WO2020152869A1 - 線維症治療剤 - Google Patents

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WO2020152869A1
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nek6
nucleic acid
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gene
fibrosis
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一久 中尾
石山　順一
航 市川
淳 増井
ゆにけ 赤坂
亜弥 本田
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杏林製薬株式会社
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    • A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5184—Virus capsids or envelopes enclosing drugs

Definitions

  • the present invention relates to an antisense nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene and a medicine containing the nucleic acid as an active ingredient.
  • Fibrosis is a disease in which organ function is impaired due to excessive collagen accumulation and progresses irreversibly.
  • organs causing the disease For example, skin, lung, liver, pancreas, kidney, bone marrow, etc. are known as the organs causing the disease. ..
  • Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) which is a type of pulmonary fibrosis, has a high incidence of 2.5 to 5 after confirmation of diagnosis, although the number of patients is about 20 per 100,000 and the morbidity is not high. It has been designated as an intractable disease in Japan due to poor year and post-treatment course.
  • pirfenidone and nintedanib have been approved by the Japanese Ministry of Health, Labor and Welfare and are on the market. Although both drugs have the effects of suppressing lung capacity decline and prolonging the progression-free period, and delaying the progression of the disease state, their therapeutic effects are not sufficiently satisfactory, and the development of therapeutic drugs based on a new mechanism is desired. There is.
  • the "NEK6 protein” which is the target of the present invention, is known as one of NIMA-related serine/threonine kinase family involved in the regulation of cell division, but it has not been paid much attention as a research target of drug development so far. .. Although the potential as a drug discovery target of cancer was reported in 2002, there is no specific report on the interaction of NEK6 protein with SMAD2/3 protein and the promotion of tissue fibrosis.
  • the object of the present invention is to provide a novel SMAD2/3 protein phosphorylation inhibitor and a fibrosis therapeutic agent.
  • the present inventors focused their attention on the fact that the mRNA level of NEK6 (NIMA-related serine/threonine kinase 6) was found to be elevated by analysis using a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model, and as a result, NEK6 The inventors have found that the SMAD system signal that contributes to fibrosis is regulated downstream of - ⁇ , and have completed the present invention.
  • NEK6 NIMA-related serine/threonine kinase 6
  • the present invention is as follows. [1] A SMAD2/3 protein phosphorylation inhibitor containing an antisense nucleic acid that suppresses NEK6 gene expression as an active ingredient; [2] A therapeutic agent for fibrosis containing an antisense nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene as an active ingredient; [3] The therapeutic agent according to [2], wherein the fibrosis is lung fibrosis, liver fibrosis or renal fibrosis; [4] A sequence having at least 90% sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 1, a sequence having at least 90% sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 2 and a sequence identity of at least 90% with the sequence of SEQ ID NO: 3 An antisense nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene, comprising a sequence selected from the group consisting of sequences having: [5] An antisense nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene, which comprises a sequence selected from the
  • [6] A method for inhibiting phosphorylation of SMAD2/3 protein, which comprises administering to a subject an antisense nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene; [7] A method for treating fibrosis, which comprises administering an antisense nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene to a subject; [8] An antisense nucleic acid that suppresses expression of the NEK6 gene used for inhibiting phosphorylation of SMAD2/3 protein; [9] An antisense nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene used for fibrosis treatment; [10] Use of an antisense nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene, for producing a phosphorylation inhibitor of SMAD2/3 protein; [11] Use of an antisense nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene, for producing a therapeutic agent for fibrosis; [12] The use according to [11], wherein
  • a nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene has a sequence having at least 90% sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 1, a sequence having at least 90% sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3
  • An inhibitor of [13] which is a nucleic acid comprising a sequence selected from the group consisting of sequences having at least 90% sequence identity with the sequence of [17]
  • the inhibitor of [13] wherein the nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene is a nucleic acid containing a sequence selected from the group consisting of the sequence of SEQ ID NO: 1, the sequence of SEQ ID NO: 2 and the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Phosphorylation of SMAD2/3 protein which comprises administering to a subject a nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene and targets a sequence on the 3′ untranslated region of mRNA of NEK6 gene.
  • a method for treating fibrosis which comprises administering to a subject a nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene, the nucleic acid targeting a sequence on the 3′ untranslated region of mRNA of the NEK6 gene; [20] A nucleic acid used for inhibiting phosphorylation of SMAD2/3 protein, which suppresses the expression of NEK6 gene and targets a sequence on the 3′ untranslated region of mRNA of NEK6 gene; [21] A nucleic acid used for the treatment of fibrosis, which suppresses the expression of the NEK6 gene and targets a sequence on the 3′ untranslated region of the NEK6 gene mRNA; [22] Use of a nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene for producing a phosphorylation inhibitor of the SMAD2/3 protein, wherein the nucleic acid targets a sequence on the 3′ untranslated region of the mRNA of
  • Use that is to: [23] Use of a nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene for producing a therapeutic agent for fibrosis, wherein the nucleic acid targets a sequence on the 3′ untranslated region of mRNA of NEK6 gene.
  • nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene is a nucleic acid containing a sequence of KB-XAX, KB-XBX or KB-XCX; [25] The inhibitor of [1], wherein the antisense nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene has 10 to 40 bases; [26] The inhibitor according to [1], wherein the antisense nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene has 12 to 21 bases; [27] The inhibitor of [1], in which artificial nucleic acid is introduced at both ends of the sequence of the antisense nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene; [28] The inhibitor of [1], wherein the antisense nucleic acid that suppresses the expression of the NEK6 gene has 12 to 21 bases, and artificial nucleic acids are introduced at both ends of the sequence; [29] The therapeutic agent according to [2], wherein the
  • FIG. 3 is a diagram showing the sequence of NEK6 gene mRNA and the target site of each antisense nucleic acid prepared in Example 1. The shaded area indicates the untranslated region. (Note that U (uracil) on the mRNA sequence is expressed as T (thymine))
  • FIG. 2 is a graph showing the transcription amount of the NEK6 gene when each antisense nucleic acid was introduced.
  • FIG. 3 shows the result of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down by each antisense nucleic acid.
  • FIG. 1 is a diagram showing the sequence of NEK6 gene mRNA and the target site of each antisense nucleic acid prepared in Example 1. The shaded area indicates the untranslated region. (Note that U (uracil) on the mRNA sequence is expressed as T (thymine))
  • FIG. 2 is a graph showing the transcription amount of the NEK6 gene when each antisense nucleic acid was introduced
  • FIG. 4 shows the results obtained by quantifying the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down by each antisense nucleic acid and correcting the phosphorylated SMAD3 amount by the total SMAD3 amount.
  • Figure 5a represents the results of co-immunoprecipitation with anti-NEK6 antibody.
  • Figure 5b represents the results of co-immunoprecipitation with anti-FLAG antibody.
  • FIG. 6 shows the result of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein in the case of reacting His-fused NEK6 protein with GST-fused SMAD3 protein.
  • FIG. 7a shows the result of Western blotting when NEK6 was knocked down by siRNA.
  • FIG. 7b shows the light emission of firefly luciferase when NEK6 was knocked down.
  • FIG. 8 shows the transcription level of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down by each antisense nucleic acid in hepatic stellate cells.
  • FIG. 9 shows the transcription level of the Fibronectin gene when NEK6 was knocked down by each antisense nucleic acid in hepatic stellate cells.
  • FIG. 10a shows the transcription amount of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down by siRNA in lung fibroblasts.
  • FIG. 10b shows the transcription amount of the ⁇ SMA gene in lung fibroblasts when NEK6 was knocked down by siRNA.
  • FIG. 11 shows the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein in kidney fibroblasts when NEK6 was knocked down by siRNA.
  • FIG. 12a shows the measurement results of serum GPT when NEK6 was knocked down by siRNA in the CCl 4 model.
  • FIG. 12b shows the measurement result of serum GOT when NEK6 was knocked down by siRNA in the CCl 4 model.
  • FIG. 13 shows the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down by siRNA in the CCl 4 model.
  • FIG. 14a shows the transcription amount of the NEK6 gene when NEK6 was knocked down by siRNA in the CCl 4 model.
  • FIG. 14b shows the transcription amount of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down by siRNA in the CCl 4 model.
  • FIG. 14c shows the transcription amount of the Col3a1 gene when NEK6 was knocked down by siRNA in the CCl 4 model.
  • FIG. 14d shows the transcription amount of the Timp1 gene when NEK6 was knocked down by siRNA in the CCl 4 model.
  • FIG. 15a shows the transcription amount of the NEK6 gene when NEK6 was knocked down by siRNA in the BDL model.
  • FIG. 15b shows the transcription amount of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down by siRNA in the BDL model.
  • FIG. 15c shows the transcription amount of the Col3a1 gene when NEK6 was knocked down by siRNA in the BDL model.
  • FIG. 15d shows the transcription amount of the Timp1 gene when NEK6 was knocked down by siRNA in the BDL model.
  • FIG. 16 shows the results of pathological analysis of the liver when NEK6 was knocked down by siRNA in the CCl 4 model.
  • FIG. 16a shows the results of the physiological saline-administered group that was not administered with CCl 4 .
  • FIG. 16b shows the results of the CCl 4 administration vehicle administration group.
  • FIG. 16c shows the result of the nucleic acid administration group of CCl 4 administration.
  • the terms used in this specification have the meanings commonly used in the technical field concerned.
  • the “number of bases” means, for example, “length” and can also be referred to as “base length”.
  • the numerical range of the number of bases is, for example, all positive integers belonging to the range are disclosed.
  • the description of “1 to 4 bases” means “1, 2, 3, Means all disclosures of "4 bases”.
  • the present invention provides a SMAD2/3 protein phosphorylation inhibitor containing an antisense nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene as an active ingredient, a fibrosis therapeutic agent containing the nucleic acid as an active ingredient, and a nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene.
  • a SMAD2/3 protein phosphorylation inhibitor containing a nucleic acid targeting a sequence on the 3'untranslated region of NEK6 gene mRNA as an active ingredient, and a fibrosis therapeutic agent containing the nucleic acid as an active ingredient It is a thing.
  • the content of the present invention will be described in detail.
  • Nucleic acid that suppresses expression of NEK6 gene NEK6 protein is one of 11 NIMA-related serine/threonine kinase families involved in cell division control, and is phosphorylated (activated) in the M phase of the cell cycle. To be done.
  • the NEK6 gene which is the target of the present invention, is a gene of mammalian origin, preferably a human gene. Seven types of human-derived NEK6 genes have been reported, and the mRNA sequence of isoform 2 (NCBI GenBank accession number: NM_014397) among them is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 4).
  • the mechanism of suppressing the expression of NEK6 gene by the nucleic acid molecule is not particularly limited as long as it can downregulate the expression.
  • the suppression of NEK6 gene expression can be confirmed by a decrease in the amount of transcripts produced from the NEK6 gene, a decrease in the amount of translation products produced from the NEK6 gene, or a decrease in the activity of the translation products.
  • nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene examples include antisense nucleic acid of NEK6 mRNA, siRNA, ssPN molecule, ssNc molecule, miRNA, ribozyme and the like.
  • the nucleic acid may be a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
  • a nucleic acid prepared based on the mRNA sequence of NEK6 isoform 2 (SEQ ID NO: 4) is preferable.
  • the above nucleic acid can be prepared based on the 3'untranslated region of the mRNA sequence of NEK6 isoform 2.
  • An antisense nucleic acid is an oligonucleotide (antisense DNA and/or antisense) that forms a duplex with a target mRNA in a sequence-specific manner and performs functional inhibition such as splicing inhibition and translation inhibition.
  • RNA which is effective when the antisense nucleic acid for the full length or a part of the target mRNA is introduced into the cell.
  • the mechanism of inhibiting the expression of antisense nucleic acid is 1) Three-dimensional inhibition of the translation initiation complex whose target sequence is the region from the 5'cap site of mRNA to about 25 bases downstream of the start codon 2) Single-stranded DNA complementary to the target mRNA and mediated by RNaseH MRNA degradation 3) Inhibition of splicing targeting the boundary region between exon and intron of pre-mRNA (inhibition of maturation of mRNA) Can be given.
  • the mechanism is not particularly limited as long as it suppresses the expression of NEK6 gene.
  • sequence contained in the antisense nucleic acid it is preferable to select a sequence specific to the NEK6 gene.
  • it is complementary to the NEK6 gene and is not complementary to the NEK7 gene (RefSeq database: NM_1333494.2), or one or more (eg, 1 to 3) bases in the region are non-complementary to the NEK7 gene ( Mismatch) can be selected.
  • Increasing the number of bases that are complementary to the NEK6 gene and non-complementary (mismatch) to the NEK7 gene is effective in avoiding the off-target effect. Useful in.
  • the number of bases contained in the antisense nucleic acid according to this embodiment is not particularly limited as long as it exerts an effect of suppressing the expression of the NEK6 gene, but is, for example, 10 to 40 bases, 10 to 35 bases, 12 to 30 bases, or It may be 12 to 21 bases.
  • An antisense nucleic acid that suppresses NEK6 gene expression can be obtained based on the cDNA sequence information of the mature NEK6 mRNA, for example, according to an antisense nucleic acid sequence design system such as Antisense LNA (registered trademark) GapmeR designtool.
  • the antisense nucleic acid preferably contains a modified nucleotide residue from the viewpoint of RNA binding stability (Tm value, etc.), mismatch sequence recognition ability, nuclease resistance, RNaseH activity and the like.
  • sequence identity of the sequences contained in the antisense nucleic acid with the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 may be 90% or more, 92% or more, 95% or more, or 98% or more, or 100%. ..
  • modifications may be added to the antisense nucleic acids of [1] to [3] to the extent that the action of suppressing the expression of the NEK6 gene is not lost.
  • modifications may be present in the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 or may be present outside the sequences. Details of modified nucleotides and the like will be described later.
  • An antisense nucleic acid that suppresses NEK6 gene expression can be easily obtained by a known method based on the nucleotide sequence of the NEK6 gene. For example, it can be appropriately designed based on the mRNA sequence information of the NEK6 gene such as the sequence of NEK6 isoform 2 mRNA (SEQ ID NO: 4) and synthesized by a conventionally known method.
  • Examples of the above-mentioned synthetic method include a synthetic method by a genetic engineering method, a chemical synthetic method and the like.
  • the genetic engineering method include an in vitro transcription synthesis method, a method using a vector, and a method using a PCR cassette.
  • the vector is not particularly limited, and examples thereof include non-viral vectors such as plasmids and viral vectors.
  • the chemical synthesis method is not particularly limited, and examples thereof include a phosphoramidite method and an H-phosphonate method.
