JP2016522675A - 上皮間葉移行に関連した疾患の治療において有用な分子標的及び前記標的のインヒビター - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分子生物学及び生化学の分野である。本発明は、線維化疾患の治療に有用な物質、特に上皮間葉移行(EMT)を阻害する物質を同定する方法に関する。EMTの阻害は、EMTが重要な役割を果たす疾患の予防及び/又は治療において有用である。特に本発明は、線維化疾患及び癌の予防及び/又は治療において使用するための物質を同定する方法を提供する。
上皮間葉移行(EMT)は、上皮細胞が間葉細胞へ転換する間のプロセスである。一般に、そのようなプロセスは、可逆的であり、且つ細胞接着及び細胞運動性により特徴づけられる。このプロセスは、通常E-カドヘリン発現の抑制を伴い、且つ生成された間葉細胞は、新たな遊走性、侵襲性及び線維形成性の特性により特徴づけられる。EMTは、重要な生物学的プロセスであり、胚形成及び通常の創傷治癒において重要な役割を果たす(Hayの文献、2005)。EMTは組織修復に寄与するが、これはまた様々な機序を通じて、臓器線維症を有害に引き起こし、且つ癌腫の進行を促進することもあり得る。EMTは、癌の進行及び転移において役割を果たすことが示された(Thieryの文献、2002)。EMTはまた、肺を含む様々な臓器における、退行性線維障害の病理に寄与することも確定されている(Wilsonの文献、2009;Lekkerkerkerらの文献、2012)。
本発明は、本明細書に開示された標的物(TARGET)の発現及び/又は活性を阻害する物質は、EMTのマーカーの発現及び/又は放出の阻害により示されるように、上皮間葉移行(EMT)を阻害することが可能であるという発見を基にしている。特に、MMP10、フィブロネクチン、E-カドヘリン及び/又は可溶性フィブロネクチンの放出又は発現の抑制は、インジケーターの例である。従って、本発明は、EMTにおいて役割を果たす標的物、標的物の発現及び/又は活性をダウンレギュレートすることが可能な物質のスクリーニング方法、並びにEMTに関連した疾患、特に線維症及び癌腫の予防及び/又は治療におけるこれらの物質の使用を提供する。本発明は、EMTの生物学、特に上皮間葉移行に関連した線維化障害に関与している標的物を提供する。特定の態様において、本発明は、線維化疾患及び癌の発症に関与しているかそうでなければ関連している標的物を提供する。
a)EMTに関連した疾患の治療において使用するための、標的物ポリペプチドへ特異的に結合する、抗体又はそれらの断片を含む、医薬組成物、
b)線維化状態の治療において使用するための、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される物質を含む、医薬組成物であって、ここで該物質が、EMTに関連した疾患の治療において使用するための、標的物ポリペプチドをコードしている選択された核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列、又はこれから操作された核酸配列を含む、医薬組成物:に関する。
(定義)
下記の用語は、以下に提示された意味を有することが意図され、且つ本発明の説明及び意図された範囲を理解する上で有用である。
本出願人の発明は、EMTに関連した状態及び障害の、より特定すると線維化疾患及び癌の治療、予防及び緩和に関連している。
一態様において、本発明は、上皮間葉移行(EMT)に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を測定する工程;
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程;
d)EMTに関連した特性を測定する工程;並びに
e)EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示す化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はそれらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を測定する工程;
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程;
d)EMTに関連した特性を測定する工程;並びに
e)EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示す化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と、又は配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸又はその機能性誘導体と接触させる工程;
b)被験化合物の該ポリペプチド又は核酸への結合親和性を同定及び/又は測定する工程;
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程;
d)EMTの阻害又は減少に関連した又は指標とする特性を測定する工程;並びに
e)EMTを阻害又は減少し、且つ該ポリペプチド又は核酸への結合親和性を示す化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程;
d)上皮間葉移行に関連した特性を測定する工程;並びに
e)上皮間葉移行を阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と、接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、上皮細胞の集団と接触させる工程;
