JPWO2019022257A1 - 線維症治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕 NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むSMAD2/3タンパク質のリン酸化阻害剤;
〔2〕 NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む線維症治療剤;
〔3〕 肺線維症、肝線維症又は腎線維症を治療対象とする、〔2〕の治療剤;
〔4〕 以下の(a)、(b)、(c)、(d)及び(e)からなる群より選ばれる二本鎖核酸分子。
(a)5’末端に配列番号1に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号6に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)から形成される二本鎖核酸分子
(b)5’末端に配列番号2に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号7に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
(c)5’末端に配列番号3に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号8に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
(d)5’末端に配列番号4に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号9に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
(e)5’末端に配列番号5に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号10に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子;
〔5〕 さらにガイド鎖(アンチセンス鎖)及び/又はパッセンジャー鎖(センス鎖)の3’末端に1〜11塩基のリボヌクレオチド残基及び/又はデオキシヌクレオチド残基が付加され、突出端を形成している、〔4〕の二本鎖核酸分子;
〔6〕 〔4〕又は〔5〕に示されたパッセンジャー鎖(センス鎖)の3’末端とガイド鎖(アンチセンス鎖)の5’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び/又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結され、あるいは、〔4〕又は〔5〕に示されたガイド鎖(アンチセンス鎖)の3’末端とパッセンジャー鎖(センス鎖)の5’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び/又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結されたヘアピン型RNA構造を形成している一本鎖核酸分子;
〔7〕 配列番号1〜5から選ばれるNEK6遺伝子の発現抑制配列を含む、以下の(A)又は(B)の一本鎖核酸分子:
(A) 領域(X)、リンカー領域(Lx)及び領域(Xc)を含む又はのみからなり、
5’側から3’側にかけて、前記領域(Xc)、前記リンカー領域(Lx)及び前記領域(X)の順で配置され、
前記領域(Xc)が、前記領域(X)と相補的であり、
前記リンカー領域(Lx)が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
かつ前記領域(X)が、上記発現抑制配列を含む;
(B)領域(Xc)、リンカー領域(Lx)、領域(X)、領域(Y)、リンカー領域(Ly)及び領域(Yc)を、5’側から3’側にかけてこの順序で含み、
前記領域(X)と前記領域(Y)とが連結して、内部領域(Z)を形成し、
前記領域(Xc)が、前記領域(X)と相補的であり、
前記領域(Yc)が、前記領域(Y)と相補的であり、
かつ前記リンカー領域(Lx)及び/又はリンカー領域(Ly)が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域(Z)が、上記発現抑制配列を含む。
〔8〕 前記リンカー領域(Lx)及び/又は(Ly)が、下記式(I)で表わされる、〔7〕の一本鎖核酸分子。
X1及びX2は、それぞれ独立して、H2、O、S又はNHであり;
Y1及びY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、O又はSであり;
R3は、環A上のC−3、C−4、C−5又はC−6に結合する水素原子又は置換基であり;
L1は、n個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、O又はSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、O又はSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、Rc及びRdは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり;
lは、1又は2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、前記環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域(Xc)及び前記領域(X)は、それぞれ、−OR1−又は−OR2−を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合し、
前記領域(Yc)及び前記領域(Y)は、それぞれ、−OR1−又は−OR2−を介して、前記リンカー領域(Ly)に結合し、
ここで、R1及びR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1及びR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記構造(I)である;
〔9〕 X又はZが、配列番号11〜25からなる群より選ばれる配列を含む、〔7〕又は〔8〕の一本鎖核酸分子;
〔10〕 NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸を対象に投与することを含む、SMAD2/3タンパク質のリン酸化を阻害する方法;
〔11〕 NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸を対象に投与することを含む、線維症を治療する方法;
〔12〕 SMAD2/3タンパク質のリン酸化の阻害に使用するNEK6遺伝子の発現を抑制する核酸;
〔13〕 線維症治療に使用するNEK6遺伝子の発現を抑制する核酸;
〔14〕 SMAD2/3タンパク質のリン酸化阻害剤を製造するための、NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸の使用;及び
