JPWO2020152869A1 - 線維症治療剤 - Google Patents

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Abstract

ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を開示する。

Description

本発明は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸及び当該核酸を有効成分とする医薬に関する。
線維症は、過剰なコラーゲンの蓄積により臓器機能が障害を受け、不可逆的に進行する疾患であり、例えば、その発症臓器としては皮膚、肺、肝臓、膵臓、腎臓、骨髄などが知られている。肺の線維症の一種である特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、人口１０万人当たり２０人程度の患者数と罹患率は高くはないものの、診断確定後の平均生存期間が２．５〜５年と治療後の経過はよくないため、日本において難病指定されている。
ＩＰＦ治療薬としては、これまでにピルフェニドン、ニンテダニブが日本国厚生労働省より承認を受け上市されている。いずれの薬剤も肺活量低下抑制と無増悪期間延長作用を示し、病態の進行を遅延させるものの、治療効果としては十分満足できるものとはいえず、新たなメカニズムに基づく治療薬の開発が望まれている。
一方、本発明の標的である「ＮＥＫ６タンパク質」は、細胞分裂の制御に関わるＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙの１つとして知られるが、医薬品開発の研究対象としてはこれまであまり着目されていない。２００２年に癌の創薬標的としての可能性が報告されるが、ＮＥＫ６タンパク質がＳＭＡＤ２／３タンパク質と相互作用すること、組織の線維化を促進することについて具体的な報告はない。
米国特許出願公開第２００４／００９７４４１号明細書
本発明は、新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、ブレオマイシン誘発肺線維症モデルを用いた解析から、ＮＥＫ６（ＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ６）のｍＲＮＡレベルの亢進が見られることに着目し研究を進めた結果、ＮＥＫ６がＴＧＦ−β下流で線維化に寄与するＳＭＡＤ系シグナルを制御することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤；
〔２〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含む線維症治療剤；
〔３〕 線維症が肺線維症、肝線維症又は腎線維症である、〔２〕の治療剤；
〔４〕 配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列及び配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含む、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸；
〔５〕 配列番号１の配列、配列番号２の配列及び配列番号３の配列からなる群より選択される配列を含む、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸；
〔６〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を対象に投与することを含む、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を阻害する方法；
〔７〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を対象に投与することを含む、線維症を治療する方法；
〔８〕 ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化の阻害に使用するＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸；
〔９〕 線維症治療に使用するＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸；
〔１０〕 ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の使用；
〔１１〕 線維症治療剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の使用；
〔１２〕ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、ＫＢ−ＸＡＸ、ＫＢ−ＸＢＸ又はＫＢ−ＸＣＸの配列を含む核酸である、〔１１〕の使用；
〔１３〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤であって、上記核酸はＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とするものである、阻害剤；
〔１４〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む線維症治療剤であって、上記核酸はＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とするものである、治療剤；
〔１５〕 線維症が肺線維症、肝線維症又は腎線維症である、〔１４〕の治療剤；
〔１６〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列及び配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含む核酸である、［１３］の阻害剤；
〔１７〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、配列番号１の配列、配列番号２の配列及び配列番号３の配列からなる群より選択される配列を含む核酸である、［１３］の阻害剤；
〔１８〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸を対象に投与することを含む、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を阻害する方法；
〔１９〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸を対象に投与することを含む、線維症を治療する方法；
〔２０〕 ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化の阻害に使用する、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸；
〔２１〕 線維症治療に使用する、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸；
〔２２〕 ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の使用であって、上記核酸はＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とするものである使用；
〔２３〕 線維症治療剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の使用であって、上記核酸はＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とするものである使用；
〔２４〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、ＫＢ−ＸＡＸ、ＫＢ−ＸＢＸ又はＫＢ−ＸＣＸの配列を含む核酸である、〔２３〕の使用；
［２５］ ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１０〜４０塩基である、［１］の阻害剤；
〔２６〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１２〜２１塩基である、［１］の阻害剤；
［２７］ ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の配列の両端に人工核酸が導入されている、［１］の阻害剤；
［２８］ ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１２〜２１塩基であり、配列の両端に人工核酸が導入されている、［１］の阻害剤；
［２９］ ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１０〜４０塩基である、［２］の治療剤；
〔３０〕 ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１２〜２１塩基である、［２］の治療剤；
［３１］ ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の配列の両端に人工核酸が導入されている、［２］の治療剤；
［３２］ ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸に含まれる塩基数が、１２〜２１塩基であり、配列の両端に人工核酸が導入されている、［２］の治療剤；
［３３］ アンチセンス核酸が、リポソーム、グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リピドマイクロスフェア、高分子ミセル、ゲル剤又はエキソソームのドラッグデリバリーキャリアに封入されて投与される、［３２］の治療剤。
本発明により新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤の提供が可能となる。
ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの配列及び実施例１で作製した各アンチセンス核酸の標的部位を示す図である。斜線部は非翻訳領域を示す。（なお、ｍＲＮＡ配列上のＵ（ウラシル）はＴ（チミン）として表記している） 図２は、各アンチセンス核酸を導入した場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を示すグラフである。 図３は、各アンチセンス核酸によりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。 図４は、各アンチセンス核酸によりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を定量化し、リン酸化ＳＭＡＤ３量をトータルＳＭＡＤ３量により補正した結果を示す。 図５ａは、抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降の結果を表す。図５ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降の結果を表す。 図６は、Ｈｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質を反応させた場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。 図７ａは、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるウェスタンブロットの結果を表す。図７ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるホタルルシフェラーゼの発光量を表す。 図８は、肝星細胞において、各アンチセンス核酸によりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。 図９は、肝星細胞において、各アンチセンス核酸によりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の転写量を表す。 図１０ａは、肺線維芽細胞において、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１０ｂは、肺線維芽細胞において、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を表す。 図１１は、腎臓線維芽細胞において、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を表す。 図１２ａは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合の血清中ＧＰＴの測定結果を表す。図１２ｂは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合の血清中ＧＯＴの測定結果を表す。 図１３は、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を表す。 図１４ａは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を表す。図１４ｂは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１４ｃは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ３ａ１遺伝子の転写量を表す。図１４ｄは、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＴｉｍｐ１遺伝子の転写量を表す。 図１５ａは、ＢＤＬモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を表す。図１５ｂは、ＢＤＬモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１５ｃは、ＢＤＬモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ３ａ１遺伝子の転写量を表す。図１５ｄは、ＢＤＬモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合のＴｉｍｐ１遺伝子の転写量を表す。 図１６は、ＣＣｌ４モデルにおいて、ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合の肝臓の病理解析の結果を表す。図１６ａはＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群の結果を表す。図１６ｂはＣＣｌ４投与の溶媒投与群の結果を表す。図１６ｃはＣＣｌ４投与の核酸投与群の結果を表す。