d)EMTに関連している特性を測定する工程;並びに
e)EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と、又は配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸若しくはそれらの機能性誘導体と、接触させる工程;
b)該ポリペプチドの発現又は活性を測定する工程;
c)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害することが可能な化合物を同定し、これにより、該ポリペプチドの発現又は活性の阻害が、EMTの阻害又は減少を生じるか又はこれに関連している工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、上皮細胞の集団と接触させ、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる工程;
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現、活性及び/又は量を測定する工程;
c)EMTに関連した特性を測定する工程;並びに
d)該ポリペプチドの発現及び/又は量の減少を生じ、且つEMTを阻害又は減少する化合物を同定する工程:を含む、方法に関係する。
a)被験化合物を、上皮細胞の集団と接触させ、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる工程;
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現、活性及び/又は量を測定する工程;
c)EMTに関連した特性を測定する工程;並びに
d)該ポリペプチドの発現及び/又は量の減少を生じ、且つEMTを阻害する化合物を同定する工程:を含む、方法に関係する。
(発現阻害性物質)
本発明の方法の特定の実施態様において、被験化合物は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択される。
特定の薬物候補化合物は、低分子量化合物である。例えば分子量500ダルトン以下の低分子量化合物は恐らく、生物学的システムにおいて良好な吸収及び浸透を有し、且つ結果的に分子量500ダルトンを上回る化合物よりも成功する薬物候補である可能性がより大きい(Lipinskiらの文献、2001)。ペプチドは、別の特定の薬物候補化合物クラスを構成する。ペプチドは、優れた薬物候補であることができ、妊娠促進ホルモン及び血小板凝集阻害剤などの、商業的に価値のあるペプチドの複数の例が存在する。天然の化合物は、薬物候補化合物の別の特定のクラスである。そのような化合物は、天然の供給源中に発見され、且つそこから抽出され、これはその後合成されることができる。脂質は、別の特定の薬物候補化合物のクラスである。
別の薬物候補化合物の好ましいクラスは、抗体である。本発明はまた、標的物に対して向けられた抗体も提供する。これらの抗体は、細胞内の標的物へ結合するように内在性に産生されるか、又は細胞の外側に存在する標的物ポリペプチドに結合するように組織に添加されてよい。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。本発明は、キメラ抗体、単鎖抗体及びヒト化抗体、更にはFAb断片及びFAb発現ライブラリーの産物、並びにFv断片及びFv発現ライブラリーの産物も含む。
標的物ポリペプチドへ特異的に結合する抗体又は断片、並びにアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される発現阻害性物質は、EMTに因果関係があるか又はこれに起因する哺乳類における状態の治療のために治療薬として使用することができる。
本発明はまた、EMTを阻害するインビトロ方法も提供し、該方法は、上皮細胞の集団を、標的物ポリペプチドの活性又は発現のインヒビターと接触させることを含む。特定の実施態様において、該インヒビターは抗体である。代替の実施態様において、該抗体はモノクローナル抗体である。
本発明は、以下に提供される実施例を使用し、更に例示される。実施例は、慣習的適合を使用し、特定の型の条件、規模又は細胞型に容易に改変及び適合させることができることは、当業者には明らかであろう。
(1.1 バックグラウンド)
気道リモデリング及び線維症は、線維症の病理の重要な特徴である。上皮間葉移行(EMT)は、線維芽細胞-様細胞の数の増加及び線維症に繋がるコラーゲンの過剰生成における機序として提唱されている。いくつかの研究が、EMTは、TGFβへの曝露時に、ヒト肺上皮細胞株及び初代気管支上皮細胞において起こり得ることを明らかにしている。EMTのいくつかの共通マーカーを使用する特別なTGFβ-誘導性EMTアッセイが、初代ヒト気管支上皮細胞(HBEC)において開発された。
HBECは、Dept of Pulmonology(LUMC、ライデン、オランダ)から入手した。HBECは、肺腫瘍の手術を受けた患者の肺切除組織に由来した。気管支上皮細胞を、プロテアーゼ消化により単離し、予め説明されたように培養した(van Weteringの文献、2000)。3名のドナーを、全ての実験を通じて使用した。一次スクリーン及びオン-標的分析には、ドナーBr299を使用し、再スクリーンには、ドナーBr291を、及び二次アッセイにおける標的バリデーションには、ドナーBr282を使用した。3名のドナーは全員、COPD患者であった。
