KR20200033927A

KR20200033927A - 섬유증 치료제

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Publication number: KR20200033927A
Application number: KR1020207005247A
Authority: KR
Inventors: 가즈히사 나카오; 준이치 이시야마; 와타루 이치카와; 아쓰시 마스이; 유니케 아카사카; 히데카즈 도요후쿠; 아야 혼다
Original assignee: 교린 세이야꾸 가부시키 가이샤
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2020-03-30
Also published as: IL272271A; AU2018307897B2; EA202090393A1; EP3659609A1; CA3069406A1; CN110996969A; WO2019022257A1; CL2020000219A1; TW201910514A; US11326163B2; CN110996969B; AU2018307897A1; JP7204649B2; EP3659609B1; PH12020500198A1; EP3659609A4; SG11201913541QA; JPWO2019022257A1; CO2020001106A2; BR112020001412A2

Abstract

NEK6(NIMA-related serine/threonine kinase 6) 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 유효 성분으로서 포함하는 SMAD2/3 단백질의 인산화 저해제 또는 섬유증 치료제를 개시한다.

Description

섬유증 치료제

본 발명은, NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산 분자 및 당해 핵산 분자를 유효 성분으로 하는 의약에 관한 것이다.

섬유증은, 과잉한 콜라겐의 축적에 의해 장기 기능이 장애를 받아, 불가역적으로 진행하는 질환이며, 예를 들어, 그 발증 장기로서는 피부, 폐, 간장, 췌장, 신장, 골수 등이 알려져 있다. 폐의 섬유증의 일종인 특발성 폐섬유증(IPF)은, 인구 10만명당 20명 정도의 환자수로 이환율은 높지는 않기는 하지만, 진단 확정 후의 평균 생존 기간이 2.5∼5년으로 치료 후의 경과는 좋지 않기 때문에, 일본에 있어서 난치병 지정되어 있다.

IPF 치료약으로서는, 지금까지 필페니돈, 닌테다닙이 일본 후생노동성에서 승인을 받아 출시되어 있다. 어느 약제도 폐활량 저하 억제와 무증악 기간 연장 작용을 나타내어, 병태의 진행을 지연시키지만, 치료 효과로서는 충분히 만족할 수 있는 것이라고는 할 수 없어, 새로운 메커니즘에 기초하는 치료약의 개발이 요망되고 있다.

한편, 본 발명의 표적인 「NEK6 단백질」은, 세포 분열의 제어에 관련되는 NIMA-related serine/threonine kinase family의 하나로서 알려지지만, 의약품 개발의 연구 대상으로서 지금까지 그다지 주목되어 있지 않다. 2002년에 암의 창약 표적으로서의 가능성이 보고되지만, NEK6 단백질이 SMAD2/3 단백질과 상호작용하는 것, 조직의 섬유화를 촉진하는 것에 대하여 구체적인 보고는 없다.

미국 특허 출원 공개 제2004/0097441호 명세서

본 발명은, 신규한 SMAD2/3 단백질의 인산화 저해제 및 섬유증 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 블레오마이신 유발 폐섬유증 모델을 이용한 해석으로부터, NEK6(NIMA-related serine/threonine kinase 6)의 mRNA 레벨의 항진이 나타나는 것에 주목하여 연구를 진행시킨 결과, NEK6이 TGF-β 하류에서 섬유화에 기여하는 SMAD계 시그널을 제어함을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하와 같다.

〔1〕 NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 유효 성분으로서 포함하는 SMAD2/3 단백질의 인산화 저해제;

〔2〕 NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 유효 성분으로서 포함하는 섬유증 치료제;

〔3〕 폐섬유증, 간섬유증 또는 신섬유증을 치료 대상으로 하는, 〔2〕의 치료제;

〔4〕 이하의 (a), (b), (c), (d) 및 (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2본쇄 핵산 분자.

(a) 5'말단에 서열 번호 1에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단 또는 5'말단에 서열 번호 6에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자

(b) 5'말단에 서열 번호 2에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단 또는 5'말단에 서열 번호 7에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자

(c) 5'말단에 서열 번호 3에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단 또는 5'말단에 서열 번호 8에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자

(d) 5'말단에 서열 번호 4에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단 또는 5'말단에 서열 번호 9에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자

(e) 5'말단에 서열 번호 5에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단 또는 5'말단에 서열 번호 10에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자;

〔5〕 추가로 가이드쇄(안티센스쇄) 및/또는 패신저쇄(센스쇄)의 3'말단에 1∼11염기의 리보뉴클레오타이드 잔기 및/또는 데옥시뉴클레오타이드 잔기가 부가되어, 돌출단을 형성하고 있는, 〔4〕의 2본쇄 핵산 분자;

〔6〕〔4〕 또는 〔5〕에 나타난 패신저쇄(센스쇄)의 3'말단과 가이드쇄(안티센스쇄)의 5'말단이, 뉴클레오타이드 잔기로 이루어지는 링커 서열 및/또는 비뉴클레오타이드 구조의 링커를 개재시켜 연결되거나, 혹은 〔4〕 또는 〔5〕에 나타난 가이드쇄(안티센스쇄)의 3'말단과 패신저쇄(센스쇄)의 5'말단이, 뉴클레오타이드 잔기로 이루어지는 링커 서열 및/또는 비뉴클레오타이드 구조의 링커를 개재시켜 연결된 헤어핀형 RNA 구조를 형성하고 있는 1본쇄 핵산 분자;

〔7〕 서열 번호 1∼5로부터 선택되는 NEK6 유전자의 발현 억제 서열을 포함하는, 이하의 (A) 또는 (B)의 1본쇄 핵산 분자:

(A) 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)를 포함하거나 또는 이들만으로 이루어지고,

5'측으로부터 3'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)의 순서로 배치되고,

상기 영역(Xc)가, 상기 영역(X)와 상보적이고,

상기 링커 영역(Lx)가, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조를 갖고,

또한 상기 영역(X)가, 상기 발현 억제 서열을 포함한다;

(B) 영역(Xc), 링커 영역(Lx), 영역(X), 영역(Y), 링커 영역(Ly) 및 영역(Yc)를, 5'측으로부터 3'측에 걸쳐 이 순서로 포함하고,

상기 영역(X)와 상기 영역(Y)가 연결되어, 내부 영역(Z)를 형성하고,

상기 영역(Xc)가, 상기 영역(X)와 상보적이고,

상기 영역(Yc)가, 상기 영역(Y)와 상보적이고,

또한 상기 링커 영역(Lx) 및/또는 링커 영역(Ly)가, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조를 갖고,

상기 내부 영역(Z)가, 상기 발현 억제 서열을 포함한다.