〔15〕 線維症治療剤を製造するための、NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸の使用。
〔16〕 NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸が、KB−001〜011の発現抑制配列(下線部部分)を含む核酸である、〔15〕の使用。
NEK6タンパク質は、細胞分裂の制御に関わる11個のNIMA−related serine/threonine kinase familyの1つであり、細胞周期のM期においてリン酸化(活性化)される。
NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸の1つであるsiRNA(small interfering RNA)を以下に説明する。
siRNAは、標的遺伝子と対合するガイド鎖(アンチセンス鎖)、ガイド鎖と二本鎖を形成しているパッセンジャー鎖(センス鎖)からなる核酸分子である。siRNAは、細胞内においてArgonaute(AGO)タンパク質を中核とする RNA−inducing silencing complex(RISC)と呼ばれる複合体に取り込まれた後、センス鎖はAGOにより分解され、ガイド鎖はRISCに残る。ガイド鎖のシード領域(ガイド鎖の5’末端から2−8塩基の7塩基領域)は、標的配列を認識する上で重要な働きを有していると考えられており、オフターゲット効果を回避する目的から標的遺伝子に特異的なシード領域を選択することが好ましいとされている。したがって、本発明の有効成分である核酸のシード領域についてもNEK6遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。例えば、NEK6遺伝子に相補的であって、且つ、NEK7遺伝子(RefSeq database:NM_133494.2)に相補的でない、あるいは、領域中1以上(例えば1〜3)の塩基がNEK7遺伝子に非相補的(ミスマッチ)である配列をシード領域として含む核酸を選択することがあげられる。また、全長配列についても、例えば、NEK6遺伝子に対しては相補的であり、NEK7遺伝子に対しては非相補的(ミスマッチ)な塩基を増加させる(例えば、4以上、好ましくは5〜7)ことは、オフターゲット効果を回避する上で有用である。ガイド鎖に含まれる発現抑制配列の塩基数は、例えば、15〜30塩基であり、好ましくは、19〜25塩基であり、より好ましくは19〜23塩基であり、さらに好ましくは21、22、23塩基であり、特に好ましくは23塩基である。
(a)5’末端に配列番号1に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号6に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)から形成される二本鎖核酸分子
(b)5’末端に配列番号2に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号7に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
(c)5’末端に配列番号3に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号8に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
(d)5’末端に配列番号4に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号9に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
(e)5’末端に配列番号5に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端又は5’末端に配列番号10に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸の1つとなるssPN分子について説明する。ssPN分子は、WO2012/017919に開示される生物学的安定性に優れた一本鎖RNA核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
本発明の有効成分となるssPN分子は、NEK6遺伝子の発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域(X)、リンカー領域(Lx)及び領域(Xc)を含み、前記領域(X)と前記領域(Xc)との間に、前記リンカー領域(Lx)が連結され、前記領域(X)及び前記領域(Xc)の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、前記リンカー領域(Lx)が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする。ssPN分子は、その5’末端と3’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
X1及びX2は、それぞれ独立して、H2、O、S又はNHであり;
Y1及びY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、O又はSであり;
R3は、環A上のC−3、C−4、C−5又はC−6に結合する水素原子又は置換基であり、
L1は、n個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、O又はSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換れていなくてもよく、又は、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、O又はSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、Rc及びRdは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり;
lは、1又は2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、前記環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域(Xc)及び前記領域(X)は、それぞれ、−OR1−又は−OR2−を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合し、
ここで、R1及びR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1及びR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記構造(I)である。
条件(1)
