｕｒｎａｌｏｆｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ２０１３年第９２１−９２２巻、８７-９５ページを参照）で測定することにより行う。

上記方法の工程（３）では、被験物質を接触させたポリペプチドのＮメチル化を触媒する酵素活性が、被験物質を接触させないポリペプチドのＮメチル化を触媒する酵素活性と比較される。
酵素活性の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。ポリペプチドのＮメチル化を触媒する酵素活性は、被験物質を接触させたポリペプチドのＮメチル化を触媒する酵素活性の測定に対し、事前に測定した酵素活性であっても、同時に測定した酵素活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した酵素活性であることが好ましい。

一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、
（１）細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞におけるＮＮＭＴの酵素活性を測定し、該酵素活性を、被験物質を接触させない対照細胞における前記酵素活性と比較する工程、及び
（３）被験物質を接触させた細胞における前記酵素活性が、対照細胞における前記酵素活性よりも低下している場合に、被験物質を慢性腎臓病の治療物質として選択する工程を含む、慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法である。

上記方法の工程（１）における、細胞とは、ＮＮＭＴの酵素活性が測定できる細胞を意味する。該工程では、細胞と被験物質とが培養培地中で接触条件下におかれる。

細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サルあるいはヒトの哺乳動物細胞を用いることができ、ヒト由来の細胞、なかでも、ヒト尿細管上皮細胞株HK2細胞やヒト・プライマリー尿細管上皮細胞、腎線維芽細胞が好ましい。

細胞と被験物質とが接触される培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約１４４時間である。

上記方法の工程（２）では、先ず、被験物質を接触させた細胞におけるＮＮＭＴの酵素活性が測定される。

上記方法の工程（３）では、被験物質を接触させた細胞におけるＮＮＭＴの酵素活性が、対照細胞におけるＮＮＭＴの酵素活性と比較される。
酵素活性の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＮＮＭＴの酵素活性は、被験物質を接触させた細胞におけるＮＮＭＴの酵素活性の測定に対し、事前に測定した酵素活性であっても、同時に測定した酵素活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した酵素活性であることが好ましい。

一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、
（１）細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞におけるＮＮＭＴの遺伝子の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（３）被験物質を接触させた細胞における前記遺伝子の発現が、対照細胞における前記遺伝子の発現よりも低下している場合に、被験物質を慢性腎臓病の治療物質として選択する工程を含む、
慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法である。

上記方法の工程（１）における、細胞とは、ＮＮＭＴの遺伝子の発現を測定することが可能な細胞のことを意味する。該工程では、細胞と被験物質とが培養培地中で接触条件下におかれる。

ＮＮＭＴの遺伝子の発現を測定することが可能な細胞とは、ＮＮＭＴの遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的または間接的に評価可能な細胞をいう。該遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、該遺伝子を天然で発現可能な細胞であり得、一方、該遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞としては、該遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞などが挙げられる。該遺伝子の発現を測定可能な細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サルあるいはヒトの哺乳動物細胞を用いることができ、ヒト由来の細胞、なかでも、ヒト尿細管上皮細胞株HK2細胞やヒト・プライマリー尿細管上皮細胞、腎線維芽細胞が好ましい。

遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、標的遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。標的遺伝子転写調節領域およびレポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入することが出来る。標的遺伝子の転写調節領域は、標的遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つ標的遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質または検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。

遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、標的となる遺伝子の転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。

上記方法の工程（２）では、先ず、被験物質を接触させた細胞におけるＮＮＭＴの遺伝子の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、公知の方法により行われ得る。例えば、該遺伝子の発現を測定可能な細胞として、ＮＮＭＴの遺伝子を天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、遺伝子の産物、例えば、転写産物または翻訳産物を対象として公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１９８０年第７０巻、４１９−４３９ページを参照）、蛍光抗体法などが使用できる。一方、ＮＮＭＴ遺伝子の発現を測定可能な細胞として、遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。