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いるものである。また、本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。本発明において、塩基数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する。
本発明は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤及び当該核酸を有効成分として含む線維症治療剤、並びに、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸であって、ＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域上の配列を標的とする核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤及び当該核酸を有効成分として含む線維症治療剤を提供するものである。以下、本発明の内容について詳細に説明する。
（１）ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸
ＮＥＫ６タンパク質は、細胞分裂の制御に関わる１１個のＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙの１つであり、細胞周期のＭ期においてリン酸化（活性化）される。
本発明の標的であるＮＥＫ６遺伝子は、哺乳類由来の遺伝子であり、好ましくはヒト由来の遺伝子である。ヒト由来のＮＥＫ６遺伝子は、７種のバリアントが報告されているが、その中のアイソフォーム２のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＮＭ＿０１４３９７）を図１に表す（配列番号４）。
核酸分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制メカニズムは、特に制限されるものではなく、発現をダウンレギュレーションできるものであればよい。ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制は、ＮＥＫ６遺伝子からの転写産物の生成量の減少、ＮＥＫ６遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、又は上記翻訳産物の活性の減少等によって確認することができる。
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸としては、ＮＥＫ６ ｍＲＮＡのアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＰＮ分子、ｓｓＮｃ分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイムなどがあげられる。上記核酸は、一本鎖核酸であってもよく、二本鎖核酸であってもよい。
アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＰＮ分子、ｓｓＮｃ分子、リボザイムは、当業者であれば、上記のヒトＮＥＫ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて容易に取得することができる。ＮＥＫ６ アイソフォーム２のｍＲＮＡ配列（配列番号４）に基づいて作製した核酸が好ましい。例えば、ＮＥＫ６ アイソフォーム２のｍＲＮＡ配列の３’非翻訳領域に基づいて上記核酸を作製することができる。
（２）アンチセンス核酸
アンチセンス核酸は、標的とするｍＲＮＡと配列特異的に二重鎖を形成し、そのスプライシング阻害及び翻訳阻害等の機能阻害を行うオリゴヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ及び／又はアンチセンスＲＮＡ）であり、標的とするｍＲＮＡの全長もしくは一部に対するアンチセンス核酸を細胞内に導入することで効果を発揮する。
アンチセンス核酸の発現阻害のメカニズムとしては、
１）ｍＲＮＡの５’キャップ部位から開始コドンの約２５塩基下流までの領域を標的配列とする翻訳開始複合体の立体的阻害
２）標的ｍＲＮＡと相補的な一本鎖ＤＮＡであり、ＲＮａｓｅＨを介したｍＲＮＡ分解
３）ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエキソンとイントロンの境界領域を標的配列とするスプライシング阻害（ｍＲＮＡの成熟阻害）
があげられる。ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するものであれば、そのメカニズムは特に制限されるものではない。
本実施形態に係るアンチセンス核酸に含まれる配列としては、ＮＥＫ６遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。例えば、ＮＥＫ６遺伝子に相補的であって、且つ、ＮＥＫ７遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ ｄａｔａｂａｓｅ：ＮＭ＿１３３４９４．２）に相補的でない、あるいは、領域中１以上（例えば1〜３）の塩基がＮＥＫ７遺伝子に非相補的（ミスマッチ）である配列を選択することがあげられる。ＮＥＫ６遺伝子に対しては相補的であり、ＮＥＫ７遺伝子に対しては非相補的（ミスマッチ）な塩基を増加させる（例えば、４以上、好ましくは５〜７）ことは、オフターゲット効果を回避する上で有用である。
本実施形態に係るアンチセンス核酸に含まれる塩基数は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する効果を発揮する限り特に制限されないが、例えば、１０〜４０塩基、１０〜３５塩基、１２〜３０塩基、又は１２〜２１塩基であってよい。
ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するアンチセンス核酸は、ＮＥＫ６の成熟ｍＲＮＡのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＬＮＡ（登録商標）ＧａｐｍｅＲ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ等のアンチセンス核酸配列設計システムに従って得ることができる。
アンチセンス核酸は、ＲＮＡとの結合安定性（Ｔｍ値など）、ミスマッチ配列認識能、ヌクレアーゼ耐性、ＲＮａｓｅＨ活性等の点から修飾ヌクレオチド残基を含むことが好ましい。
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸の具体例として、以下の一本鎖核酸分子をあげることができる。
〔１〕配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸。
〔２〕配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸。
〔３〕配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、を含む、核酸。
アンチセンス核酸に含まれる配列の配列番号１〜３の配列との配列同一性は、９０％以上、９２％以上、９５％以上又は９８％以上であってもよく、１００％であってもよい。〔１〕〜〔３〕のアンチセンス核酸は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する作用を失わない範囲で各種修飾が付加されていてもよい。各種修飾は、配列番号１〜３の配列中に存在していてもよく、配列外に存在していてもよい。修飾ヌクレオチド等の詳細については後述する。
ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するアンチセンス核酸は、ＮＥＫ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、公知の手法により、容易に取得することができる。例えば、ＮＥＫ６アイソフォーム２のｍＲＮＡの配列（配列番号４）等のＮＥＫ６遺伝子のｍＲＮＡ配列情報に基づいて適宜設計し、従来公知の方法により合成することができる。上記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。上記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。上記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法及びＨ−ホスホネート法等があげられる。上記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。
（３）ｓｉＲＮＡ
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を以下に説明する。
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と対合するガイド鎖（アンチセンス鎖）、ガイド鎖と二本鎖を形成しているパッセンジャー鎖（センス鎖）からなる核酸分子である。ｓｉＲＮＡは、細胞内においてＡｒｇｏｎａｕｔｅ（ＡＧＯ）タンパク質を中核とする ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）と呼ばれる複合体に取り込まれた後、センス鎖はＡＧＯにより分解され、ガイド鎖はＲＩＳＣに残る。ガイド鎖のシード領域（ガイド鎖の５’末端から２−８塩基の７塩基領域）は、標的配列を認識する上で重要な働きを有していると考えられており、オフターゲット効果を回避する目的から標的遺伝子に特異的なシード領域を選択することが好ましいとされている。したがって、本発明の有効成分である核酸のシード領域についてもＮＥＫ６成熟ｍＲＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ ｄａｔａｂａｓｅ：ＮＭ＿０１４３９７）に特異的な配列を選択することが好ましい。例えば、ＮＥＫ６成熟ｍＲＮＡに相補的であって、且つ、ＮＥＫ７成熟ｍＲＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ ｄａｔａｂａｓｅＮＭ＿１３３４９４．２）に相補的でない、あるいは、領域中１以上（例えば1〜３）の塩基がＮＥＫ７成熟ｍＲＮＡに非相補的（ミスマッチ）である配列をシード領域として含む核酸を選択することがあげられる。また、全長配列についても、例えば、ＮＥＫ６成熟ｍＲＮＡに対しては相補的であり、ＮＥＫ７成熟ｍＲＮＡに対しては非相補的（ミスマッチ）な塩基を増加させる（例えば、４以上、好ましくは５〜７）ことは、オフターゲット効果を回避する上で有用である。ガイド鎖に含まれる発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５〜３０塩基であり、好ましくは、１９〜２５塩基であり、より好ましくは１９〜２３塩基であり、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
上記発現抑制配列は、３’側に、さらに付加配列を有することで突出端を形成してもよい。上記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜４塩基である。付加配列は、リボヌクレオチド残基でもデオキシリボヌクレオチド残基でもよい。
ガイド鎖の塩基数は、例えば、１９〜５０塩基であり、好ましくは１９〜３０塩基であり、より好ましくは、１９〜２５塩基であり、さらに好ましくは１９〜２３塩基であり、ことさら好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