MMPは、細胞外マトリクス(ECM)タンパク質を切断する能力を有する。これらのタンパク質はまた、コラーゲン、及びフィブロネクチンなどの他のタンパク質、線維症を引き起こす誘発時に瘢痕組織を構成することが分かっているタンパク質を含むことができる。MMPの中で、MMP10は、ECMの切断に関与し、従って、関心対象のMMP-誘導する線維症経路を説明するバリデーションにおけるリードアウトとして使用される。MMP10は、MSDにより試験した。増加したレベルのMMP10は、COPDドナー及び非-COPDドナーの両方において、NTHiによる誘発時に検出される。
(1.4 トリガー)
UV照射した無莢膜型ヘモフィルス・インフルエンザ(NTHi)のバッチを作製した。細菌を、2.9×108/mL(NTHi)のアリコートにおいて照射し、使用時まで-80℃で貯蔵した。0.5ng/mL TGFβ-1、5ng/mL TNFα及び0.5×107 UV-死滅させたNTHi細菌/mLの組合せを、細胞を誘発するために使用した。
ホタルルシフェラーゼを標的化する3種の陰性対照(ffluc_v19、ffluc_v21、ffluc_v24)、及び5種の陽性対照shRNAウイルス(SMAD3_v3、SMAD4_v5及びv7、TGFβR1_v1及びTGFβR2_v7)を、カラム7の各ライブラリープレートに添加した。
一次スクリーンソースプレートの受入れ基準は、下記であった:
・スピアマン相関>0.4又はカッパ値>0.2
・リードアウトとして分泌型フィブロネクチン(FN)を使う一次スクリーンに使用した少なくとも1種の陽性対照は、2つ組でIQR<-1.5を有するものとする
・分泌型フィブロネクチンFNを使う一次スクリーンに使用した3種の陽性対照(P1、P2、P5)中2種は、陰性対照ウイルスの平均と比べ>40%の阻害を生じるものとする
・リードアウトとして分泌型MMP10を使う一次スクリーンに使用した少なくとも3種の陽性対照は、2つ組でIQR<-1.5を有するものとする。
12,000種以上のアデノウイルスshRNA構築体を含むアデノウイルスライブラリーを、一次スクリーンにおいてスクリーニングした。完全スクリーンは、143×96-ウェルプレートからなり、生物学的2つ組で行った。EMTアッセイの概略図は、図1に示している。
どの統計学的方法をデータ解析に使用するかを決定するために、全てのデータ点の度数分布プロットを作製した。この度数分布プロットは、歪みのある非ガウス分布を示す。従って四分位範囲(IQR)-ベースの正規化法が、最も適用可能であり、その理由はこの方法は、異常値に対し感度が低いからである。IQR法は、データ分散の測定として中央値(Q2)及び四分位範囲(Q3-Q1)を使用する。高度に歪みのあるデータセットを解析する場合、インヒビター又はアクチベーターのいずれが興味深いかに応じ、各々、例えば中央値及び(Q1-Q2)又は中央値及び(Q3-Q2)のデータ拡散の代替測定を採用することが可能である。カットオフ値の選択は、誤差率(ヒットを非ヒットとして同定する確率)を決定する。
図2において、一次スクリーンにおいて評価したフィブロネクチン及びMMP10のリードアウトに関する全てのソースプレートの生物学的2つ組のドットプロットを示している。陰性対照と陽性対照の間の分離は、両方のリードアウトについて観察された。表4に、一次スクリーンに関するアッセイパラメータの概要を示している。両方のリードアウトについて、平均スピアマン相関は、0.4を上回り、且つ平均カッパ値は、0.2を上回った。IQRカットオフ値-1.5での平均ヒット率は、FN及びMMP10について、各々、5.5%及び8.5%であった。
(2.1 バックグラウンド)
再-スクリーンにおいて、一次スクリーンからのヒットを、異なるCOPD HBECドナーであるBr291について新たに再増殖されたウイルスを使用し、再度スクリーニングした。
アッセイ設定は、一次スクリーンに類似したものを維持したが、異なるプレートレイアウトを伴った。陰性対照の分布を基にしたヒットコーリングを可能にするために、プレートレイアウトは、少なくとも30%の陰性対照を含んだ。5種の陽性対照は、再-スクリーンについても使った(表6参照)。再-スクリーンにおいて使用したプレートレイアウトは、図3に示している。陽性対照TGFβR1_v1は、FN1_v3と交換した。このshRNA対照は、FNリードアウトにおける陽性対照として使用したが、MMP10リードアウトにおいては使用しなかった。
一次スクリーンからの733のヒットウイルスを、14×96-ウェルプレートからなる1バッチにおいて試験した。再-スクリーンは、一次スクリーンと同じプロトコールを使用し(実施例1)、生物学的2つ組で行った。
データ解析に関して、FN及びMMP10生データは、対数変換し、引き続き陰性対照を基にしたロバストZスコアを用い、正規化した。ロバストZスコアは、リードアウト値から陰性対照の中央値を減算したものを陰性対照のMAD(中央絶対偏差値)で除算することにより計算した。陽性対照の93%及び96%は、各々、FN及びMMP10に関する2つ組のカットオフ値-2を下回り、且つほとんどの陰性対照は、2つ組においてカットオフ値-2を上回るので、ロバストZ-スコアのカットオフ値-2を選択した。FNは、主要リードアウトであり、従ってヒットコーリングに関してFN結果のみを使用することを決定した。
図4において、再スクリーンの対照性能が示されている。両方のリードアウトについて、陽性対照と陰性対照の明らかな分離が認められた。MMP10リードアウトの陰性対照の値は、非形質導入試料よりも低かったが、このことはFNリードアウトについては認められなかった。生物学的反復の間に高い相関が認められ、平均スピアマン順位相関係数値は、FNに関して0.84(0.68〜0.89)及びMMP10に関して0.92(0.58〜0.98)であった。
(3.1 バックグラウンド)