〔8〕 상기 링커 영역(Lx) 및/또는 (Ly)가, 하기 식(I)로 표시되는, 〔7〕의 1본쇄 핵산 분자.

[화학식 1]

상기 식 중,

X¹ 및 X²는, 각각 독립적으로, H₂, O, S 또는 NH이고;

Y¹ 및 Y²는, 각각 독립적으로, 단일결합, CH₂, NH, O 또는 S이고;

R³은, 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이고;

L¹은, n개의 탄소 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이고, 여기에서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, OR^a, NH₂, NHR^a, NR^aR^b, SH 혹은 SR^a로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 되거나, 또는,

L¹은, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에터쇄이고,

단, Y¹이 NH, O 또는 S인 경우, Y¹에 결합하는 L¹의 원자는 탄소이고, OR¹에 결합하는 L¹의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고;

L²는, m개의 탄소 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이고, 여기에서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, OR^c, NH₂, NHR^c, NR^cR^d, SH 혹은 SR^c로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 되거나, 또는,

L²는, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에터쇄이고,

단, Y²가 NH, O 또는 S인 경우, Y²에 결합하는 L²의 원자는 탄소이고, OR²에 결합하는 L²의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고;

R^a, R^b, R^c 및 R^d는, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고;

l은, 1 또는 2이고;

m은, 0∼30의 범위의 정수이고;

n은, 0∼30의 범위의 정수이고;

환 A는, 상기 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 되고,

상기 환 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 되고,

상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X)는, 각각, -OR¹- 또는 -OR²-를 개재시켜, 상기 링커 영역(Lx)에 결합하고,

상기 영역(Yc) 및 상기 영역(Y)는, 각각, -OR¹- 또는 -OR²-를 개재시켜, 상기 링커 영역(Ly)에 결합하고,

여기에서, R¹ 및 R²는, 존재해도 존재하지 않아도 되고, 존재하는 경우, R¹ 및 R²는, 각각 독립적으로, 뉴클레오타이드 잔기 또는 상기 구조(I)이다;

〔9〕 X 또는 Z가, 서열 번호 11∼25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 〔7〕 또는 〔8〕의 1본쇄 핵산 분자;

〔10〕 NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, SMAD2/3 단백질의 인산화를 저해하는 방법;

〔11〕 NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 섬유증을 치료하는 방법;

〔12〕 SMAD2/3 단백질의 인산화의 저해에 사용하는 NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산;

〔13〕 섬유증 치료에 사용하는 NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산;

〔14〕 SMAD2/3 단백질의 인산화 저해제를 제조하기 위한, NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산의 사용; 및

〔15〕 섬유증 치료제를 제조하기 위한, NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산의 사용.

〔16〕 NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산이, KB-001∼011의 발현 억제 서열(하선부 부분)을 포함하는 핵산인, 〔15〕의 사용.

본 발명에 의해 신규 SMAD2/3 단백질의 인산화 저해제 및 섬유증 치료제의 제공이 가능해진다.

[도 1] NEK6의 Coding Sequence 영역의 서열 및 실시예 7에서 제작한 ssPN 분자의 표적 부위를 나타내는 도면이다.
[도 2] 도 2는, 본 발명의 SMAD2/3 단백질 인산화 저해제의 유효 성분이 되는 핵산 분자의 일례를 나타내는 모식도이다. (ssPN 분자)
[도 3] 도 3은, 본 발명의 SMAD2/3 단백질 인산화 저해제의 유효 성분이 되는 핵산 분자의 일례를 나타내는 모식도이다. (ssPN 분자 또는 ssNc 분자)
[도 4] 도 4는, 본 발명의 SMAD2/3 단백질 인산화 저해제의 유효 성분이 되는 핵산 분자의 일례를 나타내는 모식도이다. (ssPN 분자 또는 ssNc 분자)
[도 5] 도 5는, 본 발명의 SMAD2/3 단백질 인산화 저해제의 유효 성분이 되는 핵산 분자의 일례를 나타내는 모식도이다. (ssNc 분자)
[도 6] 도 6은, siRNA를 도입했을 경우의 NEK6 유전자의 전사량을 나타내는 그래프이다.
[도 7] 도 7a는, NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3 단백질의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 도 7b는, NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD2 단백질의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
[도 8] 도 8a는, 항NEK6 항체에 의한 공면역 침강의 결과를 나타낸다. 도 8b는, 항FLAG 항체에 의한 공면역 침강의 결과를 나타낸다.
[도 9] 도 9는, His 융합 NEK6 단백질과 GST 융합 SMAD3 단백질을 반응시켰을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3 단백질의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
[도 10] 도 10a는, NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 도 10b는, NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 반딧불 루시페라제의 발광량을 나타낸다.
[도 11] 도 11a는, NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 Col1a1 유전자의 전사량을 나타낸다. 도 11b는, NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 αSMA 유전자의 전사량을 나타낸다.
[도 12] 도 12a는, NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 Col1a1 유전자의 전사량을 나타낸다. 도 12b는, NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 αSMA 유전자의 전사량을 나타낸다.
[도 13] 도 13은, 간성(肝星) 세포에 NEK6 siRNA를 도입했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3 단백질(pSMAD3)의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
[도 14] 도 14는, 간성 세포에 각종 NEK6 siRNA를 도입했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3 단백질(pSMAD3)의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
[도 15] 도 15a는, 간성 세포에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 NEK6의 전사량을 나타낸다. 도 15b는, 간성 세포에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 Fibronectin의 전사량을 나타낸다. 도 15c는, 간성 세포에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의αSMA 유전자의 전사량을 나타낸다.
[도 16] 도 16은, 신장 섬유아세포에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 인산화 SMAD3 단백질의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸다.
[도 17] 도 17a는, CCl₄ 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 혈청중 GPT의 측정 결과를 나타낸다. 도 17b는, CCl₄ 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 혈청중 GOT의 측정 결과를 나타낸다.
[도 18] 도 18은, CCl₄ 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 인산화 SMAD3 단백질의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸다.
[도 19] 도 19a는, CCl₄ 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 NEK6 유전자의 전사량을 나타낸다. 도 19b는, CCl₄ 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 Col1a1 유전자의 전사량을 나타낸다. 도 19c는, CCl₄ 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 Col3a1 유전자의 전사량을 나타낸다. 도 19d는, CCl₄ 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 Timp1 유전자의 전사량을 나타낸다.
[도 20] 도 20a는, BDL 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 NEK6 유전자의 전사량을 나타낸다. 도 20b는, BDL 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 Col1a1 유전자의 전사량을 나타낸다. 도 20c는, BDL 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 Col3a1 유전자의 전사량을 나타낸다. 도 20d는, BDL 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 Timp1 유전자의 전사량을 나타낸다.
[도 21] 도 21은, CCl₄ 모델에 있어서 NEK6을 녹다운했을 경우의 간장의 병리 해석의 결과를 나타낸다. 도 21a는 CCl₄ 미투여의 생리 식염수 투여군의 결과를 나타낸다. 도 21b는 CCl₄ 투여의 용매 투여군의 결과를 나타낸다. 도 21c는 CCl₄ 투여의 핵산 투여군의 결과를 나타낸다.