上記方法の工程（３）では、被験物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量が、対照細胞における遺伝子の発現量と比較される。
発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞における遺伝子の発現量は、被験物質を接触させた細胞における遺伝子の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。

他の一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、
（１）腎疾患病態モデル動物に被験物質を投与する工程、
（２）被験物質を投与した腎疾患病態モデル動物におけるＮＮＭＴの酵素活性を測定し、該酵素活性を、被験物質を投与していない対照モデル動物における前記酵素活性と比較する工程、及び
（３）被験物質を投与した腎疾患病態モデル動物におけるＮＮＭＴの酵素活性が、対照モデル動物における前記酵素活性よりも低下している場合に、被験物質を慢性腎臓病の治療物質として選択する工程を含む、
慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法である。

上記方法の工程（１）使用する腎疾患病態モデル動物は、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ２００５年第６８巻３号、９２５-９３７ページなどを参照して、作成することができる、非ヒトのモデル動物を意味する。

他の一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、
（１）腎疾患病態モデル動物に被験物質を投与する工程、
（２）被験物質を投与した腎疾患病態モデル動物におけるＮＮＭＴ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を投与していない対照モデル動物における前記遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（３）被験物質を投与した腎疾患病態モデル動物におけるＮＮＭＴ遺伝子の発現量が、対照モデル動物における前記遺伝子の発現量よりも低下している場合に、被験物質を慢性腎臓病の治療物質として選択する工程を含む、
慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法である。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

慢性腎臓病のモデルであるラット5／6腎摘モデル（ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ１９９９年第５６巻８９８−９０９を参照）を用いて、腎病態におけるニコチン酸代謝異常の有無を評価した。６週齡雄性Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（ＳＤラット）に対し腎臓の摘出手術を施し、5／6腎摘モデルを作製した。具体的にはペントバルビタール腹腔内注射による麻酔下で背部より左腎を露出させた後、左腎2／3を摘出し、皮下組織・皮膚を縫合した。その２週間後、同様の処置にて右腎を全摘出し、5／6腎摘モデルとした。解剖は手術完了から１７週間後に実施し、腎臓から遺伝子解析用サンプルおよび血清サンプルを入手した。比較対照群として偽手術群（ｓｈａｍ）を用意し、ｓｈａｍ群個体と５／６腎摘モデル群個体との間で腎臓におけるＮＮＭＴ遺伝子発現レベルの比較を、腎臓から全ＲＮＡを抽出して定量ＰＣＲにて行った。その結果、5／6腎摘ラット個体の腎臓ではｓｈａｍ群個体の腎臓と比較してＮＮＭＴの顕著な発現亢進が認められた（図１A）。また、腎臓でのＮＮＭＴ発現レベルと血清のクレアチニン値が正相関していることが明らかとなり（図１B）、腎病態においてニコチン酸代謝異常が生じていることが示唆された。

一側輸尿管結紮（ＵＵＯ: ＵｎｉｌａｔｅｒａｌＵｒｅｔｅｒａｌＯｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）マウスは、水腎症を起因とし腎線維化を引き起こすモデルとして、腎線維症の実験系で広く利用されている（ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ２００５年第６８巻３号、９２５-９３７ページを参照）。腎線維症におけるニコチン酸代謝異常を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（オス、８週齢、日本クレア社製）に対しＵＵＯ処置を施し、腎線維化モデルを作製した。具体的にはマウスをイソフルラン麻酔下で下腹部の開腹し、左輸尿管を露出させ、手術用糸で2カ所結紮後、腹膜、皮膚を縫合した。ＵＵＯ処置後、第１日目、２日目、３日目に解剖した。解剖ではソムノペンチル麻酔下において開腹後、ＵＵＯ施術腎を採取し、遺伝子発現解析用サンプルを得た。腎臓から全ＲＮＡを抽出し、定量ＰＣＲにてＮＮＭＴおよびＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現レベルの変動を解析した（図２）。比較対象として偽手術群（ｓｈａｍ）を用意し、ｓｈａｍ腎臓における発現レベルとの比較を行った。遺伝子解析より、ＵＵＯ処置後第１日から腎臓でのＮＮＭＴ遺伝子の発現亢進が認められ、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子も同様に発現亢進していることが確認された。