リードアウトとして細胞マーカーを使用するEMTアッセイ(EMT2と称す)を、再-スクリーンにおいて438種の確認された候補標的物をバリデーションするための、二次アッセイとして利用した。この二次アッセイの目的は、抗-FN抗体及び抗-E-カドヘリン抗体による免疫染色後の、InCell 2000装置(GE Healthcare社)上のハイコンテンツイメージングにより測定した、E-カドヘリン及びフィブロネクチンの異なるリードアウトの細胞発現率を使用し、EMTアッセイにおける再-スクリーンにおいて同定された標的をバリデーションすることであった。
ドナーBr282を、バリデーションスクリーンに使用した。細胞は、実施例1に記載したプロトコールに従い入手した。
再スクリーンプレートのレイアウトを基にしたレイアウトは、プレート効果又は周縁効果を減少するために、96-ウェルプレートの60個の内側ウェルを使用した(図5)。更に、ヒットコーリングを促進するために、プレートの30%は陰性対照に使用した。これらの対照の改善された分布は、プレート作用のより良い解析を可能にした。ウェルG02は、試料を含まなかったが、9個のソースプレートについて偽形質導入された。
EMTバリデーションアッセイとは異なるリードアウトを、使用した。E-カドヘリンとフィブロネクチンの比(Ecad/FN)を、EMTに関するリードアウト指標として選択した。
バリデーションアッセイはトリガーの添加後、細胞を、PBS中の4%ホルムアミドにより72時間固定し、引き続きFN及びE-カドヘリンの細胞発現を、InCell 2000装置上で、ハイコンテンツイメージングを使用し測定したこと以外は、一次スクリーンアッセイ(実施例1)と同様に行った。
対照性能を、データ分布の解析により、更に評価した。バリデーションスクリーンの対照及び試料は、対数正規分布を示し、従って解析前に対数変換した。次にロバストZ-スコアを、リードアウト値から陰性対照の中央値を減算したものを陰性対照のMAD(中央絶対偏差値)で除算することにより計算した。
平均スピアマン順位相関係数0.7(範囲0.57〜0.81)を、予め設定したカットオフ値0.4を超えた全てのソースプレートについて認めた。ロバストZ-スコアカットオフ値-1.1でのバリデーションスクリーンの、対照ヒット率及び試料ヒット率のまとめを、表xxに提示している。強力なシングルヒットであったが、生物学的反復ヒットがこのカットオフ値を通過しなかった一部の追加標的は、ヒット選択に含んだ。陰性対照の平均を下回った反復との強力なヒットを含むよう、閾値を、各反復セットについて設定した(反復1:-1.92及び<0、反復2:<0及び-1.32)。これらのカットオフ値を使用し、96種のヒットを選択した。これらのヒットの配列解析は、配列においてリードスルーを伴う1種のウイルス及び標的RNAがタンパク質をコードしなかった1種のウイルスを明らかにした。補正後、これは、94種の標的を生じ、これらをオン標的解析に進め、且つバリデーションされた候補標的と称した。
(4.1 バックグラウンド)
EMT2バリデーションアッセイにおいて同定された94種の確認された候補標的物を、オン標的スクリーンにおける評価のために選択した。当業者に公知の技術及び方法を使用し、同じ標的に対する複数のアデノウイルス-shRNA構築体(平均5種)を作出した。確認された候補標的は、少なくとも2つの独立したshRNA構築体(オリジナルのshRNA構築体を含む)が、一次スクリーンに類似しているオン標的アッセイにおいてヒットとして同定された場合に、オン標的と考えた。従って、新たに増殖された構築体を、EMT1アッセイにおいて試験した。
COPDドナーBr299由来のHBECを、オン標的スクリーンにおいて使用し、且つ実施例1と同じプロトコールを使用し入手した。
アッセイは、図6に示したように設定した。96種のオリジナルのヒットを含む、94種の遺伝子(18ソースプレート)を標的化する616種のshRNAウイルスのセットを、オン標的スクリーンにおいて試験した。再スクリーンと同様のプレートレイアウトを使用した(図7)。陰性対照の分布を基にしたヒットコーリングを可能にするために、プレートフォーマットは、少なくとも30%の陰性対照を含んだ。オン標的スクリーンに含まれたshRNAの可能性のある細胞毒性作用の決定を可能にするために、スタウロスポリン標準曲線を、各ソースプレート上で使った。CTB蛍光により測定された細胞生存度の30%の低下は、毒性作用とみなした。
スタウロスポリン濃度曲線を、減少した細胞生存度の対照として、全ての36細胞プレートに添加した(2倍希釈で1〜0.03μMの範囲)。スタウロスポリン濃度0.04μMで、細胞のみでの誘発と比べ、細胞生存度の30%の減少が認められた。この濃度は、標準曲線の第一及び第二の最低濃度の間であった。上清収集後、CTBを含む培地を、細胞に添加し、細胞を、37℃及び5%CO2で6時間インキュベーションし、引き続きEnVision(登録商標)マルチラベルリーダー(Perkin Elmer社)上で蛍光リードアウトを得た。
EMT再スクリーン(実施例2)と同じ解析を、「オン標的」データに適用し、データは、対数変換し、引き続き陰性対照を基にロバストZ-スコア正規化した。ロバストZ-スコアカットオフ値-1.25を、両方のリードアウトに選択した。このカットオフ値で、全ての陽性対照は、ヒットと同定されたが、陰性対照の<4%は偽陽性ヒットと取り上げた。
図8は、陰性及び陽性対照ウイルス、並びに616種の試料ウイルスのFN及びMMP10測定から得られた、生データを示している。陰性対照と陽性対照の間の明確な分離が、FN及びMMP10の両方において認められた。陽性対照5(FN1_v3)は、MMP10に影響を及ぼさなかった。FNに関して0.78(0.68〜0.93)及びMMP10に関して0.82(0.68〜0.92)の平均スピアマン順位相関係数値で、生物学的反復間で、高い相関が認められた。