본 명세서에서 사용하는 용어는, 특별히 언급하지 않는 한, 당해 기술 분야에서 통상 이용되는 의미로 이용하는 것이다. 또한, 본 발명에 있어서, 「염기수」는, 예를 들어, 「길이」를 의미하고, 「염기 길이」라고 할 수도 있다. 본 발명에 있어서, 염기수의 수치 범위는, 예를 들어, 그 범위에 속하는 양의 정수를 모두 개시하는 것이고, 구체예로서, 「1∼4염기」라는 기재는, 「1, 2, 3, 4염기」의 모든 개시를 의미한다.

본 발명은, NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 유효 성분으로서 포함하는 SMAD2/3 단백질 인산화 저해제 및 당해 핵산을 유효 성분으로서 포함하는 섬유증 치료제를 제공하는 것이다. 이하, 본 발명의 내용에 대해 상세하게 설명한다.

(1) NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산

NEK6 단백질은, 세포 분열의 제어에 관련되는 11개의 NIMA-related serine/threonine kinase family의 하나이며, 세포 주기의 M기에 있어서 인산화(활성화)된다.

본 발명의 표적인 NEK6 유전자는, 포유류 유래의 유전자이며, 바람직하게는 인간 유래의 유전자이다. 인간 유래의 NEK6 유전자는, 7종의 배리언트가 보고되어 있지만, 그 중의 아이소폼 2의 Coding Sequence 영역의 서열을 도 1에 나타낸다(서열 번호 56).

핵산 분자에 의한 NEK6 유전자의 발현의 억제 메커니즘은, 특별히 제한되는 것은 아니고, 발현을 다운 레귤레이션할 수 있는 것이면 된다. NEK6 유전자의 발현 억제는, NEK6 유전자로부터의 전사 산물의 생성량의 감소, NEK6 유전자로부터의 번역 산물의 생성량의 감소, 또는 상기 번역 산물의 활성의 감소 등에 의해 확인할 수 있다.

NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산으로서는, NEK6 mRNA의 안티센스 폴리뉴클레오타이드, siRNA, ssPN 분자, ssNc 분자, miRNA, 리보자임 등을 들 수 있다.

안티센스 폴리뉴클레오타이드, siRNA, ssPN 분자, ssNc 분자, 리보자임은, 당업자이면, 상기의 인간 NEK6 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 용이하게 취득할 수 있다. 바람직하게는, NEK6 아이소폼 2의 Coding Sequence 영역의 서열(서열 번호 56)에 기초하여 제작한 핵산이다.

(2) siRNA

NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산의 하나인 siRNA(small interfering RNA)를 이하에 설명한다.

siRNA는, 표적 유전자와 대합하는 가이드쇄(안티센스쇄), 가이드쇄와 2본쇄를 형성하고 있는 패신저쇄(센스쇄)로 이루어지는 핵산 분자이다. siRNA는, 세포 내에 있어서 Argonaute(AGO) 단백질을 중핵으로 하는 RNA-inducing silencing complex(RISC)로 불리는 복합체에 받아들여진 후, 센스쇄는 AGO에 의해 분해되고, 가이드쇄는 RISC에 남는다. 가이드쇄의 시드 영역(가이드쇄의 5'말단으로부터 2-8염기의 7염기 영역)은, 표적 서열을 인식하는 데에 중요한 기능을 갖고 있다고 생각되고 있어, 오프 타겟 효과를 회피할 목적에서 표적 유전자에 특이적인 시드 영역을 선택하는 것이 바람직하다고 여겨지고 있다. 따라서, 본 발명의 유효 성분인 핵산의 시드 영역에 대해서도 NEK6 유전자에 특이적인 서열을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, NEK6 유전자에 상보적이고, 또한 NEK7 유전자(RefSeq database: NM＿133494.2)에 상보적이지 않거나, 혹은, 영역 중 1 이상(예를 들어 1∼3)의 염기가 NEK7 유전자에 비상보적(미스매치)인 서열을 시드 영역으로서 포함하는 핵산을 선택하는 것을 들 수 있다. 또한, 전체 길이 서열에 대해서도, 예를 들어, NEK6 유전자에 대해서는 상보적이고, NEK7 유전자에 대해서는 비상보적(미스매치)인 염기를 증가시키는(예를 들어, 4 이상, 바람직하게는 5∼7) 것은, 오프 타겟 효과를 회피하는 데 있어서 유용하다. 가이드쇄에 포함되는 발현 억제 서열의 염기수는, 예를 들어, 15∼30염기이고, 바람직하게는, 19∼25염기이며, 보다 바람직하게는 19∼23염기이고, 더 바람직하게는 21, 22, 23염기이며, 특히 바람직하게는 23염기이다.

상기 발현 억제 서열은, 3'측에, 추가로 부가 서열을 가짐으로써 돌출단을 형성해도 된다. 상기 부가 서열의 염기수는, 예를 들어, 1∼11염기이고, 바람직하게는 1∼4염기이다. 부가 서열은, 리보뉴클레오타이드 잔기여도 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기여도 된다.

가이드쇄의 염기수는, 예를 들어, 19∼50염기이고, 바람직하게는 19∼30염기이며, 보다 바람직하게는, 19∼25염기이고, 더 바람직하게는 19∼23염기이며, 특별히 바람직하게는 21, 22, 23염기이고, 특히 바람직하게는 23염기이다.

