WO2019022257A1 - 線維症治療剤 - Google Patents

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WO2019022257A1
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bases
nek6
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linker
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一久 中尾
石山　順一
航 市川
淳 増井
ゆにけ 赤坂
秀一 豊福
亜弥 本田
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杏林製薬株式会社
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    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid molecule that suppresses the expression of the NEK6 gene and a medicament containing the nucleic acid molecule as an active ingredient.
  • Fibrosis is a disease in which organ function is impaired due to accumulation of excess collagen and irreversibly progresses.
  • organ function is impaired due to accumulation of excess collagen and irreversibly progresses.
  • skin, lung, liver, pancreas, kidney, bone marrow etc. are known as the affected organ .
  • Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) which is a type of pulmonary fibrosis, has a high incidence of about 20 patients per 100,000 population, but its average survival after diagnosis is 2.5 to 5 Because the year and the course after treatment are not good, incurable disease is designated in Japan.
  • Pirfenidone and nintedanib have been approved and marketed by the Ministry of Health, Labor and Welfare of Japan as IPF therapeutic agents. Although all drugs exhibit suppression of hypoactivity and prolongation of progression-free period, and delay the progression of the pathological condition, they are not satisfactory as therapeutic effects, and development of therapeutic agents based on new mechanisms is desired. There is.
  • the “NEK6 protein”, which is the target of the present invention is known as one of the NIMA-related serine / threonine kinase family involved in the control of cell division, but has not received much attention as a drug development research target . Although the potential as a drug discovery target for cancer is reported in 2002, there is no specific report that NEK6 protein interacts with SMAD2 / 3 protein or promotes tissue fibrosis.
  • An object of the present invention is to provide novel inhibitors of phosphorylation of SMAD2 / 3 protein and therapeutic agents for fibrosis.
  • NEK6 NIMA-related serine / threonine kinase 6
  • NEK6 NIMA-related serine / threonine kinase 6
  • a phosphorylation inhibitor of SMAD2 / 3 protein which comprises a nucleic acid which suppresses the expression of NEK6 gene as an active ingredient
  • a therapeutic agent for fibrosis which comprises a nucleic acid which suppresses the expression of NEK6 gene as an active ingredient
  • a therapeutic agent for [2] which is intended for treatment of pulmonary fibrosis, hepatic fibrosis or renal fibrosis
  • a double-stranded nucleic acid molecule selected from the group consisting of the following (a), (b), (c), (d) and (e):
  • A) The guide strand (antisense strand) having 19 to 30 nucleotides containing the sequence shown in SEQ ID NO: 1 at the 5 'end and 19 nucleotides containing the sequence shown in SEQ ID NO: 6 at the 3' end or 5 'end
  • a ribonucleotide residue and / or a deoxynucleotide residue of 1 to 11 bases is added to the 3 'end of the guide strand (antisense strand) and / or the passenger strand (sense strand) to form a protruding end [4] double stranded nucleic acid molecule; [6] Linker sequence and / or non-nucleotide wherein the 3 'end of the passenger strand (sense strand) shown in [4] or [5] and the 5' end of the guide strand (antisense strand) consist of nucleotide residues The 3 'end of the guide strand (antisense strand) and the 5' end of the passenger strand (sense strand) of the guide strand (antisense strand) shown in [4] or [5] are linked from a nucleotide residue A single stranded nucleic acid molecule forming a hairpin RNA structure linked via
  • a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond may be contained,
  • the region (Xc) and the region (X) are linked to the linker region (Lx) via -OR 1 -or -OR 2- , respectively.
  • the region (Yc) and the region (Y) are linked to the linker region (Ly) via -OR 1 -or -OR 2- , respectively.
  • R 1 and R 2 may be present or absent, and when present, R 1 and R 2 are each independently a nucleotide residue or the structure (I) above; [9] The single-stranded nucleic acid molecule of [7] or [8], wherein X or Z comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11-25; [10] A method for inhibiting the phosphorylation of SMAD2 / 3 protein, comprising administering to a subject a nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene; [11] A method of treating fibrosis, comprising administering to a subject a nucleic acid which suppresses the expression of NEK6 gene; [12] A nucleic acid which suppresses the expression of NEK6 gene, which is used to inhibit the phosphorylation of SMAD2 / 3 protein; [13] A nucleic acid that suppresses the expression of NEK6 gene used for treating fibrosis; [14] Use of a
  • the present invention makes it possible to provide novel inhibitors of phosphorylation of SMAD2 / 3 protein and therapeutic agents for fibrosis.
  • FIG. 10 shows the sequence of the Coding Sequence region of NEK6 and the target site of the ssPN molecule prepared in Example 7.
  • FIG. 2 is a schematic view showing an example of a nucleic acid molecule as an active ingredient of the SMAD2 / 3 protein phosphorylation inhibitor of the present invention.
  • SsPN molecule is a schematic view showing an example of a nucleic acid molecule as an active ingredient of the SMAD2 / 3 protein phosphorylation inhibitor of the present invention.
  • SsPN molecule or ssNc molecule FIG. 4 is a schematic view showing an example of a nucleic acid molecule to be an active ingredient of the SMAD2 / 3 protein phosphorylation inhibitor of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic view showing an example of a nucleic acid molecule as an active ingredient of the SMAD2 / 3 protein phosphorylation inhibitor of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the transcription amount of NEK6 gene when siRNA was introduced.
  • FIG. 7a represents the results of Western blot of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down.
  • FIG. 7 b represents the results of Western blot of phosphorylated SMAD2 protein when NEK6 was knocked down.
  • FIG. 8a represents the results of co-immunoprecipitation with anti-NEK6 antibody.
  • FIG. 8 b represents the results of co-immunoprecipitation with anti-FLAG antibody.
  • FIG. 9 shows the results of Western blot of phosphorylated SMAD3 protein when His fusion NEK6 protein was reacted with GST fusion SMAD3 protein.
  • FIG. 10a represents the results of Western blot in the case of knocking down NEK6.
  • FIG. 10 b shows the amount of luminescence of firefly luciferase upon knockdown of NEK6.
  • FIG. 11 a shows the transcription amount of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down.
  • FIG. 11 b shows the transcription amount of the ⁇ SMA gene when NEK6 was knocked down.
  • FIG. 12 a shows the transcription amount of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down.
  • FIG. 12 b shows the transcription amount of the ⁇ SMA gene when NEK6 was knocked down.
  • FIG. 13 shows the results of Western blot of phosphorylated SMAD3 protein (pSMAD3) when NEK6 siRNA was introduced into hepatic stellate cells.
  • FIG. 14 shows the results of Western blot of phosphorylated SMAD3 protein (pSMAD3) in the case of introducing various NEK6 siRNAs into hepatic stellate cells.
  • FIG. 15 a represents the transcript level of NEK6 when knocked down NEK6 in hepatic stellate cells.
  • FIG. 15 b represents transcript levels of Fibronectin upon knockdown of NEK6 in hepatic stellate cells.
  • FIG. 15 c represents the transcript level of the ⁇ SMA gene upon knockdown of NEK6 in hepatic stellate cells.
  • FIG. 16 depicts the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein upon knockdown of NEK6 in renal fibroblasts.
  • FIG. 17 a shows the measurement results of GPT in serum when NEK6 was knocked down in a CCl 4 model.
  • FIG. 17 b shows the measurement results of serum GOT when NEK6 was knocked down in a CCl 4 model.
  • FIG. 18 depicts the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein upon knockdown of NEK6 in a CCl 4 model.
  • FIG. 19a shows the transcript level of the NEK6 gene upon knockdown of NEK6 in the CCl 4 model.
  • FIG. 19 b shows the transcription amount of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down in a CCl 4 model.
  • FIG. 19 c represents the transcript level of the Col3a1 gene upon knockdown of NEK6 in the CCl 4 model.
  • FIG. 19 d shows the transcript level of the Timp1 gene upon knocking down NEK6 in the CCl 4 model.
  • FIG. 19a shows the transcript level of the NEK6 gene upon knockdown of NEK6 in the CCl 4 model.
  • FIG. 19 b shows the transcription amount of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down in a CCl 4 model.
  • FIG. 19 c represents
  • FIG. 20 a shows the transcription amount of NEK6 gene when NEK6 was knocked down in the BDL model.
  • FIG. 20 b shows the transcription amount of the Col1a1 gene when NEK6 was knocked down in the BDL model.
  • FIG. 20 c shows the amount of transcription of the Col3a1 gene when NEK6 was knocked down in the BDL model.
  • FIG. 20 d represents the transcript level of the Timp1 gene when NEK6 was knocked down in the BDL model.
  • FIG. 21 shows the results of pathological analysis of the liver when NEK6 was knocked down in a CCl 4 model.
  • FIG. 21 a represents the results of the saline-administered group without CCl 4 administration.
  • FIG. 21 b represents the results of solvent administration group of CCl 4 administration.
  • FIG. 21 c represents the results of the CCl 4 administered nucleic acid administration group.
  • the terms used in the present specification have the meanings commonly used in the art.
  • the “number of bases” means, for example, “length” and can also be referred to as “base length”.
  • the numerical range of the number of bases is, for example, the disclosure of all positive integers belonging to the range, and as a specific example, the description of “1 to 4 bases” means “1, 2, 3, It means all disclosure of “4 bases”.
  • the present invention provides a SMAD2 / 3 protein phosphorylation inhibitor containing a nucleic acid which suppresses the expression of the NEK6 gene as an active ingredient, and a therapeutic agent for fibrosis containing the nucleic acid as an active ingredient.
  • a SMAD2 / 3 protein phosphorylation inhibitor containing a nucleic acid which suppresses the expression of the NEK6 gene as an active ingredient
  • a therapeutic agent for fibrosis containing the nucleic acid as an active ingredient.
  • Nucleic acid that suppresses expression of NEK6 gene NEK6 protein is one of 11 NIMA-related serine / threonine kinase families involved in the control of cell division, and is phosphorylated (activated) in M phase of cell cycle Be done.
  • the NEK6 gene which is the target of the present invention is a gene of mammalian origin, preferably a gene of human origin. Seven variants of the human-derived NEK6 gene have been reported, of which the sequence of the coding sequence region of isoform 2 is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 56).
  • the mechanism for suppressing the expression of the NEK6 gene by the nucleic acid molecule is not particularly limited as long as it can downregulate the expression.
  • the suppression of expression of the NEK6 gene can be confirmed by, for example, a decrease in the amount of transcripts produced from the NEK6 gene, a decrease in the amount of translation products produced from the NEK6 gene, or a decrease in the activity of the translation products.
  • nucleic acids that suppress NEK6 gene expression include antisense polynucleotides of NEK6 mRNA, siRNA, ssPN molecules, ssNc molecules, miRNA, ribozymes and the like.
  • Antisense polynucleotides, siRNAs, ssPN molecules, ssNc molecules, and ribozymes can be easily obtained by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the human NEK6 gene described above.
  • Preferred is a nucleic acid prepared based on the sequence (SEQ ID NO: 56) of the Coding Sequence region of NEK6 isoform 2.
  • siRNA small interfering RNA
  • An siRNA is a nucleic acid molecule consisting of a guide strand (antisense strand) paired with a target gene, and a passenger strand (sense strand) forming a duplex with the guide strand.
  • RISC RNA-inducing silencing complex
  • the seed region of the guide strand (7-base region of 2-8 bases from the 5 'end of the guide strand) is considered to have an important role in recognizing the target sequence, avoiding the off-target effect It is considered preferable to select a seed region specific to a target gene for the purpose of Therefore, it is preferable to select a sequence specific to the NEK6 gene also for the seed region of the nucleic acid which is the active ingredient of the present invention.
  • the NEK6 gene is complementary to the NEK6 gene and not complementary to the NEK7 gene (RefSeq database: NM_133494.2), or one or more (for example, 1 to 3) bases in the region are noncomplementary to the NEK7 gene ( It is possible to select a nucleic acid containing a sequence that is mismatched) as a seed region.
  • non-complementary (mismatch) bases to the NEK6 gene and non-complementary (mismatch) bases to the NEK7 gene are increased (for example, 4 or more, preferably 5 to 7). Is useful in avoiding off-target effects.
  • the number of bases of the expression suppression sequence contained in the guide strand is, for example, 15 to 30 bases, preferably 19 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases, and still more preferably 21, 22, 23. It is a base, particularly preferably 23 bases.
  • the expression suppression sequence may form an overhanging end by further having an additional sequence on the 3 'side.
  • the number of bases of the addition sequence is, for example, 1 to 11 bases, preferably 1 to 4 bases.
  • the additional sequences may be ribonucleotide residues or deoxyribonucleotide residues.
  • the number of bases of the guide strand is, for example, 19 to 50 bases, preferably 19 to 30 bases, more preferably 19 to 25 bases, still more preferably 19 to 23 bases, and even more preferably 21 , 22 and 23 bases, particularly preferably 23 bases.
  • the number of bases of the passenger strand is, for example, 19 to 50 bases, preferably 19 to 30 bases, more preferably 19 to 25 bases, still more preferably 19 to 23 bases, and even more preferably 21. , 22 and 23 bases, particularly preferably 21 bases.
  • the region showing complementarity with the guide strand in the passenger strand is, for example, 19 to 50 bases, preferably 19 to 30 bases, more preferably 19 to 25 bases, and still more preferably 19 to 23 bases It is.
  • the region may further have an additional sequence on the 3 'side.
  • the number of bases of the addition sequence is, for example, 1 to 11 bases, preferably 1 to 4 bases, and the addition sequence may be a ribonucleotide residue or a deoxyribonucleotide residue.
  • the passenger strand is preferably complementary, for example, it may be complementary or one or several bases may be non-complementary to the region showing complementarity of the guide strand.
  • the one or more bases are, for example, 1 to 3 bases, preferably 1 or 2 bases.
  • siRNA that suppresses gene expression of NEK6 can be obtained, for example, according to the siRNA sequence design system such as siSNIPER (registered trademark) or siDirect (registered trademark) for drug discovery and diagnostic research based on the cDNA sequence information of the NEK 6 gene .
  • siSNIPER registered trademark
  • siDirect registered trademark
  • the NEK6 siRNA is preferably an siRNA that specifically acts on NEK6, and examples thereof include double-stranded nucleic acids as follows.
  • A The guide strand (antisense strand) having 19 to 30 nucleotides containing the sequence shown in SEQ ID NO: 1 at the 5 'end and 19 nucleotides containing the sequence shown in SEQ ID NO: 6 at the 3' end or 5 'end
  • a double-stranded nucleic acid molecule (b) formed from a passenger strand (sense strand) of -30 and a guide strand (antisense strand) having 19 to 30 bases including the sequence shown in SEQ ID NO: 2 at the 5 'end
  • a double-stranded nucleic acid molecule formed from (a) a guide strand (antisense strand) having 19 to 30 bases including the sequence shown in SEQ ID NO: 5 at the 5 'end and the sequence at the 3' or 5 'end A double-stranded nucleic acid molecule formed from a passenger strand (sense strand) having 19 to 30 bases comprising the sequence shown in No. 10
  • siRNAs that suppress the expression of the NEK6 gene have a linker sequence and / or non-nucleotide structure in which the 3 'end of the passenger strand (sense strand) and the 5' end of the guide strand (antisense strand) consist of nucleotide residues.
  • the 3 'end of the guide strand (antisense strand) and the 5' end of the passenger strand (sense strand) are linked via a linker, or via a linker of a nucleotide sequence consisting of nucleotide residues and / or a non-nucleotide structure linker It may be a single-stranded nucleic acid molecule forming a hairpin RNA structure linked together.
  • the length of the linker sequence consisting of the nucleotide residues is not particularly limited, for example, it is preferable that the length allows the passenger strand and the guide strand to form a double strand.
  • the lower limit of the number of bases in the linker sequence is, for example, 1 base, preferably 2 bases, more preferably 3 bases, and the upper limit is, for example, 100 bases, preferably 80 bases. Yes, more preferably 50 bases.
  • Specific examples of the number of bases of the linker sequence are 1 to 100 bases, 2 to 80 bases, and 3 to 50 bases.
  • non-nucleotide linkers examples include chemical linkers such as hexaethylene glycol linker, poly- (oxyphosphinico-oxy-1,3-propanediol) linker, allyl linker, or polyethylene glycol linker, carbamate structure Amino linkers etc. can be mentioned.
  • the length of the non-nucleotide structure linker is not particularly limited, for example, it is preferable that the length allows the passenger strand and the guide strand to form a duplex.
  • the ssPN molecule used as one of the nucleic acids which suppresses the expression of NEK6 gene is explained.
  • the ssPN molecule means a single stranded RNA nucleic acid molecule excellent in biological stability disclosed in WO 2012/017919, and specifically, it is as follows.
  • the ssPN molecule to be an active ingredient of the present invention is a single-stranded nucleic acid molecule containing an expression suppression sequence of NEK6 gene, and comprises a region (X), a linker region (Lx) and a region (Xc), which region (X)
  • the linker region (Lx) is linked between the region (Xc) and the region (Xc), and at least one of the region (X) and the region (Xc) contains the expression suppression sequence, and the linker region (Lx) )
  • the ssPN molecule is not linked at its 5 'end and 3' end, and may be referred to as a linear single-stranded nucleic acid molecule.
  • the expression suppression sequence of the NEK6 gene is, for example, a sequence showing an activity of suppressing the expression of the NEK6 gene when the ssPN molecule of the present invention is introduced into cells in vivo or in vitro.
  • the siRNA sequence binding to NEK6 mRNA can be obtained according to the existing siRNA design system based on the cDNA sequence information of the NEK6 gene, and the expression suppression sequence of said siRNA is also used as the expression suppression sequence of ssPN molecule even in ssPN molecule It can be used.
  • the expression suppression sequence preferably has, for example, 80% or more complementarity to the target region of NEK6 gene, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more. More preferably, it is 98% or more, and particularly preferably 100%.
  • siRNA for the portion corresponding to the seed region of siRNA, it is preferable to select a sequence specific to the NEK6 gene as in the case of siRNA.
  • ssPN molecules The suppression of NEK6 gene expression by ssPN molecules is presumed to be due to, for example, the occurrence of RNA interference, but is not limited by this mechanism.
  • the ssPN molecule of the present invention is not introduced into a cell or the like as a dsRNA consisting of two single-stranded RNAs, for example, as a so-called siRNA, and the excision of the expression suppression sequence in cells is It is not necessarily essential.
  • the linker region (Lx) may have, for example, a non-nucleotide structure including the pyrrolidine backbone, or may have a non-nucleotide structure including the piperidine backbone, or the pyrrolidine backbone It may have both a non-nucleotide structure including the non-nucleotide structure including the piperidine skeleton.
  • the pyrrolidine skeleton may be, for example, a skeleton of a pyrrolidine derivative in which one or more carbons constituting the 5-membered ring of pyrrolidine are substituted, and when substituted, for example, the 2-position of the 5-membered ring It is preferably a carbon atom other than carbon (C-2).
  • the carbon may be substituted, for example, by nitrogen, oxygen or sulfur.
  • the pyrrolidine skeleton may contain, for example, a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond, for example, in the 5-membered ring of pyrrolidine.
  • carbon and nitrogen constituting the 5-membered ring of pyrrolidine may be, for example, hydrogen or a substituent as described later.
  • the linker region (Lx) may be bonded to the region (X) and the region (Xc), for example, via any group of the pyrrolidine skeleton, and preferably, any one of the 5-membered rings Carbon atoms and nitrogen, preferably carbon (C-2) at position 2 of the 5-membered ring and nitrogen.
  • Examples of the pyrrolidine skeleton include a proline skeleton and a prolinol skeleton.
  • the proline skeleton, prolinol skeleton and the like are, for example, in-vivo substances and their reductants, and therefore also excellent in safety.
  • the piperidine skeleton may be, for example, a skeleton of a piperidine derivative in which one or more carbons constituting the 6-membered ring of piperidine are substituted, and when substituted, for example, the 2-position of the 6-membered ring It is preferably a carbon atom other than carbon (C-2).
  • the carbon may be substituted, for example, by nitrogen, oxygen or sulfur.
  • the piperidine skeleton may contain, for example, a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond, for example, in the 6-membered ring of piperidine.
  • carbon and nitrogen constituting a 6-membered ring of piperidine may be bonded with, for example, a hydrogen group or a substituent as described later.
  • the linker region (Lx) may be bonded to the region (X) and the region (Xc), for example, via any group of the piperidine skeleton, and preferably, any one of the six-membered rings Carbon atoms and nitrogen, preferably carbon (C-2) and nitrogen at position 2 of the 6-membered ring.
  • the linker region may contain, for example, only non-nucleotide residues consisting of the non-nucleotide structure, or may contain non-nucleotide residues consisting of the non-nucleotide structure and nucleotide residues.
  • the linker region is represented, for example, by the following formula (I).
  • X 1 and X 2 are each independently H 2 , O, S or NH; Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S; R 3 is a hydrogen atom or a substituent bonded to C-3, C-4, C-5 or C-6 on ring A, L 1 is an alkylene chain consisting of n carbon atoms, wherein the hydrogen atom on the alkylene carbon atom is OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R b , SH or SR a Or may not be substituted, or L 1 is a polyether chain in which at least one carbon atom of the alkylene chain is substituted with an oxygen atom, However, when Y 1 is NH, O or S, the atom of L 1 bonded to Y 1 is carbon, the atom of L 1 bonded to OR 1 is carbon, and the oxygen atoms are not adjacent to each other; L 2 is an alkylene chain consisting of n
  • a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond may be contained,
  • the region (Xc) and the region (X) are linked to the linker region (Lx) via -OR 1 -or -OR 2- , respectively.
  • R 1 and R 2 may or may not be present, and when present, R 1 and R 2 are each independently a nucleotide residue or the structure (I) above.
  • X 1 and X 2 are each independently, for example, H 2 , O, S or NH.
  • X 1 is H 2 means that X 1 forms a CH 2 (methylene group) together with the carbon atom to which X 1 is bonded. The same is true for X 2.
  • each of Y 1 and Y 2 independently represents a single bond, CH 2 , NH, O or S.
  • l 1 or 2.
  • ring A is a 5-membered ring, for example, the pyrrolidine skeleton described above.
  • examples of the pyrrolidine skeleton include a proline skeleton, a prolinol skeleton and the like, and these divalent structures can be exemplified.
  • ring A 2
  • ring A is a 6-membered ring, for example, the piperidine skeleton.
  • one carbon atom other than C-2 on ring A may be substituted with nitrogen, oxygen or sulfur.
  • ring A may contain a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond in ring A.
  • Ring A may be, for example, L-form or D-form.
  • R 3 is a hydrogen atom or a substituent bonded to C-3, C-4, C-5 or C-6 on ring A.
  • R 3 is the above-described substituent, one or more substituents R 3 may not be present, and when two or more substituents R 3 may be the same or different.
  • R 4 and R 5 are each independently, for example, a substituent or a protecting group, and may be the same or different.
  • the substituent as R 4 and R 5 is, for example, halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl Aminoalkyl, heterocyclylalkenyl, heterocyclylalkyl, heteroarylalkyl, silyl, silyloxyalkyl and the like.
  • the protective group as R 4 and R 5 is, for example, a functional group that converts a highly reactive functional group into an inactive group, and examples thereof include known protective groups and the like.
  • the protective group the description in the literature (JFW McOmie, "Protecting Groups in Organic Chemistry", Prenum Press, London and New York, 1973) can be incorporated.
  • the protective group is not particularly limited.
  • tert-butyldimethylsilyl TDMS
  • bis (2-acetoxyethyloxy) methyl ACE
  • triisopropylsilyloxymethyl TOM
  • 1- (2) And -cyanoethoxy) ethyl group CEE
  • 2-cyanoethoxymethyl group CEM
  • tolylsulfonylethoxymethyl group TEM
  • dimethoxytrityl group DMTr
  • the protective group is not particularly limited, and examples thereof include TBDMS group, ACE group, TOM group, CEE group, CEM group and TEM group.
  • L 1 is an alkylene chain consisting of n carbon atoms. Hydrogen atoms on the alkylene carbon atoms is, for example, OH, OR a, NH 2 , NHR a, NR a R b, SH, or may be substituted by SR a, it may not be substituted.
  • L 1 may be a polyether chain in which one or more carbon atoms (for example, 1 to 3) of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom.
  • the polyether chain is, for example, polyethylene glycol.
  • Y 1 is NH, O or S
  • the atom of L 1 bonded to Y 1 is carbon
  • the atom of L 1 bonded to OR 1 is carbon
  • the oxygen atoms are not adjacent to each other. That is, for example, if Y 1 is O, the oxygen atom of an oxygen atom and L 1 is not adjacent the oxygen atom of an oxygen atom and L 1 of OR 1 are not adjacent.
  • L 2 is an alkylene chain consisting of m carbon atoms.
  • the hydrogen atom on the alkylene carbon atom may be substituted or unsubstituted, for example, with OH, OR c , NH 2 , NHR c , NR c R d , SH or SR c .
  • L 2 may be a polyether chain in which one or more carbon atoms (for example, 1 to 3) of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom.
  • Y 2 is NH, O or S
  • the atom of L 2 bonded to Y 2 is carbon
  • the atom of L 2 bonded to OR 2 is carbon
  • the oxygen atoms are not adjacent to each other. That is, for example, when Y 2 is O, the oxygen atom of an oxygen atom and L 2 are not adjacent the oxygen atom of an oxygen atom and L 2 of OR 2 are not adjacent.
  • n of L 1 and the m of L 2 are not particularly limited, and the lower limit is, for example, 0, and the upper limit is also not particularly limited.
  • n and m can be set as appropriate according to, for example, the desired length of the linker region (Lx).
  • Each of n and m is preferably 0 to 30, more preferably 0 to 20, and still more preferably 0 to 15, from the viewpoint of, for example, production cost and yield.
  • n + m is, for example, 0-30, preferably 0-20, more preferably 0-15.
  • n of L 1 and m of L 2 represent the number of carbon atoms of each alkylene chain
  • a polyether chain in which at least one carbon atom of the alkylene chain of L 1 or L 2 is substituted with an oxygen atom
  • n and m mean the total number of carbon atoms and the number of oxygen atoms substituted.