ラット腎臓の線維芽細胞株であるＮＲＫ４９Ｆ細胞を用い、線維化促進刺激として知られるＴＧＦβ1刺激（ＮｅｐｈｒｏｌＤｉａｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ１９９８年第１３巻、５７３‐５７９ページを参照）によるＮＮＭＴやコラーゲン遺伝子の変動に対する影響について調べた。ＮＲＫ４９Ｆ細胞を１２ウェルプレートに４×１０^４個/ｗｅｌｌ/ｍＬで播種し７２時間後に血清不含培地に置換し、２４時間後にリコンビナントヒトＴＧＦβ１（Ｒ&Ｄ社製、５ｎｇ/ｍＬ)を添加し、６、２４、４８時間培養を行なった。培養後、細胞より全ＲＮＡを抽出し、ＮＮＭＴおよびＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１及びＣＯＬ４Ａ１遺伝子の発現レベルを定量ＰＣＲにて測定した。その結果、ＴＧＦβ1刺激により、ＮＮＭＴ（図３Ａ）、ＣＯＬ１Ａ１（図３Ｂ）及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子（図３Ｃ）は経時的な上昇を示した。ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の上昇は６時間で最高に達し２４時間までプラトーを維持していた（図３Ｄ）。これらの結果より、ＴＧＦβ1刺激でＮＮＮＴ遺伝子の発現亢進が認められ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１及びＣＯＬ４Ａ１遺伝子も同様に発現亢進していることが確認された。

ラット腎臓の線維芽細胞株であるＮＲＫ49Ｆ細胞にＮＮＭＴのsiRNAを導入し、ＴＧＦβ1刺激で惹起されるＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１及びＣＯＬ４Ａ１遺伝子の発現亢進作用に対する影響について調べた（図４）。ＮＲＫ４９F細胞を１２ウェルプレートに４×１０^４個／ｗｅｌｌ／ｍＬで播種し、７２時間後に抗生剤不含培地に置換、購入したラットＮＮＭＴ siRNA配列（F；CCACAUCCAAUAAUGAAGGACUCUU、R；AAGAGUCCUUCAUUAUUGGAUGUGG）を、siRNA導入試薬であるＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたリポフェクション法による２４時間の導入処理を行なった。次に、血清不含培地に置換し２４時間後にリコンビナントヒトＴＧＦβ１（Ｒ&Ｄ社製、５ｎｇ／ｍＬ）を添加し、４８時間培養した。培養後、細胞の全ＲＮＡを抽出し、ＮＮＭＴおよびＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１及びＣＯＬ４Ａ１遺伝子の発現レベルを定量ＰＣＲにて測定した。その結果、ＴＧＦβ１刺激によりＮＮＭＴ遺伝子は約３．６倍上昇が認められたが、siRNA処理群（０．０１ｎM、０．１ｎM、1 ｎM）でＮＮＭＴ遺伝子の発現量がそれぞれ、２３%、４５%、６０%ノックダウンされている事が確認された。同様に、ＴＧＦβ１刺激でＣＯＬ１Ａ１遺伝子は７．１倍、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子は６．５倍、ＣＯＬ４Ａ１は３．１倍の上昇を示したのに対して、siRNA処理（０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ）で、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量は２０%、３６%、７８%、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現量は２０%、３１%、６２%、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の発現量は３３%、１５%、５７%の低下が、それぞれ認められた。これらの結果より、線維化遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１及びＣＯＬ４Ａ１遺伝子の発現亢進にＮＮＭＴが関与していることが確認され、ＮＮＭＴを阻害することにより線維化が抑制されることが示唆された。