  • a commercially available automatic nucleic acid synthesizer can be used.
  • siRNA small interfering RNA
  • NEK6 small interfering RNA
  • SiRNA is a nucleic acid molecule consisting of a guide strand (antisense strand) that pairs with a target gene and a passenger strand (sense strand) that forms a double strand with the guide strand.
  • the siRNA is incorporated into a complex called RNA-inducing silencing complex (RISC) that has Argonaute (AGO) protein as the core in the cell, and then the sense strand is decomposed by AGO and the guide strand remains in RISC.
  • RISC RNA-inducing silencing complex
  • AGO Argonaute
  • the seed region of the guide strand (7 base region of 2-8 bases from the 5'end of the guide strand) is considered to have an important function in recognizing the target sequence, and avoids the off-target effect.
  • NEK6 mature mRNA (RefSeq database: NM_014397) for the seed region of the nucleic acid which is the active ingredient of the present invention.
  • it is complementary to NEK6 mature mRNA and is not complementary to NEK7 mature mRNA (RefSeq data base NM_133494.2), or one or more (eg 1 to 3) bases in the region are non-complementary to NEK7 mature mRNA.
  • One example is selecting a nucleic acid containing a (mismatch) sequence as a seed region.
  • the full-length sequence for example, it increases the number of bases that are complementary to NEK6 mature mRNA and non-complementary (mismatch) to NEK7 mature mRNA (for example, 4 or more, preferably 5 to 7). ) Is useful in avoiding off-target effects.
  • the number of bases of the expression suppressing sequence contained in the guide strand is, for example, 15 to 30 bases, preferably 19 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases, and further preferably 21, 22, 23. It is a base, particularly preferably 23 bases.
  • the expression-suppressing sequence may have an additional sequence on the 3'side to form a protruding end.
  • the number of bases in the additional sequence is, for example, 1 to 11 bases, preferably 1 to 4 bases.
  • the additional sequence may be a ribonucleotide residue or a deoxyribonucleotide residue.
  • the number of bases in the guide chain is, for example, 19 to 50 bases, preferably 19 to 30 bases, more preferably 19 to 25 bases, further preferably 19 to 23 bases, and particularly preferably 21 bases. , 22 and 23 bases, and particularly preferably 23 bases.
  • the passenger chain has, for example, 19 to 50 bases, preferably 19 to 30 bases, more preferably 19 to 25 bases, still more preferably 19 to 23 bases, and most preferably 21 bases. , 22 and 23 bases, and particularly preferably 21 bases.
  • the region complementary to the guide strand is, for example, 19 to 50 bases, preferably 19 to 30 bases, more preferably 19 to 25 bases, and further preferably 19 to 23 bases. Is.
  • the above region may further have an additional sequence on the 3'side.
  • the number of bases in the addition sequence is, for example, 1 to 11 bases, preferably 1 to 4 bases, and the addition sequence may be a ribonucleotide residue or a deoxyribonucleotide residue.
  • the passenger strand may be, for example, complementary or one or several bases may be non-complementary to the region showing the complementarity of the guide strand, but it is preferably complementary.
  • the above-mentioned 1 base or several bases are, for example, 1 to 3 bases, preferably 1 base or 2 bases.
  • siRNA that suppresses the gene expression of NEK6 can be obtained according to the siRNA sequence design system such as siSNIPER (registered trademark) and siDirect (registered trademark) for drug discovery/diagnosis research based on the cDNA sequence information of NEK6 mature mRNA. it can.
  • siSNIPER registered trademark
  • siDirect registered trademark
  • the NEK6 siRNA is preferably an siRNA that acts specifically on NEK6, and examples thereof include the following double-stranded nucleic acids.
  • A a double-stranded nucleic acid molecule formed from a guide strand (antisense strand) containing a sequence having at least 90% sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 1 and a passenger strand (sense strand)
  • SEQ ID NO: A double-stranded nucleic acid molecule (c) consisting of a guide strand (antisense strand) having a sequence having at least 90% sequence identity with the sequence of 2, and a sequence of SEQ ID NO:3.
  • Sequence identity of the sequence contained in the guide strand (antisense strand) contained in the double-stranded nucleic acid molecule with the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 90 is 90% or more, 92% or more, 95% or more, or 98% or more. Or may be 100%.
  • siRNA that suppresses the expression of NEK6 gene has a linker sequence consisting of nucleotide residues and/or a non-nucleotide structure at the 3'end of the passenger strand (sense strand) and the 5'end of the guide strand (antisense strand).
  • Linked via a linker, or the 3'end of the guide strand (antisense strand) and the 5'end of the passenger strand (sense strand) are linked via a linker sequence consisting of nucleotide residues and/or a non-nucleotide structure linker. It may be a single-stranded nucleic acid molecule forming a hairpin-type RNA structure linked with each other.
  • the ssPN molecule which is one of the nucleic acids that suppresses the expression of the NEK6 gene, will be described.
  • the ssPN molecule means a single-stranded RNA nucleic acid molecule excellent in biological stability disclosed in WO2012/017919, and specifically, it is as follows.
  • the ssPN molecule which is an active ingredient of the present invention, is a single-stranded nucleic acid molecule containing an expression suppressing sequence of NEK6 gene, which contains a region (X), a linker region (Lx) and a region (Xc). ) And the region (Xc), the linker region (Lx) is linked, and at least one of the region (X) and the region (Xc) contains the expression suppressing sequence, and the linker region (Lx). ) Has a non-nucleotide structure containing at least one of a pyrrolidine skeleton and a piperidine skeleton. The ssPN molecule is not linked at its 5'end and 3'end, and can be referred to as a linear single-stranded nucleic acid molecule.
  • the expression suppressing sequence of the NEK6 gene is, for example, a sequence showing an activity of suppressing the expression of the NEK6 gene when the ssPN molecule of the present invention is introduced into cells in vivo or in vitro.
  • the siRNA sequence that binds to NEK6 mRNA can be obtained according to the existing siRNA design system based on the cDNA sequence information of the NEK6 gene.
  • the siRNA expression suppression sequence is used as the ssPN molecule expression suppression sequence. Can be used.
  • the expression-suppressing sequence preferably has, for example, 80% or more complementarity to the target region of the NEK6 gene, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, It is more preferably 98% or more, and particularly preferably 100%.
  • siRNA for the portion corresponding to the seed region of siRNA, it is preferable to select a sequence specific to the NEK6 gene as in the case of siRNA.
  • the suppression of NEK6 gene expression by the ssPN molecule is presumed to be caused by RNA interference, but is not limited by this mechanism.
  • the ssPN molecule of the present invention is, for example, a so-called siRNA, which is not introduced into a cell or the like as a dsRNA composed of two single-stranded RNAs, and the excision of the expression suppressing sequence is performed in the cell. Not necessarily required.
  • the linker region (Lx) may have, for example, a non-nucleotide structure containing the pyrrolidine skeleton, a non-nucleotide structure containing the piperidine skeleton, or the pyrrolidine skeleton. It may have both a non-nucleotide structure containing and a non-nucleotide structure containing the piperidine skeleton.
  • ssNc molecule which is one of the nucleic acids that suppresses the expression of the NEK6 gene, will be described.
  • the ssNc molecule means the single-stranded RNA nucleic acid molecule disclosed in WO2012/05368, and specifically is as follows.
  • the ssNc molecule is a single-stranded nucleic acid molecule containing an expression suppressing sequence that suppresses the expression of the target gene, From the 5′ side to the 3′ side, the 5′ side region (Xc), the internal region (Z) and the 3′ side region (Yc) are included in the above order,
  • the internal region (Z) is configured by connecting the internal 5′ side region (X) and the internal 3′ side region (Y),
  • the 5'side region (Xc) is complementary to the internal 5'side region (X),
  • the 3'side region (Yc) is complementary to the internal 3'side region (Y), At least one of the internal region (Z), the 5′ side region (Xc), and the 3′ side region (Yc) includes an expression suppressing sequence.
  • the ssNc molecule is not linked at its 5'end and 3'end, and can be referred to as a linear single-stranded nucleic acid molecule.
  • the ssNc molecule of the present invention for example, in the internal region (Z), the internal 5'region (X) and the internal 3'region (Y) are directly linked.
  • the 5'side region (Xc) is complementary to the internal 5'side region (X), and the 3'side region (Yc) is complementary to the internal 3'side region (Y).
  • the region (Xc) is folded back toward the region (X), and the region (Xc) and the region (X) can form a double chain by self-annealing.
  • the region (Yc) is folded back toward the region (Y), and the region (Yc) and the region (Y) can form a double chain by self-annealing. ..
  • the ssNc molecule can form a double strand in the molecule.
  • siRNA used for conventional RNA interference
  • two separated single-stranded RNAs are annealed to form a double-stranded RNA. Is a structure that is distinctly different from the one that forms.
  • ssPN molecule can be incorporated by reference for the expression suppression sequence in the ssNc molecule.
  • Suppression of the NEK6 gene expression by the ssNc molecule is achieved by, for example, a structure in which the expression suppression sequence is arranged in at least one of the internal region (Z), the 5′ side region (Xc) and the 3′ side region (Yc). It is speculated that this is due to the occurrence of RNA interference or a phenomenon similar to RNA interference (a phenomenon similar to RNA interference).
  • the mechanism of the ssNc molecule is not limited to the mechanism of the ssPN molecule.
  • the ssNc molecule does not introduce into a cell or the like as a dsRNA composed of two single-stranded RNAs like so-called siRNA, and the excision of the expression suppressing sequence is not always essential in the cell. Absent. Therefore, it can be said that the ssNc molecule has a function similar to RNA interference, for example.
  • the method for synthesizing the ssPN molecule and ssNc molecule is not particularly limited, and a conventionally known method can be adopted.
  • Examples of the above-mentioned synthetic method include a synthetic method by a genetic engineering method, a chemical synthetic method and the like.
  • Examples of the genetic engineering method include an in vitro transcription synthesis method, a method using a vector, and a method using a PCR cassette.
  • the vector is not particularly limited, and examples thereof include non-viral vectors such as plasmids and viral vectors.
  • the chemical synthesis method is not particularly limited, and examples thereof include a phosphoramidite method and an H-phosphonate method.
  • a commercially available automatic nucleic acid synthesizer can be used.
  • amidite is generally used.
  • the amidite is not particularly limited, and examples of commercially available amidites include RNA Phosphoramidite (2′-O-TBDMSi, trade name, Sanchiri Pharmaceutical Co., Ltd.), ACE amidite, TOM amidite, CEE amidite, CEM amidite, TEM amidite, and the like.
  • the ssPN molecule and the ssNc molecule of the present invention can be produced according to the production methods described in WO2012/05368, WO2012/17919, WO2013/27843, and WO2016/159374.
  • miRNA that is one of the nucleic acids that suppresses the expression of the NEK6 gene will be described below.
  • MiRNA is involved in the regulation of gene expression through inhibition of translation of mRNA into protein or degradation of mRNA.
  • miRNA is a short-chain (20-25 bases) non-coding RNA existing in cells.
  • the miRNA is first transcribed from DNA as a single-stranded pri-RNA that includes the miRNA and its complementary strand and can have a hairpin loop structure.
  • a part of the pri-RNA is cleaved by an enzyme called Drosha in the nucleus to become pre-RNA, which is transported to the outside of the nucleus.
  • the pre-RNA is further cleaved by Dicer to function as miRNA.
  • miRNAs perform incomplete hybridization binding to the 3'untranslated region of mRNA and inhibit the synthesis of the protein encoded by that mRNA.
  • the miRNA that suppresses the NEK6 gene expression can be obtained based on the gene name of the target gene or the mRNA sequence information, for example, according to a database such as miRDB (http://mirdb.org/miRDB/index.html).
  • nucleotide residue used in the nucleic acid that is an active ingredient contains sugar, base and phosphate as constituent elements.
  • nucleotide residue include a ribonucleotide residue and a deoxyribonucleotide residue.
  • the ribonucleotide residue has, for example, a ribose residue as a sugar and adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and uracil (U) as a base
  • the deoxyribose residue is
  • it has a deoxyribose residue as a sugar and has adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (T) as a base.
  • nucleotide residues include non-modified nucleotide residues and modified nucleotide residues.
  • each of the constituent elements is, for example, the same or substantially the same as a naturally occurring one, and preferably the same or substantially the same as a naturally occurring one in the human body. ..
  • the modified nucleotide residue is, for example, a nucleotide residue obtained by modifying the unmodified nucleotide residue.
  • the modified nucleotide may be modified, for example, in any of the constituent elements of the unmodified nucleotide residue.
  • “modification” means, for example, substitution, addition and/or deletion of the above-mentioned constituents, substitution, addition and/or deletion of atoms and/or functional groups in the above-mentioned constituents, and is referred to as “modification”. be able to.
  • modified nucleotide residue include naturally occurring nucleotide residues, artificially modified nucleotide residues, and the like.
  • modified nucleotide residue derived from nature, for example, Rimbach et al. (Limbach et al. 1994, Summary: the modified nucleic acids of RNA, Nucleic Acids Res. 22:2183 to 2196) can be referred to. Further, the modified nucleotide residue may be, for example, a residue of a substitute for the nucleotide.
  • the modification of the above-mentioned nucleotide residue includes, for example, modification of ribose-phosphate skeleton (hereinafter referred to as ribophosphate skeleton).
  • ribophosphate skeleton for example, ribose residues can be modified.
  • the ribose residue can be modified at, for example, the 2'-position carbon, and specifically, for example, the hydroxyl group bonded to the 2'-position carbon can be replaced with hydrogen or fluoro.
  • the ribose residue can be replaced with deoxyribose by replacing the hydroxyl group at the 2'-position carbon with hydrogen.
  • ribose residue may be substituted, for example, with a stereoisomer, and may be replaced with, for example, an arabinose residue.
  • the ribophosphate skeleton may be replaced with, for example, a non-ribophosphate skeleton having a non-ribose residue and/or a non-phosphate.
  • examples of the non-ribophosphate skeleton include uncharged ribophosphate skeletons and the like.
  • Examples of the substitutes for the nucleotides substituted with the non-ribophosphate skeleton include morpholino, cyclobutyl, pyrrolidine and the like. Besides the above, examples of the substitute include artificial nucleic acid monomer residues and the like.
  • nucleic acid peptide nucleic acid
  • 2',4'-BNA Bridged Nucleic Acid, also known as LNA (Locked Nucleic Acid)]
  • AmNA amino acid
  • ENA 2'-O, 4'
  • the nucleic acid according to the present embodiment is an antisense nucleic acid that utilizes the mechanism of RNA degradation by RNaseH, it is preferably an antisense nucleic acid into which an artificial nucleic acid has been introduced, and more preferably an artificial nucleic acid at both ends of the sequence.