  • R a , R b , R c and R d are, for example, each independently a substituent or a protecting group.
  • the substituents and protecting groups of R a , R b , R c and R d are, for example, the same as the substituents and protecting groups of R 4 and R 5 .
  • each hydrogen atom may be independently substituted with a halogen such as Cl, Br, F and I.
  • the region (Xc) and the region (X) are linked to the linker region (Lx) via, for example, -OR 1 -or -OR 2- , respectively.
  • R 1 and R 2 may or may not be present.
  • R 1 and R 2 are each independently a nucleotide residue or a structure of Formula (I) above.
  • the linker region (Lx) is, for example, the non-nucleotide residue consisting of the structure of the formula (I) excluding nucleotide residues R 1 and / or R 2 It is formed from a group and the nucleotide residue.
  • the linker region (Lx) is, for example, two or more non-nucleotide residues consisting of the structure of the formula (I) linked It becomes a structure.
  • the structure of the formula (I) may include, for example, one, two, three or four.
  • the structure of (I) may be, for example, directly linked or may be linked via the nucleotide residue.
  • R 1 and R 2 are absent, the linker region (Lx) is formed only of the non-nucleotide residue consisting of the structure of the formula (I), for example.
  • the combination of bonding of the region (Xc) and the region (X) with -OR 1 -and -OR 2- is not particularly limited, and examples thereof include any of the following conditions.
  • Condition (1) The region (Xc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 2 -and the region (X) via -OR 1- .
  • Condition (2) The region (Xc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 1 -and the region (X) via -OR 2- .
  • the structure of the formula (I) can be exemplified by the following formulas (I-1) to (I-9), and in the following formulas, n and m are the same as the formula (I). In the following formula, q is an integer of 0 to 10.
  • n, m and q are not particularly limited, and are as described above.
  • the region (Xc) is complementary to the region (X). Therefore, in the ssPN molecule, the region (Xc) is folded toward the region (X), and the region (Xc) and the region (X) can form a double strand by self-annealing. In the ssPN molecule, for example, only the region (Xc) may be folded to form a duplex with the region (X), and further, a new duplex may be formed in another region.
  • first ssPN molecule a molecule in which duplex formation is one place
  • second ssPN molecule a molecule in which duplex formation is two places
  • first ssPN molecule and the second ssPN molecule are exemplified.
  • the first ssPN molecule is, for example, a molecule comprising the region (X), the region (Xc) and the linker region (Lx).
  • the first ssPN molecule may have, for example, the region (Xc), the linker region (Lx) and the region (X) in the above order from the 5 'side to the 3' side.
  • the region (Xc), the linker region (Lx), and the region (X) may be provided in the above order from the 'side to the 5' side.
  • the region (Xc) is complementary to the region (X).
  • the region (Xc) may have a sequence complementary to the entire region of the region (X) or a partial region thereof, and preferably, the entire region of the region (X) or the region thereof It contains a sequence complementary to a partial region or consists of only the complementary sequence.
  • the region (Xc) may be, for example, complementary to the entire region complementary to the region (X) or the partial region complementary to it, or one or several bases may be non-complementary Good, but preferably complementary.
  • the one or more bases are, for example, 1 to 3 bases, preferably 1 or 2 bases.
  • the expression suppression sequence is included in at least one of the region (Xc) and the region (X).
  • the first ssPN molecule may have, for example, one or two or more of the expression suppression sequences. In the latter case, the first ssPN molecule may have, for example, two or more of the same expression suppression sequences for the NEK6 gene, or may have two or more different expression suppression sequences for the NEK6 gene.
  • the location of each expression suppression sequence is not particularly limited, and any one of the region (X) and the region (Xc) It may be a different area.
  • FIG. 2A is, as an example, a schematic view showing an outline of the order of each region for the ssPN molecule
  • FIG. 2B shows that the ssPN molecule forms a double chain in the molecule.
  • FIG. 2 (B) shows that a double chain is formed between the region (Xc) and the region (X), and the Lx region is a loop according to its length. Take structure.
  • FIG. 2 (B) shows that ssPN molecule forms a double chain in the molecule.
  • the second shows only the connection order of the above regions and the positional relationship of each region forming a double chain, for example, the length of each region, the shape of the linker region (Lx), etc. It is not restricted.
  • the number of bases in the region (Xc) and the region (X) is not particularly limited. Although the length of each area is illustrated below, the present invention is not limited to this.
  • the region (Xc) may, for example, be complementary to the entire region of the region (X).
  • the region (Xc) means, for example, a base sequence complementary to the entire region from the 5 'end to the 3' end of the region (X), ie, the region (Xc) It means that the region (X) has the same base length, and all the bases in the region (Xc) are complementary to all the bases in the region (X).
  • the region (Xc) may be complementary to, for example, a partial region of the region (X).
  • the region (Xc) means, for example, a base sequence complementary to a partial region of the region (X), that is, the region (Xc) is larger than the region (X), It consists of a base sequence having a base length of one or more bases short, and all bases in the region (Xc) are complementary to all bases in the partial region of the region (X).
  • the partial region of the region (X) is, for example, a region consisting of a base sequence which continues from the base at the end on the region (Xc) side (the first base) in the region (X).
  • the relationship between the number of bases (X) in the region (X) and the number of bases (Xc) in the region (Xc) satisfies, for example, the following condition (3) or (5):
  • the condition of the following (11) is satisfied.
  • X-Xc 1 to 10, preferably 1, 2 or 3, More preferably, 1 or 2 (11)
  • X Xc (5)
  • the region (X) and / or the region (Xc) includes the expression suppression sequence
  • the region may be, for example, a region consisting of only the expression suppression sequence, or a region including the expression suppression sequence. Good.
  • the number of bases of the expression suppression sequence is, for example, 15 to 30 bases, preferably 19 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases, still more preferably 21, 22 or 23 bases, and particularly preferably Is 23 bases.
  • the region including the expression suppression sequence may further have an additional sequence, for example, 5 'and / or 3' of the expression suppression sequence.
  • the number of bases of the addition sequence is, for example, 1 to 31 bases, preferably 1 to 21 bases, and more preferably 1 to 11 bases.
  • the number of bases in the region (X) is not particularly limited.
  • the lower limit is, for example, 19 bases.
  • the upper limit thereof is, for example, 50 bases, preferably 40 bases, more preferably 30 bases, still more preferably 25 bases.
  • Specific examples of the number of bases in the region (X) are, for example, 19 to 50 bases, preferably 19 to 30 bases, more preferably 19 to 25 bases, and still more preferably 21, 22, and 23 bases. Particularly preferred is 23 bases.
  • the number of bases in the region (Xc) is not particularly limited.
  • the lower limit is, for example, 19 bases, preferably 20 bases, and more preferably 21 bases.
  • the upper limit thereof is, for example, 50 bases, preferably 40 bases, more preferably 30 bases, still more preferably 25 bases.
  • Specific examples of the number of bases in the region (Xc) are, for example, 19 to 50 bases, preferably 19 to 30 bases, more preferably 19 to 25 bases, and still more preferably 21, 22 and 23 bases. Particularly preferred is 21 bases.
  • the length of the linker region (Lx) is not particularly limited.
  • the linker region (Lx) preferably has, for example, a length such that the region (X) and the region (Xc) can form a duplex.
  • the lower limit of the number of bases of the linker region (Lx) is, for example, 1 base, preferably 2 It is a base, more preferably 3 bases, and the upper limit thereof is, for example, 100 bases, preferably 80 bases, more preferably 50 bases.
  • Specific examples of the number of bases in the linker region (Lx) are 1 to 100 bases, 2 to 80 bases, and 3 to 50 bases. It is preferable that the structure does not cause self-annealing in the linker region (Lx) itself.
  • the total length of the first ssPN molecule is not particularly limited.
  • the lower limit of the total number of bases is, for example, 38 bases, preferably 42 bases, more preferably 44 bases, further preferably 48
  • the upper limit is, for example, 300 bases, preferably 200 bases, more preferably 150 bases, still more preferably 100 bases, and particularly preferably 80 bases.
  • Specific examples of the total number of bases in the full length of the first ssPN molecule are 38 to 300 bases, 42 to 200 bases, 44 to 150 bases, 48 to 100 bases, and 48 to 80 bases.
  • the lower limit of the total number of bases excluding the linker region (Lx) is, for example, 38 bases, preferably 42 bases, more preferably 44 bases, and the upper limit is For example, it is 300 bases, preferably 200 bases, more preferably 150 bases, still more preferably 100 bases, particularly preferably 80 bases.
  • Specific examples of the total number of bases excluding the linker region (Lx) are 38 to 300 bases, 42 to 200 bases, 42 to 150 bases, 44 to 100 bases, and 44 to 80 bases.
  • Lx is a linker region Lx and represents L-proline diamide amidite of the following structural formula.
  • a preferred first ssPN molecule contains a sequence that suppresses expression of the NEK6 gene selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, and consists of only the region (X), the linker region (Lx) and the region (Xc)
  • the region (Xc), the linker region (Lx) and the region (X) are arranged in this order from the 'side to the 3' side
  • the linker region (Lx) has a non-nucleotide structure including at least one of a pyrrolidine backbone and a piperidine backbone, And the said area
  • the region (Xc) is the above-mentioned single-stranded nucleic acid which is completely complementary to the whole region or a partial region of the region (X). Particularly preferred is the above single-stranded nucleic acid molecule, wherein said region (X) comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-25.
  • the second ssPN molecule further includes a region (Y) and the region (Y) in addition to the region (X), the linker region (Lx) and the region (Xc).
  • Y) is a molecule having a region (Yc) complementary to Y).
  • the region (X) and the region (Y) are linked to form an inner region (Z).
  • the description of the first ssPN molecule can be incorporated into the second ssPN molecule unless otherwise indicated.
  • the second ssPN molecule includes, for example, the region (Xc), the linker region (Lx), the region (X), the region (Y), and the region (Yc) from the 5 'side to the 3' side. , And may be in the above order.
  • the region (Xc) is the 5 'region (Xc)
  • the region (X) in the internal region (Z) is the internal 5' region (X)
  • the internal region (Z) The region (Y) is also referred to as an internal 3 'region (Y), and the region (Yc) is also referred to as a 3' region (Yc).
  • the second ssPN molecule is, for example, the region (Xc), the linker region (Lx), the region (X), the region (Y), and the region (Yc) from the 3 'side to the 5' side. ) May be included in the above order.
  • the region (Xc) is a 3'-side region (Xc)
  • the region (X) in the internal region (Z) is an internal 3'-region (X)
  • the internal region (Z) The region (Y) is also referred to as an internal 5 'region (Y), and the region (Yc) is also referred to as a 5' region (Yc).
  • the region (X) and the area (Y) are connected.
  • the region (X) and the region (Y) are, for example, directly linked, with no intervening sequence therebetween.
  • the internal area (Z) is defined as "the area (X) and the area (Y) are connected to each other" to indicate the arrangement relationship between the area (Xc) and the area (Yc).
  • the region (X) and the region (Y) are separate and separate regions in the use of the ssPN molecule. That is, for example, when the internal region (Z) has the expression suppression sequence, the expression suppression sequence is arranged in the internal region (Z) over the region (X) and the region (Y). It is also good.
  • the region (Xc) is complementary to the region (X).
  • the region (Xc) may have a sequence complementary to the entire region of the region (X) or a partial region thereof, and preferably, the entire region of the region (X) or the region thereof It comprises a sequence complementary to a partial region, or consists of the complementary sequence.
  • the region (Xc) may be, for example, complementary to the entire region complementary to the region (X) or the partial region complementary to it, or one or several bases may be non-complementary Good, but preferably complementary.
  • the one or more bases are, for example, 1 to 3 bases, preferably 1 or 2 bases.
  • the region (Yc) is complementary to the region (Y).
  • the region (Yc) may have a complementary sequence to the entire region of the region (Y) or a partial region thereof, and preferably, the entire region of the region (Y) or a partial region thereof Or a sequence complementary thereto, or consisting of said complementary sequence.
  • the region (Yc) may be, for example, complementary to the entire region complementary to the region (Y) or the partial region complementary to it, or one or several bases may be non-complementary Good, but preferably complementary.
  • the one or more bases are, for example, 1 to 3 bases, preferably 1 or 2 bases.
  • the expression suppression sequence is, for example, included in at least one of the internal region (Z) and the region (Xc) formed from the region (X) and the region (Y). And may further be included in the area (Yc).
  • it is a ssPN molecule in which the expression suppression sequence is contained in the internal region (Z).
  • the expression suppression sequence may be provided in any of the region (X) and the region (Y), and with the region (X) You may have the said expression suppression sequence over the said area
  • the second ssPN molecule may have, for example, one or two or more of the expression suppression sequences.
  • each expression suppression sequence is not particularly limited, and either one of the internal region (Z) and the region (Xc) It may be another area other than either the inner area (Z) or the area (Xc).
  • the region (Yc) and the region (Y) may be, for example, directly linked or may be linked indirectly.
  • direct linkage includes, for example, linkage by phosphodiester bond and the like.
  • a linker region (Ly) is provided between the region (Yc) and the region (Y), and the region (Yc) and the region (Y) are interposed via the linker region (Ly).
  • lifted is mention
  • the linker region (Ly) may be, for example, a linker consisting of the nucleotide residue or at least one of the pyrrolidine skeleton and the piperidine skeleton described above. It may be a linker having a non-nucleotide structure.
  • the linker region (Ly) can be represented, for example, by the formula (I), and the description of the formula (I) in the linker region (Lx) can be incorporated.
  • the region (Yc) and the region (Y) are linked to the linker region (Ly) via, for example, -OR 1 -or -OR 2- , respectively.
  • R 1 and R 2 may or may not be present, as in the linker region (Lx) described above.
  • the combination of the region (Xc) and the region (X), and the combination of the region (Yc) and the (Y) and the -OR 1 -and -OR 2- is not particularly limited, and, for example, One of the following conditions can be mentioned.
  • Condition (1) The region (Xc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 2 -and the region (X) via -OR 1-
  • the region (Yc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 1 -and the region (Y) via -OR 2- .
  • the region (Xc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 2 -and the region (X) via -OR 1-
  • the region (Yc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 2 -and the region (Y) via -OR 1- .
  • Condition (3) The region (Xc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 1- , the region (X) via -OR 2- ,
  • the region (Yc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 1 -and the region (Y) via -OR 2- .
  • the region (Xc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 1- , the region (X) via -OR 2- ,
  • the region (Yc) is linked to the structure of the formula (I) via -OR 2 -and the region (Y) via -OR 1- .
  • FIG. 3A is, as an example, a schematic view showing an outline of the order of the respective regions from the 5 'side to the 3' side of the ssPN molecule
  • FIG. 3B is a schematic diagram showing the ssPN molecule
  • Fig. 6 is a schematic view showing a state in which a double chain is formed in the molecule.
  • the ssPN molecule has a double strand between the region (Xc) and the region (X), and between the region (Y) and the region (Yc).
  • the Lx area and the Ly area have a loop structure according to their lengths.
  • FIG. 3 shows only the connection order of the respective regions and the positional relationship of the respective regions forming the double chain, and for example, the length of each region, the shape of the linker region and the like are not limited thereto.
  • FIG. 3 showed the said area
  • the number of bases in the region (Xc), the region (X), the region (Y) and the region (Yc) is not particularly limited.
  • the length of each region is exemplified below, but the present invention is not limited thereto.
  • the region (Xc) may, for example, be complementary to the entire region of the region (X).
  • the region (Xc) has, for example, the same base length as the region (X) and has a base sequence complementary to the entire region of the region (X).
  • the region (Xc) is more preferably the same base length as the region (X), and all the bases of the region (Xc) are complementary to all the bases of the region (X) .
  • the region (Xc) may be complementary to, for example, a partial region of the region (X).
  • the region (Xc) has, for example, the same base length as the partial region of the region (X), that is, consists of a base sequence having a base length one base or more shorter than the region (X).
  • the region (Xc) is more preferably the same base length as the partial region of the region (X), and all the bases of the region (Xc) are the same as the partial region of the region (X).
  • the partial region of the region (X) is, for example, a region consisting of a base sequence which continues from the base at the end on the region (Xc) side (the first base) in the region (X).
  • the region (Yc) may, for example, be complementary to the entire region of the region (Y).
  • the region (Yc) has, for example, the same base length as the region (Y) and has a base sequence complementary to the entire region of the region (Y).
  • the region (Yc) is more preferably the same base length as the region (Y), and all the bases in the region (Yc) are complementary to all the bases in the region (Y). .
  • the region (Yc) may be complementary to, for example, a partial region of the region (Y).
  • the region (Yc) has, for example, the same base length as the partial region of the region (Y), that is, consists of a base sequence having a base length one base or more shorter than the region (Y).
  • the region (Yc) is more preferably the same base length as the partial region of the region (Y), and all the bases of the region (Yc) are the same as the partial region of the region (Y).
  • the partial region of the region (Y) is, for example, a region consisting of a base sequence which continues from the base at the end on the region (Yc) side (the first base) in the region (Y).
  • the relationship between the number of bases (Z) in the internal region (Z) and the number of bases (Xc) in the region (Xc) and the number of bases (Yc) in the region (Yc) is, for example, Meet the requirements of 2).
  • Z X + Y (1)
  • the relationship between the number of bases (X) in the region (X) and the number of bases (Y) in the region (Y) is not particularly limited. .
  • the difference in the number of bases (Yc) of (Yc) preferably satisfies, for example, the following condition.
  • X-Xc 0 ...
  • Y-Yc 1 to 10, preferably 1, 2, 3 or 4, More preferably 1, 2 or 3 ...
  • C The conditions of the following formulas (15) and (16) are satisfied.
  • X-Xc 1 to 10, preferably 1, 2 or 3, More preferably, 1 or 2
  • Y-Yc 1 to 10, preferably 1, 2 or 3, More preferably, 1 or 2 (16)
  • D The conditions of the following formulas (17) and (18) are satisfied.
  • X-Xc 0 ... (17)
  • Y-Yc 0 ... (18)
  • FIG. 4 shows ssPN including the linker region (Lx) and the linker region (Ly), (A) ssPN molecule of (a), (B) ssPN molecule of (b), C) is an example of the ssPN molecule of (c), and (D) is an example of the ssPN molecule of (d).
  • dotted lines indicate the state in which duplexes are formed by self-annealing.
  • FIG. 4 is a schematic view showing the relationship between the region (X) and the region (Xc) and the relationship between the region (Y) and the region (Yc) to the last, for example, the length of each region
  • the shape, the presence or absence of the linker region (Ly), and the like are not limited thereto.
  • the structure has a base which is not aligned with any of the region (Xc) and the region (Yc) in the internal region (Z) and has a base which does not form a duplex.
  • the base not to be aligned also referred to as a base which does not form a double strand
  • the free base region is indicated by “F”.
  • the number of bases in the region (F) is not particularly limited.
  • the number of bases (F) of the region (F) is, for example, the number of bases of “X-Xc” in the case of the ssPN molecule of the above (a), and in the case of the ssPN molecule of the above (b), “Y-Yc In the case of the ssPN molecule of (c), it is the total number of "X-Xc" bases and "Y-Yc" bases.
  • the ssPN molecule of (d) is, for example, a structure in which the entire region of the inner region (Z) is aligned with the region (Xc) and the region (Yc). It can be said that the region is a structure forming a double chain. In the ssPN molecule of (d), the 5 'end of the region (Xc) and the 3' end of the region (Yc) are not linked.
  • the total number of bases of the free base (F) in the region (Xc), the region (Yc), and the inner region (Z) is the number of bases in the inner region (Z). Therefore, the length of the region (Xc) and the length of the region (Yc) can be appropriately determined according to, for example, the length of the inner region (Z), the number of free bases, and the position thereof.
  • the number of bases in the internal region (Z) is, for example, 19 or more.
  • the lower limit of the number of bases is, for example, 19 bases, preferably 20 bases, and more preferably 21 bases.
  • the upper limit of the number of bases is, for example, 50 bases, preferably 40 bases, and more preferably 30 bases.
  • Specific examples of the number of bases in the internal region (Z) are, for example, 19 to 50 bases, 20 to 40 bases, 21 to 30 bases, and 21 to 25 bases.
  • the internal region (Z) may be, for example, a region constituted of only the expression suppression sequence or a region containing the expression suppression sequence.
  • the number of bases of the expression suppression sequence is, for example, 15 to 30 bases, preferably 19 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases, and still more preferably 21, 22 or 23 bases. , Particularly preferably 23 bases.
  • the internal region (Z) may further have an additional sequence on the 5 'side and / or 3' side of the expression suppression sequence.
  • the number of bases of the addition sequence is, for example, 1 to 31 bases, preferably 1 to 21 bases, more preferably 1 to 11 bases, and still more preferably 1 to 7 bases. More preferably, it is 1 to 3 bases.
  • the number of bases in the region (Xc) is, for example, 1 to 49 bases, preferably 1 to 39 bases, and more preferably 1 to 29 bases.
  • the number of bases in the region (Yc) is, for example, 1 to 49 bases, preferably 1 to 39 bases, and more preferably 1 to 29 bases.
  • the number of bases in any one of the regions (Xc) and (Yc) is preferably 1 to 4 bases, more preferably 1 base, 2 bases or 3 bases.
  • the number of bases in the internal region (Z), the region (Xc) and the region (Yc) can be represented, for example, by “Z ⁇ Xc + Yc” in the formula (2).
  • the number of bases of “Xc + Yc” is, for example, the same as the internal region (Z) or smaller than the internal region (Z).
  • “Z- (Xc + Yc)” is, for example, 1-10, preferably 1-4, more preferably 1, 2 or 3.
  • the “Z ⁇ (Xc + Yc)” corresponds to, for example, the number of bases (F) of the free region (F) in the inner region (Z).
  • the lengths of the linker region (Lx) and the linker region (Ly) are not particularly limited.
  • the linker region (Lx) is as described above.
  • the lower limit of the number of bases of the linker region (Ly) is, for example, 1 base, preferably 2 bases, more preferably 3 bases
  • the upper limit is, for example, 100 bases, preferably 80 bases, more preferably 50 bases.
  • Specific examples of the number of bases in each of the linker regions include 1 to 50 bases, 1 to 30 bases, 1 to 20 bases, 1 to 10 bases, 1 to 7 bases, and 1 to 4 bases. It is not limited to this.
  • the linker region (Ly) is preferably a structure that does not cause self-annealing within its own region.
  • the linker region (Ly) may be, for example, the same as or different from the linker region (Lx).
  • the total length of the second ssPN molecule is not particularly limited.
  • the lower limit of the total number of bases is, for example, 38 bases, preferably 42 bases, more preferably 44 bases, further preferably 48 It is a base, particularly preferably 50 bases, and the upper limit thereof is, for example, 300 bases, preferably 200 bases, more preferably 150 bases, still more preferably 100 bases, particularly preferably 80 It is a base.
  • Specific examples of the total number of bases in the entire length of the second ssPN molecule are 38 to 300 bases, 42 to 200 bases, 44 to 150 bases, 48 to 100 bases, and 50 to 80 bases.
  • the lower limit of the total number of bases excluding the linker region (Lx) and the linker region (Ly) is, for example, 38 bases, preferably 42 bases, more preferably 44 bases More preferably 48 bases, particularly preferably 50 bases, and the upper limit is, for example, 300 bases, preferably 200 bases, more preferably 150 bases, still more preferably 100 bases It is more preferably 80 bases, particularly preferably 60 bases.
  • Specific examples of the total number of bases excluding the linker region (Lx) are 38 to 300 bases, 42 to 200 bases, 44 to 150 bases, 48 to 100 bases, 48 to 80 bases, and 50 to 60 bases.
  • the linker region (Lx) may have the non-nucleotide structure, and the other constituent units are not particularly limited.
  • the constituent unit include nucleotide residues and the like.
  • the nucleotide residues include, for example, ribonucleotide residues and deoxyribonucleotide residues.
  • Examples of the nucleotide residue include non-modified unmodified nucleotide residues and modified modified nucleotide residues.
  • the ssPN molecule can improve nuclease resistance and stability, for example, by including the modified nucleotide residue.
  • the ssPN molecule may further contain, for example, non-nucleotide residues in addition to the nucleotide residues.
  • the constituent units of the region (Xc), the region (X), the region (Y) and the region (Yc) are preferably the nucleotide residues respectively.
  • Each of the regions is composed of, for example, the following residues (1) to (3).
  • (1) Unmodified nucleotide residue (2) Modified nucleotide residue
  • the linker region (Lx) may be composed of only the non-nucleotide residue, for example Or the non-nucleotide and the nucleotide residue.
  • the linker region (Lx) is composed of, for example, the following residues (4) to (7).
  • non-nucleotide residue non-nucleotide residue and non-modified nucleotide residue (6) non-nucleotide residue and modified nucleotide residue (7) non-nucleotide residue, non-modified nucleotide residue and modified nucleotide residue
  • the constituent unit of the linker region (Ly) is not particularly limited, and examples thereof include the nucleotide residue and the non-nucleotide residue.
  • the linker region may be composed, for example, of only the nucleotide residue, only the non-nucleotide residue, or may be composed of the nucleotide residue and the non-nucleotide residue.
  • the linker region is composed of, for example, the following residues (1) to (7).
  • the ssPN molecule examples include, except for the linker region (Lx), a molecule composed only of the nucleotide residue, a molecule containing the non-nucleotide residue in addition to the nucleotide residue, and the like.
  • the nucleotide residue may be, for example, only the unmodified nucleotide residue or only the modified nucleotide residue, or both the unmodified nucleotide residue and the modified nucleotide residue. It is also good.
  • the number of modified nucleotide residues is not particularly limited, and is, for example, “one or several”, specifically, For example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • the number of non-nucleotide residues is not particularly limited, and is, for example, "one or several", specifically, for example, one or two is there.
  • the nucleotide residue is preferably, for example, a ribonucleotide residue.
  • the ssPN molecule of the present invention is also referred to, for example, as a "P-ssRNA molecule".
  • P-ssRNA molecule include, except for the linker region (Lx), a molecule composed only of the ribonucleotide residue, a molecule containing the non-nucleotide residue in addition to the ribonucleotide residue, and the like.
