BR112020001412A2

BR112020001412A2 - inibidor de fosforilação da proteína smad2/3, agente terapêutico para fibrose, e, moléculas de ácido nucleico de fita dupla e de fita simples.

Info

Publication number: BR112020001412A2
Application number: BR112020001412-5A
Authority: BR
Inventors: Kazuhisa Nakao; Junichi Ishiyama; Wataru Ichikawa; Atsushi Masui; Yunike Akasaka; Hidekazu Toyofuku; Aya Honda
Original assignee: Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2020-08-04
Also published as: KR20200033927A; CA3069406A1; CO2020001106A2; CL2020000219A1; PH12020500198A1; SG11201913541QA; EP3659609A1; EP3659609B1; EP3659609A4; JP7204649B2; CN110996969B; EA202090393A1; US20210087556A1; JPWO2019022257A1; AU2018307897A1; AU2018307897B2; TW201910514A; IL272271A; US11326163B2; CN110996969A

Abstract

É descrito um inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3 ou um agente terapêutico para fibrose que contém, como ingrediente ativo, um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 (serina/treonina quinase relacionada à NIMA 6).

Description

1 / 104 INIBIDOR DE FOSFORILAÇÃO DA PROTEÍNA SMAD2/3, AGENTE TERAPÊUTICO PARA FIBROSE, E, MOLÉCULAS DE ÁCIDO

NUCLEICO DE FITA DUPLA E DE FITA SIMPLES Campo técnico

[001] A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 e um medicamento que compreende a molécula de ácido nucleico como ingrediente ativo. Fundamentos da invenção

[002] A fibrose é uma doença na qual a função do órgão é comprometida pelo acúmulo excessivo de colágeno, levando à progressão irreversível e sabe-se, por exemplo, que a pele, pulmão, fígado, pâncreas, rim, medula óssea e outros são os órgãos iniciais. A fibrose pulmonar idiopática (FPI), que é um tipo de fibrose no pulmão, é concebida como uma doença intratável no Japão porque, embora a prevalência da doença não seja tão alta, uma vez que representa cerca de vinte pacientes por cem mil pessoas na população, o prognóstico após o tratamento não é o desejado, conforme indicado pelo período médio de sobrevida de 2,5 a 5 anos após confirmação do diagnóstico.

[003] Os fármacos terapêuticos para FPI, pirfenidona e nintedanibe foram aprovados pelo Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão e já lançados até o momento. Apesar mostrarem suprimir o declínio da capacidade vital e ação prolongada sobre a sobrevida livre de progressão e de abrandar a progressão da condição patológica, esses dois fármacos não podem ser considerados suficientemente satisfatórios em termos de eficácia terapêutica, e o desenvolvimento de um novo fármaco terapêutico com base em um novo mecanismo tem sido reivindicado.

[004] Enquanto isso, a “proteína NEK6”, que é um alvo da presente invenção, é conhecida como uma das famílias de serina/treonina quinases relacionadas à NIMA envolvidas no controle da divisão celular, mas que, até

2 / 104 agora, não havia atraído atenção como objeto de pesquisa para o desenvolvimento de fármacos. Apesar de ter-se relatado seu potencial como alvo de desenvolvimento de fármacos para o câncer em 2002, não há relato específico de que a proteína NEK6 interaja com a proteína SMAD2/3 e promova fibrogênese tecidual. Lista de citação Literatura de patente

[005] Literatura de Patente 1: Publicação do Pedido de Patente U.S. No 2004/0097441 Sumário da invenção Problema técnico

[006] A presente invenção tem por objetivo prover um novo inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3 e um agente terapêutico para fibrose. Solução para o problema

[007] Os inventores concentraram a atenção em verificar um nível aprimorado do mRNA de NEK6 (serina/treonina quinase relacionada à NIMA 6) a partir da análise com um modelo de fibrose pulmonar induzida por bleomicina, a seguir, prosseguiram com sua pesquisa e, como resultado, constataram que NEK6 controla o sistema de sinalização de SMAD que contribui para a fibrogênese a jusante de TGF-β, e chegaram à conclusão da presente invenção.

[008] A presente invenção é como segue:

[1] Um inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3, compreendendo um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6, como ingrediente ativo;

[2] Um agente terapêutico para fibrose, compreendendo um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6, como ingrediente ativo;

[3] O agente terapêutico de acordo com [2], em que o agente

3 / 104 terapêutico é para fibrose pulmonar, fibrose hepática ou fibrose renal;

[4] Uma molécula de ácido nucleico de fita dupla selecionada a partir do grupo que consiste nos (a), (b), (c), (d) e (e) seguintes: (a) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 6 na extremidade 3’ ou extremidade 5’, (b) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 2 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 7 na extremidade 3’ ou extremidade 5’, (c) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 3 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 8 na extremidade 3’ ou extremidade 5’, (d) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 4 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 9 na extremidade 3’ ou extremidade 5’ e (e) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 5 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 10 na extremidade 3’ ou extremidade 5’;

[5] A molécula de ácido nucleico de fita dupla de acordo com

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[4], em que 1 a 11 resíduos de ribonucleotídeos e/ou resíduos de desoxirribonucleotídeos são adicionados ainda à extremidade 3’ da fita guia (fita antisense) e/ou da fita passageira (fita sense) para formar uma extremidade saliente;

[6] Uma molécula de ácido nucleico de fita simples que forma uma estrutura de RNA do tipo grampo de cabelo (hairpin), em que a extremidade 3’ da fita passageira (fita sense) e a extremidade 5’ da fita guia (fita antisense), apresentadas em [4] ou [5], são unidas uma à outra por intermédio de uma sequência ligante (de ligação) com um resíduo de nucleotídeo e/ou um ligante de estrutura não nucleotídica, ou a extremidade 3’ da fita guia (fita antisense) e a extremidade 5’ da fita passageira (fita sense) apresentadas em [4] ou [5] são unidas uma à outra por intermédio de uma sequência ligante com um resíduo de nucleotídeo e/ou um ligante de estrutura não nucleotídica;

[7] Uma molécula de ácido nucleico de fita simples do (A) ou (B) seguintes, compreendendo uma sequência que suprime a expressão do gene NEK6 selecionada dentre SEQ ID NOs: 1 a 5: (A) a molécula de ácido nucleico que compreende ou consiste apenas em uma região (X), uma região de ligação (Lx) e uma região (Xc), em que a região (Xc), a região de ligação (Lx) e a região (X) estão dispostas nessa ordem, do lado 5’ para o lado 3’, em que a região (Xc) é complementar à região (X), em que a região de ligação (Lx) possui uma estrutura não nucleotídica compreendendo pelo menos um dentre um esqueleto de pirrolidina e um esqueleto de piperidina, e em que a região (X) compreende a sequência que suprime a expressão; (B) a molécula de ácido nucleico compreendendo uma região (Xc), uma região de ligação (Lx), uma região (X), uma região (Y), uma região

5 / 104 de ligação (Ly) e uma região (Yc), nessa ordem, do lado 5’ para o lado 3’, em que a região (X) e a região (Y) são unidas e formam uma região interna (Z), em que a região (Xc) é complementar à região (X), em que a região (Yc) é complementar à região (Y), e em que a região de ligação (Lx) e/ou a região de ligação (Ly) possuem uma estrutura não nucleotídica compreendendo pelo menos um dentre um esqueleto de pirrolidina e um esqueleto de piperidina, e em que a região interna (Z) compreende a sequência que suprime a expressão;

[8] A molécula de ácido nucleico de fita simples de acordo com [7], em que a região de ligação (Lx) e/ou (Ly) são representadas como a fórmula (I) seguinte: Fórmula química 1 em que, X1 e X2 são cada um independentemente H2, O, S ou NH; Y1 e Y2 são cada um independentemente uma ligação simples, CH2, NH, O ou S; R3 é um átomo de hidrogênio ou um substituinte ligado a C-3, C-4, C-5 ou C-6 no anel A; L1 é uma cadeia de alquileno com número n de átomos de carbono, em que cada um dos átomos de hidrogênio no átomo de carbono do alquileno pode ou não ser substituído por OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH

6 / 104 ou SRa, ou L1 é uma cadeia de poliéter na qual um ou mais átomos de carbono na cadeia do alquileno são substituídos por um ou mais átomos de oxigênio, com a condição de que, se Y1 for NH, O ou S, então um átomo em L1 ligado a Y1 é carbono, um átomo em L1 ligado a OR1 é carbono e os átomos de oxigênio não são adjacentes um ao outro; L2 é uma cadeia de alquileno tendo número m de átomos de carbono, em que cada um dos átomos de hidrogênio no átomo de carbono do alquileno pode ou não ser substituído por OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH ou SRc, ou L2 é uma cadeia de poliéter na qual um ou mais átomos de carbono na cadeia do alquileno são substituídos por um ou mais átomos de oxigênio, com a condição de que, se Y2 for NH, O ou S, então um átomo em L2 ligado a Y2 é carbono, um átomo em L2 ligado a OR2 é carbono e os átomos de oxigênio não são adjacentes um ao outro; Ra, Rb, Rc e Rd são cada um independentemente um substituinte ou um grupo protetor; l é 1 ou 2; m é um número inteiro variando de 0 a 30; n é um número inteiro variando de 0 a 30; um átomo de carbono no anel A, excluindo C-2, pode ser substituído por nitrogênio, oxigênio ou enxofre, o anel A pode compreender uma ligação dupla carbono- carbono ou uma ligação dupla carbono-nitrogênio no mesmo, a região (Xc) e a região (X) são, cada uma, ligadas à região de ligação (Lx) por intermédio de -OR1- ou OR2- e a região (Yc) e a região (Y) são, cada uma, ligadas à região de

7 / 104 ligação (Ly) por intermédio de -OR1- ou OR2-; em que R1 e R2 podem ou não estar presentes e, se presentes, R1 e R2 são cada um independentemente um resíduo de nucleotídeo ou a estrutura (I);

[9] A molécula de ácido nucleico de fita simples de acordo com [7] ou [8], em que X ou Z compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 11 a 25;

[10] Um método para inibir a fosforilação da proteína SMAD2/3, compreendendo administrar um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 a um indivíduo;

[11] Um método para tratar fibrose, compreendendo administrar um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 a um indivíduo;

[12] Um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 para uso em inibir a fosforilação da proteína SMAD2/3;

[13] Um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 para uso no tratamento de fibrose;

[14] Uso de um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 na produção de um inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3; e

[15] Uso de um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 na produção de um agente terapêutico para fibrose.

[009] [16] O uso de acordo com [15], em que o ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 é um ácido nucleico compreendendo uma sequência que suprime expressão em KB-001 a -011 (uma parte sublinhada). Efeito vantajoso da invenção

[0010] De acordo com a presente invenção, um novo inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3 e um agente terapêutico para fibrose podem ser providos.

8 / 104 Breve descrição dos desenhos

[0011] A Figura 1 é um desenho mostrando a região de NEK6 na Sequência de Codificação e um sítio alvo da molécula ssPN produzida no Exemplo 7.

[0012] A Figura 2 representa diagramas esquemáticos mostrando um exemplo de moléculas de ácido nucleico, como ingrediente ativo, de um inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3 da presente invenção (uma molécula ssPN).

[0013] A Figura 3 representa diagramas esquemáticos mostrando um exemplo de moléculas de ácido nucleico, como ingrediente ativo, de um inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3 da presente invenção (uma molécula ssPN ou molécula ssNc).

[0014] A Figura 4 representa diagramas esquemáticos mostrando um exemplo de moléculas de ácido nucleico, como ingrediente ativo, de um inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3 da presente invenção (moléculas ssPN ou moléculas ssNc).

[0015] A Figura 5 representa diagramas esquemáticos mostrando um exemplo de moléculas de ácido nucleico, como ingrediente, ativo de um inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3 da presente invenção (uma molécula ssNc).

[0016] A Figura 6 é um gráfico mostrando as quantidades dos transcritos do gene NEK6 quando siRNAs foram introduzidos.

[0017] A Figura 7a representa os resultados do Western blot para proteína SMAD3 fosforilada quando NEK6 teve a expressão reduzida (knockdown). A Figura 7b representa os resultados do Western blot para proteína SMAD2 fosforilada quando NEK6 teve a expressão reduzida.

[0018] A Figura 8a representa os resultados da coimunoprecipitação com um anticorpo anti-NEK6. Figura 8b representa os resultados da coimunoprecipitação com um anticorpo anti-FLAG.

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[0019] A Figura 9 representa os resultados do Western blot para proteína SMAD3 fosforilada quando a proteína NEK6 fundida com His e a proteína SMAD3 fundida com GST foram reagidas.

[0020] A Figura 10a representa os resultados do Western blot quando NEK6 teve a expressão reduzida. A Figura 10b mostra a quantidade de luminescência da luciferase de vagalumes quando NEK6 teve a expressão reduzida.

[0021] A Figura 11a mostra as quantidades de transcritos do gene Col1a1 quando NEK6 teve a expressão reduzida. A Figura 11b mostra as quantidades de transcritos do gene αSMA quando NEK6 teve a expressão reduzida.

[0022] A Figura 12a mostra as quantidades de transcritos do gene Col1a1 quando NEK6 teve a expressão reduzida. A Figura 12b mostra as quantidades de transcritos do gene αSMA quando NEK6 teve a expressão reduzida.

[0023] A Figura 13 representa os resultados do Western blot para proteína SMAD3 fosforilada (pSMAD3) quando siRNAs de NEK6 foram introduzidos em células hepáticas estreladas.

[0024] A Figura 14 representa os resultados do Western blot para proteína SMAD3 fosforilada (pSMAD3) quando vários siRNAs de NEK6 foram introduzidos em células hepáticas estreladas.

[0025] A Figura 15a mostra as quantidades de transcritos de NEK6 quando NEK6 teve a expressão reduzida em células hepáticas estreladas. A Figura 15b mostra as quantidades de transcritos de Fibronectina quando NEK6 teve a expressão reduzida in células hepáticas estreladas. A Figura 15c mostra as quantidades de transcritos do gene αSMA quando NEK6 teve a expressão reduzida em células hepáticas estreladas.

[0026] A Figura 16 representa os resultados do Western blotting para proteína SMAD3 fosforilada quando NEK6 teve a expressão reduzida em

10 / 104 fibroblastos renais.

[0027] A Figura 17a representa resultados da medição de GPT sérica quando NEK6 teve a expressão reduzida em modelos de CCl4. A Figura 17b representa resultados da medição de GOT sérica quando NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com CCl4.

[0028] A Figura 18 representa os resultados do Western blotting para proteína SMAD3 fosforilada quando NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com CCl4.

[0029] A Figura 19a mostra as quantidades de transcritos do gene NEK6 quando NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com CCl4. A Figura 19b mostra as quantidades de transcritos do gene Col1a1 quando NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com CCl4. A Figura 19c mostra as quantidades de transcritos do gene Col3a1 quando NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com CCl4. A Figura 19d mostra as quantidades de transcritos do gene Timp1 quando o gene NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com CCl4.

[0030] A Figura 20a mostra as quantidades de transcritos do gene NEK6 quando NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com BDL. A Figura 20b mostra as quantidades de transcritos do gene Col1a1 quando NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com BDL. A Figura 20c mostra as quantidades de transcritos do gene Col3a1 quando o gene NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com BDL. A Figura 20d mostra as quantidades de transcritos do gene Timp1 quando o gene NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com BDL.

[0031] A Figura 21 representa os resultados da análise patológica do fígado quando NEK6 teve a expressão reduzida em modelos com CCl4. A Figura 21a representa um resultado do grupo de administração de solução salina que não recebeu CCl4. A Figura 21b representa um resultado do grupo de administração de solvente que recebeu CCl4. A Figura 21c representa um

11 / 104 resultado do grupo de administração do ácido nucleico que recebeu CCl4. Descrição de modalidades

[0032] Os termos usados no presente têm o significado comumente entendido na técnica a menos que indicado de outra forma. Além disso, na presente invenção, “número de nucleotídeos” significa, por exemplo, “comprimento”, e pode também ser referido como “comprimento do nucleotídeo”. Na presente invenção, a faixa do número de nucleotídeos descreve, por exemplo, todos os números inteiros positivos que se situam dentro da faixa e, como exemplo específico, a descrição “1 a 4 nt” significa a descrição de todos “1, 2, 3, 4 nt”.

[0033] A presente invenção provê um inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3, compreendendo um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6, como ingrediente ativo, e um agente terapêutico para fibrose, compreendendo o ácido nucleico, como ingrediente ativo. A seguir, o conteúdo da presente invenção será descrito detalhadamente. (1) Ácidos nucleicos que suprimem a expressão do gene NEK6

[0034] A proteína NEK6 é uma das 11 famílias de serina/treonina quinase relacionada à NIMA, envolvidas no controle da divisão celular, e é fosforilada (ativada) na fase M do ciclo celular.

[0035] O gene NEK6, que é um alvo da presente invenção, é um gene derivado de mamíferos e, preferivelmente, um gene derivado de humanos. Foram relatados 7 variantes para o gene NEK6 derivado de humanos, entre as quais a região da Sequência de Codificação da isoforma 2 é mostrada na Figura 1 (SEQ ID NO: 56).

[0036] O mecanismo de supressão da expressão do gene NEK6 por uma molécula de ácido nucleico não é especialmente limitado, e é simplesmente necessário para permitir que a expressão seja regulada negativamente. A supressão da expressão do gene NEK6 pode ser confirmada por diminuição na produção do produto da transcrição do gene NEK6,

12 / 104 diminuição na produção do produto da tradução do gene NEK6 gene ou diminuição na atividade do produto traduzido.

[0037] Os ácidos nucleicos que suprimem a expressão do gene NEK6 incluem polinucleotídeos antisense, siRNAs, moléculas ssPN, moléculas ssNc, miRNAs, ribozimas e outros do mRNA de NEK6.

[0038] Os polinucleotídeos antisense, siRNAs, moléculas ssPN, moléculas ssNc e ribozimas podem ser facilmente obtidos pelos técnicos no assunto tendo por base a sequência nucleotídica do gene NEK6 humano descrito acima. De preferência, este é um ácido nucleico produzido bom se em uma sequência da região na Sequência de Codificação da isoformas 2 de NEK6 (SEQ ID NO: 56). (2) siRNAs

[0039] Um siRNA (pequeno RNA de interferência), um dos ácidos nucleicos que suprime a expressão do gene NEK6, será descrito abaixo.

[0040] Um siRNA é uma molécula de ácido nucleico que consiste em uma fita guia (fita antisense), para pareamento com um gene alvo, e uma fita passageira (fita sense) que forma uma fita dupla junto com a fita guia. Dentro de uma célula, um siRNA é incorporado em um complexo denominado complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), que envolve uma proteína Argonauta (AGO) como um componente central, e então a fita sense é degradada pela AGO e a fita guia permanece no RISC. Foi considerado que uma região semente em uma fita guia (uma região com 7 nt nas posições 2 a 8 desde a extremidade 5’ da fita guia) desempenha uma função importante no reconhecimento de uma sequência alvo, e acredita-se que seja preferível selecionar uma região semente específica para um gene alvo com o objetivo de evitar um efeito fora do alvo. Consequentemente, em relação à região semente do ácido nucleico como ingrediente ativo da presente invenção, é também preferível selecionar uma sequência específica para o gene NEK6. Tais exemplos incluem selecionar um ácido nucleico contendo, como a região

13 / 104 semente, uma sequência que é complementar ao gene NEK6 e não é complementar ao NEK7 (Base de dados RefSeq: NM_133494.2) ou na qual um ou mais (por exemplo, 1 a 3) nucleotídeos na região não sejam complementares (mal pareados) ao gene NEK7. Além disso, igualmente em relação à sequência complete, é útil, por exemplo, aumentar os nucleotídeos que são complementares ao gene NEK6 e não complementares (mal pareados) ao gene NEK7 (por exemplo, 4 ou mais, de preferência 5 a 7 nucleotídeos), com o objetivo de evitar o efeito fora do alvo. O número de nucleotídeos em uma sequência que suprime a expressão contida em uma fita guia é, por exemplo, 15 a 30, de preferência 19 a 25, mais preferivelmente 19 a 23, ainda preferivelmente 21, 22, 23 e de preferência em particular 23.

[0041] A sequência que suprime a expressão descrita acima pode conter ainda uma sequência adicional no lado 3’ para formar uma extremidade saliente. O número de nucleotídeos na sequência adicional descrita acima é, por exemplo, a 1 a 11 e, de preferência, 1 a 4. A sequência adicional pode ser de resíduos de ribonucleotídeos ou resíduos de desoxirribonucleotídeos.

[0042] O número de nucleotídeos na fita guia é, por exemplo, 19 a 50 nt, de preferência 19 a 30 nt, mais preferivelmente 19 a 25 nt, ainda preferivelmente 19 a 23 nt, ainda mais preferivelmente 21, 22, 23 e de preferência em particular 23 nt.

[0043] O número de nucleotídeos na fita passageira é, por exemplo, 19 a 50 nt, de preferência 19 a 30 nt, mais preferivelmente 19 a 25 nt, ainda preferivelmente 19 a 23 nt, ainda mais preferivelmente 21, 22, 23 nt e de preferência em particular 21 nt.

[0044] Na fita passageira, uma região revelando complementaridade com a fita guia contém, por exemplo, 19 a 50 nt, de preferência 19 a 30 nt, mais preferivelmente 19 a 25 nt e, ainda preferivelmente, 19 a 23 nt de comprimento. A região pode conter ainda uma sequência adicional no lado 3’.

14 / 104 O número de nucleotídeos na sequência adicional é, por exemplo, 1 a 11 nt e, de preferência, 1 a 4 nt, e a sequência adicional pode ser de resíduos de ribonucleotídeos ou resíduos de desoxirribonucleotídeos. A fita passageira, por exemplo, pode ser complementar à região revelando complementaridade com a fita guia, ou pode ter um ou diversos nucleotídeos que não são complementares, mas é preferível que seja complementar. Um nucleotídeo ou diversos nucleotídeos significam, por exemplo, 1 a 3 nt e, de preferência, 1 nt ou 2 nt.

[0045] Um siRNA que suprime a expressão do gene NEK6 pode ser obtido tendo por base as informações na sequência de cDNA do gene NEK6, por exemplo, de acordo com um sistema para a concepção de siRNAs, tal como siSNIPER(R) ou siDirect(R), visando à verificação de fármacos/pesquisa diagnóstica.

[0046] É preferível que o siRNA de NEK6 seja um siRNA que atue especificamente em NEK6, e os exemplos incluem os ácidos nucleicos de fita dupla como segue: (a) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 6 na extremidade 3’ ou na extremidade 5’, (b) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 2 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 7 na extremidade 3’ ou na extremidade 5’, (c) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 3 na extremidade 5’ e uma fita

15 / 104 passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 8 na extremidade 3’ ou na extremidade 5’, (d) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 4 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 9 na extremidade 3’ ou na extremidade 5’, (e) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 5 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 10 na extremidade 3’ ou na extremidade 5’. Tabela 1

[0047] O siRNA que suprime a expressão do gene NEK6 pode também ser uma molécula de ácido nucleico de fita simples formando uma estrutura de RNA do tipo grampo de cabelo, em que a extremidade 3’ da fita passageira (fita sense) e a extremidade 5’ da fita guia (fita antisense) são unidas uma à outra por intermédio de uma sequência ligante de um resíduo de nucleotídeo e/ou um ligante de estrutura não nucleotídica, ou a extremidade 3’

16 / 104 da fita guia (fita antisense) e a extremidade 5’ da fita passageira (fita sense) são unidas uma à outra por intermédio de uma sequência ligante de um resíduo de nucleotídeo e/ou um ligante de estrutura não nucleotídica.

[0048] O comprimento da sequência ligante de um resíduo de nucleotídeo descrita acima não é especialmente limitado, mas é preferível, por exemplo, que a fita passageira e a fita guia tenham um comprimento que possa formar uma fita duplex. O número de nucleotídeos na sequência ligante tem o limite inferior de, por exemplo, 1 nt, de preferência 2 nt e mais preferivelmente 3 nt; e o limite superior de, por exemplo, 100 nt, de preferência 80 nt e mais preferivelmente 50 nt. Exemplos específicos do número de nucleotídeos na sequência ligante são 1 a 100, 2 a 80 e 3 a 50.

[0049] Os exemplos dos ligantes compreendendo uma estrutura não nucleotídica descrita acima incluem ligantes químicos, tais como um ligante hexaetilenoglicol, um ligante poli(oxifosfinico-oxi-1,3-propanodiol), um ligante alila ou um ligante polietilenoglicol; e um ligante amino tendo uma estrutura de carbamato. O comprimento do ligante compreendendo uma estrutura não nucleotídica não é limitado, mas é preferível, por exemplo, que a fita passageira e a fita guia tenham um comprimento que possam formar uma fita duplex. (3) moléculas ssPN

[0050] Uma molécula ssPN para ser uma do ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 será descrita. Uma molécula ssPN significa uma molécula de ácido nucleico de RNA de fita simples dotada de excelente estabilidade biológica, a qual é descrita em WO2012/017919, e é especialmente como segue.