패신저쇄의 염기수는, 예를 들어, 19∼50염기이고, 바람직하게는 19∼30염기이며, 보다 바람직하게는, 19∼25염기이고, 더 바람직하게는 19∼23염기이며, 특별히 바람직하게는 21, 22, 23염기이고, 특히 바람직하게는 21염기이다.

패신저쇄에서, 가이드쇄와 상보성을 나타내는 영역은, 예를 들어, 19∼50염기이고, 바람직하게는 19∼30염기이며, 보다 바람직하게는, 19∼25염기이고, 더 바람직하게는 19∼23염기이다. 상기 영역은, 3'측에, 추가로 부가 서열을 가져도 된다. 상기 부가 서열의 염기수는, 예를 들어, 1∼11염기이고, 바람직하게는 1∼4염기이며, 부가 서열은, 리보뉴클레오타이드 잔기여도 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기여도 된다. 패신저쇄는, 가이드쇄의 상보성을 나타내는 영역에 대해서, 예를 들어, 상보적이어도 되고, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 되지만, 상보적인 것이 바람직하다. 상기 1염기 혹은 수 염기는, 예를 들어, 1∼3염기, 바람직하게는 1염기 또는 2염기이다.

NEK6의 유전자 발현을 억제하는 siRNA는, NEK6 유전자의 cDNA 서열 정보에 기초하여, 예를 들어, siSNIPER(등록상표), 창약·진단 연구용 siDirect(등록상표) 등의 siRNA 서열 설계 시스템에 따라 얻을 수 있다.

NEK6 siRNA는, NEK6에 특이적으로 작용하는 siRNA가 바람직하고, 예를 들어 이하와 같은 2본쇄 핵산을 들 수 있다.

(e) 5'말단에 서열 번호 5에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단 또는 5'말단에 서열 번호 10에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자

또한, NEK6 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는, 패신저쇄(센스쇄)의 3'말단과 가이드쇄(안티센스쇄)의 5'말단이, 뉴클레오타이드 잔기로 이루어지는 링커 서열 및/또는 비뉴클레오타이드 구조의 링커를 개재시켜 연결되거나, 혹은 가이드쇄(안티센스쇄)의 3'말단과 패신저쇄(센스쇄)의 5'말단이, 뉴클레오타이드 잔기로 이루어지는 링커 서열 및/또는 비뉴클레오타이드 구조의 링커를 개재시켜 연결된 헤어핀형 RNA 구조를 형성하고 있는 1본쇄 핵산 분자여도 된다.

상기 뉴클레오타이드 잔기로 이루어지는 링커 서열의 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 상기 패신저쇄와 상기 가이드쇄가 이중쇄를 형성 가능한 길이인 것이 바람직하다. 상기 링커 서열의 염기수는, 그 하한이, 예를 들어, 1염기이고, 바람직하게는 2염기이며, 보다 바람직하게는 3염기이고, 그 상한이, 예를 들어, 100염기이고, 바람직하게는 80염기이며, 보다 바람직하게는 50염기이다. 상기 링커 서열의 염기수의 구체예는, 1∼100염기, 2∼80염기, 3∼50염기이다.

상기 비뉴클레오타이드 구조의 링커의 예로서는, 헥사에틸렌 글라이콜 링커, 폴리-(옥시포스피니코-옥시-1,3-프로페인다이올) 링커, 알릴 링커, 또는 폴리에틸렌 글라이콜 링커 등의 화학 링커, 카바메이트 구조를 갖는 아미노 링커 등을 들 수 있다. 상기 비뉴클레오타이드 구조 링커의 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 상기 패신저쇄와 상기 가이드쇄가 이중쇄를 형성 가능한 길이인 것이 바람직하다.

(3) ssPN 분자

NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산의 하나가 되는 ssPN 분자에 대해 설명한다. ssPN 분자는, WO2012/017919에 개시되는 생물학적 안정성이 우수한 1본쇄 RNA 핵산 분자를 의미하고, 구체적으로는 이하와 같다.

본 발명의 유효 성분이 되는 ssPN 분자는, NEK6 유전자의 발현 억제 서열을 포함하는 1본쇄 핵산 분자로서, 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)를 포함하고, 상기 영역(X)와 상기 영역(Xc) 사이에, 상기 링커 영역(Lx)가 연결되고, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중 적어도 한쪽이, 상기 발현 억제 서열을 포함하고, 상기 링커 영역(Lx)가, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. ssPN 분자는, 그 5'말단과 3'말단이 미연결이며, 선상 1본쇄 핵산 분자라고 할 수도 있다.

ssPN 분자에 있어서, NEK6 유전자의 발현 억제 서열은, 예를 들어, 본 발명의 ssPN 분자가, in vivo 또는 in vitro로 세포 내에 도입되었을 경우에, NEK6 유전자의 발현을 억제하는 활성을 나타내는 서열이다. NEK6 mRNA에 결합하는 siRNA 서열은, NEK6 유전자의 cDNA 서열 정보에 기초하여, 기존의 siRNA 설계 시스템에 따라 얻을 수 있고, ssPN 분자에 있어서도, 상기 siRNA의 발현 억제 서열을, ssPN 분자의 발현 억제 서열로서 사용할 수 있다.

상기 발현 억제 서열은, 예를 들어, NEK6 유전자의 표적 영역에 대해서, 80% 이상의 상보성을 갖고 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 90% 이상이며, 더 바람직하게는 95% 이상이고, 특별히 바람직하게는 98% 이상이며, 특히 바람직하게는 100%이다.

특히, siRNA의 시드 영역에 해당하는 부분에 대해서는, siRNA의 경우와 마찬가지로 NEK6 유전자에 특이적인 서열을 선택하는 것이 바람직하다.

ssPN 분자에 의한 NEK6 유전자의 발현의 억제는, 예를 들어, RNA 간섭이 생기는 것에 의한다고 추측되지만, 이 메커니즘에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들어, 이른바 siRNA와 같이, 2개의 1본쇄 RNA로 이루어지는 dsRNA로서, 세포 등에 도입하는 것은 아니고, 또한, 세포 내에 있어서, 상기 발현 억제 서열의 절출은, 반드시 필수는 아니다.

ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 상기 피롤리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조를 가져도 되고, 상기 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조를 가져도 되고, 상기 피롤리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조와 상기 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조의 양쪽을 가져도 된다.

ssPN 분자에 있어서, 상기 피롤리딘 골격은, 예를 들어, 피롤리딘의 5원환을 구성하는 탄소가, 1개 이상, 치환된 피롤리딘 유도체의 골격이어도 되고, 치환되는 경우, 예를 들어, 5원환의 2위의 탄소(C-2) 이외의 탄소 원자인 것이 바람직하다. 상기 탄소는, 예를 들어, 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 된다. 상기 피롤리딘 골격은, 예를 들어, 피롤리딘의 5원환 내에, 예를 들어, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 된다. 상기 피롤리딘 골격에 있어서, 피롤리딘의 5원환을 구성하는 탄소 및 질소는, 예를 들어, 수소가 결합해도 되고, 후술하는 바와 같은 치환기가 결합해도 된다. 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 상기 피롤리딘 골격의 어느 기를 개재시켜, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc)와 결합해도 되고, 바람직하게는, 상기 5원환의 어느 1개의 탄소 원자와 질소이며, 바람직하게는, 상기 5원환의 2위의 탄소(C-2)와 질소이다. 상기 피롤리딘 골격으로서는, 예를 들어, 프롤린 골격, 프롤린올 골격 등을 들 수 있다. 상기 프롤린 골격 및 프롤린올 골격 등은, 예를 들어, 생체내 물질 및 그의 환원체이기 때문에, 안전성도 우수하다.

ssPN 분자에 있어서, 상기 피페리딘 골격은, 예를 들어, 피페리딘의 6원환을 구성하는 탄소가, 1개 이상, 치환된 피페리딘 유도체의 골격이어도 되고, 치환되는 경우, 예를 들어, 6원환의 2위의 탄소(C-2) 이외의 탄소 원자인 것이 바람직하다. 상기 탄소는, 예를 들어, 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 된다. 상기 피페리딘 골격은, 예를 들어, 피페리딘의 6원환 내에, 예를 들어, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 된다. 상기 피페리딘 골격에 있어서, 피페리딘의 6원환을 구성하는 탄소 및 질소는, 예를 들어, 수소기가 결합해도 되고, 후술하는 바와 같은 치환기가 결합해도 된다. 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 상기 피페리딘 골격의 어느 기를 개재시켜, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc)와 결합해도 되고, 바람직하게는, 상기 6원환의 어느 1개의 탄소 원자와 질소이며, 바람직하게는, 상기 6원환의 2위의 탄소(C-2)와 질소이다.

상기 링커 영역은, 예를 들어, 상기 비뉴클레오타이드 구조로 이루어지는 비뉴클레오타이드 잔기만을 포함해도 되고, 상기 비뉴클레오타이드 구조로 이루어지는 비뉴클레오타이드 잔기와, 뉴클레오타이드 잔기를 포함해도 된다.

ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역은, 예를 들어, 하기 식(I)로 표시된다.

[화학식 2]

상기 식(I) 중, 예를 들어,

X¹ 및 X²는, 각각 독립적으로, H₂, O, S 또는 NH이고;

R³은, 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이고,

l은, 1 또는 2이고;

m은, 0∼30의 범위의 정수이고;

n은, 0∼30의 범위의 정수이고;

환 A는, 상기 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가 질소, 산소, 황으로 치환되어도 되고,

여기에서, R¹ 및 R²는, 존재해도 존재하지 않아도 되고, 존재하는 경우, R¹ 및 R²는, 각각 독립적으로, 뉴클레오타이드 잔기 또는 상기 구조(I)이다.

상기 식(I) 중, X¹ 및 X²는, 예를 들어, 각각 독립적으로, H₂, O, S 또는 NH이다. 상기 식(I) 중에 있어서, X¹이 H₂라는 것은, X¹이, X¹의 결합하는 탄소 원자와 함께, CH₂(메틸렌기)를 형성하는 것을 의미한다. X²에 대해서도 마찬가지이다.

상기 식(I) 중, Y¹ 및 Y²는, 각각 독립적으로, 단일결합, CH₂, NH, O 또는 S이다.

상기 식(I) 중, 환 A에 있어서, l은, 1 또는 2이다. l=1인 경우, 환 A는, 5원환이고, 예를 들어, 상기 피롤리딘 골격이다. 상기 피롤리딘 골격은, 예를 들어, 프롤린 골격, 프롤린올 골격 등을 들 수 있고 이들의 2가의 구조를 예시할 수 있다. l=2인 경우, 환 A는, 6원환이고, 예를 들어, 상기 피페리딘 골격이다. 환 A는, 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가, 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 된다. 또한, 환 A는, 환 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 된다. 환 A는, 예를 들어, L형 및 D형의 어느 것이어도 된다.

상기 식(I) 중, R³은, 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이다. R³이 상기 치환기인 경우, 치환기 R³은, 1이어도 복수여도, 존재하지 않아도 되고, 복수의 경우, 동일해도 상이해도 된다. 치환기 R³은, 예를 들어, 할로젠, OH, OR⁴, NH₂, NHR⁴, NR⁴R⁵, SH, SR⁴, 옥소기(=O), 알킬, 알켄일, 알킨닐, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킬알킬, 사이클릴알킬, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 헤테로사이클릴알켄일, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등이다.

R⁴및 R⁵는, 예를 들어, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이며, 동일해도 상이해도 된다. R⁴및 R⁵로서의 치환기는, 예를 들어, 할로젠, 알킬, 알켄일, 알킨일, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킬알킬, 사이클릴알킬, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 헤테로사이클릴알켄일, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 들 수 있다.

R⁴및 R⁵로서의 보호기는, 예를 들어, 반응성이 높은 작용기를 불활성으로 변환하는 작용기이며, 공지된 보호기 등을 들 수 있다. 상기 보호기는, 예를 들어, 문헌(J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and NewYork, 1973)의 기재를 원용할 수 있다. 상기 보호기는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, tert-뷰틸다이메틸실릴기(TBDMS), 비스(2-아세톡시에틸옥시)메틸기(ACE), 트라이아이소프로필실릴옥시메틸기(TOM), 1-(2-사이아노에톡시)에틸기(CEE), 2-사이아노에톡시메틸기(CEM) 및 톨릴설폰일에톡시메틸기(TEM), 다이메톡시트라이틸기(DMTr) 등을 들 수 있다. R³이 OR⁴인 경우, 상기 보호기는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, TBDMS기, ACE기, TOM기, CEE기, CEM기 및 TEM기 등을 들 수 있다.