  • the ribonucleotide residue may be, for example, only the unmodified ribonucleotide residue, or only the modified ribonucleotide residue, or the unmodified ribonucleotide residue and the modified ribosome. It may contain both nucleotide residues.
  • the P-ssRNA molecule includes, for example, the modified ribonucleotide residue in addition to the non-modified ribonucleotide residue
  • the number of the modified ribonucleotide residue is not particularly limited. Specifically, it is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • the modified ribonucleotide residue relative to the non-modified ribonucleotide residue include the deoxyribonucleotide residue and the like in which a ribose residue is substituted with a deoxyribose residue.
  • the number of deoxyribonucleotide residues is not particularly limited, for example, “one or several”. Specifically, it is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • a preferred ssPN molecule for suppressing the expression of the NEK6 gene includes an expression suppression sequence of the NEK6 gene selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, and the region (Xc), linker region (Lx), region (X), region (Y), The linker region (Ly) and the region (Yc) are contained in this order from the 5 'side to the 3' side, The area (X) and the area (Y) are connected to form an inner area (Z), Said region (Xc) is complementary to said region (X), The region (Yc) is complementary to the region (Y), And the linker region (Lx) and the linker region (Ly) have a non-nucleotide structure including at least one of a pyrrolidine backbone and a piperidine backbone, The internal region (Z) can be exemplified by a single-stranded nucleic acid molecule containing the above-mentioned expression suppression sequence.
  • the ssNc molecule which is one of the nucleic acids which suppresses the expression of NEK6 gene is explained.
  • the ssNc molecule means a single-stranded RNA nucleic acid molecule disclosed in WO2012 / 05368, and specifically as follows.
  • the ssNc molecule is a single-stranded nucleic acid molecule containing an expression suppression sequence that suppresses the expression of a target gene, and From the 5 'side to the 3' side, the 5 'side region (Xc), the internal region (Z) and the 3' side region (Yc) are contained in the above order,
  • the internal region (Z) is constituted by linking the internal 5 'region (X) and the internal 3' region (Y),
  • the 5 'region (Xc) is complementary to the internal 5' region (X),
  • the 3 'region (Yc) is complementary to the inner 3' region (Y), At least one of the internal region (Z), the 5 'region (Xc), and the 3' region (Yc) includes the expression suppression sequence.
  • the ssNc molecule is not linked at its 5 'end and 3' end, and may be referred to as a linear single-stranded nucleic acid molecule.
  • the ssNc molecule of the present invention for example, in the internal region (Z), the internal 5 'region (X) and the internal 3' region (Y) are directly linked.
  • the 5 'region (Xc) is complementary to the internal 5' region (X), and the 3 'region (Yc) is complementary to the internal 3' region (Y) It is Therefore, on the 5 'side, the region (Xc) is folded toward the region (X), and the region (Xc) and the region (X) can form a double strand by self-annealing. Also, on the 3 'side, the region (Yc) is folded toward the region (Y), and the region (Yc) and the region (Y) can form a double strand by self-annealing. .
  • the ssNc molecule can thus form a duplex within the molecule, eg double stranded RNA due to annealing of two separated single stranded RNAs like siRNA used for conventional RNA interference It is an apparently different structure from what forms.
  • the said expression suppression sequence in ssNc molecule can use description of ssPN molecule.
  • the suppression of NEK6 gene expression by ssNc molecules can be achieved, for example, by placing the expression suppression sequence in at least one of the internal region (Z), the 5 'region (Xc) and the 3' region (Yc). It is presumed that this is due to the occurrence of RNA interference or a phenomenon similar to RNA interference (RNA interference-like phenomenon).
  • the mechanism of the ssNc molecule is not limited as well as the mechanism of the ssPN molecule.
  • ssNc molecules are not introduced into cells etc. as dsRNA consisting of two single-stranded RNAs, as in so-called siRNAs, and in cells, excision of the expression suppression sequence is not necessarily essential. Absent. Therefore, ssNc molecules can also be said to have, for example, RNA interference-like functions.
  • the expression suppression sequence is included in at least one of the internal region (Z), the 5 'region (Xc), and the 3' region (Yc).
  • the ssNc molecule may have, for example, one or two or more of the expression suppression sequences. In the latter case, for example, the ssNc molecule may have two or more of the same expression suppression sequences for the NEK6 gene, or may have two or more different expression suppression sequences for the NEK6 gene.
  • each expression suppression sequence is not particularly limited, and the internal region (Z), the 5 'side region (Xc) and the 3' side It may be any one of the regions (Yc) or may be different regions.
  • the inner region (Z) is connected to the inner 5 'region (X) and the inner 3' region (Y).
  • the region (X) and the region (Y) are, for example, directly linked, with no intervening sequence therebetween.
  • the internal region (Z) may be referred to as "the internal 5 'region (X) and the internal 3' side to indicate the sequence relationship between the 5 'region (Xc) and the 3' region (Yc).
  • “The region (Y) is formed by linking”, and in the internal region (Z), the internal 5 ′ side region (X) and the internal 3 ′ side region (Y) are, for example,
  • the use of the ssNc molecule is not limited to being a separate and independent region. That is, for example, when the internal region (Z) has the expression suppression sequence, the expression suppression sequence is arranged in the internal region (Z) over the region (X) and the region (Y). It is also good.
  • the 5 'region (Xc) is complementary to the inner 5' region (X).
  • the region (Xc) may have a sequence complementary to the entire region of the region (X) or a partial region thereof, and specifically, for example, the region (X) It is preferable to include a sequence complementary to the entire region or a partial region thereof, or consist of the complementary sequence.
  • the region (Xc) may be, for example, completely complementary, or one or several bases are non-complementary to the entire region complementary to the region (X) or the partial region complementary to the region (X). Although they may be complementary, they are preferably complementary.
  • the 3 'region (Yc) is complementary to the inner 3' region (Y).
  • the region (Yc) may have a complementary sequence to the entire region of the region (Y) or a partial region thereof, and specifically, for example, the entire region of the region (Y) Alternatively, it is preferable to include a sequence complementary to the partial region or consist of the complementary sequence.
  • the region (Yc) may be, for example, completely complementary, or one or several bases are non-complementary to the entire region complementary to the region (Y) or the partial region complementary to the region (Y). Although they may be complementary, they are preferably complementary.
  • the one or more bases are, for example, 1 to 3 bases, preferably 1 or 2 bases.
  • the 5'-side region (Xc) and the internal 5'-side region (X) may be, for example, directly linked or may be linked indirectly.
  • direct linkage includes, for example, linkage by phosphodiester bond.
  • a linker region (Lx) is provided between the region (Xc) and the region (X), and the region (Xc) and the region (X) are interposed via the linker region (Lx).
  • the 3 'side region (Yc) and the inner 3' side region (Y) may be directly linked or may be indirectly linked.
  • direct linkage includes, for example, linkage by phosphodiester bond.
  • a linker region (Ly) is provided between the region (Yc) and the region (Y), and the region (Yc) and the region (Y) are interposed via the linker region (Ly).
  • lifted is mention
  • the ssNc molecule may have, for example, both the linker region (Lx) and the linker region (Ly), or may have one or the other.
  • the linker region (Lx) is provided between the 5 'region (Xc) and the internal 5' region (X), and the 3 'region (Yc) and the internal 3' A mode is exemplified in which the linker region (Ly) is not provided between the side regions (Y), that is, the region (Yc) and the region (Y) are directly linked.
  • the linker region (Ly) is provided between the 3 'region (Yc) and the inner 3' region (Y), and the 5 'region (Xc) and the inner region
  • the linker region (Lx) is not provided between the 5 'side region (X), that is, a form in which the region (Xc) and the region (X) are directly linked is mentioned.
  • linker region (Lx) and the linker region (Ly) each have a structure that does not cause self-annealing within their own region.
  • FIG. 5 (A) is a schematic view showing an outline of the order of the respective regions from the 5 ′ side to the 3 ′ side of the ssNc molecule
  • FIG. 5 (B) is a schematic diagram showing the ssNc molecule is the molecule It is a schematic diagram which shows the state which has formed the double chain inside.
  • the ssNc molecule is folded between the 5 'side region (Xc) and the internal 5' side region (X) so that the 5 'side region (Xc) is folded.
  • FIG. 5 shows only the connection order of the respective regions and the positional relationship of the respective regions forming the double chain, and for example, the length of each region is not limited thereto.
  • FIG. 3A is, as an example, a schematic view showing an outline of the order of the respective regions from the 5 'side to the 3' side of the ssNc molecule
  • FIG. 3B is a schematic diagram showing the ssNc molecule
  • Fig. 6 is a schematic view showing a state in which a double chain is formed in the molecule. As shown in FIG.
  • FIG. 3 shows only the connection order of the respective regions and the positional relationship of the respective regions forming the double chain, and for example, the length of each region is not limited thereto.
  • the number of bases of the 5 'side region (Xc), the internal 5' side region (X), the internal 3 'side region (Y) and the 3' side region (Yc) is not particularly limited.
  • the 5 'region (Xc) may, for example, be complementary to the entire region of the internal 5' region (X).
  • the region (Xc) has, for example, the same base length as the region (X), and is composed of a nucleotide sequence complementary to the entire region from the 5 'end to the 3' end of the region (X). preferable.
  • the region (Xc) is more preferably the same base length as the region (X), and all the bases of the region (Xc) are complementary to all the bases of the region (X) Is preferred. In addition, it is not restrict
  • the 5'-side region (Xc) may be complementary to, for example, a partial region of the inner 5'-side region (X).
  • the region (Xc) has, for example, the same base length as the partial region of the region (X), that is, consists of a base sequence having a base length one base or more shorter than the region (X) preferable.
  • the region (Xc) is more preferably the same base length as the partial region of the region (X), and all the bases of the region (Xc) are the same as the partial region of the region (X). Preferably, they are complementary to all the bases.
  • the partial region of the region (X) is, for example, a region (segment) consisting of a base sequence continuous from the base at the 5 'end (the first base) in the region (X).
  • the 3 'side region (Yc) may be, for example, complementary to the entire region of the inner 3' side region (Y).
  • the region (Yc) has, for example, the same base length as the region (Y), and is composed of a nucleotide sequence complementary to the entire region from the 5 'end to the 3' end of the region (Y).
  • the region (Yc) is more preferably the same base length as the region (Y), and all the bases in the region (Yc) are complementary to all the bases in the region (Y). Is preferred. In addition, it is not restrict
  • the 3 'side region (Yc) may be complementary to, for example, a partial region of the inner 3' side region (Y).
  • the region (Yc) has, for example, the same base length as the partial region of the region (Y), that is, consists of a base sequence having a base length one base or more shorter than the region (Y).
  • the region (Yc) is more preferably the same base length as the partial region of the region (Y), and all the bases of the region (Yc) are the same as the partial region of the region (Y).
  • they are complementary to all the bases.
  • the partial region of the region (Y) is preferably, for example, a region (segment) consisting of a base sequence continuous from the base at the 3 'end (the first base) in the region (Y).
  • the relationship between the number of bases (X) in the internal 5 'side region (X) and the length of the number of bases (Y) in the internal 3' side region (Y) is not particularly limited. Any condition of the formula may be satisfied.
  • X Y (19) X ⁇ Y (20) X> Y (21)
  • the difference between the number of bases (Y) of Y) and the number of bases (Yc) of the 3'-side region (Yc) preferably satisfies, for example, the following condition.
  • X-Xc 0 ...
  • Y-Yc 1 to 10, preferably 1, 2, 3 or 4, More preferably 1, 2 or 3 ...
  • C The conditions of the following formulas (15) and (16) are satisfied.
  • X-Xc 1 to 10, preferably 1, 2 or 3, More preferably, 1 or 2
  • Y-Yc 1 to 10, preferably 1, 2 or 3, More preferably, 1 or 2 (16)
  • D The conditions of the following formulas (17) and (18) are satisfied.
  • X-Xc 0 ... (17)
  • Y-Yc 0 ... (18)
  • FIG. 4 shows ssNc including the linker region (Lx) and the linker region (Ly), where (A) is the ssNc molecule of (a), (B) is the ssNc molecule of (b), C) is an example of the ssNc molecule of (c), and (D) is an example of the ssNc molecule of (d).
  • dotted lines indicate the state in which duplexes are formed by self-annealing.
  • FIG. 4 shows the relationship between the inner 5 'side region (X) and the 5' side region (Xc), and between the inner 3 'side region (Y) and the 3' side region (Yc)
  • the length, shape, etc. of each region are not limited to this, and the presence or absence of a linker region (Lx) and a linker region (Ly) is also not limited to this.
  • the ssNc molecules of (a) to (c) are, for example, the 5 'side region (Xc) and the internal 5' side region (X), and the 3 'side region (Yc) and the internal 3' side
  • the structure (Y) has a base which can not be aligned with any of the 5 'side region (Xc) and the 3' side region (Yc) in the internal region (Z) by forming a double chain respectively. It can be said that the structure has a base that does not form a duplex.
  • the base that can not be aligned also referred to as a base that does not form a duplex
  • free base region is indicated by “F”.
  • the number of bases in the region (F) is not particularly limited.
  • the number of bases (F) in the region (F) is, for example, the number of bases of “X-Xc” in the case of the ssNc molecule in the above (a), and in the case of the ssNc molecule in the above (b), “Y-Yc In the case of the ssNc molecule of (c), the total number of bases of “X-Xc” and “Y-Yc”.
  • the ssNc molecule of (d) is, for example, a structure in which the entire region of the internal region (Z) aligns with the 5 'region (Xc) and the 3' region (Yc); It can be said that the entire region of the region (Z) forms a double chain.
  • the 5 'end of the 5' side region (Xc) and the 3 'end of the 3' side region (Yc) are unconnected.
  • the total number of bases of the free base (F) in the 5 'side region (Xc), the 3' side region (Yc), and the internal region (Z) is, for example, the number of bases of the internal region (Z) It becomes. Therefore, the lengths of the 5 'side region (Xc) and the 3' side region (Yc) depend on, for example, the length of the internal region (Z), the number (F) of the free bases, and their positions. Can be determined accordingly.
  • the number of bases in the internal region (Z) is, for example, 19 or more.
  • the lower limit of the number of bases is, for example, 19 bases, preferably 20 bases, and more preferably 21 bases.
  • the upper limit of the number of bases is, for example, 50 bases, preferably 40 bases, and more preferably 30 bases.
  • Specific examples of the number of bases in the internal region (Z) are, for example, 19 to 50 bases, 20 to 40 bases, 21 to 30 bases, and 21 to 23 bases.
  • the internal region (Z) may be, for example, a region constituted of only the expression suppression sequence or a region containing the expression suppression sequence.
  • the number of bases of the expression suppression sequence is, for example, 15 to 30 bases, preferably 19 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases, and still more preferably 21, 22 or 23 bases. Particularly preferred is 23 bases.
  • the internal region (Z) contains the expression suppression sequence it may further have an additional sequence on the 5 'side and / or 3' side of the expression suppression sequence.
  • the number of bases of the addition sequence is, for example, 1 to 31 bases, preferably 1 to 21 bases, more preferably 1 to 11 bases, and still more preferably 1 to 7 bases. More preferably, it is 1 to 3 bases.
  • the number of bases in the 5'-side region (Xc) is, for example, 1 to 49 bases, preferably 1 to 39 bases, and more preferably 1 to 29 bases.
  • the number of bases in the 3'-side region (Yc) is, for example, 1 to 49 bases, preferably 1 to 39 bases, and more preferably 1 to 29 bases.
  • the number of bases in one of the 5 'side region (Xc) and the 3' side region (Yc) is preferably 1 to 4 bases, more preferably 1 base, 2 bases, 3 bases.
  • the number of bases of the internal region (Z), the 5 'side region (Xc) and the 3' side region (Yc) can be represented, for example, by "Z X Xc + Yc" of the formula (2).
  • the number of bases of “Xc + Yc” is, for example, the same as the internal region (Z) or smaller than the internal region (Z).
  • “Z- (Xc + Yc)” is, for example, 1-10, preferably 1-4, more preferably 1, 2 or 3.
  • the “Z ⁇ (Xc + Yc)” corresponds to, for example, the number of bases (F) of the free base region (F) in the inner region (Z).
  • the lengths of the linker region (Lx) and the linker region (Ly) are not particularly limited.
  • the linker region (Lx) preferably has a length such that the inner 5 'side region (X) and the 5' side region (Xc) can form a double strand, for example, and the linker region (Ly)
  • the length is such that the inner 3 'region (Y) and the 3' region (Yc) can form a double strand, for example.
  • the linker region (Lx) and the constituent unit of the linker region (Ly) contain a base
  • the numbers of bases of the linker region (Lx) and the linker region (Ly) may be the same or different.
  • the base sequences may also be the same or different.
  • the lower limit of the number of bases of the linker region (Lx) and the linker region (Ly) is, for example, 1 base, preferably 2 bases, more preferably 3 bases, and the upper limit thereof is, for example, It is 100 bases, preferably 80 bases, more preferably 50 bases.
  • Specific examples of the number of bases in each of the linker regions include 1 to 50 bases, 1 to 30 bases, 1 to 20 bases, 1 to 10 bases, 1 to 7 bases, and 1 to 4 bases. It is not limited to this.
  • the total length of the ssNc molecule is not particularly limited.
  • the lower limit of the total number of bases is, for example, 38 bases, preferably 42 bases, more preferably 50 bases, still more preferably 51 bases
  • the upper limit is, for example, 300 bases, preferably 200 bases, more preferably 150 bases, still more preferably 100 bases, and still more preferably 80 It is a base, particularly preferably 60 bases.
  • Specific examples of the total number of bases in the full length of the ssNc molecule are 38 to 300 bases, 42 to 200 bases, 50 to 150 bases, 51 to 100 bases and 52 to 80 bases.
  • the lower limit of the total number of bases excluding the linker region (Lx) and the linker region (Ly) is, for example, 38 bases, preferably 42 bases, more preferably 50 bases, and further The number of bases is preferably 51 bases, particularly preferably 52 bases, and the upper limit is, for example, 300 bases, preferably 200 bases, more preferably 150 bases, still more preferably 100 bases. Preferably 80 bases, particularly preferably 60 bases. Specific examples of the total number of bases excluding the linker region (Lx) are 38 to 300 bases, 42 to 200 bases, 50 to 150 bases, 51 to 100 bases, 52 to 80 bases and 52 to 60 bases.
  • the nucleotide residues that are the main constituent units of the ssNc molecule include, for example, ribonucleotide residues and deoxyribonucleotide residues.
  • the nucleotide residues include, for example, unmodified nucleotide residues which have not been modified and modified nucleotide residues which have been modified.
  • the ssNc molecule can improve nuclease resistance and stability, for example, by including the modified nucleotide residue.
  • the ssNc molecule of the present invention may further contain, for example, non-nucleotide residues in addition to the above-mentioned nucleotide residues.
  • the constituent units of the internal region (Z), the 5 'region (Xc) and the 3' region (Yc) are preferably the nucleotide residues respectively.
  • Each of the regions is composed of, for example, the following residues (1) to (3). (1) unmodified nucleotide residue (2) modified nucleotide residue (3) unmodified nucleotide residue and modified nucleotide residue
  • the constituent units of the linker region (Lx) and the linker region (Ly) are not particularly limited, and examples thereof include the nucleotide residue and the non-nucleotide residue.
  • the linker region may be composed, for example, of only the nucleotide residue, only the non-nucleotide residue, or may be composed of the nucleotide residue and the non-nucleotide residue.
  • the linker region is composed of, for example, the following residues (1) to (7).
  • both constitutional units may be the same or different.
  • a form in which a constituent unit of both linker regions is the nucleotide residue
  • a form in which a constituent unit of both linker regions is the non-nucleotide residue
  • a constituent unit of one region is the nucleotide residue
  • forms in which the constituent unit of the other linker region is a non-nucleotide residue.
  • the ssNc molecule examples include a molecule composed of only the nucleotide residue, a molecule containing the non-nucleotide residue in addition to the nucleotide residue, and the like.
  • the nucleotide residue may be, for example, only the unmodified nucleotide residue or only the modified nucleotide residue, or both of the unmodified nucleotide residue and the modified nucleotide residue.
  • the number of modified nucleotide residues is not particularly limited, and is, for example, “one or several”, specifically, For example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • the number of non-nucleotide residues is not particularly limited, and is, for example, "one or several", specifically, for example, 1 to 8, One to six, one to four, one, two or three.
  • the nucleotide residue is preferably, for example, a ribonucleotide residue.
  • the ssNc molecule of the present invention is also referred to, for example, as an "N-ssRNA molecule".
  • N-ssRNA molecule examples include a molecule composed of only the ribonucleotide residue, and a molecule containing the non-nucleotide residue in addition to the ribonucleotide residue.
  • the ribonucleotide residue may be, for example, only the unmodified ribonucleotide residue, or only the modified ribonucleotide residue, or the unmodified ribonucleotide residue and the modified ribosome. It may contain both nucleotide residues.
  • the N-ssRNA molecule includes, for example, the modified ribonucleotide residue in addition to the non-modified ribonucleotide residue
  • the number of the modified ribonucleotide residue is not particularly limited. Specifically, it is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • the modified ribonucleotide residue relative to the non-modified ribonucleotide residue may be, for example, the deoxyribonucleotide residue in which a ribose residue is substituted with a deoxyribose residue.
  • the number of deoxyribonucleotide residues is not particularly limited, and, for example, “one or several”. Specifically, it is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • Method of synthesizing ssPN molecule and ssNc molecule is not particularly limited, and a conventionally known method can be adopted.
  • the synthesis method include synthesis methods by genetic engineering methods, chemical synthesis methods and the like.
  • genetic engineering techniques include in vitro transcription synthesis methods, methods using vectors, methods using PCR cassettes, and the like.
  • the vector is not particularly limited, and examples thereof include non-viral vectors such as plasmids, viral vectors and the like.
  • the chemical synthesis method is not particularly limited, and examples thereof include a phosphoramidite method and an H-phosphonate method.
  • a commercially available automatic nucleic acid synthesizer can be used.
  • amidites are generally used.
  • the amidite is not particularly limited, and commercially available amidites such as RNA Phosphoramidites (2'-O-TBDMSi, trade name, Sansen Pharmaceutical), ACE amidite, TOM amidite, CEE amidite, CEM amidite, etc. Can be mentioned.
  • ssPN molecules and ssNc molecules of the present invention can be produced according to the production methods described in WO2012 / 05368, WO2012 / 17919, WO2013 / 27843, WO2016 / 159374.
  • Antisense Polynucleotide which is one of the nucleic acids suppressing the expression of the NEK6 gene is described below.
  • the antisense polynucleotide is an antisense DNA and / or an antisense RNA, and exerts an effect by introducing an antisense nucleic acid to a full length or a part of a target gene RNA into a cell.
  • the antisense polynucleotide preferably contains a modified nucleotide residue in view of binding stability (such as Tm value) with RNA, mismatch sequence recognition ability, nuclease resistance, RNase H activity and the like.
  • modified nucleotide residue modification to a ribose residue or phosphate backbone is preferable.
  • miRNA which is one of the nucleic acids that suppress the expression of the NEK6 gene is described below.
  • MiRNAs are involved in the regulation of gene expression through inhibition of mRNA to protein translation or degradation of mRNA.
  • miRNAs are short (20-25 bases) non-coding RNAs present in cells.
  • the miRNA is first transcribed from DNA as a single-stranded pri-RNA that includes the miRNA and its complementary strand and can form a hairpin loop structure.
  • pri-RNA is partially cleaved by an enzyme called Drosha in the nucleus to be transported to the nucleus as pre-RNA.
  • the pre-RNA is further cleaved by Dicer to function as a miRNA.
  • miRNAs perform incomplete hybridization binding to the 3 'untranslated region of mRNAs and inhibit the synthesis of proteins encoded by the mRNAs.
  • a miRNA that suppresses gene expression of NEK6 can be obtained, for example, according to a database such as miRDB (http://mirdb.org/miRDB/index.html) based on the gene name or mRNA sequence information of a target gene.
  • miRDB http://mirdb.org/miRDB/index.html
  • nucleotide residues used for the nucleic acid which is the active ingredient of the present invention include sugar, base and phosphoric acid as constituents.
  • the nucleotide residues include, for example, ribonucleotide residues and deoxyribonucleotide residues.
  • the ribonucleotide residue has, for example, a ribose residue as a sugar, and has adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and uracil (U) as bases
  • the deoxyribose residue is For example, it has a deoxyribose residue as a sugar, and has adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (T) as bases.
  • nucleotide residue examples include unmodified nucleotide residues and modified nucleotide residues.
  • the non-modified nucleotide residue is, for example, the same as or substantially the same as the naturally occurring one, preferably, the same or substantially the same as the one naturally occurring in the human body. .
  • the modified nucleotide residue is, for example, a nucleotide residue obtained by modifying the non-modified nucleotide residue.
  • any component of the non-modified nucleotide residue may be modified.
  • “modification” is, for example, substitution, addition and / or deletion of the component, substitution and / or deletion of atom and / or functional group in the component, and “modification”. be able to.
  • the modified nucleotide residue include naturally occurring nucleotide residues, artificially modified nucleotide residues and the like. For the naturally-occurring modified nucleotide residues, for example, refer to Limbach et al.
  • modified nucleotide residue may be, for example, a residue of an alternative to the nucleotide.
  • the modification of the nucleotide residue may be, for example, modification of a ribose-phosphate backbone (hereinafter, a ribophosphate backbone).
  • ribose residues can be modified in the ribophosphate backbone.
  • the ribose residue can be modified at the 2'-position carbon, and specifically, for example, a hydroxyl group bonded to the 2'-position carbon can be substituted with hydrogen, fluoro or the like.
  • the ribose residue can be substituted with deoxyribose by substituting the hydroxyl group at the 2'-position carbon with hydrogen.
  • the ribose residue may be substituted, for example, to a stereoisomer, for example, may be substituted to an arabinose residue.
  • the ribophosphate backbone may be substituted, for example, to a non-ribophosphate backbone having non-ribose residues and / or non-phosphate.