[0051] A molécula ssPN como ingrediente ativo da presente invenção é uma molécula de ácido nucleico de fita simples contendo uma sequência que suprime a expressão do gene NEK6, sendo distinguida por conter uma região (X), uma região de ligação (Lx) e uma região (Xc); em que a região de

17 / 104 ligação (Lx) é ligada entre a região (X) e a região (Xc); em que pelo menos uma dentre a região (X) e a região (Xc) contém a sequência que suprime a expressão; em que a região de ligação (Lx) possui uma estrutura não nucleotídica contendo pelo menos um dentre um esqueleto de pirrolidina e um esqueleto de piperidina. A molécula ssPN tem a extremidade 5’ e a extremidade 3’ não ligadas, e pode também ser referida como uma molécula de ácido nucleico de fita simples linear.

[0052] Na molécula ssPN, uma sequência que suprime a expressão do gene NEK6 é, por exemplo, uma sequência que exibe um atividade de supressão na expressão do gene NEK6 quando a molécula ssPN da presente invenção é introduzida em uma célula in vivo ou in vitro. Uma sequência de siRNA ligada ao mRNA de NEK6 pode ser obtida de acordo com um sistema existente para a concepção de siRNA tendo por base as informações na sequência de cDNA do gene NEK6, e a molécula ssPN pode também empregar a sequência que suprime a expressão de siRNA como uma sequência que suprime a expressão da molécula ssPN.

[0053] É preferível que a sequência que suprime a expressão tenha, por exemplo, 80% ou mais de complementaridade com uma região alvo do gene NEK6, a qual é mais preferivelmente 90% ou mais, ainda preferivelmente 95% ou mais, ainda mais preferivelmente 98% ou mais e de preferência em particular 100%.

[0054] Em particular, em relação a uma parte correspondente a uma região semente de siRNA, é preferível selecionar uma sequência específica para o gene NEK6 de modo semelhante ao caso de siRNA.

[0055] Estima-se que a supressão da expressão do gene NEK6 causada pela molécula ssPN se deva a, por exemplo, a ocorrência de interferência pelo RNA, mas não se restringe a esse mecanismo. A molécula ssPN da presente invenção não é aquela que é introduzida em uma célula, ou semelhantes, como um dsRNA constituído por dois RNA de fita simples, tal

18 / 104 como o assim chamado siRNA, e além do mais, a excisão da sequência que suprime a expressão não é necessariamente essencial dentro de uma célula.

[0056] Na molécula ssPN, a região de ligação (Lx) pode ter, por exemplo, a estrutura não nucleotídica contendo um esqueleto de pirrolidina, ou pode ter a estrutura não nucleotídica contendo um esqueleto de piperidina, ou pode ter ambas, a estruturas não nucleotídica contendo um esqueleto de pirrolidina e a estrutura não nucleotídica contendo um esqueleto de piperidina.

[0057] Na molécula ssPN, o esqueleto de pirrolidina pode ser, por exemplo, um esqueleto de derivados de pirrolidina nos quais um ou mais carbonos que compõem um anel de cinco membros de pirrolidina são substituídos e, se substituídos, é preferível que seja, por exemplo, um átomo de carbono diferente de um carbono na posição 2 (C-2) no anel de cinco membros. O carbono pode ser substituído por, por exemplo, nitrogênio, oxigênio ou enxofre. O esqueleto de pirrolidina pode conter, por exemplo, uma ligação dupla carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-nitrogênio, por exemplo, dentro de um anel de cinco membros de pirrolidina. No esqueleto de pirrolidina, os carbonos e um nitrogênio que compõem um anel de cinco membros de pirrolidina, podem ter uma ligação a um hidrogênio ou podem ter uma ligação a um substituinte como mencionado mais adiante. A região de ligação (Lx) pode ligar-se à região (X) e à região (Xc), por exemplo, por intermédio de quaisquer grupos no esqueleto de pirrolidina, os quais são preferivelmente qualquer um dentre átomos de carbono e um nitrogênio no anel de cinco membros e são preferivelmente um carbono na posição 2 (C-2) e um nitrogênio no anel de cinco membros. Os exemplos dos esqueleto de pirrolidina incluem um esqueleto de prolina e um esqueleto de prolinol. O esqueleto de prolina e o esqueleto de prolinol e os semelhantes são, por exemplo, uma substância in vivo e um redutor do mesmo e, assim, possuem excelente segurança.

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[0058] Na molécula ssPN, o esqueleto de piperidina pode ser, por exemplo, um esqueleto de derivados de piperidina nos quais um ou mais carbonos que compõem um anel de seis membros de piperidina são substituídos e, se substituídos, é preferível que seja, por exemplo, um átomo de carbono diferente de um carbono na posição 2 (C-2) no anel de seis membros. O carbono pode ser substituído por, por exemplo, nitrogênio, oxigênio ou enxofre. O esqueleto de piperidina pode conter, por exemplo, uma ligação dupla carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-nitrogênio, por exemplo, dentro de um anel de seis membros de pirrolidina. No esqueleto de piperidina, carbonos e um nitrogênio que compõem um anel de seis membros de piperidina, por exemplo, podem ter uma ligação a um hidrogênio ou podem ter uma ligação a um substituinte como mencionado mais adiante. A região de ligação (Lx) pode ligar-se à região (X) e à região (Xc), por exemplo, por intermédio de quaisquer grupos no esqueleto de piperidina, os quais são preferivelmente qualquer um dentre átomos de carbono e um nitrogênio no anel de seis membros e são preferivelmente um carbono na posição 2 (C-2) e um nitrogênio no anel de seis membros.

[0059] A região de ligação, por exemplo, pode conter somente um resíduo não de nucleotídeo consistindo na estrutura não nucleotídica descrita acima, ou pode conter resíduo não de nucleotídeo consistindo na estrutura não nucleotídica e um resíduo de nucleotídeo.

[0060] Na molécula ssPN, a região de ligação é representada por, por exemplo, a fórmula (I) seguinte. Fórmula química 2

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[0061] Na fórmula (I), por exemplo, X1 e X2 são cada um independentemente H2, O, S ou NH; Y1 e Y2 são cada um independentemente uma ligação simples, CH2, NH, O ou S; R3 é um átomo de hidrogênio ou um substituinte ligado a C-3, C-4, C-5 ou C-6 no anel A; L1 é uma cadeia de alquileno tenho número n de átomos de carbono, em que cada um dos átomos de hidrogênio no átomo de carbono do alquileno pode ou não ser substituído por OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, ou SRa, ou L1 é uma cadeia de poliéter na qual um ou mais átomos de carbono na cadeia do alquileno são substituídos por um ou mais átomos de oxigênio, com a condição de que, se Y1 for NH, O ou S, então um átomo em L1 ligado a Y1 é carbono, um átomo em L1 ligado a OR1 é carbono e os átomos de oxigênio não são adjacentes um ao outro; L2 é uma cadeia de alquileno compreendendo m átomos de carbono, em que cada um dos átomos de hidrogênio no átomo de carbono do alquileno pode ou não ser substituído por OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH ou SRc, ou L2 é uma cadeia de poliéter na qual um ou mais átomos de carbono na cadeia do alquileno são substituídos por um ou mais átomos de oxigênio, com a condição de que, se Y2 for NH, O ou S, então um átomo em L2 ligado a Y2 é carbono, um átomo em L2 ligado a OR2 é carbono e os átomos de oxigênio não são adjacentes um ao outro; Ra, Rb, Rc e Rd são cada um independentemente um substituinte ou um grupo protetor; l é 1 ou 2;

21 / 104 m é um número inteiro variando de 0 a 30; n é um número inteiro variando de 0 a 30; um átomo de carbono no anel A, excluindo C-2, pode ser substituído por nitrogênio, oxigênio ou enxofre, o anel A pode compreender uma ligação dupla carbono- carbono ou uma ligação dupla carbono-nitrogênio no mesmo, a região (Xc) e a região (X) são, cada uma, ligadas à região de ligação (Lx) por intermédio de -OR1- ou OR2-; em que R1 e R2 podem ou não estar presentes e, se presentes, R1 e R2 são cada um independentemente um resíduo de nucleotídeo ou a estrutura (I).

[0062] Na fórmula (I), X1 e X2 são, por exemplo, cada um independentemente, H2, O, S ou NH. Na fórmula (I), “X1 é H2” significa que X1 forma CH2 (grupo metileno) com um átomo de carbono ligado a X1. O mesmo também se aplica a X2.

[0063] Na fórmula (I), Y1 e Y2 são cada um independentemente uma ligação simples, CH2, NH, O ou S.

[0064] Na fórmula (I), no anel A, l é 1 ou 2. No caso de l = 1, o anel A é um anel de cinco membros, por exemplo, o esqueleto de pirrolidina descrito acima. Os exemplos do esqueleto de pirrolidina incluem um esqueleto de prolina e um esqueleto de prolinol, incluindo estruturas bivalentes dos mesmos. No caso de l = 2, o anel A é um anel de seis membros, por exemplo, o esqueleto de piperidina descrito acima. No anel A, um átomo de carbono, excluindo C-2, no anel A pode ser substituído por nitrogênio, oxigênio ou enxofre. O anel A pode também conter uma ligação dupla carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-nitrogênio dentro anel A. O anel A pode ser, por exemplo, do tipo L ou do tipo D.

[0065] Na fórmula (I), R3 é um átomo de hidrogênio ou um substituinte ligado a C-3, C-4, C-5 ou C-6 no anel A. Se R3 for o substituinte,

22 / 104 o substituinte R3 pode ser único ou plural, ou ausente, e quando R3 for plural, estes podem ser iguais ou diferentes. O substituinte R3 é, por exemplo, halogênio, OH, OR4, NH2, NHR4, NR4R5, SH, SR4, um grupo oxo (=O), alquila, alquenila, alquinila, haloalquila, arila, heteroarila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquilalquila, ciclilalquila, hidroxialquila, alcoxialquila, aminoalquila, heterociclilalquenila, heterociclilalquila, heteroarilalquila, silila, sililoxialquila ou os semelhantes.

[0066] R4 e R5 são, por exemplo, cada um independentemente um substituinte ou um grupo protetor, e podem ser iguais ou diferentes. Os exemplos dos substituintes como R4 e R5 incluem halogênio, alquila, alquenila, alquinila, haloalquila, arila, heteroarila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquilalquila, ciclilalquila, hidroxialquila, alcoxialquila, aminoalquila, heterociclilalquenila, heterociclilalquila, heteroarilalquila, silila e sililoxialquila.

[0067] Os grupos protetores como R4 e R5 são, por exemplo, grupos funcionais que convertem um grupo funcional altamente reativo em um inativo, e incluem grupos protetores conhecidos. O grupo protetor pode empregar, por exemplo, descrições em uma referência (J. F. W. McOmie, “Protecting Groups in Organic Chemistry”, Prenum Press, London e New York, 1973). O grupo protetor não é especialmente limitado, e os exemplos incluem um grupo terc-butildimetilsilila (TBDMS), um grupo bis(2- acetoxietiloxi)metila (ACE), um grupo triisopropilsililoximetila (TOM), um grupo 1-(2-cianoetoxi)etila (CEE), um grupo 2-cianoetoximetila (CEM) e um grupo tolilsulfoniletoximetila (TEM), um grupo dimetoxitritila (DMTr). Se R3 for OR4, os grupos protetores não são especialmente limitados, e os exemplos incluem um grupo TBDMS, um grupo ACE, um grupo TOM, um grupo CEE, um grupo CEM e um grupo TEM.

[0068] Na fórmula (I), L1 é uma cadeia de alquileno tendo número n de átomos de carbono. Cada um dos átomos de hidrogênio no átomo de

23 / 104 carbono do alquileno pode ou não ser substituído por, por exemplo, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH ou SRa. Alternativamente, L1 pode ser uma cadeia de poliéter na qual um ou mais (por exemplo, 1-3) átomos de carbono na cadeia do alquileno são substituídos por um ou mais átomos de oxigênio. A cadeia de poliéter é, por exemplo, polietilenoglicol. Aqui, se Y1 for NH, O ou S, então um átomo em L1 ligado a Y1 é carbono, um átomo em L1 ligado a OR1 é carbono e os átomos de oxigênio não são adjacentes um ao outro. Em outras palavras, por exemplo, se Y1 for O, então tal átomo de oxigênio e um átomo de oxigênio de L1 não são adjacentes, e um átomo de oxigênio de OR1 e o átomo de oxigênio de L1 não são adjacentes.

[0069] Na fórmula (I), L2 é uma cadeia de alquileno tendo número m de átomos de carbono. Cada um dos átomos de hidrogênio no átomo de carbono do alquileno pode ou não ser substituído por, por exemplo, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH ou SRc. Alternativamente, L2 pode ser uma cadeia de poliéter na qual um ou mais (por exemplo, 1-3) átomos de carbono na cadeia do alquileno são substituídos por um ou mais átomos de oxigênio. Aqui, se Y2 for NH, O ou S, então um átomo em L2 ligado a Y2 é carbono, um átomo em L2 ligado a OR2 é carbono e os átomos de oxigênio não são adjacentes um ao outro. Em outras palavras, por exemplo, se Y2 for O, então tal átomo de oxigênio e um átomo de oxigênio de L2 não são adjacentes, e um átomo de oxigênio de OR2 e o átomo de oxigênio de L2 não são adjacentes.

[0070] n de L1 e m de L2 não são especialmente limitados, e em cada um destes, o limite inferior é, por exemplo, 0, e o limite superior não é também especialmente limitado. n e m podem ser adequadamente definidos, por exemplo, de acordo com um comprimento desejado da região de ligação (Lx). É preferível que n e m sejam, por exemplo, cada um 0-30 em vista do custo de produção e rendimento, e estes são mais preferivelmente 0-20 e, ainda preferivelmente, 0-15. n e m podem ser iguais (n = m) ou diferentes. n + m é, por exemplo, 0-30, de preferência 0-20 e mais preferivelmente 0-15.

24 / 104 Aqui, n de L1 e m de L2 são os números de átomos de carbono em cada cadeia de alquileno, mas, no caso de uma cadeia de poliéter na qual um ou mais átomos de carbono na cadeia do alquileno de L1 ou L2 são substituídos por um átomo de oxigênio, n e m significam a soma do número de átomos de carbono e o número de átomos substituídos de oxigênio.

[0071] Ra, Rb, Rc e Rd são, por exemplo, cada um independentemente, um substituinte ou um grupo protetor. O substituinte e o grupo protetor de Ra, Rb, Rc e Rd são, por exemplo, semelhantes ao substituinte e ao grupo protetor de R4 e R5.

[0072] Na fórmula (I), os átomos de hidrogênio podem ser, por exemplo, cada um independentemente, substituídos por halogênio tais como as Cl, Br, F e I.

[0073] A região (Xc) e a região (X) são ligadas, cada uma, por exemplo, à região de ligação (Lx) por intermédio de -OR1- ou -OR2-. Aqui, R1 e R2 podem ou não estar presentes. Se R1 e R2 estiverem presentes, R1 e R2 têm, cada um independentemente, um resíduo de nucleotídeo ou a estrutura da fórmula (I). Se R1 e/ou R2 forem os resíduos de nucleotídeos, a região de ligação (Lx), por exemplo, compreende o resíduo não nucleotídico que consiste na estrutura da fórmula (I) exceto pelos resíduos de nucleotídeos R1 e/ou R2 e o resíduo de nucleotídeo. Se R1 e/ou R2 representarem as estruturas da fórmula (I), a região de ligação (Lx) terá uma estrutura, por exemplo, na qual os dois ou mais resíduos não nucleotídicos que consistem nas estruturas da fórmula (I) são unidos uns aos outros. Por exemplo, um, dois, três ou quatro das estruturas da fórmula (I) podem estar incluídos. Assim, quando uma pluralidade das estruturas for incluída, as estruturas da (I) podem ser, por exemplo, diretamente unidas ou ligadas por intermédio do resíduo de nucleotídeo. Enquanto isso, se R1 e R2 não estiverem presentes, a região de ligação (Lx) compreende, por exemplo, somente o resíduo não nucleotídico que consiste na estrutura da fórmula (I).

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[0074] As combinações de ligações da região (Xc) e a região (X) com -OR1- e -OR2- não são especialmente limitadas, e os exemplos incluem qualquer um dos requisitos a seguir. Requisito (1)

[0075] A região (Xc), por intermédio de -OR2-, e a região (X) por intermédio de -OR1-, ligam-se à estrutura da fórmula (I). Requisito (2)

[0076] A região (Xc), por intermédio de -OR1-, e a região (X), por intermédio de -OR2-, ligam-se à estrutura da fórmula (I).

[0077] Os exemplos das estruturas da fórmula (I) incluem a fórmula (I-1) à fórmula (I-9) a seguir, e nas fórmulas seguintes, n e m são iguais àqueles na fórmula (I). Nas formulas seguintes, q é um número inteiro entre 0-10. Fórmula química 3

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[0078] Nas fórmulas (I-1)-(I-9), n, m e q não são especialmente limitados e são como mencionados acima. Exemplos específicos incluem n = 8 na fórmula (I-1), n = 3 na (I-2), n = 4 ou 8 na fórmula (I-3), n = 7 ou 8 na (I- 4), n = 3 e m = 4 na fórmula (I-5), n = 8 e m = 4 na (I-6), n = 8 e m = 4 na fórmula (I-7), n = 5 e m = 4 na (I-8), q = 1 e m = 4 na fórmula (I-9). Um exemplo da fórmula (I-4) (n = 8) é mostrado na fórmula (I-4a) seguinte, e um

27 / 104 exemplo da fórmula (I-8) (n = 5, m = 4) é mostrado na fórmula (I-8a) seguinte. Fórmula química 4

[0079] Na molécula ssPN, a região (Xc) é complementar à região (X). Consequentemente, na molécula ssPN, a região (Xc) dobra-se em direção à região (X), e a região (Xc) e a região (X) podem formar uma fita duplex através de autoanelamento.

[0080] Na molécula ssPN, por exemplo, somente a região (Xc) pode dobrar-se para formar uma fita duplex juntamente com a região (X) e, além disso, uma nova fita duplex pode formar-se em outra região. A seguir, a primeira molécula ssPN, ou seja, uma molécula com formação de fita duplex em uma posição, é referida como “primeira molécula ssPN”, e a última molécula ssPN, ou seja, uma molécula com formação de fita duplex em duas posições é referida como “segunda molécula ssPN”. A primeira molécula ssPN e a segunda molécula ssPN serão ilustradas abaixo. (i) Primeiras moléculas ssPN

[0081] A primeira molécula ssPN é uma molécula que consiste em, por exemplo, a região (X), a região (Xc) e a região de ligação (Lx).

[0082] A primeira molécula ssPN, por exemplo, pode ter a região (Xc), a região de ligação (Lx) e a região (X) nessa ordem, do lado 5’ para o lado 3’, ou pode ter a região (Xc), a região de ligação (Lx) e a região (X)

28 / 104 nessa ordem do lado 3’ para o lado 5’.

[0083] Na primeira molécula ssPN, a região (Xc) é complementar à região (X). Aqui, é necessário simplesmente que a região (Xc) tenha uma sequência complementar à região inteira da região (X) ou uma região parcial da mesma e, de preferência, contém uma sequência complementar à região inteira da região (X) ou região parcial da mesma ou consiste em somente a sequência complementar. A região (Xc) pode ser, por exemplo, complementar à região complementar inteira ou à região parcial complementar da região (X), ou um ou diversos nucleotídeos podem não ser complementares, mas é preferível que sejam complementares. Um nucleotídeo ou diversos nucleotídeos significam, por exemplo, 1 a 3 nt e, de preferência, 1 nt ou 2 nt.

[0084] Na primeira molécula ssPN, a sequência que suprime a expressão está contida em pelo menos uma dentre a região (Xc) e a região (X). A primeira molécula ssPN, por exemplo, pode conter uma dentre a sequência que suprime a expressão ou pode ter duas ou mais destes. No último caso, a primeira molécula ssPN, por exemplo, pode conter duas ou mais sequências que suprimem a expressão do gene NEK6 que são iguais, ou pode ter duas ou mais sequências que suprimem a expressão do gene NEK6 que são diferentes. Se a primeira molécula ssPN contiver duas ou mais das sequências que suprimem a expressão, a localização do posicionamento de cada sequência que suprime a expressão não é especialmente limitada, e pode ser em qualquer região dentre a região (X) e a região (Xc), ou pode ser em uma região diferente.

[0085] Um exemplo das primeiras moléculas ssPN será descrito de acordo com os diagramas esquemáticos na Figura 2. A Figura 2 (A) é um diagrama esquemático mostrando um esboço da ordem de cada região para a molécula ssPN como um exemplo, e a Figura 2 (B) é um diagrama esquemático mostrando um estado no qual a molécula ssPN forma uma fita duplex dentro da molécula. Tal qual mostrado na Figura 2 (B), na molécula

29 / 104 ssPN, uma fita duplex é formada entre a região (Xc) e a região (X), e a Lx região assume uma estrutura de alça de acordo com o comprimento. A Figura 2 mostra exclusivamente a ordem das ligações entre as regiões e a relação posicional de cada região que forma uma fita duplex e, por exemplo, o comprimento de cada região, a forma da região de ligação (Lx) e os semelhantes não estão limitados a esses.

[0086] Na primeira molécula ssPN, os números de nucleotídeos na região (Xc) e na região (X) não são especialmente limitados. O comprimento de cada região será ilustrado abaixo, mas a presente invenção não está limitada a esse.

[0087] A região (Xc) pode ser, por exemplo, complementar à região inteira da região (X). Esse caso significa que a região (Xc), por exemplo, consiste em uma sequência nucleotídica complementar à região inteira desde a extremidade 5’ até a extremidade 3’ da região (X) e, em outras palavras, significa que a região (Xc) e a região (X) têm o mesmo comprimento de nucleotídeos, bem como que todos os nucleotídeos na região (Xc) são complementares a todos os nucleotídeos na região (X).

[0088] A região (Xc) pode também ser, por exemplo, complementar a uma região parcial da região (X). Esse caso significa que a região (Xc), por exemplo, consiste em uma sequência nucleotídica complementar à região parcial da região (X) e, em outras palavras, significa que a região (Xc) consiste em uma sequência nucleotídica tendo um comprimento de nucleotídeos com um ou mais nucleotídeos mais curto do que a região (X), e que todos os nucleotídeos na região (Xc) são complementares a todos os nucleotídeos na região parcial da região (X). É preferível que a região parcial da região (X) seja, por exemplo, uma região que consiste em uma sequência nucleotídica vindo desde o nucleotídeo final (o primeiro nucleotídeo) no lado da região (Xc) na região (X).

[0089] Na primeira molécula ssPN, as relações do número de

30 / 104 nucleotídeos (X) na região (X) e do número de nucleotídeos (Xc) na região (Xc) satisfaz, por exemplo, os requisitos (3) ou (5) seguintes e, no primeiro caso, ela satisfaz particularmente, por exemplo, o requisito (11) seguinte. X > Xc ... (3)

[0090] X - Xc = 1 a 10, de preferência 1, 2 ou 3, mais preferivelmente 1 ou 2 ... (11) X = Xc ... (5)

[0091] Se a região (X) e/ou a região (Xc) contiver a sequência que suprime a expressão, então a região, por exemplo, pode ser uma região composta somente pela sequência que suprime a expressão, ou pode ser uma região contendo a sequência que suprime a expressão.

[0092] O número de nucleotídeos na sequência que suprime a expressão é, por exemplo, 15 a 30 nt, de preferência 19 a 25 nt, mais preferivelmente 19 a 23 nt, ainda preferivelmente 21, 22, 23 nt e de preferência em particular 23 nt. Uma região contendo a sequência que suprime a expressão pode ter, por exemplo, uma sequência adicional no lado 5’ e/ou no lado 3’ da sequência que suprime a expressão. O número de nucleotídeos na sequência adicional é, por exemplo, 1 a 31 nt, de preferência 1 a 21 nt e mais preferivelmente 1 a 11 nt.

[0093] O número de nucleotídeos na região (X) não é especialmente limitado. Se a região (X) contiver a sequência que suprime a expressão, o limite inferior é, por exemplo, 19 nt. O limite superior é, por exemplo, 50 nt, de preferência 40 nt, mais preferivelmente 30 nt e ainda preferivelmente 25 nt. Exemplos específicos do número de nucleotídeos na região (X) são, por exemplo, 19 a 50 nt, de preferência, 19 a 30 nt, mais preferivelmente 19 a 25 nt, ainda preferivelmente 21, 22, 23 nt e de preferência em particular 23 nt.

[0094] O número de nucleotídeos na região (Xc) não é especialmente limitado. O limite inferior é, por exemplo, 19 nt, de preferência 20 nt e mais preferivelmente 21 nt. O limite superior é, por exemplo, 50 nt, de preferência

31 / 104 40 nt, mais preferivelmente 30 nt e ainda preferivelmente 25 nt. Exemplos específicos do número de nucleotídeos na região (Xc) são, por exemplo, 19 a 50 nt, de preferência 19 a 30 nt, mais preferivelmente 19 a 25 nt, ainda preferivelmente 21, 22- e 23 nt e de preferência em particular 21 nt.