상기 식(I) 중, L¹은, n개의 탄소 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, 예를 들어, OH, OR^a, NH₂, NHR^a, NR^aR^b, SH 혹은 SR^a로 치환되어도 되고, 치환되어 있지 않아도 된다. 또는, L¹은, 상기 알킬렌쇄의 하나 이상의 탄소 원자(예를 들어, 1∼3개)가 산소 원자로 치환된 폴리에터쇄여도 된다. 상기 폴리에터쇄는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜이다. 한편, Y¹이 NH, O 또는 S인 경우, Y¹에 결합하는 L¹의 원자는 탄소이고, OR¹에 결합하는 L¹의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다. 즉, 예를 들어, Y¹이 O인 경우, 그 산소 원자와 L¹의 산소 원자는 인접하지 않고, OR¹의 산소 원자와 L¹의 산소 원자는 인접하지 않는다.

상기 식(I) 중, L²는, m개의 탄소 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, 예를 들어, OH, OR^c, NH₂, NHR^c, NR^cR^d, SH 혹은 SR^c로 치환되어도 되고, 치환되어 있지 않아도 된다. 또는, L²는, 상기 알킬렌쇄의 하나 이상의 탄소 원자(예를 들어, 1∼3개)가 산소 원자로 치환된 폴리에터쇄여도 된다. 한편, Y²가 NH, O 또는 S인 경우, Y²에 결합하는 L²의 원자는 탄소이고, OR²에 결합하는 L²의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다. 즉, 예를 들어, Y²가 O인 경우, 그 산소 원자와 L²의 산소 원자는 인접하지 않고, OR²의 산소 원자와 L²의 산소 원자는 인접하지 않는다.

L¹의 n 및 L²의 m은, 특별히 제한되지 않고, 각각, 하한은, 예를 들어, 0이며, 상한도, 특별히 제한되지 않는다. n 및 m은, 예를 들어, 상기 링커 영역(Lx)의 원하는 길이에 따라서, 적절히 설정할 수 있다. n 및 m은, 예를 들어, 제조 비용 및 수율 등의 점에서, 각각, 0∼30이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0∼20이며, 더 바람직하게는 0∼15이다. n과 m은, 동일해도 되고(n=m), 상이해도 된다. n+m은, 예를 들어, 0∼30이고, 바람직하게는 0∼20이며, 보다 바람직하게는 0∼15이다. 한편, L¹의 n 및 L²의 m은, 각각의 알킬렌쇄의 탄소 원자수이지만, L¹또는 L²의 알킬렌쇄의 1개 이상 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에터쇄인 경우는, n 및 m은, 탄소 원자수와 치환된 산소 원자수의 합계수를 의미한다.

R^a, R^b, R^c 및 R^d는, 예를 들어, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이다. R^a, R^b, R^c 및 R^d의 치환기 및 보호기는, 예를 들어, R⁴및 R⁵의 치환기 및 보호기와 마찬가지이다.

상기 식(I)에 있어서, 수소 원자는, 예를 들어, 각각 독립적으로, Cl, Br, F 및 I 등의 할로젠으로 치환되어도 된다.

상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X)는, 예를 들어, 각각, -OR¹- 또는 -OR²-를 개재시켜, 상기 링커 영역(Lx)에 결합한다. 여기에서, R¹ 및 R²는, 존재해도 존재하지 않아도 된다. R¹ 및 R²가 존재하는 경우, R¹ 및 R²는, 각각 독립적으로, 뉴클레오타이드 잔기 또는 상기 식(I)의 구조이다. R¹ 및/또는 R²가 상기 뉴클레오타이드 잔기인 경우, 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 뉴클레오타이드 잔기 R¹ 및/또는 R²를 제외한 상기 식(I)의 구조로 이루어지는 상기 비뉴클레오타이드 잔기와 상기 뉴클레오타이드 잔기로부터 형성된다. R¹ 및/또는 R²가 상기 식(I)의 구조인 경우, 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 상기 식(I)의 구조로 이루어지는 상기 비뉴클레오타이드 잔기가, 2개 이상 연결된 구조가 된다. 상기 식(I)의 구조는, 예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개 포함해도 된다. 이와 같이, 상기 구조를 복수 포함하는 경우, 상기 (I)의 구조는, 예를 들어, 직접 연결되어도 되고, 상기 뉴클레오타이드 잔기를 개재시켜 결합해도 된다. 한편, R¹ 및 R²가 존재하지 않는 경우, 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 상기 식(I)의 구조로 이루어지는 상기 비뉴클레오타이드 잔기만으로부터 형성된다.

상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X)와, -OR¹- 및 -OR²-의 결합의 조합은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 이하의 어느 하나의 조건을 들 수 있다.

조건(1)

상기 영역(Xc)는, -OR²-를 개재시키고, 상기 영역(X)는, -OR¹-을 개재시켜, 상기 식(I)의 구조와 결합한다.

조건(2)

상기 영역(Xc)는, -OR¹-을 개재시키고, 상기 영역(X)는, -OR²-를 개재시켜, 상기 식(I)의 구조와 결합한다.

상기 식(I)의 구조는, 예를 들어, 하기 식(I-1)∼식(I-9)를 예시할 수 있고, 하기 식에 있어서, n 및 m은, 상기 식(I)과 동일하다. 하기 식에 있어서, q는, 0∼10의 정수이다.

[화학식 3]

상기 식(I-1)∼(I-9)에 있어서, n, m 및 q는, 특별히 제한되지 않고, 전술한 바와 같다. 구체예로서, 상기 식(I-1)에 있어서, n=8, 상기 (I-2)에 있어서, n=3, 상기 식(I-3)에 있어서, n=4 또는 8, 상기 (I-4)에 있어서, n=7 또는 8, 상기 식(I-5)에 있어서, n=3 및 m=4, 상기 (I-6)에 있어서, n=8 및 m=4, 상기 식(I-7)에 있어서, n=8 및 m=4, 상기 (I-8)에 있어서, n=5 및 m=4, 상기 식(I-9)에 있어서, q=1 및 m=4를 들 수 있다. 상기 식(I-4)의 일례(n=8)를, 하기 식(I-4a)에, 상기 식(I-8)의 일례(n=5, m=4)를, 하기 식(I-8a)에 나타낸다.