  • examples of the non-ribophosphate backbone include uncharged members of the above-described ribophosphate backbone.
  • Alternatives to the nucleotides substituted in the non-ribophosphate backbone include, for example, morpholino, cyclobutyl, pyrrolidine and the like. Other than the above, for example, artificial nucleic acid monomer residues and the like can be mentioned.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • ENA 2'-O, 4'-C-Ethylene bridged Nucleic Acids
  • a phosphate group can be modified in the ribophosphate backbone.
  • the phosphate group closest to the sugar residue is called the alpha phosphate group.
  • the alpha phosphate group is negatively charged, and its charge is uniformly distributed over the two oxygen atoms not bound to the sugar residue.
  • two oxygen atoms which are not bonded to the sugar residue in the phosphodiester bond between nucleotide residues are hereinafter also referred to as “non-linking oxygen”.
  • linking oxygen the two oxygen atoms linked to the sugar residue are hereinafter referred to as "linking oxygen”. It is preferable that, for example, the ⁇ -phosphate group be modified to be uncharged or to have an asymmetric charge distribution at the non-bonding atom.
  • the phosphate group may, for example, replace the non-bonding oxygen.
  • the oxygen is, for example, S (sulfur), Se (selenium), B (boron), C (carbon), H (hydrogen), N (nitrogen) and OR (R is, for example, an alkyl group or an aryl group) It can be substituted by any atom, preferably substituted by S.
  • the non-binding oxygen is preferably, for example, both substituted, and more preferably both substituted with S.
  • modified phosphate group examples include phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoroselerate, boranophosphate, boranophosphate ester, phosphonate hydrogen, phosphoroamidate, alkyl or aryl phosphonate, phosphotriester and the like. Preferred among these are phosphorodithioates in which the two non-linking oxygens are both substituted with S.
  • the phosphate group may, for example, replace the attached oxygen.
  • the oxygen can be substituted by, for example, any atom of S (sulfur), C (carbon) and N (nitrogen).
  • Examples of the modified phosphate group include cross-linked phosphoroamidates substituted with N, cross-linked phosphorothioates substituted with S, and cross-linked methylene phosphonates substituted with C.
  • the substitution of the binding oxygen is preferably performed, for example, at least one of the 5 'terminal nucleotide residue and the 3' terminal nucleotide residue of the ssPN molecule of the present invention, and in the case of the 5 'side, the substitution by C is preferable. In the case of the 'side, substitution by N is preferred.
  • the phosphate group may be substituted, for example, to the non-phosphorus-containing linker.
  • the linker is, for example, siloxane, carbonate, carboxymethyl, carbamate, amide, thioether, ethylene oxide linker, sulfonate, sulfonamide, thioform acetal, form acetal, oxime, methylene imino, methylene methyl imino, methylene hydrazo, methylene dimethyl Hydrazo, methylene oxymethyl imino and the like are preferable, and preferably, methylene carbonyl amino group and methylene methyl imino group are included.
  • the modification of the terminal nucleotide residue includes, for example, addition of other molecules.
  • the other molecules include labeling substances as described above, functional molecules such as protecting groups, and the like.
  • the protective group include S (sulfur), Si (silicon), B (boron), and an ester-containing group.
  • the other molecule may be attached to, for example, the phosphate group of the nucleotide residue, or may be attached to the phosphate group or the sugar residue via a spacer.
  • the terminal atom of the spacer can be added or substituted, for example, to the linked oxygen of the phosphate group or O, N, S or C of a sugar residue.
  • the binding site of the sugar residue is preferably, for example, C at the 3'position or C at the 5'position, or an atom binding thereto.
  • the spacer can also be added or substituted, for example, at the terminal atom of a nucleotide substitute such as the PNA.
  • the spacer is not particularly limited, and, for example,-(CH 2 ) n -,-(CH 2 ) n N-,-(CH 2 ) n O-,-(CH 2 ) n S-, O (CH 2) CH 2 O) n CH 2 CH 2 OH, abasic sugar, amide, carboxy, amine, oxyamine, oxyimine, thioether, disulfide, thiourea, sulfonamide, morpholino, etc., and also containing biotin reagent, fluorescein reagent, etc. Good.
  • the molecules to be added to the terminal may be, for example, dyes, intercalating agents (eg, acridine), crosslinkers (eg, psoralens, mitomycin C), porphyrins (TPPC4, texaphyrin, saffirins), polycyclic, etc.
  • intercalating agents eg, acridine
  • crosslinkers eg, psoralens, mitomycin C
  • porphyrins TPPC4, texaphyrin, saffirins
  • polycyclic etc.
  • Aromatic hydrocarbon eg phenazine, dihydrophenazine
  • artificial endonuclease eg EDTA
  • lipophilic carrier eg cholesterol, cholic acid, adamantane acetic acid, 1-pyrenebutyric acid, dihydrotestosterone, 1,3-bis- O (hexadecyl) glycerol, geranyl oxyhexyl group, hexadecyl glycerol, borneol, menthol, 1,3-propanediol, heptadecyl group, palmitic acid, myristic acid, O3- (oleoyl) lithocholic acid, O3- (oleoyl) call , Dimethoxytrityl, or phenoxazine) and peptide conjugates (e.g., antennapedia peptide, Tat peptide), alkylating agents, phosphate, amino, mercapto, P
  • the nucleic acid molecule may be modified at the 5 'end, for example, with a phosphate group or phosphate analog.
  • the phosphate group is, for example, 5 'monophosphate ((HO) 2 (O) PO-5'), 5 'diphosphate ((HO) 2 (O) PO-P (HO) (O) -O-5 '), 5'-triphosphate ((HO) 2 (O) P-O- (HO) (O) P-O-P (HO) (O) -O-5') , 5'-guanosine cap (7-methylated or unmethylated, 7m-G-O-5 '-(HO) (O) P-O- (HO) (O) P-O-P (HO) ( O) -O-5 '), 5'-adenosine cap (Appp), any modified or unmodified nucleotide cap structure (N-O-5'-(HO) (O) P-O- (HO) (O) ) P-O-
  • the base is not particularly limited.
  • the base may be, for example, a natural base or a non-natural base.
  • the base may be, for example, naturally derived or synthetic.
  • As the base for example, a general base, a modified analog thereof or the like can be used.
  • Examples of the base include purine bases such as adenine and guanine, and pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine.
  • Other examples of the base include inosine, thymine, xanthine, hypoxanthine, nubaularine, isoguanisine, tubercidine and the like.
  • the base includes, for example, alkyl derivatives such as 2-aminoadenine, 6-methylated purine and the like; alkyl derivatives such as 2-propylated purine; 5-halouracil and 5-halocytosine; 5-propynyluracil and 5-propynylcytosine; -Azouracil, 6-azocytosine and 6-azothymine; 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 5-halouracil, 5- (2-aminopropyl) uracil, 5-aminoallyluracil; 8-haloation, amination, Thiolated, thioalkylated, hydroxylated and other 8-substituted purines; 5-trifluoromethylated and other 5-substituted pyrimidines; 7-methyl guanine; 5-substituted pyrimidines; 6-aza pyrimidines; N-2, N -6, and O-6 substituted purines (including
  • alkyl includes, for example, a linear or branched alkyl group.
  • the carbon number of the alkyl is not particularly limited, and is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 6 or 1 to 4.
  • the alkyl group is, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-decyl and the like can be mentioned.
  • Preferred examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl and the like.
  • alkenyl includes, for example, linear or branched alkenyl.
  • alkenyl include those in the alkyl having one or more double bonds.
  • the carbon number of the alkenyl is not particularly limited, and is, for example, the same as the alkyl, preferably 2 to 8.
  • alkenyl include vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1,3-butadienyl, 3-methyl-2-butenyl and the like.
  • alkynyl includes, for example, linear or branched alkynyl.
  • alkynyl include the above alkyls having one or more triple bonds, and the like.
  • the carbon number of the alkynyl is not particularly limited, and is, for example, the same as the alkyl, preferably 2 to 8.
  • alkynyl include ethynyl, propynyl, butynyl and the like.
  • the alkynyl may further have, for example, one or more double bonds.
  • aryl includes, for example, a monocyclic aromatic hydrocarbon group and a polycyclic aromatic hydrocarbon group.
  • the monocyclic aromatic hydrocarbon group include phenyl and the like.
  • the polycyclic aromatic hydrocarbon group is, for example, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 1-anthryl, 2-anthryl, 9-anthryl, 1-phenanthryl, 2-phenanthryl, 3-phenanthryl, 4-phenanthryl, 9- Phenantril etc. are mentioned.
  • Preferred examples include phenyl, naphthyl such as 1-naphthyl and 2-naphthyl, and the like.
  • heteroaryl includes, for example, a single ring aromatic heterocyclic group and a fused aromatic heterocyclic group.
  • the heteroaryl include furyl (eg, 2-furyl, 3-furyl), thienyl (eg, 2-thienyl, 3-thienyl), pyrrolyl (eg, 1-pyrrolyl, 2-pyrrolyl, 3-pyrrolyl), Imidazolyl (eg: 1-imidazolyl, 2-imidazolyl, 4-imidazolyl), pyrazolyl (eg: 1-pyrazolyl, 3-pyrazolyl, 4-pyrazolyl), triazolyl (eg: 1,2,4-triazol-1-yl, 1,2,4-triazol-3-yl, 1,2,4-triazol-4-yl), tetrazolyl (eg, 1-tetrazolyl, 2-tetrazolyl, 5-tetrazolyl), oxazolyl (eg,
  • cycloalkyl is, for example, a cyclic saturated hydrocarbon group, and the carbon number is, for example, 3 to 15.
  • examples of the cycloalkyl include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, a bridged cyclic hydrocarbon group, a spiro hydrocarbon group and the like, with preference given to cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl And bridged cyclic hydrocarbon groups.
  • the “bridged cyclic hydrocarbon group” is, for example, bicyclo [2.1.0] pentyl, bicyclo [2.2.1] heptyl, bicyclo [2.2.2] octyl and bicyclo [3. .2.1] Octyl, tricyclo [2.2.1.0] heptyl, bicyclo [3.3.1] nonane, 1-adamantyl, 2-adamantyl and the like.
  • examples of the "spiro hydrocarbon group” include spiro [3.4] octyl and the like.
  • cycloalkenyl covers, for example, a cyclic unsaturated aliphatic hydrocarbon group and has, for example, 3 to 7 carbon atoms.
  • examples of the group include cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl and the like, with preference given to cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl and the like.
  • the cycloalkenyl also includes, for example, a bridged cyclic hydrocarbon group and an spirohydrocarbon group having an unsaturated bond in the ring.
  • arylalkyl includes, for example, benzyl, 2-phenethyl, naphthalenylmethyl and the like
  • cycloalkylalkyl or “cyclylalkyl” includes, for example, cyclohexylmethyl, adamantyl methyl and the like.
  • hydroxyalkyl include, for example, hydroxymethyl and 2-hydroxyethyl and the like.
  • alkoxy includes, for example, the aforementioned alkyl-O- group, and examples thereof include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy and the like
  • alkoxyalkyl is, for example, Examples thereof include methoxymethyl and the like
  • aminoalkyl includes, for example, 2-aminoethyl and the like.
  • heterocyclyl is, for example, 1-pyrrolinyl, 2-pyrrolinyl, 3-pyrrolinyl, 1-pyrrolidinyl, 2-pyrrolidinyl, 3-pyrrolidinyl, pyrrolidinone, 1-imidazolinyl, 2-imidazolinyl, 4-imidazolinyl, 1 -Imidazolidinyl, 2-imidazolidinyl, 4-imidazolidinyl, imidazolidinone, 1-pyrazolinyl, 3-pyrazolinyl, 4-pyrazolinyl, 4-pyrazolinyl, 1-pyrazolidinyl, 3-pyrazolidinyl, 4-pyrazolidinyl, piperidinone, piperidino, 2-piperidinyl, 3-piperidinyl 4- piperidinyl, 1-piperazinyl, 2-piperazinyl, piperazinone, 2-morpholinyl, 3-morpholinyl, morpholino,
  • heterocyclylalkyl includes, for example, piperidinylmethyl, piperazinylmethyl and the like
  • heterocyclylalkenyl includes, for example, 2-piperidinylethenyl and the like
  • heteroarylalkyl includes pyridylmethyl and quinolin-3-ylmethyl.
  • sil includes a group represented by the formula R 3 Si—, and R can be independently selected from the above alkyl, aryl and cycloalkyl, for example, trimethylsilyl, tert-butyldimethylsilyl
  • R can be independently selected from the above alkyl, aryl and cycloalkyl, for example, trimethylsilyl, tert-butyldimethylsilyl
  • the "silyloxy” include a trimethylsilyloxy group and the like
  • examples of the “silyloxy alkyl” include a trimethylsilyloxymethyl and the like.
  • alkylene examples include methylene, ethylene, propylene and the like.
  • the various groups described above may be substituted.
  • the substituent is, for example, hydroxy, carboxy, halogen, halogenated alkyl (eg, CF 3 , CH 2 CF 3 , CH 2 CCl 3 ), nitro, nitroso, cyano, alkyl (eg, methyl, ethyl, isopropyl, tert.
  • alkenyl eg: vinyl
  • alkynyl eg: ethynyl
  • cycloalkyl eg: cyclopropyl, adamantyl
  • cycloalkylalkyl eg: cyclohexylmethyl, adamantyl methyl
  • cycloalkenyl eg: cyclopropenyl
  • Aryl eg: phenyl, naphthyl
  • arylalkyl eg: benzyl, phenethyl
  • heteroaryl eg: pyridyl, furyl
  • heteroarylalkyl eg: pyridylmethyl
  • heterocyclyl eg: piperidyl
  • heterocyclylalkyl eg.
  • arylalkyloxy eg benzyloxy
  • amino [alkylamino eg methylamino, ethylamino, dimethylamino
  • acylamino eg acetylamino, benzoylamino
  • arylalkylamino eg, benzyla
  • SMAD2 / 3 Protein Phosphorylation Inhibitor
  • the phosphorylation inhibition of SMAD2 / 3 protein means that the phosphorylation of SMAD2 and / or SMAD3 promoted by TGF- ⁇ stimulation is inhibited (controlled).
  • SMAD2 / 3 is a type of R-SMAD (receptor regued SMAD) that is phosphorylated by TGF- ⁇ type I receptor, and after stimulation by TGF- ⁇ , phosphorylated (activated) SMAD2 and SMAD3 are Co -Move into the nucleus with SMAD4 which is SMAD (common partner SMAD).
  • NEK6 protein interacts with SMAD2 / 3 protein in cells to promote phosphorylation of SMAD2 / 3 protein.
  • the phosphorylated SMAD2 / 3 protein forms an SMAD protein complex, translocates into the nucleus, and promotes transcription of ⁇ -SMA, ⁇ 2-collagen, interferon ⁇ , interleukin-5, VEGF and the like.
  • fibroblasts in the wound healing process. It can be understood that they are useful for the suppression of differentiation to myofibroblasts such as hepatic stellate cells, the control of matrix synthesis by fibroblasts and the like, and the regulation of inflammation and immune response.
  • the therapeutic agent for fibrosis of the present invention is liver fibrosis, cirrhosis, viral hepatitis, autoimmune hepatitis, primary biliary hepatitis, nonalcoholic steatohepatitis, alcoholic liver disease, primary Sclerosing cholecystitis, hemochromatosis, Wilson's disease, ⁇ 1-antitrypsin deficiency, nonviral congestive liver cirrhosis, drug-induced liver injury, pancreatitis, pancreatic fibrosis, retinal fibrosis, vocal cord scarring, vocal fold mucosal fibrosis , Laryngeal fibrosis, pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, idiopathic pulmonary fibrosis, nonspecific interstitial pneumonia, idiopathic organizing pneumonia, exfoliative interstitial pneumonia, respiratory bronchiolitis related interstitial pneumonia , Acute interstitial pneumonia, lymphocytic inter
  • the administration method of the therapeutic agent for fibrosis of the present invention is not particularly limited, but is preferably parenteral administration such as inhalation, intravenous injection, transdermal administration and the like.
  • the dose of the nucleic acid molecule of the present invention in the treatment method of the present invention is not particularly limited as long as it is a therapeutically effective amount of the disease, and varies depending on the type of disease, severity, age, body weight, administration route, etc. Usually, it may be about 0.0001 to about 100 mg / kg body weight, for example about 0.001 to about 10 mg / kg body weight, preferably about 0.005 to about 5 mg / kg body weight per adult.
  • the amount can be administered, for example, at an interval of 3 times a day to once a month, preferably once a day to a week.
  • the therapeutic agent for fibrosis of the present invention is usually formulated as an appropriate pharmaceutical composition together with a pharmaceutically acceptable carrier and administered orally or parenterally.
  • the culture conditions were 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the medium used for human lung fibroblast cell line LL29 cells is F-12K medium (Gibco) containing 10% FCS, and the medium used for human primary hepatic stellate cells (ScienCell) Stellate cell culture medium (ScienCell) containing 2% FCS, 1% Stellate cell growth supplement (SteCGS, ScienCell).
  • Example 1 Knockdown of NEK6 using siRNA Human lung fibroblast cell line LL29 cells established from the lungs of IPF patients, siRNA against human NEK6 (ON-TARGET plus SMART pool siRNA, Dharmacon, or Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) was transfected using Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen). Twenty-four hours after transfection, the medium was changed from F-12K medium (Gibco) containing 10% FCS to F-12K medium containing 0.1% BSA. 72 hours after transfection, RNA was extracted from cells transfected with siRNA using the RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • siRNA against human NEK6 ON-TARGET plus SMART pool siRNA, Dharmacon, or Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) was transfected using Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen). Twenty-four hours after transfection, the medium was changed from F-12K medium (Gibco
  • RNA was subjected to reverse transcription using a High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) to obtain cDNA.
  • the obtained cDNA was subjected to real time PCR using TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) to examine the influence on the transcription amount of NEK6 gene by knockdown of NEK6.
  • the transcription amount of the NEK6 gene was calculated by dividing the measured value with the NEK6 Taqman Probe (HS00205221_m1, Applied Biosystems) by the measured value with the 18s Probe.
  • custom synthesis 18s MGB Probe custom synthesis 18s Primer 1
  • custom synthesis 18s Primer 2 custom synthesis 18s Primer 2 were mixed to 0.2 ⁇ M, 0.4 ⁇ M and 0.4 ⁇ M, respectively, and real-time PCR was performed.
  • Custom Synthetic 18s MGB Probe (Applied Biosystems): 5'- ATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC-3 '(sequence number 57) Custom Synthetic 18s Primer 1 (ThermoFisher): 5'-CGGCTACCACATCCA AGGA AG-3 '(SEQ ID NO: 58) Custom Synthetic 18s Primer 2 (ThermoFisher): 5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3 '(SEQ ID NO: 59)
  • ON-TARGET plus SMART pool siRNA (equal mixture of SEQ ID NOS: 51 to 54) and Stealth RNAi siRNA (SEQ ID NO: 55) were used.
  • siNEK6 5'-CUGUCCUCGGCCUAUAUCUC-3 '(SEQ ID NO: 51) siNEK6: 5'-UAUUUGGGUGGUUCAGUUG-3 '(SEQ ID NO: 52) siNEK6: 5'-CAACUCCAGCACAAUGUUC-3 '(SEQ ID NO: 53) siNEK6: 5'-UACUUGAUCUCUGCGAGA-3 '(SEQ ID NO: 54) ⁇ Stealth RNAi siRNA> siNEK6: 5'-AAGUACUUCCAUACUGUCCUCUCC-3 '(SEQ ID NO: 55)
  • FIG. 6a shows the results of real-time PCR of NEK6 when ON-TARGET plus SMART pool siRNA was introduced to NEK6
  • FIG. 6b shows the results of real-time PCR of NEK6 when Stealth RNAi siRNA to NEK6 was introduced.
  • the introduction of NEK6 siRNA suppressed the transcription level of the NEK6 gene. Therefore, it was shown that the NEK6 siRNA used efficiently suppressed the expression of the target gene.
  • Example 2 The effect of NEK6 knockdown on SMAD2 / 3 protein phosphorylation
  • NEK6 protein regulates TGF- ⁇ signal the amount of phosphorylated SMAD2 / 3 in cells transfected with NEK6 siRNA was used. It analyzed.
  • Human lung fibroblast cell line LL29 cells established from the lungs of IPF patients with ON-TARGET plus SMART pool siRNA (Dharmacon) or Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) against human NEK6 using Lipofectamine RNAi MAX Transfected. Twenty-four hours after transfection, the medium was changed from F-12K medium containing 10% FCS to F-12K medium containing 0.1% BSA. Forty-eight hours after transfection, human TGF- ⁇ protein (Peprotech) was added to a final concentration of 5 ng / mL.
  • the separated protein is transferred to a PVDF membrane, and anti-phosphorylated SMAD3 antibody (Cell Signaling Technology), anti-phosphorylated SMAD2 antibody (Cell Signaling Technology), anti-SMAD2 / 3 antibody (Cell Signaling Technology), anti-NEK6 Western blotting was performed with an antibody (Santa Cruz Biotechnology), an anti- ⁇ -Actin antibody (Sigma Aldrich).
  • FIG. 7a shows the results of Western blot of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down.
  • NEK6 siRNA reduced the amount of NEK6 protein and reduced the amount of phosphorylated SMAD3 elevated by TGF- ⁇ . At this time, the amount of total SMAD3 protein did not change.
  • FIG. 7 b shows the results of Western blot of phosphorylated SMAD2 protein when NEK6 was knocked down.
  • NEK6 siRNA reduced the amount of NEK6 protein and reduced the amount of phosphorylated SMAD2 elevated by TGF- ⁇ . At this time, the amount of total SMAD2 protein did not change.
  • lysis buffer (175 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.6, 0.1% NP40, 0.2 mM EDTA pH 8.0, 1.4 mM ⁇ -Mercaptoethanol, 1% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail
  • the cells were collected and the supernatant was obtained by centrifugation.
  • the supernatant was added with TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads (Rockland) and centrifuged to remove nonspecific binding. After adding normal goat IgG (Santa Cruz Biotechnology) or an anti-NEK6 antibody as a control to the supernatant obtained therefrom and incubating at 4 ° C.
  • TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads are added for 4 hours at 4 ° C. Incubate. After centrifugation to remove the supernatant, TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads were washed with lysis buffer to remove nonspecific binding. Add 2x SDS PAGE loading buffer (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50 mM DTT) to TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads and heat for 5 minutes at 95 ° C The co-immunoprecipitate contained in the supernatant was recovered.
  • 2x SDS PAGE loading buffer 100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50 mM DTT
  • the co-immunoprecipitates with anti-NEK6 antibody were subjected to western blotting using anti-SMAD3 antibody (Cell Signaling Technology) and anti-NEK6 antibody to detect whether NEK6 protein and SMAD3 protein were co-precipitated.
  • anti-SMAD3 antibody Cell Signaling Technology
  • FIG. 8a shows the results of co-immunoprecipitation with anti-NEK6 antibody. From the co-immunoprecipitate, NEK6 protein and SMAD3 protein were detected.
  • LL29 cells were transfected with a human NEK6 expression vector and a human SMAD3 expression vector labeled with a FLAG tag. The medium was changed 24 hours after transfection. After 48 hours of transfection, lysis buffer (250 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.6, 0.1% NP40, 0.2 mM EDTA pH 8.0, 1.4 mM ⁇ -Mercaptoethanol, 1% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail) The cells were collected and the supernatant was obtained by centrifugation.
  • lysis buffer 250 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.6, 0.1% NP40, 0.2 mM EDTA pH 8.0, 1.4 mM ⁇ -Mercaptoethanol, 1% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail
  • Anti-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma-Aldrich) was added to the resulting supernatant and incubated overnight at 4 ° C. Thereafter, centrifugation was performed and the supernatant was removed. Anti-FLAG M2 Affinity Gel was washed with lysis buffer to remove nonspecific binding. Add 2x SDS PAGE loading buffer (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50 mM DTT) to Anti-FLAG M2 Affinity Gel and heat at 95 ° C for 4 minutes The co-immunoprecipitate contained in the supernatant was recovered.
  • 2x SDS PAGE loading buffer 100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50 mM DTT
  • the obtained co-immunoprecipitates are separated on the basis of size by SDS-PAGE, then transferred to a PVDF membrane, and anti-phosphorylated SMAD3 antibody, anti-FLAG against co-immunoprecipitates by Anti-FLAG M2 Affinity Gel.
  • Western blotting was performed using an antibody (Sigma-Aldrich) and an anti-NEK6 antibody to detect whether the NEK6 protein and the phosphorylated SMAD3 protein were coprecipitated.
  • FIG. 8 b shows the results of co-immunoprecipitation with anti-FLAG antibody. From the co-immunoprecipitate, NEK6 protein and FLAG-SMAD3 protein were detected. Moreover, transfection of human NEK6 expression vector increased the amount of phosphorylated SMAD3 protein.
  • SMAD3 protein was detected in the co-immunoprecipitate by anti-NEK6 antibody, and conversely, NEK6 was detected in the co-immunoprecipitate by anti-FLAG antibody, the NEK6 protein and SMAD3 protein interact in cells It was shown to form a complex. Furthermore, as the amount of phosphorylated SMAD3 protein was increased by transfection of human NEK6 expression vector, it was shown that NEK6 protein phosphorylates SMAD3 protein in cells.
  • Example 4 SMAD3 protein phosphorylation by NEK6 protein The possibility that NEK6 protein is directly phosphorylated using SMAD3 protein as a substrate was examined using purified proteins of NEK6 and SMAD3.
  • His fusion NEK6 protein (Eurofins) and GST fusion SMAD3 protein (Sigma-Aldrich) as reaction solvents (150 ⁇ M ATP, 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 1% Mixed with phosphatase inhibitor cocktail) and incubated at 30 ° C. for 45 minutes. An equal volume of 2 ⁇ SDS sample buffer containing 5% ⁇ -Mercaptoethanol and 0.025% Bromophenol blue was added to the reaction solution to stop the reaction, and then heated at 95 ° C. for 5 minutes to prepare a sample.