オン標的スクリーンは、EMT1及びCTBの両アッセイを含んだ。両方のアッセイに関して、ロバストZ-スコアカットオフ値を選択し、これは、CTBアッセイにおいて毒性ではないFN及びMMP10ダブルヒットの選択をもたらした。表11において、オン標的であることが認められた「確認された候補標的」の同定に繋がる、選択されたヒットの数のまとめを提示している。FNダブルヒットであり且つオン標的スクリーンにおいて毒性でない80種のオリジナルヒットのうち、62種が、同じ標的を標的化した追加のノックダウン構築体を有し、且つ更にダブルFNヒットであった。従って、これらの62種の標的は、「オン標的」と称した。同様の選択を、MMP10について行い、これは、MMP10に関する29種のオン標的をもたらした。7種の標的は、FN及びMMP10の両方に関してオン標的であることがわかった。62種のFNオン標的を、標的発現解析及び優先順位付けに進めた。
(5.1 バックグラウンド)
加えて、標的ウイルスにより引き起こされる可能性のある毒性を評価するために、第二の毒性アッセイを、ATPlite(Perkin Elmer社)アッセイを用いて開発した。このアッセイにより、代謝活性のある細胞により生成されるATPは、ルシフェラーゼ及びD-ルシフェリンと反応し、光を放出する。このアッセイは、D-ルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ-媒介性及びATP-依存性変換を基にし、発光を生じる。ルミネセンスとして測定される放出された光は、試料中のATP濃度に比例し、結果的に生存細胞の数に比例する。
スタウロスポリン濃度曲線(2倍希釈で1〜0.03μMの範囲)を、毒性に関する参照として、各細胞プレートに添加し、且つATPliteリードアウトを行った。使用したスタウロスポリン最高濃度は、ルミネセンスをほぼバックグラウンドシグナルまで減少し、これはこれらのウェルにおける強い細胞毒性を示している。濃度0.06μMのスタウロスポリンは、トリガーのみと比べ、細胞生存度の30%の減少を生じた。
ATPliteアッセイにおいて生物学的反復間で、平均スピアマン順位相関0.55(0.52〜0.57)が、認められた。スタウロスポリン0.6μM処置は、30%毒性に対応することが示されている。対数変換及び陰性を基にしたロバストZ-スコア正規化後のデータを、結果の解析に使用した。0.6μMスタウロスポリンの平均Z-スコアは、-5.5であり、-5.5を下回る2つ組Z-スコアを有するshRNAは、毒性があると考えられた。標的化12遺伝子の試験した24種のウイルスはいずれも、2つ組で毒性があるとはみなされなかった。
(6.1 バックグラウンド)
標的において同定されたmRNA発現を確認するために、mRNAをBr291細胞から単離し、全トランスクリプトーム配列決定を行った。線維化状態に関連するように、これらの標的は、該疾患の関連組織において発現されるものとする。標的のインビボ発現を確認するために、HBEC及び小気道上皮細胞(SAEC)を、組織溶液から得られたIPF患者組織試料から単離した。IPF組織からのHBEC及びSAECの単離は、COPDドナーと同様に行った(van Weteringの文献、2000に先に記載されたように)。
誘発されない細胞及び選択された組合せ誘発された細胞のRNAの単離のために、COPDドナーBr291及びBr299のHBEC、IPF患者のHBEC、及びIPF患者のSAECを、培養し且つ再スクリーンと同じ様式で96-ウェルプレートに播種した(実施例2参照)。誘発されない細胞由来のRNAを、1日目に収集し、その日に形質導入を行った。細胞は、6日目に誘発させ、誘発された細胞由来のRNAを、9日目に収集した。
画像解析、塩基-コーリング、及び品質チェックを、Illuminaデータ解析ピペリン(pipeline)RTA v1.13.48及び/又はOLB v1.9及びCASAVA v1.8.2により行った。
Illumina HiSeq 2000シークエンサーから得られた読み値は、最小閾値Q25及び最短長さ50塩基の品質スコアによりフィルタリングした。
同定された12種の標的に関する結果は、表17に含んだ。オン標的スクリーンにおいて当初同定された63種の標的を、全トランスクリプトーム配列決定に供した。これらの63種の標的物の、選択された12種の標的物は、誘発条件下(+T)又は非誘発条件下(-T)で、FPKM値>0.00を示し、これらの標的はHBECにおいて発現されることを確認した。リアルタイムPCR試験の結果は、12種の標的物全て、Br299細胞及び/又はIPF HBEC及びSAECにおいてCt値40以下を示し、これらの標的はこれらの細胞において発現されることを確認することを指摘している。
(7.1 バックグラウンド)
shRNAノックダウン構築体が、異なるmRNAの発現、その後意図されたmRNAの発現に対する作用、いわゆるオフ-標的作用を有することを排除するために、オン-標的バリデーションを、選択された標的物に対するsiRNA構築体を用い、確認された候補標的物により行った。
SMAD3及びSMAD4に対するsiRNAを、陽性対照として使用し、且つ非-標的化siRNA(Thermo Fisher Scientific Biosciences社)を、陰性対照として使用した。
HBECは、Dept of Pulmonology(LUMC、ライデン、オランダ)から入手した。HBECは、肺腫瘍の手術を受けた患者の肺切除組織に由来した。気管支上皮細胞は、プロテアーゼ消化により単離し、且つ既述のように培養した(van Weteringの文献、2000)。