[0095] Na primeira molécula ssPN, o comprimento da região de ligação (Lx) não é especialmente limitado. É preferível que a região de ligação (Lx), por exemplo, seja suficientemente longa para que a região (X) e a região (Xc) formem uma fita duplex. Se a região de ligação (Lx) contiver o resíduo de nucleotídeo, excluindo o resíduo não nucleotídico, o número de nucleotídeos na região de ligação (Lx) tem o limite inferior de, por exemplo, 1 nt, de preferência 2 nt e mais preferivelmente 3 nt, e o limite superior de, por exemplo, 100 nt, de preferência 80 nt e mais preferivelmente 50 nt. Exemplos específicos do número de nucleotídeos na região de ligação (Lx) são 1 a 100 nt, 2 a 80 nt e 3 a 50 nt. É preferível que a região de ligação (Lx) tenha uma estrutura que não provoque autoanelamento dentro se sua própria região.

[0096] O comprimento total da primeira molécula ssPN não é especialmente limitado. Na primeira molécula ssPN, a soma do número de nucleotídeos (o número de nucleotídeos no comprimento total) tem o limite inferior de, por exemplo, 38 nt, de preferência 42 nt, mais preferivelmente 44 nt e ainda preferivelmente 48 nt; e o limite superior de, por exemplo, 300 nt, de preferência 200 nt, mais preferivelmente 150 nt, ainda preferivelmente 100 nt e de preferência em particular 80 nt. Exemplos específicos da soma do número de nucleotídeos no comprimento total da primeira molécula ssPN são 38 a 300 nt, 42 a 200 nt, 44 a 150 nt, 48 a 100 nt e 48 a 80 nt. Na primeira molécula ssPN, a soma do número de nucleotídeos, exceto por aquele da região de ligação (Lx), tem o limite inferior de, por exemplo, 38 nt, de preferência 42 nt e ainda preferivelmente 44 nt; e o limite superior de, por exemplo, 300 nt, de preferência 200 nt, mais preferivelmente 150 nt, ainda

32 / 104 preferivelmente 100 nt e de preferência em particular 80. Exemplos específicos da soma do número de nucleotídeos, exceto por aquele da região de ligação (Lx), são 38 a 300 nt, 42 a 200 nt, 42 a 150 nt, 44 a 100 nt e 44 a 80 nt.

[0097] Exemplos específicos das primeiras moléculas ssPN que suprimem a expressão do gene NEK6 incluem as seguintes moléculas de ácido nucleico de fita simples. KB-001

[0098] 5’-GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC-Lx- GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA-3’ (SEQ ID NO: 31) KB-002

[0099] 5’-CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC-Lx- GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC-3’ (SEQ ID NO: 32) KB-003

[00100] 5’-CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC-Lx- GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC-3’ (SEQ ID NO: 33) KB-004

[00101] 5’-GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC-Lx- GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC-3’ (SEQ ID NO: 34) KB-005

[00102] 5’-CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC-Lx- GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU-3’ (SEQ ID NO: 35) KB-006

[00103] 5’-GGAGAUAAGAUGAAUCUCUUCCC-Lx- GGGAAGAGAUUCAUCUUAUCUCCAU-3’ (SEQ ID NO: 46) KB-007

[00104] 5’-CUAUGGAGAUAAGAUGAAUCUCC-Lx- GGAGAUUCAUCUUAUCUCCAUAGAA-3’ (SEQ ID NO: 47) KB-008

33 / 104

[00105] 5’-GCGGACUUCCAGAUCGAAAAGCC-Lx- GGCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCCA-3’ (SEQ ID NO: 48) KB-009

[00106] 5’-CGGACUUCCAGAUCGAAAAGACC-Lx- GGUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCC-3’ (SEQ ID NO: 49) KB-010

[00107] 5’-GACUUCCAGAUCGAAAAGAAGCC-Lx- GGCUUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCG-3’ (SEQ ID NO: 50) KB-011

[00108] 5’-GACUCGUUUAUCGAAGACAACCC-Lx- GGGUUGUCUUCGAUAAACGAGUCCA-3’ (SEQ ID NO: 61)

[00109] Em que Lx é uma região de ligação Lx e representa L-prolina- diamida-amidita na fórmula estrutural seguinte. Fórmula química 5

[00110] Além disso, as primeiras moléculas ssPN preferíveis incluem uma molécula de ácido nucleico de fita simples que contém uma sequência que suprime a expressão do gene NEK6 selecionada dentre SEQ ID NOs: 1 a 5 e consiste em somente uma região (X), uma região de ligação (Lx) e uma região (Xc), as quais estão dispostas na ordem: a região (Xc), a região de ligação (Lx) e a região (X) do lado 5’ para o lado 3’, em que a região de ligação (Lx) possui uma estrutura não nucleotídica contendo pelo menos um dentre um esqueleto de pirrolidina e um esqueleto de piperidina, e em que a região (X) compreende a sequência que suprime a

34 / 104 expressão.

[00111] Ainda preferivelmente, a região (Xc) é o ácido nucleico de fita simples descrito acima, totalmente complementar à região inteira ou a uma região parcial da região (X). De preferência em particular, a região (X) é o ácido nucleico de fita simples descrito acima contendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 11 a 25. Tabela 2 (ii) Segundas moléculas ssPN

[00112] A segunda molécula ssPN é, por exemplo, uma molécula tendo ainda uma região (Y) e uma região (Yc) complementar à região (Y) além da região (X), da região de ligação (Lx) e da região (Xc). Na segunda molécula ssPN, a região (X) e a região (Y) são unidas uma à outra para formar uma região interna (Z). Além disso, a menos que indicado de outra forma, a segunda molécula ssPN pode empregar as descrições sobre a primeira molécula ssPN.

35 / 104

[00113] A segunda molécula ssPN, por exemplo, pode ter a região (Xc), a região de ligação (Lx), a região (X), a região (Y) e a região (Yc), nessa ordem, do lado 5’ para o lado 3’. Nesse caso, a região (Xc) é também referida como região do lado 5’ (Xc); a região (X) na região interna (Z) é também referida como região interna do lado 5’ (X); a região (Y) na região interna (Z) é também referida como região interna 3’ (Y); e a região (Yc) é também referida como região do lado 3’ (Yc). A segunda molécula ssPN pode igualmente ter, por exemplo, a região (Xc), a região de ligação (Lx), a região (X), a região (Y), e a região (Yc) nessa ordem, do lado 3’ para o lado 5’. Nesse caso, a região (Xc) é também referida como as região do lado 3’ (Xc); a região (X) na região interna (Z) é também referida como região interna do lado 3’ (X); a região (Y) da região interna (Z) é também referida como uma região interna 5’ (Y); e a região (Yc) é também referida como região do lado 5’ (Yc).

[00114] Na região interna (Z), por exemplo, a região (X) e a região (Y) são unidas uma à outra. A região (X) e a região (Y) são, por exemplo, ligadas diretamente e não possuem qualquer sequência intervindo entre as mesmas. A região interna (Z) é definida como “consiste na região (X) ligada à região (Y)” a fim de mostrar a relação de sequências da região (Xc) e da região (Yc), e não está limitada, pois, na região interna (Z), a região (X) e a região (Y) são regiões separadas, independentes em uso da molécula ssPN. Em outras palavras, por exemplo, se a região interna (Z) contiver as sequências que suprimem a expressão, as sequências que suprimem a expressão podem estar dispostas ao longo da região (X) e da região (Y) na região interna (Z).

[00115] Na segunda molécula ssPN, a região (Xc) é complementar à região (X). Aqui, é necessário simplesmente que a região (Xc) tenha uma sequência complementar à região inteira da região (X) ou uma região parcial da mesma e, de preferência, contém uma sequência complementar à região inteira da região (X) ou uma região parcial da mesma, ou consiste na

36 / 104 sequência complementar. A região (Xc) pode ser, por exemplo, complementar à região complementar inteira ou à região complementar parcial da região (X), ou um ou diversos nucleotídeos podem não ser complementares, mas é preferível que sejam complementares. Um nucleotídeo ou diversos nucleotídeos significam, por exemplo, 1 a 3 nt e, de preferência, 1 nt ou 2 nt.

[00116] Na segunda molécula ssPN, a região (Yc) é complementar à região (Y). Aqui, é necessário simplesmente que a região (Yc) tenha uma sequência complementar à região inteira da região (Y) ou a uma região parcial da mesma e, de preferência, contém uma sequência complementar à região inteira da região (Y) ou a uma região parcial da mesma, ou consiste na sequência complementar. A região (Yc) pode ser, por exemplo, complementar à região complementar inteira ou à região complementar parcial da região (Y), ou um ou diversos nucleotídeos podem não ser complementares, mas é preferível que sejam complementares. Um nucleotídeo ou diversos nucleotídeos significam, por exemplo, 1 a 3 nt e, de preferência, 1 nt ou 2 nt.

[00117] Na segunda molécula ssPN, a sequência que suprime a expressão, por exemplo, está contida em pelo menos uma dentre a região interna (Z) compreendendo a região (X) e a região (Y) e a região (Xc), e pode estar contida ainda na região (Yc). É preferível uma molécula ssPN na qual a sequência que suprime a expressão esteja contida na região interna (Z). Se contiver a sequência que suprime a expressão, a região interna (Z), por exemplo, pode conter a sequência que suprime a expressão in em qualquer uma dentre a região (X) e a região (Y) ou, alternativamente, pode conter a sequência que suprime a expressão ao longo da região (X) e da região (Y). A segunda molécula ssPN, por exemplo, pode conter uma das sequências que suprimem a expressão ou pode conter duas ou mais destas.

[00118] Se a segunda molécula ssPN contiver duas ou mais das sequências que suprimem a expressão, a localização do posicionamento de cada sequência que suprime a expressão não é especialmente limitada, e pode

37 / 104 ser em qualquer uma dentre a região interna (Z) e a região (Xc), ou pode ser em qualquer uma dentre a região interna (Z) e a região (Xc) e ainda em outra região diferente.

[00119] Na segunda molécula ssPN, a região (Yc) e a região (Y), por exemplo, podem ser ligadas diretamente ou ligadas indiretamente. No primeiro caso, os exemplos de ligações diretas incluem ligações tais como ligação fosfodiéster. No último caso, os exemplos incluem uma forma tendo uma região de ligação (Ly) entre a região (Yc) e a região (Y), em que a região (Yc) e a região (Y) são unidas uma à outra por intermédio da região de ligação (Ly).

[00120] Se a segunda molécula ssPN tiver a região de ligação (Ly), a região de ligação (Ly) pode ser, por exemplo, um ligante consistindo no resíduo de nucleotídeo, ou pode ser um ligante tendo a estrutura não nucleotídica contendo pelo menos um dentre um esqueleto de pirrolidina e um esqueleto de piperidina como mencionado acima. No último caso, a região de ligação (Ly) pode ser representada por, por exemplo, a fórmula (I), e pode empregar todas as descrições sobre a fórmula (I) na região de ligação (Lx).

[00121] A região (Yc) e a região (Y) são ligadas, cada uma, por exemplo, à região de ligação (Ly) por intermédio de -OR1- ou -OR2-. Aqui, R1 e R2 podem ou não estar presentes de modo semelhante àqueles na região de ligação (Lx) mencionada acima.

[00122] Combinações de ligações da região (Xc) e a região (X) e a região (Yc) e a (Y) com -OR1- e -OR2- não são especialmente limitadas, e os exemplos incluem qualquer um dos requisitos a seguir. Requisito (1)

[00123] A região (Xc), por intermédio de -OR2-, e a região (X) por intermédio de -OR1- ligam-se à estrutura da fórmula (I), e a região (Yc), por intermédio de -OR1-, e a região (Y) por intermédio de - OR2- ligam-se à estrutura da fórmula (I).

38 / 104 Requisito (2)

[00124] A região (Xc), por intermédio de -OR2-, e a região (X) por intermédio de -OR1- ligam-se à estrutura da fórmula (I), e a região (Yc), por intermédio de -OR2-, e a região (Y) por intermédio de -OR1- ligam-se à estrutura da fórmula (I). Requisito (3)

[00125] A região (Xc), por intermédio de -OR1-, e a região (X) por intermédio de -OR2- ligam-se à estrutura da fórmula (I), e a região (Yc), por intermédio de -OR1-, e a região (Y) por intermédio de -OR2- ligam-se à estrutura da fórmula (I). Requisito (4)

[00126] A região (Xc), por intermédio de -OR1-, e a região (X) por intermédio de -OR2- ligam-se à estrutura da fórmula (I), e a região (Yc), por intermédio de -OR2-, e a região (Y) por intermédio de -OR1- ligam-se à estrutura da fórmula (I).

[00127] Em relação à segunda molécula ssPN, um exemplo das moléculas ssPN tendo a região de ligação (Ly) será descrito de acordo com os diagramas esquemáticos na Figura 3. A Figura 3 (A) é um diagrama esquemático mostrando um esboço da ordem de cada região, do lado 5’ para o lado 3’, para a molécula ssPN como um exemplo, e a Figura 3 (B) é um diagrama esquemático mostrando um estado no qual a molécula ssPN forma uma fita duplex dentro da molécula. Tal qual mostrado na Figura 3 (B), na molécula ssPN, fitas duplex são formadas entre a região (Xc) e a região (X) e entre a região (Y) e a região (Yc), e a região Lx e a região Ly assumem estruturas em alça dependendo do comprimento. A Figura 3 mostra exclusivamente a ordem de ligações de cada região e a relação posicional de cada região que forma uma fita duplex e, por exemplo, o comprimento de cada região, a forma da região de ligação e os semelhantes não estão limitados a esses. Além disso, na Figura 3, a região (Xc) é mostrada no lado 5’, mas não

39 / 104 se limita a essa, e a região (Xc) pode estar localizada no lado 3’.

[00128] Na segunda molécula ssPN, os números de nucleotídeos na região (Xc), na região (X), na região (Y) e na região (Yc) não são especialmente limitados. O comprimento de cada região será ilustrado abaixo, mas a presente invenção não se limita a esse.

[00129] A região (Xc) pode ser, por exemplo, complementar à região inteira da região (X). Nesse caso, é preferível que a região (Xc), por exemplo, tenha o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região (X), e que consista em uma sequência nucleotídica complementar à região inteira da região (X). A região (Xc) tem, mais preferivelmente, o mesmo comprimento de nucleotídeo que a região (X), e todos os nucleotídeos na região (Xc) são complementares a todos os nucleotídeos na região (X). Além, nenhum é limitado a isso, por exemplo, um ou diversos nucleotídeos podem não ser complementares.

[00130] A região (Xc) pode igualmente ser, por exemplo, complementar a uma região parcial da região (X). Nesse caso, é preferível que a região (Xc) tenha, por exemplo, o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região parcial da região (X), em outras palavras, que consista em uma sequência de nucleotídeos tendo um comprimento de nucleotídeos com um ou mais nucleotídeos mais curto do que a região (X). A região (Xc) tem, mais preferivelmente, o mesmo comprimento de nucleotídeo que a região parcial da região (X), e todos os nucleotídeos na região (Xc) são complementares a todos os nucleotídeos na região parcial da região (X). É preferível que a região parcial da região (X) seja, por exemplo, uma região que consiste em uma sequência de nucleotídeos vindo desde o nucleotídeo final (o primeiro nucleotídeo) no lado da região (Xc) na região (X).

[00131] A região (Yc) pode ser, por exemplo, complementar à região inteira da região (Y). Nesse caso, é preferível que a região (Yc) tenha, por exemplo, o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região (Y), e que

40 / 104 consista em uma sequência nucleotídica complementar à região inteira da região (Y). A região (Yc) tem, mais preferivelmente, o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região (Y) e todos os nucleotídeos na região (Yc) são complementares a todos os nucleotídeos na região (Y). Além disso, nenhum se limita a isso, por exemplo, um ou diversos nucleotídeos podem não ser complementares.

[00132] A região (Yc) pode igualmente ser, por exemplo, complementar a uma região parcial da região (Y). Nesse caso, a região (Yc) tem, por exemplo, o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região parcial da região (Y) e, em outras palavras, é preferível que consista em uma sequência nucleotídica tendo um comprimento de nucleotídeos com um ou mais nucleotídeos mais curto que a região (Y). A região (Yc) tem, mais preferivelmente, o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região parcial da região (Y), e todos os nucleotídeos na região (Yc) são complementares a todos os nucleotídeos na região parcial da região (Y). É preferível que a região parcial da região (Y) seja, por exemplo, uma região que consiste em uma sequência nucleotídica vindo desde o nucleotídeo final (o primeiro nucleotídeo) no lado da região (Yc) na região (Y).

[00133] Na segunda molécula ssPN, a relação entre o número de nucleotídeos (Z) na região interna (Z) e o número de nucleotídeos (X) na região (X) e o número de nucleotídeos (Y) na região (Y), e a relação entre o número de nucleotídeos (Z) na região interna (Z) e o número de nucleotídeos (Xc) na região (Xc) e o número de nucleotídeos (Yc) na região (Yc) satisfaz, por exemplo, os requisitos das fórmulas (1) e (2) seguintes. Z = X + Y ... (1) Z ≥ Xc + Yc ... (2)

[00134] Na segunda molécula ssPN, a relação entre o número de nucleotídeos (X) na região (X) e o número de nucleotídeos (Y) na região (Y) não é especialmente limitada, e por exemplo, satisfaz qualquer um dos

41 / 104 requisitos das fórmulas seguintes. X = Y ... (19) X < Y ... (20) X > Y ... (21)

[00135] Na segunda molécula ssPN, a relação entre o número de nucleotídeos (X) na região (X), o número de nucleotídeos (Xc) na região (Xc), o número de nucleotídeos (Y) na região (Y) e o número de nucleotídeos (Yc) na região (Yc) satisfaz, por exemplo, qualquer um dos requisitos de (a) a (d) a seguir.

[00136] (a) Satisfaz os requisitos das fórmulas (3) e (4) seguintes. X > Xc ... (3) Y = Yc ... (4)

[00137] (b) Satisfaz os requisitos das fórmulas (5) e (6) seguintes. X = Xc ... (5) Y > Yc ... (6)

[00138] (c) Satisfaz os requisitos das fórmulas (7) e (8) seguintes. X > Xc ... (7) Y > Yc ... (8)

[00139] (d) Satisfaz os requisitos das fórmulas (9) e (10) seguintes. X = Xc ... (9) Y = Yc ... (10)

[00140] No (a) ao (d), é preferível que a diferença entre o número de nucleotídeos (X) na região (X) e o número de nucleotídeos (Xc) na região (Xc) e a diferença entre o número de nucleotídeos (Y) na região (Y) e o número de nucleotídeos (Yc) na região (Yc) satisfaçam, por exemplo, os requisitos a seguir.

[00141] (a) Satisfaçam os requisitos das fórmulas (11) e (12) seguintes.

[00142] X - Xc = 1 a 10, de preferência 1, 2, 3 ou 4, mais preferivelmente 1, 2 ou 3 ... (11)

42 / 104 Y - Yc = 0 ... (12)

[00143] (b) Satisfaçam os requisitos das fórmulas (13) e (14) seguintes. X - Xc = 0 ... (13) Y - Yc = 1 a 10, de preferência 1, 2, 3 ou 4, mais preferivelmente 1, 2 ou 3 ... (14)

[00144] (c) Satisfaçam os requisitos das fórmulas (15) e (16) seguintes.

[00145] X - Xc = 1 a 10, de preferência, 1, 2 ou 3, mais preferivelmente 1 ou 2 ... (15) Y - Yc = 1 a 10, de preferência, 1, 2 ou 3, mais preferivelmente 1 ou 2 ... (16)

[00146] (d) Satisfaçam os requisitos das fórmulas (17) e (18) seguintes. X - Xc = 0 ... (17) Y - Yc = 0 ... (18)

[00147] Em relação às segundas moléculas ssPN do (a) ao (d), um exemplo de cada estrutura será descrito de acordo com diagramas esquemáticos na Figura 4. A Figura 4 representa ssPNs contendo a região de ligação (Lx) e a região de ligação (Ly): (A) é um exemplo de moléculas ssPN do (a); (B) é um exemplo de moléculas ssPN do (b); (C) é um exemplo de moléculas ssPN do (c); e (D) é um exemplo de moléculas ssPN do (d). Na Figura 4, linhas pontilhadas representam um estado em que uma fita duplex é formada através de autoanelamento. Em moléculas ssPN na Figura 4, o número de nucleotídeos (X) na região (X) e o número de nucleotídeos (Y) na região (Y) são representados como “X < Y” da fórmula (20), mas não estão limitados a esse, e podem ser “X = Y” da fórmula (19) ou “X > Y” da fórmula (21). Além disso, a Figura 4 representa diagramas esquemáticos exclusivamente mostrando a relação entre a região (X) e a região (Xc), e a relação entre a região (Y) e a região (Yc) e, por exemplo, o comprimento de cada região, a forma, a presença ou ausência da região de ligação (Ly), ou os semelhantes não se limitam a esses.

43 / 104

[00148] As moléculas ssPN do (a) ao (c) possuem estruturas, por exemplo, nas quais cada uma dentre a região (Xc) com a região (X) e a região (Yc) com região (Y) forma uma fita duplex, havendo, assim nucleotídeos não alinhados com a região (Xc) ou a região (Yc) na região interna (Z); e podem também ser considerados como nucleotídeo não formadores de fitas duplex. Na região interna (Z), os nucleotídeos não alinhados (também referidos como nucleotídeos não formadores de fita duplex) são a seguir referidos como “nucleotídeos livres”. Na Figura 4, a região de nucleotídeos livres é mostrada por “F”. O número de nucleotídeos na região (F) não é especialmente limitado. O número de nucleotídeos (F) na região (F) é, por exemplo, o número de nucleotídeos de “X - Xc” no caso da molécula ssPN do (a), o número de nucleotídeos de “Y - Yc” no caso da molécula ssPN do (b), a soma do número de nucleotídeos de “X - Xc” e do número de nucleotídeos de “Y - Yc” no caso da molécula ssPN no (c).

[00149] Em contraste, a molécula ssPN do (d) possui uma estrutura, por exemplo, na qual a região inteira da região interna (Z) está alinhada com a região (Xc) e a região (Yc), e pode também ser considerada como uma estrutura na qual a região inteira da região interna (Z) forma uma fita duplex. Aqui, na molécula ssPN do (d), a extremidade 5’ da região (Xc) e a extremidade 3’ da região (Yc) não são ligadas.

[00150] A soma do número de nucleotídeos da região (Xc), da região (Yc) e os nucleotídeos livres (F) na região interna (Z) será o número de nucleotídeos na região interna (Z). Assim, os comprimentos da região (Xc) e da região (Yc) são adequadamente determinados, por exemplo, de acordo com o comprimento da região interna (Z) e o número e a posição dos nucleotídeos livres.

[00151] O número de nucleotídeos na região interna (Z) é, por exemplo, 19 nt ou mais. O limite inferior do número de nucleotídeos é, por exemplo, 19 nt, de preferência 20 nt e mais preferivelmente 21 nt. O limite

44 / 104 superior do número de nucleotídeos é, por exemplo, 50 nt, de preferência 40 nt e mais preferivelmente 30 nt. Exemplos específicos do número de nucleotídeos na região interna (Z) são, por exemplo, 19 a 50 nt, 20 a 40 nt, 21 a 30 nt e 21 a 25 nt.

[00152] Se a região interna (Z) contiver a sequência que suprime a expressão, a região interna (Z) pode ser, por exemplo, uma região composta somente pela sequência que suprime a expressão ou por uma região contendo a sequência que suprime a expressão. O número de nucleotídeos da sequência que suprime a expressão é, por exemplo, 15 a 30 nt, de preferência 19 a 25 nt, mais preferivelmente 19 a 23 nt, ainda preferivelmente, 21 nt, 22 nt, 23 nt e de preferência em particular 23 nt. A região interna (Z), se contiver a sequência que suprime a expressão, pode ter ainda uma sequência adicional no lado 5’ e/ou no lado 3’ da sequência que suprime a expressão. O número de nucleotídeos da sequência adicional é, por exemplo, 1 a 31 nt, de preferência 1 a 21 nt, mais preferivelmente 1 a 11 nt, ainda preferivelmente 1 a 7 nt e ainda mais preferivelmente 1 a 3 nt.

[00153] O número de nucleotídeos na região (Xc) é, por exemplo, 1 a 49 nt, de preferência 1 a 39 nt e mais preferivelmente 1 a 29 nt. O número de nucleotídeos na região (Yc) é, por exemplo, 1 a 49 nt, de preferência 1 a 39 nt e mais preferivelmente 1 a 29 nt. É preferível que o número de nucleotídeos de qualquer uma dentre a região (Xc) ou (Yc) seja 1 a 4 nt, ainda preferivelmente 1 nt, 2 nt ou 3 nt.

[00154] O número de nucleotídeos na região interna (Z), na região (Xc) e na região (Yc) pode ser representado, por exemplo, por “Z ≥ Xc + Yc” na fórmula (2). Como exemplo específico, o número de nucleotídeos de “Xc + Yc” é, por exemplo, igual àquele da região interna (Z), ou menos do que na região interna (Z). No último caso, “Z - (Xc + Yc)” é, por exemplo, 1 a 10, de preferência 1 a 4 e mais preferivelmente 1, 2 ou 3. O “Z - (Xc + Yc)” corresponde a, por exemplo, o número de nucleotídeos (F) da região livre (F)

45 / 104 na região interna (Z).