  • Is an introduced nucleic acid particularly preferably an antisense nucleic acid in which artificial nucleic acid is introduced only at both ends of the sequence. This is because by using an antisense nucleic acid in which artificial nucleic acid is introduced only at both ends of the sequence, RNA degradation by RNase H occurs while maintaining the characteristics of the artificial nucleic acid, and a high antisense effect can be expected.
  • the nucleic acid according to the present embodiment is an antisense nucleic acid that utilizes the mechanism of inducing exon skipping
  • RNase H is used like a mixmer or a fully modified oligonucleotide.
  • the design is preferably such that RNA degradation does not occur.
  • the phosphate group can be modified.
  • the phosphate group closest to the sugar residue is called an ⁇ -phosphate group.
  • the ⁇ -phosphate group is negatively charged and its charge is evenly distributed over the two oxygen atoms unbonded to the sugar residue.
  • two oxygen atoms that are not bonded to the sugar residue in the phosphodiester bond between nucleotide residues are hereinafter referred to as “non-linking oxygen”.
  • linking oxygen the two oxygen atoms bonded to the sugar residue are hereinafter referred to as "linking oxygen”.
  • the ⁇ -phosphate group is preferably modified, for example, to be uncharged or to have an asymmetric charge distribution in the non-bonded atom.
  • the phosphate group may replace the non-bonded oxygen, for example.
  • the oxygen is, for example, S (sulfur), Se (selenium), B (boron), C (carbon), H (hydrogen), N (nitrogen) and OR (R is, for example, an alkyl group or an aryl group). It can be replaced by any atom, preferably S.
  • Both of the non-bonded oxygens are preferably substituted, and more preferably both are substituted with S.
  • Examples of the modified phosphate group include phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoroselenate, boranophosphate, boranophosphate ester, phosphonate hydrogen, phosphoramidate, alkyl or aryl phosphonate, and phosphotriester. Among them, phosphorodithioate in which both of the above two non-bonded oxygens are substituted with S is preferable.
  • the phosphate group may replace the bonded oxygen, for example.
  • the oxygen can be substituted with, for example, any atom of S (sulfur), C (carbon) and N (nitrogen), or borane (BH 3 ).
  • Examples of the modified phosphate group include a bridged phosphoramidate substituted with N, a bridged phosphorothioate substituted with S, and a bridged methylenephosphonate substituted with C.
  • the phosphorothioate modification (S conversion) in which the oxygen atom is replaced with an S (sulfur) atom is a modification of the phosphodiester bond portion that connects nucleic acids, and the phosphodiester bond in the sequence is modified to a phosphorothioate bond.
  • substitution of the bound oxygen may be carried out at at least one of the 5′-terminal nucleotide residue and the 3′-terminal nucleotide residue of the nucleic acid according to this embodiment, or at both. Further, for example, all phosphodiester bonds in the nucleic acid according to this embodiment may be modified to phosphorothioate bonds.
  • the above phosphate group may be substituted with, for example, the above phosphorus-free linker.
  • the linker include siloxane, carbonate, carboxymethyl, carbamate, amide, thioether, ethylene oxide linker, sulfonate, sulfonamide, thioformacetal, formacetal, oxime, methyleneimino, methylenemethylimino, methylenehydrazo, methylenedimethyl. It includes hydrazo, methyleneoxymethylimino and the like, and preferably contains a methylenecarbonylamino group and a methylenemethylimino group.
  • the modification of the terminal nucleotide residue may be, for example, addition of another molecule.
  • the above-mentioned other molecules include functional molecules such as the above-mentioned labeling substances and protective groups.
  • the protective group include S (sulfur), Si (silicon), B (boron), and ester-containing groups.
  • the above-mentioned other molecule may be added to, for example, the phosphate group of the above nucleotide residue, or may be added to the above phosphate group or the above sugar residue via a spacer.
  • the terminal atom of the spacer can be added or substituted to, for example, the above-mentioned bonded oxygen of the above-mentioned phosphate group or O, N, S or C of the sugar residue.
  • the binding site of the sugar residue is preferably, for example, C at the 3'position or C at the 5'position, or an atom binding to these.
  • the spacer can also be added or substituted, for example, at the terminal atom of the nucleotide substitute such as PNA.
  • the spacer is not particularly limited and includes, for example, —(CH 2 ) n —, —(CH 2 ) n N—, —(CH 2 ) n O—, —(CH 2 ) n S—, O(CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 OH, abasic sugar, amide, carboxy, amine, oxyamine, oximine, thioether, disulfide, thiourea, sulfonamide, morpholino, etc., as well as biotin reagent and fluorescein reagent etc. Good.
  • the molecule to be added to the terminal includes, for example, dyes, intercalating agents (eg, acridine), cross-linking agents (eg, psoralen, mitomycin C), porphyrins (TPPC4, texaphyrin, sapphirin), polycyclic Aromatic hydrocarbons (eg phenazine, dihydrophenazine), artificial endonucleases (eg EDTA), lipophilic carriers (eg cholesterol, cholic acid, adamantane acetic acid, 1-pyrene butyric acid, dihydrotestosterone, 1,3-bis- O (hexadecyl) glycerol, geranyloxyhexyl group, hexadecyl glycerol, borneol, menthol, 1,3-propanediol, heptadecyl group, palmitic acid, myristic acid, O3-(oleoyl)
  • the nucleic acid molecule may be modified at the 5'end with, for example, a phosphate group or a phosphate group analog.
  • the phosphoric acid group is, for example, 5′ monophosphoric acid ((HO) 2 (O)PO-5′) or 5′ diphosphoric acid ((HO) 2 (O)POP(HO)).
  • the base is not particularly limited.
  • the base may be, for example, a natural base or a non-natural base.
  • the base may be, for example, naturally derived or synthetic.
  • As the base for example, a general base or a modified analog thereof can be used.
  • Examples of the base include purine bases such as adenine and guanine, pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine, and the like.
  • examples of the base include inosine, thymine, xanthine, hypoxanthine, nubularine, isoguanisine, and tubercidine.
  • the base examples include alkyl derivatives such as 2-aminoadenine and 6-methylated purine; alkyl derivatives such as 2-propylated purine; 5-halouracil and 5-halocytosine; 5-propynyluracil and 5-propynylcytosine; 6 -Azouracil, 6-azocytosine and 6-azothymine; 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 5-halouracil, 5-(2-aminopropyl)uracil, 5-aminoallyluracil; 8-halogenated, aminated, Thiolation, thioalkylation, hydroxylation and other 8-substituted purines; 5-trifluoromethylated and other 5-substituted pyrimidines; 7-methylguanine; 5-substituted pyrimidines; 6-azapyrimidines; N-2, N -6, and O-6 substituted purines (including 2-aminopropyladenine); 5-prop
  • nucleic acid linker, etc., which are the active ingredients, are those commonly used in the technical field, and are shown as follows, for example. be able to.
  • alkyl includes, for example, a linear or branched alkyl group.
  • the number of carbon atoms of the above alkyl is not particularly limited and is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 6 or 1 to 4.
  • Examples of the alkyl group include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, Examples thereof include n-octyl, n-nonyl, n-decyl and the like.
  • Preferred examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl and isohexyl.
  • aryl includes, for example, a monocyclic aromatic hydrocarbon group and a polycyclic aromatic hydrocarbon group.
  • the monocyclic aromatic hydrocarbon group include phenyl and the like.
  • the polycyclic aromatic hydrocarbon group include 1-naphthyl, 2-naphthyl, 1-anthryl, 2-anthryl, 9-anthryl, 1-phenanthryl, 2-phenanthryl, 3-phenanthryl, 4-phenanthryl, 9- Examples include phenanthryl.
  • Preferred examples include naphthyl such as phenyl, 1-naphthyl and 2-naphthyl, and the like.
  • SMAD2/3 Protein Phosphorylation Inhibitor (10) SMAD2/3 Protein Phosphorylation Inhibitor The term "inhibition of SMAD2/3 protein phosphorylation" means that phosphorylation of SMAD2 and/or SMAD3 promoted by TGF- ⁇ stimulation is inhibited (controlled).
  • SMAD2/3 is a kind of R-SMAD (receptor regulated SMAD) that is phosphorylated by TGF- ⁇ type I receptor, and after stimulation with TGF- ⁇ , phosphorylated (activated) SMAD2 and SMAD3 are Co -Move into the nucleus with SMAD4 which is SMAD (common partner SMAD).
  • R-SMAD receptor regulated SMAD
  • phosphorylated (activated) SMAD2 and SMAD3 are Co -Move into the nucleus with SMAD4 which is SMAD (common partner SMAD).
  • SMAD4 common partner SMAD
  • the phosphorylated SMAD2/3 protein forms a SMAD protein complex, translocates into the nucleus, and enhances transcription of ⁇ -SMA, ⁇ 2-collagen, interferon ⁇ , interleukin-5, VEGF and the like.
  • the SMAD2/3 protein phosphorylation inhibitor according to the present embodiment, it becomes possible to control the transcription of ⁇ -SMA, ⁇ 2-collagen, interferon ⁇ , etc., and eventually the fibers in the wound healing process. It can be understood that it is useful for suppressing the differentiation of blast cells, hepatic stellate cells and the like into myofibroblasts, controlling matrix synthesis by fibroblasts and the like, regulating inflammation/immune reaction and the like.
  • the therapeutic agent for fibrosis includes liver fibrosis, cirrhosis, viral hepatitis, autoimmune hepatitis, primary biliary hepatitis, non-alcoholic steatohepatitis, alcoholic liver disease, Primary sclerosing cholangitis, hemochromatosis, Wilson disease, ⁇ 1-antitrypsin deficiency, non-viral congestive cirrhosis, drug-induced liver injury, pancreatitis, pancreatic fibrosis, retinal fibrosis, vocal cord mucosa, vocal cord mucosa Fibrosis, laryngeal fibrosis, pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, idiopathic pulmonary fibrosis, nonspecific interstitial pneumonia, idiopathic organizing pneumonia, exfoliative interstitial pneumonia, respiratory bronchiolitis-related interstitium Pneumonia, acute interstitial pneumonia, lymphoc
  • the administration method of the therapeutic agent for fibrosis according to the present embodiment is not particularly limited, but inhalation, intravenous administration (intravenous injection), intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intrathecal administration and transdermal administration. Parenteral administration such as skin administration is preferred.
  • the therapeutic agent for fibrosis according to the present embodiment is administered to a subject in need of the therapeutic agent for fibrosis, for example, a subject who has developed the above-mentioned disease associated with fibrosis and a subject whose risk of developing the same is high.
  • the subject may be a human or a non-human animal.
  • the dose of the nucleic acid molecule according to the present embodiment in the treatment method according to the present embodiment is not particularly limited as long as it is a therapeutically effective amount for the above diseases, and the type of disease, severity, age, weight, administration route, etc. Depending on the individual adult, it can be usually about 0.0001 to about 100 mg/kg body weight, for example about 0.001 to about 10 mg/kg body weight, preferably about 0.005 to about 5 mg/kg body weight.
  • the amount can be administered, for example, three times a day to once a month, preferably once a day to once a week.
  • the therapeutic agent for fibrosis according to the present embodiment is usually formulated as a suitable pharmaceutical composition with a pharmaceutically acceptable carrier and administered in an oral or parenteral form.
  • the antisense nucleic acid according to the present embodiment is preferably administered by being encapsulated in a liposome, a glycolic acid copolymer (PLGA) microsphere, a lipid microsphere, a polymer micelle, a gel agent or an exosome drug delivery carrier.
  • PLGA glycolic acid copolymer
  • antisense oligonucleotide is synonymous with “antisense nucleic acid” and "ASO”.
  • Example 1 Knockdown of NEK6 using antisense oligonucleotide
  • Human hepatic stellate cell line LI-90 cells were transfected with human NEK6 antisense oligonucleotides (KB-XAX, KB-XBX, KB-XCX) at a final concentration of 30 nM using Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen). .. 48 hours after transfection, the medium was exchanged with 10% FCS-containing DMEM Low Glucose medium (Thermo Fisher) for 0.2% FCS-containing DMEM Low Glucose medium (Thermo Fisher). 96 hours after the transfection, RNA was extracted from the cells transfected with the antisense oligonucleotide using RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • NEK6 antisense oligonucleotide (KB-XAX): 5'-GCAATCCTGAAGGTAG-3' (SEQ ID NO: 1)
  • NEK6 antisense oligonucleotide (KB-XBX): 5'-GACAGCTCAGACAATT-3' (SEQ ID NO: 2)
  • NEK6 antisense oligonucleotide (KB-XCX): 5'-TCAAGGAGGTGACGAA-3' (SEQ ID NO: 3)
  • RNA was reverse transcribed using a High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) to obtain cDNA.
  • the obtained cDNA was subjected to real-time PCR using TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) to examine the effect of NEK6 knockdown on the transcription amount of the NEK6 gene.
  • the transcription amount of the NEK6 gene was calculated by dividing the measurement value of NEK6 Taqman Probe (HS002052221_m1, Applied Biosystems) by the measurement value of 18s Probe.
  • 18s Probe mixed the following custom synthesis 18s MGB Probe, custom synthesis 18s Primer 1 and custom synthesis 18s Primer 2 to 0.2 ⁇ M, 0.4 ⁇ M and 0.4 ⁇ M, respectively, and performed real-time PCR.
  • Custom Synthesis 18s MGB Probe (Applied Biosystems): 5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGGTGCCAGC-3' (SEQ ID NO: 5)
  • Custom Synthesis 18s Primer1 (ThermoFisher): 5'-CGGCTACCACATCCAAGGAAG-3' (SEQ ID NO: 6)
  • Custom Synthesis 18s Primer2 (ThermoFisher): 5'-GCTGGAATTACCCGCGCT-3' (SEQ ID NO: 7)
  • Fig. 2 shows the result of NEK6 real-time PCR when the NEK6 antisense oligonucleotide was introduced.
  • Introduction of the NEK6 antisense oligonucleotide suppressed the transcription amount of the NEK6 gene. Therefore, it was shown that the NEK6 antisense oligonucleotide used efficiently suppressed the expression of the target gene.
  • Example 2 Effect of NEK6 knockdown on SMAD3 phosphorylation
  • Human hepatic stellate cell line LI-90 cells were transfected with human NEK6 antisense oligonucleotides (KB-XAX, XBX, XCX) using Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen) at a final concentration of 30 nM. Twenty-four hours after transfection, the medium was replaced with 10% FCS-containing DMEM Low Glucose medium (Thermo Fisher) from 0.2% FCS-containing DMEM Low Glucose medium (Thermo Fisher). 48 hours after transfection, human TGF- ⁇ protein (Peprotech) was added to a final concentration of 5 ng/ml.