実験設定は、以下のようであった:0日目に、HBECの2500個細胞/ウェルを、32μg/mL PureColコーティング(Advanced Biomatrix社、カタログ番号5005-B)によりコートされた、96-ウェルプレートに播種した。3日後、siRNAトランスフェクションを行った。細胞を、Dharmafect 1(Thermo社、カタログ番号T-2001-03)0.02μL/ウェルを用いて、トランスフェクトした。OnTarget Plus siRNA(Thermo Fisher Scientific Biosciences社)を、最終濃度20nMで、1ウェルにつき4種の構築体のスマートプールとして使用した。1日後、EMTを誘導する組合せトリガー(0.5ng/mL TGFβ1+5ng/mL TNFα+0.5×107 UV-死滅させたNTHi細菌/mL)を添加した。6日目に、スタウロスポリンを、対照ウェルの細胞に添加した(各プレート上1つの単独列)。7日目に、上清を収集した。同日、RNA単離を、標準MagMax全RNA単離キット(Ambion社、カタログ番号AM1830)を使用し行った。Cell Titer Blueアッセイ(Promega社、カタログ番号G808B)を、同日行った。FNは、実施例1に説明した様な研究室で開発したアッセイを使用し、SECTOR(登録商標)イメージャー6000装置(MSD)上でメソスケールディスカバリー(MSD)プラットフォームを使用し、測定した。
正規化された阻害率(NPI)解析を用い、siRNA構築体のリードアウトに対する作用を定量化した。計算において、SMAD3又はSMAD4 siRNAを陽性対照として使用し、且つ非-標的化siRNAを陰性対照として使用した。正規化された阻害率(NPI)は、試料測定値と陽性対照平均の差を、陽性対照と陰性対照の差により、除算することにより算出した。
(8.1 バックグラウンド) インビボにおける標的物遺伝子の発現を試験するために、いくつかのマウス及びラット線維症モデルを試験し、腎臓、肺及び皮膚などの特定組織における発現を決定した。
一側尿管閉塞を、Balb/c雌マウス(Harlan社-フランスより)において、1群あたりマウス10匹で作製した。0日目に、マウスに、腹腔内注射により麻酔をかけ、皮膚の切開後、左側尿管を切り離し、その長手方向に沿って2点を4.0絹糸で結紮した。その後尿管を、2つの結紮の間で切断した。無傷のマウスを、対照として使用した。マウスを、10又は21日後に、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
腎摘出術を、Sprague-Dawley雄ラット(CERJ社-フランスより)において、1群あたりラット10匹で作製した。0日目に、ラットに麻酔をかけ、皮膚の切開後、副腎を保護しながら、腎臓皮膜を除去した。腎門部を結紮し、右側腎臓を摘出した。左側腎臓の末端を、メスで切除し、5/6腎摘出を生じた。ラットを、4又は8週間後に屠殺した。
肺線維症を、ブレオマイシン静脈内投与について、CD1雄マウス(CERJ社-フランスより)において、1群あたりマウス6〜8匹で誘導し、且つブレオマイシン脊髄内投与について、C57/Bl6 J雌マウス(Janvier社より)において、1群あたりマウス14匹で誘導した。
強皮症は、Balb/c雌マウス(CERJ社-フランスより)において、1群あたりマウス15匹で誘導した。0日目に、マウスに、溶液(キシラジン5mg/kg、ケタミン75mg/kg)の腹腔内注射により麻酔をかけ、剃毛した。ブレオマイシン1mg/ml溶液又は食塩水の容積100μlを、マウスの剃毛した背部へ、26g針により、皮下注射した。ブレオマイシンを、連続する3週間にわたり1週につき5日間注射した。合計の実験期間は、6週間であった。6週間後に、マウスを、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
インビボ実験の最後に、動物を屠殺し、組織(UUOモデルについて1/2マウス腎臓、5/6NTXモデルについて1/3ラット腎臓、マウス強皮症モデルについて皮膚小片、及びマウス肺線維症モデルについて肺一葉)を、RNALater(登録商標)安定化溶液(Ambion社、#AM7021)の入った、2ml-マイクロチューブ(Ozyme社、#03961-1-405.2)中に収集した。組織を、Precellys(登録商標)24組織ホモジナイザー(Bertin Technologies社)内で1.4mmセラミックビーズ(Ozyme社、#03961-1-103、BER1042)により破壊した。全RNAを単離し、組換えDNase消化に供し、Qiazol(登録商標)(Qiagen社、#79306)及びNucleoSpin(登録商標)RNAキット(Macherey-Nagel社、#740955.250)を製造業者の推奨に従い用い精製した。RNAを、RNase-非含有水60μlにより溶離した。RNAの濃度及び純度を、260、280及び230nmでの吸光度により決定した。cDNAを、全RNA 500ngから、高性能cDNA RTキット(Applied Biosystems社、#4368814)を使用する逆転写により、調製した。10倍希釈したcDNA調製品5μlを、リアルタイム定量的PCRに使用した。qPCRは、SYBR Green技術を使用するQiagen社からの遺伝子特異的プライマーにより行った。反応は、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)中での、95℃で5分間の変性工程、続けて40サイクル(95℃で10秒間、60℃で30秒間)で実行した。
各遺伝子の発現レベルは、対照動物におけるそれらの閾値サイクル(CT)値により推定した。
全ての試験したmRNAは、線維化組織(腎臓、肺及び皮膚)において良好に発現された(表13参照)。