  • reaction solvents 150 ⁇ M ATP, 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 1% Mixed with phosphatase inhibitor cocktail
  • SDS-PAGE was performed using the obtained samples to separate proteins contained in the reaction solution according to size. Thereafter, the separated proteins were transferred to a PVDF membrane, and western blotting was performed with an anti-phosphorylated SMAD3 antibody and an anti-GST antibody (Santa Cruz Biotechnology) and an anti-NEK6 antibody.
  • FIG. 9 shows the results of Western blot of phosphorylated SMAD3 protein when His fusion NEK6 protein was reacted with GST fusion SMAD3 protein.
  • Example 5 Effects of SMAD Protein Complex on Transcriptional Activity by Knockdown of NEK6
  • DNA of SMAD protein complex is used.
  • a luciferase reporter assay was performed using the binding sequence and the luciferase gene.
  • Western blotting was performed using simultaneously prepared LL29 cells to confirm knockdown of NEK6.
  • Human lung fibroblast cell line LL29 cells established from the lungs of IPF patients were transfected with ON-TARGET plus SMART pool siRNA (Dharmacon), which is an siRNA for human NEK6, using Lipofectamine RNAi MAX. Twenty-four hours after transfection of siRNA, the medium was changed from F-12K medium containing 10% FCS to F-12K medium containing 0.4% FCS.
  • ON-TARGET plus SMART pool siRNA (Dharmacon), which is an siRNA for human NEK6, using Lipofectamine RNAi MAX. Twenty-four hours after transfection of siRNA, the medium was changed from F-12K medium containing 10% FCS to F-12K medium containing 0.4% FCS.
  • siRNA DNA binding sequence of SMAD protein complex [SMAD biding element (SBE)] and expression vector (pTL-SBE-luc: 5'-AGTATGTCTAGACTGAGATGATGTTCTAGACTGAAGTATGTTCTAGACTGA-3 '(sequence) in which firefly luciferase gene was cloned No. 60), Panomics) and a vector for correcting a reporter assay (pRL-TK: Promega) containing wild-type Renilla luciferase were transfected using Lipofectamine LTX with PLUS reagent (Thermo Fisher Scientific).
  • human TGF- ⁇ protein was added to a final concentration of 10 ng / mL. Twenty-four hours after the addition of TGF- ⁇ , the cells are lysed with 2 ⁇ SDS sample buffer (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 6 M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail) did. After separating the protein contained in the obtained cell extract by SDS-PAGE, the protein was transferred to a PVDF membrane, and western blotting was performed using an anti-SMAD3 antibody, an anti-NEK6 antibody, and an anti-Vinculin antibody.
  • SDS sample buffer 100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 6 M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail
  • LL29 cells prepared in the same manner as described above were sequentially collected by Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), and luminescence by firefly luciferase and sea pansy luciferase was measured. The amount of luminescence of firefly luciferase was corrected by the amount of luminescence by sea pansy luciferase.
  • FIG. 10a shows the result of Western blot in the case of knocking down NEK6.
  • the use of NEK6 siRNA was shown to reduce the amount of NEK6 protein, but the amount of SMAD3 protein was not changed.
  • FIG. 10 b shows the amount of luminescence of firefly luciferase corrected for Renilla luciferase when NEK6 was knocked down.
  • NEK6 siRNA By using NEK6 siRNA, the amount of luminescence of firefly luciferase, which is increased by TGF- ⁇ , was reduced. Therefore, it was shown that knockdown of NEK6 suppresses the transcriptional activity of the SMAD protein complex.
  • Example 6 Effect on transcription amount of fibrosis related gene by knockdown of NEK6
  • knockdown of NEK6 shows therapeutic effect on fibrosis
  • fibrosis related in cells transfected with NEK6 siRNA The transcript level of the gene was analyzed.
  • Human lung fibroblast cell line LL29 cells established from the lungs of IPF patients were transfected with siRNA against human NEK6 (ON-TARGET plus SMART pool siRNA, Dharmacon) using Lipofectamine RNAi MAX. Twenty-four hours after transfection, the medium was changed from F-12K medium containing 10% FCS to F-12K medium containing 0.1% BSA. Forty-eight hours after transfection, human TGF- ⁇ protein was added to a final concentration of 1 ng / mL. 72 hours after transfection, RNA was extracted from cells transfected with siRNA using the RNeasy Mini Kit. The obtained RNA was subjected to reverse transcription using High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit to obtain cDNA.
  • the obtained cDNA was subjected to real-time PCR using TaqMan Gene Expression Assays to detect the influence of the knockdown of NEK6 on the transcription amount of the gene.
  • the transcript levels of the Col1a1 gene and the ⁇ SMA gene are the values measured with the Col1a1 Taqman Probe (HS00164004_m1, Applied Biosystems) or the values measured with the ⁇ SMA Taqman Probe (HS00426835_g1, Applied Biosystems) divided by the values obtained with the 18s Probe. Calculated by doing.
  • FIG. 11a shows the amount of transcription of Col1a1 in the case of knocking down NEK6 and the amount of transcription of the ⁇ SMA gene in the case of knocking down NEK6 in FIG. 11b.
  • Example 7 Synthesis of single-stranded nucleic acid molecule
  • the nucleic acid molecule shown below was synthesized by a nucleic acid synthesizer (trade name: ABI 3900 DNA Synthesizer, Applied Biosystems) based on the phosphoroamidite method. Solid phase synthesis was performed using CPG (Controlled Pore Glass) as a solid phase carrier and EMM amidite (WO 2013/027843) as RNA amidite. The cleavage from the solid support and the deprotection of the phosphate protecting group, the deprotection of the base protecting group, and the deprotection of the 2'-hydroxy protecting group followed a standard method. The synthesized single stranded nucleic acid molecule was purified by HPLC.
  • Lx is a linker region Lx and represents L-proline diamide amidite of the following structural formula.
  • underlined part in the following single stranded nucleic acid molecule is a gene expression suppression sequence of NEK6.
  • Example 8 In Vitro Evaluation of ssPN Molecules (Single-Stranded Nucleic Acid Molecules) In vitro evaluation of ssPN molecules (single-stranded nucleic acid molecules) designed against NEK6 was performed. The measurement method of each item was according to the method (Examples 1, 2 and 6) performed with the above-mentioned ON-TARGET plus SMART pool siRNA and Stealth RNAi siRNA. The KB-001-005 ssPN nucleic acids all repressed the transcriptional level of NEK6 and efficiently knocked down the target gene. Furthermore, the decrease in the amount of phosphorylated SMAD3 protein was confirmed by the action of the ssPN nucleic acid of KB-001 to 005.
  • FIG. 12a shows the transcript amount of the Col1a1 gene when KB-001 or KB-003 is allowed to act
  • FIG. 12b shows the transcript amount of the ⁇ SMA gene when KB-001 or KB-003 is allowed to act.
  • Example 9 Verification of antifibrotic effect by in vivo knockdown of NEK6
  • NEK6 siRNA is administered to bleomycin lung fibrosis model mice And analyze the antifibrotic effect.
  • Bleomycin (Nippon Kayaku Co., Ltd.) is administered at a dose of 0.4 mg / kg to a 7-week-old Crl: CD1 (ICR) mouse (Charles River Japan) to prepare a lung fibrosis model mouse.
  • NEK6 siRNA is administered at a frequency of 50 mg / kg body weight at a frequency of once every 2 to 7 days.
  • imaging on microCT for laboratory animals is performed once a week.
  • dissect the lungs At 14 to 30 days after the first administration of NEK6 siRNA, dissect the lungs. The amount of transcription of fibrosis related gene and the amount of expression of fibrosis related protein using isolated lung are measured, pathological analysis and the like.
  • fibrosis is suppressed in the NEK6 siRNA-administered group as compared to the NEK6 siRNA-unadministered group, and it exhibits an antifibrotic action in the lung fibrosis model mouse of NEK6 siRNA. it can.
  • Example 10 Effect of NEK6 siRNA on SMAD3 protein phosphorylation in hepatic stellate cells To examine the possibility that NEK6 protein regulates TGF- ⁇ signal in hepatic stellate cells, phosphorylated SMAD3 in cells transfected with NEK6 siRNA The amount was analyzed.
  • lipopolysaccharide (LPS, Sigma Aldrich) was added to the medium to a final concentration of 100 ng / ml.
  • human TGF- ⁇ protein (Peprotech) was added to a final concentration of 5 ng / ml.
  • TGF- ⁇ TGF- ⁇ cells were treated with 2 ⁇ SDS sample buffer [100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 6 M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail (Nacalai Tesque), 1% phosphatase inhibitor It was dissolved with cocktail (Nacalai Tesque) to make a cell extract.
  • the obtained cell extract was heated at 95 ° C. for 4 minutes to obtain a sample.
  • SDS-PAGE was performed using the obtained sample, and proteins contained in the sample were separated by size. After that, the separated proteins are transferred to a PVDF membrane, and anti-phosphorylated SMAD3 antibody (Cell Signaling Technology) and anti-SMAD3 antibody (Cell Signaling Technology), anti-phosphorylated SMAD2 antibody (Cell Signaling Technology) and anti-SMAD2 antibody Western blotting was performed with Cell Signaling Technology (A), anti-NEK6 antibody (Santa Cruz Biotechnology), and anti-Vinculin antibody (Sigma Aldrich).
  • FIG. 13 shows the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein and phosphorylated SMAD2 protein when NEK6 siRNA was transfected.
  • NEK6 siRNA reduced the amount of NEK6 protein and reduced the amount of phosphorylated SMAD3 and phosphorylated SMAD2 elevated by TGF- ⁇ . Therefore, it was shown that knockdown of NEK6 suppresses phosphorylation of SMAD3 protein and SMAD2 protein.
  • Example 11 NEK6 siRNA SMAD3 phosphorylation inhibitory action in hepatic stellate cells
  • the amount of phosphorylated SMAD3 was analyzed in cells transfected with each NEK6 siRNA.
  • human TGF- ⁇ protein was added to a final concentration of 5 ng / ml 30 minutes after addition of TGF- ⁇ , the cells were treated with 2 ⁇ SDS sample buffer (100 mM Tris-HCl pH 6).
  • the cell extract was dissolved in 8,4% SDS, 6 M urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail), and ⁇ -Mercaptoethanol and Bromophenol blue were respectively added to the cell extract.
  • the sample was added to a final concentration of 5%, 0.025%, and then heated for 4 minutes at 95 ° C. to make a sample SDS-PAGE was performed using the obtained sample, and the proteins contained in the sample were sized.
  • the separated proteins were then transferred to a PVDF membrane, and anti-phosphorylated SMAD3 antibody and anti-SMAD3 antibody, anti-NEK6 antibody, anti-Vinculin, Western blotte Was done.
  • FIG. 14 shows the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down by various NEK6 siRNAs.
  • Introduction of various NEK6 siRNAs reduced the amount of NEK6 protein and reduced the amount of phosphorylated SMAD3 elevated by TGF- ⁇ . Therefore, it has been shown that knockdown of NEK6 suppresses phosphorylation of SMAD3 protein by using multiple NEK6 siRNA sequences.
  • Example 12 Effects of NEK6 siRNA on Fibrosis-Related Genes in Hepatic Stellate Cells
  • a group of fibrosis-related genes in NEK6 siRNA-transfected cells was examined. The amount of transcription was analyzed.
  • RNA was extracted from the cells transfected with KB-004 using the RNeasy Mini Kit. The obtained RNA was subjected to reverse transcription using High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit to obtain cDNA. The obtained cDNA was subjected to real-time PCR using TaqMan Gene Expression Assays to detect the influence of the knockdown of NEK6 on the transcription amount of the gene.
  • the transcript levels of the NEK6 gene, the Fibronectin gene and the ⁇ SMA gene were measured with the NEK6 Taqman Probe (HS00205221_m1, Applid Biosystems), measured with the Fibronectin Taqman Probe (HS01549976_m1, Applid Biosystems), or ⁇ SMA Taqman Probe (HS00426835_G1).
  • the values measured by Applid Biosystems were divided by the values measured by 18s Probe.
  • Fig. 15a shows the transcription amount of NEK6 in the case of knocking down NEK6, the transcription amount of Fibronectin in the case of knocking down NEK6 in Fig. 15b, and the transcription amount of the ⁇ SMA gene in the case of knocking down NEK6 in Fig. 15c.
  • NEK6 siRNA reduced the transcript level of Fibronectin, ⁇ SMA gene, which is elevated by TGF- ⁇ . Therefore, knockdown of NEK6 was shown to suppress fibrosis.
  • Example 13 Effects of NEK6 siRNA on SMAD3 Protein Phosphorylation in Renal Fibroblasts
  • NEK6 siRNA the amount of phosphorylated SMAD3 is analyzed in cells transfected with NEK6 siRNA did.
  • Rat renal fibroblast cell line NRK-49F cells were transfected with siRNA against human NEK6 (KB-004) using Lipofectamine RNAi MAX. Twenty-four hours after transfection, the medium was changed from DMEM medium containing 10% FCS to DMEM medium containing 0.1% FCS. Forty-eight hours after transfection, human TGF- ⁇ protein was added to a final concentration of 5 ng / ml. Thirty minutes or one hour after addition, the cells are lysed with 2 ⁇ SDS sample buffer (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 6 M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail) The extract was used as the extract.
  • 2 ⁇ SDS sample buffer 100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 6 M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail
  • the obtained cell extract was heated at 95 ° C. for 4 minutes to obtain a sample.
  • SDS-PAGE was performed using the obtained sample, and proteins contained in the sample were separated by size. Thereafter, the separated proteins were transferred to a PVDF membrane, and Western blotting was performed with anti-phosphorylated SMAD3 antibody and anti-SMAD3 antibody, anti-NEK6 antibody (abcam), and anti-Vinculin antibody.
  • FIG. 16 shows the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down.
  • NEK6 siRNA reduced the amount of NEK6 protein and reduced the amount of phosphorylated SMAD3 elevated by TGF- ⁇ . Therefore, it was shown that knockdown of NEK6 suppresses phosphorylation of SMAD3 protein.
  • Example 14 Evaluation of Efficacy of NEK6 siRNA in a Carbon Tetrachloride (CCl 4 ) Induced Liver Fibrosis Model
  • CCl 4 model mice were treated with NEK 6
  • the siRNA was intravenously administered to analyze antifibrotic activity.
  • a nucleic acid dose of 0.3 mg / mL was prepared according to the product protocol of in vivofectamine 3.0 using KB-004 as NEK6 siRNA and in vivofectamine 3.0 Reagent (Thermo Fisher Scientific) as a dose solvent.
  • the nucleic acid administration group is tail vein administered with a nucleic acid administration solution containing KB-004 so as to be 3 mg / kg body weight, and the solvent administration group has an administration solvent equivalent to the nucleic acid administration group and the day before the first administration of CCl 4 and
  • the tail vein was administered on the 10th day of pathological condition induction. Evaluation of liver injury and fibrosis was performed on the 13th day of pathological condition induction (Examples 15, 16, 17 and 19).
  • Example 15 Analysis of Hepatic Injury Markers in a CCl 4 Model Fibrosis is understood to be an excessive wound healing process for cellular and tissue injury. Therefore, suppressing cell and tissue damage as well as fibrosis is considered to be effective for the treatment of various types of fibrosis. Therefore, in order to examine whether knockdown of NEK6 shows an effect on liver injury, measurement of a liver injury marker in the CCl 4 model was performed.
  • Glutamate pyruvate transaminase (GPT) and glutamate oxaloacetate transaminase (GOT) in serum were measured using transaminase CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The measurement method followed the instructions of the reagent.
  • FIG. 17a The measurement results of GPT in serum are shown in FIG. 17a, and the measurement results of GOT in serum are shown in FIG. 17b.
  • Administration of NEK6 siRNA suppressed the elevation of serum GPT and GOT observed in the CCl 4 model. Therefore, knockdown of NEK6 was shown to suppress liver injury.
  • Example 16 To knockdown of CCl 4 Analysis of SMAD3 protein phosphorylation in model NEK6 To investigate whether shows the effect on the phosphorylation of SMAD3 proteins were analyzed amount of phosphorylated SMAD3 in CCl 4 model.
  • Lysis buffer 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM benzyl fluoride, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail
  • An organ extract was prepared using a handy ultrasound generator. ⁇ -Mercaptoethanol and Bromophenol blue were added to the supernatant obtained by centrifuging the organ extract to a final concentration of 5% and 0.025%, respectively. Thereafter, the sample was heated at 95 ° C. for 4 minutes.
  • SDS-PAGE was performed using the obtained sample, and proteins contained in the sample were separated by size. Thereafter, the separated proteins were transferred to a PVDF membrane, and Western blotting was performed with anti-phospho-SMAD3 antibody (abcam), anti-SMAD3 antibody, anti-NEK6 antibody (abcam), and anti-Vinculin antibody. Phosphorylated SMAD3 was corrected by the total amount of SMAD3.
  • FIG. 18 shows the results of Western blotting of phosphorylated SMAD3 protein when NEK6 was knocked down.
  • NEK6 siRNA reduced the amount of NEK6 protein and reduced the amount of phosphorylated SMAD3 elevated by TGF- ⁇ . Therefore, it was shown that knockdown of NEK6 suppresses phosphorylation of SMAD3 protein in the liver of CCl 4 model.
  • Example 17 Knock-down of CCl 4 Analysis of fibrosis-related genes in the model NEK6 is to consider whether the effectiveness against fibrosis were analyzed transcription level of fibrosis-related genes in CCl 4 model.
  • NEK6 Taqman Probe (Mm00480730_m1, Applied Biosystems) using TaqMan Gene Expression Assay, and Col1a1 Taqman Probe (Mm00801666_g1, Applied Biosystems) as a fibrosis related gene, Col3a1 Taqman Probe (Mm01254476_m1, Applied Biosystems), , The amount of transcription of Applied Biosystems) was measured, and 18s rRNA Taqman Probe (Hs99999901_s1, Applied Biosystems) which is an internal standard. The relative ratio between the transfer amount was transferred amount of each gene.
  • the transcript levels of each gene in the CCl 4 model are shown in FIGS. 19 a-d.
  • Administration of NEK6 siRNA reduced the transcript level of the NEK6 gene. From this, it was shown that the used KB-004 efficiently repressed the transcription of the target gene. At this time, the amount of transcription of fibrosis related genes (Col1a1, Col3a1, Timp1) induced by the induction of disease state was significantly reduced. Therefore, knockdown of NEK6 was shown to suppress fibrosis.
  • Example 18 Analysis of fibrosis-related genes in bile duct ligation-induced liver fibrosis (BDL) model
  • BDL model bile duct ligation-induced liver fibrosis model mouse
  • the liver was collected on the 14th day after bile duct ligation, and NEK6 Taqman Probe (Mm00480730_m1, Applied Biosystems), and Col1a1 Taqman Probe (Mm00801666_g1, Applied Biosystems) as a fibrosis related gene, Col3a1 Taqman Probe (Mm01254476_m1, as described above).
  • the amount of transcription of Applied Biosystems) and Timp1 Taqman Probe was measured, and the relative ratio to the amount of transcription of GAPDH Taqman Probe (Mm9999995_g1, Applied Biosystems) as an internal standard was determined. And the transfer amount of the child.
  • the amount of transcription of each gene in the BDL model is shown in FIG.
  • Administration of NEK6 siRNA reduced the transcript level of the NEK6 gene. From this, it was shown that the used KB-004 efficiently repressed the transcription of the target gene. At this time, the amount of transcription of fibrosis related genes (Col1a1, Col3a1, Timp1) induced by the induction of disease state was significantly reduced. Therefore, knockdown of NEK6 was shown to suppress fibrosis.
  • Example 19 Pathological analysis in CCl 4 model
  • knockdown of NEK6 shows an effect on a CCl 4 induced liver fibrosis model
  • observation of a pathological image was performed.
  • FIG. 21 shows a representative example of a pathological image.
  • Figure 21a is CCl 4 results saline administration group untreated
  • Figure 21b is the result of the solvent administration group CCl 4 administration
  • Figure 21c represents the result of the nucleic acid administration group CCl 4 administration.
  • Vacuolar degeneration which is frequently observed in FIG. 21b, indicates cell damage, and a portion with a large number of nuclei present near the central portion indicates cell necrosis.
  • Administration of NEK6 siRNA reduced cell damage and necrosis observed in liver tissue of the CCl 4 model. Therefore, it has been shown that knockdown of NEK6 suppresses pathological changes in a CCl 4 -induced liver fibrosis model.
  • the present invention makes it possible to provide novel inhibitors of phosphorylation of SMAD2 / 3 protein and therapeutic agents for fibrosis.