パッセンジャー鎖の塩基数は、例えば、１９〜５０塩基であり、好ましくは１９〜３０塩基であり、より好ましくは、１９〜２５塩基であり、さらに好ましくは１９〜２３塩基であり、ことさら好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２１塩基である。
パッセンジャー鎖で、ガイド鎖と相補性を示す領域は、例えば、１９〜５０塩基であり、好ましくは１９〜３０塩基であり、より好ましくは、１９〜２５塩基であり、さらに好ましくは１９〜２３塩基である。上記領域は、３’側に、さらに付加配列を有してもよい。上記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜４塩基であり、付加配列は、リボヌクレオチド残基でもデオキシリボヌクレオチド残基でもよい。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖の相補性を示す領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。上記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ６成熟ｍＲＮＡのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、ｓｉＳＮＩＰＥＲ（登録商標）、創薬・診断研究用ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）等のｓｉＲＮＡ配列設計システムに従って得ることができる。
ＮＥＫ６ ｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ６に特異的に作用するｓｉＲＮＡが好ましく、例えば以下のような二本鎖核酸をあげることができる。
（ａ）配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むガイド鎖（アンチセンス鎖）と、パッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
（ｂ）配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むガイド鎖（アンチセンス鎖）と、パッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
（ｃ）配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むガイド鎖（アンチセンス鎖）と、パッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
上記二本鎖核酸分子に含まれるガイド鎖（アンチセンス鎖）に含まれる配列の配列番号１〜３の配列との配列同一性は、９０％以上、９２％以上、９５％以上又は９８％以上であってもよく、１００％であってもよい。
また、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端とガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結され、あるいは、ガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端とパッセンジャー鎖（センス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結されたヘアピン型ＲＮＡ構造を形成している一本鎖核酸分子であってもよい。
（４）ｓｓＰＮ分子
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つとなるｓｓＰＮ分子について説明する。ｓｓＰＮ分子は、ＷＯ２０１２／０１７９１９に開示される生物学的安定性に優れた一本鎖ＲＮＡ核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
本発明の有効成分となるｓｓＰＮ分子は、ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）を含み、上記領域（Ｘ）と上記領域（Ｘｃ）との間に、上記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、上記領域（Ｘ）及び上記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、上記発現抑制配列を含み、上記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする。ｓｓＰＮ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
ｓｓＰＮ分子において、ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子が、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。ＮＥＫ６ ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡ配列は、ＮＥＫ６遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、既存のｓｉＲＮＡ設計システムに従って得ることができ、ｓｓＰＮ分子においても、上記ｓｉＲＮＡの発現抑制配列を、ｓｓＰＮ分子の発現抑制配列として使用することができる。
上記発現抑制配列は、例えば、ＮＥＫ６遺伝子の標的領域に対して、８０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、ことさらに好ましくは９８％以上であり、特に好ましくは１００％である。
特に、ｓｉＲＮＡのシード領域に該当する部分については、ｓｉＲＮＡの場合と同様にＮＥＫ６遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。
ｓｓＰＮ分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制は、例えば、ＲＮＡ干渉が生じることによると推測されるが、このメカニズムにより限定されるものではない。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、上記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。
ｓｓＰＮ分子において、上記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、上記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、上記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、上記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造と、上記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造との両方を有してもよい。
（５）ｓｓＮｃ分子
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｓｓＮｃ分子を説明する。
ｓｓＮｃ分子は、ＷＯ２０１２／０５３６８に開示される一本鎖ＲＮＡ核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
ｓｓＮｃ分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）及び３’側領域（Ｙｃ）を、上記順序で含み、
上記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）及び内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
上記５’側領域（Ｘｃ）が、上記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
上記３’側領域（Ｙｃ）が、上記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
上記内部領域（Ｚ）、上記５’側領域（Ｘｃ）及び上記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、発現抑制配列を含むことを特徴とする。
ｓｓＮｃ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、上記内部領域（Ｚ）において、上記内部５’領域（Ｘ）と上記内部３’領域（Ｙ）が、直接的に連結されている。
ｓｓＮｃ分子において、上記５’側領域（Ｘｃ）は、上記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、上記３’側領域（Ｙｃ）は、上記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である。このため、５’側において、上記領域（Ｘｃ）が上記領域（Ｘ）に向かって折り返し、上記領域（Ｘｃ）と上記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能であり、また、３’側において、上記領域（Ｙｃ）が上記領域（Ｙ）に向かって折り返し、上記領域（Ｙｃ）と上記領域（Ｙ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
ｓｓＮｃ分子は、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
ｓｓＮｃ分子における上記発現抑制配列は、ｓｓＰＮ分子の説明を援用することができる。
ｓｓＮｃ分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制は、例えば、上記内部領域（Ｚ）、上記５’側領域（Ｘｃ）及び上記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに上記発現抑制配列を配置した構造をとることで、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡ干渉に類似する現象（ＲＮＡ干渉様の現象）が生じることによると推測される。なお、ｓｓＮｃ分子のメカニズムもｓｓＰＮ分子のメカニズム同様限定されるものではない。ｓｓＮｃ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、上記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、ｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
（６）ｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子の合成方法
ｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。上記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。上記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。上記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法及びＨ−ホスホネート法等があげられる。上記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。上記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。上記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。また、本発明のｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子は、ＷＯ２０１２／０５３６８、ＷＯ２０１２／１７９１９、ＷＯ２０１３／２７８４３、ＷＯ２０１６／１５９３７４に記載の製造方法に従って製造することができる。
（７）ｍｉＲＮＡ
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｍｉＲＮＡについて以下に説明する。
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の阻害又はｍＲＮＡの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、細胞内に存在する短鎖（２０−２５塩基）のノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、まず、ＤＮＡから、ｍｉＲＮＡとその相補鎖とを含みヘアピンループ構造を取ることが可能な一本鎖のｐｒｉ−ＲＮＡとして転写される。次にｐｒｉ−ＲＮＡは、核内にあるＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって一部が切断されｐｒｅ−ＲＮＡとなって核外に輸送される。その後、ｐｒｅ−ＲＮＡはさらにＤｉｃｅｒによって切断されることにより、ｍｉＲＮＡとして機能する。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域へ不完全なハイブリダイゼーション結合を行い、そのｍＲＮＡがコードするタンパク質合成を阻害する。
ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の遺伝子名又はｍＲＮＡ配列情報に基づいて、例えば、ｍｉＲＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｄｂ．ｏｒｇ／ｍｉＲＤＢ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）等のデータベースに従って得ることができる。
（８）核酸に使用されるヌクレオチド残基
本実施形態において、有効成分である核酸に使用されるヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。上記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。上記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を有し、上記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）を有する。
上記ヌクレオチド残基は、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基等があげられる。上記非修飾ヌクレオチド残基は、上記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一又は実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一又は実質的に同一である。
上記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、上記非修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。上記修飾ヌクレオチドは、例えば、上記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、上記構成要素の置換、付加及び／又は欠失、上記構成要素における原子及び／又は官能基の置換、付加及び／又は欠失であり、「改変」ということができる。上記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。上記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、上記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、上記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。
上記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。上記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。上記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素又はフルオロ等に置換できる。上記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。また、２’位水酸基にメチル基又はメトキシエチル基等を導入することによっても修飾でき、例えば、２’−Ｆ、２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ（２’−ＯＭｅ）及び２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（２’−ＭＯＥ）等があげられる。上記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
上記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基及び／又は非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。上記非リボリン酸骨格は、例えば、上記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。上記非リボリン酸骨格に置換された、上記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。上記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、架橋型人工核酸である２’，４’−ＢＮＡ[Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）]、ＡｍＮＡ、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）、ＧｕＮＡ及びｓｃｐＢＮＡ等があげられる。本実施形態に係る核酸が、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解のメカニズムを利用したアンチセンス核酸である場合には、人工核酸が導入されたアンチセンス核酸であることが好ましく、さらに好ましくは配列の両端に人工核酸が導入された核酸であり、特に好ましくは配列の両端のみに人工核酸が導入されたアンチセンス核酸である。配列の両端のみに人工核酸が導入されたアンチセンス核酸とすることで、人工核酸の特性を維持しつつもＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解が起こり、高いアンチセンス効果を期待できるためである。
一方、本実施形態に係る核酸が、エキソンスキッピング誘導のメカニズムを利用したアンチセンス核酸である場合には、標的ＲＮＡを切断しないようにするため、ミックスマーや全修飾型オリゴヌクレオチドのようにＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解が起こらない設計とすることが好ましい。
上記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。上記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。上記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。上記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、上記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。上記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、又は、上記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
上記リン酸基は、例えば、上記非結合酸素を置換してもよい。上記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）及びＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基又はアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。上記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。上記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステル等があげられ、中でも、上記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
上記リン酸基は、例えば、上記結合酸素を置換してもよい。上記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）及びＮ（窒素）のいずれかの原子、又はボラン（ＢＨ３）で置換できる。上記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、及びＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。上記酸素原子をＳ（硫黄）原子に置換したホスホロチオエート修飾（Ｓ化）は核酸と核酸をつなぐリン酸ジエステル結合部の修飾であり、配列中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に改変される。これにより、ヌクレアーゼ耐性の向上が期待できるため、好ましい。上記結合酸素の置換は、例えば、本実施形態に係る核酸の５’末端ヌクレオチド残基及び３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行ってもよく、両方において行ってもよい。また、例えば、本実施形態に係る核酸におけるすべてのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に改変されてもよい。
上記リン酸基は、例えば、上記リン非含有のリンカーに置換してもよい。上記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基及びメチレンメチルイミノ基を含む。
上記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。上記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。上記保護基としては、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。
上記他の分子は、例えば、上記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、上記リン酸基又は上記糖残基に付加してもよい。上記スペーサーの末端原子は、例えば、上記リン酸基の上記結合酸素、又は、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加又は置換できる。上記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、又はこれらに結合する原子が好ましい。上記スペーサーは、例えば、上記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加又は置換することもできる。
上記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、及びモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬及びフルオレセイン試薬等を含んでもよい。上記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３又は６が好ましい。
上記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
核酸分子は、上記５’末端が、例えば、リン酸基又はリン酸基アナログで修飾されてもよい。上記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化又は非メチル化、７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸及び三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
上記ヌクレオチド残基において、上記塩基は、特に制限されない。上記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。上記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。上記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
上記塩基は、例えば、アデニン及びグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基等があげられる。上記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。上記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシル及び５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシン及び６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化及び他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリン及びピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、及びイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