[00155] Na segunda molécula ssPN, os comprimentos da região de ligação (Lx) e da região de ligação (Ly) não são especialmente limitados. A região de ligação (Lx) é como mencionada acima. Se as unidades estruturais da região de ligação (Ly) contiverem um nucleotídeo, o número de nucleotídeos na região de ligação (Ly) tem o limite inferior de, por exemplo, 1 nt, de preferência 2 nt e mais preferivelmente 3 nt; e o limite superior de, por exemplo, 100 nt, de preferência 80 nt e mais preferivelmente 50 nt. Exemplos específicos do número de nucleotídeos em cada uma das regiões de ligação incluem, entre outros, 1 a 50 nt, 1 a 30 nt, 1 a 20 nt, 1 a 10 nt, 1 a 7 nt, e 1 a 4 nt. É preferível que a região de ligação (Ly) seja uma estrutura que não provoque autoanelamento dentro de sua própria região.

[00156] A região de ligação (Ly) pode ser, por exemplo, igual ou diferente da região de ligação (Lx).

[00157] O comprimento total da segunda molécula ssPN não é especialmente limitado. Na segunda molécula ssPN, a soma do número de nucleotídeos (o número de nucleotídeos do comprimento total) tem o limite inferior de, por exemplo, 38 nt, de preferência 42 nt, mais preferivelmente 44 nt, ainda preferivelmente 48 nt e de preferência em particular 50 nt; e o limite superior de, por exemplo, 300 nt, de preferência 200 nt, mais preferivelmente 150 nt, ainda preferivelmente 100 nt e de preferência em particular 80 nt. Exemplos específicos da soma do número de nucleotídeos do comprimento total da segunda molécula ssPN são 38 a 300 nt, 42 a 200 nt, 44 a 150 nt, 48 a 100 nt e 50 a 80 nt. Na segunda molécula ssPN, a soma do número de nucleotídeos, exceto por aqueles na região de ligação (Lx) e na região de ligação (Ly), tem o limite inferior de, por exemplo, 38 nt, de preferência 42 nt, mais preferivelmente 44 nt, ainda preferivelmente 48 nt e de preferência em particular 50 nt; e o limite superior de, por exemplo, 300 nt, de preferência 200 nt, mais preferivelmente 150 nt, ainda preferivelmente 100 nt, ainda mais

46 / 104 preferivelmente 80 nt e de preferência em particular 60 nt. Exemplos específicos da soma do número de nucleotídeos, exceto por aquele na região de ligação (Lx), é 38 a 300 nt, 42 a 200 nt, 44 a 150 nt, 48 a 100 nt, 48 a 80 nt e 50 a 60 nt.

[00158] Na molécula ssPN, é simplesmente necessário que a região de ligação (Lx) tenha a estrutura não nucleotídica, e as unidades da estrutura não são especialmente limitadas. Os exemplos das unidades da estrutura incluem resíduos de nucleotídeos. Os exemplos dos resíduos de nucleotídeos incluem resíduos de ribonucleotídeos e resíduos de desoxirribonucleotídeos. Os exemplos dos resíduos de nucleotídeos incluem resíduos de nucleotídeos não modificados sem qualquer modificação e resíduos de nucleotídeos modificados com modificação. As moléculas ssPN podem, por exemplo, conter o resíduo de nucleotídeo modificado, tornando possível, assim, melhorar a resistência à nuclease e aumentar a estabilidade. A molécula ssPN pode igualmente, por exemplo, conter ainda um resíduo não nucleotídico, excluindo o resíduo de nucleotídeo.

[00159] É preferível que cada uma das unidades da estrutura da região (Xc), da região (X), da região (Y) da região (Yc) seja o resíduo de nucleotídeo. Cada uma das regiões é composta, por exemplo, pelos seguintes resíduos (1) a (3): (1) um resíduo de nucleotídeo não modificado, (2) um resíduo de nucleotídeo modificado, (3) um resíduo de nucleotídeo não modificado e um resíduo de nucleotídeo modificado.

[00160] A região de ligação (Lx), por exemplo, pode ser composta somente pelo resíduo não nucleotídico, ou pode ser composta pelo resíduo não nucleotídico e de nucleotídeo. A região de ligação (Lx) é composta por, por exemplo, os seguintes resíduos (4) a (7): (4) um resíduo não nucleotídico,

47 / 104 (5) um resíduo não nucleotídico e um resíduo de nucleotídeo não modificado, (6) um resíduo não nucleotídico e um resíduo de nucleotídeo modificado, (7) um resíduo não nucleotídico, um resíduo de nucleotídeo não modificado e um resíduo de nucleotídeo modificado.

[00161] As unidades da estrutura da região de ligação (Ly) não são especialmente limitadas, e os exemplos incluem os resíduos de nucleotídeos e os resíduos não nucleotídicos. A região de ligação, por exemplo, pode ser composta somente pelo resíduo de nucleotídeo, ou pode ser composta somente pelo resíduo não nucleotídico, ou pode ser composta pelo resíduo de nucleotídeo e o resíduo não nucleotídico. A região de ligação é composta por, por exemplo, os seguintes resíduos (1) a (7): (1) um resíduo de nucleotídeo não modificado, (2) um resíduo de nucleotídeo modificado, (3) um resíduo de nucleotídeo não modificado e um resíduo de nucleotídeo modificado, (4) um resíduo não nucleotídico, (5) um resíduo não nucleotídico e um resíduo de nucleotídeo não modificado, (6) um resíduo não nucleotídico e um resíduo de nucleotídeo modificado, (7) um resíduo não nucleotídico, um resíduo de nucleotídeo não modificado e um resíduo de nucleotídeo modificado.

[00162] Os exemplos das moléculas ssPN incluem uma molécula composta somente pelos resíduos de nucleotídeos, exceto pela região de ligação (Lx), e uma molécula contendo o resíduo não nucleotídico, excluindo o resíduo de nucleotídeo. Na molécula ssPN, os resíduos de nucleotídeos, por exemplo, podem ser somente os resíduos de nucleotídeos não modificados, ou

48 / 104 podem ser somente os resíduos de nucleotídeos modificados, ou podem ser ambos, o resíduo de nucleotídeo não modificado e o resíduo de nucleotídeo modificado. Se a molécula ssPN contiver o resíduo de nucleotídeo não modificado e o resíduo de nucleotídeo modificado, o número do resíduo de nucleotídeo modificado não é especialmente limitado, mas é, por exemplo, “um ou diversos”, especialmente, por exemplo, 1 a 5, de preferência 1 a 4, mais preferivelmente 1 a 3 e, o mais preferível, 1 ou 2. Se a molécula ssPN contiver o resíduo não nucleotídico, o número do resíduo não nucleotídico não é especialmente limitado, mas é, por exemplo, “um ou diversos”, e especialmente, por exemplo, 1 ou 2.

[00163] Na molécula ssPN, é preferível que o resíduo de nucleotídeo seja, por exemplo, um resíduo de ribonucleotídeo. Nesse caso, a molécula ssPN da presente invenção é também referida como as, por exemplo, “molécula P-ssRNA”. Os exemplos das moléculas P-ssRNA incluem uma molécula composta somente pelos resíduos de ribonucleotídeos, exceto pela região de ligação (Lx), e uma molécula contendo o resíduo não nucleotídico, excluindo o resíduo de ribonucleotídeo. Na molécula P-ssRNA, os resíduos de ribonucleotídeos, por exemplo, podem ser somente os resíduos de ribonucleotídeos não modificados, ou podem ser somente os resíduos de ribonucleotídeos modificados, ou pode conter ambos, o resíduo de ribonucleotídeo não modificado e o resíduo de ribonucleotídeo modificado.

[00164] Se a molécula P-ssRNA contiver, por exemplo, o resíduo de ribonucleotídeo modificado, excluindo o resíduo de ribonucleotídeo não modificado, o número do resíduo de ribonucleotídeo modificado não é especialmente limitado, mas é, por exemplo, “um ou diversos”, especialmente, por exemplo, 1 a 5, de preferência 1 a 4, mais preferivelmente 1 a 3 e, o mais preferível, 1 ou 2. Os exemplos dos resíduos de ribonucleotídeos modificados correspondente aos resíduos de ribonucleotídeos não modificados incluem o resíduo de

49 / 104 desoxirribonucleotídeo com a substituição de um resíduo de ribose por um resíduo de desoxirribose. Se a molécula P-ssRNA contiver, por exemplo, o resíduo de desoxirribonucleotídeo, excluindo o resíduo de ribonucleotídeo não modificado, o número do desoxirribonucleotídeo não é especialmente limitado, mais, por exemplo, “um ou diversos”, especialmente, por exemplo, 1 a 5, de preferência 1 a 4, mais preferivelmente 1 a 3 e, o mais preferível, 1 ou 2.

[00165] As moléculas ssPN preferíveis que suprimem a expressão do gene NEK6 incluem uma molécula de ácido nucleico de fita simples que contém uma sequência que suprime a expressão do gene NEK6 selecionada dentre SEQ ID NOs: 1 a 5, e contém uma região (Xc), uma região de ligação (Lx), uma região (X), uma região (Y), uma região de ligação (Ly) e uma região (Yc) nessa ordem, do lado 5’ para o lado 3’, em que a região (X) e a região (Y) são unidas uma à outra para formar uma região interna (Z), em que a região (Xc) é complementar à região (X), em que a região (Yc) é complementar à região (Y), e em que a região de ligação (Lx) e a região de ligação (Ly) possuem uma estrutura não nucleotídica compreendendo pelo menos um dentre um esqueleto de pirrolidina e um esqueleto de piperidina, e em que a região interna (Z) compreende a sequência que suprime a expressão. (4) Molécula ssNc

[00166] Uma molécula ssNc, que é uma de ácidos nucleicos que suprimem a expressão do gene NEK6, será descrita.

[00167] Uma molécula ssNc significa uma molécula de ácido nucleico RNA de fita simples descrita em WO2012/05368, e é especificamente somo segue.

[00168] A molécula ssNc é um molécula de ácido nucleico de fita

50 / 104 simples contendo uma sequência supressora de expressão que suprime a expressão de um gene alvo, e Contém uma região do lado 5’ (Xc), uma região interna (Z) e uma região do lado 3’ (Yc) nessa ordem, do lado 5’ para o lado 3’, em que a região interna (Z) consiste em uma região interna do lado 5’ (X) ligada a uma região interna do lado 3’ (Y), em que a região do lado 5’ (Xc) é complementar à região interna do lado 5’ (X), em que a região do lado 3’ (Yc) é complementar à região interna do lado 3’ (Y), em que pelo menos uma dentre a região interna (Z), a região do lado 5’ (Xc) e a região do lado 3’ (Yc) contém a sequência que suprime a expressão.

[00169] A molécula ssNc possui a extremidade 5’ e a extremidade 3’ não ligadas, e pode igualmente ser referida como uma molécula de ácido nucleico de fita simples linear. A molécula ssNc da presente invenção, por exemplo, possui a região interna (Z) na qual a região interna 5’ (X) e a região interna 3’ (Y) são ligadas diretamente.

[00170] Na molécula ssNc, a região do lado 5’ (Xc) é complementar à região interna do lado 5’ (X) e a região do lado 3’ (Yc) é complementar à região interna do lado 3’ (Y). Consequentemente, no lado 5’, a região (Xc) dobra-se em direção à região (X), e a região (Xc) e a região (X) podem formar uma fita duplex através de autoanelamento, enquanto que, no lado 3’, a região (Yc) dobra-se em direção à região (Y), e a região (Yc) e a região (Y) podem formar uma fita duplex através de autoanelamento.

[00171] A molécula ssNc pode, assim, formar uma fita duplex dentro de uma molécula e possui uma estrutura nitidamente diferente daquela na qual dois RNAs de fita simples formam um RNA de fita dupla através de anelamento, por exemplo, como os siRNAs utilizados para um RNA

51 / 104 convencional de interferência.

[00172] A sequência que suprime a expressão na molécula ssNc pode empregar a descrição para as moléculas ssPN.

[00173] Estima-se que a molécula ssNc provoque a supressão da expressão do gene NEK6, por exemplo, ao assumir uma estrutura na qual a sequência que suprime a expressão fique disposta em pelo menos uma dentre a região interna (Z), a região do lado 5’ (Xc) e a região do lado 3’ (Yc), levando, assim, à interferência por RNA ou a um fenômeno semelhante à interferência por RNA (fenômeno do tipo interferência por RNA). Aqui, os mecanismos das moléculas ssNc não são igualmente limitado, como o são os casos com mecanismos das moléculas ssPN. A molécula ssNc não é aquela que é introduzida em uma célula, ou semelhantes, como um dsRNA que consiste em dois RNAs de fita simples, tal como o chamado siRNA e, além do mais, a excisão da sequência que suprime a expressão não é necessariamente essencial dentro de uma célula. Assim, pode ser igualmente considerado que as moléculas ssNc tenham, por exemplo, uma função do tipo RNA de interferência.

[00174] Na molécula ssNc, a sequência que suprime a expressão está contida em pelo menos uma dentre a região interna (Z), a região do lado 5’ (Xc) e a região do lado 3’ (Yc). A molécula ssNc, por exemplo, pode ter uma das sequências que suprimem a expressão ou pode ter duas ou mais destas. No último caso, a molécula ssNc, por exemplo, pode ter duas ou mais das sequências iguais que suprimem a expressão do gene NEK6, ou pode ter duas ou mais sequências diferentes que suprimem a expressão do gene NEK6. Se a molécula ssNc tiver duas ou mais das sequências que suprimem a expressão, a localização do posicionamento de cada sequência que suprime a expressão não é especialmente limitada, e pode ser qualquer uma dentre a região da região interna (Z), a região do lado 5’ (Xc) e a região do lado 3’ (Yc), ou pode ser em regiões diferentes.

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[00175] Na região interna (Z), a região interna do lado 5’ (X) e a região interna do lado 3’ (Y) são unidas uma à outra. A região (X) e a região (Y) são, por exemplo, ligadas diretamente, e não possuem qualquer sequência intervindo entre as mesmas. A região interna (Z) é indicada como “consiste na região interna do lado 5’ (X) ligada à região interna do lado 3’ (Y)” a fim de mostrar a relação de sequências da região do lado 5’ (Xc) e da região do lado 3’ (Yc), e não está limitada, pois, na região interna (Z), a região interna do lado 5’ (X) e a região interna do lado 3’ (Y) são regiões separadas, independentes, por exemplo, em uso da molécula ssNc. Em outras palavras, por exemplo, se a região interna (Z) tiver as sequências que suprimem a expressão, as sequências que suprimem a expressão podem estar dispostas ao longo da região (X) e da região (Y) na região interna (Z).

[00176] Na molécula ssNc, a região do lado 5’ (Xc) é complementar à região interna do lado 5’ (X). Aqui, é simplesmente necessário que a região (Xc) tenha uma sequência complementar à região inteira da região (X) ou uma região parcial da mesma, e é preferível que, especialmente, por exemplo, contenha uma sequência complementar à região inteira da região (X) ou região parcial da mesma, ou consista na sequência complementar. A região (Xc) pode ser, por exemplo, totalmente complementar à região complementar inteira ou à região complementar parcial da região (X), ou um ou diversos nucleotídeos podem não ser complementares, mas é preferível que sejam complementares. Na molécula ssNc, a região do lado 3’ (Yc) é complementar à região interna do lado 3’ (Y). Aqui, é simplesmente necessário que a região (Yc) tenha uma sequência complementar à região inteira da região (Y) ou uma região parcial da mesma, e é preferível que, especialmente, por exemplo, contenha uma sequência complementar à região inteira da região (Y) ou uma região parcial da mesma ou que consista na sequência complementar. A região (Yc) pode ser, por exemplo, totalmente complementar à região complementar inteira ou à região complementar parcial da região (Y), ou um

53 / 104 ou diversos nucleotídeos podem não ser complementares, mas é preferível que sejam complementares. Um nucleotídeo ou diversos nucleotídeos significam, por exemplo, 1 a 3 nt, de preferência 1 nt ou 2 nt.

[00177] Na molécula ssNc, a região do lado 5’ (Xc) e a região interna do lado 5’ (X), por exemplo, pode ser ligadas diretamente ou ligadas indiretamente. No primeiro caso, os exemplos de ligações diretas incluem uma ligação fosfodiéster. No último caso, os exemplos incluem uma forma tendo uma região de ligação (Lx) entre a região (Xc) e a região (X) em que a região (Xc) e a região (X) são unidas uma à outra por intermédio da região de ligação (Lx).

[00178] Na molécula ssNc, a região do lado 3’ (Yc) e a região interna do lado 3’ (Y), por exemplo, podem ser ligadas diretamente ou ligadas indiretamente. No primeiro caso, os exemplos de ligações diretas incluem uma ligação fosfodiéster. No último caso, os exemplos incluem uma forma tendo uma região de ligação (Ly) entre a região (Yc) e a região (Y), em que a região (Yc) e a região (Y) são unidas uma à outra por intermédio da região de ligação (Ly).

[00179] A molécula ssNc, por exemplo, pode ter ambas, a região de ligação (Lx) e a região de ligação (Ly), ou pode ter qualquer uma destas. Os últimos casos incluem uma forma que tem a região de ligação (Lx) entre a região do lado 5’ (Xc) e a região interna do lado 5’ (X) e que não tem a região de ligação (Ly) entre a região do lado 3’ (Yc) e a região interna do lado 3’ (Y), em outras palavras, na qual a região (Yc) e a região (Y) são ligadas diretamente. Enquanto isso, os exemplos dos últimos casos incluem uma forma que tem a região de ligação (Ly) entre a região do lado 3’ (Yc) e a região interna do lado 3’ (Y) e que não tem a região de ligação (Lx) entre a região do lado 5’ (Xc) e a região interna do lado 5’ (X), em outras palavras, na qual a região (Xc) e a região (X) são ligadas diretamente.

[00180] É preferível que a região de ligação (Lx) e a região de ligação

54 / 104 (Ly) não possuam uma estrutura que provoque autoanelamento no interior de suas próprias regiões.

[00181] Em relação à molécula ssNc, um exemplo das moléculas ssNc não contendo a região de ligação será descrito de acordo com os diagramas esquemáticos na Figura 5. A Figura 5 (A) é um diagrama esquemático mostrando um esboço da ordem de cada região, do lado 5’ para o lado 3’, da molécula ssNc, e a Figura 5 (B) é um diagrama esquemático mostrando um estado no qual a molécula ssNc forma uma fita duplex dentro da molécula. Tal qual mostrado na Figura 5 (B), na molécula ssNc, a região do lado 5’ (Xc) dobra-se e uma fita duplex é formada entre a região do lado 5’ (Xc) e a região interna do lado 5’ (X); e a região do lado 3’ (Yc) dobra-se e uma fita duplex é formada entre a região do lado 3’ (Yc) e a região interna do lado 3’ (Y). A Figura 5 mostra exclusivamente a ordem de ligações de cada região e a relação posicional de cada região que forma uma fita duplex e, por exemplo, o comprimento de cada região e os semelhantes não se limitam a isso.

[00182] Em relação à molécula ssNc, um exemplo das moléculas ssNc tendo a região de ligação será descrito de acordo com os diagramas esquemáticos na Figura 3. A Figura 3 (A) é um diagrama esquemático mostrando um esboço da ordem de cada região, do lado 5’ para o lado 3’, para a molécula ssNc como um exemplo, e a Figura 3 (B) é um diagrama esquemático mostrando um estado no qual a molécula ssNc forma uma fita duplex dentro da molécula. Tal qual mostrado na Figura 3 (B), na molécula ssNc, fitas duplex são formadas entre a região do lado 5’ (Xc) e a região interna do lado 5’ (X) e entre a região interna do lado 3’ (Y) e a região do lado 3’ (Yc), e as regiões (Lx) e (Ly) assumem estruturas de alças. A Figura 3 mostra exclusivamente a ordem de ligações de cada região e a relação posicional de cada região que forma uma fita duplex e, por exemplo, o comprimento de cada região e os semelhantes não se limitam a isso.

[00183] Na molécula ssNc, os números de nucleotídeos na região do

55 / 104 lado 5’ (Xc), na região interna do lado 5’ (X), na região interna do lado 3’ (Y) e na região do lado 3’ (Yc) não são especialmente limitados e, por exemplo, são como segue.

[00184] A região do lado 5’ (Xc) pode ser, por exemplo, complementar à região inteira da região interna do lado 5’ (X). Nesse caso, é preferível que a região (Xc), por exemplo, tenha o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região (X) e consista em uma sequência nucleotídica complementar à região inteira desde a extremidade 5’ até a extremidade 3’ da região (X). A região (Xc) mais preferivelmente tem o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região (X), e é preferível que todos os nucleotídeos na região (Xc) sejam complementares a todos os nucleotídeos na região (X). Além, nenhum está limitado a isso e, e por exemplo, um ou diversos nucleotídeos podem não ser complementares.

[00185] A região do lado 5’ (Xc) pode igualmente ser, por exemplo, complementar a uma região parcial da região interna do lado 5’ (X). Nesse caso, é preferível que a região (Xc) tenha, por exemplo, o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região parcial da região (X), em outras palavras, consista em uma sequência nucleotídica com comprimento de nucleotídeos um ou mais nucleotídeos mais curto do que a região (X). A região (Xc) mais preferivelmente tem o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região parcial da região (X), e é preferível que todos os nucleotídeos na região (Xc) sejam complementares a todos os nucleotídeos na região parcial da região (X). É preferível que a região parcial da região (X) seja, por exemplo, uma região (segmento) consistindo em uma sequência nucleotídica vindo desde a extremidade 5’ nucleotídeo (o primeiro nucleotídeo) na região (X).

[00186] A região do lado 3’ (Yc) pode ser, por exemplo, complementar à região inteira da região interna do lado 3’ (Y). Nesse caso, é preferível que a região (Yc), por exemplo, tenha o mesmo comprimento de nucleotídeos que a

56 / 104 região (Y) e que consista em uma sequência nucleotídica complementar à região inteira desde a extremidade 5’ até a extremidade 3’ da região (Y). A região (Yc) mais preferivelmente tem o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região (Y), e é preferível que todos os nucleotídeos na região (Yc) sejam complementares a todos os nucleotídeos na região (Y). Além disso, nenhum está limitado a isso e, por exemplo, um ou diversos nucleotídeos podem não ser complementares.

[00187] A região do lado 3’ (Yc) pode igualmente ser, por exemplo, complementar a uma região parcial da região interna do lado 3’ (Y). Nesse caso, é preferível que a região (Yc) tenha, por exemplo, o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região parcial da região (Y), em outras palavras, consista em um sequência nucleotídica com comprimento de nucleotídeos um ou mais nucleotídeos mais curto do que a região (Y). A região (Yc) mais preferivelmente tem o mesmo comprimento de nucleotídeos que a região parcial da região (Y), e é preferível que todos os nucleotídeos na região (Yc) sejam complementares a todos os nucleotídeos na região parcial da região (Y). É preferível que a região parcial da região (Y) seja, por exemplo, uma região (segmento) consistindo em um sequência nucleotídica vindo desde a extremidade 3’ nucleotídeo (o primeiro nucleotídeo) na região (Y).

[00188] Na molécula ssNc, a relação entre o número de nucleotídeos (Z) na região interna (Z) e o número de nucleotídeos (X) na região interna do lado 5’ (X) e o número de nucleotídeos (Y) na região interna do lado 3’ (Y), e a relação entre o número de nucleotídeos (Z) na região interna (Z) e o número de nucleotídeos (Xc) na região interna do lado 5’ (Xc) e o número de nucleotídeos (Yc) na região do lado 5’ (Yc) satisfazem, por exemplo, os requisitos das fórmulas (1) e (2) seguintes. Z = X + Y ... (1) Z ≥ Xc + Yc ... (2)

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[00189] Na molécula ssNc, a relação de comprimento entre o número de nucleotídeos (X) na região interna do lado 5’ (X) e o número de nucleotídeos (Y) na região interna do lado 3’ (Y) não é especialmente limitada, e pode satisfazer, por exemplo, qualquer requisito das fórmulas seguintes. X = Y ... (19) X < Y ... (20) X > Y ... (21)

[00190] Na molécula ssNc, a relação do número de nucleotídeos (X) na região interna do lado 5’ (X), o número de nucleotídeos (Xc) na região do lado 5’ (Xc), o número de nucleotídeos (Y) na região interna do lado 3’ (Y) e o número de nucleotídeos (Yc) na região do lado 3’ (Yc) satisfiz, por exemplo, qualquer requisito do (a) ao (d) seguintes.

[00191] (a) Satisfaz os requisitos das fórmulas (3) e (4) seguintes. X > Xc ... (3) Y = Yc ... (4)

[00192] (b) Satisfaz os requisitos das fórmulas (5) e (6) seguintes. X = Xc ... (5) Y > Yc ... (6)

[00193] (c) Satisfaz os requisitos das fórmulas (7) e (8) seguintes. X > Xc ... (7) Y > Yc ... (8)

[00194] (d) Satisfaz os requisitos das fórmulas (9) e (10) seguintes. X = Xc ... (9) Y = Yc ... (10)

[00195] No (a) ao (d), é preferível que a diferença entre o número de nucleotídeos (X) na região interna do lado 5’ (X) e o número de nucleotídeos (Xc) na região do lado 5’ (Xc), e a diferença entre o número de nucleotídeos (Y) na região interna do lado 3’ (Y) e o número de nucleotídeos (Yc) na

58 / 104 região do lado 3’ (Yc) satisfaçam, por exemplo, os requisitos seguintes.