  • the cells were added to 2 ⁇ SDS sample buffer [100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 6M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor quattail (nacalai eater quats). cocktail (nacalai tesque)] to obtain a cell extract.
  • 2 ⁇ SDS sample buffer 100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 6M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor quattail (nacalai eater quats). cocktail (nacalai tesque)] to obtain a cell extract.
  • ⁇ -Mercaptoethanol and Bromophenol blue were added to the obtained cell extract so that the final concentrations were 5% and 0.025%, respectively, and heated at 95°C for 4 minutes to prepare a sample.
  • SDS-PAGE was performed using the obtained sample, and the proteins contained in the sample were separated by size. Then, the separated protein was transferred to a PVDF membrane, and an anti-phosphorylated SMAD3 antibody (Cell Signaling Technology), an anti-SMAD3 antibody (Cell Signaling Technology), an anti-NEK6 antibody (Santa Cruz Biotechnology-antic), an anti-NEK6 antibody (Santa Biotechnology-anti-A).
  • Western blotting was performed by Sigma Aldrich). The phosphorylated SMAD3 amount was corrected by the total SMAD3 amount.
  • Fig. 3 shows the result of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down
  • Fig. 4 shows the result of the phosphorylated SMAD3 amount corrected by the total SMAD3 amount.
  • Example 3 Intracellular interaction between NEK6 protein and SMAD3 protein
  • Coimmunoprecipitation was performed to examine whether NEK6 protein interacts with SMAD3 and phosphorylates SMAD3 intracellularly.
  • Expression vector pEZ-M02 Nek6, GeneCopoia
  • human NEK6 and human SMAD3 labeled with FLAG tag were cloned into human lung fibroblast cell line LL29 cells established from the lungs of IPF patients.
  • PEZ-M11 Flag-hSmad3, GeneCopoia was transfected using X-tremeGene HP (Roche). The medium was exchanged 24 hours after transfection.
  • lysis buffer (175 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.6, 0.1% NP40, 0.2 mM EDTA pH 8.0, 1.4 mM ⁇ -Mercaptoethanol, 1% protease inhibitor cottail, 1% phosphabitatorinate).
  • lysis buffer (175 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.6, 0.1% NP40, 0.2 mM EDTA pH 8.0, 1.4 mM ⁇ -Mercaptoethanol, 1% protease inhibitor cottail, 1% phosphabitatorinate).
  • 2 ⁇ SDS PAGE loading buffer 100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50 mM DTT
  • 1 ⁇ SDS PAGE loading buffer 100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50 mM DTT
  • the co-immunoprecipitate contained in the supernatant was recovered.
  • the co-immunoprecipitate with the anti-NEK6 antibody was subjected to Western blotting using an anti-SMAD3 antibody (Cell Signaling Technology) and an anti-NEK6 antibody to detect whether the NEK6 protein and the SMAD3 protein were co-precipitated.
  • Figure 5a shows the results of co-immunoprecipitation with anti-NEK6 antibody.
  • NEK6 protein and SMAD3 protein were detected in the co-immunoprecipitate.
  • LL29 cells were transfected with a human NEK6 expression vector and a human SMAD3 expression vector labeled with a FLAG tag in order to analyze whether the SMAD3 protein interacts with NEK6 and is phosphorylated.
  • the medium was exchanged 24 hours after transfection. 48 hours after transfection, lysis buffer (250 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.6, 0.1% NP40, 0.2 mM EDTA pH 8.0, 1.4 mM ⁇ -Mercaptoethanol, 1% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatabile inhitrate. ) And the supernatant was obtained by centrifugation.
  • Anti-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma-Aldrich) was added to the obtained supernatant, and the mixture was incubated overnight at 4°C. Then, centrifugation was performed and the supernatant was removed. Anti-FLAG M2 Affinity Gel was washed with a lysis buffer to remove non-specific binding. 2 ⁇ SDS PAGE loading buffer (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50 mM DTT) was added to Anti-FLAG M2 Affinity Gel at 95° C. for 4 minutes. Then, the co-immunoprecipitate contained in the supernatant was recovered.
  • 2 ⁇ SDS PAGE loading buffer 100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50 mM DTT
  • the obtained co-immunoprecipitate was separated by SDS-PAGE based on the size, transferred to a PVDF membrane, and anti-phosphorylated SMAD3 antibody and anti-FLAG were co-immunoprecipitated with Anti-FLAG M2 Affinity Gel.
  • Western blotting was performed using an antibody (Sigma-Aldrich) and an anti-NEK6 antibody to detect whether the NEK6 protein and phosphorylated SMAD3 protein were coprecipitated.
  • Figure 5b shows the results of co-immunoprecipitation with anti-FLAG antibody.
  • NEK6 protein and FLAG-SMAD3 protein were detected in the co-immunoprecipitate.
  • transfection of the human NEK6 expression vector increased the amount of phosphorylated SMAD3 protein.
  • NMAD3 protein Since the SMAD3 protein was detected in the co-immunoprecipitate with the anti-NEK6 antibody, and conversely, NEK6 was detected in the co-immunoprecipitate with the anti-FLAG antibody, the NEK6 protein and the SMAD3 protein interacted intracellularly. Were shown to form a complex. Furthermore, since the amount of phosphorylated SMAD3 protein was increased by transfection with the expression vector of human NEK6, it was shown that NEK6 protein phosphorylates SMAD3 protein intracellularly.
  • Example 4 SMAD3 protein phosphorylation by NEK6 protein
  • the possibility that NEK6 protein was directly phosphorylated using SMAD3 protein as a substrate was examined using purified proteins of NEK6 and SMAD3.
  • a His fusion NEK6 protein (eurofins) and a GST fusion SMAD3 protein (Sigma-Aldrich) were used as reaction solvents (150 ⁇ M ATP, 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 1%). Phosphatase inhibitor cocktail) and incubated for 45 minutes at 30°C. 2 ⁇ SDS sample buffer containing 5% ⁇ -Mercaptoethanol and 0.025% Bromophenol blue was added to the reaction solution in an equal amount to stop the reaction, and then heated at 95° C. for 5 minutes to prepare a sample.
  • SDS-PAGE was performed using the obtained sample, and the proteins contained in the reaction solution were separated according to size. Then, the separated protein was transferred to a PVDF membrane, and Western blotting was performed using an anti-phosphorylated SMAD3 antibody, an anti-GST antibody (Santa Cruz Biotechnology), and an anti-NEK6 antibody.
  • FIG. 6 shows the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when the His-fused NEK6 protein and GST-fused SMAD3 protein were reacted.
  • the amount of phosphorylated SMAD3 was increased by using NEK6 protein. Therefore, it was shown that the NEK6 protein directly phosphorylates the SMAD3 protein as a substrate.
  • Example 5 Effect of knockdown of NEK6 on transcriptional activity of SMAD protein complex
  • a luciferase reporter assay using the DNA binding sequence of the SMAD protein complex and the luciferase gene was performed.
  • Western blotting was performed using LL29 cells prepared at the same time to confirm knockdown of NEK6.
  • Human lung fibroblast cell line LL29 cells established from the lungs of an IPF patient were transfected with ON-TARGET plus SMART pool siRNA (Dharmacon), which is siRNA against human NEK6, using Lipofectamine RNAi MAX. Twenty-four hours after transfection of siRNA, the medium was changed from 10% FCS-containing F-12K medium to 0.4% FCS-containing F-12K medium.
  • the protein contained in the obtained cell extract was separated by SDS-PAGE, the protein was transferred to a PVDF membrane, and Western blotting was performed with anti-SMAD3 antibody, anti-NEK6 antibody, and anti-Vinculin antibody.
  • LL29 cells prepared in the same manner as above were collected according to the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), and the luminescence by firefly luciferase and Renilla luciferase was measured. The luminescence of firefly luciferase was corrected by the luminescence of Renilla luciferase.
  • siRNA ⁇ ON-TARGET plus SMART pool siRNA> siNEK6:5'-CUGUCCUCGGGCCUAUUCUC-3' (SEQ ID NO: 9) siNEK6:5'-UAUUUGGGUGGUGUCAGUUG-3' (SEQ ID NO: 10) siNEK6:5'-CAACUCCACGCACAAUGUUC-3' (SEQ ID NO: 11) siNEK6:5'-UACUUGAUCAUCUGCGAGA-3' (SEQ ID NO: 12)
  • FIG. 7a shows the result of Western blotting when NEK6 was knocked down. It was shown that the amount of NEK6 protein was reduced by using NEK6 siRNA, but the amount of SMAD3 protein was not changed.
  • FIG. 7b shows the amount of luminescence of firefly luciferase corrected with Renilla luciferase when NEK6 was knocked down. By using NEK6 siRNA, the amount of luminescence of firefly luciferase increased by TGF- ⁇ decreased. Therefore, it was shown that the knockdown of NEK6 suppressed the transcriptional activity of the SMAD protein complex.
  • Example 6 Effect of knockdown of NEK6 on hepatic stellate cells on transcription amount of fibrosis-related gene
  • Human hepatic stellate cell line LI-90 cells were transfected with human NEK6 antisense oligonucleotides (KB-XAX, XBX and XCX) using Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen) at a final concentration of 30 nM.
  • the medium was replaced with 10% FCS-containing DMEM Low Glucose medium (Thermo Fisher) from 0.2% FCS-containing DMEM Low Glucose medium (Thermo Fisher).
  • human TGF- ⁇ protein (Peprotech) was added to a final concentration of 2 ng/ml.
  • RNA was extracted from cells transfected with NEK6 antisense oligonucleotide using RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • the resulting RNA was reverse transcribed using a High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) to obtain cDNA.
  • the obtained cDNA was subjected to real-time PCR using TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems), and the effect of NEK6 knockdown on the gene transcription level was detected.
  • the transcription amount of the Col1a1 gene and the Fibronectin gene is measured by the Col1a1 Taqman Probe (HS00164004_m1, Applied Biosystems), or by the Fibronectin Taqman probe (HS015499sp18d18), and the Fibronectin Taqman probe value (HS01549976_d1) by the Fibronectin Taqman probe. It was calculated by doing.
  • 18s Probe mixed the following custom synthesis 18s MGB Probe, custom synthesis 18s Primer1, custom synthesis 18s Primer2 to 0.2 ⁇ M, 0.4 ⁇ M and 0.4 ⁇ M, respectively, and performed real-time PCR.
  • Custom Synthesis 18s MGB Probe (Applied Biosystems): 5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGGTGCCAGC-3' (SEQ ID NO: 5)
  • Custom Synthesis 18s Primer1 (ThermoFisher): 5'-CGGCTACCACATCCAAGGAAG-3' (SEQ ID NO: 6)
  • Custom Synthesis 18s Primer2 (ThermoFisher): 5'-GCTGGAATTACCCGCGCT-3' (SEQ ID NO: 7)
  • FIG. 8 shows the transcription amount of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down
  • FIG. 9 shows the transcription amount of the Fibronectin gene when NEK6 was knocked down.
  • Example 7 Effect of knockdown of NEK6 in lung fibroblasts on transcription amount of fibrosis-related gene
  • Human lung fibroblast cell line LL29 cells established from the lungs of IPF patients were transfected with siRNA for human NEK6 (ON-TARGET plus SMART pool siRNA, Dharmacon) using Lipofectamine RNAi MAX. 24 hours after transfection, the medium was exchanged from F-12K medium containing 10% FCS to F-12K medium containing 0.1% BSA. 48 hours after transfection, human TGF- ⁇ protein was added to a final concentration of 1 ng/mL. 72 hours after transfection, RNA was extracted from siRNA-transfected cells using RNeasy Mini Kit. The obtained RNA was reverse transcribed using a High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit to obtain a cDNA.
  • the obtained cDNA was subjected to real-time PCR using TaqMan GeneExpression Assays, and the effect of NEK6 knockdown on the gene transcription amount was detected.
  • the transcription amount of the Col1a1 gene and the ⁇ SMA gene is measured by the Col1a1 Taqman Probe (HS00164004_m1, Applied Biosystems), or measured by the ⁇ SMA Taqman Probe (HS00426835_g1, Applied18) measured by the ⁇ SMA Taqman Probe, and Applied Bios. It was calculated by doing.
  • Fig. 10a shows the transcription amount of Col1a1 when NEK6 was knocked down
  • Fig. 10b shows the transcription amount of the ⁇ SMA gene when NEK6 was knocked down.
  • Example 8 Effect of NEK6 knockdown on SMAD3 protein phosphorylation in renal fibroblasts
  • An ssPN molecule (KB-004:5′-GAUAAGAUGAAUCUCUCUCUCCCC-Lx-GG GGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUCe lect- 3o (SEQ ID NO: 16), underlined is an expression suppression sequence f ) in rat renal fibroblast cell line NRK-49F cells against human NEK6. Transfection was performed using RNAi MAX. Twenty-four hours after transfection, the medium was changed from DMEM medium containing 10% FCS to DMEM medium containing 0.1% FCS. 48 hours after transfection, human TGF- ⁇ protein was added to a final concentration of 5 ng/ml.
  • the cells were lysed with 2 ⁇ SDS sample buffer (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 6M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor).
  • Cell extract. ⁇ -Mercaptoethanol and Bromophenol blue were added to the obtained cell extract so that the final concentrations were 5% and 0.025%, respectively, and the mixture was heated at 95° C. for 4 minutes to prepare a sample. SDS-PAGE was performed using the obtained sample, and the proteins contained in the sample were separated by size.
  • the separated protein was transferred to a PVDF membrane, and Western blotting was performed with an anti-phosphorylated SMAD3 antibody, an anti-SMAD3 antibody, an anti-NEK6 antibody (abcam), and an anti-Vinculin antibody.
  • FIG. 11 shows the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down.
  • the amount of NEK6 protein was reduced and the amount of phosphorylated SMAD3 elevated by TGF- ⁇ was reduced. Therefore, it was shown that knockdown of NEK6 suppresses phosphorylation of SMAD3 protein.
  • Example 9 Evaluation of efficacy of knockdown of NEK6 in carbon tetrachloride (CCl 4 )-induced liver fibrosis model.
  • CCl 4 carbon tetrachloride
  • nucleic acid administration solution containing KB-004 was intravenously administered to the nucleic acid administration group so as to have a dose of 3 mg/kg body weight, and a solvent administration group was administered with the same amount of the administration solvent as the nucleic acid administration group on the day before the first administration of CCl 4 and Tail vein administration was performed on the 10th day of pathological induction. Evaluation of liver damage and fibrosis was carried out on the 13th day of induction of pathological conditions (Examples 10, 11, 12 and 14).