（９）その他の用語の定義
本実施形態において、有効成分である核酸、リンカー等の説明にて使用される用語は、当該技術分野での通常用いられるものであり、例えば、以下のように示すことができる。
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状又は分枝状のアルキル基を含む。上記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６又は１〜４である。上記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基及び多環芳香族炭化水素基を含む。上記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。上記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチル及び２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
（１０）ＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤
ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害とは、ＴＧＦ−β刺激により促進されるＳＭＡＤ２及び／又はＳＭＡＤ３のリン酸化が阻害（制御）されることを意味する。
ＳＭＡＤ２／３は、ＴＧＦ−βＩ型レセプターによってリン酸化を受けるＲ−ＳＭＡＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＳＭＡＤ）の１種であり、ＴＧＦ−βによる刺激後、リン酸化（活性化）されたＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３は、Ｃｏ−ＳＭＡＤ（ｃｏｍｍｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ ＳＭＡＤ）であるＳＭＡＤ４とともに核内へ移行する。実施例４に示すように、本発明者らは、ＮＥＫ６タンパク質が、細胞内でＳＭＡＤ２／３タンパク質と相互作用し、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を促進することを見出した。リン酸化されたＳＭＡＤ２／３タンパク質はＳＭＡＤタンパク質複合体形成し、核内に移行し、α―ＳＭＡ、α２−コラーゲン、インターフェロンβ、インターロイキン−５、ＶＥＧＦ等の転写を亢進する。
したがって、本実施形態に係るＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤によってＳＭＡＤシグナル系を阻害することで、α−ＳＭＡ、α２−コラーゲン、インターフェロンβ等の転写制御が可能となり、ひいては創傷治癒過程における、線維芽細胞、肝星細胞等の筋線維芽細胞への分化抑制、線維芽細胞等によるマトリックス合成の制御、炎症・免疫反応の調節等に有用であることが理解できる。
（１１）線維症治療剤
本実施形態に係る線維症治療剤は、肝線維症、肝硬変、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アルコール性肝疾患、原発性硬化性胆菅炎、ヘモクロマトーシス、ウイルソン病、α１−アンチトリプシン欠損症、非ウイルス性鬱血性肝硬変、薬剤性肝障害、膵炎、膵線維症、網膜線維症、声帯瘢痕化、声帯粘膜線維症、喉頭線維症、肺線維症、間質性肺炎、特発性肺線維症、非特異性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺炎、急性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、サルコイドーシス、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、リンパ脈管筋腫症、肺胞蛋白症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、肺ランゲルハンス細胞組織球症、鉄肺症、アミロイドーシス、肺胞微石症、過敏性肺炎、じん肺、感染性肺疾患、薬剤性肺炎、放射線肺炎、嚢胞性線維症、骨髄線維症、腎線維症、慢性腎不全、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、悪性腎硬化症、多発性嚢胞腎、薬剤性腎障害、後腹膜線維症、膠原病、強皮症、先天性角化不全症、腎性全身性線維症の他、気道の線維化、腸管の線維化、膀胱の線維化、前立腺の線維化、皮膚の線維化を含む広く線維化に関する疾患に対する治療剤である。好ましくは、肝線維症、肝硬変、肺線維症、間質性肺炎、腎線維症又は慢性腎不全であり、より好ましくは、肺線維症、肝線維症又は腎線維症である。
本実施形態に係る線維症治療剤の投与方法は、特に制限されるものではないが、吸入、静脈内投与（静注）、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、髄腔内投与及び経皮投与等の非経口投与であることが好ましい。本実施形態に係る線維症治療剤は、当該線維症治療剤を必要とする対象、例えば、上述した線維化に関する疾患を発症している対象及びその発症リスクが高いと判断される対象に投与されることが好ましい。対象は、ヒトであってもよく、非ヒト動物であってもよい。本実施形態に係る治療方法における本実施形態に係る核酸分子の投与量は、上記疾患の治療上有効な量であれば特に制限されず、疾患の種類、重症度、齢、体重、投与経路等によって異なるが、通常、成人１回あたり約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．００５〜約５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。当該量を、例えば、１日３回〜１ヶ月に１回、好ましくは１日〜１週間に１回の間隔で投与することができる。
本実施形態に係る線維症治療剤は、通常、薬学的に許容される担体とともに適当な医薬組成物として製剤化されて経口又は非経口の形で投与される。
本実施形態に係るアンチセンス核酸は、リポソーム、グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リピドマイクロスフェア、高分子ミセル、ゲル剤又はエキソソームのドラッグデリバリーキャリアに封入され、投与されることが好ましい。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本実施例において「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、「アンチセンス核酸」、「ＡＳＯ」と同意である。
〔実施例１： アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＮＥＫ６のノックダウン〕
ヒト肝星細胞株ＬＩ−９０細胞に、ヒトＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ−ＸＡＸ、ＫＢ−ＸＢＸ、ＫＢ−ＸＣＸ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、終濃度３０ｎＭでトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）から０．２％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）に交換した。トランスフェクションから９６時間後、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列としては、以下のＫＢ−ＸＡＸ、ＸＢＸ及びＸＣＸを使用した。
ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ−ＸＡＸ）：５’−ＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号１）
ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ−ＸＢＸ）：５’−ＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡＡＴＴ−３’（配列番号２）
ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ−ＸＣＸ）：５’−ＴＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＧＡＡ−３’（配列番号３）
得られたＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡについて、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによるＮＥＫ６遺伝子の転写量に対する影響を調べた。ＮＥＫ６遺伝子の転写量は、ＮＥＫ６ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００２０５２２１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。１８ｓ Ｐｒｏｂｅは下記のカスタム合成１８ｓ ＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ、カスタム合成１８ｓ Ｐｒｉｍｅｒ１及びカスタム合成１８ｓ Ｐｒｉｍｅｒ２を、それぞれ０．２μＭ、０．４μＭ及び０．４μＭとなるように混合し、リアルタイムＰＣＲを行った。
カスタム合成１８ｓ ＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
５’−ＡＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号５）
カスタム合成１８ｓ Ｐｒｉｍｅｒ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’−ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号６）
カスタム合成１８ｓ Ｐｒｉｍｅｒ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’−ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ−３’（配列番号７）
図２にＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドが導入された場合のＮＥＫ６のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入は、ＮＥＫ６遺伝子の転写量を抑制した。したがって、用いられたＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率的に標的遺伝子の発現を抑制したことが示された。
〔実施例２： ＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤ３リン酸化に対する影響〕
ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドがＴＧＦ−βシグナルを制御する可能性を検討するため、各ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
ヒト肝星細胞株ＬＩ−９０細胞に、ヒトＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ−ＸＡＸ，ＸＢＸ、ＸＣＸ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、終濃度３０ｎＭでトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）から０．２％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ−β添加３０分後、細胞を２×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，４％ ＳＤＳ，６Ｍ Ｕｒｅａ，１２％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社），１％ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）］で溶解し、細胞抽出液とした。
得られた細胞抽出液にβ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％及び０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び抗ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗β−Ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）によりウェスタンブロッティングを行った。リン酸化ＳＭＡＤ３量はトータルＳＭＡＤ３量により補正した。