ＵＵＯマウスに対するＮＮＭＴのアンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）投与試験を実施した（図５）。具体的には、Ｃ５７ＢＬ/６ＪＪｃｌマウス（オス、８週齢、日本クレア社製）に対しＡＳＯ（＃１：CACAGTGTCTGGAC、＃２：GTGGTAGAAGAGTA）を１５ｍｇ／ｋｇで皮下にて投与し、その２日後にＵＵＯ処置を施した。ＵＵＯ作製から４日後にソムノペンチル麻酔下にて解剖を実施、ＵＵＯ施術腎を採取し、遺伝子発現解析用サンプルを得た。腎臓から全RNAを抽出し、定量ＰＣＲにて代謝遺伝子の変動を解析した。比較対象としてコントロールのＡＳＯを投与したＵＵＯマウス腎の発現レベルとの比較を行った。その結果、コントロールと比較してＣＯＬ１Ａ１の有意な発現抑制作用がＮＮＭＴのＡＳＯ投与群にて認められた。

本発明は、医薬品の分野、慢性腎臓病、特に線維化を伴う慢性腎臓病の治療薬の開発および製造の分野において利用可能である。

図１Ａは、 5／６腎摘出ラットにおけるＮＮＭＴ遺伝子の変動を示す。横軸は実験群を、縦軸はＮＮＭＴ遺伝子発現量（ハウスキーピング遺伝子に対する発現量の相対比）を示す。図１Ｂは、腎臓でのＮＮＭＴ発現量と血清のクレアチニン値との相関を示す。横軸は血清クレアチニン値を、縦軸はＮＮＭＴ遺伝子発現量（ハウスキーピング遺伝子に対する発現量の相対比）を示す。図２は、輸尿管結紮マウスにおけるＮＮＭＴおよびＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現変動を示す。横軸は結紮後の日数を、縦軸はｓｈａｍ処置群に対する発現倍率を示す。図３Ａは、ラット腎間質線維芽細胞（ＮＲＫ４９Ｆ）をＴＧＦβ１刺激した際のＮＮＭＴ遺伝子の発現変動を示す。横軸は刺激時間を、縦軸はコントロール（無刺激）に対する発現倍率を示す。図３Ｂは、ラット腎間質線維芽細胞（ＮＲＫ４９Ｆ）をＴＧＦβ１刺激した際のＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現変動を示す。横軸は刺激時間を、縦軸はコントロール（無刺激）に対する発現倍率を示す。図３Ｃは、ラット腎間質線維芽細胞（ＮＲＫ４９Ｆ）をＴＧＦβ１刺激した際のＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現変動を示す。横軸は刺激時間を、縦軸はコントロール（無刺激）に対する発現倍率を示す。図３Ｄは、ラット腎間質線維芽細胞（ＮＲＫ４９Ｆ）をＴＧＦβ１刺激した際のＣＯＬ４Ａ１遺伝子の発現変動を示す。横軸は刺激時間を、縦軸はコントロール（無刺激）に対する発現倍率を示す。図４は、ＮＲＫ49Ｆ細胞のＴＧＦβ１刺激によるコラーゲン遺伝子発現に対するＮＮＭＴの siRNA処理の影響を示す。横軸はＮＮＭＴのsiRNA濃度と発現遺伝子を、縦軸はＴＧＦβ１刺激時の発現量に対するパーセンテージを示す。図５は輸尿管結紮マウスにおけるASO投与時のＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現変動を示す。横軸は実験群を、縦軸はｓｈａｍ処置群に対する発現倍率を示す。

Claims

ＮＮＭＴの遺伝子の発現を抑制する物質を含み、前記物質がsiRNA若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はこれらの発現ベクターである、慢性腎臓病の治療用医薬組成物。
ＮＮＭＴの遺伝子の発現を指標とする、慢性腎臓病の治療物質のスクリーニング方法。