[화학식 4]

ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)와 상보적이다. 이 때문에, ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)가 상기 영역(X)를 향해 되접어 꺾어져, 상기 영역(Xc)와 상기 영역(X)가, 자기 어닐링에 의해, 이중쇄를 형성 가능하다.

ssPN 분자는, 예를 들어, 상기 영역(Xc)만이 되접어 꺾어져 상기 영역(X)와 이중쇄를 형성해도 되고, 추가로 다른 영역에 있어서 새로운 이중쇄를 형성해도 된다. 이하, 전자의 ssPN 분자, 즉, 이중쇄 형성이 1개소인 분자를 「제 1 ssPN 분자」라고 하고, 후자의 ssPN 분자, 즉, 이중쇄 형성이 2개소인 분자를 「제 2 ssPN 분자」라고 한다. 이하에, 상기 제 1 ssPN 분자 및 상기 제 2 ssPN 분자에 대해, 예시한다.

(i) 제 1 ssPN 분자

상기 제 1 ssPN 분자는, 예를 들어, 상기 영역(X), 상기 영역(Xc) 및 상기 링커 영역(Lx)로 이루어지는 분자이다.

상기 제 1 ssPN 분자는, 예를 들어, 5'측으로부터 3'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)를, 상기 순서로 가져도 되고, 3'측으로부터 5'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)를, 상기 순서로 가져도 된다.

상기 제 1 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)에 상보적이다. 여기에서, 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 대해서 상보적인 서열을 갖고 있으면 되고, 바람직하게는, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 상보적인 서열을 포함하거나, 또는 상기 상보적인 서열만으로 이루어진다. 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)의 상보적인 상기 전체 영역 또는 상보적인 상기 부분 영역에 대해서, 예를 들어, 상보적이어도 되고, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 되지만, 상보적인 것이 바람직하다. 상기 1염기 혹은 수 염기는, 예를 들어, 1∼3염기, 바람직하게는 1염기 또는 2염기이다.

상기 제 1 ssPN 분자에 있어서, 상기 발현 억제 서열은, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X) 중 적어도 한쪽에 포함된다. 상기 제 1 ssPN 분자는, 상기 발현 억제 서열을, 예를 들어, 1개 가져도 되고, 2개 이상 가져도 된다. 후자의 경우, 상기 제 1 ssPN 분자는, 예를 들어, NEK6 유전자에 대한 동일한 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 되고, NEK6 유전자에 대한 상이한 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 된다. 상기 제 1 ssPN 분자가, 2개 이상의 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 각 발현 억제 서열의 배치 개소는, 특별히 제한되지 않고, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc)의 어느 한 영역이어도 되고, 상이한 영역이어도 된다.

상기 제 1 ssPN 분자의 일례를, 도 2의 모식도에 따라 설명한다. 도 2(A)는, 일례로서, 상기 ssPN 분자에 대해, 각 영역의 순서의 개략을 나타내는 모식도이며, 도 2(B)는, 상기 ssPN 분자가, 상기 분자 내에 있어서 이중쇄를 형성하고 있는 상태를 나타내는 모식도이다. 도 2(B)에 나타내는 바와 같이, 상기 ssPN 분자는, 상기 영역(Xc)와 상기 영역(X)의 사이에서, 이중쇄가 형성되고, 상기 Lx 영역이, 그 길이에 따라서 루프 구조를 취한다. 도 2는, 어디까지나, 상기 영역의 연결 순서 및 이중쇄를 형성하는 각 영역의 위치 관계를 나타내는 것이고, 예를 들어, 각 영역의 길이, 상기 링커 영역(Lx)의 형상 등은, 이것에 제한되지 않는다.

상기 제 1 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 이하에 각 영역의 길이를 예시하지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다.

상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)의 전체 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)의 5'말단으로부터 3'말단의 전체 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것을 의미하고, 즉, 상기 영역(Xc)와 상기 영역(X)가, 동일한 염기 길이이며, 또한 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 모든 염기와 상보적인 것을 의미한다.

또한, 상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)의 부분 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)의 부분 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것을 의미하고, 즉, 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)보다도, 1염기 이상 짧은 염기 길이의 염기 서열로 이루어지고, 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 상기 부분 영역의 모든 염기와 상보적인 것을 의미한다. 상기 영역(X)의 상기 부분 영역은, 예를 들어, 상기 영역(X)에 있어서의, 상기 영역(Xc)측의 말단의 염기(1번째의 염기)로부터 연속되는 염기 서열로 이루어지는 영역인 것이 바람직하다.

상기 제 1 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X)와 상기 영역(Xc)의 염기수(Xc)의 관계는, 예를 들어, 하기 (3) 또는 (5)의 조건을 만족시키고, 전자의 경우, 구체적으로는, 예를 들어, 하기 (11)의 조건을 만족시킨다.

X＞Xc ···(3)

X-Xc=1∼10, 바람직하게는 1, 2 또는 3,

보다 바람직하게는 1 또는 2 ···(11)

X=Xc ···(5)

상기 영역(X) 및/또는 상기 영역(Xc)가 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 영역은, 예를 들어, 상기 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역이어도 되고, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 영역이어도 된다.

상기 발현 억제 서열의 염기수는, 예를 들어, 15∼30염기이고, 바람직하게는, 19∼25염기, 보다 바람직하게는 19∼23염기이며, 더 바람직하게는 21, 22, 23염기이고, 특히 바람직하게는 23염기이다. 상기 발현 억제 서열을 포함하는 영역은, 예를 들어, 상기 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 가져도 된다. 상기 부가 서열의 염기수는, 예를 들어, 1∼31염기이고, 바람직하게는, 1∼21염기이며, 보다 바람직하게는, 1∼11염기이다.

상기 영역(X)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 영역(X)가, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 그 하한은, 예를 들어, 19염기이다. 그 상한은, 예를 들어, 50염기이고, 바람직하게는 40염기이며, 보다 바람직하게는 30염기이고, 더 바람직하게는 25염기이다. 상기 영역(X)의 염기수의 구체예는, 예를 들어, 19∼50염기이고, 바람직하게는, 19∼30염기, 보다 바람직하게는 19∼25염기, 더 바람직하게는 21, 22, 23염기이며, 특히 바람직하게는 23염기이다.