[00196] (a) Satisfaçam os requisitos das fórmulas (11) e (12) seguintes. X - Xc = 1 a 10, de preferência 1, 2, 3 ou 4, mais preferivelmente 1, 2 ou 3 ... (11) Y - Yc = 0 ... (12)

[00197] (b) Satisfaçam os requisitos das fórmulas (13) e (14) seguintes. X - Xc = 0 ... (13) Y - Yc = 1 a 10, de preferência 1, 2, 3 ou 4, mais preferivelmente 1, 2 ou 3 ... (14)

[00198] (c) Satisfaçam os requisitos das fórmulas (15) e (16) seguintes. X - Xc = 1 a 10, de preferência, 1, 2 ou 3, mais preferivelmente 1 ou 2 ... (15) Y - Yc = 1 a 10, de preferência, 1, 2 ou 3, mais preferivelmente 1 ou 2 ... (16)

[00199] (d) Satisfaçam os requisitos das fórmulas (17) e (18) seguintes. X - Xc = 0 ... (17) Y - Yc = 0 ... (18)

[00200] Em relação às moléculas ssNc do (a) ao (d), um exemplo de cada estrutura será descrito de acordo com os diagramas esquemáticos na Figura 4. A Figura 4 representa ssNcs contendo a região de ligação (Lx) e a região de ligação (Ly): (A) é um exemplo de moléculas ssNc do (a); (B) é um exemplo de moléculas ssNc do (b); (C) é um exemplo de moléculas ssNc do (c); e (D) é um exemplo de moléculas ssNc do (d). Na Figura 4, as linhas tracejadas representam um estado em que uma fita duplex é formada através de autoanelamento. Em moléculas ssNc na Figura 4, o número de nucleotídeos (X) na região interna do lado 5’ (X) e o número de nucleotídeos (Y) na região interna do lado 3’ (Y) são representadas como “X < Y” da fórmula (20), mas não estão limitados a esse, e podem ser “X = Y” da fórmula (19) ou “X > Y” da fórmula (21). Além disso, a Figura 4 representa

59 / 104 diagramas esquemáticos mostrando exclusivamente a relação entre a região interna do lado 5’ (X) e a região do lado 5’ (Xc), e a relação entre a região interna do lado 3’ (Y) e a região do lado 3’ (Yc) e, por exemplo, o comprimento, a forma e os semelhantes não estão limitados a esses, e além disso, a presença e ausência da região de ligação (Lx) e da região de ligação (Ly) não estão igualmente limitados a isso.

[00201] As moléculas ssNc do (a) ao (c) possuem estruturas, por exemplo, nas quais cada uma dentre a região do lado 5’ (Xc) com a região interna do lado 5’ (X) e a região do lado 3’ (Yc) com a região interna do lado 3’ (Y) forma uma fita duplex, havendo, assim, nucleotídeos que não podem ser alinhados com qualquer uma dentre a região do lado 5’ (Xc) e a região do lado 3’ (Yc) na região interna (Z); e podem também ser consideradas como estruturas não formadoras de fitas duplex. Na região interna (Z), os nucleotídeos não alinhados (também referidos como nucleotídeos não formadores de fita duplex) são a seguir referidos como “nucleotídeos livres”. Na Figura 4, a região de nucleotídeos livres é mostrada por “F”. O número de nucleotídeos na região (F) não é especialmente limitado. O número de nucleotídeos (F) na região (F) é, por exemplo, o número de nucleotídeos de “X - Xc” no caso da molécula ssNc do (a), o número de nucleotídeos de “Y - Yc” no caso da molécula ssNc do (b), a soma do número de nucleotídeos de “X - Xc” e o número de nucleotídeos de “Y - Yc” no caso da molécula ssNc do (c).

[00202] Em contraste, a molécula ssNc do (d) possui uma estrutura, por exemplo, na qual a região inteira da região interna (Z) é alinhada com a região do lado 5’ (Xc) e a região do lado 3’ (Yc), e pode também ser considerada como uma estrutura na qual a região inteira da região interna (Z) forma uma fita duplex. Aqui, na molécula ssNc do (d), a extremidade 5’ da região do lado 5’ (Xc) e a extremidade 3’ da região do lado 3’ (Yc) não são ligadas.

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[00203] A soma do número de nucleotídeos na região do lado 5’ (Xc), na região do lado 3’ (Yc) e dos nucleotídeos livres (F) na região interna (Z) será o número de nucleotídeos na região interna (Z). Assim, o comprimento da região do lado 5’ (Xc) e da região do lado 3’ (Yc) é adequadamente determinado, por exemplo, de acordo com o comprimento da região interna (Z) e o número e a posição dos nucleotídeos livres.

[00204] O número de nucleotídeos na região interna (Z) é, por exemplo, 19 nt ou mais. O limite inferior do número de nucleotídeos é, por exemplo, 19 nt, de preferência 20 nt e mais preferivelmente 21 nt. O limite superior do número de nucleotídeos é, por exemplo, 50 nt, de preferência 40 nt e mais preferivelmente 30 nt. Exemplos específicos do número de nucleotídeos na região interna (Z) são, por exemplo, 19 a 50 nt, 20 a 40 nt, 21 a 30 nt e 21 a 23 nt.

[00205] Se a região interna (Z) contiver a sequência que suprime a expressão, a região interna (Z) pode ser, por exemplo, uma região composta somente pela sequência que suprime a expressão, ou uma região contendo a sequência que suprime a expressão. O número de nucleotídeos da sequência que suprime a expressão é, por exemplo, 15 a 30 nt, de preferência 19 a 25 nt, mais preferivelmente 19 a 23 nt, ainda preferivelmente 21, 22, 23 nt e de preferência em particular 23 nt. A região interna (Z), se contiver a sequência que suprime a expressão, pode ter ainda uma sequência adicional no lado 5’ e/ou no lado 3’ da sequência que suprime a expressão. O número de nucleotídeos da sequência adicional é, por exemplo, 1 a 31 nt, de preferência 1 a 21 nt, mais preferivelmente 1 a 11 nt, ainda preferivelmente 1 a 7 nt e ainda mais preferivelmente 1 a 3 nt.

[00206] O número de nucleotídeos na região do lado 5’ (Xc) é, por exemplo, 1 a 49 nt, de preferência 1 a 39 nt e mais preferivelmente 1 a 29 nt. O número de nucleotídeos na região do lado 3’ (Yc) é, por exemplo, 1 a 49 nt, de preferência 1 a 39 nt e mais preferivelmente 1 a 29 nt. É preferível que o

61 / 104 número de nucleotídeos de qualquer uma dentre a região do lado 5’ (Xc) e a região do lado 3’ (Yc) sejam1 a 4 nt, ainda preferivelmente 1 nt, 2 nt ou 3 nt.

[00207] O número de nucleotídeos na região interna (Z), na região do lado 5’ (Xc) e na região do lado 3’ (Yc) pode ser representado, por exemplo, por “Z ≥ Xc + Yc” na fórmula (2). Como um exemplo específico, o número de nucleotídeos de “Xc + Yc” é, por exemplo, igual ao da região interna (Z), ou menos do que na região interna (Z). No último caso, “Z - (Xc + Yc)” é, por exemplo, 1 a 10, de preferência 1 a 4 e mais preferivelmente 1, 2 ou 3. O “Z - (Xc + Yc)” corresponde a, por exemplo, o número de nucleotídeos (F) da região livre (F) na região interna (Z).

[00208] Na molécula ssNc, os comprimentos da região de ligação (Lx) e da região de ligação (Ly) não são especialmente limitados. É preferível que a região de ligação (Lx), por exemplo, seja suficientemente longa para que a região interna do lado 5’ (X) e a região do lado 5’ (Xc) formem uma fita duplex, e que a região de ligação (Ly), por exemplo, seja suficientemente longa para que a região interna do lado 3’ (Y) e a região do lado 3’ (Yc) formem uma fita duplex. Se as unidades da estrutura da região de ligação (Lx) e da região de ligação (Ly) contiverem um nucleotídeo, cada um dos números de nucleotídeos na região de ligação (Lx) e na região de ligação (Ly) pode ser igual ou diferente, e as suas sequências nucleotídicas podem também ser iguais ou diferentes. Os números de nucleotídeos na região de ligação (Lx) e na região de ligação (Ly) têm o limite inferior de, por exemplo, 1 nt, de preferência 2 nt e mais preferivelmente 3 nt, e o limite superior de, por exemplo, 100 nt, de preferência 80 nt e mais preferivelmente 50 nt. Exemplos específicos dos números de nucleotídeos em cada uma das regiões de ligação incluem, entre outros, 1 a 50 nt, 1 a 30 nt, 1 a 20 nt, 1 a 10 nt, 1 a 7 nt e 1 a 4 nt.

[00209] O comprimento total da molécula ssNc não é especialmente limitado. Na molécula ssNc da presente invenção, a soma do número de

62 / 104 nucleotídeos (o número de nucleotídeos do comprimento total) descrita acima tem o limite inferior de, por exemplo, 38 nt, de preferência 42 nt, mais preferivelmente 50 nt, ainda preferivelmente 51 nt e de preferência em particular 52 nt; e o limite superior de, por exemplo, 300 nt, de preferência 200 nt, mais preferivelmente 150 nt, ainda preferivelmente 100 nt, ainda mais preferivelmente 80 nt e de preferência em particular 60 nt. Exemplos específicos da soma do número de nucleotídeos do comprimento total da molécula ssNc inclui 38 a 300 nt, 42 a 200 nt, 50 a 150 nt, 51 a 100 nt e 52 a 80 nt. Na molécula ssNc, a soma do número de nucleotídeos, exceto por aqueles na região de ligação (Lx) e na região de ligação (Ly), tem o limite inferior de, por exemplo, 38 nt, de preferência 42 nt, mais preferivelmente 50 nt, ainda preferivelmente 51 nt e de preferência em particular 52 nt; e o limite superior de, por exemplo, 300 nt, de preferência 200 nt, mais preferivelmente 150 nt, ainda preferivelmente 100 nt, ainda mais preferivelmente 80 nt e de preferência em particular 60 nt. Exemplos específicos da soma do número de nucleotídeos, exceto por aquele na região de ligação (Lx), incluem 38 a 300 nt, 42 a 200 nt, 50 a 150 nt, 51 a 100 nt, 52 a 80 nt e 52 a 60 nt.

[00210] Os exemplos dos resíduos de nucleotídeos, que são as principais unidades da estrutura da molécula ssNc, incluem resíduos de ribonucleotídeos e resíduos de desoxirribonucleotídeos. Os exemplos dos resíduos de nucleotídeos incluem resíduos de nucleotídeos não modificados sem modificação e resíduos de nucleotídeos modificados com modificação. As moléculas ssNc podem, por exemplo, conter o resíduo de nucleotídeo modificado, tornando possível, assim, melhorar a resistência à nuclease e aumentar a estabilidade. A molécula ssNc da presente invenção pode igualmente, por exemplo, conter ainda um resíduo não nucleotídico, excluindo o resíduo de nucleotídeo.

[00211] Na molécula ssNc, é preferível que as unidades da estrutura de cada uma dentre a região interna (Z), a região do lado 5’ (Xc) e a região do

63 / 104 lado 3’ (Yc) sejam os resíduos de nucleotídeos. Cada uma das regiões é composta por, por exemplo, resíduos dos seguintes (1) a (3): (1) um resíduo de nucleotídeo não modificado, (2) um resíduo de nucleotídeo modificado, (3) um resíduo de nucleotídeo não modificado e um resíduo de nucleotídeo modificado.

[00212] Na molécula ssNc, as unidades da estrutura da região de ligação (Lx) e a região de ligação (Ly) não são especialmente limitadas, e os exemplos incluem o resíduo de nucleotídeo e o resíduo não nucleotídico. A região de ligação, por exemplo, pode ser composta somente pelo resíduo de nucleotídeo, ou pode ser composta somente pelo resíduo não nucleotídico, ou pode ser composta pelo resíduo de nucleotídeo e pelo resíduo não nucleotídico. A região de ligação é composta por, por exemplo, resíduos dos seguintes (1) a (7).

[00213] (1) um resíduo de nucleotídeo não modificado, (2) um resíduo de nucleotídeo modificado, (3) um resíduo de nucleotídeo não modificado e um resíduo de nucleotídeo modificado, (4) um resíduo não nucleotídico, (5) um resíduo não nucleotídico e um resíduo de nucleotídeo não modificado, (6) um resíduo não nucleotídico e um resíduo de nucleotídeo modificado, (7) um resíduo não nucleotídico, um resíduo de nucleotídeo não modificado, e um resíduo de nucleotídeo modificado.

[00214] Se a molécula ssNc tiver ambas, a região de ligação (Lx) e a região de ligação (Ly), por exemplo, as unidades da estrutura de ambas podem ser iguais ou diferentes. Exemplos específicos incluem uma forma na qual as unidades da estrutura de ambas as regiões de ligação são os resíduos

64 / 104 de nucleotídeos, uma forma na qual as unidades da estrutura de ambas as regiões de ligação são os resíduos não nucleotídicos, uma forma na qual uma unidade da estrutura de uma região é o resíduo de nucleotídeo enquanto uma unidade da estrutura da outra região de ligação é o resíduo não nucleotídico.

[00215] Os exemplos das moléculas ssNc incluem uma molécula composta somente pelos resíduos de nucleotídeos e uma molécula contendo o resíduo não nucleotídico, excluindo o resíduo de nucleotídeo. Na molécula ssNc da presente invenção, o resíduo de nucleotídeo, por exemplo, pode ser somente os resíduos de nucleotídeos não modificados, ou pode ser somente os resíduos de nucleotídeos modificados, ou pode ser ambos, o resíduo de nucleotídeo não modificado e o resíduo de nucleotídeo modificado. Se a molécula ssNc contiver o resíduo de nucleotídeo não modificado e o resíduo de nucleotídeo modificado, o número dos resíduos de nucleotídeos modificados não é especialmente limitado, mas é, por exemplo, “um ou diversos”, especificamente, por exemplo, 1 a 5, de preferência 1 a 4, mais preferivelmente 1 a 3 e, o mais preferível, 1 ou 2. Se a molécula ssNc contiver o resíduo não nucleotídico, o número dos resíduos não nucleotídicos não é especialmente limitado, mas é, por exemplo, “um ou diversos”, especialmente, por exemplo, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1, 2 ou 3.

[00216] Na molécula ssNc, é preferível que o resíduo de nucleotídeo seja, por exemplo, um resíduo de ribonucleotídeo. Nesse caso, a molécula ssNc da presente invenção é também referida como, por exemplo, “molécula N-ssRNA”. Os exemplos das moléculas N-ssRNA incluem uma molécula composta somente pelos resíduos de ribonucleotídeos, e uma molécula contendo o resíduo não nucleotídico, excluindo o resíduo de ribonucleotídeo. Na molécula N-ssRNA, os resíduos de ribonucleotídeos, por exemplo, podem ser somente os resíduos de ribonucleotídeos não modificados, podem ser somente os resíduos de ribonucleotídeos modificados, ou pode conter ambos, o resíduo de ribonucleotídeo não modificado e o resíduo de ribonucleotídeo

65 / 104 modificado.

[00217] Se a molécula N-ssRNA contiver, por exemplo, o resíduo de ribonucleotídeo modificado, excluindo o resíduo de ribonucleotídeo não modificado, o número dos resíduos de ribonucleotídeos modificados não é especialmente limitado, mas é, por exemplo, “um ou diversos”, especialmente, por exemplo, 1 a 5, de preferência 1 a 4, mais preferivelmente 1 a 3 e, o mais preferível, 1 ou 2. O resíduo de ribonucleotídeo modificado correspondente ao resíduo de ribonucleotídeo não modificado pode ser, por exemplo, o resíduo de desoxirribonucleotídeo no qual um resíduo de ribose é substituído por um resíduo de desoxirribose. Se a molécula N-ssRNA contiver, por exemplo, o resíduo de desoxirribonucleotídeo, excluindo o resíduo de ribonucleotídeo não modificado, o número dos resíduos de desoxirribonucleotídeos não é especialmente limitado, e é, por exemplo, “um ou diversos”, especialmente, por exemplo, 1 a 5, de preferência 1 a 4, mais preferivelmente 1 a 3 e, o mais preferível, 1 ou 2. (5) Método de síntese da molécula ssPN e molécula ssNc

[00218] Os métodos de síntese das moléculas ssPN e moléculas ssNc não são especialmente limitados, e podem empregar métodos convencionais conhecidos. Os exemplos dos métodos de síntese incluem um método de síntese por uma técnica de engenharia genética e um método de síntese química. Os exemplos de técnicas de engenharia genética incluem um método de síntese com transcrição in vitro, um método utilizando um vetor e um método por um cassete de PCR. O vetor não é especialmente limitado, e os exemplos incluem vetores não virais, tais como plasmídeos, e vetores virais. O método de síntese química não é especialmente limitado, e os exemplos incluem um método com fosforamidita e um método com H-fosfonato. O método de síntese química pode utilizar, por exemplo, um sintetizador automático de ácidos nucleicos, disponível comercialmente. No método de síntese química, em geral, é utilizada amidita. A amidita não é especialmente

66 / 104 limitada, e os exemplos de amiditas disponíveis comercialmente incluem RNA-Fosforamiditas (2’-O-TBDMSi, nome comercial, Samchully Pharmaceutical Co., Ltd), ACE amidita, TOM amidita, CEE amidita, CEM amidita e TEM amidita. Além disso, a molécula ssPN e a molécula ssNc da presente invenção podem ser produzidas de acordo com métodos de produção descritos em WO2012/05368, WO2012/17919, WO2013/27843, e WO2016/159374. (6) Polinucleotídeo antisense

[00219] Um polinucleotídeo antisense, que é um de ácidos nucleicos que suprimem a expressão do gene NEK6, será descrito abaixo.

[00220] Um polinucleotídeo antisense é um DNA antisense e/ou um RNA antisense, e exerce um efeito ao ser introduzido em uma célula, um ácido nucleico antisense contra todo ou uma parte de um RNA do gene alvo.

[00221] Os mecanismos de inibição da expressão por um polinucleotídeo antisense incluem: 1) inibição estérica de um complexo de iniciação da tradução, pelo direcionamento para uma região desde o sítio 5’ cap do mRNA até aproximadamente 25 nt a jusante do códon de iniciação como uma sequência alvo, 2) degradação do mRNA por intermédio de RNaseH com um DNA de fita simples complementar a um mRNA alvo e 3) inibição do splicing que direciona para um região limite entre um éxon e um íntron de um pré-mRNA como uma sequência alvo (inibição da maturação do mRNA), mas o mecanismo não é especialmente limitado, desde que suprima a expressão do gene NEK6.

[00222] É preferível que o polinucleotídeo antisense contenha um resíduo de nucleotídeo modificado em vista da estabilidade de ligação com RNA (tal como valor de Tm), capacidade para reconhecimento de erro de

67 / 104 pareamento de sequências, resistência à nuclease, atividade de RNaseH e outros.

[00223] Para o resíduo de nucleotídeo modificado, a modificação em um resíduo de ribose e um esqueleto de fosfato é preferível. (7) miRNA

[00224] Um miRNA, que é aquele de ácidos nucleicos que suprimem a expressão do gene NEK6, será descrito abaixo.

[00225] Um miRNA participa na regulação da expressão gênica através da inibição da tradução de mRNA em proteína ou na degradação do mRNA. Um miRNA é um RNA de cadeia curta (20 a 25 nt) não codificador, presente dentro de uma célula. Inicialmente, um miRNA é transcrito como um pri-RNA de fita simples que contém um miRNA e a fita complementar do mesmo, e pode assumir uma estrutura em alça do tipo grampo de cabelo do DNA. Em seguida, o pri-RNA é cortado com uma parte por uma enzima denominada Drosha dentro de um núcleo, convertido em um pré-RNA e transportado para fora do núcleo. Depois, o pré-RNA é clivado mais por Dicer, funcionado, assim, como um miRNA. O miRNA executa a ligação por hibridização incompleta à região não traduzida 3’ do mRNA e inibe a síntese da proteína codificada pelo mRNA.

[00226] O miRNA que suprime a expressão do gene NEK6 pode ser obtido com base no nome do gene ou informações sobre a sequência de mRNA de um gene alvo, por exemplo, de acordo com uma base de dados tal como miRDB (http://mirdb.org/miRDB/index.html). (8) Resíduos de nucleotídeos utilizados para ácido nucleico

[00227] O resíduo de nucleotídeo, utilizado para um ácido nucleico como ingrediente ativo da presente invenção, contém um açúcar, uma base e fosfato como componentes. Os exemplos dos resíduos de nucleotídeos incluem resíduos de ribonucleotídeos e resíduos de desoxirribonucleotídeos. O resíduo de ribonucleotídeo, por exemplo, possui um resíduo de ribose,

68 / 104 como açúcar, e possui adenina (A), guanina (G), citosina (C) e uracila (U), como base; e o resíduo de desoxirribose, por exemplo, possui um resíduo de desoxirribose, como açúcar, e possui adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) como base.

[00228] Os resíduos de nucleotídeos incluem resíduos de nucleotídeos não modificados e resíduos de nucleotídeos modificados. No resíduo de nucleotídeo não modificado, cada um dos componentes é, por exemplo, idêntico ou substancialmente idêntico àquele natural e, de preferência, idêntico ou substancialmente idêntico àquele natural no corpo humano.

[00229] O resíduo de nucleotídeo modificado é, por exemplo, um resíduo de nucleotídeo no qual o resíduo de nucleotídeo não modificado é modificado. No nucleotídeo modificado, por exemplo, qualquer um dos componentes no resíduo de nucleotídeo não modificado pode ser modificado. Na presente invenção, “modificação” representa, por exemplo, substituição, adição e/ou deleção do componente, e substituição, adição e/ou deleção de um átomo e/ou de um grupo funcional no componente, e pode ser referido como “alteração”. Os exemplos dos resíduos de nucleotídeos modificados incluem um resíduo de nucleotídeo de ocorrência natural e um resíduo de nucleotídeo modificado artificialmente. Em relação ao resíduo de nucleotídeo modificado originado naturalmente pode ser feita referência a, por exemplo, Limbach et al. (Limbach et al., 1994, Summary: the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res., 22:2183-2196). Além disso, o resíduo de nucleotídeo modificado pode ser, por exemplo, um resíduo alternativo do nucleotídeo.

[00230] Os exemplos de modificações dos resíduos de nucleotídeos incluem modificação de um esqueleto ribose-fosfato (a seguir referido como um esqueleto ribofosfato).

[00231] No esqueleto ribofosfato, por exemplo, um resíduo de ribose pode ser modificado. O resíduo de ribose pode ser, por exemplo, modificado no carbono da posição 2’, e pode ser especificamente, por exemplo,

69 / 104 substituído em um grupo hidroxila ligado ao carbono 2’ por hidrogênio ou flúor. Ao se substituir um grupo hidroxila no carbono 2’ por hidrogênio, um resíduo de ribose pode ser substituído por desoxirribose. O resíduo de ribose pode ser, por exemplo, substituído por um estereoisômero e, pode ser, por exemplo, substituído por um resíduo de arabinose.

[00232] O esqueleto ribofosfato pode ser substituído, por exemplo, por um esqueleto não ribofosfato tendo um resíduo não de ribose e/ou não fosfato. Os exemplos dos esqueletos não ribofosfato incluem uma forma sem carga do esqueleto ribofosfato. Os exemplos de alternativas ao nucleotídeo tendo substituição pelo esqueleto não ribofosfato incluem morfolino, ciclobutila e pirrolidina. Além desses, os exemplos das alternativas incluem resíduos artificiais de monômeros de ácido nucleico. Os exemplos específicos incluem PNA (Ácido nucleico peptídico), LNA (Ácido nucleico bloqueado) e ENA (Ácidos nucleicos ligados em ponte com 2’-O, 4’-C-Etileno), e um preferível é PNA.

[00233] No esqueleto ribofosfato, por exemplo, um grupo fosfato pode ser modificado. No esqueleto ribofosfato, um grupo fosfato mais próximo a um resíduo de açúcar é referido como grupo α fosfato. O grupo α fosfato é carregado negativamente, e as cargas elétricas são distribuídas uniformemente nos dois átomos de oxigênio não ligados ao resíduo de açúcar. Entre os quatro átomos de oxigênio no grupo α fosfato, dois átomos de oxigênio não ligados ao resíduo de açúcar em uma ligação fosfodiéster entre os resíduos de nucleotídeos são também referidos abaixo como “oxigênio não ligantes (não vinculantes)”. Em contraste, dois átomos de oxigênio ligados ao resíduo de açúcar na ligação fosfodiéster entre os resíduos de nucleotídeos são referidos abaixo como “oxigênio ligante (vinculante)”. É preferível que o grupo α fosfato seja submetido a, por exemplo, uma modificação para passar a não ter carga ou uma modificação para permitir que a distribuição de cargas elétricas no átomo não ligado seja do tipo assimétrico.