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Abstract

ＮＥＫ６（ＮＩＭＡ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　６）遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤又は線維症治療剤を開示する。

Description

線維症治療剤
　本発明は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸分子及び当該核酸分子を有効成分とする医薬に関する。
　線維症は、過剰なコラーゲンの蓄積により臓器機能が障害を受け、不可逆的に進行する疾患であり、例えば、その発症臓器としては皮膚、肺、肝臓、膵臓、腎臓、骨髄などが知られている。肺の線維症の一種である特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、人口１０万人当たり２０人程度の患者数と罹患率は高くはないものの、診断確定後の平均生存期間が２．５～５年と治療後の経過はよくないため、日本において難病指定されている。
　ＩＰＦ治療薬としては、これまでにピルフェニドン、ニンテダニブが日本国厚生労働省より承認を受け上市されている。いずれの薬剤も肺活量低下抑制と無増悪期間延長作用を示し、病態の進行を遅延させるものの、治療効果としては十分満足できるものとはいえず、新たなメカニズムに基づく治療薬の開発が望まれている。
　一方、本発明の標的である「ＮＥＫ６タンパク質」は、細胞分裂の制御に関わるＮＩＭＡ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙの１つとして知られるが、医薬品開発の研究対象としてはこれまであまり着目されていない。２００２年に癌の創薬標的としての可能性が報告されるが、ＮＥＫ６タンパク質がＳＭＡＤ２／３タンパク質と相互作用すること、組織の線維化を促進することについて具体的な報告はない。
米国特許出願公開第２００４／００９７４４１号明細書
　本発明は、新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ブレオマイシン誘発肺線維症モデルを用いた解析から、ＮＥＫ６（ＮＩＭＡ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　６）のｍＲＮＡレベルの亢進が見られることに着目し研究を進めた結果、ＮＥＫ６がＴＧＦ－β下流で線維化に寄与するＳＭＡＤ系シグナルを制御することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤；
〔２〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む線維症治療剤；
〔３〕　肺線維症、肝線維症又は腎線維症を治療対象とする、〔２〕の治療剤；
〔４〕　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群より選ばれる二本鎖核酸分子。
　（ａ）５’末端に配列番号１に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号６に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
　（ｂ）５’末端に配列番号２に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号７に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
　（ｃ）５’末端に配列番号３に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号８に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
　（ｄ）５’末端に配列番号４に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号９に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
　（ｅ）５’末端に配列番号５に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号１０に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子；
〔５〕　さらにガイド鎖（アンチセンス鎖）及び／又はパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端に１～１１塩基のリボヌクレオチド残基及び／又はデオキシヌクレオチド残基が付加され、突出端を形成している、〔４〕の二本鎖核酸分子；
〔６〕　〔４〕又は〔５〕に示されたパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端とガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結され、あるいは、〔４〕又は〔５〕に示されたガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端とパッセンジャー鎖（センス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結されたヘアピン型ＲＮＡ構造を形成している一本鎖核酸分子；
〔７〕　配列番号１～５から選ばれるＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含む、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の一本鎖核酸分子：
　（Ａ）　領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）を含む又はのみからなり、
５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）の順で配置され、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
かつ前記領域（Ｘ）が、上記発現抑制配列を含む；
　（Ｂ）領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、領域（Ｘ）、領域（Ｙ）、リンカー領域（Ｌｙ）及び領域（Ｙｃ）を、５’側から３’側にかけてこの順序で含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成し、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｙｃ）が、前記領域（Ｙ）と相補的であり、
かつ前記リンカー領域（Ｌｘ）及び／又はリンカー領域（Ｌｙ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域（Ｚ）が、上記発現抑制配列を含む。
〔８〕　前記リンカー領域（Ｌｘ）及び／又は（Ｌｙ）が、下記式（Ｉ）で表わされる、〔７〕の一本鎖核酸分子。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 前記式中、
　Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
　Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
　Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５又はＣ－６に結合する水素原子又は置換基であり；
　Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
　Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
　ただし、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
　Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
　Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
　ただし、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
　Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
　ｌは、１又は２であり；
　ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
　ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
　環Ａは、前記環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよく、
　前記環Ａ内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよく、
　前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）は、それぞれ、－ＯＲ１－又は－ＯＲ２－を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
　前記領域（Ｙｃ）及び前記領域（Ｙ）は、それぞれ、－ＯＲ１－又は－ＯＲ２－を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
　ここで、Ｒ１及びＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記構造（Ｉ)である；
〔９〕　Ｘ又はＺが、配列番号１１～２５からなる群より選ばれる配列を含む、〔７〕又は〔８〕の一本鎖核酸分子；
〔１０〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を対象に投与することを含む、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を阻害する方法；
〔１１〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を対象に投与することを含む、線維症を治療する方法；
〔１２〕　ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化の阻害に使用するＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸； 
〔１３〕　線維症治療に使用するＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸；
〔１４〕　ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の使用；及び
〔１５〕　線維症治療剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の使用。
〔１６〕　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、ＫＢ－００１～０１１の発現抑制配列（下線部部分）を含む核酸である、〔１５〕の使用。
　本発明により新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤の提供が可能となる。
ＮＥＫ６のＣｏｄｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ領域の配列及び実施例７で作製したｓｓＰＮ分子の標的部位を示す図である。 図２は、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤の有効成分となる核酸分子の一例を示す模式図である。（ｓｓＰＮ分子） 図３は、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤の有効成分となる核酸分子の一例を示す模式図である。（ｓｓＰＮ分子又はｓｓＮｃ分子） 図４は、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤の有効成分となる核酸分子の一例を示す模式図である。（ｓｓＰＮ分子又はｓｓＮｃ分子） 図５は、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤の有効成分となる核酸分子の一例を示す模式図である。（ｓｓＮｃ分子） 図６は、ｓｉＲＮＡを導入した場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を示すグラフである。 図７ａは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。図７ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ２タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。 図８ａは、抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降の結果を表す。図８ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降の結果を表す。 図９は、Ｈｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質を反応させた場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。 図１０ａは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるウェスタンブロットの結果を表す。図１０ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるホタルルシフェラーゼの発光量を表す。 図１１ａは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１１ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を表す。 図１２ａは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１２ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を表す。 図１３は、肝星細胞にＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを導入した場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質（ｐＳＭＡＤ３）のウェスタンブロットの結果を表す。 図１４は、肝星細胞に各種ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを導入した場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質（ｐＳＭＡＤ３）のウェスタンブロットの結果を表す。 図１５ａは、肝星細胞においてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６の転写量を表す。図１５ｂは、肝星細胞においてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎの転写量を表す。図１５ｃは、肝星細胞においてＮＥＫ６をノックダウンした場合のαＳＭＡ遺伝子の転写量を表す。 図１６は、腎臓線維芽細胞においてＮＥＫ６をノックダウンした場合のリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を表す。 図１７ａは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合の血清中ＧＰＴの測定結果を表す。図１７ｂは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合の血清中ＧＯＴの測定結果を表す。 図１８は、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を表す。 図１９ａは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を表す。図１９ｂは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１９ｃは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ３ａ１遺伝子の転写量を表す。図１９ｄは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＴｉｍｐ１遺伝子の転写量を表す。 図２０ａは、ＢＤＬモデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を表す。図２０ｂは、ＢＤＬモデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図２０ｃは、ＢＤＬモデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ３ａ１遺伝子の転写量を表す。図２０ｄは、ＢＤＬモデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＴｉｍｐ１遺伝子の転写量を表す。 図２１は、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合の肝臓の病理解析の結果を表す。図２１ａはＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群の結果を表す。図２１ｂはＣＣｌ４投与の溶媒投与群の結果を表す。図２１ｃはＣＣｌ４投与の核酸投与群の結果を表す。
　本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いるものである。また、本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。本発明において、塩基数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１～４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する。
　本発明は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤及び当該核酸を有効成分として含む線維症治療剤を提供するものである。以下、本発明の内容について詳細に説明する。
（１）ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸
　ＮＥＫ６タンパク質は、細胞分裂の制御に関わる１１個のＮＩＭＡ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙの１つであり、細胞周期のＭ期においてリン酸化（活性化）される。
　本発明の標的であるＮＥＫ６遺伝子は、哺乳類由来の遺伝子であり、好ましくはヒト由来の遺伝子である。ヒト由来のＮＥＫ６遺伝子は、７種のバリアントが報告されているが、その中のアイソフォーム２のＣｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ領域の配列を図１に表す（配列番号５６）。
　核酸分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制メカニズムは、特に制限されるものではなく、発現をダウンレギュレーションできるものであればよい。ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制は、ＮＥＫ６遺伝子からの転写産物の生成量の減少、ＮＥＫ６遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、又は前記翻訳産物の活性の減少等によって確認することができる。
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸としては、ＮＥＫ６ ｍＲＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＰＮ分子、ｓｓＮｃ分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイムなどがあげられる。
　アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＰＮ分子、ｓｓＮｃ分子、リボザイムは、当業者であれば、上記のヒトＮＥＫ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて容易に取得することができる。好ましくは、ＮＥＫ６ アイソフォーム２のＣｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ領域の配列（配列番号５６）に基づいて作製した核酸である。
（２）ｓｉＲＮＡ
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を以下に説明する。
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と対合するガイド鎖（アンチセンス鎖）、ガイド鎖と二本鎖を形成しているパッセンジャー鎖（センス鎖）からなる核酸分子である。ｓｉＲＮＡは、細胞内においてＡｒｇｏｎａｕｔｅ（ＡＧＯ）タンパク質を中核とする ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）と呼ばれる複合体に取り込まれた後、センス鎖はＡＧＯにより分解され、ガイド鎖はＲＩＳＣに残る。ガイド鎖のシード領域（ガイド鎖の５’末端から２－８塩基の７塩基領域）は、標的配列を認識する上で重要な働きを有していると考えられており、オフターゲット効果を回避する目的から標的遺伝子に特異的なシード領域を選択することが好ましいとされている。したがって、本発明の有効成分である核酸のシード領域についてもＮＥＫ６遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。例えば、ＮＥＫ６遺伝子に相補的であって、且つ、ＮＥＫ７遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ ｄａｔａｂａｓｅ：ＮＭ＿１３３４９４．２）に相補的でない、あるいは、領域中１以上（例えば1～３）の塩基がＮＥＫ７遺伝子に非相補的（ミスマッチ）である配列をシード領域として含む核酸を選択することがあげられる。また、全長配列についても、例えば、ＮＥＫ６遺伝子に対しては相補的であり、ＮＥＫ７遺伝子に対しては非相補的（ミスマッチ）な塩基を増加させる（例えば、４以上、好ましくは５～７）ことは、オフターゲット効果を回避する上で有用である。ガイド鎖に含まれる発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５～３０塩基であり、好ましくは、１９～２５塩基であり、より好ましくは１９～２３塩基であり、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
　前記発現抑制配列は、３’側に、さらに付加配列を有することで突出端を形成してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１～１１塩基であり、好ましくは１～４塩基である。付加配列は、リボヌクレオチド残基でもデオキシリボヌクレオチド残基でもよい。
　ガイド鎖の塩基数は、例えば、１９～５０塩基であり、好ましくは１９～３０塩基であり、より好ましくは、１９～２５塩基であり、さらに好ましくは１９～２３塩基であり、ことさら好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
　パッセンジャー鎖の塩基数は、例えば、１９～５０塩基であり、好ましくは１９～３０塩基であり、より好ましくは、１９～２５塩基であり、さらに好ましくは１９～２３塩基であり、ことさら好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２１塩基である。
　パッセンジャー鎖で、ガイド鎖と相補性を示す領域は、例えば、１９～５０塩基であり、好ましくは１９～３０塩基であり、より好ましくは、１９～２５塩基であり、さらに好ましくは１９～２３塩基である。前記領域は、３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１～１１塩基であり、好ましくは１～４塩基であり、付加配列は、リボヌクレオチド残基でもデオキシリボヌクレオチド残基でもよい。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖の相補性を示す領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１～３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
　ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ６遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、ｓｉＳＮＩＰＥＲ（登録商標）、創薬・診断研究用ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）等のｓｉＲＮＡ配列設計システムに従って得ることができる。
　ＮＥＫ６ｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ６に特異的に作用するｓｉＲＮＡが好ましく、例えば以下のような二本鎖核酸をあげることができる。
（ａ）５’末端に配列番号１に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号６に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
（ｂ）５’末端に配列番号２に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号７に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｃ）５’末端に配列番号３に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号８に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｄ）５’末端に配列番号４に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号９に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｅ）５’末端に配列番号５に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号１０に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端とガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結され、あるいは、ガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端とパッセンジャー鎖（センス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結されたヘアピン型ＲＮＡ構造を形成している一本鎖核酸分子であってもよい。
　前記ヌクレオチド残基からなるリンカー配列の長さは、特に制限されないが、例えば、前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー配列の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記リンカー配列の塩基数の具体例は、１～１００塩基、２～８０塩基、３～５０塩基である。
　前記非ヌクレオチド構造のリンカーの例としては、ヘキサエチレングリコールリンカー、ポリ－（オキシホスフィニコ－オキシ－１，３－プロパンジオール）リンカー、アリルリンカー、又はポリエチレングリコールリンカー等の化学リンカー、カルバメート構造を有するアミノリンカー等をあげることができる。前記非ヌクレオチド構造リンカーの長さは、特に制限されないが、例えば、前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。
（３）ｓｓＰＮ分子
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つとなるｓｓＰＮ分子について説明する。ｓｓＰＮ分子は、ＷＯ２０１２／０１７９１９に開示される生物学的安定性に優れた一本鎖ＲＮＡ核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
　本発明の有効成分となるｓｓＰＮ分子は、ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする。ｓｓＰＮ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
　ｓｓＰＮ分子において、ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。ＮＥＫ６ ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡ配列は、ＮＥＫ６遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、既存のｓｉＲＮＡ設計システムに従って得ることができ、ｓｓＰＮ分子においても、前記ｓｉＲＮＡの発現抑制配列を、ｓｓＰＮ分子の発現抑制配列として使用することができる。
　前記発現抑制配列は、例えば、ＮＥＫ６遺伝子の標的領域に対して、８０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、ことさらに好ましくは９８％以上であり、特に好ましくは１００％である。
　特に、ｓｉＲＮＡのシード領域に該当する部分については、ｓｉＲＮＡの場合と同様にＮＥＫ６遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。
　ｓｓＰＮ分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制は、例えば、ＲＮＡ干渉が生じることによると推測されるが、このメカニズムにより限定されるものではない。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。
　ｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造と、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造との両方を有してもよい。
　ｓｓＰＮ分子において、前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、５員環の２位の炭素（Ｃ－２）以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素及び窒素は、例えば、水素が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ－２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記プロリン骨格及びプロリノール骨格等は、例えば、生体内物質及びその還元体であるため、安全性にも優れる。
　ｓｓＰＮ分子において、前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、６員環の２位の炭素（Ｃ－２）以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよい。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素及び窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記６員環の２位の炭素（Ｃ－２）と窒素である。
　前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含んでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
　ｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　前記式（Ｉ）中、例えば、
　Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
　Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
　Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５又はＣ－６に結合する水素原子又は置換基であり、
　Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
　Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
　ただし、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
　Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、又は、
　Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
　ただし、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
　Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
　ｌは、１又は２であり；
　ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
　ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
　環Ａは、前記環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
　前記環Ａ内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）は、それぞれ、－ＯＲ１－又は－ＯＲ２－を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
　ここで、Ｒ１及びＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記構造（Ｉ)である。
　前記式（Ｉ）中、Ｘ１及びＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
　前記式（Ｉ）中、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳである。
　前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１又は２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型及びＤ型のいずれでもよい。
　前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５又はＣ－６に結合する水素原子又は置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４、オキソ基（＝Ｏ）、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等である。
　Ｒ４及びＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり、同一でも異なってもよい。Ｒ４及びＲ５としての置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
　Ｒ４及びＲ５としての保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」　　Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９７３）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２－アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１－（２－シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２－シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）及びトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基及びＴＥＭ基等があげられる。
　前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子（例えば、１～３個）が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
　前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子（例えば、１～３個）が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
　Ｌ１のｎ及びＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎ及びｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎ及びｍは、例えば、製造コスト及び収率等の点から、それぞれ、０～３０が好ましく、より好ましくは０～２０であり、さらに好ましくは０～１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０～３０であり、好ましくは０～２０であり、より好ましくは０～１５である。なお、Ｌ１のｎ及びＬ２のｍは、それぞれのアルキレン鎖の炭素原子数であるが、Ｌ１又はＬ２のアルキレン鎖の一つ以上炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖である場合は、ｎ及びｍは、炭素原子数と置換された酸素原子数の合計数を意味する。
　Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基である。Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄの置換基及び保護基は、例えば、Ｒ４及びＲ５の置換基及び保護基と同様である。
　前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ及びＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
　前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）は、例えば、それぞれ、－ＯＲ１－又は－ＯＲ２－を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。ここで、Ｒ１及びＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１及びＲ２が存在する場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記式（Ｉ）の構造である。Ｒ１及び／又はＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１及び／又はＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１及び／又はＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個又は４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１及びＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
　前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）と、－ＯＲ１－及び－ＯＲ２－との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
　前記領域（Ｘｃ）は、－ＯＲ２－を介して、前記領域（Ｘ）は、－ＯＲ１－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
　前記領域（Ｘｃ）は、－ＯＲ１－を介して、前記領域（Ｘ）は、－ＯＲ２－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
　前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ－１）～式（Ｉ－９）が例示でき、下記式において、ｎ及びｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０～１０の整数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　前記式（Ｉ－１）～（Ｉ－９）において、ｎ、ｍ及びｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ－１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ－２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ－３）において、ｎ＝４又は８、前記（Ｉ－４）において、ｎ＝７又は８、前記式（Ｉ－５）において、ｎ＝３及びｍ＝４、前記（Ｉ－６）において、ｎ＝８及びｍ＝４、前記式（Ｉ－７）において、ｎ＝８及びｍ＝４、前記（Ｉ－８）において、ｎ＝５及びｍ＝４、前記式（Ｉ－９）において、ｑ＝１及びｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ－４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ－４ａ）に、前記式（Ｉ－８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ－８ａ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）と相補的である。このため、ｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
　ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）のみが折り返して前記領域（Ｘ）と二重鎖を形成してもよいし、さらに、他の領域において新たな二重鎖を形成してもよい。以下、前者のｓｓＰＮ分子、すなわち、二重鎖形成が１カ所である分子を「第１のｓｓＰＮ分子」といい、後者のｓｓＰＮ分子、すなわち、二重鎖形成が２カ所である分子を「第２のｓｓＰＮ分子」という。以下に、前記第１のｓｓＰＮ分子及び前記第２のｓｓＰＮ分子について、例示する。
（ｉ）第１のｓｓＰＮ分子
　前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）及び前記リンカー領域（Ｌｘ）からなる分子である。
　前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよいし、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよい。
　前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列のみからなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１～３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
　前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）の少なくとも一方に含まれる。前記第１のｓｓＰＮ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。後者の場合、前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、ＮＥＫ６遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、ＮＥＫ６遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。前記第１のｓｓＰＮ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｘｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。
　前記第１のｓｓＰＮ分子の一例を、図２の模式図に従って説明する。図２（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＰＮ分子について、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記ｓｓＰＮ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図２は、あくまでも、前記領域の連結順序及び二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
　前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。
　前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的であることを意味する。
　また、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなり、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることを意味する。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
　前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）又は（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
　　　　Ｘ＞Ｘｃ　　・・・（３）
　　　　Ｘ－Ｘｃ＝１～１０、好ましくは１、２又は３、
　　　　　　　　より好ましくは１又は２　　　　・・・（１１）
　　　　Ｘ＝Ｘｃ　　・・・（５）
　前記領域（Ｘ）及び／又は前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。
　前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５～３０塩基であり、好ましくは、１９～２５塩基、より好ましくは１９～２３塩基であり、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側及び／又は３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１～３１塩基であり、好ましくは、１～２１塩基であり、より好ましくは、１～１１塩基である。
　前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む場合、その下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基であり、さらに好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘ）の塩基数の具体例は、例えば、１９～５０塩基であり、好ましくは、１９～３０塩基、より好ましくは１９～２５塩基、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
　前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基であり、さらに好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘｃ）の塩基数の具体例は、例えば、１９～５０塩基であり、好ましくは、１９～３０塩基、より好ましくは１９～２５塩基、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２１塩基である。
　前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド残基の他に、前記ヌクレオチド残基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数の具体例は、１～１００塩基、２～８０塩基、３～５０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
　前記第１のｓｓＰＮ分子の全長は、特に制限されない。前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは４４塩基であり、さらに好ましくは４８塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第１のｓｓＰＮ分子の全長の塩基数の合計の具体例は、３８～３００塩基、４２～２００塩基、４４～１５０塩基、４８～１００塩基、４８～８０塩基である。前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、さらに好ましくは４４ 塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計の具体例は、３８～３００塩基、４２～２００塩基、４２～１５０塩基、４４～１００塩基、４４～８０塩基である。
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する第１のｓｓＰＮ分子の具体例として、以下の一本鎖核酸分子をあげることができる。
ＫＢ－００１
５’－ＧＡＧＧＧＡＧＵＵＣＣＡＡＣＡＡＣＣＵＣＵＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＡＧＡＧＧＵＵＧＵＵＧＧＡＡＣＵＣＣＣＵＣＣＡ－３’（配列番号３１）
ＫＢ－００２
５’－ＣＧＡＧＧＣＡＧＧＡＣＵＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＣＣＵＵＧＡＣＡＣＡＧＵＣＣＵＧＣＣＵＣＧＣＣ－３’（配列番号３２）
ＫＢ－００３
５’－ＣＧＵＧＧＡＧＣＡＣＡＵＧＣＡＵＵＣＡＣＧＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＣＧＵＧＡＡＵＧＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＡＣＧＧＣ－３’（配列番号３３）
ＫＢ－００４
５’－ＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＵＣＣＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣ－３’（配列番号３４）
ＫＢ－００５
５’－ＣＡＧＡＧＡＣＣＵＧＡＣＡＵＣＧＧＡＵＡＣＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＧＵＡＵＣＣＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＣＵＣＵＧＧＵ－３’（配列番号３５）
ＫＢ－００６
５’－ＧＧＡＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣＣＡＵ－３’（配列番号４６）
ＫＢ－００７
５’－ＣＵＡＵＧＧＡＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡ－３’（配列番号４７）
ＫＢ－００８
５’－ＧＣＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＡＡＡＧＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＣＵＵＵＵＣＧＡＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＧＣＣＡ－３’（配列番号４８）
ＫＢ－００９
５’－ＣＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＵＣＵＵＵＵＣＧＡＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＧＣＣ－３’（配列番号４９）
ＫＢ－０１０
５’－ＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＣＵＵＣＵＵＵＵＣＧＡＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＧ－３’（配列番号５０）
ＫＢ－０１１
５’－ＧＡＣＵＣＧＵＵＵＡＵＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＧＵＵＧＵＣＵＵＣＧＡＵＡＡＡＣＧＡＧＵＣＣＡ－３’（配列番号６１）
　式中、Ｌｘは、リンカー領域Ｌｘであり、下記構造式のＬ－プロリンジアミドアミダイトを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　また、好ましい第１のｓｓＰＮ分子としては、配列番号１～５から選ばれるＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する配列を含み、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）のみからなり、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）の順で配置され、
　前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
　かつ前記領域（Ｘ）が、上記発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子をあげることができる。
　さらに好ましくは、前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）の全領域又は部分領域に完全に相補的な上記一本鎖核酸である。特に好ましくは、前記領域（Ｘ） が、配列番号１１～２５からなる群より選ばれる配列を含む上記一本鎖核酸分子である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（ｉｉ）第２のｓｓＰＮ分子
　前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘｃ）の他に、さらに、領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙ）に相補的な領域（Ｙｃ）を有する分子である。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成している。なお、特に示さない限り、前記第２のｓｓＰＮ分子は、前記第１のｓｓＰＮ分子の記載を援用できる。
　前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、５’側領域（Ｘｃ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部５’側領域（Ｘ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部３’領域（Ｙ）、前記領域（Ｙｃ）を、３’側領域（Ｙｃ）ともいう。また、前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、３’側領域（Ｘｃ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部３’側領域（Ｘ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部５’領域（Ｙ）、前記領域（Ｙｃ）を、５’側領域（Ｙｃ）ともいう。
　前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）が連結して構成される」と定義するものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが、前記ｓｓＰＮ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
　前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１～３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
　前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｙ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１～３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
　前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とから形成される前記内部領域（Ｚ）及び前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一つに含まれ、さらに、前記領域（Ｙｃ）に含まれてもよい。好ましくは、前記内部領域（Ｚ）に前記発現抑制配列が含まれるｓｓＰＮ分子である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を有する場合、例えば、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｙ）のいずれに前記発現抑制配列を有してもよく、また、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列を有してもよい。前記第２のｓｓＰＮ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
　前記第２のｓｓＰＮ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）及び前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方でもよいし、前記内部領域（Ｚ）及び前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方と、さらに他の異なる領域であってもよい。
　前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結等があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態等があげられる。
　前記第２のｓｓＰＮ分子が前記リンカー領域（Ｌｙ）を有する場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記ヌクレオチド残基からなるリンカーでもよいし、前述した、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有するリンカーでもよい。後者の場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）で表わすことができ、前記リンカー領域（Ｌｘ）における前記式（Ｉ）の説明を全て援用できる。
　前記領域（Ｙｃ）及び前記領域（Ｙ）は、例えば、それぞれ、－ＯＲ１－又は－ＯＲ２－を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合する。ここで、Ｒ１及びＲ２は、前述のリンカー領域（Ｌｘ）と同様に、存在しても存在しなくてもよい。
　前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）及び前記（Ｙ）と、前記－ＯＲ１－及び－ＯＲ２－との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
　前記領域（Ｘｃ）は、－ＯＲ２－を介して、前記領域（Ｘ）は、－ＯＲ１－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
　前記領域（Ｙｃ）は、－ＯＲ１－を介して、前記領域（Ｙ）は、－ＯＲ２－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
　前記領域（Ｘｃ）は、－ＯＲ２－を介して、前記領域（Ｘ）は、－ＯＲ１－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
　前記領域（Ｙｃ）は、－ＯＲ２－を介して、前記領域（Ｙ）は、－ＯＲ１－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
　前記領域（Ｘｃ）は、－ＯＲ１－を介して、前記領域（Ｘ）は、－ＯＲ２－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
　前記領域（Ｙｃ）は、－ＯＲ１－を介して、前記領域（Ｙ）は、－ＯＲ２－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
　前記領域（Ｘｃ）は、－ＯＲ１－を介して、前記領域（Ｘ）は、－ＯＲ２－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
　前記領域（Ｙｃ）は、－ＯＲ２－を介して、前記領域（Ｙ）は、－ＯＲ１－を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
　前記第２のｓｓＰＮ分子について、前記リンカー領域（Ｌｙ）を有するｓｓＰＮ分子の一例を、図３の模式図に従って説明する。図３（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＰＮ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図３（Ｂ）は、前記ｓｓＰＮ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図３（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域及び前記Ｌｙ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図３は、あくまでも、各領域の連結順番及び二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域の形状等は、これに制限されない。また、図３は、前記領域（Ｘｃ）を５’側に示したが、これには制限されず、前記領域（Ｘｃ）が、３’側に位置してもよい。
　前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されない。各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
　前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である。なお、これには制限されず、例えば、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
　また、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
　前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である。なお、これには制限されず、例えば、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
　また、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、前記領域（Ｙｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