前記領域(Xc)は、−OR2−を介して、前記領域(X)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(2)
前記領域(Xc)は、−OR1−を介して、前記領域(X)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
前記式(I)の構造は、例えば、下記式(I−1)〜式(I−9)が例示でき、下記式において、n及びmは、前記式(I)と同じである。下記式において、qは、0〜10の整数である。
ssPN分子は、例えば、前記領域(Xc)のみが折り返して前記領域(X)と二重鎖を形成してもよいし、さらに、他の領域において新たな二重鎖を形成してもよい。以下、前者のssPN分子、すなわち、二重鎖形成が1カ所である分子を「第1のssPN分子」といい、後者のssPN分子、すなわち、二重鎖形成が2カ所である分子を「第2のssPN分子」という。以下に、前記第1のssPN分子及び前記第2のssPN分子について、例示する。
前記第1のssPN分子は、例えば、前記領域(X)、前記領域(Xc)及び前記リンカー領域(Lx)からなる分子である。
前記第1のssPN分子は、例えば、5’側から3’側にかけて、前記領域(Xc)、前記リンカー領域(Lx)及び前記領域(X)を、前記順序で有してもよいし、3’側から5’側にかけて、前記領域(Xc)、前記リンカー領域(Lx)及び前記領域(X)を、前記順序で有してもよい。
前記第1のssPN分子において、前記領域(Xc)及び前記領域(X)の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。
X>Xc ・・・(3)
X−Xc=1〜10、好ましくは1、2又は3、
より好ましくは1又は2 ・・・(11)
X=Xc ・・・(5)
前記領域(X)及び/又は前記領域(Xc)が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。
KB−001
5’−GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC−Lx−GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA−3’(配列番号31)
KB−002
5’−CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC−Lx−GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC−3’(配列番号32)
KB−003
5’−CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC−Lx−GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC−3’(配列番号33)
KB−004
5’−GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC−Lx−GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC−3’(配列番号34)
KB−005
5’−CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC−Lx−GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU−3’(配列番号35)
KB−006
5’−GGAGAUAAGAUGAAUCUCUUCCC−Lx−GGGAAGAGAUUCAUCUUAUCUCCAU−3’(配列番号46)
KB−007
5’−CUAUGGAGAUAAGAUGAAUCUCC−Lx−GGAGAUUCAUCUUAUCUCCAUAGAA−3’(配列番号47)
KB−008
5’−GCGGACUUCCAGAUCGAAAAGCC−Lx−GGCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCCA−3’(配列番号48)
KB−009
5’−CGGACUUCCAGAUCGAAAAGACC−Lx−GGUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCC−3’(配列番号49)
KB−010
5’−GACUUCCAGAUCGAAAAGAAGCC−Lx−GGCUUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCG−3’(配列番号50)
KB−011
5’−GACUCGUUUAUCGAAGACAACCC−Lx−GGGUUGUCUUCGAUAAACGAGUCCA−3’(配列番号61)
前記リンカー領域(Lx)が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
かつ前記領域(X)が、上記発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子をあげることができる。
前記第2のssPN分子は、例えば、前記領域(X)、前記リンカー領域(Lx)及び前記領域(Xc)の他に、さらに、領域(Y)及び前記領域(Y)に相補的な領域(Yc)を有する分子である。前記第2のssPN分子において、前記領域(X)と前記領域(Y)とが連結して、内部領域(Z)を形成している。なお、特に示さない限り、前記第2のssPN分子は、前記第1のssPN分子の記載を援用できる。
条件(1)
前記領域(Xc)は、−OR2−を介して、前記領域(X)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR1−を介して、前記領域(Y)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(2)
前記領域(Xc)は、−OR2−を介して、前記領域(X)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR2−を介して、前記領域(Y)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(3)
前記領域(Xc)は、−OR1−を介して、前記領域(X)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR1−を介して、前記領域(Y)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(4)
前記領域(Xc)は、−OR1−を介して、前記領域(X)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR2−を介して、前記領域(Y)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
Z=X+Y ・・・(1)
Z≧Xc+Yc ・・・(2)
前記第2のssPN分子において、前記領域(X)の塩基数(X)と前記領域(Y)の塩基数(Y)の関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たす。