第一列は、標的物遺伝子記号を示す。2つ組みIQR-スコアは、一次EMT1 FN及びMMP10スクリーンについて示され、ここでカットオフ値は、FNに関する2つ組IQR≦-1.5、及び2つ組IQR≦-1.3を使用した。再スクリーンロバストZ-スコアは、FN及びMMP10の両方のリードアウトについて示されている。FNについて2つ組ロバストZのカットオフ値≦-2.0を使用した。EMT2バリデーションアッセイの結果は、2つ組Z-スコアで示し、2つ組ロバストZのカットオフ値≦-1.1を、以下の基準と組合せて使用した:反復1:-1.92及び<0、反復2:<0及び-1.32。
この表は、オン標的アッセイにおいて確認された標的物の性能のまとめを示す。確認された候補標的物遺伝子記号及びアデノウイルス構築体のノックダウン配列を示している。ヒットと考えられたshRNA、加えて当初ヒットであったshRNA(太字)の結果を示し、及び「両方」の列は、このshRNAが両方のOTアッセイにおいて再度ヒットであることを示している(はい/いいえ)。2つ組の結果は、標的スクリーンに関するEMTにおけるFN及びMMP10のリードアウトについて示されている。2つ組ロバストZのカットオフ値≦-1.25を使用した。毒性評価に関するCTB結果を示し、2つ組ロバストZ≦-10であった。ヒットは、FN阻害及びCTBアッセイにおける無毒作用を基に含んだ。二次ATPlite毒性アッセイを行い、2つ組ロバストZのカットオフ値を使用した。
Claims (43)
- 上皮間葉移行に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び誘導体と接触させる工程;
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を決定する工程;
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程;
d)上皮間葉移行に関連した特性を測定する工程;並びに
e)上皮間葉移行を阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示すことが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。 - 上皮間葉移行に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程;並びに、
d)上皮間葉移行に関連した特性を測定する工程;並びに
e) 上皮間葉移行を阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。 - 上皮間葉移行に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する上皮細胞集団と接触させる工程;
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現及び/又は量を測定する工程;
c)上皮間葉移行に関連した特性を測定する工程;並びに
d)該ポリペプチドの発現及び/又は量の減少を生じ、且つ上皮間葉移行を阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。 - 上皮間葉移行(EMT)を阻害する化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程;
d)EMTに関連した特性を測定する工程;並びに
e)EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する工程:を含む、前記方法。 - 上皮間葉移行(EMT)を阻害する化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させるか、又は配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸若しくはそれらの機能性誘導体と接触させる工程;
b)該ポリペプチドの発現又は活性を測定する工程;
c)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害することが可能な化合物を同定し、これにより、該ポリペプチドの発現又は活性の阻害が、EMTの阻害又は減少を生じるか又はこれに関連している工程:を含む、前記方法。 - 前記核酸が、配列番号:4-5、1-3及び6-17からなる群から選択される、請求項5記載の方法。
- 前記疾患が、線維化疾患である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記疾患が、癌である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記試験される化合物を対照と比較する工程を追加的に含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、検出可能な標識と結合されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記工程(a)及び(b)の該ポリペプチド配列が、インビトロ無細胞調製物中に存在する、請求項1、2、4、又は5記載の方法。
- 前記工程(a)及び(b)の該ポリペプチド配列が、細胞内に存在する、請求項1、2、4又は5のいずれか一項記載の方法。
- 前記細胞が、該ポリペプチドを天然に発現する、請求項3又は12のいずれか一項記載の方法。
- 前記細胞が、該ポリペプチドを発現するように操作されている、請求項13記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項12〜14記載の方法。