図３にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を、図４にリン酸化ＳＭＡＤ３量をトータルＳＭＡＤ３量により補正した結果を示す。ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ−βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。
〔実施例３： ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質との細胞内における相互作用〕
ＮＥＫ６タンパク質が細胞内でＳＭＡＤ３と相互作用してＳＭＡＤ３をリン酸化しているかを検討するため、共免疫沈降を行った。
ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６がクローニングされた発現ベクター（ｐＥＺ−Ｍ０２ Ｎｅｋ６，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）とＦＬＡＧタグで標識されたヒトＳＭＡＤ３がクローニングされた発現ベクター（ｐＥＺ−Ｍ１１ Ｆｌａｇ−ｈＳｍａｄ３，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）を、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培地を交換した。トランスフェクション４８時間後、溶解バッファー（１７５ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６，０．１％ ＮＰ４０，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０，１．４ｍＭ β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１％ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）で細胞を回収し、遠心分離によって上清を得た。上清にＴｒｕｅＢｌｏｔ Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ ＩｇＩＰ Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）を添加し、遠心分離を行い、非特異的な結合を除去した。そこから得られた上清にコントロールとしてｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、もしくは抗ＮＥＫ６抗体を加え、オーバーナイト４℃にてインキュベートした後に、ＴｒｕｅＢｌｏｔ Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ ＩｇＩＰ Ｂｅａｄｓを加え４時間、４℃にてインキュベートした。遠心分離を行って上清を除いた後に、ＴｒｕｅＢｌｏｔ Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ ＩｇＩＰ Ｂｅａｄｓを溶解バッファーで洗浄して非特異的な結合を除去した。２×ＳＤＳ ＰＡＧＥ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ ｐＨ６．８，４％ ＳＤＳ，２０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ，５０ｍＭ ＤＴＴ）をＴｒｕｅＢｌｏｔ Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ ＩｇＩＰ Ｂｅａｄｓに添加して９５℃で５分間加熱し、上清に含まれる共免疫沈降物を回収した。抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降物に対して抗ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が共沈降されるかを検出した。
図５ａに、抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が検出された。
ＳＭＡＤ３タンパク質がＮＥＫ６と細胞内で相互作用しリン酸化されているかを解析するため、ヒトＮＥＫ６発現ベクターとＦＬＡＧタグで標識されたヒトＳＭＡＤ３発現ベクターをＬＬ２９細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培地を交換した。トランスフェクション４８時間後、溶解バッファー（２５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６，０．１％ ＮＰ４０，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０，１．４ｍＭ β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１％ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）で細胞を回収し、遠心分離によって上清を得た。得られた上清にＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加し、４℃にてオーバーナイトでインキュベートした。その後、遠心分離を行い、上清を除いた。Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを溶解バッファーで洗浄して非特異的な結合を除去した。２×ＳＤＳ ＰＡＧＥ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ ｐＨ６．８，４％ ＳＤＳ，２０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ，５０ｍＭ ＤＴＴ）をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌに添加して９５℃で４分間加熱し、上清に含まれる共免疫沈降物を回収した。得られた共免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさに基づいて分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌによる共免疫沈降物に対しては抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、抗ＮＥＫ６抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＮＥＫ６タンパク質とリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質が共沈降されるかを検出した。
図５ｂに、抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＮＥＫ６タンパク質とＦＬＡＧ−ＳＭＡＤ３タンパク質が検出された。また、ヒトＮＥＫ６の発現ベクターのトランスフェクションによって、リン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質の量が上昇した。
抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降物中にＳＭＡＤ３タンパク質が検出されたこと、及び逆に抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降物中にＮＥＫ６が検出されたことから、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が細胞内で相互作用して複合体を形成することが示された。更に、ヒトＮＥＫ６の発現ベクターのトランスフェクションによってリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質の量が上昇したことから、ＮＥＫ６タンパク質はＳＭＡＤ３タンパク質を細胞内でリン酸化することが示された。
〔実施例４： ＮＥＫ６タンパク質によるＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化〕
ＮＥＫ６タンパク質がＳＭＡＤ３タンパク質を基質として直接リン酸化している可能性を、ＮＥＫ６とＳＭＡＤ３の精製タンパク質を用いて検討した。
Ｈｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質（ｅｕｒｏｆｉｎｓ社）とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を反応溶媒（１５０μＭ ＡＴＰ，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，１％ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）と混合し、３０°Ｃにて４５分間インキュベートした。５％ β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及び０．０２５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅを含む２×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを、反応液に等量添加して反応を停止させた後に、９５℃で５分加熱し、サンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、反応液に含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体によりウェスタンブロッティングを行った。
図６にＨｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質を反応させた場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６タンパク質を用いることで、リン酸化ＳＭＡＤ３の量が上昇した。したがって、ＮＥＫ６タンパク質はＳＭＡＤ３タンパク質を基質として直接リン酸化することが示された。
〔実施例５： ＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤタンパク質複合体の転写活性に対する影響〕
ＮＥＫ６タンパク質が、ＳＭＡＤタンパク質複合体の核内移行後におこる転写活性も制御しているかを検討するため、ＳＭＡＤタンパク質複合体のＤＮＡ結合配列とルシフェラーゼ遺伝子を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。また、同時に調製したＬＬ２９細胞を用いてウェスタンブロッティングを実施し、ＮＥＫ６のノックダウンについて確認した。
ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡである ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション２４時間後、培地を１０％ ＦＣＳ含有Ｆ−１２Ｋ培地から０．４％ ＦＣＳ含有Ｆ−１２Ｋ培地に交換した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション４８時間後、ＳＭＡＤタンパク質複合体のＤＮＡ結合配列［ＳＭＡＤ ｂｉｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＢＥ）］とホタルルシフェラーゼ遺伝子がクローニングされた発現ベクター（ｐＴＬ−ＳＢＥ−ｌｕｃ：５’−ＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号８），Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）と野生型ウミシイタケルシフェラーゼを含むレポーターアッセイ補正用のベクター（ｐＲＬ−ＴＫ：Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ｗｉｔｈ ＰＬＵＳ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクションした。発現ベクターのトランスフェクション２時間後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質を終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。ＴＧＦ−β添加２４時間後において、細胞を２×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，４％ ＳＤＳ，６Ｍ Ｕｒｅａ，１２％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解した。得られた細胞抽出液に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。また、上記と同様に調製したＬＬ２９細胞をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に順じて回収し、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼによる発光を測定した。ホタルルシフェラーゼの発光量をウミシイタケルシフェラーゼによる発光量で補正した。