70 / 104

[00234] O grupo fosfato pode ser substituído, por exemplo, no oxigênio não ligante. O oxigênio pode ser, por exemplo, substituído por qualquer átomo dentre S (enxofre), Se (selênio), B (boro), C (carbono), H (hidrogênio), N (nitrogênio) e OR (R é, por exemplo, um grupo alquila ou um grupo arila), e preferivelmente substituído por S. É preferível que, nos oxigênios não ligantes, por exemplo, ambos sejam substituídos, e mais preferivelmente, ambos sejam substituídos por S. Os exemplos dos grupos fosfato modificados incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosfoselenato, boranofosfato, boranofosfato éster, hidrogenofosfonato, fosforamidato, alquila ou arilfosfonato e fosfotriéster, e entre estes, é preferível fosforoditioato no qual ambos os oxigênios não ligantes são substituídos por S.

[00235] O grupo fosfato pode ser substituído, por exemplo, no oxigênio ligante. O oxigênio pode ser substituído por, por exemplo, qualquer átomo dentre S (enxofre), C (carbono) e N (nitrogênio). Os exemplos dos grupos fosfato modificados incluem um fosforamidato reticulado tendo uma substituição com N, um fosforotioato reticulado tendo uma substituição com S e um metilenofosfonato reticulado tendo uma substituição com C. É preferível que a substituição do oxigênio ligante seja feita, por exemplo, em pelo menos um dentre o resíduo de nucleotídeo da extremidade 5’ e o resíduo de nucleotídeo da extremidade 3’ da molécula ssPN da presente invenção; no caso do lado 5’, a substituição por C é preferível e, no caso do lado 3’, a substituição por N é preferível.

[00236] O grupo fosfato pode ser substituído com, por exemplo, o ligante sem fósforo descrito acima. Os ligantes incluem, por exemplo, siloxano, carbonato, carboximetila, carbamato, amida, tio éter, ligante de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formacetal, oxima, metilenoimino, metilenometilimino, metileno-hidrazo, metilenodimetil- hidrazo e metileno-oximetilimino e, preferivelmente, incluem um grupo

71 / 104 metilenocarbonilamino e um grupo metilenometilimino.

[00237] Os exemplos de modificações do resíduo de nucleotídeo final incluem a adição de outra molécula. Os exemplos das outras moléculas incluem moléculas funcionais, tais como uma substância de marcação, e um grupo protetor como mencionado acima. Os exemplos dos grupos protetores incluem um grupo contendo S (enxofre), Si (silício), B (boro) e um éster.

[00238] A outra molécula, por exemplo, pode ser adicionada a um grupo fosfato do resíduo de nucleotídeo, ou pode ser adicionada ao grupo fosfato ou ao resíduo de açúcar por intermédio de um espaçador. Um átomo final do espaçador pode ser adicionado ou substituído com, por exemplo, o oxigênio ligante do grupo fosfato, ou O, N, S ou C de um resíduo de açúcar. É preferível que o sítio de ligação do resíduo de açúcar seja, por exemplo, C da posição 3’ ou C da posição 5’, ou um átomo ligado ao mesmo. O espaçador pode também ser adicionado ou substituído com, por exemplo, um átomo final do nucleotídeo alternativo tal como o PNA.

[00239] O espaçador não é especialmente limitado, e pode conter, por exemplo, -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, O(CH2CH2O)nCH2CH2OH, açúcar não de bases, amida, carbóxi, amina, oxiamina, oxiimina, tioéter, dissulfeto, tioureia, sulfonamida, morfolino e um reagente de biotina, um reagente de fluoresceína. Na fórmula, n é um número inteiro positivo, e n = 3 ou 6 é preferível.

[00240] Além desses, os exemplos das moléculas a serem adicionadas à extremidade incluem corantes, intercalantes (por exemplo, acridina), reticulantes (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirina (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarboneto aromático policíclico (por exemplo, fenadina, dihidrofenadina), endonucleases artificiais (por exemplo, EDTA), carreadores lipofílicos (por exemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantanoacético, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis- O(hexadecil)glicerol, um grupo geraniloxi-hexila, hexadecilglicerol, borneol,

72 / 104 mentol, 1,3-propanodiol, um grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)cólico, dimetoxitritila ou fenoxazina) e complexos peptídicos (por exemplo, peptídeos Antennapedia, peptídeos Tat), alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquila, alquila substituídos, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), aceleradores de transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico) e ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agrupamentos de imidazol, complexos acridina- imidazol, complexos de Eu3+ tetra-aza-macrocíclico).

[00241] A molécula de ácido nucleico pode ser modificada na extremidade 5’ com, por exemplo, um grupo fosfato ou um análogo do grupo fosfato. Os exemplos do grupo fosfato include 5’ monofosfato ((HO)2(O)P-O- 5’), 5’ difosfato ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’), 5’ trifosfato ((HO)2(O)P-O- (HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’), caps 5’-guanosina (7-metilado ou não metilado, 7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’), caps 5’- adenosina (Appp), qualquer estrutura de cap de nucleotídeo modificado ou não modificado (N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’), 5’- tiofosfato (fosforotioato: (HO)2(S)P-O-5’), 5’-ditiofosfato (fosforoditioato: (HO)(HS)(S)P-O-5’), ácido 5’-fosforotiólico ((HO)2(O)P-S-5’), monofosfato, difosfato e trifosfato substituídos com enxofre (tal como 5’-α-tiotrifosfato ou 5’-γ-tiotrifosfato), 5’-fosforamidato ((HO)2(O)P-NH-5’, (HO)(NH2)(O)P-O- 5’), 5’-alquilfosfonato (por exemplo, RP(OH)(O)-O-5’, (OH)2(O)P-5’-CH2, em que R é alquila [tal como metila, etila, isopropila ou propila]) e 5’-alquil- éterfosfato (por exemplo, RP(OH)(O)-O-5’, em que R é alquil éter [tal como metoximetila ou etoximetila]).

[00242] No resíduo de nucleotídeo, a base não é especialmente limitada. A base pode ser, por exemplo, uma base natural ou uma base não natural. A base pode ser, por exemplo, originada naturalmente ou uma

73 / 104 sintetizada. A base pode empregar, por exemplo, uma base comum ou um análogo modificado da mesma.

[00243] Os exemplos das bases incluem bases purínicas tais como adenina e guanina, e bases pirimidínicas tais como citosina, uracila e timina. Outras bases incluem inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina e tubercidina. Os exemplos das bases include alquil derivados tais como 2-amino adenina, purina 6-metilada; alquil derivados tais como purina 2-propilada; 5-halouracila e 5-halocitosina; 5-propiniluracila e 5- propinilcitosina; 6-azouracila, 6-azocitosina e 6-azotimina; 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 5-halouracila, 5-(2-aminopropil)uracila, 5- aminoalil uracila; purinas 8-haloato, aminada, tiolada, tioalquilada, hidroxilada e outras 8-substituídas; pirimidinas 5-trifluorometiladas e outras 5-substituídas; 7-metilguanina; pirimidina 5-substituída; 6-azapirimidina; purina N-2, N-6 e O-6 substituída (incluindo 2-amino propiladenina); 5- propiniluracila e 5-propinilcitosina; dihidrouracila; 3-deaza-5-azacitosina; 2- amino purina; 5-alquil uracila; 7-alquil guanina; 5-alquil citosina; 7-deaza- adenina; N6,N6-dimetiladenina; 2,6-diaminopurina; 5-amino-alil-uracila; N3- metiluracila; 1,2,4-triazol substituído; 2-piridinona; 5-nitroindol; 3-nitropirrol; 5-metoxiuracila; ácido uracil-5-oxiacético; 5-metoxicarbonilmetiluracila; 5- metil-2-tiouracila; 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouracila; 5-metilaminometil-2- tiouracila; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracila; 3-metilcitosina; 5- metilcitosina; N4-acetilcitosina; 2-tiocitosina; N6-metiladenina; N6- isopentiladenina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenina; N-metilguanina; e bases O-alquiladas. Além disso, os exemplos de purinas e pirimidinas incluem aqueles descritos na Patente U.S. No 3 687 808, “Concise Enciclopedia Of Polymer Science and Engineering”, p. 858-859, ed. Kroschwitz J.I., John Wiley & Sons, 1990, e Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, p.613. (9) Definição de outros termos

74 / 104

[00244] Os termos usados em descrições dos ácidos nucleicos como ingrediente ativo da presente invenção, ligante e outros são aqueles comumente usados na técnica e, por exemplo, podem ser mostrados como segue.

[00245] Na presente invenção, “alquila” inclui, por exemplo, grupos alquila lineares ou ramificados. O número de carbonos do alquila não é especialmente limitado, mas é, por exemplo, 1 a 30 e, preferivelmente, 1 a 6 ou 1 a 4. Os exemplos dos grupos alquila incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, neopentila, n-hexila, isohexila, n-heptila, n-octila, n-nonila, n-decila. De preferência, os exemplos incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, neopentila, n-hexila e isohexila.

[00246] Na presente invenção, “alquenila” inclui, por exemplo, alquenilas lineares ou ramificados. O alquenila inclui aqueles com uma ou mais ligações duplas, ou os semelhantes, no alquila. O número de carbonos do alquenila não é especialmente limitado, mas é, por exemplo, semelhante àquele no alquila e, preferivelmente 2-8. Os exemplos do alquenila incluem vinila, 1-propenila, 2-propenila, 1-butenila, 2-butenila, 3-butenila, 1,3- butadienila, e 3-metil-2-butenila.

[00247] Na presente invenção, “alquinila” inclui, por exemplo, alquinilas lineares ou ramificados. O alquinila inclui aqueles com uma ou mais ligações triplas, ou os semelhantes, no alquila. O número de carbonos do alquinila não é especialmente limitado, mas é, por exemplo, semelhante àquele do alquila e, preferivelmente, 2 a 8. Os exemplos do alquinila incluem etinila, propinila e butinila. O alquinila pode ter ainda, por exemplo, uma ou mais ligações duplas.

[00248] Na presente invenção, “arila” inclui, por exemplo, grupos hidrocarbonetos aromáticos monocíclicos e grupos hidrocarbonetos

75 / 104 aromáticos policíclicos. Os exemplos dos grupos hidrocarbonetos aromáticos monocíclicos incluem fenila. Os exemplos dos grupos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos incluem 1-naftila, 2-naftila, 1-antrila, 2-antrila, 9- antrila, 1-fenantrila, 2-fenantrila, 3-fenantrila, 4-fenantrila e 9-fenantrila. De preferência, os exemplos incluem fenila e naftila tal como 1-naftila e 2- naftila.

[00249] Na presente invenção, “heteroarila” inclui, por exemplo, grupos heterocíclicos aromáticos monocíclicos e grupos heterocíclicos aromáticos condensados. Os exemplos do heteroarila incluem furila (por exemplo, 2-furila, 3-furila), tienila (por exemplo, 2-tienila, 3-tienila), pirrolila (por exemplo, 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila), imidazolila (por exemplo, 1- imidazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila), pirazolila (por exemplo, 1- pirazolila, 3-pirazolila, 4-pirazolila), triazolila (por exemplo, 1,2,4-triazol-1- ila, 1,2,4-triazol-3-ila, 1,2,4-triazol-4-ila), tetrazolila (por exemplo, 1- tetrazolila, 2-tetrazolila, 5-tetrazolila), oxazolila (por exemplo, 2-oxazolila, 4- oxazolila, 5-oxazolila), isoxazolila (por exemplo, 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila), tiazolila (por exemplo, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila), tiadiazolila, isotiazolila (por exemplo, 3-isotiazolila, 4-isotiazolila, 5- isotiazolila), piridila (por exemplo, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila), piridadinila (por exemplo, 3-piridadinila, 4-piridadinila), pirimidinila (por exemplo, 2-pirimidinila, 4-pirimidinila, 5-pirimidinila), furazanila (por exemplo, 3-furazanila), piradinila (por exemplo, 2-piradinila), oxadiazolila (por exemplo, 1,3,4-oxadiazol-2-ila), benzofurila (por exemplo, 2- benzo[b]furila, -benzo[b]furila, 4-benzo[b]furila, 5-benzo[b]furila, 6- benzo[b]furila, 7-benzo[b]furila), benzotienila (por exemplo, 2- benzo[b]tienila, 3-benzo[b]tienila, 4-benzo[b]tienila, 5-benzo[b]tienila, 6- benzo[b]tienila, 7-benzo[b]tienila), benzimidazolila (por exemplo, 1- benzoimidazolila, 2-benzoimidazolila, 4-benzoimidazolila, 5- benzoimidazolila), dibenzofurila, benzoxazolila, benzotiazolila, quinoxalila

76 / 104 (por exemplo, 2-quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 6-quinoxalinila), cinolinila (por exemplo, 3-cinolinila, 4-cinolinila, 5-cinolinila, 6-cinolinila, 7-cinolinila, 8-cinolinila), quinazolila (por exemplo, 2-quinazolinila, 4-quinazolinila, 5- quinazolinila, 6-quinazolinila, 7-quinazolinila, 8-quinazolinila), quinolila (por exemplo, 2-quinolila, 3-quinolila, 4-quinolila, 5-quinolila, 6-quinolila, 7- quinolila, 8-quinolila), ftaradinila (por exemplo, 1-ftaradinila, 5-ftaradinila, 6- ftaradinila), isoquinolila (por exemplo, 1-isoquinolila, 3-isoquinolila, 4- isoquinolila, 5-isoquinolila, 6-isoquinolila, 7-isoquinolila, 8-isoquinolila), purila, puteridinila (por exemplo, 2-puteridinila, 4-puteridinila, 6-puteridinila, 7-puteridinila), carbazolila, fenantridinila, acridinila (por exemplo, 1- acridinila, 2-acridinila, 3-acridinila, 4-acridinila, 9-acridinila), indolila (por exemplo, 1-indolila, 2-indolila, 3-indolila, 4-indolila, 5-indolila, 6-indolila, 7- indolila), isoindolila e fenadinila (por exemplo, 1-fenadinila, 2-fenadinila) ou fenotiadinila (por exemplo, 1-fenotiadinila, 2-fenotiadinila, 3-fenotiadinila, 4- fenotiadinila).

[00250] Na presente invenção, “cicloalquila” é, por exemplo, um grupo hidrocarboneto saturado cíclico, no qual o número de carbonos é, por exemplo, 3 a 15. Os exemplos do cicloalquila incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, cicloheptila, ciclooctila, grupos hidrocarbonetos cíclicos em ponte e grupos hidrocarbonetos espiro e, de preferência, incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila e grupos hidrocarbonetos cíclicos em ponte.

[00251] Na presente invenção, os exemplos de “grupos hidrocarbonetos cíclicos em ponte” incluem biciclo[2.1.0]pentila, biciclo[2.2.1]heptila, biciclo[2.2.2]octila e biciclo[3.2.1]octila, triciclo[2.2.1.0]heptila, biciclo[3.3.1]nonano, 1-adamantila e 2-adamantila.

[00252] Na presente invenção, os exemplos de “grupos hidrocarbonetos espiro” incluem espiro[3.4]octila.

[00253] Na presente invenção, “cicloalquenila” abrange, por exemplo,

77 / 104 um grupo hidrocarboneto alifático insaturado cíclico, no qual o número de carbonos é, por exemplo, 3 a 7. Os exemplos dos grupos incluem ciclopropenila, ciclobutenila, ciclopentenila, ciclohexenila, e cicloheptenila e são, de preferência, ciclopropenila, ciclobutenila, ciclopentenila, ciclohexenila. O cicloalquenila também inclui, por exemplo, um grupo hidrocarboneto cíclico em ponte e um grupo hidrocarboneto espiro tendo uma ligação insaturada dentro de um anel.

[00254] Na presente invenção, os exemplos de “arilalquila” incluem benzila, 2-fenetila e naftalenilmetila; os exemplos de “cicloalquil alquila” ou “ciclilalquila” incluem ciclohexilmetila e adamantilmetila; e os exemplos de “hidroxialquila” incluem hidroximetila e 2-hidroxietila.

[00255] Na presente invenção, “alcóxi” inclui o grupo alquil -O-, e os exemplos incluem metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi e n-butóxi; os exemplos de “alcoxialquila” incluem metoximetila; e os exemplos de “amino alquila” incluem 2-aminoetila.

[00256] Na presente invenção, os exemplos de “heterociclila” incluem 1-pirrolinila, 2-pirrolinila, 3-pirrolinila, 1-pirrolidinila, 2-pirrolidinila, 3- pirrolidinila, pirrolidinona, 1-imidazolinila, 2-imidazolinila, 4-imidazolinila, 1-imidazolidinila, 2-imidazolidinila, 4-imidazolidinila, imidazolidinona, 1- pirazolinila, 3-pirazolinila, 4-pirazolinila, 1-pirazolidinila, 3-pirazolidinila, 4- pirazolidinila, piperidinona, piperidino, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4- piperidinila, 1-piperadinila, 2-piperadinila, piperadinona, 2-morfolinila, 3- morfolinila, morfolino, tetrahidropiranila e tetrahidrofuranila.

[00257] Na presente invenção, os exemplos de “heterociclilalquila” incluem piperidinilmetila e piperadinilmetila; os exemplos de “heterociclilalquenila” incluem 2-piperidiniletenila; e os exemplos de “heteroarilalquila” incluem piridilmetila e quinolin-3-ilmetila.

[00258] Na presente invenção, “silila” inclui um grupo representado pela fórmula R3Si-, na qual R pode ser selecionado independentemente dentre

78 / 104 alquila, arila e cicloalquila descritos acima, e os exemplos incluem um grupo trimetilsilila e um grupo terc-butildimetilsilila; os exemplos de “sililoxi” incluem um grupo trimetilsililoxi; e os exemplos e “sililoxialquila” incluem trimetilsililoximetila.

[00259] Na presente invenção, os exemplos de “alquileno” incluem metileno, etileno e propileno.

[00260] Na presente invenção, os vários tipos de grupos mencionados acima podem ser substituídos. Os exemplos dos substituintes incluem hidróxi, carbóxi, halogênio, alquila halogenado (por exemplo, CF3, CH2CF3, CH2CCl3), nitro, nitroso, ciano, alquila (por exemplo, metila, etila, isopropila, terc-butila), alquenila (por exemplo, vinila), alquinila (por exemplo, etinila), cicloalquila (por exemplo, ciclopropila, adamantila), cicloalquil alquila (por exemplo, ciclohexilmetila, adamantilmetila), cicloalquenila (por exemplo, ciclopropenila), arila (por exemplo, fenila, naftila), arilalquila (por exemplo, benzila, fenetila), heteroarila (por exemplo, piridila, furila), heteroarilalquila (por exemplo, piridilmetila), heterociclila (por exemplo, piperidila), heterociclilalquila (por exemplo, morfolilmetila), alcóxi (por exemplo, metóxi, etóxi, propóxi, butóxi), alcóxi halogenado (por exemplo, OCF3), alqueniloxi (por exemplo, viniloxi, aliloxi), ariloxi (por exemplo, feniloxi), alquil oxicarbonila (por exemplo, metoxicarbonila, etoxicarbonila, terc- butoxicarbonila), arilalquiloxi (por exemplo, benziloxi), amino (alquilamino [por exemplo, metilamino, etilamino, dimetilamino], acilamino [por exemplo, acetilamino, benzoilamino], arilalquilamino [por exemplo, benzilamino, tritilamino], hidroxiamino), alquilaminoalquila (por exemplo, dietilaminometila), sulfamoíla e oxo. (10) Inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3

[00261] Inibição da fosforilação da proteína SMAD2/3 significa que a fosforilação de SMAD2 e/ou SMAD3 promovida por estimulação de TGF-β é inibida (controlada).

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[00262] SMAD2/3 é uma das R-SMADs (SMADs reguladas por receptor) que sofrem fosforilação pelo receptor de TGF-β do tipo I e, depois da estimulação por TGF-β, SMAD2 e SMAD3 fosforiladas (ativadas) imigram juntamente com SMAD4, a qual é Co-SMAD (parceira comum SMAD), para o núcleo. Como mostrado no Exemplo 4, os inventores verificaram que a proteína NEK6 interage com a proteína SMAD2/3 dentro de uma célula e promove a fosforilação da proteína SMAD2/3. A proteína SMAD2/3 fosforilada forma uma complexo com a proteína SMAD, imigra para o núcleo e realça a transcrição de α-SMA, colágeno-α2, interferon β, interleucina-5, VEGF e os semelhantes.

[00263] Desse modo, a inibição do sistema de sinalização de SMAD pelo inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3 da presente invenção permite o controle transcricional de α-SMA, colágeno-α2, interferon β e os semelhantes, e é, por sua vez, útil para suprimir a diferenciação de um fibroblasto, uma célula hepática estrelada, ou os semelhantes, em um miofibroblasto, controlando a síntese de matriz causada por fibroblastos, ou outros, e regulando as reações inflamatórias e imunes, e outras, em um processo de cicatrização de ferida. (11) Agente terapêutico para fibrose

[00264] O agente terapêutico para fibrose da presente invenção é um agente terapêutico para fibrose hepática, cirrose hepática, hepatite viral, hepatite autoimune, hepatite biliar primária, esteato-hepatite não alcoólica, doença hepática alcoólica, colangite esclerosante primária, hemocromatose, doença de Wilson, deficiência de α1-antitripsina, cirrose hepática congestiva não viral, transtorno hepático induzido por fármacos, pancreatite, fibrose pancreática, fibrose na retina, cicatriz nas cordas vocais, fibrose na mucosa das cordas vocais, fibrose laríngea, fibrose pulmonar, pneumonite, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite inespecífica, pneumonia em organização idiopática, pneumonite descamativa, pneumonite associada à bronquiolite

80 / 104 respiratória, pneumonite aguda, pneumonite linfocítica, sarcoidose, pneumonia eosinofílica crônica, pneumonia eosinofílica aguda, linfangioleiomiomatose, proteinose alveolar pulmonar, síndrome de Hermansky-Pudlak, histiocitose pulmonar de células de Langerhans, siderose, amiloidose, microlitíase alveolar pulmonar, pneumonite por hipersensibilidade, pneumoconiose, doença pulmonar infecciosa, pneumonia induzida por fármacos, pneumonia por radiação, fibrose cística, mielofibrose, fibrose renal, insuficiência renal crônica, nefropatia diabética, glomerulonefrite crônica, nefrosclerose maligna, rim policístico, transtorno renal induzido por fármacos, fibrose retroperitoneal, colagenose, esclerodermia, disceratose congênita, fibrose sistêmica nefrogênica e, além disso, doenças amplamente associadas com fibrogênese incluindo fibrogênese das vias aéreas, fibrogênese intestinal, fibrogênese da bexiga urinária, fibrogênese da próstata e fibrogênese dérmica. De preferência, é para fibrose hepática, cirrose hepática, fibrose pulmonar, pneumonite, fibrose renal e insuficiência renal crônica.

[00265] Um método de administração do agente terapêutico para fibrose da presente invenção não é especialmente limitado, mas é preferível que seja administração parenteral tal como administração por inalação, injeção intravenosa ou transdérmica. A dose da molécula de ácido nucleico da presente invenção em um método terapêutico da presente invenção não é especialmente limitado, desde que seja uma quantidade eficaz para tratar a doença descrita acima, e varia dependendo do tipo de doença, do grau de gravidade, idade, peso corporal, via de administração, e outros, mas pode ser tipicamente entre aproximadamente 0,0001 e 100 mg/kg de peso corporal por onça para um adulto, por exemplo, entre aproximadamente 0,001 e 10 mg/kg de peso corporal e, de preferência, entre aproximadamente 0,005 e 5 mg/kg de peso corporal. Tal quantidade pode ser administrada em um intervalo de, por exemplo, três vezes ao dia a uma vez por mês, de preferência uma vez ao dia

81 / 104 a uma semana. O agente terapêutico para fibrose da presente invenção é tipicamente formulado como uma composição farmacêutica adequada com um veículo farmaceuticamente aceitável e administrado em uma forma oral ou parenteral.

[00266] A seguir, a presente invenção será descrita detalhadamente com os Exemplos e os semelhantes, mas a presente invenção não se limita a esses. A propósito, a condição da cultura foi a 37 º, sob 5% de CO2. Além disso, a menos que indicado o contrário, um meio usado para a linhagem celular LL29 de fibroblastos pulmonares humanos foi o meio F-12K (Gibco(R)) contendo FCS 10%; um meio usado para células hepáticas estreladas primárias humanas (ScienCell Research Laboratories, Inc.) foi o meio de células estreladas (ScienCell Research Laboratories, Inc.) contendo FCS 2% e suplemento para crescimento de células estreladas 1% (SteCGS, ScienCell Research Laboratories, Inc.). Exemplos Exemplo 1: Knockdown de NEK6 usando siRNAs

[00267] Células da linhagem LL29 de fibroblastos pulmonares humanos, estabelecidos no pulmão de um paciente com FPI foram transfectadas com siRNAs para NEK6 humano (ON-TARGET plus SMART pool siRNA, Dharmacon Inc., ou Stealth RNAi siRNA, Thermo Fisher Scientific, Inc.) utilizando Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen(TM)). 24 horas depois da transfecção, o meio foi trocado do meio F-12K (Gibco(R)) contendo FCS 10% para o meio F-12K contendo BSA 0,1%. 72 horas depois da transfecção, os RNAs foram extraídos das células transfectadas com os siRNAs, utilizando o kit RNeasy Mini (Qiagen N.V.). Os RNAs assim obtidos foram submetidos à transcrição reversa utilizando o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems(R)) para obter cDNAs. Os cDNAs assim obtidos foram submetidos à PCR em tempo real por meio de ensaios de expressão gênica com TaqMan (Applied Biosystems(R)) para

82 / 104 examinar a influência sobre a quantidade de transcritos do gene NEK6 por knockdown (redução da expressão) de NEK6. A quantidade de transcritos do gene NEK6 foi calculada dividindo um valor medido na sonda NEK6 Taqman Probe (HS00205221_m1, Applied Biosystems(R)) por um valor medido na Sonda 18s. Como a Sonda 18s, a Sonda MGB 18s sintetizada sob medida seguinte, o Primer 1 18s sintetizado sob medida e o Primer 2 18S sintetizado sob medida foram misturados de modo que ficassem a 0,2 µM, 0,4 µM e 0.4 µM, respectivamente, e foram submetidos à PCR em tempo real.