　前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）及び前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）との関係は、例えば、下記式（１）及び（２）の条件を満たす。
　　　　Ｚ＝Ｘ＋Ｙ　　　　　・・・（１）
　　　　Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ　　　・・・（２）
　前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たす。
　　　　Ｘ＝Ｙ　　・・・（１９）
　　　　Ｘ＜Ｙ　　・・・（２０）
　　　　Ｘ＞Ｙ　　・・・（２１）
　第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）及び（４）の条件を満たす。
　　　　Ｘ＞Ｘｃ　　・・・（３）
　　　　Ｙ＝Ｙｃ　　・・・（４）
（ｂ）下記式（５）及び（６）の条件を満たす。
　　　　Ｘ＝Ｘｃ　　・・・（５）
　　　　Ｙ＞Ｙｃ　　・・・（６）
（ｃ）下記式（７）及び（８）の条件を満たす。
　　　　Ｘ＞Ｘｃ　　・・・（７）
　　　　Ｙ＞Ｙｃ　　・・・（８）
（ｄ）下記式（９）及び（１０）の条件を満たす。
　　　　Ｘ＝Ｘｃ　　・・・（９）
　　　　Ｙ＝Ｙｃ　　・・・（１０）
　前記（ａ）～（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）及び（１２）の条件を満たす。
　　　　Ｘ－Ｘｃ＝１～１０、好ましくは１、２、３又は４、
　　　　　　　　より好ましくは１、２又は３　　・・・（１１）
　　　　Ｙ－Ｙｃ＝０　　・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）及び（１４）の条件を満たす。
　　　　Ｘ－Ｘｃ＝０　　・・・（１３）
　　　　Ｙ－Ｙｃ＝１～１０、好ましくは１、２、３又は４、
　　　　　　　　より好ましくは１、２又は３　　・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）及び（１６）の条件を満たす。
　　　　Ｘ－Ｘｃ＝１～１０、好ましくは、１、２又は３、
　　　　　　　　より好ましくは１又は２　　・・・（１５）
　　　　Ｙ－Ｙｃ＝１～１０、好ましくは、１、２又は３、
　　　　　　　　より好ましくは１又は２　　・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）及び（１８）の条件を満たす。
　　　　Ｘ－Ｘｃ＝０　　・・・（１７）
　　　　Ｙ－Ｙｃ＝０　　・・・（１８）
　前記（ａ）～（ｄ）の第２のｓｓＰＮ分子について、それぞれの構造の一例を、図４の模式図に従って説明する。図４は、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＰＮであり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＰＮ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＰＮ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＰＮ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＰＮ分子の例である。図４において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図４のｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」と表わしたが、これには制限されず、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図４は、あくまでも前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との関係、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状、リンカー領域（Ｌｙ）の有無等は、これには制限されない。
　前記（ａ）～（ｃ）のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）、及び、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントしない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントしない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図４において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｘ－Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｙ－Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｘ－Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ－Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
　他方、前記(ｄ)のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）の５’末端と前記領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
　前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙｃ）、及び前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数及びその位置に応じて、適宜決定できる。
　前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９～５０塩基、２０～４０塩基、２１～３０塩基、２１～２５塩基である。
　前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５～３０塩基であり、好ましくは、１９～２５塩基であり、より好ましくは１９～２３塩基であり、さらに好ましくは、２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側及び／又は３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１～３１塩基であり、好ましくは、１～２１塩基であり、より好ましくは、１～１１塩基であり、さらに好ましくは、１～７塩基であり、ことさらに好ましくは１～３塩基である。
　前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１～４９塩基であり、好ましくは１～３９塩基であり、より好ましくは１～２９塩基である。 前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１～４９塩基であり、好ましくは１～３９塩基であり、より好ましくは１～２９塩基である。前記領域（Ｘｃ）及び（Ｙｃ）のいずれか一方の塩基数は、１～４塩基であることが好ましく、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
　前記内部領域（Ｚ）、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、又は、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ－（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１～１０、好ましくは１～４、より好ましくは１、２又は３である。前記「Ｚ－（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）におけるフリーの領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
　前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前述の通りである。前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１～５０塩基、１～３０塩基、１～２０塩基、１～１０塩基、１～７塩基、１～４塩基等が例示できるが、これには制限されない。前記リンカー領域（Ｌｙ）は、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
　前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）と同じでもよいし、異なってもよい。
　前記第２のｓｓＰＮ分子の全長は、特に制限されない。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは４４塩基であり、さらに好ましくは４８塩基であり、特に好ましくは５０塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第２のｓｓＰＮ分子の全長の塩基数の合計の具体例は、３８～３００塩基、４２～２００塩基、４４～１５０塩基、４８～１００塩基、５０～８０塩基である。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及びリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは４４塩基であり、さらに好ましくは４８塩基であり、特に好ましくは５０塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、ことさらに好ましくは８０塩基であり、特に好ましくは６０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計の具体例は、３８～３００塩基、４２～２００塩基、４４～１５０塩基、４８～１００塩基、４８～８０塩基、５０～６０塩基である。
　ｓｓＰＮ分子は、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド構造を有していればよく、その他の構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基及び修飾された修飾ヌクレオチド残基等があげられる。ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
　前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）～（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
　前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチドと前記ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、下記（４）～（７）の残基で構成される。
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
　前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基及び前記非ヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）～（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
　ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。ｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基及び前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＰＮ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。ｓｓＰＮ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１又は２個である。
　ｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、「Ｐ－ｓｓＲＮＡ分子」ともいう。前記Ｐ－ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。前記Ｐ－ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基及び前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
　前記Ｐ－ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記Ｐ－ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する好ましいｓｓＰＮ分子として、配列番号１～５から選ばれるＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含み、領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、領域（Ｘ）、領域（Ｙ）、リンカー領域（Ｌｙ）及び領域（Ｙｃ）を、５’側から３’側にかけてこの順序で含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成し、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｙｃ）が、前記領域（Ｙ）と相補的であり、
かつ前記リンカー領域（Ｌｘ）及びリンカー領域（Ｌｙ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域（Ｚ）が、上記発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子をあげることができる。
（４）ｓｓＮｃ分子
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｓｓＮｃ分子を説明する。
ｓｓＮｃ分子は、ＷＯ２０１２／０５３６８に開示される一本鎖ＲＮＡ核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
ｓｓＮｃ分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）及び３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）及び内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする。
　ｓｓＮｃ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）において、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が、直接的に連結されている。
　ｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である。このため、５’側において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能であり、また、３’側において、前記領域（Ｙｃ）が前記領域（Ｙ）に向かって折り返し、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
　ｓｓＮｃ分子は、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
　ｓｓＮｃ分子における前記発現抑制配列は、ｓｓＰＮ分子の説明を援用することができる。
　ｓｓＮｃ分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制は、例えば、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに前記発現抑制配列を配置した構造をとることで、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡ干渉に類似する現象（ＲＮＡ干渉様の現象）が生じることによると推測される。なお、ｓｓＮｃ分子のメカニズムもｓｓＰＮ分子のメカニズム同様限定されるものではない。ｓｓＮｃ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、ｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
　ｓｓＮｃ分子において、前記発現抑制配列は、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに含まれる。ｓｓＮｃ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。後者の場合、ｓｓＮｃ分子は、例えば、ＮＥＫ６遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、ＮＥＫ６遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。ｓｓＮｃ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。
　前記内部領域（Ｚ）は、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成される」と表わすものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが、例えば、前記ｓｓＮｃ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
　ｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、具体的には、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。ｓｓＮｃ分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を有していればよく、具体的には、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１～３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
　ｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している形態があげられる。
　ｓｓＮｃ分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態があげられる。
　ｓｓＮｃ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有してもよいし、いずれか一方を有してもよい。後者の場合として、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有さない、つまり、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが直接連結された形態があげられる。また、後者の場合として、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有さない、つまり、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが直接連結された形態があげられる。
　前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）は、それぞれ、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
　ｓｓＮｃ分子について、前記リンカー領域を有さないｓｓＮｃ分子の一例を、図５の模式図に従って説明する。図５（Ａ）は、前記ｓｓＮｃ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図５（Ｂ）は、前記ｓｓＮｃ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図５（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＮｃ分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）が折り返し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間で二重鎖が形成され、前記３’側領域（Ｙｃ）が折り返し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間で二重鎖が形成される。図５は、あくまでも、各領域の連結順番及び二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
　ｓｓＮｃ分子について、前記リンカー領域を有するｓｓＮｃ分子の一例を、図３の模式図に従って説明する。図３（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＮｃ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図３（Ｂ）は、前記ｓｓＮｃ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図３（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＮｃ分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域及び前記Ｌｙ領域が、ループ構造をとる。図３は、あくまでも、各領域の連結順番及び二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
　ｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部５’側領域（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されず、例えば、以下の通りである。
　前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
　また、前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることが好ましい。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、５’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
　前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
　また、前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることが好ましい。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、３’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
　ｓｓＮｃ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）及び前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）及び前記５’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）との関係は、例えば、下記式（１）及び（２）の条件を満たす。
　　　　Ｚ＝Ｘ＋Ｙ　　　　・・・（１）
　　　　Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ　　・・・（２）
　ｓｓＮｃ分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の長さの関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たしてもよい。
　　　　Ｘ＝Ｙ　　・・・（１９）
　　　　Ｘ＜Ｙ　　・・・（２０）
　　　　Ｘ＞Ｙ　　・・・（２１）
　ｓｓＮｃ分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）及び（４）の条件を満たす。
　　　　Ｘ＞Ｘｃ　　・・・（３）
　　　　Ｙ＝Ｙｃ　　・・・（４）
（ｂ）下記式（５）及び（６）の条件を満たす。
　　　　Ｘ＝Ｘｃ　　・・・（５）
　　　　Ｙ＞Ｙｃ　　・・・（６）
（ｃ）下記式（７）及び（８）の条件を満たす。
　　　　Ｘ＞Ｘｃ　　・・・（７）
　　　　Ｙ＞Ｙｃ　　・・・（８）
（ｄ）下記式（９）及び（１０）の条件を満たす。
　　　　Ｘ＝Ｘｃ　　・・・（９）
　　　　Ｙ＝Ｙｃ　　・・・（１０）
　前記（ａ）～（ｄ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）及び（１２）の条件を満たす。
　　　　Ｘ－Ｘｃ＝１～１０、好ましくは１、２、３又は４、
　　　　　　　　より好ましくは１、２又は３　　・・・（１１）
　　　　Ｙ－Ｙｃ＝０　　　　・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）及び（１４）の条件を満たす。
　　　　Ｘ－Ｘｃ＝０　　　　・・・（１３）
　　　　Ｙ－Ｙｃ＝１～１０、好ましくは１、２、３又は４、
　　　　　　　　より好ましくは１、２又は３　　・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）及び（１６）の条件を満たす。
　　　　Ｘ－Ｘｃ＝１～１０、好ましくは、１、２又は３、
　　　　　　　　より好ましくは１又は２　　・・・（１５）
　　　　Ｙ－Ｙｃ＝１～１０、好ましくは、１、２又は３、
　　　　　　　　より好ましくは１又は２　　・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）及び（１８）の条件を満たす。
　　　　Ｘ－Ｘｃ＝０　　　　　　　　・・・（１７）
　　　　Ｙ－Ｙｃ＝０　　　　　　　　・・・（１８）
　前記（ａ）～（ｄ）のｓｓＮｃ分子について、それぞれの構造の一例を、図４の模式図に従って説明する。図４は、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＮｃであり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＮｃ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＮｃ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＮｃ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＮｃ分子の例である。図４において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図４のｓｓＮｃ分子は、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」として表わすが、これには制限されず、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図４は、あくまでも、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）との関係、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状等は、これには制限されず、また、リンカー領域（Ｌｘ）及びリンカー領域（Ｌｙ）の有無も、これには制限されない。
　前記（ａ）～（ｃ）のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）、及び、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントできない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントできない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図４において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｘ－Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｙ－Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｘ－Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ－Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
　他方、前記(ｄ)のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の５’末端と前記３’側領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
　前記５’側領域（Ｘｃ）、前記３’側領域（Ｙｃ）、及び前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数（Ｆ）及びその位置に応じて、適宜決定できる。
　前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９～５０塩基、２０～４０塩基、２１～３０塩基、２１～２３塩基である。
　前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５～３０塩基であり、好ましくは、１９～２５塩基であり、より好ましくは１９～２３塩基であり、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側及び／又は３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１～３１塩基であり、好ましくは、１～２１塩基であり、より好ましくは、１～１１塩基であり、さらに好ましくは、１～７塩基であり、ことさらに好ましくは１～３塩基である。
　前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１～４９塩基であり、好ましくは１～３９塩基であり、より好ましくは１～２９塩基である。前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１～４９塩基であり、好ましくは１～３９塩基であり、より好ましくは１～２９塩基である。前記５’側領域（Ｘｃ）及び３’側領域（Ｙｃ）のいずれか一方の塩基数は、１～４塩基であることが好ましく、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
　前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、又は、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ－（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１～１０、好ましくは１～４、より好ましくは１、２又は３である。前記「Ｚ－（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
　ｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）のそれぞれの塩基数は、同じであっても異なってもよく、また、その塩基配列も、同じであっても異なってもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１～５０塩基、１～３０塩基、１～２０塩基、１～１０塩基、１～７塩基、１～４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
　ｓｓＮｃ分子の全長は、特に制限されない。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、ことさらに好ましくは８０塩基であり、特に好ましくは６０塩基である。前記ｓｓＮｃ分子の全長の塩基数の合計の具体例は、３８～３００塩基、４２～２００塩基、５０～１５０塩基、５１～１００塩基、５２～８０塩基である。ｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及びリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、ことさらに好ましくは８０塩基であり、特に好ましくは６０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計の具体例は、３８～３００塩基、４２～２００塩基、５０～１５０塩基、５１～１００塩基、５２～８０塩基、５２～６０塩基である。
　ｓｓＮｃ分子の主要構成単位である前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基及び修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。ｓｓＮｃ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
　ｓｓＮｃ分子において、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）～（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
　ｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基及び前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）～（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
　ｓｓＮｃ分子が、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有する場合、例えば、両方の構成単位が同じでもよいし、異なってもよい。具体例として、例えば、両方のリンカー領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基である形態、両方のリンカー領域の構成単位が前記非ヌクレオチド残基である形態、一方の領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基であり、他方のリンカー領域の構成単位が非ヌクレオチド残基である形態等があげられる。
　ｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基及び前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＮｃ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。ｓｓＮｃ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１～８個、１～６個、１～４個、１、２又は３個である。
　ｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、「Ｎ－ｓｓＲＮＡ分子」ともいう。前記Ｎ－ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子があげられる。前記Ｎ－ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基及び前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
　前記Ｎ－ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。前記Ｎ－ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。
（５）ｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子の合成方法
　ｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法及びＨ－ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。また、本発明のｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子は、ＷＯ２０１２／０５３６８、ＷＯ２０１２／１７９１９、ＷＯ２０１３／２７８４３、ＷＯ２０１６／１５９３７４に記載の製造方法に従って製造することができる。
（６）アンチセンスポリヌクレオチド
　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるアンチセンスポリヌクレオチドについて以下に説明する。
アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡ及び／又はアンチセンスＲＮＡであり、標的とする遺伝子ＲＮＡの全長もしくは一部に対するアンチセンス核酸を細胞内に導入することで効果を発揮する。
アンチセンスポリヌクレオチドの発現阻害のメカニズムとしては、
１）ｍＲＮＡの５’キャップ部位から開始コドンの約２５塩基下流までの領域を標的配列とする翻訳開始複合体の立体的阻害
２）標的ｍＲＮＡと相補的な一本鎖ＤＮＡであり、ＲＮａｓｅＨを介したｍＲＮＡ分解
３）ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエキソンとイントロンの境界領域を標的配列とするスプライシング阻害（ｍＲＮＡの成熟阻害）
があげられるが、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するものであれば、そのメカニズムは特に制限されるものではない。
　アンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡとの結合安定性（Ｔｍ値など）、ミスマッチ配列認識能、ヌクレアーゼ耐性、ＲＮａｓｅＨ活性等の点から修飾ヌクレオチド残基を含むことが好ましい。
　修飾ヌクレオチド残基としては、リボース残基、リン酸骨格への修飾が好ましい。
（７）ｍｉＲＮＡ
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｍｉＲＮＡについて以下に説明する。
　ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の阻害又はｍＲＮＡの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、細胞内に存在する短鎖（２０－２５塩基）のノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、まず、ＤＮＡから、ｍｉＲＮＡとその相補鎖とを含みヘアピンループ構造を取ることが可能な一本鎖のｐｒｉ－ＲＮＡとして転写される。次にｐｒｉ－ＲＮＡは、核内にあるＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって一部が切断されｐｒｅ－ＲＮＡとなって核外に輸送される。その後、ｐｒｅ－ＲＮＡはさらにＤｉｃｅｒによって切断されることにより、ｍｉＲＮＡとして機能する。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域へ不完全なハイブリダイゼーション結合を行い、そのｍＲＮＡがコードするタンパク質合成を阻害する。
　ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の遺伝子名又はｍＲＮＡ配列情報に基づいて、例えば、ｍｉＲＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｄｂ．ｏｒｇ／ｍｉＲＤＢ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）等のデータベースに従って得ることができる。
（８）核酸に使用されるヌクレオチド残基
　本発明の有効成分である核酸に使用されるヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）を有する。
　前記ヌクレオチド残基は、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基等があげられる。前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一又は実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一又は実質的に同一である。
　前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加及び／又は欠失、前記構成要素における原子及び／又は官能基の置換、付加及び／又は欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ．１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ｏｆ　ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：２１８３～２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。
　前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース－リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素又はフルオロ等に置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
　前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基及び／又は非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
　前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ－ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、又は、前記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
　前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）及びＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基又はアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
　前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）及びＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、及びＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子の５’末端ヌクレオチド残基及び３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
　前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基及びメチレンメチルイミノ基を含む。
　前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。
　前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基又は前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、又は、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加又は置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、又はこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加又は置換することもできる。
　前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎＮ－、－（ＣＨ２）ｎＯ－、－（ＣＨ２）ｎＳ－、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、及びモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬及びフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３又は６が好ましい。
　前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
　核酸分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基又はリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－グアノシンキャップ（７－メチル化又は非メチル化、７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸及び三リン酸（例えば、５’－α－チオ三リン酸、５’－γ－チオ三リン酸等）、５’－ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’－アルキルエーテルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
　前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
　前記塩基は、例えば、アデニン及びグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基等があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２－アミノアデニン、６－メチル化プリン等のアルキル誘導体；２－プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５－ハロウラシル及び５－ハロシトシン；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；６－アゾウラシル、６－アゾシトシン及び６－アゾチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、５－ハロウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル；８－ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８－置換プリン；５－トリフルオロメチル化及び他の５－置換ピリミジン；７－メチルグアニン；５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３－デアザ－５－アザシトシン；２－アミノプリン；５－アルキルウラシル；７－アルキルグアニン；５－アルキルシトシン；７－デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン；２，６－ジアミノプリン；５－アミノ－アリル－ウラシル；Ｎ３－メチルウラシル；置換１，２，４－トリアゾール；２－ピリジノン；５－ニトロインドール；３－ニトロピロール；５－メトキシウラシル；ウラシル－５－オキシ酢酸；５－メトキシカルボニルメチルウラシル；５－メチル－２－チオウラシル；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル；５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル；３－メチルシトシン；５－メチルシトシン；Ｎ４－アセチルシトシン；２－チオシトシン；Ｎ６－メチルアデニン；Ｎ６－イソペンチルアデニン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン；Ｎ－メチルグアニン；Ｏ－アルキル化塩基等があげられる。また、プリン及びピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　Ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８～８５９頁、クロシュビッツ　ジェー　アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ　Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、１９９０、及びイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
（９）その他の用語の定義
　本発明の有効成分である核酸、リンカー等の説明にて使用される用語は、当該技術分野での通常用いられるものであり、例えば、以下のように示すことができる。
　本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状又は分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１～３０であり、好ましくは、１～６又は１～４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
　本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状又は分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個又は複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２～８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１，３－ブタジエニル、３－メチル－２－ブテニル等があげられる。
　本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状又は分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個又は複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２～８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個又は複数の二重結合を有してもよい。
　本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基及び多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１－ナフチル、２－ナフチル、１－アントリル、２－アントリル、９－アントリル、１－フェナントリル、２－フェナントリル、３－フェナントリル、４－フェナントリル、９－フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１－ナフチル及び２－ナフチル等のナフチル等があげられる。
　本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基及び縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２－フリル、３－フリル）、チエニル（例：２－チエニル、３－チエニル）、ピロリル（例：１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル）、イミダゾリル（例：１－イミダゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１－ピラゾリル、３－ピラゾリル、４－ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４－トリアゾール－１－イル、１，２，４－トリアゾール－３－イル、１，２，４－トリアゾール－４－イル）、テトラゾリル（例：１－テトラゾリル、２－テトラゾリル、５－テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、５－オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３－イソキサゾリル、４－イソキサゾリル、５－イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３－イソチアゾリル、４－イソチアゾリル、５－イソチアゾリル）、ピリジル（例：２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル）、ピリダジニル（例：３－ピリダジニル、４－ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２－ピリミジニル、４－ピリミジニル、５－ピリミジニル）、フラザニル（例：３－フラザニル）、ピラジニル（例：２－ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）、ベンゾフリル（例：２－ベンゾ［ｂ］フリル、－ベンゾ［ｂ］フリル、４－ベンゾ［ｂ］フリル、５－ベンゾ［ｂ］フリル、６－ベンゾ［ｂ］フリル、７－ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２－ベンゾ［ｂ］チエニル、３－ベンゾ［ｂ］チエニル、４－ベンゾ［ｂ］チエニル、５－ベンゾ［ｂ］チエニル、６－ベンゾ［ｂ］チエニル、７－ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１－ベンゾイミダゾリル、２－ベンゾイミダゾリル、４－ベンゾイミダゾリル、５－ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、６－キノキサリニル）、シンノリニル（例：３－シンノリニル、４－シンノリニル、５－シンノリニル、６－シンノリニル、７－シンノリニル、８－シンノリニル）、キナゾリル（例：２－キナゾリニル、４－キナゾリニル、５－キナゾリニル、６－キナゾリニル、７－キナゾリニル、８－キナゾリニル）、キノリル（例：２－キノリル、３－キノリル、４－キノリル、５－キノリル、６－キノリル、７－キノリル、８－キノリル）、フタラジニル（例：１－フタラジニル、５－フタラジニル、６－フタラジニル）、イソキノリル（例：１－イソキノリル、３－イソキノリル、４－イソキノリル、５－イソキノリル、６－イソキノリル、７－イソキノリル、８－イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２－プテリジニル、４－プテリジニル、６－プテリジニル、７－プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１－アクリジニル、２－アクリジニル、３－アクリジニル、４－アクリジニル、９－アクリジニル）、インドリル（例：１－インドリル、２－インドリル、３－インドリル、４－インドリル、５－インドリル、６－インドリル、７－インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１－フェナジニル、２－フェナジニル）又はフェノチアジニル（例：１－フェノチアジニル、２－フェノチアジニル、３－フェノチアジニル、４－フェノチアジニル）等があげられる。
　本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３～１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
　本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル及びビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１－アダマンチル、２－アダマンチル等があげられる。
　本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
　本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３～７個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基及びスピロ炭化水素基も含む。
　本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２－フェネチル、及びナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」又は「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、例えば、ヒドロキシメチル及び２－ヒドロキシエチル等があげられる。
　本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル－Ｏ－基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、及びｎ－ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２－アミノエチル等があげられる。
　本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１－ピロリニル、２－ピロリニル、３－ピロリニル、１－ピロリジニル、２－ピロリジニル、３－ピロリジニル、ピロリジノン、１－イミダゾリニル、２－イミダゾリニル、４－イミダゾリニル、１－イミダゾリジニル、２－イミダゾリジニル、４－イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１－ピラゾリニル、３－ピラゾリニル、４－ピラゾリニル、１－ピラゾリジニル、３－ピラゾリジニル、４－ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－ピペリジニル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニル、ピペラジノン、２－モルホリニル、３－モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
　本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２－ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチル及びキノリン－３－イルメチル等があげられる。
　本発明において、「シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ－で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリール及びシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
　本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、及びプロピレン等があげられる。
　本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、スルファモイル、オキソ等があげられる。
（１０）ＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤
　ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害とは、ＴＧＦ－β刺激により促進されるＳＭＡＤ２及び／又はＳＭＡＤ３のリン酸化が阻害（制御）されることを意味する。
ＳＭＡＤ２／３は、ＴＧＦ－βＩ型レセプターによってリン酸化を受けるＲ－ＳＭＡＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＳＭＡＤ）の１種であり、ＴＧＦ－βによる刺激後、リン酸化（活性化）されたＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３は、Ｃｏ－ＳＭＡＤ（ｃｏｍｍｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ ＳＭＡＤ）であるＳＭＡＤ４とともに核内へ移行する。実施例４に示すように、本発明者らは、ＮＥＫ６タンパク質が、細胞内でＳＭＡＤ２／３タンパク質と相互作用し、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を促進することを見出した。リン酸化されたＳＭＡＤ２／３タンパク質はＳＭＡＤタンパク質複合体形成し、核内に移行し、α―ＳＭＡ、α２－コラーゲン、インターフェロンβ、インターロイキン－５、ＶＥＧＦ等の転写を亢進する。
　したがって、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤によってＳＭＡＤシグナル系を阻害することで、α―ＳＭＡ、α２－コラーゲン、インターフェロンβ等の転写制御が可能となり、ひいては創傷治癒過程における、線維芽細胞、肝星細胞等の筋線維芽細胞への分化抑制、線維芽細胞等によるマトリックス合成の制御、炎症・免疫反応の調節等に有用であることが理解できる。
（１１）線維症治療剤
　本発明の線維症治療剤は、肝線維症、肝硬変、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アルコール性肝疾患、原発性硬化性胆菅炎、ヘモクロマトーシス、ウイルソン病、α１－アンチトリプシン欠損症、非ウイルス性鬱血性肝硬変、薬剤性肝障害、膵炎、膵線維症、網膜線維症、声帯瘢痕化、声帯粘膜線維症、喉頭線維症、肺線維症、間質性肺炎、特発性肺線維症、非特異性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺炎、急性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、サルコイドーシス、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、リンパ脈管筋腫症、肺胞蛋白症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、肺ランゲルハンス細胞組織球症、鉄肺症、アミロイドーシス、肺胞微石症、過敏性肺炎、じん肺、感染性肺疾患、薬剤性肺炎、放射線肺炎、嚢胞性線維症、骨髄線維症、腎線維症、慢性腎不全、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、悪性腎硬化症、多発性嚢胞腎、薬剤性腎障害、後腹膜線維症、膠原病、強皮症、先天性角化不全症、腎性全身性線維症の他、気道の線維化、腸管の線維化、膀胱の線維化、前立腺の線維化、皮膚の線維化を含む広く線維化に関する疾患に対する治療剤である。好ましくは、肝線維症、肝硬変、肺線維症、間質性肺炎、腎線維症、慢性腎不全である。
　本発明の線維症治療剤の投与方法は、特に制限されるものではないが、吸入、静注、経皮投与などの非経口投与であることが好ましい。本発明の治療方法における本発明の核酸分子の投与量は、前記疾患の治療上有効な量であれば特に制限されず、疾患の種類、重症度、齢、体重、投与経路等によって異なるが、通常、成人１回あたり約０．０００１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．００１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．００５～約５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。当該量を、例えば、１日３回～１ヶ月に１回、好ましくは１日～１週間に１回の間隔で投与することができる。本発明の線維症治療剤は、通常、薬学的に許容される担体とともに適当な医薬組成物として製剤化されて経口又は非経口の形で投与される。