X=Y ・・・(19)
X<Y ・・・(20)
X>Y ・・・(21)
第2のssPN分子において、前記領域(X)の塩基数(X)、前記領域(Xc)の塩基数(Xc)、前記領域(Y)の塩基数(Y)及び前記領域(Yc)の塩基数(Yc)の関係は、例えば、下記(a)〜(d)のいずれかの条件を満たす。
(a)下記式(3)及び(4)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(3)
Y=Yc ・・・(4)
(b)下記式(5)及び(6)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(5)
Y>Yc ・・・(6)
(c)下記式(7)及び(8)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(7)
Y>Yc ・・・(8)
(d)下記式(9)及び(10)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(9)
Y=Yc ・・・(10)
(a)下記式(11)及び(12)の条件を満たす。
X−Xc=1〜10、好ましくは1、2、3又は4、
より好ましくは1、2又は3 ・・・(11)
Y−Yc=0 ・・・(12)
(b)下記式(13)及び(14)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(13)
Y−Yc=1〜10、好ましくは1、2、3又は4、
より好ましくは1、2又は3 ・・・(14)
(c)下記式(15)及び(16)の条件を満たす。
X−Xc=1〜10、好ましくは、1、2又は3、
より好ましくは1又は2 ・・・(15)
Y−Yc=1〜10、好ましくは、1、2又は3、
より好ましくは1又は2 ・・・(16)
(d)下記式(17)及び(18)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(17)
Y−Yc=0 ・・・(18)
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
前記リンカー領域(Lx)は、例えば、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチドと前記ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域(Lx)は、例えば、下記(4)〜(7)の残基で構成される。
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基
(6)非ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基
(6)非ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
前記領域(X)と前記領域(Y)とが連結して、内部領域(Z)を形成し、
前記領域(Xc)が、前記領域(X)と相補的であり、
前記領域(Yc)が、前記領域(Y)と相補的であり、
かつ前記リンカー領域(Lx)及びリンカー領域(Ly)が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域(Z)が、上記発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子をあげることができる。
NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸の1つであるssNc分子を説明する。
ssNc分子は、WO2012/05368に開示される一本鎖RNA核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
ssNc分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
5’側から3’側にかけて、5’側領域(Xc)、内部領域(Z)及び3’側領域(Yc)を、前記順序で含み、
前記内部領域(Z)が、内部5’側領域(X)及び内部3’側領域(Y)が連結して構成され、
前記5’側領域(Xc)が、前記内部5’側領域(X)と相補的であり、
前記3’側領域(Yc)が、前記内部3’側領域(Y)と相補的であり、
前記内部領域(Z)、前記5’側領域(Xc)及び前記3’側領域(Yc)の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする。
前記5’側領域(Xc)は、例えば、前記内部5’側領域(X)の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域(Xc)は、例えば、前記領域(X)と同じ塩基長であり、前記領域(X)の5’末端から3’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域(Xc)は、より好ましくは、前記領域(X)と同じ塩基長であり、且つ、前記領域(Xc)の全ての塩基が、前記領域(X)の全ての塩基と相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、1もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
Z=X+Y ・・・(1)
Z≧Xc+Yc ・・・(2)
X=Y ・・・(19)
X<Y ・・・(20)
X>Y ・・・(21)
(a)下記式(3)及び(4)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(3)
Y=Yc ・・・(4)
(b)下記式(5)及び(6)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(5)
Y>Yc ・・・(6)
(c)下記式(7)及び(8)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(7)
Y>Yc ・・・(8)
(d)下記式(9)及び(10)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(9)
Y=Yc ・・・(10)
(a)下記式(11)及び(12)の条件を満たす。
X−Xc=1〜10、好ましくは1、2、3又は4、
より好ましくは1、2又は3 ・・・(11)
Y−Yc=0 ・・・(12)
(b)下記式(13)及び(14)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(13)
Y−Yc=1〜10、好ましくは1、2、3又は4、
より好ましくは1、2又は3 ・・・(14)
(c)下記式(15)及び(16)の条件を満たす。
X−Xc=1〜10、好ましくは、1、2又は3、
より好ましくは1又は2 ・・・(15)
Y−Yc=1〜10、好ましくは、1、2又は3、
より好ましくは1又は2 ・・・(16)
(d)下記式(17)及び(18)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(17)