[00268] Sonda MGB 18s sintetizada sob medida (Applied Biosystems(R)): 5’-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC-3’ (SEQ ID NO: 57)

[00269] Primer 1 18s sintetizado sob medida (Thermo Fisher Scientific, Inc.): 5’-CGGCTACCACATCCAAGGAAG-3’ (SEQ ID NO: 58)

[00270] Primer 2 18s sintetizado sob medida (Thermo Fisher Scientific, Inc.): 5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’ (SEQ ID NO: 59)

[00271] Como as sequências de siRNA, foram utilizados ON- TARGET plus SMART pool siRNA (misturando as SEQ ID NOs: 51 a 54 em quantidades iguais) e Stealth RNAi siRNA (SEQ ID NO: 55). <ON-TARGET plus SMART pool siRNA>

[00272] siNEK6:5’-CUGUCCUCGGCCUAUCUUC-3’ (SEQ ID NO: 51) siNEK6:5’-UAUUUGGGUGGUUCAGUUG-3’ (SEQ ID NO: 52) siNEK6:5’-CAACUCCAGCACAAUGUUC-3’ (SEQ ID NO: 53) siNEK6:5’-UACUUGAUCAUCUGCGAGA-3’ (SEQ ID NO:

83 / 104 54) <Stealth RNAi siRNA>

[00273] siNEK6:5’-AAGUACUUCCAUACUGUCCUCUCC-3’ (SEQ ID NO: 55)

[00274] A Figura 6a mostra os resultados da PCR em tempo real de NEK6 quando o ON-TARGET plus SMART pool siRNA para NEK6 foi introduzido, e a Figura 6b mostra os resultados de NEK6 quando Stealth RNAi siRNA para NEK6 foi introduzido. A introdução de siRNAs de NEK6 suprimiu a quantidade de transcritos do gene NEK6. Consequentemente, foi demonstrado que os siRNAs usados de NEK6 suprimiram eficientemente a expressão de um gene alvo. Exemplo 2: Influência do knockdown de NEK6 sobre a fosforilação da proteína SMAD2/3

[00275] A fim de investigar a possibilidade de que a proteína NEK6 pode controlar o sinal de TGF-β, a quantidade de SMAD2/3 fosforilada foi analisada em células transfectada com siRNAs de NEK6.

[00276] Células da linhagem LL29 de fibroblastos pulmonares humanos, estabelecidos no pulmão de um paciente com FPI foram transfectadas com ON-TARGET plus SMART pool siRNA para NEK6 humano (Dharmacon Inc.) ou Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) utilizando Lipofectamine RNAi MAX. 24 depois da transfecção, o meio foi trocado do meio F-12K contendo FCS 10% para o F-12K contendo BSA 0,1%. 48 depois da transfecção, proteína TGF-β humana (PeproTech, Inc.) foi adicionada para que fosse obtida uma concentração final de 5 ng/mL. Duas horas depois da adição de TGF-β, as células foram lisadas com 2 × tampão de amostra SDS (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS 4%, ureia 6 M, glicerol 12%, coquetel inibidor de proteases 2% [Nacalai Tesque Inc.], coquetel inibidor de fosfatase 1% [Nacalai Tesque Inc.]) para fornecer um extrato celular. Ao extrato celular assim obtido, β-mercaptoetanol e azul de bromofenol foram

84 / 104 adicionados para que fossem obtidas as concentrações finais de 5% e 0,025%, respectivamente, e então aquecidos a 95 ºC por 4 minutos para fornecer uma amostra. Com a amostra assim obtida, SDS-PAGE foi realizada para separar as proteínas contidas na amostra de acordo com seus tamanhos. Em seguida, as proteínas separadas foram transferidas para uma membrana PVDF e submetidas a Western blotting com um anticorpo anti-SMAD3 fosforilada (Cell Signaling Technology, Inc.), um anticorpo anti-SMAD2 fosforilada (Cell Signaling Technology, Inc.), um anticorpo anti-SMAD23 (Cell Signaling Technology, Inc.), um anticorpo anti-NEK6 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) e um anticorpo anti-β-Actina (Sigma-Aldrich Co. LLC.)

[00277] A Figura 7a mostra os resultados do Western blot da proteína SMAD3 fosforilada quando NEK6 teve a expressão reduzida. Com o uso de siRNAs de NEK6, a quantidade de proteína NEK6 foi diminuída, e a quantidade de SMAD3 fosforilada que é elevada por TGF-β foi diminuída. Neste momento, a quantidade de proteína SMAD3 total não alterou. Enquanto isso, a Figura 7b mostra os resultados do Western blot de proteína SMAD2 fosforilada quando NEK6 teve a expressão reduzida. Com o uso de siRNAs de NEK6, a quantidade de proteína NEK6 foi diminuída, e a quantidade de SMAD2 fosforilada que é elevada por TGF-β foi diminuída. Neste momento, a quantidade de proteína SMAD2 total não alterou.

[00278] Consequentemente, foi mostrado que a fosforilação da proteína SMAD2/3 é suprimida pelo knockdown de NEK6. Exemplo 3: Interação entre proteína NEK6 e proteína SMAD3 dentro de uma célula

[00279] A fim de investigar se a proteína NEK6 interagiria com SMAD3 e fosforila SMAD3 dentro de uma célula, foi realizada coimunoprecipitação

[00280] A linhagem de células LL29 de fibroblastos, estabelecidos no pulmão de um paciente com FPI foram transfectadas com um vetor de

85 / 104 expressão no qual NEK6 humano foi clonado (pEZ-M02 Nek6, GeneCopoeia, Inc.) e com um vetor de expressão no qual SMAD3 humana marcada com tag FLAG foi clonada (pEZ-M11 Flag-hSmad3, GeneCopoeia, Inc.) utilizando X- treme GENE HP (Roche Diagnostics K. K). 24 depois da transfecção, o meio foi trocado. 48 depois da transfecção, as células foram recuperadas com tampão de lise (NaCl 175 mM, HEPES 50 mM, pH 7,6, NP40 0,1%, EDTA 0,2 mM, pH 8,0, β-mercaptoetanol 1,4 mM, coquetel inibidor de proteases 1%, coquetel inibidor de fosfatase 1%), e o sobrenadante foi obtido por centrifugação. Ao sobrenadante, as microesferas TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads (Rockland Immunochemicals Inc.) foram adicionadas e submetidas à centrifugação para eliminar ligação não específica. Ao sobrenadante assim obtido, uma IgG normal de cabra (Santa Cruz Biotechnology Inc.), como controle, ou um anticorpo anti-NEK6 foi adicionado e incubado a 4 ºC durante a noite e, a seguir, as TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads foram adicionada e incubada a 4 ºC por 4 horas. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, as TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads foram lavadas com tampão de lise para eliminar ligação não específica. Às TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads, 2 × tampão de carga de SDS PAGE (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS 4%, glicerol 20%, azul de bromofenol 0,2%, DTT 50 mM) foram adicionados e aquecidos a 95 ºC por 5 minutos, e o coimunoprecipitado contido no sobrenadante foi recuperado. Para o coimunoprecipitado com o anticorpo anti-NEK6, Western blotting foi realizado com um anticorpo anti-SMAD3 (Cell Signaling Technology, Inc.) ou um anticorpo anti-NEK6 e submetido à detecção para averiguar se a proteína NEK6 e a proteína SMAD3 teriam coimunoprecipitado.

[00281] A Figura 8a mostra os resultados da coimunoprecipitação com o anticorpo anti-NEK6. A proteína NEK6 e a proteína SMAD3 foram detectadas no coimunoprecipitado.

[00282] A fim de analisar se a proteína SMAD3 interage com NEK6 e

86 / 104 se é fosforilada dentro de uma célula, um vetor de expressão para NEK6 humano e um vetor de expressão para SMAD3 humana marcada com tag FLAG foram transfectados em células LL29. 24 depois da transfecção, o meio foi trocado. 48 depois da transfecção, as células foram recuperadas com tampão de lise (NaCl 250 mM, HEPES 50 mM, pH 7,6, NP40 0,1%, EDTA 0,2 mM, pH 8,0, β-mercaptoetanol 1,4 mM, coquetel inibidor de proteases 1%, coquetel inibidor de fosfatase 1%), e o sobrenadante foi obtido por centrifugação. Ao sobrenadante assim obtido, o Anti-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma-Aldrich Co. LLC.) foi adicionado e incubado a 4 ºC durante a noite. Em seguida, foi realizada centrifugação para remover o sobrenadante. O Anti- FLAG M2 Affinity Gel foi lavado com tampão de lise para eliminar ligação não específica. Ao Anti-FLAG M2 Affinity Gel, 2 × tampão de carga de SDS PAGE (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS 4%, glicerol 20%, azul de bromofenol 0,2%, DTT 50 mM) foram adicionados e aquecidos a 95 ºC por 4 minutos, e o coimunoprecipitado contido no sobrenadante foi recuperado. O coimunoprecipitado assim obtido foi separado com SDS-PAGE tendo por base os tamanhos, seguido pela transferência para uma membrana PVDF e Western blotting submetido ao coimunoprecipitado no Anti-FLAG M2 Affinity Gel utilizando um anticorpo anti-SMAD3 fosforilada, um anticorpo anti-FLAG (Sigma-Aldrich Co. LLC.) e um anticorpo anti-NEK6 para detectar se a proteína NEK6 e a proteína SMAD3 fosforilada seriam coimunoprecipiatadas.

[00283] A Figura 8b mostra os resultados da coimunoprecipitação pelo anticorpo anti-FLAG. A proteína NEK6 e a proteína FLAG-SMAD3 foram detectadas no coimunoprecipitado. Além disso, a transfecção de um vetor de expressão de NEK6 humano fez com que a quantidade de proteína SMAD3 fosforilada elevasse.

[00284] Como a proteína SMAD3 foi detectada no coimunoprecipitado por um anticorpo anti-NEK6 e, por outro lado, NEK6 foi detectada no

87 / 104 coimunoprecipitado por um anticorpo anti-FLAG, mostrou-se que a proteína NEK6 e a proteína SMAD3 interagem dentro de uma célula e formam um complexo. Além disso, como a quantidade de proteína SMAD3 fosforilada foi elevada pela transfecção de um vetor de expressão de NEK6 humano, mostrou-se que a proteína NEK6 fosforila a proteína SMAD3 dentro de uma célula. Exemplo 4: Fosforilação da proteína SMAD3 pela proteína NEK6

[00285] A possibilidade de que a proteína NEK6 possa fosforilar diretamente a proteína SMAD3 como um substrato foi investigada utilizando as proteínas purificadas de NEK6 e SMAD3.

[00286] A proteína de fusão His-NEK6 (Eurofins Scientific SE) e a proteína de fusão GST-SMAD3 (Sigma-Aldrich Co. LLC.) foram misturadas com solvente de reação (ATP 150 µM, HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 0,1%, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, coquetel inibidor de fosfatase 1%), e incubadas a 30 ºC por 45 minutos. À solução de reação, 2 × tampão de amostra de SDS, contendo β-mercaptoetanol 5% e azul de bromofenol 0,025%, foram adicionados em quantidades iguais para encerrar a reação e, a seguir, aquecidos a 95 ºC por 5 minutos para fornecer uma amostra. Com a amostra assim obtida, SDS-PAGE foi realizado para separar as proteínas contidas na solução de reação de acordo com seus tamanhos. Em seguida, as proteínas separadas foram transferidas para uma membrana PVDF e submetidas a Western blotting com um anticorpo anti-SMAD3 fosforilada, um anticorpo anti-GST (Santa Cruz Biotechnology Inc.) e um anticorpo anti- NEK6.

[00287] A Figura 9 mostra os resultados do Western blot da proteína SMAD3 fosforilada, quando a proteína de fusão His-NEK6 e a proteína de fusão GST-SMAD3 foram reagidas. Com o uso da proteína NEK6, a quantidade de SMAD3 fosforilada foi elevada. Consequentemente, mostrou- se que a proteína NEK6 fosforila diretamente a proteína SMAD3 como um

88 / 104 substrato. Exemplo 5: Influência sobre a atividade transcricional do complexo de proteínas SMAD por knockdown de NEK6

[00288] A fim de investigar se a proteína NEK6 controlaria também a atividade transcricional que gera a translocação nuclear do complexo de proteínas SMAD, realizou-se um ensaio de repórter luciferase com uma sequência de ligação ao DNA do complexo de proteínas SMAD e o gene luciferase. Além disso, foi realizado Western blotting, utilizando células LL29 preparadas simultaneamente para verificar a redução da expressão de NEK6.

[00289] A linhagem de células LL29 de fibroblastos, estabelecidos no pulmão de um paciente com FPI foi transfectada com ON-TARGET plus SMART pool siRNA (Dharmacon Inc.), que é um siRNA para NEK6 humano, utilizando Lipofectamine RNAi MAX. 24 depois da transfecção do siRNA, o meio foi trocado do meio F-12K contendo FCS 10% para o meio F- 12K contendo FCS 0,4%. 48 depois da transfecção do siRNA, um vetor de expressão, no qual uma sequência de ligação ao DNA do complexo de proteínas SMAD (elemento de ligação a SMAD [SBE]) e gene luciferase de vagalume (pTL-SBE-luc: 5’-

AGTATGTCTAGACTGAAGTATGTCTAGACTGAAGTATGTCTAGACT GA-3’ [SEQ ID NO: 60], Panomics Inc.) foi clonada, e um vetor para calibração de um ensaio de repórter que contém luciferase de Renilla do tipo selvagem (pRL-TK: Promega Corporation) foram transfectados utilizando Lipofectamine LTX com reagente PLUS (Thermo Fisher Scientific Inc). Duas horas depois da transfecção dos vetores de expressão, proteína TGF-β humana foi adicionada para que fosse obtida uma concentração final de 10 ng/mL. 24 horas depois da adição de TGF-β, as células foram lisadas com 2 × tampão de amostra de SDS (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS 4%, ureia 6 M, glicerol 12%, coquetel inibidor de proteases 2%, coquetel inibidor de fosfatase 1%). As proteínas contidas no extrato celular assim obtido foram

89 / 104 separadas por SDS-PAGE, seguido pela transferência das proteínas para uma membrana PVDF e Western blotting submetido com um anticorpo anti- SMAD3, um anticorpo anti-NEK6 e um anticorpo anti-Vinculina. Enquanto isso, células LL29, preparadas de maneira semelhante à descrita acima, foram recuperadas de acordo com o sistema de ensaio duplo de repórter luciferase (Promega Corporation), e mediu-se a luminescência pela luciferase de vagalume e luciferase de Renilla. A quantidade de luminescência da luciferase de vagalume foi calibrada pela quantidade de luminescência da luciferase de Renilla.

[00290] A Figura 10a mostra os resultados do Western blot quando NEK6 teve a expressão reduzida. Foi mostrado que, com o uso de siRNAs de NEK6, a quantidade de proteína NEK6 diminuiu, mas a quantidade de SMAD3 não alterou. A Figura 10b mostra a quantidade de luminescência da luciferase de vagalume calibrada por aquela da luciferase de Renilla quando NEK6 teve a expressão reduzida. Com o uso de siRNAs de NEK6, a quantidade de luminescência da luciferase de vagalume, que é elevada por TGF-β, foi diminuída. Consequentemente, foi mostrado que a atividade transcricional do complexo de proteínas SMAD é suprimida pelo knockdown de NEK6. Exemplo 6: Influência sobre as quantidades de transcritos dos genes relacionados à fibrose pelo knockdown de NEK6

[00291] A fim de investigar se o knockdown de NEK6 exibe efeito terapêutico sobre fibrose, as quantidades de transcritos de genes relacionados à fibrose em células transfectadas com siRNAs de NEK6 foram analisadas.

[00292] A linhagem de células LL29 de fibroblastos pulmonares humanos, estabelecidos no pulmão de um paciente com FPI foi transfectada com um siRNA para NEK6 humano (ON-TARGET plus SMART pool siRNA, Dharmacon Inc.) utilizando Lipofectamine RNAi MAX. 24 depois da transfecção, o meio foi trocado do meio F-12K, contendo FCS 10%, para o

90 / 104 meio F-12K contendo BSA 0,1%. 48 depois da transfecção, proteína TGF-β humana foi adicionada para que fosse obtida uma concentração final de 1 ng/mL. 72 depois da transfecção, os RNAs foram extraídos das células transfectadas com o siRNA, utilizando o kit RNeasy Mini. Os RNAs assim obtidos foram submetidos à transcrição reversa com o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription para fornecer cDNAs. Os cDNAs assim obtidos foram submetidos à PCR em tempo real por meio de ensaios de expressão gênica com TaqMan para detectar a influência sobre as quantidades de transcritos dos genes por knockdown de NEK6. As quantidades de transcritos do gene Col1a1 e do gene αSMA foram calculadas dividindo um valor medido na Sonda Col1a1 Taqman (HS00164004_m1, Applied Biosystems(R)) ou na Sonda αSMA Taqman (HS00426835_g1, Applied Biosystems(R)) por um valor medido na Sonda 18s.

[00293] A Figura 11a mostra a quantidade de transcritos do Col1a1 quando NEK6 teve a expressão reduzida, e a Figura 11b mostra a quantidade de transcritos do gene αSMA quando NEK6 teve a expressão reduzida. Com o uso de siRNAs de NEK6, as quantidades de transcritos do genes Col1a1 e αSMA, que são elevadas por TGF-β, foram diminuídas. Consequentemente, foi mostrado que o knockdown de NEK6 exibe efeito terapêutico sobre fibrose. Exemplo 7: Síntese de moléculas de ácido nucleico de fita simples

[00294] As moléculas de ácido nucleico mostradas abaixo foram sintetizadas tendo por base um método com fosforamidita em um sintetizador de ácidos nucleicos (nome comercial: ABI3900 DNA Synthesizer, Applied Biosystems(R)). A síntese em fase sólida foi realizada utilizando CPG (Vidro de poros controlados) como suporte de fase sólida, e EMM amidita (WO2013/027843) como RNA amidita. A excisão do suporte de fase sólida e a desproteção de um grupo protetor de fosfato, a desproteção de um grupo protetor de bases e a desproteção de um grupo protetor de 2’-hidroxila

91 / 104 seguiram métodos convencionais. As moléculas sintetizadas de ácido nucleico de fita simples foram purificadas por HPLC.

[00295] Nas moléculas de ácido nucleico de fita simples a seguir da presente invenção, Lx é uma região de ligação Lx representa L-prolina diamida amidita da fórmula estrutural seguinte. Fórmula química 6

[00296] Além disso, os sublinhados nas moléculas de ácido nucleico de fita simples abaixo representam sequências que suprimem a expressão do gene NEK6. KB-001

[00297] 5’-GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC-Lx- GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA-3’ (SEQ ID NO: 31) KB-002

[00298] 5’-CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC-Lx- GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC-3’ (SEQ ID NO: 32) KB-003

[00299] 5’-CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC-Lx- GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC-3’ (SEQ ID NO: 33) KB-004

[00300] 5’-GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC-Lx- GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC-3’ (SEQ ID NO: 34) KB-005

[00301] 5’-CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC-Lx- GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU-3’ (SEQ ID NO: 35)

92 / 104 Exemplo 8: Avaliação in vitro de moléculas ssPN (moléculas de ácido nucleico de fita simples)

[00302] A avaliação in vitro das moléculas ssPN (moléculas de ácido nucleico de fita simples) projetadas para NEK6 foi realizada. Um método de medição para cada item, após os métodos mencionados acima, foi realizado com ON-TARGET plus SMART pool siRNA e Stealth RNAi siRNA (Exemplos 1, 2 e 6). Todos os ácidos nucleicos ssPN, de KB-001 a -005, suprimiram a quantidade de transcritos do NEK6, e reduziram a expressão do gene alvo. Além disso, a diminuição na quantidade de proteína SMAD3 fosforilada foi confirmada pela ação de ácidos nucleicos ssPN de KB-001 a -

005.

[00303] Além disso, são mostrados na Figura 12 resultados nos quais a influência sobre as quantidades de transcritos de genes relacionados à fibrogênese (Col1a1 e αSMA) foram examinados para KB-001 e KB-003. A Figura 12a mostra as quantidades de transcritos do gene Col1a1 quando KB- 001 ou KB-003 atuaram, e a Figura 12b mostra as quantidades de transcritos do gene αSMA quando KB-001 ou KB-003 atuaram. Foi confirmado que ambas as moléculas ssPN de KB-001 e KB-003 suprimem as quantidades de transcritos de genes relacionados à fibrogênese. A partir desses resultados, foi possível confirmar a ação de supressão da fibrogênese das moléculas ssPN (moléculas de ácido nucleico de fita simples) projetadas para NEK6. Exemplo 9: Verificação da ação anti-fibrogênese por knockdown in vivo de NEK6

[00304] A fim de verificar se o knockdown de NEK6 exibe efeito terapêutico sobre fibrose, siRNAs de NEK6 são administrados a camundongos de um modelo de fibrogênese pulmonar por bleomicina para analisar a ação anti-fibrogênese.

[00305] A um camundongo Crl:CD1 (ICR) com 7 semanas de idade (Charles River Laboratories Japan, Inc.), bleomicina (Nippon Kayaku Co.,

93 / 104 Ltd.) é administrada a uma dose de 0,4 mg/kg de peso corporal para criar um camundongo modelo de fibrogênese pulmonar. siRNAs de NEK6 são administrados com uma frequência de uma vez por 2 a 7 dias na dose máxima de 50 mg/kg de peso corporal. Durante o período de administração de siRNAs de NEK6, o exame de imagem diagnóstica é realizado com uma frequência de uma vez por semana com micro TC de uso em animais experimentais. Depois de 14 a 30 dias da administração inicial de siRNAs de NEK6, é realizada dissecação para ressecar o pulmão. Medições das quantidades de transcritos de genes relacionados à fibrose e de quantidades expressas de proteínas relacionadas à fibrose, análise patológica e outros utilizando o pulmão ressecado são realizados. Com esses, é possível confirmar que a fibrogênese é suprimida em um grupo ao qual siRNA de NEK6 foi administrado quando comparado a um grupo em que siRNA de NEK6 não foi administrado, e mostrar a ação anti-fibrogênese de siRNAs de NEK6 em um camundongo modelo de fibrogênese pulmonar. Exemplo 10: Influência de siRNAs de NEK6 sobre a fosforilação de proteína SMAD3 em células hepáticas estreladas

[00306] A fim de investigar a possibilidade de que a proteína NEK6 pode controlar o sinal de TGF-β em células hepáticas estreladas, a quantidade de SMAD3 fosforilada foi analisada em células transfectadas com siRNAs de NEK6.

[00307] Células hepáticas estreladas primárias humanas isoladas de fígado humano (ScienCell Research Laboratories, Inc.) foram cultivadas em uma placa de cultura celular revestida com poli-L-lisina (PLL) por 5 dias. Depois, siRNAs para NEK6 humano (KB-004) foram transfectados utilizando Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen(TM)). 48 depois da transfecção, o meio foi mudado do meio para células estreladas (ScienCell Research Laboratories, Inc.), contendo FCS 2% e suplemento para crescimento de células estreladas 1% (SteCGS, ScienCell Research Laboratories, Inc.), para o

94 / 104 meio de células estreladas contendo FCS 0,2% e SteCGS 1%. 72 depois da transfecção, lipopolissacarídeo (LPS, Sigma-Aldrich Co. LLC.) foi adicionado ao meio para que fosse obtida uma concentração final de 100 ng/mL. Onze horas e meia depois da LPS, proteína TGF-β humana (PeproTech, Inc.) foi adicionada para que fosse obtida uma concentração final de 5 ng/mL. Trinta minutos depois da adição de TGF-β, as células foram lisadas com 2 × tampão de amostras SDS (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS 4%, ureia 6 M, glicerol 12%, coquetel inibidor de proteases 2% [Nacalai Tesque Inc.], coquetel inibidor de fosfatase 1% [Nacalai Tesque Inc.]) para fornecer um extrato celular.