＜ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ＞
ｓｉＮＥＫ６：５’−ＣＵＧＵＣＣＵＣＧＧＣＣＵＡＵＣＵＵＣ−３’（配列番号９）
ｓｉＮＥＫ６：５’−ＵＡＵＵＵＧＧＧＵＧＧＵＵＣＡＧＵＵＧ−３’（配列番号１０）
ｓｉＮＥＫ６：５’−ＣＡＡＣＵＣＣＡＧＣＡＣＡＡＵＧＵＵＣ−３’（配列番号１１）
ｓｉＮＥＫ６：５’−ＵＡＣＵＵＧＡＵＣＡＵＣＵＧＣＧＡＧＡ−３’（配列番号１２）
図７ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少している事が示されたが、ＳＭＡＤ３タンパク質の量は変化しなかった。図７ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合における、ウミシイタケルシフェラーゼで補正したホタルルシフェラーゼの発光量を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＴＧＦ−βによって上昇するホタルルシフェラーゼの発光量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤタンパク質複合体の転写活性が抑制されることが示された。
〔実施例６： 肝星細胞におけるＮＥＫ６のノックダウンによる線維症関連遺伝子の転写量に対する影響〕
ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、ＮＥＫ６ アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
ヒト肝星細胞株ＬＩ−９０細胞に、ヒトＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＢ−ＸＡＸ、ＸＢＸ及びＸＣＸ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、終濃度３０ｎＭでトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）から０．２％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）に交換した。トランスフェクション７２時間後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を終濃度２ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ−β添加２４時間後、ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。
得られたＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによる遺伝子の転写量に対する影響を検出した。Ｃｏｌ１ａ１遺伝子とＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の転写量は、Ｃｏｌ１ａ１ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００１６４００４＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、又はＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ０１５４９９７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。１８ｓ Ｐｒｏｂｅは下記のカスタム合成１８ｓ ＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ、カスタム合成１８ｓ Ｐｒｉｍｅｒ１、カスタム合成１８ｓ Ｐｒｉｍｅｒ２を、それぞれ０．２μＭ、０．４μＭ及び０．４μＭとなるように混合し、リアルタイムＰＣＲを行った。
カスタム合成１８ｓ ＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
５’−ＡＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号５）
カスタム合成１８ｓ Ｐｒｉｍｅｒ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’−ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号６）
カスタム合成１８ｓ Ｐｒｉｍｅｒ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’−ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ−３’（配列番号７）
図８にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量、図９にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の転写量を示す。ＮＥＫ６アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、ＴＧＦ−βによって上昇するＣｏｌ１ａ１遺伝子、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の転写量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。
〔実施例７： 肺線維芽細胞におけるＮＥＫ６のノックダウンによる線維症関連遺伝子の転写量に対する影響〕
ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことをさらに検討するため、ＮＥＫ６ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞にヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％ＦＣＳ含有Ｆ−１２Ｋ培地から０．１％ＢＳＡ含有Ｆ−１２Ｋ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質を終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。トランスフェクション７２時間後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによる遺伝子の転写量に対する影響を検出した。Ｃｏｌ１ａ１遺伝子とαＳＭＡ遺伝子の転写量は、Ｃｏｌ１ａ１ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００１６４００４＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、又はαＳＭＡ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００４２６８３５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。
図１０ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１の転写量、図１０ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＴＧＦ−βによって上昇するＣｏｌ１ａ１、αＳＭＡ、遺伝子の転写量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維症を抑制することが示された。
〔実施例８： 腎臓線維芽細胞におけるＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化に対する影響〕
ＮＥＫ６タンパク質がＴＧＦ−βシグナルを制御する可能性を検討するため、ＮＥＫ６ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
ラット腎線維芽細胞株ＮＲＫ−４９Ｆ細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｓＰＮ分子（ＫＢ−００４：５’−ＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＵＣＣＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣ−３’（配列番号１６）、下線は発現抑制配列を示す）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地から０．１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。添加後３０分或いは１時間後、細胞を２×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，６Ｍ Ｕｒｅａ，１２％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解し細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液にβ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体（ａｂｃａｍ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。
図１１にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ−βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。
〔実施例９： 四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘発肝線維化モデルにおけるＮＥＫ６のノックダウンの有効性評価〕
ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを確認するため、ＣＣｌ４モデルマウスに、ＮＥＫ６ ｓｉＲＮＡを静脈内投与して抗線維化作用を解析した。
７週齢雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、１０ｖ／ｖ％ＣＣｌ４含有オリーブ油溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）を、１０ ｍＬ／ｋｇ体重で０，４，７，１１日目に腹腔内投与し、肝線維化モデルマウスを作製した。ＣＣｌ４の初回投与前日の体重で群わけを実施し、群設定は、ＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群（ｎ＝５）、ＣＣｌ４投与の溶媒投与群（ｎ＝１０）、ＣＣｌ４投与の核酸投与群（ｎ＝１０）とした。ＮＥＫ６ ｓｓＰＮ分子としてＫＢ−００４を、投与溶媒としてｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３．０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３．０の製品プロトコールに従い、０．３ｍｇ／ｍＬの核酸投与液を作製した。核酸投与群にはＫＢ−００４を含む核酸投与液を３ｍｇ／ｋｇ体重となるように尾静脈投与し、溶媒投与群には核酸投与群と等量の投与溶媒を、ＣＣｌ４の初回投与前日および病態誘発１０日目に尾静脈投与した。肝障害および線維化の評価は病態誘発１３日目で実施した（実施例１０、１１、１２及び１４）。
〔実施例１０： ＣＣｌ４モデルでの肝障害マーカーの解析〕
線維化とは、細胞や組織の障害に対する過剰な創傷治癒過程だと理解されている。そのため、線維化と共に細胞や組織の障害を抑制することは、各種線維症の治療に有効であると考えられている。そこで、ＮＥＫ６のノックダウンが肝障害に対して効果を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおける肝障害マーカーの測定を行った。
病態誘発１３日目に尾静脈よりプレーンのキャピラリー採血管を用いて採血し、３０分以上静置した。静置後の血液を遠心分離し、血清を得た。トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて血清中グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）及びグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）を測定した。測定方法は試薬の説明書に従った。
図１２ａに血清中ＧＰＴの測定結果、図１２ｂに血清中ＧＯＴの測定結果を示した。ＮＥＫ６ ｓｉＲＮＡを投与することで、ＣＣｌ４モデルで認められた血清中ＧＰＴ及びＧＯＴの上昇が抑制された。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは肝障害を抑制することが示された。