Y−Yc=0 ・・・(18)
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基
(6)非ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
ssPN分子及びssNc分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、PCRカセットによる方法等があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法及びH−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、RNA Phosphoramidites(2’−O−TBDMSi、商品名、三千里製薬)、ACEアミダイト、TOMアミダイト、CEEアミダイト、CEMアミダイト、TEMアミダイト等があげられる。また、本発明のssPN分子及びssNc分子は、WO2012/05368、WO2012/17919、WO2013/27843、WO2016/159374に記載の製造方法に従って製造することができる。
NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸の1つであるアンチセンスポリヌクレオチドについて以下に説明する。
アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスDNA及び/又はアンチセンスRNAであり、標的とする遺伝子RNAの全長もしくは一部に対するアンチセンス核酸を細胞内に導入することで効果を発揮する。
アンチセンスポリヌクレオチドの発現阻害のメカニズムとしては、
1)mRNAの5’キャップ部位から開始コドンの約25塩基下流までの領域を標的配列とする翻訳開始複合体の立体的阻害
2)標的mRNAと相補的な一本鎖DNAであり、RNaseHを介したmRNA分解
3)pre−mRNAのエキソンとイントロンの境界領域を標的配列とするスプライシング阻害(mRNAの成熟阻害)
があげられるが、NEK6遺伝子の発現を抑制するものであれば、そのメカニズムは特に制限されるものではない。
NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸の1つであるmiRNAについて以下に説明する。
本発明の有効成分である核酸に使用されるヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)及びウラシル(U)を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)及びチミン(T)を有する。
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、2’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、2’位炭素に結合する水酸基を、水素又はフルオロ等に置換できる。前記2’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
本発明の有効成分である核酸、リンカー等の説明にて使用される用語は、当該技術分野での通常用いられるものであり、例えば、以下のように示すことができる。
SMAD2/3タンパク質のリン酸化阻害とは、TGF−β刺激により促進されるSMAD2及び/又はSMAD3のリン酸化が阻害(制御)されることを意味する。
SMAD2/3は、TGF−βI型レセプターによってリン酸化を受けるR−SMAD(receptor regulated SMAD)の1種であり、TGF−βによる刺激後、リン酸化(活性化)されたSMAD2及びSMAD3は、Co−SMAD(common partner SMAD)であるSMAD4とともに核内へ移行する。実施例4に示すように、本発明者らは、NEK6タンパク質が、細胞内でSMAD2/3タンパク質と相互作用し、SMAD2/3タンパク質のリン酸化を促進することを見出した。リン酸化されたSMAD2/3タンパク質はSMADタンパク質複合体形成し、核内に移行し、α―SMA、α2−コラーゲン、インターフェロンβ、インターロイキン−5、VEGF等の転写を亢進する。
本発明の線維症治療剤は、肝線維症、肝硬変、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アルコール性肝疾患、原発性硬化性胆菅炎、ヘモクロマトーシス、ウイルソン病、α1−アンチトリプシン欠損症、非ウイルス性鬱血性肝硬変、薬剤性肝障害、膵炎、膵線維症、網膜線維症、声帯瘢痕化、声帯粘膜線維症、喉頭線維症、肺線維症、間質性肺炎、特発性肺線維症、非特異性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺炎、急性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、サルコイドーシス、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、リンパ脈管筋腫症、肺胞蛋白症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、肺ランゲルハンス細胞組織球症、鉄肺症、アミロイドーシス、肺胞微石症、過敏性肺炎、じん肺、感染性肺疾患、薬剤性肺炎、放射線肺炎、嚢胞性線維症、骨髄線維症、腎線維症、慢性腎不全、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、悪性腎硬化症、多発性嚢胞腎、薬剤性腎障害、後腹膜線維症、膠原病、強皮症、先天性角化不全症、腎性全身性線維症の他、気道の線維化、腸管の線維化、膀胱の線維化、前立腺の線維化、皮膚の線維化を含む広く線維化に関する疾患に対する治療剤である。好ましくは、肝線維症、肝硬変、肺線維症、間質性肺炎、腎線維症、慢性腎不全である。
IPF患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株LL29細胞に、ヒトNEK6に対するsiRNA(ON−TARGET plus SMART pool siRNA,Dharmacon社、或いはStealth RNAi siRNA,Thermo Fisher Scientific社)を、Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen社)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後、培地を10% FCS含有F−12K培地(Gibco社)から0.1% BSA含有F−12K培地に交換した。トランスフェクションから72時間後、siRNAをトランスフェクションした細胞から、RNeasy Mini Kit(Qiagen社)を用いてRNAを抽出した。得られたRNAをHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems社)を用いて逆転写を行い、cDNAを得た。得られたcDNAはTaqMan GeneExpression Assays(Applied Biosystems社)を用いてリアルタイムPCRを行い、NEK6のノックダウンによるNEK6遺伝子の転写量に対する影響を調べた。NEK6遺伝子の転写量は、NEK6 Taqman Probe(HS00205221_m1、Applied Biosystems社)での測定値を、18s Probeでの測定値で除することで算出した。18s Probeは下記のカスタム合成18s MGB Probe、カスタム合成18s Primer1、カスタム合成18s Primer2を、それぞれ0.2μM、0.4μM、0.4μMとなるように混合し、リアルタイムPCRを行った。