[00308] Ao extrato celular assim obtido, β-mercaptoetanol e azul de bromofenol foram adicionados para que fossem obtidas as concentrações finais de 5% e 0,025%, respectivamente, e então aquecidos a 95 ºC por 4 minutos para fornecer uma amostra. Com a amostra assim obtida, SDS-PAGE foi realizada para separar as proteínas contidas na amostra de acordo com seus tamanhos. Em seguida, as proteínas separadas foram transferidas para uma membrana PVDF e submetidas a Western blotting com um anticorpo anti- SMAD3 fosforilada (Cell Signaling Technology, Inc.) e um anticorpo anti- SMAD3 (Cell Signaling Technology, Inc.), um anticorpo anti-SMAD2 fosforilada (Cell Signaling Technology, Inc.) e um anticorpo anti-SMAD2 (Cell Signaling Technology, Inc.), um anticorpo anti-NEK6 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) e um anticorpo anti-Vinculina (Sigma-Aldrich Co. LLC.).

[00309] A Figura 13 mostra os resultados do Western blotting da proteína SMAD3 fosforilada e proteína SMAD2 fosforilada quando siRNAs de NEK6 foram transfectados. Com os siRNAs de NEK6, a quantidade de proteína NEK6 foi diminuída e as quantidades de SMAD3 fosforilada e de SMAD2 fosforilado, que são elevadas por TGF-β, foram diminuídas. Consequentemente, foi mostrado que a fosforilação da proteína SMAD3 e da

95 / 104 proteína SMAD2 é suprimida pelo knockdown de NEK6. Exemplo 11: Supressão da fosforilação de SMAD3 por siRNAs de NEK6 em células hepáticas estreladas

[00310] A fim de investigar a possibilidade de que a proteína NEK6 pode também controlar o sinal de TGF-β, a quantidade de SMAD3 fosforilada foi analisada em células transfectadas com cada siRNA de NEK6.

[00311] Células hepáticas estreladas primárias isoladas de fígado humano foram cultivadas em uma placa de cultura celular revestida com PLL por 5 dias. Depois, vários siRNAs para NEK6 humano (KB-006, KB-004, KB-011, KB-005, KB-010) foram transfectados utilizando Lipofectamine RNAi MAX. 48 depois da transfecção, o meio foi mudado do meio para células estreladas, contendo 2% FCS e SteCGS 1%, para meio de células estreladas contendo FCS 0,2% e SteCGS 1%. 72 depois da transfecção, LPS foi adicionado ao meio para que fosse obtida uma concentração final de 100 ng/ml. Onze horas e meia depois da adição de LPS, proteína TGF-β humana foi adicionada para que fosse obtida uma concentração final de 5 ng/ml. Trinta minutos depois da adição de TGF-β, as células foram lisadas com 2 × tampão de amostra SDS (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS 4%, ureia 6 M, glicerol 12%, coquetel inibidor de proteases 2% [Nacalai Tesque Inc.], coquetel inibidor de fosfatase 1% [Nacalai Tesque Inc.]) para fornecer um extrato celular. Ao extrato celular assim obtido, β-mercaptoetanol e azul de bromofenol foram adicionados para que fossem obtidas as concentrações finais de 5% e 0,025%, respectivamente, e então aquecidos a 95 ºC por 4 minutos para fornecer uma amostra. Com a amostra assim obtida, SDS-PAGE foi realizada para separar as proteínas contidas na amostra de acordo com seus tamanhos. Em seguida, as proteínas separadas foram transferidas para uma membrana PVDF e submetidas a Western blotting com um anticorpo anti- SMAD3 fosforilada e um anticorpo anti-SMAD3, um anticorpo anti-NEK6 e um anti-Vinculina.

96 / 104

[00312] A Figura 14 mostra os resultados do Western blotting da proteína SMAD3 fosforilada quando NEK6 teve a expressão reduzida por vários tipos de siRNAs de NEK6. Com a introdução de vários tipos dos siRNAs de NEK6, a quantidade de proteína NEK6 foi diminuída, e a quantidade de SMAD3 fosforilada, que é elevada por TGF-β, foi diminuída. Consequentemente, foi mostrado que a fosforilação de proteína SMAD3 é suprimida pelo knockdown de NEK6 utilizando-se uma pluralidade de sequências de siRNA de NEK6. Exemplo 12: Influência de siRNAs de NEK6 sobre genes relacionados à fibrose em células hepáticas estreladas

[00313] A fim de investigar se o knockdown de NEK6 exibe eficácia contra fibrose, as quantidades de genes relacionados à fibrose foram analisadas em células transfectadas com siRNAs de NEK6.

[00314] Células hepáticas estreladas humanas primárias isoladas de fígado humano foram cultivadas em uma placa de cultura celular revestida com PLL por 5 dias. Depois, siRNAs para NEK6 humano (KB-004) foram transfectados utilizando Lipofectamine RNAi MAX. 48 depois da transfecção, o meio foi mudado do meio para células estreladas, contendo FCS 2% e suplemento para crescimento de células estreladas 1%, para meio contendo FCS 0,2% e SteCGS 1%. 72 depois da transfecção, LPS foi adicionado ao meio para que fosse obtida uma concentração final de 100 ng/ml. Onze horas e meia depois da adição de LPS, proteína TGF-β humana foi adicionada para que fosse obtida uma concentração final de 5 ng/ml. 24 horas depois da adição de TGF-β, os RNAs foram extraídos das células transfectadas com KB-004, utilizando o kit RNeasy Mini. Os RNAs assim obtidos foram submetidos à transcrição reversa com o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription para fornecer cDNAs. Os cDNAs assim obtidos foram submetidos à PCR em tempo real por meio de ensaios de expressão gênica com TaqMan para detectar a influência sobre as quantidades de

97 / 104 transcritos de genes pelo knockdown de NEK6. As quantidades de transcritos do gene NEK6, do gene Fibronectina e do gene αSMA foram calculadas dividindo um valor medido na sonda NEK6 Taqman (HS00205221_m1, Applied Biosystems(R)), um valor medido na sonda Fibronectina Taqman (HS01549976_m1, Applied Biosystems(R)) ou um valor medido na sonda αSMA Taqman (HS00426835_g1, Applied Biosystems(R)) por um valor medido da Sonda 18s.

[00315] A Figura 15a mostra a quantidade de transcritos do NEK6 quando gene NEK6 teve a expressão reduzida, a Figura 15b mostra a quantidade de transcritos do gene Fibronectina quando NEK6 teve a expressão reduzida e a Figura 15c mostra a quantidade de transcritos do gene αSMA quando NEK6 teve a expressão reduzida. Com os siRNAs de NEK6, as quantidades de transcritos dos gene Fibronectina e αSMA que são elevadas por TGF-β foram diminuídas. Consequentemente, foi mostrado que o knockdown de NEK6 suprime a fibrogênese. Exemplo 13: Influência de siRNAs de NEK6 sobre a fosforilação de proteína SMAD3 em fibroblasto renal

[00316] A fim de investigar a possibilidade de que a proteína NEK6 pode controlar o sinal de TGF-β, a quantidade de SMAD3 fosforilada foi analisada em células transfectadas com siRNAs de NEK6.

[00317] Células da linhagem NRK-49F de fibroblastos renais de rato foi transfectada com siRNAs para NEK6 humano (KB-004) utilizando Lipofectamine RNAi MAX. 24 depois da transfecção, o meio foi mudado do meio DMEM, contendo FCS 10%, para meio DMEM contendo FCS 0,1%. 48 depois da transfecção, proteína TGF-β humana foi adicionada para que fosse obtida uma concentração final de 5 ng/ml. Trinta minutos ou uma hora depois da adição, as células foram lisadas 2 × tampão de amostra SDS (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS 4%, ureia 6 M, glicerol 12%, coquetel inibidor de proteases 2%, coquetel inibidor de fosfatase 1%) para fornecer um extrato celular. Ao

98 / 104 extrato celular assim obtido, β-mercaptoetanol e azul de bromofenol foram adicionados para que fossem obtidas as concentrações finais de 5% e 0,025%, respectivamente, e então aquecidos a 95 ºC por 4 minutos para fornecer uma amostra. Com a amostra assim obtida, SDS-PAGE foi realizada para separar as proteínas contidas na amostra de acordo com seus tamanhos. Em seguida, as proteínas separadas foram transferidas para uma membrana PVDF e submetidas a Western blotting com um anticorpo anti-SMAD3 fosforilada e um anticorpo anti-SMAD3, um anticorpo anti-NEK6 (Abcam plc.) e um anticorpo anti-Vinculina.

[00318] A Figura 16 mostra os resultados do Western blotting da proteína SMAD3 fosforilada quando NEK6 teve a expressão reduzida. Com o uso de siRNAs de NEK6, a quantidade de proteína NEK6 foi diminuída, e a quantidade de SMAD3 fosforilada que é elevada por TGF-β foi diminuída. Consequentemente, foi mostrado que a fosforilação a proteína SMAD3 é suprimida pelo knockdown de NEK6. Exemplo 14: Avaliação da eficácia de siRNAs de NEK6 em modelos de fibrogênese hepática induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

[00319] A fim de averiguar se o knockdown de NEK6 exibe eficácia contra fibrose, siRNAs de NEK6 foram administrados por via intravenosa a camundongos modelo com CCl4 e submetido à análise de ação anti- fibrogênese.

[00320] A camundongos male C57BL/6J machos com 7 semanas de idade (Charles River Laboratories Japan, Inc.), foi administrada uma solução de óleo de oliva contendo CCl4 10% v/v (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) por via intraperitoneal a 10 mL/kg de peso corporal no Dia 0, 4, 7 e 11 para criar camundongos modelo de fibrogênese hepática. O agrupamento foi realizado pelo peso corporal no dia antes da administração inicial de CCl4, e o desenho dos grupos foi um grupo com administração de solução que não recebeu CCl4 (n = 5), um grupo com administração de

99 / 104 solvente que recebeu CCl4 (n = 10) e um grupo com administração de ácido nucleico que recebeu CCl4 (n = 10). Utilizando KB-004 como siRNAs de NEK6 e o reagente Invivofectamine 3.0 (Thermo Fisher Scientific Inc.) como solvente de administração, preparou-se uma solução para administração do ácido nucleico 0,3 mg/mL de acordo com o protocolo do produto de Invivofectamine 3.0. Para o grupo de administração do ácido nucleico, a solução para administração do ácido nucleico contendo KB-004 foi administrada pela veia da cauda para que fossem fornecidos 3 mg/kg de peso corporal; e para o grupo administrado com solvente, o solvente para administração, em uma quantidade igual àquela do grupo com administração do ácido nucleico, foi administrado pela via da cauda antes da administração inicial de CCl4 e 10 dias de indução da patologia. A avaliação do transtorno hepático e da fibrogênese foi realizada 13 dias depois de indução da patologia (Exemplos 15, 16, 17 e 19). Exemplo 15: Análise de marcadores de transtorno hepático em modelos com CCl4

[00321] A fibrogênese tem sido entendida como um processo de cicatrização excessiva de feridas contra o transtorno de uma célula ou tecido. Assim, a supressão do transtorno de uma célula ou tecido juntamente com da fibrogênese foi considerada eficaz para o tratamento de vários tipos de fibrose. Então, a fim de investigar se o knockdown de NEK6 exibiria efeito sobre transtorno hepático, a medição de marcadores de transtorno hepático foi realizada em modelos com CCl4.

[00322] No Dia 13 após indução da patologia, foi coletado sangue da veia da cauda utilizando um tubo capilar plano para amostragem de sangue, e submetido ao repouso por 30 minutos ou mais. O sangue após o repouso foi centrifugado para obter soro. A transaminase glutâmico pirúvica (GPT) e a transaminase glutâmico oxaloacética (GOT) séricas foram medidas com o teste Transaminase CII da Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). O

100 / 104 método de medição seguiu a instrução para o reagente.

[00323] A Figura 17a mostrou os resultados da medição de GPT sérica, e a Figura 17b mostrou os resultados da medição de GOT sérica. A elevação de GPT e GOT séricas, encontrada em modelos com CCl4, foi suprimida pela administração de siRNAs de NEK6. Consequentemente, foi mostrado que o knockdown de NEK6 suprime transtorno hepático. Exemplo 16: Análise da fosforilação de proteína SMAD3 em modelos com CCl4

[00324] A fim de investigar se o knockdown de NEK6 exibiria efeito sobre a fosforilação da proteína SMAD3, a quantidade de SMAD3 fosforilada em modelos com CCl4 foi analisada.

[00325] Um fígado coletado no Dia 13 após indução da patologia foi congelado e triturado até ficar em pó. Ao fígado em pó, adicionou-se tampão de lise (NaCl 150 mM, NP40 1%, SDS 0,1%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, fluoreto de benzilsulfonila 1 mM, coquetel inibidor de proteases 2%, coquetel inibidor de fosfatase 1%), e um extrato do órgão foi preparado utilizando um gerador ultrassônico manual. Ao sobrenadante obtido por centrifugação do extrato do órgão, β-mercaptoetanol e azul de bromofenol foram adicionados para que fossem obtidas as concentrações finais de 5% e 0,025%, respectivamente. Depois, foi feito aquecimento a 95 ºC por 4 minutos para fornecer uma amostra. Com a amostra assim obtida, SDS-PAGE foi realizada para separar as proteínas contidas na amostra de acordo com seus tamanhos. Em seguida, as proteínas separadas foram transferidas para uma membrana PVDF e submetidas a Western blotting com um anticorpo anti-SMAD3 fosforilada (Abcam plc.) e um anticorpo anti- SMAD3, um anticorpo anti-NEK6 (Abcam plc.) e um anticorpo anti- Vinculina. SMAD3 fosforilada foi calibrada pela quantidade de SMAD3 total.

[00326] A Figura 18 mostra os resultados do Western blotting da proteína SMAD3 fosforilada quando NEK6 teve a expressão reduzida. Com o

101 / 104 uso de siRNAs de NEK6, a quantidade de proteína NEK6 foi diminuída, e a quantidade de SMAD3 fosforilada, que é elevada por TGF-β, foi diminuída. Consequentemente, foi mostrado que o knockdown de NEK6 suprime a fosforilação da proteína SMAD3 no fígado de um modelo com CCl4. Exemplo 17: Análise de genes relacionados à fibrose em modelos com CCl4

[00327] A fim de investigar se o knockdown de NEK6 exibiria eficácia contra fibrogênese, as quantidades de transcritos de genes relacionados à fibrose em modelos com CCl4 foram analisadas.

[00328] RNAs foram extraídos de um fígado coletado no Dia 13 após indução de patologia, utilizando o reagente QIAzol Lysis (QIAGEN N.V). Subsequentemente, os RNAs foram purificados com o kit RNeasy mini e submetidos à reação de transcrição reversa utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription. As quantidades de transcritos da Sonda NEK6 Taqman (Mm00480730_m1, Applied Biosystems(R)); da sonda Col1a1 Taqman (Mm00801666_g1, Applied Biosystems(R)), da sonda Col3a1 Taqman (Mm01254476_m1, Applied Biosystems(R)) e da sonda Timp1 Taqman (Mm01341361_m1, Applied Biosystems(R)), como genes relacionados à fibrose, foram medidas por meio do ensaio de expressão gênica com TaqMan, e a razão relativa para a quantidade de transcritos da sonda 18s rRNA Taqman (Hs99999901_s1, Applied Biosystems(R)), que é um controle interno, é definida como a quantidade de transcritos de cada gene.

[00329] As quantidades de transcritos de cada gene em modelos com CCl4 são mostradas nas Figuras 19a-d. A quantidade de transcritos do gene NEK6 diminuiu pela administração de siRNAs de NEK6. A partir disso, foi mostrado que KB-004 utilizado suprimiu eficientemente a transcrição do gene alvo. Neste momento, as quantidades de transcritos de genes relacionados à fibrose (Col1a1, Col3a1, Timp1) que são derivadas pela indução da patologia diminuíram significativamente. Consequentemente, foi mostrado que o knockdown de NEK6 suprime a fibrogênese.

102 / 104 Exemplo 18: Análise de genes relacionados à fibrose em modelos de fibrogênese hepática induzida pela ligadura de ductos biliares (BDL)

[00330] A fim de investigar se o knockdown de NEK6 exibe eficácia contra fibrose, siRNAs de NEK6 foram administrados por via intravenosa a camundongos modelo de fibrogênese hepática induzida pela ligadura de ductos biliares (modelos BDL) para analisar as quantidades de transcritos de genes relacionados à fibrose.

[00331] Camundongos C57BL/6J de nove semanas de idade (Charles River Laboratories Japan, Inc.) foram agrupados de acordo com o peso corporal, e a solução de KB-004 (0,3 mg/mL) preparada de acordo com a bula do produto do reagente para transferência de genes, Invivofectamine 3.0 (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi administrada pela veia da cauda a uma dose de 3 mg/kg de peso corporal (n = 12). A um grupo controle, somente solvente foi administrado (n = 15). No dia seguinte ao da administração, o ducto biliar comum foi ligado em dois pontos para criar um camundongo modelo de fibrogênese hepática. A um grupo operado com simulação, solução salina (Otsuka Normal Saline) foi administrada pela veia da cauda, e apenas o descolamento do ducto biliar comum foi realizado (n = 7). Um fígado foi coletado no Dia 14 após a ligadura do ducto biliar; e as quantidades de transcritos da sonda NEK6 Taqman (Mm00480730_m1, Applied Biosystems(R)), da sonda Col1a1 Taqman (Mm00801666_g1, Applied Biosystems(R)), da sonda Col3a1 Taqman (Mm01254476_m1, Applied Biosystems(R)) e da sonda Timp1 Taqman (Mm01341361_m1, Applied Biosystems(R)), como genes relacionados à fibrose, foram medidas de maneira semelhante à descrita acima, e a razão relativa para a quantidade de transcritos da sonda GAPDH Taqman (Mm9999995_g1, Applied Biosystems(R)), que é um controle interno, é definida como a quantidade de transcritos de cada gene.

[00332] As quantidades de transcritos de cada gene em modelos BDL

103 / 104 são mostradas nas Figuras 20 a-d. A quantidade de transcritos do gene NEK6 diminuiu pela administração de siRNAs de NEK6. A partir disso, foi mostrado que KB-004 usado suprimiu eficientemente a transcrição do gene alvo. Neste momento, as quantidades de transcritos de genes relacionados à fibrose (Col1a1, Col3a1, Timp1), que são derivadas por indução da patologia, diminuíram significativamente. Consequentemente, foi mostrado que o knockdown de NEK6 suprime a fibrogênese. Exemplo 19: Análise patológica em modelos com CCl4

[00333] A fim de investigar se o knockdown de NEK6 exibiria efeito contra um modelo de fibrogênese hepática induzida por CCl4, foi realizada a observação histopatológica.

[00334] O lobo interno direito de um fígado foi coletado no Dia 13 após indução da patologia, e fixado com solução de formalina neutra tamponada 10%. Depois de incorporação em parafina, foram obtidos cortes do tecido que foram corados com hematoxilina-eosina.

[00335] A Figura 21 mostra exemplos representativos da histopatologia. A Figura 21a representa os resultados do grupo com administração de solução salina que não recebeu CCl4, a Figura 21b representa os resultados do grupo com administração de solvente que recebeu CCl4, e a Figura 21c representa os resultados do grupo com administração de do ácido nucleico que recebeu CCl4. A degeneração vacuolar averiguada numerosamente na Figura 21b indica transtorno celular, e uma área que está abundantemente presente em volta da parte central e na qual os núcleos não estão corados indica necrose celular. Transtorno, necrose e os semelhantes encontrados em um tecido hepático de um modelo com CCl4 foram diminuídos pela administração de siRNAs de NEK6 siRNAs. Consequentemente, foi mostrado que o knockdown de NEK6 suprime a histopatologia em um modelo de fibrogênese hepática induzida por CCl4. Aplicabilidade industrial

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[00336] De acordo com a presente invenção, um novo inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3 e um agente terapêutico para fibrose podem ser providos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Inibidor de fosforilação da proteína SMAD2/3, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 como ingrediente ativo.

2. Agente terapêutico para fibrose, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que suprime a expressão do gene NEK6 como ingrediente ativo.

3. Molécula de ácido nucleico de fita dupla, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em (a), (b), (c), (d) e (e) seguintes: (a) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 6 na extremidade 3’, (b) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 2 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 7 na extremidade 3’, (c) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 3 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 8 na extremidade 3’, (d) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 4 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 9 na extremidade 3’, e (e) uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que compreende uma fita guia com 19 a 30 nt (fita antisense), compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 5 na extremidade 5’, e uma fita passageira com 19 a 30 nt (fita sense) compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 10 na extremidade 3’.

4. Molécula de ácido nucleico de fita dupla de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que 1 a 11 resíduos de ribonucleotídeos e/ou resíduos de desoxirribonucleotídeos são ainda adicionados à extremidade 3’ da fita guia (fita antisense) e/ou à fita passageira (fita sense) para formar uma extremidade saliente.

5. Molécula de ácido nucleico de fita simples formando uma estrutura de RNA do tipo grampo de cabelo, caracterizada pelo fato de que a extremidade 3’ da fita passageira (fita sense) e a extremidade 5’ da fita guia (fita antisense), definidas na reivindicação 3 ou 4, são unidas uma à outra por intermédio de uma sequência ligante de um resíduo de nucleotídeo e/ou um ligante de estrutura não nucleotídica, ou a extremidade 3’ da fita guia (fita antisense) e a extremidade 5’ da fita passageira (fita sense), definidas na reivindicação 3 ou 4, são unidas uma à outra por intermédio de uma sequência ligante de um resíduo de nucleotídeo e/ou um ligante de estrutura não nucleotídica.

6. Molécula de ácido nucleico de fita simples do (A) ou (B) abaixo, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência que suprime a expressão do gene NEK6 selecionada dentre SEQ ID NOs: 1 a 5: (A) a molécula de ácido nucleico que compreende ou consiste em somente uma região (X), uma região de ligação (Lx) e uma região (Xc), em que a região (Xc), a região de ligação (Lx) e a região (X) estão dispostas nessa ordem, do lado 5’ para o lado 3’, em que a região (Xc) é complementar à região (X),

em que a região de ligação (Lx) possui uma estrutura não nucleotídica compreendendo pelo menos um dentre um esqueleto de pirrolidina e um esqueleto de piperidina, e em que a região (X) compreende a sequência que suprime a expressão; (B) a molécula de ácido nucleico compreendendo uma região (Xc), uma região de ligação (Lx), uma região (X), uma região (Y), uma região de ligação (Ly) e uma região (Yc) nessa ordem, do lado 5’ para o lado 3’, em que a região (X) e a região (Y) são ligadas e formam uma região interna (Z), em que a região (Xc) é complementar à região (X), em que a região (Yc) é complementar à região (Y), e em que a região de ligação (Lx) e/ou a região de ligação (Ly) possuem uma estrutura não nucleotídica compreendendo pelo menos um dentre um esqueleto de pirrolidina e um esqueleto de piperidina, e em que a região interna (Z) compreende a sequência que suprime a expressão .

7. Molécula de ácido nucleico de fita simples de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a região de ligação (Lx) e/ou (Ly) são representadas pela fórmula (I) seguinte: em que X1 e X2 são cada um independentemente H2, O, S ou NH; Y1 e Y2 são cada um independentemente uma ligação simples, CH2, NH, O ou S;

R3 é um átomo de hidrogênio ou um substituinte ligado a C-3, C-4, C-5 ou C-6 no anel A; L1 é uma cadeia de alquileno com número n de átomos de carbono, em que cada um dos átomos de hidrogênio no átomo de carbono do alquileno pode ou não ser substituído por OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH ou SRa, ou L1 é uma cadeia de poliéter na qual um ou mais átomos de carbono na cadeia do alquileno são substituídos por um ou mais átomos de oxigênio, com a condição de que, se Y1 for NH, O ou S, então um átomo em L1 ligado a Y1 é carbono, um átomo em L1 ligado a OR1 é carbono e os átomos de oxigênio não são adjacentes um ao outro; L2 é uma cadeia de alquileno com número m de átomos de carbono, em que cada um dos átomos de hidrogênio no átomo de carbono do alquileno pode ou não ser substituído por OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH ou SRc, ou L2 é uma cadeia de poliéter na qual um ou mais átomos de carbono na cadeia do alquileno são substituídos por um ou mais átomos de oxigênio, com a condição de que, se Y2 for NH, O ou S, então um átomo em L2 ligado a Y2 é carbono, um átomo em L2 ligado a OR2 é carbono e os átomos de oxigênio não são adjacentes um ao outro; Ra, Rb, Rc e Rd são cada um independentemente um substituinte ou um grupo protetor; l é 1 ou 2; m é um número inteiro variando de 0 a 30; n é um número inteiro variando de 0 a 30; um átomo de carbono no anel A, excluindo C-2, pode ser substituído por nitrogênio, oxigênio ou enxofre,

o anel A pode compreender uma ligação dupla carbono- carbono ou uma ligação dupla carbono-nitrogênio no mesmo, a região (Xc) e a região (X) são, cada uma, ligadas à região de ligação (Lx) por intermédio de -OR1- ou OR2-, a região (Yc) e a região (Y) são, cada uma, ligadas à região de ligação (Ly) por intermédio de -OR1- ou OR2-, respectivamente, em que R1 e R2 podem ou não estar presentes e, se presentes, R1 e R2 são cada um independentemente um resíduo de nucleotídeo ou a estrutura (I).

8. Molécula de ácido nucleico de fita simples de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que X ou Z compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 11 a

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