　以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。また、特に記載しない限り、ヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に使用した培地は、１０％　ＦＣＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ社）であり、ヒト初代肝星細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）に使用した培地は、２％　ＦＣＳ、１％　Ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳｔｅＣＧＳ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）含有ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）である。
実施例１：　ｓｉＲＮＡを用いたＮＥＫ６のノックダウン
　ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、或いはＳｔｅａｌｔｈ　ＲＮＡｉ　ｓｉＲＮＡ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％　ＦＣＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ社）から０．１％　ＢＳＡ含有Ｆ－１２Ｋ培地に交換した。トランスフェクションから７２時間後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＨｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによるＮＥＫ６遺伝子の転写量に対する影響を調べた。ＮＥＫ６遺伝子の転写量は、ＮＥＫ６　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００２０５２２１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ　Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。１８ｓ　Ｐｒｏｂｅは下記のカスタム合成１８ｓ　ＭＧＢ　Ｐｒｏｂｅ、カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ１、カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ２を、それぞれ０．２μＭ、０．４μＭ、０．４μＭとなるように混合し、リアルタイムＰＣＲを行った。
カスタム合成１８ｓ　ＭＧＢ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
５’－ＡＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣ－３’（配列番号５７）
カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’－ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ－３’（配列番号５８）
カスタム合成１８ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’－ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ－３’（配列番号５９）
　ｓｉＲＮＡの配列は、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡ（配列番号５１～５４を等量混合）及びＳｔｅａｌｔｈ　ＲＮＡｉ　ｓｉＲＮＡ（配列番号５５）を使用した。
＜ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡ＞
ｓｉＮＥＫ６：５’－ＣＵＧＵＣＣＵＣＧＧＣＣＵＡＵＣＵＵＣ－３’（配列番号５１）
ｓｉＮＥＫ６：５’－ＵＡＵＵＵＧＧＧＵＧＧＵＵＣＡＧＵＵＧ－３’（配列番号５２）
ｓｉＮＥＫ６：５’－ＣＡＡＣＵＣＣＡＧＣＡＣＡＡＵＧＵＵＣ－３’（配列番号５３）
ｓｉＮＥＫ６：５’－ＵＡＣＵＵＧＡＵＣＡＵＣＵＧＣＧＡＧＡ－３’（配列番号５４）
＜Ｓｔｅａｌｔｈ　ＲＮＡｉ　ｓｉＲＮＡ＞
ｓｉＮＥＫ６：５’－ＡＡＧＵＡＣＵＵＣＣＡＵＡＣＵＧＵＣＣＵＣＵＣＣ－３’（配列番号５５）
　図６ａにＮＥＫ６に対するＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡが導入された場合のＮＥＫ６のリアルタイムＰＣＲの結果を、図６ｂにＮＥＫ６に対するＳｔｅａｌｔｈ　ＲＮＡｉ　ｓｉＲＮＡが導入された場合のＮＥＫ６のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡの導入は、ＮＥＫ６遺伝子の転写量を抑制した。したがって、用いられたＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡは、効率的に標的遺伝子の発現を抑制したことが示された。
実施例２：　ＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化に対する影響
　ＮＥＫ６タンパク質がＴＧＦ－βシグナルを制御する可能性を検討するため、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ２／３の量を解析した。
　ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）又はＳｔｅａｌｔｈ　ＲＮＡｉ　ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％　ＦＣＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地から０．１％　ＢＳＡ含有Ｆ－１２Ｋ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を終濃度５ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。ＴＧＦ－β添加２時間後、細胞を２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，６Ｍ　Ｕｒｅａ，１２％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社），１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社）］で溶解し、細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液にβ－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＳＭＡＤ２／３抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗β－Ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）によりウェスタンブロッティングを行った。
　図７ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ－βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。この時、総ＳＭＡＤ３タンパク質の量は変化しなかった。また、図７ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ２タンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ－βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ２の量が減少した。この時、総ＳＭＡＤ２タンパク質の量は変化しなかった。
　したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。
実施例３：　ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質との細胞内における相互作用
　ＮＥＫ６タンパク質が細胞内でＳＭＡＤ３と相互作用してＳＭＡＤ３をリン酸化しているかを検討するため、共免疫沈降を行った。
　ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６がクローニングされた発現ベクター（ｐＥＺ－Ｍ０２　Ｎｅｋ６，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）とＦＬＡＧタグで標識されたヒトＳＭＡＤ３がクローニングされた発現ベクター（ｐＥＺ－Ｍ１１　Ｆｌａｇ－ｈＳｍａｄ３，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）を、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ　ＨＰ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培地を交換した。トランスフェクション４８時間後、溶解バッファー（１７５ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．６，０．１％　ＮＰ４０，０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０，１．４ｍＭ　β－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）で細胞を回収し、遠心分離によって上清を得た。上清にＴｒｕｅＢｌｏｔ　Ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ　ＩｇＩＰ　Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）を添加し、遠心分離を行い、非特異的な結合を除去した。そこから得られた上清にコントロールとしてｎｏｒｍａｌ　ｇｏａｔ　ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、もしくは抗ＮＥＫ６抗体を加え、オーバーナイト４℃にてインキュベートした後に、ＴｒｕｅＢｌｏｔ　Ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ　ＩｇＩＰ　Ｂｅａｄｓを加え４時間、４℃にてインキュベートした。遠心分離を行って上清を除いた後に、ＴｒｕｅＢｌｏｔ　Ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ　ＩｇＩＰ　Ｂｅａｄｓを溶解バッファーで洗浄して非特異的な結合を除去した。２×ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，２０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２％　Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ，５０ｍＭ　ＤＴＴ）をＴｒｕｅＢｌｏｔ　Ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ　ＩｇＩＰ　Ｂｅａｄｓに添加して９５℃で５分間加熱し、上清に含まれる共免疫沈降物を回収した。抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降物に対して抗ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が共沈降されるかを検出した。
　図８ａに、抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が検出された。
　ＳＭＡＤ３タンパク質がＮＥＫ６と細胞内で相互作用しリン酸化されているかを解析するため、ヒトＮＥＫ６発現ベクターとＦＬＡＧタグで標識されたヒトＳＭＡＤ３発現ベクターをＬＬ２９細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培地を交換した。トランスフェクション４８時間後、溶解バッファー（２５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．６，０．１％　ＮＰ４０，０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０，１．４ｍＭ　β－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）で細胞を回収し、遠心分離によって上清を得た。得られた上清にＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加し、４℃にてオーバーナイトでインキュベートした。その後、遠心分離を行い、上清を除いた。Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌを溶解バッファーで洗浄して非特異的な結合を除去した。２×ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，２０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２％　Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ，５０ｍＭ　ＤＴＴ）をＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌに添加して９５℃で４分間加熱し、上清に含まれる共免疫沈降物を回収した。得られた共免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより大きさに基づいて分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌによる共免疫沈降物に対しては抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、抗ＮＥＫ６抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＮＥＫ６タンパク質とリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質が共沈降されるかを検出した。
　図８ｂに、抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＮＥＫ６タンパク質とＦＬＡＧ－ＳＭＡＤ３タンパク質が検出された。また、ヒトＮＥＫ６の発現ベクターのトランスフェクションによって、リン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質の量が上昇した。
　抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降物中にＳＭＡＤ３タンパク質が検出されたこと、及び逆に抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降物中にＮＥＫ６が検出されたことから、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が細胞内で相互作用して複合体を形成することが示された。更に、ヒトＮＥＫ６の発現ベクターのトランスフェクションによってリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質の量が上昇したことから、ＮＥＫ６タンパク質はＳＭＡＤ３タンパク質を細胞内でリン酸化することが示された。
実施例４：　ＮＥＫ６タンパク質によるＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化
　ＮＥＫ６タンパク質がＳＭＡＤ３タンパク質を基質として直接リン酸化している可能性を、ＮＥＫ６とＳＭＡＤ３の精製タンパク質を用いて検討した。
　Ｈｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質（ｅｕｒｏｆｉｎｓ社）とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を反応溶媒（１５０μＭ　ＡＴＰ，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＤＴＴ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）と混合し、３０°Ｃにて４５分間インキュベートした。５％　β－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及び０．０２５％　Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ　を含む２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを、反応液に等量添加して反応を停止させた後に、９５℃で５分加熱し、サンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、反応液に含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体によりウェスタンブロッティングを行った。
　図９にＨｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質を反応させた場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６タンパク質を用いることで、リン酸化ＳＭＡＤ３の量が上昇した。したがって、ＮＥＫ６タンパク質はＳＭＡＤ３タンパク質を基質として直接リン酸化することが示された。
実施例５：　ＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤタンパク質複合体の転写活性に対する影響
　ＮＥＫ６タンパク質が、ＳＭＡＤタンパク質複合体の核内移行後におこる転写活性も制御しているかを検討するため、ＳＭＡＤタンパク質複合体のＤＮＡ結合配列とルシフェラーゼ遺伝子を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。また、同時に調製したＬＬ２９細胞を用いてウェスタンブロッティングを実施し、ＮＥＫ６のノックダウンについて確認した。
　ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡである　ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション２４時間後、培地を１０％　ＦＣＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地から０．４％　ＦＣＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地に交換した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション４８時間後、ＳＭＡＤタンパク質複合体のＤＮＡ結合配列［ＳＭＡＤ　ｂｉｄｉｎｇ　ｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＢＥ）］とホタルルシフェラーゼ遺伝子がクローニングされた発現ベクター（ｐＴＬ－ＳＢＥ－ｌｕｃ：５’－ＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡ－３’（配列番号６０），Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）と野生型ウミシイタケルシフェラーゼを含むレポーターアッセイ補正用のベクター（ｐＲＬ－ＴＫ：Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ　ｗｉｔｈ　ＰＬＵＳ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクションした。発現ベクターのトランスフェクション２時間後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質を終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。ＴＧＦ－β添加２４時間後において、細胞を２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，６Ｍ　Ｕｒｅａ，１２％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解した。得られた細胞抽出液に含まれるタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。また、上記と同様に調製したＬＬ２９細胞をＤｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に順じて回収し、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼによる発光を測定した。ホタルルシフェラーゼの発光量をウミシイタケルシフェラーゼによる発光量で補正した。
　図１０ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少している事が示されたが、ＳＭＡＤ３タンパク質の量は変化しなかった。図１０ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合における、ウミシイタケルシフェラーゼで補正したホタルルシフェラーゼの発光量を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＴＧＦ－βによって上昇するホタルルシフェラーゼの発光量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤタンパク質複合体の転写活性が抑制されることが示された。
実施例６：　ＮＥＫ６のノックダウンによる線維症関連遺伝子の転写量に対する影響
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して治療的効果を示すことを検討するため、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
　ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞にヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％　ＦＣＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地から０．１％　ＢＳＡ含有Ｆ－１２Ｋ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質を終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。トランスフェクション７２時間後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＨｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによる遺伝子の転写量に対する影響を検出した。Ｃｏｌ１ａ１遺伝子とαＳＭＡ遺伝子の転写量は、Ｃｏｌ１ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００１６４００４＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、又はαＳＭＡ　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００４２６８３５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ　Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。
　図１１ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１の転写量、図１１ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＴＧＦ－βによって上昇するＣｏｌ１ａ１、αＳＭＡ、遺伝子の転写量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維症に対して治療的効果を示すことが示された。
実施例７：　一本鎖核酸分子の合成
　以下に示す核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ３９００　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により合成した。固相担体としてＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ）を用い、ＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いた固相合成を行った。固相担体からの切り出し及びリン酸基保護基の脱保護、塩基保護基の脱保護、２’－水酸基保護基の脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。
　本発明の下記一本鎖核酸分子において、Ｌｘは、リンカー領域Ｌｘであり、下記構造式のＬ－プロリンジアミドアミダイトを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　また、下記一本鎖核酸分子中の下線部は、ＮＥＫ６の遺伝子発現抑制配列である。
ＫＢ－００１
５’－ＧＡＧＧＧＡＧＵＵＣＣＡＡＣＡＡＣＣＵＣＵＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＡＧＡＧＧＵＵＧＵＵＧＧＡＡＣＵＣＣＣＵＣＣＡ－３’（配列番号３１）
ＫＢ－００２
５’－ＣＧＡＧＧＣＡＧＧＡＣＵＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＣＣＵＵＧＡＣＡＣＡＧＵＣＣＵＧＣＣＵＣＧＣＣ－３’（配列番号３２）
ＫＢ－００３
５’－ＣＧＵＧＧＡＧＣＡＣＡＵＧＣＡＵＵＣＡＣＧＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＣＧＵＧＡＡＵＧＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＡＣＧＧＣ－３’（配列番号３３）
ＫＢ－００４
５’－ＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＵＣＣＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣ－３’（配列番号３４）
ＫＢ－００５
５’－ＣＡＧＡＧＡＣＣＵＧＡＣＡＵＣＧＧＡＵＡＣＣＣ－Ｌｘ－ＧＧＧＵＡＵＣＣＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＣＵＣＵＧＧＵ－３’（配列番号３５）
実施例８：　ｓｓＰＮ分子（一本鎖核酸分子）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
　ＮＥＫ６に対して設計したｓｓＰＮ分子（一本鎖核酸分子）のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの評価を実施した。各項目の測定方法は、上述のＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　ＳＭＡＲＴ　ｐｏｏｌ　ｓｉＲＮＡとＳｔｅａｌｔｈ　ＲＮＡｉ　ｓｉＲＮＡで行った方法（実施例１、２及び６）に従った。ＫＢ－００１～００５のｓｓＰＮ核酸は全てＮＥＫ６の転写量を抑制し、標的遺伝子を効率的にノックダウンした。さらに、ＫＢ－００１～００５のｓｓＰＮ核酸を作用させることにより、リン酸化ＳＭＡＤ３のタンパク質量の減少が確認された。
　また、ＫＢ－００１とＫＢ－００３について線維化関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１及びαＳＭＡ）の転写量に及ぼす影響を調べた結果を図１２に示す。図１２ａにＫＢ－００１又はＫＢ－００３を作用させた場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を、図１２ｂにＫＢ－００１又はＫＢ－００３を作用させた場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を示す。ＫＢ－００１及びＫＢ－００３のいずれのｓｓＰＮ分子も線維化関連遺伝子の転写量を抑制していることを確認した。これらの結果から、ＮＥＫ６に対して設計したｓｓＰＮ分子（一本鎖核酸分子）の線維化抑制作用を確認することができた。
実施例９：　ＮＥＫ６のｉｎ　ｖｉｖｏノックダウンによる抗線維化作用の検証
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して治療的効果を示すことを確認するため、ブレオマイシン肺線維化モデルマウスに、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを投与して抗線維化作用を解析する。
　７週齢のＣｒｌ：ＣＤ１　（ＩＣＲ）マウス（日本チャールス・リバー社）に、０．４ｍｇ／ｋｇ体重の容量でブレオマイシン（日本化薬株式会社）を投与し、肺線維化モデルマウスを作製する。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡは、２日～７日に１回の頻度で、５０ｍｇ／ｋｇ体重を最大容量として投与する。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡの投与期間中は、１週間に１回の頻度で実験動物用マイクロＣＴでの画像診断を行う。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡの初回投与から１４～３０日目に解剖し、肺を摘出する。摘出した肺を用いた線維症関連遺伝子の転写量、線維症関連タンパク質の発現量の測定、病理学的解析等を行う。これらによって、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡ未投与群に比べて、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡ投与群で線維化が抑制されていることを確認することができ、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡの肺線維化モデルマウスでの抗線維化作用を示すことができる。
実施例１０：　肝星細胞におけるＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡのＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化に対する影響
　肝星細胞においてＮＥＫ６タンパク質がＴＧＦ－βシグナルを制御する可能性を検討するため、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
　ヒトの肝臓より単離されたヒト初代肝星細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）をポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）コート細胞培養ディッシュ上にて５日間培養した。その後、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＫＢ－００４）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を２％　ＦＣＳ、１％　Ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳｔｅＣＧＳ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）含有ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）から０．２％　ＦＣＳ、１％　ＳｔｅＣＧＳ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ培地に交換した。トランスフェクション７２時間後、リポ多糖（ＬＰＳ，Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。ＬＰＳ添加１１時間半後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ－β添加３０分後、細胞を２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ　［１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，６Ｍ　Ｕｒｅａ，１２％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　２％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社），１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社）］で溶解し、細胞抽出液とした。
　得られた細胞抽出液にβ－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び抗ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び抗ＳＭＡＤ２抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体　（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）によりウェスタンブロッティングを行った。
　図１３にＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質とリン酸化ＳＭＡＤ２タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ－βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３とリン酸化ＳＭＡＤ２の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質とＳＭＡＤ２タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。
実施例１１：　肝星細胞におけるＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡ　ＳＭＡＤ３リン酸化抑制作用
　ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡもＴＧＦ－βシグナルを制御する可能性を検討するため、各ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
　ヒトの肝臓より単離されたヒト初代肝星細胞をＰＬＬコート細胞培養ディッシュ上にて５日間培養した。その後、ヒトＮＥＫ６に対する各種ｓｉＲＮＡ（ＫＢ－００６、ＫＢ－００４、ＫＢ－０１１、ＫＢ－００５、ＫＢ－０１０をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を２％　ＦＣＳ、１％　ＳｔｅＣＧＳ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ培地から０．２％　ＦＣＳ、１％　ＳｔｅＣＧＳ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ培地に交換した。トランスフェクション７２時間後、ＬＰＳを終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。ＬＰＳ添加１１時間半後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ－β添加３０分後、細胞を２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，６Ｍ　Ｕｒｅａ，１２％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解し、細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液にβ－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎによりウェスタンブロッティングを行った。
　図１４に各種ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３のタンパク質のウェスタンブロッティング結果を示す。各種ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡの導入により、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ－βにより上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化が抑制されることが複数のＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡ配列を用いる事で示された。
実施例１２：　肝星細胞におけるＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡの線維症関連遺伝子に対する影響
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
　ヒトの肝臓より単離されたヒト初代肝星細胞をＰＬＬコート細胞培養ディッシュ上にて５日間培養した。その後、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＫＢ－００４）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を２％　ＦＣＳ、１％　Ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ培地から０．２％　ＦＣＳ、１％　ＳｔｅＣＧＳ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ培地に交換した。トランスフェクション７２時間後、ＬＰＳを終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。ＬＰＳ添加１１時間半後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ－β添加２４時間後、ＫＢ－００４をトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＨｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによる遺伝子の転写量に対する影響を検出した。ＮＥＫ６遺伝子、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子とαＳＭＡ遺伝子の転写量は、ＮＥＫ６　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００２０５２２１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ０１５４９９７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、又はαＳＭＡ　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００４２６８３５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ　Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。
　図１５ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＮＥＫ６の転写量、図１５ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎの転写量、図１５ｃにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を示す。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡにより、ＴＧＦ－βによって上昇するＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、αＳＭＡ遺伝子の転写量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。
実施例１３：　腎臓線維芽細胞におけるＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡのＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化に対する影響
　ＮＥＫ６タンパク質がＴＧＦ－βシグナルを制御する可能性を検討するため、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
　ラット腎線維芽細胞株ＮＲＫ－４９Ｆ細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＫＢ－００４）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地から０．１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ－βタンパク質を終濃度５　ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。添加後３０分或いは１時間後、細胞を２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ６．８，４％　ＳＤＳ，６Ｍ　Ｕｒｅａ，１２％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解し細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液にβ－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体（ａｂｃａｍ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。
　図１６にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ－βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。
実施例１４：　四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘発肝線維化モデルにおけるＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡの有効性評価
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを確認するため、ＣＣｌ４モデルマウスに、ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを静脈内投与して抗線維化作用を解析した。
　７週齢雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、１０ｖ／ｖ％ＣＣｌ４含有オリーブ油溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）を、１０　ｍＬ／ｋｇ体重で０，４，７，１１日目に腹腔内投与し、肝線維化モデルマウスを作製した。ＣＣｌ４の初回投与前日の体重で群わけを実施し、群設定は、ＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群（ｎ＝５）、ＣＣｌ４投与の溶媒投与群（ｎ＝１０）、ＣＣｌ４投与の核酸投与群（ｎ＝１０）とした。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡとしてＫＢ－００４を、投与溶媒としてｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３．０　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３．０の製品プロトコールに従い、０．３ｍｇ／ｍＬの核酸投与液を作製した。核酸投与群にはＫＢ－００４を含む核酸投与液を３ｍｇ／ｋｇ体重となるように尾静脈投与し、溶媒投与群には核酸投与群と等量の投与溶媒を、ＣＣｌ４の初回投与前日および病態誘発１０日目に尾静脈投与した。肝障害および線維化の評価は病態誘発１３日目で実施した（実施例１５、１６、１７及び１９）。
実施例１５：　ＣＣｌ４モデルでの肝障害マーカーの解析
　線維化とは、細胞や組織の障害に対する過剰な創傷治癒過程だと理解されている。そのため、線維化と共に細胞や組織の障害を抑制することは、各種線維症の治療に有効であると考えられている。そこで、ＮＥＫ６のノックダウンが肝障害に対して効果を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおける肝障害マーカーの測定を行った。
　病態誘発１３日目に尾静脈よりプレーンのキャピラリー採血管を用いて採血し、３０分以上静置した。静置後の血液を遠心分離し、血清を得た。トランスアミナーゼＣＩＩ－テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて血清中グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）及びグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）を測定した。測定方法は試薬の説明書に従った。
　図１７ａに血清中ＧＰＴの測定結果、図１７ｂに血清中ＧＯＴの測定結果を示した。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを投与することで、ＣＣｌ４モデルで認められた血清中ＧＰＴ及びＧＯＴの上昇が抑制された。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは肝障害を抑制することが示された。
実施例１６：　ＣＣｌ４モデルでのＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化の解析
　ＮＥＫ６のノックダウンがＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化に対して効果を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおけるリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。
　病態誘発１３日目に採取した肝臓を凍結後に粉砕し粉状にした。粉末状の肝臓へ溶解バッファー（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％　ＮＰ４０，０．１％　ＳＤＳ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１ｍＭ　Ｂｅｎｚｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，２％　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）を加え、ハンディ超音波発生機を用いて臓器抽出液を調製した。臓器抽出液を遠心分離して得られた上清へβ－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した。その後、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（ａｂｃａｍ社）及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体（ａｂｃａｍ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。リン酸化ＳＭＡＤ３はトータルＳＭＡＤ３量により補正した。
　図１８にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ－βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンはＣＣｌ４モデルの肝臓においてＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化を抑制することが示された。
実施例１７：　ＣＣｌ４モデルでの線維症関連遺伝子の解析
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維化に対して有効性を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおける線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
　病態誘発１３日目に採取した肝臓からＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡを抽出した。続いて、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔを用いてＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。ＴａｑＭａｎ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙを用いてＮＥＫ６　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００４８０７３０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び線維症関連遺伝子としてＣｏｌ１ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｏｌ３ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１２５４４７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｉｍｐ１　　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１３４１３６１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量を測定し、内部標準である１８ｓ　ｒＲＮＡ　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量との相対比を各遺伝子の転写量とした。　
　ＣＣｌ４モデルにおける各遺伝子の転写量を図１９ａ～ｄに示す。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡの投与によって、ＮＥＫ６遺伝子の転写量が低下した。このことから、用いられたＫＢ－００４は、効率的に標的遺伝子の転写を抑制したことが示された。この時、病態誘発によって誘導される線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｔｉｍｐ１）の転写量は有意に低下した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。
実施例１８：　胆管結紮誘発肝線維化（ＢＤＬ）モデルでの線維症関連遺伝子の解析
　ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、胆管結紮誘発肝線維化モデルマウス（ＢＤＬモデル）にＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを静脈内投与して線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
　９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を体重で群分けし、遺伝子導入試薬ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎ　３．０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の添付文書に従って調製したＫＢ－００４溶液（０．３ｍｇ／ｍＬ）を３ｍｇ／ｋｇ体重の用量で尾静脈内投与した（ｎ＝１２）。対照群には、溶媒のみを投与した（ｎ＝１５）。投与翌日、総胆管を２箇所結紮し、肝線維化モデルマウスを作製した。偽手術群は、生理食塩水（大塚生食注）を尾静脈内投与し、総胆管の剥離のみ行った（ｎ＝７）。胆管結紮１４日目に肝臓を採取し、上記と同様にしてＮＥＫ６　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００４８０７３０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び線維症関連遺伝子としてＣｏｌ１ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｏｌ３ａ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１２５４４７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｉｍｐ１　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１３４１３６１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量を測定し、内部標準であるＧＡＰＤＨ　Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ９９９９９９５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量との相対比を各遺伝子の転写量とした。
　ＢＤＬモデルにおける各遺伝子転写量を図２０にａ～ｄに示す。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡの投与によって、ＮＥＫ６遺伝子の転写量が低下した。このことから、用いられたＫＢ－００４は、効率的に標的遺伝子の転写を抑制したことが示された。この時、病態誘発によって誘導される線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｔｉｍｐ１）の転写量は有意に低下した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。
実施例１９：　ＣＣｌ４モデルでの病理解析
　ＮＥＫ６のノックダウンがＣＣｌ４誘発肝線維化モデルに対して効果を示すかを検討するため、病理像の観察を行った。
　病態誘発１３日目に肝臓の内側右葉を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液を用いて固定した。パラフィンで包埋した後に、組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。
　図２１に病理像の代表例を示した。図２１ａはＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群の結果、図２１ｂはＣＣｌ４投与の溶媒投与群の結果、図２１ｃはＣＣｌ４投与の核酸投与群の結果を表す。図２１ｂ中に多く認められる空胞変性は細胞の障害を示し、中央部付近に多く存在する核が染色していない部分は細胞の壊死を示す。ＮＥＫ６　ｓｉＲＮＡを投与することで、ＣＣｌ４モデルの肝臓組織で認められた細胞の障害や壊死が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンはＣＣｌ４誘発肝線維化モデルにおける病理像の変化を抑制することが示された。
　本発明により新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤の提供が可能となる。

Claims (8)

  1. 　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤。
  2. 　ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む線維症治療剤。
  3. 　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群より選ばれる二本鎖核酸分子。
    　（ａ）５’末端に配列番号１に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号６に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
    　（ｂ）５’末端に配列番号２に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号７に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
    　（ｃ）５’末端に配列番号３に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号８に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
    　（ｄ）５’末端に配列番号４に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号９に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
    　（ｅ）５’末端に配列番号５に示される配列を含む塩基数１９～３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号１０に示される配列を含む塩基数１９～３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
  4. 　さらにガイド鎖（アンチセンス鎖）及び／又はパッセンジャー鎖（センス鎖）の３‘末端に１～１１塩基のリボヌクレオチド残基及び／又はデオキシリボヌクレオチド残基が付加され、突出端を形成している、請求項３記載の二本鎖核酸分子。
  5. 　請求項３又は４に示されたパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端とガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造からなるリンカーを介して連結され、あるいは、請求項３又は４に示されたガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端とパッセンジャー鎖（センス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造からなるリンカーを介して連結されたヘアピン型ＲＮＡ構造を形成している一本鎖核酸分子。
  6. 　配列番号１～５から選ばれるＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含む、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の一本鎖核酸分子：
    　（Ａ）　領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）を含む又はのみからなり、
    ５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）の順で配置され、
    前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
    前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
    かつ前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む；
    　（Ｂ）領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、領域（Ｘ）、領域（Ｙ）、リンカー領域（Ｌｙ）及び領域（Ｙｃ）を、５’側から３’側にかけてこの順序で含み、
    前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成し、
    前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
    前記領域（Ｙｃ）が、前記領域（Ｙ）と相補的であり、
    かつ前記リンカー領域（Ｌｘ）及び／又はリンカー領域（Ｌｙ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
    前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を含む。
  7. 　前記リンカー領域（Ｌｘ）及び／又は（Ｌｙ）が、下記式（Ｉ）で表わされる、請求項６記載の一本鎖核酸分子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     前記式中、
    　Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
    　Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
    　Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５又はＣ－６に結合する水素原子又は置換基であり；
    　Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
    　Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    　ただし、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    　Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
    　Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    　ただし、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    　Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
    　ｌは、１又は２であり；
    　ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
    　ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
    　環Ａは、前記環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよく、
    　前記環Ａ内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよく、
    　前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）は、それぞれ、－ＯＲ１－又はＯＲ２－を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
    　前記領域（Ｙｃ）及び前記領域（Ｙ）は、それぞれ、－ＯＲ１－又はＯＲ２－を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
    　ここで、Ｒ１及びＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記構造（Ｉ)である。
  8. 　Ｘ又はＺが、配列番号１１～２５からなる群より選ばれる配列を含む、請求項６又は７記載の一本鎖核酸分子。
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