5’−ATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC−3’(配列番号57)
カスタム合成18s Primer1(ThermoFisher社):
5’−CGGCTACCACATCCAAGGAAG−3’(配列番号58)
カスタム合成18s Primer2(ThermoFisher社):
5’−GCTGGAATTACCGCGGCT−3’(配列番号59)
siNEK6:5’−CUGUCCUCGGCCUAUCUUC−3’(配列番号51)
siNEK6:5’−UAUUUGGGUGGUUCAGUUG−3’(配列番号52)
siNEK6:5’−CAACUCCAGCACAAUGUUC−3’(配列番号53)
siNEK6:5’−UACUUGAUCAUCUGCGAGA−3’(配列番号54)
<Stealth RNAi siRNA>
siNEK6:5’−AAGUACUUCCAUACUGUCCUCUCC−3’(配列番号55)
NEK6タンパク質がTGF−βシグナルを制御する可能性を検討するため、NEK6 siRNAをトランスフェクションした細胞においてリン酸化SMAD2/3の量を解析した。
NEK6タンパク質が細胞内でSMAD3と相互作用してSMAD3をリン酸化しているかを検討するため、共免疫沈降を行った。
NEK6タンパク質がSMAD3タンパク質を基質として直接リン酸化している可能性を、NEK6とSMAD3の精製タンパク質を用いて検討した。
NEK6タンパク質が、SMADタンパク質複合体の核内移行後におこる転写活性も制御しているかを検討するため、SMADタンパク質複合体のDNA結合配列とルシフェラーゼ遺伝子を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。また、同時に調製したLL29細胞を用いてウェスタンブロッティングを実施し、NEK6のノックダウンについて確認した。
NEK6のノックダウンが線維症に対して治療的効果を示すことを検討するため、NEK6 siRNAをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
以下に示す核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機(商品名ABI3900 DNA Synthesizer、Applied Biosystems)により合成した。固相担体としてCPG(Controlled Pore Glass)を用い、RNAアミダイトとして、EMMアミダイト(国際公開第2013/027843号)を用いた固相合成を行った。固相担体からの切り出し及びリン酸基保護基の脱保護、塩基保護基の脱保護、2’−水酸基保護基の脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、HPLCにより精製した。
KB−001
5’−GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC−Lx−GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA−3’(配列番号31)
KB−002
5’−CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC−Lx−GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC−3’(配列番号32)
KB−003
5’−CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC−Lx−GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC−3’(配列番号33)
KB−004
5’−GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC−Lx−GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC−3’(配列番号34)
KB−005
5’−CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC−Lx−GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU−3’(配列番号35)
NEK6に対して設計したssPN分子(一本鎖核酸分子)のin vitroでの評価を実施した。各項目の測定方法は、上述のON−TARGET plus SMART pool siRNAとStealth RNAi siRNAで行った方法(実施例1、2及び6)に従った。KB−001〜005のssPN核酸は全てNEK6の転写量を抑制し、標的遺伝子を効率的にノックダウンした。さらに、KB−001〜005のssPN核酸を作用させることにより、リン酸化SMAD3のタンパク質量の減少が確認された。
NEK6のノックダウンが線維症に対して治療的効果を示すことを確認するため、ブレオマイシン肺線維化モデルマウスに、NEK6 siRNAを投与して抗線維化作用を解析する。
肝星細胞においてNEK6タンパク質がTGF−βシグナルを制御する可能性を検討するため、NEK6 siRNAをトランスフェクションした細胞においてリン酸化SMAD3の量を解析した。
NEK6 siRNAもTGF−βシグナルを制御する可能性を検討するため、各NEK6 siRNAをトランスフェクションした細胞においてリン酸化SMAD3の量を解析した。
NEK6のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、NEK6 siRNAをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
NEK6タンパク質がTGF−βシグナルを制御する可能性を検討するため、NEK6 siRNAをトランスフェクションした細胞においてリン酸化SMAD3の量を解析した。
NEK6のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを確認するため、CCl4モデルマウスに、NEK6 siRNAを静脈内投与して抗線維化作用を解析した。