  • Fibrosis is understood to be the excessive process of wound healing against cell and tissue damage. Therefore, suppressing the damage of cells and tissues together with fibrosis is considered to be effective for the treatment of various fibrosis. Therefore, in order to examine whether knockdown of NEK6 has an effect on liver injury, a liver injury marker in a CCl 4 model was measured.
  • Glutamate pyruvate transaminase (GPT) and glutamate oxaloacetate transaminase (GOT) in serum were measured using transaminase CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The measuring method followed the instruction manual of the reagent.
  • FIG. 12a The measurement results of GPT in serum are shown in FIG. 12a, and the measurement results of GOT in serum are shown in FIG. 12b.
  • Administration of NEK6 siRNA suppressed the increase in serum GPT and GOT observed in the CCl 4 model. Therefore, knockdown of NEK6 was shown to suppress liver damage.
  • Example 11 Analysis of SMAD3 protein phosphorylation in CCl 4 model
  • the liver collected on the 13th day of pathological induction was frozen and then crushed into powder. Lysis buffer to powdered liver (150 mM NaCl, 1% NP40, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM Benzylsulfonylfluoride, 2% protease inhibitor cocotail, 1% phosphatate, 1% phosphaitate).
  • An organ extract was prepared using a handy ultrasonic generator. ⁇ -Mercaptoethanol and Bromophenol blue were added to the supernatant obtained by centrifuging the organ extract so that the final concentrations were 5% and 0.025%, respectively.
  • FIG. 13 shows the result of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down.
  • the amount of NEK6 protein was reduced and the amount of phosphorylated SMAD3 elevated by TGF- ⁇ was reduced. Therefore, knockdown of NEK6 was shown to suppress phosphorylation of SMAD3 protein in liver of CCl 4 model.
  • Example 12 Analysis of fibrosis-related genes in CCl 4 model
  • NEK6 Taqman Probe (Mm00480730_m1, Applied Biosystems, Inc.), and Col1a1 Taqman Probe as fibrosis related genes (Mm00801666_g1, Applied Biosystems, Inc.), Col3a1 Taqman Probe (Mm01254476_m1, Applied Biosystems, Inc.), Timp1 Taqman Probe (Mm01341361_m1 , Applied Biosystems) was measured, and the relative ratio with the transcription level of 18s rRNA Taqman Probe (Hs99999901_s1, Applied Biosystems), which is an internal standard, was used as the transcription level of each gene. ..
  • the transcription amount of each gene in the CCl 4 model is shown in FIGS. 14a to 14d.
  • Administration of the NEK6 ssPN molecule reduced the transcription level of the NEK6 gene. From this, it was shown that the KB-004 used efficiently suppressed the transcription of the target gene. At this time, the transcription levels of the fibrosis-related genes (Col1a1, Col3a1, Timp1) induced by pathological induction were significantly reduced. Therefore, knockdown of NEK6 was shown to suppress fibrosis.
  • Example 13 Analysis of fibrosis-related genes in a bile duct ligation-induced liver fibrosis (BDL) model.
  • BDL model bile duct ligation-induced liver fibrosis model mice
  • the liver was collected on the 14th day of bile duct ligation, and NEK6 Taqman Probe (Mm00480730_m1, Applied Biosystems) and Col1a1 Taqman_44m1m24m3Ab (Nm6Taqman Probe) (Mm00801666m1m3b10m3b), as the fibrosis-related gene (Mm00801666m1m3b10m3b).
  • the transcription levels of each gene in the BDL model are shown in a to d in FIG.
  • Administration of NEK6 siRNA reduced the transcription amount of NEK6 gene. From this, it was shown that the KB-004 used efficiently suppressed the transcription of the target gene. At this time, the transcription levels of the fibrosis-related genes (Col1a1, Col3a1, Timp1) induced by pathological induction were significantly reduced. Therefore, knockdown of NEK6 was shown to suppress fibrosis.
  • Example 14 Pathological analysis using CCl 4 model
  • the inner right lobe of the liver was collected on day 13 after the induction of pathological conditions, and fixed with 10% neutral buffered formalin solution. After embedding in paraffin, a tissue section was prepared and stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 16 shows a representative example of the pathological image.
  • FIG. 16a shows the result of the physiological saline-administered group not administered with CCl 4
  • FIG. 16b shows the result of the solvent-administered group administered with CCl 4
  • FIG. 16c shows the result of the nucleic acid-administered group administered with CCl 4 .
  • Vacuolar degeneration which is often observed in FIG. 16b, indicates cell damage, and a portion where a large number of nuclei are not stained near the central portion indicates necrosis of cells.
  • Administration of NEK6 siRNA reduced the cell damage and necrosis observed in the CCl 4 model liver tissue. Therefore, it was shown that knockdown of NEK6 suppresses the change of pathological image in the CCl 4 -induced liver fibrosis model.
  • Reference Example 1 Synthesis of single-stranded nucleic acid molecule
  • the nucleic acid molecule shown below was synthesized by a nucleic acid synthesizer (trade name: ABI3900 DNA Synthesizer, Applied Biosystems) based on the phosphoramidite method. Solid-phase synthesis was performed using CPG (Controlled Pore Glass) as the solid-phase carrier and EMM amidite (International Publication No. 2013/027843) as the RNA amidite. Cleavage from the solid phase carrier, deprotection of the phosphate protecting group, deprotection of the base protecting group, and deprotection of the 2'-hydroxyl protecting group were carried out according to standard methods. The synthesized single-stranded nucleic acid molecule was purified by HPLC.
  • Lx is a linker region Lx, and represents L-proline diamide amidite of the following structural formula.
  • underlined portion in the following single-stranded nucleic acid molecule is the gene expression suppressing sequence of NEK6.
  • KB-001 5'-GAGGGAGUUCCAACAAACCUCUCC-Lx-GG AGAGGUUGUGUGGAACUCCCUCCA -3' (SEQ ID NO: 13)
  • KB-003 5'-CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC-Lx-GG CGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC -3'
  • KB-004 5'-GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC-Lx-GG GGAGAAGAGAUUCAUCUUAUUCUC -3' (SEQ ID NO: 16) KB-005 5'-CAGAGACCUGACAUCCGGAUACCC-Lx-GG GUAUC

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Abstract

ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を開示する。

Description

線維症治療剤
　本発明は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸及び当該核酸を有効成分とする医薬に関する。
　線維症は、過剰なコラーゲンの蓄積により臓器機能が障害を受け、不可逆的に進行する疾患であり、例えば、その発症臓器としては皮膚、肺、肝臓、膵臓、腎臓、骨髄などが知られている。肺の線維症の一種である特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、人口１０万人当たり２０人程度の患者数と罹患率は高くはないものの、診断確定後の平均生存期間が２．５～５年と治療後の経過はよくないため、日本において難病指定されている。
　ＩＰＦ治療薬としては、これまでにピルフェニドン、ニンテダニブが日本国厚生労働省より承認を受け上市されている。いずれの薬剤も肺活量低下抑制と無増悪期間延長作用を示し、病態の進行を遅延させるものの、治療効果としては十分満足できるものとはいえず、新たなメカニズムに基づく治療薬の開発が望まれている。
　一方、本発明の標的である「ＮＥＫ６タンパク質」は、細胞分裂の制御に関わるＮＩＭＡ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙの１つとして知られるが、医薬品開発の研究対象としてはこれまであまり着目されていない。２００２年に癌の創薬標的としての可能性が報告されるが、ＮＥＫ６タンパク質がＳＭＡＤ２／３タンパク質と相互作用すること、組織の線維化を促進することについて具体的な報告はない。
米国特許出願公開第２００４／００９７４４１号明細書
　本発明は、新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ブレオマイシン誘発肺線維症モデルを用いた解析から、ＮＥＫ６（ＮＩＭＡ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　６）のｍＲＮＡレベルの亢進が見られることに着目し研究を進めた結果、ＮＥＫ６がＴＧＦ－β下流で線維化に寄与するＳＭＡＤ系シグナルを制御することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤；
〔２〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含む線維症治療剤；
〔３〕　線維症が肺線維症、肝線維症又は腎線維症である、〔２〕の治療剤；
〔４〕　配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列及び配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含む、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸；
〔５〕　配列番号１の配列、配列番号２の配列及び配列番号３の配列からなる群より選択される配列を含む、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸；
〔６〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を対象に投与することを含む、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を阻害する方法；
〔７〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を対象に投与することを含む、線維症を治療する方法；
〔８〕　ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化の阻害に使用するＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸；
〔９〕　線維症治療に使用するＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸；
〔１０〕　ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の使用；
〔１１〕　線維症治療剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の使用；
〔１２〕ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、ＫＢ－ＸＡＸ、ＫＢ－ＸＢＸ又はＫＢ－ＸＣＸの配列を含む核酸である、〔１１〕の使用；
〔１３〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤であって、上記核酸はＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とするものである、阻害剤；
〔１４〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む線維症治療剤であって、上記核酸はＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とするものである、治療剤；
〔１５〕　線維症が肺線維症、肝線維症又は腎線維症である、〔１４〕の治療剤；
〔１６〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列及び配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含む核酸である、［１３］の阻害剤；
〔１７〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、配列番号１の配列、配列番号２の配列及び配列番号３の配列からなる群より選択される配列を含む核酸である、［１３］の阻害剤；
〔１８〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸を対象に投与することを含む、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を阻害する方法；
〔１９〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸を対象に投与することを含む、線維症を治療する方法；
〔２０〕　ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化の阻害に使用する、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸；
〔２１〕　線維症治療に使用する、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸；
〔２２〕　ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の使用であって、上記核酸はＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とするものである使用；
〔２３〕　線維症治療剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の使用であって、上記核酸はＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とするものである使用；
〔２４〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、ＫＢ－ＸＡＸ、ＫＢ－ＸＢＸ又はＫＢ－ＸＣＸの配列を含む核酸である、〔２３〕の使用；
［２５］　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１０～４０塩基である、［１］の阻害剤；
〔２６〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１２～２１塩基である、［１］の阻害剤；
［２７］　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の配列の両端に人工核酸が導入されている、［１］の阻害剤；
［２８］　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１２～２１塩基であり、配列の両端に人工核酸が導入されている、［１］の阻害剤；
［２９］　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１０～４０塩基である、［２］の治療剤；
〔３０〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１２～２１塩基である、［２］の治療剤；
［３１］　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の配列の両端に人工核酸が導入されている、［２］の治療剤；
［３２］　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１２～２１塩基であり、配列の両端に人工核酸が導入されている、［２］の治療剤；
［３３］　アンチセンス核酸が、リポソーム、グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リピドマイクロスフェア、高分子ミセル、ゲル剤又はエキソソームのドラッグデリバリーキャリアに封入されて投与される、［３２］の治療剤。
　本発明により新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤の提供が可能となる。
ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの配列及び実施例１で作製した各アンチセンス核酸の標的部位を示す図である。斜線部は非翻訳領域を示す。（なお、ｍＲＮＡ配列上のＵ（ウラシル）はＴ（チミン）として表記している） 図２は、各アンチセンス核酸を導入した場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を示すグラフである。 図３は、各アンチセンス核酸によりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。 図４は、各アンチセンス核酸によりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を定量化し、リン酸化ＳＭＡＤ３量をトータルＳＭＡＤ３量により補正した結果を示す。 図５ａは、抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降の結果を表す。図５ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降の結果を表す。 図６は、Ｈｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質を反応させた場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。 図７ａは、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるウェスタンブロットの結果を表す。図７ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるホタルルシフェラーゼの発光量を表す。 図８は、肝星細胞において、各アンチセンス核酸によりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。 図９は、肝星細胞において、各アンチセンス核酸によりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の転写量を表す。 図１０ａは、肺線維芽細胞において、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１０ｂは、肺線維芽細胞において、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を表す。 図１１は、腎臓線維芽細胞において、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を表す。 図１２ａは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合の血清中ＧＰＴの測定結果を表す。図１２ｂは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合の血清中ＧＯＴの測定結果を表す。 図１３は、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を表す。 図１４ａは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を表す。図１４ｂは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１４ｃは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ３ａ１遺伝子の転写量を表す。図１４ｄは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＴｉｍｐ１遺伝子の転写量を表す。 図１５ａは、ＢＤＬモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を表す。図１５ｂは、ＢＤＬモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１５ｃは、ＢＤＬモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ３ａ１遺伝子の転写量を表す。図１５ｄは、ＢＤＬモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＴｉｍｐ１遺伝子の転写量を表す。 図１６は、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合の肝臓の病理解析の結果を表す。図１６ａはＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群の結果を表す。図１６ｂはＣＣｌ４投与の溶媒投与群の結果を表す。図１６ｃはＣＣｌ４投与の核酸投与群の結果を表す。
　本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いるものである。また、本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。本発明において、塩基数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１～４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する。
　本発明は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤及び当該核酸を有効成分として含む線維症治療剤、並びに、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤及び当該核酸を有効成分として含む線維症治療剤を提供するものである。以下、本発明の内容について詳細に説明する。
（１）ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸
　ＮＥＫ６タンパク質は、細胞分裂の制御に関わる１１個のＮＩＭＡ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙの１つであり、細胞周期のＭ期においてリン酸化（活性化）される。
　本発明の標的であるＮＥＫ６遺伝子は、哺乳類由来の遺伝子であり、好ましくはヒト由来の遺伝子である。ヒト由来のＮＥＫ６遺伝子は、７種のバリアントが報告されているが、その中のアイソフォーム２のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＮＭ＿０１４３９７）を図１に表す（配列番号４）。
　核酸分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制メカニズムは、特に制限されるものではなく、発現をダウンレギュレーションできるものであればよい。ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制は、ＮＥＫ６遺伝子からの転写産物の生成量の減少、ＮＥＫ６遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、又は上記翻訳産物の活性の減少等によって確認することができる。
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸としては、ＮＥＫ６　ｍＲＮＡのアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＰＮ分子、ｓｓＮｃ分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイムなどがあげられる。上記核酸は、一本鎖核酸であってもよく、二本鎖核酸であってもよい。
　アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＰＮ分子、ｓｓＮｃ分子、リボザイムは、当業者であれば、上記のヒトＮＥＫ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて容易に取得することができる。ＮＥＫ６　アイソフォーム２のｍＲＮＡ配列（配列番号４）に基づいて作製した核酸が好ましい。例えば、ＮＥＫ６　アイソフォーム２のｍＲＮＡ配列の３’非翻訳領域に基づいて上記核酸を作製することができる。
（２）アンチセンス核酸
　アンチセンス核酸は、標的とするｍＲＮＡと配列特異的に二重鎖を形成し、そのスプライシング阻害及び翻訳阻害等の機能阻害を行うオリゴヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ及び／又はアンチセンスＲＮＡ）であり、標的とするｍＲＮＡの全長もしくは一部に対するアンチセンス核酸を細胞内に導入することで効果を発揮する。
　アンチセンス核酸の発現阻害のメカニズムとしては、
１）ｍＲＮＡの５’キャップ部位から開始コドンの約２５塩基下流までの領域を標的配列とする翻訳開始複合体の立体的阻害
２）標的ｍＲＮＡと相補的な一本鎖ＤＮＡであり、ＲＮａｓｅＨを介したｍＲＮＡ分解
３）ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエキソンとイントロンの境界領域を標的配列とするスプライシング阻害（ｍＲＮＡの成熟阻害）
があげられる。ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するものであれば、そのメカニズムは特に制限されるものではない。
　本実施形態に係るアンチセンス核酸に含まれる配列としては、ＮＥＫ６遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。例えば、ＮＥＫ６遺伝子に相補的であって、且つ、ＮＥＫ７遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ　ｄａｔａｂａｓｅ：ＮＭ＿１３３４９４．２）に相補的でない、あるいは、領域中１以上（例えば1～３）の塩基がＮＥＫ７遺伝子に非相補的（ミスマッチ）である配列を選択することがあげられる。ＮＥＫ６遺伝子に対しては相補的であり、ＮＥＫ７遺伝子に対しては非相補的（ミスマッチ）な塩基を増加させる（例えば、４以上、好ましくは５～７）ことは、オフターゲット効果を回避する上で有用である。
　本実施形態に係るアンチセンス核酸に含まれる塩基数は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する効果を発揮する限り特に制限されないが、例えば、１０～４０塩基、１０～３５塩基、１２～３０塩基、又は１２～２１塩基であってよい。
　ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するアンチセンス核酸は、ＮＥＫ６の成熟ｍＲＮＡのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＬＮＡ（登録商標）ＧａｐｍｅＲ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｏｏｌ等のアンチセンス核酸配列設計システムに従って得ることができる。
　アンチセンス核酸は、ＲＮＡとの結合安定性（Ｔｍ値など）、ミスマッチ配列認識能、ヌクレアーゼ耐性、ＲＮａｓｅＨ活性等の点から修飾ヌクレオチド残基を含むことが好ましい。
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の具体例として、以下の一本鎖核酸分子をあげることができる。
〔１〕配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸。
〔２〕配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸。
〔３〕配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、を含む、核酸。
　アンチセンス核酸に含まれる配列の配列番号１～３の配列との配列同一性は、９０％以上、９２％以上、９５％以上又は９８％以上であってもよく、１００％であってもよい。〔１〕～〔３〕のアンチセンス核酸は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する作用を失わない範囲で各種修飾が付加されていてもよい。各種修飾は、配列番号１～３の配列中に存在していてもよく、配列外に存在していてもよい。修飾ヌクレオチド等の詳細については後述する。
　ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するアンチセンス核酸は、ＮＥＫ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、公知の手法により、容易に取得することができる。例えば、ＮＥＫ６アイソフォーム２のｍＲＮＡの配列（配列番号４）等のＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡ配列情報に基づいて適宜設計し、従来公知の方法により合成することができる。上記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。上記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。上記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法及びＨ－ホスホネート法等があげられる。上記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。
（３）ｓｉＲＮＡ
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）を以下に説明する。
　ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と対合するガイド鎖（アンチセンス鎖）、ガイド鎖と二本鎖を形成しているパッセンジャー鎖（センス鎖）からなる核酸分子である。ｓｉＲＮＡは、細胞内においてＡｒｇｏｎａｕｔｅ（ＡＧＯ）タンパク質を中核とする　ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）と呼ばれる複合体に取り込まれた後、センス鎖はＡＧＯにより分解され、ガイド鎖はＲＩＳＣに残る。ガイド鎖のシード領域（ガイド鎖の５’末端から２－８塩基の７塩基領域）は、標的配列を認識する上で重要な働きを有していると考えられており、オフターゲット効果を回避する目的から標的遺伝子に特異的なシード領域を選択することが好ましいとされている。したがって、本発明の有効成分である核酸のシード領域についてもＮＥＫ６成熟ｍＲＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ　ｄａｔａｂａｓｅ：ＮＭ＿０１４３９７）に特異的な配列を選択することが好ましい。例えば、ＮＥＫ６成熟ｍＲＮＡに相補的であって、且つ、ＮＥＫ７成熟ｍＲＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ　ｄａｔａｂａｓｅＮＭ＿１３３４９４．２）に相補的でない、あるいは、領域中１以上（例えば1～３）の塩基がＮＥＫ７成熟ｍＲＮＡに非相補的（ミスマッチ）である配列をシード領域として含む核酸を選択することがあげられる。また、全長配列についても、例えば、ＮＥＫ６成熟ｍＲＮＡに対しては相補的であり、ＮＥＫ７成熟ｍＲＮＡに対しては非相補的（ミスマッチ）な塩基を増加させる（例えば、４以上、好ましくは５～７）ことは、オフターゲット効果を回避する上で有用である。ガイド鎖に含まれる発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５～３０塩基であり、好ましくは、１９～２５塩基であり、より好ましくは１９～２３塩基であり、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
　上記発現抑制配列は、３’側に、さらに付加配列を有することで突出端を形成してもよい。上記付加配列の塩基数は、例えば、１～１１塩基であり、好ましくは１～４塩基である。付加配列は、リボヌクレオチド残基でもデオキシリボヌクレオチド残基でもよい。
　ガイド鎖の塩基数は、例えば、１９～５０塩基であり、好ましくは１９～３０塩基であり、より好ましくは、１９～２５塩基であり、さらに好ましくは１９～２３塩基であり、ことさら好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
　パッセンジャー鎖の塩基数は、例えば、１９～５０塩基であり、好ましくは１９～３０塩基であり、より好ましくは、１９～２５塩基であり、さらに好ましくは１９～２３塩基であり、ことさら好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２１塩基である。
　パッセンジャー鎖で、ガイド鎖と相補性を示す領域は、例えば、１９～５０塩基であり、好ましくは１９～３０塩基であり、より好ましくは、１９～２５塩基であり、さらに好ましくは１９～２３塩基である。上記領域は、３’側に、さらに付加配列を有してもよい。上記付加配列の塩基数は、例えば、１～１１塩基であり、好ましくは１～４塩基であり、付加配列は、リボヌクレオチド残基でもデオキシリボヌクレオチド残基でもよい。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖の相補性を示す領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。上記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１～３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
　ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ６成熟ｍＲＮＡのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、ｓｉＳＮＩＰＥＲ（登録商標）、創薬・診断研究用ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）等のｓｉＲＮＡ配列設計システムに従って得ることができる。
　ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ６に特異的に作用するｓｉＲＮＡが好ましく、例えば以下のような二本鎖核酸をあげることができる。
（ａ）配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むガイド鎖（アンチセンス鎖）と、パッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
（ｂ）配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むガイド鎖（アンチセンス鎖）と、パッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
（ｃ）配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むガイド鎖（アンチセンス鎖）と、パッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
　上記二本鎖核酸分子に含まれるガイド鎖（アンチセンス鎖）に含まれる配列の配列番号１～３の配列との配列同一性は、９０％以上、９２％以上、９５％以上又は９８％以上であってもよく、１００％であってもよい。
　また、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端とガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結され、あるいは、ガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端とパッセンジャー鎖（センス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結されたヘアピン型ＲＮＡ構造を形成している一本鎖核酸分子であってもよい。
（４）ｓｓＰＮ分子
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つとなるｓｓＰＮ分子について説明する。ｓｓＰＮ分子は、ＷＯ２０１２／０１７９１９に開示される生物学的安定性に優れた一本鎖ＲＮＡ核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
　本発明の有効成分となるｓｓＰＮ分子は、ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）を含み、上記領域（Ｘ）と上記領域（Ｘｃ）との間に、上記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、上記領域（Ｘ）及び上記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、上記発現抑制配列を含み、上記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする。ｓｓＰＮ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
　ｓｓＰＮ分子において、ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子が、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。ＮＥＫ６ ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡ配列は、ＮＥＫ６遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、既存のｓｉＲＮＡ設計システムに従って得ることができ、ｓｓＰＮ分子においても、上記ｓｉＲＮＡの発現抑制配列を、ｓｓＰＮ分子の発現抑制配列として使用することができる。
　上記発現抑制配列は、例えば、ＮＥＫ６遺伝子の標的領域に対して、８０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、ことさらに好ましくは９８％以上であり、特に好ましくは１００％である。
　特に、ｓｉＲＮＡのシード領域に該当する部分については、ｓｉＲＮＡの場合と同様にＮＥＫ６遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。
　ｓｓＰＮ分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制は、例えば、ＲＮＡ干渉が生じることによると推測されるが、このメカニズムにより限定されるものではない。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、上記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。
　ｓｓＰＮ分子において、上記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、上記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、上記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、上記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造と、上記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造との両方を有してもよい。
（５）ｓｓＮｃ分子
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｓｓＮｃ分子を説明する。
ｓｓＮｃ分子は、ＷＯ２０１２／０５３６８に開示される一本鎖ＲＮＡ核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
　ｓｓＮｃ分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）及び３’側領域（Ｙｃ）を、上記順序で含み、
上記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）及び内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
上記５’側領域（Ｘｃ）が、上記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
上記３’側領域（Ｙｃ）が、上記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
上記内部領域（Ｚ）、上記５’側領域（Ｘｃ）及び上記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、発現抑制配列を含むことを特徴とする。
　ｓｓＮｃ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、上記内部領域（Ｚ）において、上記内部５’領域（Ｘ）と上記内部３’領域（Ｙ）が、直接的に連結されている。
　ｓｓＮｃ分子において、上記５’側領域（Ｘｃ）は、上記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、上記３’側領域（Ｙｃ）は、上記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である。このため、５’側において、上記領域（Ｘｃ）が上記領域（Ｘ）に向かって折り返し、上記領域（Ｘｃ）と上記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能であり、また、３’側において、上記領域（Ｙｃ）が上記領域（Ｙ）に向かって折り返し、上記領域（Ｙｃ）と上記領域（Ｙ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
　ｓｓＮｃ分子は、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
　ｓｓＮｃ分子における上記発現抑制配列は、ｓｓＰＮ分子の説明を援用することができる。
　ｓｓＮｃ分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制は、例えば、上記内部領域（Ｚ）、上記５’側領域（Ｘｃ）及び上記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに上記発現抑制配列を配置した構造をとることで、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡ干渉に類似する現象（ＲＮＡ干渉様の現象）が生じることによると推測される。なお、ｓｓＮｃ分子のメカニズムもｓｓＰＮ分子のメカニズム同様限定されるものではない。ｓｓＮｃ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、上記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、ｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
（６）ｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子の合成方法
　ｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。上記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。上記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。上記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法及びＨ－ホスホネート法等があげられる。上記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。上記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。上記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。また、本発明のｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子は、ＷＯ２０１２／０５３６８、ＷＯ２０１２／１７９１９、ＷＯ２０１３／２７８４３、ＷＯ２０１６／１５９３７４に記載の製造方法に従って製造することができる。
（７）ｍｉＲＮＡ
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｍｉＲＮＡについて以下に説明する。
　ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の阻害又はｍＲＮＡの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、細胞内に存在する短鎖（２０－２５塩基）のノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、まず、ＤＮＡから、ｍｉＲＮＡとその相補鎖とを含みヘアピンループ構造を取ることが可能な一本鎖のｐｒｉ－ＲＮＡとして転写される。次にｐｒｉ－ＲＮＡは、核内にあるＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって一部が切断されｐｒｅ－ＲＮＡとなって核外に輸送される。その後、ｐｒｅ－ＲＮＡはさらにＤｉｃｅｒによって切断されることにより、ｍｉＲＮＡとして機能する。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域へ不完全なハイブリダイゼーション結合を行い、そのｍＲＮＡがコードするタンパク質合成を阻害する。
　ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の遺伝子名又はｍＲＮＡ配列情報に基づいて、例えば、ｍｉＲＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｄｂ．ｏｒｇ／ｍｉＲＤＢ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）等のデータベースに従って得ることができる。
（８）核酸に使用されるヌクレオチド残基
　本実施形態において、有効成分である核酸に使用されるヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。上記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。上記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を有し、上記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）を有する。
　上記ヌクレオチド残基は、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基等があげられる。上記非修飾ヌクレオチド残基は、上記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一又は実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一又は実質的に同一である。
　上記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、上記非修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。上記修飾ヌクレオチドは、例えば、上記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、上記構成要素の置換、付加及び／又は欠失、上記構成要素における原子及び／又は官能基の置換、付加及び／又は欠失であり、「改変」ということができる。上記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。上記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ．１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ｏｆ　ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：２１８３～２１９６）を参照できる。また、上記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、上記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。
　上記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース－リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。上記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。上記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素又はフルオロ等に置換できる。上記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。また、２’位水酸基にメチル基又はメトキシエチル基等を導入することによっても修飾でき、例えば、２’－Ｆ、２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ（２’－ＯＭｅ）及び２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（２’－ＭＯＥ）等があげられる。上記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
　上記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基及び／又は非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。上記非リボリン酸骨格は、例えば、上記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。上記非リボリン酸骨格に置換された、上記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。上記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、架橋型人工核酸である２’，４’－ＢＮＡ[Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）]、ＡｍＮＡ、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）、ＧｕＮＡ及びｓｃｐＢＮＡ等があげられる。本実施形態に係る核酸が、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解のメカニズムを利用したアンチセンス核酸である場合には、人工核酸が導入されたアンチセンス核酸であることが好ましく、さらに好ましくは配列の両端に人工核酸が導入された核酸であり、特に好ましくは配列の両端のみに人工核酸が導入されたアンチセンス核酸である。配列の両端のみに人工核酸が導入されたアンチセンス核酸とすることで、人工核酸の特性を維持しつつもＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解が起こり、高いアンチセンス効果を期待できるためである。
　一方、本実施形態に係る核酸が、エキソンスキッピング誘導のメカニズムを利用したアンチセンス核酸である場合には、標的ＲＮＡを切断しないようにするため、ミックスマーや全修飾型オリゴヌクレオチドのようにＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解が起こらない設計とすることが好ましい。
　上記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。上記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。上記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。上記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ－ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、上記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。上記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、又は、上記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
　上記リン酸基は、例えば、上記非結合酸素を置換してもよい。上記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）及びＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基又はアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。上記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。上記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステル等があげられ、中でも、上記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
　上記リン酸基は、例えば、上記結合酸素を置換してもよい。上記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）及びＮ（窒素）のいずれかの原子、又はボラン（ＢＨ３）で置換できる。上記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、及びＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。上記酸素原子をＳ（硫黄）原子に置換したホスホロチオエート修飾（Ｓ化）は核酸と核酸をつなぐリン酸ジエステル結合部の修飾であり、配列中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に改変される。これにより、ヌクレアーゼ耐性の向上が期待できるため、好ましい。上記結合酸素の置換は、例えば、本実施形態に係る核酸の５’末端ヌクレオチド残基及び３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行ってもよく、両方において行ってもよい。また、例えば、本実施形態に係る核酸におけるすべてのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に改変されてもよい。