- 前記細胞が、上皮細胞である、請求項15記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト上皮細胞である、請求項16記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト気管支上皮細胞である、請求項17記載の方法。
- 前記特性が、上皮間葉移行のマーカー(EMTマーカー)の放出及び/又は発現の阻害である、請求項1〜4記載の方法。
- 前記特性が、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、細胞フィブロネクチン(FN)、E-カドヘリン、可溶性フィブロネクチン、及びビメンチンからなる群から選択されるマーカーの発現及び/又は放出である、請求項19記載の方法。
- 前記マーカーが、MMP10、フィブロネクチン、E-カドヘリン及び可溶性フィブロネクチンからなる群から選択される、請求項20記載の方法。
- 前記細胞が、上皮間葉移行を誘導する因子(EMT誘導性因子)により誘発されている、請求項16〜18のいずれか一項記載の方法。
- 前記EMT誘導性因子が、TGFβ、IL-1β、TNFα、及び細菌チャレンジからなる群から選択される、請求項22記載の方法。
- 前記因子が、TGFβ、IL-1β及び無莢膜型ヘモフィルス・インフルエンザの組合せを含む、請求項23記載の方法。
- 前記被験化合物が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択される、請求項3記載の方法。
- 前記被験化合物が、配列番号:4-5、1-3及び6-17からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、請求項25記載の方法。
- 哺乳類細胞中のベクターが、該化合物を発現する、請求項25記載の方法。
- 前記ベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターである、請求項27記載の方法。
- 前記アンチセンスポリヌクレオチド、該siRNA又は該shRNAが、センス鎖に相補的な17-25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ここで該センス鎖が、配列番号:4-5、1-3及び6-17からなる群から選択される核酸配列の17-25の連続ヌクレオチドから選択される、請求項25記載の方法。
- 前記siRNA又はshRNAが、該センス鎖を更に含む、請求項29記載の方法。
- 前記化合物が、抗体又は抗体断片である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 上皮間葉移行に関連した疾患の治療に使用するための、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、抗体又はそれらの断片を含有する医薬組成物。
- 前記アンタゴニストが、モノクローナル抗体である、請求項32記載の医薬組成物。
- 前記アンタゴニストが、単鎖抗体である、請求項32記載の医薬組成物。
- 上皮間葉移行に関連した疾患の治療に使用するための、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される物質を含有する医薬組成物であって、ここで該物質が、配列番号:4-5、1-3及び6-17からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、前記医薬組成物。
- 請求項32〜35のいずれか一項記載の上皮間葉移行に関連した疾患の治療において使用するための医薬組成物であって、ここで該疾患が、線維化疾患又は癌である、前記医薬組成物。
- 前記疾患が、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び/又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症及びペイロニー病から選択される、請求項32〜35のいずれか一項記載の上皮間葉移行に関連した疾患の治療において使用するための医薬組成物。
- 前記疾患が、メラノーマ、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫、肥満細胞腫、結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膠芽細胞腫、原発性肝癌、卵巣癌、前立腺癌及び子宮平滑筋肉腫から選択される、請求項32〜35のいずれか一項記載の上皮間葉移行に関連した疾患の治療において使用するための医薬組成物。
- 前記疾患が、癌転移である、請求項32〜35のいずれか一項記載の上皮間葉移行に関連した疾患の治療において使用するための医薬組成物。
- 上皮間葉移行を阻害するインビトロ方法であって:
上皮細胞の集団を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性及び/又は発現のインヒビターと接触させる工程を含む、前記インビトロ方法。 - 前記インヒビターが、抗体である、請求項40記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項40記載の方法。
- 前記インヒビターが、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択され、ここで該インヒビターが、該ポリペプチドをコードしている核酸の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、請求項40記載の方法。
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