線維化とは、細胞や組織の障害に対する過剰な創傷治癒過程だと理解されている。そのため、線維化と共に細胞や組織の障害を抑制することは、各種線維症の治療に有効であると考えられている。そこで、NEK6のノックダウンが肝障害に対して効果を示すかを検討するため、CCl4モデルにおける肝障害マーカーの測定を行った。
NEK6のノックダウンがSMAD3タンパク質のリン酸化に対して効果を示すかを検討するため、CCl4モデルにおけるリン酸化SMAD3の量を解析した。
NEK6のノックダウンが線維化に対して有効性を示すかを検討するため、CCl4モデルにおける線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
NEK6のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、胆管結紮誘発肝線維化モデルマウス(BDLモデル)にNEK6 siRNAを静脈内投与して線維症関連遺伝子の転写量を解析した。
NEK6のノックダウンがCCl4誘発肝線維化モデルに対して効果を示すかを検討するため、病理像の観察を行った。
Claims (8)
- NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むSMAD2/3タンパク質のリン酸化阻害剤。
- NEK6遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む線維症治療剤。
- 以下の(a)、(b)、(c)、(d)及び(e)からなる群より選ばれる二本鎖核酸分子。
(a)5’末端に配列番号1に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端に配列番号6に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)から形成される二本鎖核酸分子
(b)5’末端に配列番号2に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端に配列番号7に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
(c)5’末端に配列番号3に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端に配列番号8に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
(d)5’末端に配列番号4に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端に配列番号9に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子
(e)5’末端に配列番号5に示される配列を含む塩基数19〜30のガイド鎖(アンチセンス鎖)と3’末端に配列番号10に示される配列を含む塩基数19〜30のパッセンジャー鎖(センス鎖)とから形成される二本鎖核酸分子 - さらにガイド鎖(アンチセンス鎖)及び/又はパッセンジャー鎖(センス鎖)の3‘末端に1〜11塩基のリボヌクレオチド残基及び/又はデオキシリボヌクレオチド残基が付加され、突出端を形成している、請求項3記載の二本鎖核酸分子。
- 請求項3又は4に示されたパッセンジャー鎖(センス鎖)の3’末端とガイド鎖(アンチセンス鎖)の5’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び/又は非ヌクレオチド構造からなるリンカーを介して連結され、あるいは、請求項3又は4に示されたガイド鎖(アンチセンス鎖)の3’末端とパッセンジャー鎖(センス鎖)の5’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び/又は非ヌクレオチド構造からなるリンカーを介して連結されたヘアピン型RNA構造を形成している一本鎖核酸分子。
- 配列番号1〜5から選ばれるNEK6遺伝子の発現抑制配列を含む、以下の(A)又は(B)の一本鎖核酸分子:
(A) 領域(X)、リンカー領域(Lx)及び領域(Xc)を含む又はのみからなり、
5’側から3’側にかけて、前記領域(Xc)、前記リンカー領域(Lx)及び前記領域(X)の順で配置され、
前記領域(Xc)が、前記領域(X)と相補的であり、
前記リンカー領域(Lx)が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
かつ前記領域(X)が、前記発現抑制配列を含む;
(B)領域(Xc)、リンカー領域(Lx)、領域(X)、領域(Y)、リンカー領域(Ly)及び領域(Yc)を、5’側から3’側にかけてこの順序で含み、
前記領域(X)と前記領域(Y)とが連結して、内部領域(Z)を形成し、
前記領域(Xc)が、前記領域(X)と相補的であり、
前記領域(Yc)が、前記領域(Y)と相補的であり、
かつ前記リンカー領域(Lx)及び/又はリンカー領域(Ly)が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域(Z)が、前記発現抑制配列を含む。 - 前記リンカー領域(Lx)及び/又は(Ly)が、下記式(I)で表わされる、請求項6記載の一本鎖核酸分子。
X1及びX2は、それぞれ独立して、H2、O、S又はNHであり;
Y1及びY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、O又はSであり;
R3は、環A上のC−3、C−4、C−5又はC−6に結合する水素原子又は置換基であり;
L1は、n個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、O又はSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、O又はSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、Rc及びRdは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり;
lは、1又は2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、前記環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域(Xc)及び前記領域(X)は、それぞれ、−OR1−又はOR2−を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合し、
前記領域(Yc)及び前記領域(Y)は、それぞれ、−OR1−又はOR2−を介して、前記リンカー領域(Ly)に結合し、
ここで、R1及びR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1及びR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記構造(I)である。 - X又はZが、配列番号11〜25からなる群より選ばれる配列を含む、請求項6又は7記載の一本鎖核酸分子。
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