〔実施例１１： ＣＣｌ４モデルでのＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化の解析〕
ＮＥＫ６のノックダウンがＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化に対して効果を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおけるリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
病態誘発１３日目に採取した肝臓を凍結後に粉砕し粉状にした。粉末状の肝臓へ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＮＰ４０，０．１％ ＳＤＳ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ Ｂｅｎｚｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ，２％ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を加え、ハンディ超音波発生機を用いて臓器抽出液を調製した。臓器抽出液を遠心分離して得られた上清へβ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した。その後、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（ａｂｃａｍ社）及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体（ａｂｃａｍ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。リン酸化ＳＭＡＤ３はトータルＳＭＡＤ３量により補正した。
図１３にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ−βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンはＣＣｌ４モデルの肝臓においてＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化を抑制することが示された。
〔実施例１２： ＣＣｌ４モデルでの線維症関連遺伝子の解析〕
ＮＥＫ６のノックダウンが線維化に対して有効性を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおける線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
病態誘発１３日目に採取した肝臓からＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡを抽出した。続いて、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いてＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。ＴａｑＭａｎ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いてＮＥＫ６ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００４８０７３０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び線維症関連遺伝子としてＣｏｌ１ａ１ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｏｌ３ａ１ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１２５４４７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｉｍｐ１ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１３４１３６１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量を測定し、内部標準である１８ｓ ｒＲＮＡ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量との相対比を各遺伝子の転写量とした。
ＣＣｌ４モデルにおける各遺伝子の転写量を図１４ａ〜ｄに示す。ＮＥＫ６ ｓｓＰＮ分子の投与によって、ＮＥＫ６遺伝子の転写量が低下した。このことから、用いられたＫＢ−００４は、効率的に標的遺伝子の転写を抑制したことが示された。この時、病態誘発によって誘導される線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｔｉｍｐ１）の転写量は有意に低下した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。
〔実施例１３： 胆管結紮誘発肝線維化（ＢＤＬ）モデルでの線維症関連遺伝子の解析〕
ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、胆管結紮誘発肝線維化モデルマウス（ＢＤＬモデル）にＮＥＫ６ ｓｉＲＮＡを静脈内投与して線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を体重で群分けし、遺伝子導入試薬ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎ ３．０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の添付文書に従って調製したＫＢ−００４溶液（０．３ｍｇ／ｍＬ）を３ｍｇ／ｋｇ体重の用量で尾静脈内投与した（ｎ＝１２）。対照群には、溶媒のみを投与した（ｎ＝１５）。投与翌日、総胆管を２箇所結紮し、肝線維化モデルマウスを作製した。偽手術群は、生理食塩水（大塚生食注）を尾静脈内投与し、総胆管の剥離のみ行った（ｎ＝７）。胆管結紮１４日目に肝臓を採取し、上記と同様にしてＮＥＫ６ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００４８０７３０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び線維症関連遺伝子としてＣｏｌ１ａ１ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｏｌ３ａ１ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１２５４４７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｉｍｐ１ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１３４１３６１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量を測定し、内部標準であるＧＡＰＤＨ Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ９９９９９９５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量との相対比を各遺伝子の転写量とした。
ＢＤＬモデルにおける各遺伝子転写量を図１５にａ〜ｄに示す。ＮＥＫ６ ｓｉＲＮＡの投与によって、ＮＥＫ６遺伝子の転写量が低下した。このことから、用いられたＫＢ−００４は、効率的に標的遺伝子の転写を抑制したことが示された。この時、病態誘発によって誘導される線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｔｉｍｐ１）の転写量は有意に低下した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。
〔実施例１４： ＣＣｌ４モデルでの病理解析〕
ＮＥＫ６のノックダウンがＣＣｌ４誘発肝線維化モデルに対して効果を示すかを検討するため、病理像の観察を行った。
病態誘発１３日目に肝臓の内側右葉を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液を用いて固定した。パラフィンで包埋した後に、組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。
図１６に病理像の代表例を示した。図１６ａはＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群の結果、図１６ｂはＣＣｌ４投与の溶媒投与群の結果、図１６ｃはＣＣｌ４投与の核酸投与群の結果を表す。図１６ｂ中に多く認められる空胞変性は細胞の障害を示し、中央部付近に多く存在する核が染色していない部分は細胞の壊死を示す。ＮＥＫ６ ｓｉＲＮＡを投与することで、ＣＣｌ４モデルの肝臓組織で認められた細胞の障害や壊死が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンはＣＣｌ４誘発肝線維化モデルにおける病理像の変化を抑制することが示された。
参考例１： 一本鎖核酸分子の合成
以下に示す核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ３９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により合成した。固相担体としてＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）を用い、ＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いた固相合成を行った。固相担体からの切り出し及びリン酸基保護基の脱保護、塩基保護基の脱保護、２’−水酸基保護基の脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。
本発明の下記一本鎖核酸分子において、Ｌｘは、リンカー領域Ｌｘであり、下記構造式のＬ−プロリンジアミドアミダイトを示す。
Figure 2020152869
また、下記一本鎖核酸分子中の下線部は、ＮＥＫ６の遺伝子発現抑制配列である。
ＫＢ−００１
５’−ＧＡＧＧＧＡＧＵＵＣＣＡＡＣＡＡＣＣＵＣＵＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＡＧＡＧＧＵＵＧＵＵＧＧＡＡＣＵＣＣＣＵＣＣＡ−３’（配列番号１３）
ＫＢ−００２
５’−ＣＧＡＧＧＣＡＧＧＡＣＵＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＣＣＵＵＧＡＣＡＣＡＧＵＣＣＵＧＣＣＵＣＧＣＣ−３’（配列番号１４）
ＫＢ−００３
５’−ＣＧＵＧＧＡＧＣＡＣＡＵＧＣＡＵＵＣＡＣＧＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＣＧＵＧＡＡＵＧＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＡＣＧＧＣ−３’（配列番号１５）
ＫＢ−００４
５’−ＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＵＣＣＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣ−３’（配列番号１６）
ＫＢ−００５
５’−ＣＡＧＡＧＡＣＣＵＧＡＣＡＵＣＧＧＡＵＡＣＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＧＵＡＵＣＣＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＣＵＣＵＧＧＵ−３’（配列番号１７）

Claims (5)

  1. ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤。
  2. ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を有効成分として含む線維症治療剤。
  3. 線維症が肺線維症、肝線維症又は腎線維症である、請求項２の治療剤。
  4. ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸が、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列及び配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１記載の阻害剤。
  5. ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸が、配列番号１の配列、配列番号２の配列及び配列番号３の配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１記載の阻害剤。
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