　上記リン酸基は、例えば、上記リン非含有のリンカーに置換してもよい。上記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基及びメチレンメチルイミノ基を含む。
　上記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。上記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。上記保護基としては、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。
　上記他の分子は、例えば、上記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、上記リン酸基又は上記糖残基に付加してもよい。上記スペーサーの末端原子は、例えば、上記リン酸基の上記結合酸素、又は、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加又は置換できる。上記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、又はこれらに結合する原子が好ましい。上記スペーサーは、例えば、上記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加又は置換することもできる。
　上記スペーサーは、特に制限されず、例えば、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎＮ－、－（ＣＨ２）ｎＯ－、－（ＣＨ２）ｎＳ－、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、及びモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬及びフルオレセイン試薬等を含んでもよい。上記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３又は６が好ましい。
　上記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
　核酸分子は、上記５’末端が、例えば、リン酸基又はリン酸基アナログで修飾されてもよい。上記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－グアノシンキャップ（７－メチル化又は非メチル化、７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸及び三リン酸（例えば、５’－α－チオ三リン酸、５’－γ－チオ三リン酸等）、５’－ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’－アルキルエーテルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
　上記ヌクレオチド残基において、上記塩基は、特に制限されない。上記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。上記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。上記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
　上記塩基は、例えば、アデニン及びグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基等があげられる。上記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。上記塩基は、例えば、２－アミノアデニン、６－メチル化プリン等のアルキル誘導体；２－プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５－ハロウラシル及び５－ハロシトシン；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；６－アゾウラシル、６－アゾシトシン及び６－アゾチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、５－ハロウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル；８－ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８－置換プリン；５－トリフルオロメチル化及び他の５－置換ピリミジン；７－メチルグアニン；５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３－デアザ－５－アザシトシン；２－アミノプリン；５－アルキルウラシル；７－アルキルグアニン；５－アルキルシトシン；７－デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン；２，６－ジアミノプリン；５－アミノ－アリル－ウラシル；Ｎ３－メチルウラシル；置換１，２，４－トリアゾール；２－ピリジノン；５－ニトロインドール；３－ニトロピロール；５－メトキシウラシル；ウラシル－５－オキシ酢酸；５－メトキシカルボニルメチルウラシル；５－メチル－２－チオウラシル；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル；５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル；３－メチルシトシン；５－メチルシトシン；Ｎ４－アセチルシトシン；２－チオシトシン；Ｎ６－メチルアデニン；Ｎ６－イソペンチルアデニン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン；Ｎ－メチルグアニン；Ｏ－アルキル化塩基等があげられる。また、プリン及びピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　Ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８～８５９頁、クロシュビッツ　ジェー　アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ　Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、１９９０、及びイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
（９）その他の用語の定義
　本実施形態において、有効成分である核酸、リンカー等の説明にて使用される用語は、当該技術分野での通常用いられるものであり、例えば、以下のように示すことができる。
　本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状又は分枝状のアルキル基を含む。上記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１～３０であり、好ましくは、１～６又は１～４である。上記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
　本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基及び多環芳香族炭化水素基を含む。上記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。上記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１－ナフチル、２－ナフチル、１－アントリル、２－アントリル、９－アントリル、１－フェナントリル、２－フェナントリル、３－フェナントリル、４－フェナントリル、９－フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１－ナフチル及び２－ナフチル等のナフチル等があげられる。
（１０）ＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤
　ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害とは、ＴＧＦ－β刺激により促進されるＳＭＡＤ２及び／又はＳＭＡＤ３のリン酸化が阻害（制御）されることを意味する。
　ＳＭＡＤ２／３は、ＴＧＦ－βＩ型レセプターによってリン酸化を受けるＲ－ＳＭＡＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ＳＭＡＤ）の１種であり、ＴＧＦ－βによる刺激後、リン酸化（活性化）されたＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３は、Ｃｏ－ＳＭＡＤ（ｃｏｍｍｏｎ　ｐａｒｔｎｅｒ　ＳＭＡＤ）であるＳＭＡＤ４とともに核内へ移行する。実施例４に示すように、本発明者らは、ＮＥＫ６タンパク質が、細胞内でＳＭＡＤ２／３タンパク質と相互作用し、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を促進することを見出した。リン酸化されたＳＭＡＤ２／３タンパク質はＳＭＡＤタンパク質複合体形成し、核内に移行し、α―ＳＭＡ、α２－コラーゲン、インターフェロンβ、インターロイキン－５、ＶＥＧＦ等の転写を亢進する。
　したがって、本実施形態に係るＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤によってＳＭＡＤシグナル系を阻害することで、α－ＳＭＡ、α２－コラーゲン、インターフェロンβ等の転写制御が可能となり、ひいては創傷治癒過程における、線維芽細胞、肝星細胞等の筋線維芽細胞への分化抑制、線維芽細胞等によるマトリックス合成の制御、炎症・免疫反応の調節等に有用であることが理解できる。
（１１）線維症治療剤
　本実施形態に係る線維症治療剤は、肝線維症、肝硬変、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アルコール性肝疾患、原発性硬化性胆菅炎、ヘモクロマトーシス、ウイルソン病、α１－アンチトリプシン欠損症、非ウイルス性鬱血性肝硬変、薬剤性肝障害、膵炎、膵線維症、網膜線維症、声帯瘢痕化、声帯粘膜線維症、喉頭線維症、肺線維症、間質性肺炎、特発性肺線維症、非特異性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺炎、急性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、サルコイドーシス、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、リンパ脈管筋腫症、肺胞蛋白症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、肺ランゲルハンス細胞組織球症、鉄肺症、アミロイドーシス、肺胞微石症、過敏性肺炎、じん肺、感染性肺疾患、薬剤性肺炎、放射線肺炎、嚢胞性線維症、骨髄線維症、腎線維症、慢性腎不全、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、悪性腎硬化症、多発性嚢胞腎、薬剤性腎障害、後腹膜線維症、膠原病、強皮症、先天性角化不全症、腎性全身性線維症の他、気道の線維化、腸管の線維化、膀胱の線維化、前立腺の線維化、皮膚の線維化を含む広く線維化に関する疾患に対する治療剤である。好ましくは、肝線維症、肝硬変、肺線維症、間質性肺炎、腎線維症又は慢性腎不全であり、より好ましくは、肺線維症、肝線維症又は腎線維症である。
　本実施形態に係る線維症治療剤の投与方法は、特に制限されるものではないが、吸入、静脈内投与（静注）、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、髄腔内投与及び経皮投与等の非経口投与であることが好ましい。本実施形態に係る線維症治療剤は、当該線維症治療剤を必要とする対象、例えば、上述した線維化に関する疾患を発症している対象及びその発症リスクが高いと判断される対象に投与されることが好ましい。対象は、ヒトであってもよく、非ヒト動物であってもよい。本実施形態に係る治療方法における本実施形態に係る核酸分子の投与量は、上記疾患の治療上有効な量であれば特に制限されず、疾患の種類、重症度、齢、体重、投与経路等によって異なるが、通常、成人１回あたり約０．０００１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．００１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．００５～約５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。当該量を、例えば、１日３回～１ヶ月に１回、好ましくは１日～１週間に１回の間隔で投与することができる。
　本実施形態に係る線維症治療剤は、通常、薬学的に許容される担体とともに適当な医薬組成物として製剤化されて経口又は非経口の形で投与される。
　本実施形態に係るアンチセンス核酸は、リポソーム、グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リピドマイクロスフェア、高分子ミセル、ゲル剤又はエキソソームのドラッグデリバリーキャリアに封入され、投与されることが好ましい。
　以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本実施例において「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、「アンチセンス核酸」、「ＡＳＯ」と同意である。
〔実施例１：　アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＮＥＫ６のノックダウン〕
　ヒト肝星細胞株ＬＩ－９０細胞に、ヒトＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ－ＸＡＸ、ＫＢ－ＸＢＸ、ＫＢ－ＸＣＸ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、終濃度３０ｎＭでトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を１０％　ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ　Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）から０．２％　ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ　Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）に交換した。トランスフェクションから９６時間後、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列としては、以下のＫＢ－ＸＡＸ、ＸＢＸ及びＸＣＸを使用した。
ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ－ＸＡＸ）：５’－ＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧ－３’（配列番号１）
ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ－ＸＢＸ）：５’－ＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡＡＴＴ－３’（配列番号２）
ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ－ＸＣＸ）：５’－ＴＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＧＡＡ－３’（配列番号３）
　得られたＲＮＡをＨｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡについて、ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによるＮＥＫ６遺伝子の転写量に対する影響を調べた。ＮＥＫ６遺伝子の転写量は、ＮＥＫ６　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００２０５２２１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ　Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。１８ｓ　Ｐｒｏｂｅは下記のカスタム合成１８ｓ　ＭＧＢ　Ｐｒｏｂｅ、カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ１及びカスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ２を、それぞれ０．２μＭ、０．４μＭ及び０．４μＭとなるように混合し、リアルタイムＰＣＲを行った。
カスタム合成１８ｓ　ＭＧＢ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
５’－ＡＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣ－３’（配列番号５）
カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’－ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ－３’（配列番号６）
カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’－ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ－３’（配列番号７）
　図２にＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドが導入された場合のＮＥＫ６のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入は、ＮＥＫ６遺伝子の転写量を抑制した。したがって、用いられたＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率的に標的遺伝子の発現を抑制したことが示された。
〔実施例２：　ＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤ３リン酸化に対する影響〕
　ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドがＴＧＦ－βシグナルを制御する可能性を検討するため、各ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
　ヒト肝星細胞株ＬＩ－９０細胞に、ヒトＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ－ＸＡＸ，ＸＢＸ、ＸＣＸ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、終濃度３０ｎＭでトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％　ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）から０．２％　ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ　Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ－β添加３０分後、細胞を２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，６Ｍ　Ｕｒｅａ，１２％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社），１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社）］で溶解し、細胞抽出液とした。
　得られた細胞抽出液にβ－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％及び０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び抗ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗β－Ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）によりウェスタンブロッティングを行った。リン酸化ＳＭＡＤ３量はトータルＳＭＡＤ３量により補正した。
　図３にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を、図４にリン酸化ＳＭＡＤ３量をトータルＳＭＡＤ３量により補正した結果を示す。ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ－βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。
〔実施例３：　ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質との細胞内における相互作用〕
　ＮＥＫ６タンパク質が細胞内でＳＭＡＤ３と相互作用してＳＭＡＤ３をリン酸化しているかを検討するため、共免疫沈降を行った。
　ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６がクローニングされた発現ベクター（ｐＥＺ－Ｍ０２　Ｎｅｋ６，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）とＦＬＡＧタグで標識されたヒトＳＭＡＤ３がクローニングされた発現ベクター（ｐＥＺ－Ｍ１１　Ｆｌａｇ－ｈＳｍａｄ３，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）を、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ　ＨＰ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培地を交換した。トランスフェクション４８時間後、溶解バッファー（１７５ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．６，０．１％　ＮＰ４０，０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０，１．４ｍＭ　β－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）で細胞を回収し、遠心分離によって上清を得た。上清にＴｒｕｅＢｌｏｔ　Ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ　ＩｇＩＰ　Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）を添加し、遠心分離を行い、非特異的な結合を除去した。そこから得られた上清にコントロールとしてｎｏｒｍａｌ　ｇｏａｔ　ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、もしくは抗ＮＥＫ６抗体を加え、オーバーナイト４℃にてインキュベートした後に、ＴｒｕｅＢｌｏｔ　Ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ　ＩｇＩＰ　Ｂｅａｄｓを加え４時間、４℃にてインキュベートした。遠心分離を行って上清を除いた後に、ＴｒｕｅＢｌｏｔ　Ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ　ＩｇＩＰ　Ｂｅａｄｓを溶解バッファーで洗浄して非特異的な結合を除去した。２×ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，２０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２％　Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ，５０ｍＭ　ＤＴＴ）をＴｒｕｅＢｌｏｔ　Ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ　ＩｇＩＰ　Ｂｅａｄｓに添加して９５℃で５分間加熱し、上清に含まれる共免疫沈降物を回収した。抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降物に対して抗ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が共沈降されるかを検出した。
　図５ａに、抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が検出された。
　ＳＭＡＤ３タンパク質がＮＥＫ６と細胞内で相互作用しリン酸化されているかを解析するため、ヒトＮＥＫ６発現ベクターとＦＬＡＧタグで標識されたヒトＳＭＡＤ３発現ベクターをＬＬ２９細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培地を交換した。トランスフェクション４８時間後、溶解バッファー（２５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．６，０．１％　ＮＰ４０，０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０，１．４ｍＭ　β－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）で細胞を回収し、遠心分離によって上清を得た。得られた上清にＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加し、４℃にてオーバーナイトでインキュベートした。その後、遠心分離を行い、上清を除いた。Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌを溶解バッファーで洗浄して非特異的な結合を除去した。２×ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，２０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２％　Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ，５０ｍＭ　ＤＴＴ）をＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌに添加して９５℃で４分間加熱し、上清に含まれる共免疫沈降物を回収した。得られた共免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより大きさに基づいて分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌによる共免疫沈降物に対しては抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、抗ＮＥＫ６抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＮＥＫ６タンパク質とリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質が共沈降されるかを検出した。
　図５ｂに、抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＮＥＫ６タンパク質とＦＬＡＧ－ＳＭＡＤ３タンパク質が検出された。また、ヒトＮＥＫ６の発現ベクターのトランスフェクションによって、リン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質の量が上昇した。
　抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降物中にＳＭＡＤ３タンパク質が検出されたこと、及び逆に抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降物中にＮＥＫ６が検出されたことから、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が細胞内で相互作用して複合体を形成することが示された。更に、ヒトＮＥＫ６の発現ベクターのトランスフェクションによってリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質の量が上昇したことから、ＮＥＫ６タンパク質はＳＭＡＤ３タンパク質を細胞内でリン酸化することが示された。
〔実施例４：　ＮＥＫ６タンパク質によるＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化〕
　ＮＥＫ６タンパク質がＳＭＡＤ３タンパク質を基質として直接リン酸化している可能性を、ＮＥＫ６とＳＭＡＤ３の精製タンパク質を用いて検討した。
　Ｈｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質（ｅｕｒｏｆｉｎｓ社）とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を反応溶媒（１５０μＭ　ＡＴＰ，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＤＴＴ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）と混合し、３０°Ｃにて４５分間インキュベートした。５％　β－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及び０．０２５％　Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅを含む２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを、反応液に等量添加して反応を停止させた後に、９５℃で５分加熱し、サンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、反応液に含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体によりウェスタンブロッティングを行った。
　図６にＨｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質を反応させた場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６タンパク質を用いることで、リン酸化ＳＭＡＤ３の量が上昇した。したがって、ＮＥＫ６タンパク質はＳＭＡＤ３タンパク質を基質として直接リン酸化することが示された。
〔実施例５：　ＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤタンパク質複合体の転写活性に対する影響〕
　ＮＥＫ６タンパク質が、ＳＭＡＤタンパク質複合体の核内移行後におこる転写活性も制御しているかを検討するため、ＳＭＡＤタンパク質複合体のＤＮＡ結合配列とルシフェラーゼ遺伝子を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。また、同時に調製したＬＬ２９細胞を用いてウェスタンブロッティングを実施し、ＮＥＫ６のノックダウンについて確認した。
　ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡである　ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション２４時間後、培地を１０％　ＦＣＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地から０．４％　ＦＣＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地に交換した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション４８時間後、ＳＭＡＤタンパク質複合体のＤＮＡ結合配列［ＳＭＡＤ　ｂｉｄｉｎｇ　ｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＢＥ）］とホタルルシフェラーゼ遺伝子がクローニングされた発現ベクター（ｐＴＬ－ＳＢＥ－ｌｕｃ：５’－ＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡ－３’（配列番号８），Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）と野生型ウミシイタケルシフェラーゼを含むレポーターアッセイ補正用のベクター（ｐＲＬ－ＴＫ：Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ　ｗｉｔｈ　ＰＬＵＳ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクションした。発現ベクターのトランスフェクション２時間後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質を終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。ＴＧＦ－β添加２４時間後において、細胞を２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，６Ｍ　Ｕｒｅａ，１２％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解した。得られた細胞抽出液に含まれるタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。また、上記と同様に調製したＬＬ２９細胞をＤｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に順じて回収し、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼによる発光を測定した。ホタルルシフェラーゼの発光量をウミシイタケルシフェラーゼによる発光量で補正した。
＜ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡ＞
ｓｉＮＥＫ６：５’－ＣＵＧＵＣＣＵＣＧＧＣＣＵＡＵＣＵＵＣ－３’（配列番号９）
ｓｉＮＥＫ６：５’－ＵＡＵＵＵＧＧＧＵＧＧＵＵＣＡＧＵＵＧ－３’（配列番号１０）
ｓｉＮＥＫ６：５’－ＣＡＡＣＵＣＣＡＧＣＡＣＡＡＵＧＵＵＣ－３’（配列番号１１）
ｓｉＮＥＫ６：５’－ＵＡＣＵＵＧＡＵＣＡＵＣＵＧＣＧＡＧＡ－３’（配列番号１２）
　図７ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少している事が示されたが、ＳＭＡＤ３タンパク質の量は変化しなかった。図７ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合における、ウミシイタケルシフェラーゼで補正したホタルルシフェラーゼの発光量を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＴＧＦ－βによって上昇するホタルルシフェラーゼの発光量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤタンパク質複合体の転写活性が抑制されることが示された。
〔実施例６：　肝星細胞におけるＮＥＫ６のノックダウンによる線維症関連遺伝子の転写量に対する影響〕
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、ＮＥＫ６　アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
　ヒト肝星細胞株ＬＩ－９０細胞に、ヒトＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ－ＸＡＸ、ＸＢＸ及びＸＣＸ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、終濃度３０ｎＭでトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を１０％　ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ　Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）から０．２％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ　Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）に交換した。トランスフェクション７２時間後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を終濃度２ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ－β添加２４時間後、ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。
　得られたＲＮＡをＨｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによる遺伝子の転写量に対する影響を検出した。Ｃｏｌ１ａ１遺伝子とＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の転写量は、Ｃｏｌ１ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００１６４００４＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、又はＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ０１５４９９７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ　Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。１８ｓ　Ｐｒｏｂｅは下記のカスタム合成１８ｓ　ＭＧＢ　Ｐｒｏｂｅ、カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ１、カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ２を、それぞれ０．２μＭ、０．４μＭ及び０．４μＭとなるように混合し、リアルタイムＰＣＲを行った。
カスタム合成１８ｓ　ＭＧＢ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
５’－ＡＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣ－３’（配列番号５）
カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’－ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ－３’（配列番号６）
カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’－ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ－３’（配列番号７）
　図８にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量、図９にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の転写量を示す。ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、ＴＧＦ－βによって上昇するＣｏｌ１ａ１遺伝子、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の転写量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。
〔実施例７：　肺線維芽細胞におけるＮＥＫ６のノックダウンによる線維症関連遺伝子の転写量に対する影響〕
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことをさらに検討するため、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
　ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞にヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％ＦＣＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地から０．１％ＢＳＡ含有Ｆ－１２Ｋ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質を終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。トランスフェクション７２時間後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＨｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによる遺伝子の転写量に対する影響を検出した。Ｃｏｌ１ａ１遺伝子とαＳＭＡ遺伝子の転写量は、Ｃｏｌ１ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００１６４００４＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、又はαＳＭＡ　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００４２６８３５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ　Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。
　図１０ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１の転写量、図１０ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＴＧＦ－βによって上昇するＣｏｌ１ａ１、αＳＭＡ、遺伝子の転写量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維症を抑制することが示された。
〔実施例８：　腎臓線維芽細胞におけるＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化に対する影響〕
　ＮＥＫ６タンパク質がＴＧＦ－βシグナルを制御する可能性を検討するため、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
　ラット腎線維芽細胞株ＮＲＫ－４９Ｆ細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｓＰＮ分子（ＫＢ－００４：５’－ＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＵＣＣＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣ－３’（配列番号１６）、下線は発現抑制配列を示す）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地から０．１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。添加後３０分或いは１時間後、細胞を２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，６Ｍ　Ｕｒｅａ，１２％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解し細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液にβ－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体（ａｂｃａｍ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。
　図１１にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ－βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。
〔実施例９：　四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘発肝線維化モデルにおけるＮＥＫ６のノックダウンの有効性評価〕
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを確認するため、ＣＣｌ４モデルマウスに、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを静脈内投与して抗線維化作用を解析した。
　７週齢雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、１０ｖ／ｖ％ＣＣｌ４含有オリーブ油溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）を、１０　ｍＬ／ｋｇ体重で０，４，７，１１日目に腹腔内投与し、肝線維化モデルマウスを作製した。ＣＣｌ４の初回投与前日の体重で群わけを実施し、群設定は、ＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群（ｎ＝５）、ＣＣｌ４投与の溶媒投与群（ｎ＝１０）、ＣＣｌ４投与の核酸投与群（ｎ＝１０）とした。ＮＥＫ６　ｓｓＰＮ分子としてＫＢ－００４を、投与溶媒としてｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３．０　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３．０の製品プロトコールに従い、０．３ｍｇ／ｍＬの核酸投与液を作製した。核酸投与群にはＫＢ－００４を含む核酸投与液を３ｍｇ／ｋｇ体重となるように尾静脈投与し、溶媒投与群には核酸投与群と等量の投与溶媒を、ＣＣｌ４の初回投与前日および病態誘発１０日目に尾静脈投与した。肝障害および線維化の評価は病態誘発１３日目で実施した（実施例１０、１１、１２及び１４）。
〔実施例１０：　ＣＣｌ４モデルでの肝障害マーカーの解析〕
　線維化とは、細胞や組織の障害に対する過剰な創傷治癒過程だと理解されている。そのため、線維化と共に細胞や組織の障害を抑制することは、各種線維症の治療に有効であると考えられている。そこで、ＮＥＫ６のノックダウンが肝障害に対して効果を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおける肝障害マーカーの測定を行った。
　病態誘発１３日目に尾静脈よりプレーンのキャピラリー採血管を用いて採血し、３０分以上静置した。静置後の血液を遠心分離し、血清を得た。トランスアミナーゼＣＩＩ－テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて血清中グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）及びグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）を測定した。測定方法は試薬の説明書に従った。
　図１２ａに血清中ＧＰＴの測定結果、図１２ｂに血清中ＧＯＴの測定結果を示した。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを投与することで、ＣＣｌ４モデルで認められた血清中ＧＰＴ及びＧＯＴの上昇が抑制された。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは肝障害を抑制することが示された。
〔実施例１１：　ＣＣｌ４モデルでのＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化の解析〕
　ＮＥＫ６のノックダウンがＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化に対して効果を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおけるリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
　病態誘発１３日目に採取した肝臓を凍結後に粉砕し粉状にした。粉末状の肝臓へ溶解バッファー（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％　ＮＰ４０，０．１％　ＳＤＳ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１ｍＭ　Ｂｅｎｚｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，２％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）を加え、ハンディ超音波発生機を用いて臓器抽出液を調製した。臓器抽出液を遠心分離して得られた上清へβ－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した。その後、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（ａｂｃａｍ社）及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体（ａｂｃａｍ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。リン酸化ＳＭＡＤ３はトータルＳＭＡＤ３量により補正した。
　図１３にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ－βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンはＣＣｌ４モデルの肝臓においてＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化を抑制することが示された。
〔実施例１２：　ＣＣｌ４モデルでの線維症関連遺伝子の解析〕
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維化に対して有効性を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおける線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
　病態誘発１３日目に採取した肝臓からＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡを抽出した。続いて、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔを用いてＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。ＴａｑＭａｎ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙを用いてＮＥＫ６　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００４８０７３０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び線維症関連遺伝子としてＣｏｌ１ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｏｌ３ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１２５４４７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｉｍｐ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１３４１３６１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量を測定し、内部標準である１８ｓ　ｒＲＮＡ　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量との相対比を各遺伝子の転写量とした。　
　ＣＣｌ４モデルにおける各遺伝子の転写量を図１４ａ～ｄに示す。ＮＥＫ６　ｓｓＰＮ分子の投与によって、ＮＥＫ６遺伝子の転写量が低下した。このことから、用いられたＫＢ－００４は、効率的に標的遺伝子の転写を抑制したことが示された。この時、病態誘発によって誘導される線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｔｉｍｐ１）の転写量は有意に低下した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。
〔実施例１３：　胆管結紮誘発肝線維化（ＢＤＬ）モデルでの線維症関連遺伝子の解析〕
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、胆管結紮誘発肝線維化モデルマウス（ＢＤＬモデル）にＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを静脈内投与して線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
　９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を体重で群分けし、遺伝子導入試薬ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎ　３．０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の添付文書に従って調製したＫＢ－００４溶液（０．３ｍｇ／ｍＬ）を３ｍｇ／ｋｇ体重の用量で尾静脈内投与した（ｎ＝１２）。対照群には、溶媒のみを投与した（ｎ＝１５）。投与翌日、総胆管を２箇所結紮し、肝線維化モデルマウスを作製した。偽手術群は、生理食塩水（大塚生食注）を尾静脈内投与し、総胆管の剥離のみ行った（ｎ＝７）。胆管結紮１４日目に肝臓を採取し、上記と同様にしてＮＥＫ６　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００４８０７３０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び線維症関連遺伝子としてＣｏｌ１ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｏｌ３ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１２５４４７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｉｍｐ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１３４１３６１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量を測定し、内部標準であるＧＡＰＤＨ　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ９９９９９９５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量との相対比を各遺伝子の転写量とした。
　ＢＤＬモデルにおける各遺伝子転写量を図１５にａ～ｄに示す。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡの投与によって、ＮＥＫ６遺伝子の転写量が低下した。このことから、用いられたＫＢ－００４は、効率的に標的遺伝子の転写を抑制したことが示された。この時、病態誘発によって誘導される線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｔｉｍｐ１）の転写量は有意に低下した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。
〔実施例１４：　ＣＣｌ４モデルでの病理解析〕
　ＮＥＫ６のノックダウンがＣＣｌ４誘発肝線維化モデルに対して効果を示すかを検討するため、病理像の観察を行った。
　病態誘発１３日目に肝臓の内側右葉を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液を用いて固定した。パラフィンで包埋した後に、組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。
　図１６に病理像の代表例を示した。図１６ａはＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群の結果、図１６ｂはＣＣｌ４投与の溶媒投与群の結果、図１６ｃはＣＣｌ４投与の核酸投与群の結果を表す。図１６ｂ中に多く認められる空胞変性は細胞の障害を示し、中央部付近に多く存在する核が染色していない部分は細胞の壊死を示す。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを投与することで、ＣＣｌ４モデルの肝臓組織で認められた細胞の障害や壊死が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンはＣＣｌ４誘発肝線維化モデルにおける病理像の変化を抑制することが示された。
参考例１：　一本鎖核酸分子の合成
　以下に示す核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ３９００　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により合成した。固相担体としてＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ）を用い、ＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いた固相合成を行った。固相担体からの切り出し及びリン酸基保護基の脱保護、塩基保護基の脱保護、２’－水酸基保護基の脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。
　本発明の下記一本鎖核酸分子において、Ｌｘは、リンカー領域Ｌｘであり、下記構造式のＬ－プロリンジアミドアミダイトを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　また、下記一本鎖核酸分子中の下線部は、ＮＥＫ６の遺伝子発現抑制配列である。
ＫＢ－００１
５’－ＧＡＧＧＧＡＧＵＵＣＣＡＡＣＡＡＣＣＵＣＵＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＡＧＡＧＧＵＵＧＵＵＧＧＡＡＣＵＣＣＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１３）
ＫＢ－００２
５’－ＣＧＡＧＧＣＡＧＧＡＣＵＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＣＣＵＵＧＡＣＡＣＡＧＵＣＣＵＧＣＣＵＣＧＣＣ－３’（配列番号１４）
ＫＢ－００３
５’－ＣＧＵＧＧＡＧＣＡＣＡＵＧＣＡＵＵＣＡＣＧＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＣＧＵＧＡＡＵＧＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＡＣＧＧＣ－３’（配列番号１５）
ＫＢ－００４
５’－ＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＵＣＣＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣ－３’（配列番号１６）
ＫＢ－００５
５’－ＣＡＧＡＧＡＣＣＵＧＡＣＡＵＣＧＧＡＵＡＣＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＧＵＡＵＣＣＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＣＵＣＵＧＧＵ－３’（配列番号１７）

Claims (5)

  1. 　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤。
  2. 　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含む線維症治療剤。
  3. 　線維症が肺線維症、肝線維症又は腎線維症である、請求項２の治療剤。
  4. 　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸が、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列及び配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１記載の阻害剤。
  5. 　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸が、配列番号１の配列、配列番号２の配列及び配列番号３の配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１記載の阻害剤。
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