상기 영역(Xc)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 그 하한은, 예를 들어, 19염기이고, 바람직하게는 20염기이며, 보다 바람직하게는 21염기이다. 그 상한은, 예를 들어, 50염기이고, 바람직하게는 40염기이며, 보다 바람직하게는 30염기이고, 더 바람직하게는 25염기이다. 상기 영역(Xc)의 염기수의 구체예는, 예를 들어, 19∼50염기이고, 바람직하게는, 19∼30염기, 보다 바람직하게는 19∼25염기, 더 바람직하게는 21, 22, 23염기이며, 특히 바람직하게는 21염기이다.

상기 제 1 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)의 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 상기 영역(X)와 상기 영역(Xc)가 이중쇄를 형성 가능한 길이인 것이 바람직하다. 상기 링커 영역(Lx)가, 상기 비뉴클레오타이드 잔기 외에, 상기 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 경우, 상기 링커 영역(Lx)의 염기수는, 그 하한이, 예를 들어, 1염기이고, 바람직하게는 2염기이며, 보다 바람직하게는 3염기이고, 그 상한이, 예를 들어, 100염기이고, 바람직하게는 80염기이며, 보다 바람직하게는 50염기이다. 상기 링커 영역(Lx)의 염기수의 구체예는, 1∼100염기, 2∼80염기, 3∼50염기이다. 상기 링커 영역(Lx), 그 자체의 영역 내부에 있어서, 자기 어닐링을 일으키지 않는 구조인 것이 바람직하다.

상기 제 1 ssPN 분자의 전체 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 제 1 ssPN 분자에 있어서, 상기 염기수의 합계(전체 길이의 염기수)는, 하한이, 예를 들어, 38염기이고, 바람직하게는 42염기이며, 보다 바람직하게는 44염기이고, 더 바람직하게는 48염기이며, 그 상한은, 예를 들어, 300염기이고, 바람직하게는 200염기이며, 보다 바람직하게는 150염기이고, 더 바람직하게는 100염기이며, 특히 바람직하게는 80염기이다. 상기 제 1 ssPN 분자의 전체 길이의 염기수의 합계의 구체예는, 38∼300염기, 42∼200염기, 44∼150염기, 48∼100염기, 48∼80염기이다. 상기 제 1 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)를 제외한 염기수의 합계는, 하한이, 예를 들어, 38염기이고, 바람직하게는 42염기이며, 더 바람직하게는 44염기이고, 상한이, 예를 들어, 300염기이고, 바람직하게는 200염기이며, 보다 바람직하게는 150염기이고, 더 바람직하게는 100염기이며, 특히 바람직하게는 80염기이다. 상기 링커 영역(Lx)를 제외한 염기수의 합계의 구체예는, 38∼300염기, 42∼200염기, 42∼150염기, 44∼100염기, 44∼80염기이다.

NEK6 유전자의 발현을 억제하는 제 1 ssPN 분자의 구체예로서, 이하의 1본쇄 핵산 분자를 들 수 있다.

KB-001

5'-GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC-Lx-GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA-3'(서열 번호 31)

KB-002

5'-CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC-Lx-GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC-3'(서열 번호 32)

KB-003

5'-CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC-Lx-GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC-3'(서열 번호 33)

KB-004

5'-GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC-Lx-GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC-3'(서열 번호 34)

KB-005

5'-CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC-Lx-GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU-3'(서열 번호 35)

KB-006

5'-GGAGAUAAGAUGAAUCUCUUCCC-Lx-GGGAAGAGAUUCAUCUUAUCUCCAU-3'(서열 번호 46)

KB-007

5'-CUAUGGAGAUAAGAUGAAUCUCC-Lx-GGAGAUUCAUCUUAUCUCCAUAGAA-3'(서열 번호 47)

KB-008

5'-GCGGACUUCCAGAUCGAAAAGCC-Lx-GGCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCCA-3'(서열 번호 48)

KB-009

5'-CGGACUUCCAGAUCGAAAAGACC-Lx-GGUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCC-3'(서열 번호 49)

KB-010

5'-GACUUCCAGAUCGAAAAGAAGCC-Lx-GGCUUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCG-3'(서열 번호 50)

KB-011

5'-GACUCGUUUAUCGAAGACAACCC-Lx-GGGUUGUCUUCGAUAAACGAGUCCA-3'(서열 번호 61)

식 중, Lx는, 링커 영역 Lx이며, 하기 구조식의 L-프롤린다이아마이드아미다이트를 나타낸다.

[화학식 5]

또한, 바람직한 제 1 ssPN 분자로서는, 서열 번호 1∼5로부터 선택되는 NEK6 유전자의 발현을 억제하는 서열을 포함하고, 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)만으로 이루어지고, 5'측으로부터 3'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)의 순서로 배치되고,

또한 상기 영역(X)가, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 1본쇄 핵산 분자를 들 수 있다.

더 바람직하게는, 상기 영역(Xc)가, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 부분 영역에 완전히 상보적인 상기 1본쇄 핵산이다. 특히 바람직하게는, 상기 영역(X)가, 서열 번호 11∼25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 상기 1본쇄 핵산 분자이다.

(ii) 제 2 ssPN 분자

상기 제 2 ssPN 분자는, 예를 들어, 상기 영역(X), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(Xc) 외에, 추가로 영역(Y) 및 상기 영역(Y)에 상보적인 영역(Yc)를 갖는 분자이다. 상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(X)와 상기 영역(Y)가 연결되어, 내부 영역(Z)를 형성하고 있다. 한편, 특별히 나타내지 않는 한, 상기 제 2 ssPN 분자는, 상기 제 1 ssPN 분자의 기재를 원용할 수 있다.

상기 제 2 ssPN 분자는, 예를 들어, 5'측으로부터 3'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx), 상기 영역(X), 상기 영역(Y) 및 상기 영역(Yc)를, 상기 순서로 가져도 된다. 이 경우, 상기 영역(Xc)를, 5'측 영역(Xc), 상기 내부 영역(Z) 중의 상기 영역(X)를, 내부 5'측 영역(X), 상기 내부 영역(Z) 중의 상기 영역(Y)를, 내부 3'영역(Y), 상기 영역(Yc)를, 3'측 영역(Yc)라고도 한다. 또한, 상기 제 2 ssPN 분자는, 예를 들어, 3'측으로부터 5'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx), 상기 영역(X), 상기 영역(Y) 및 상기 영역(Yc)를, 상기 순서로 가져도 된다. 이 경우, 상기 영역(Xc)를, 3'측 영역(Xc), 상기 내부 영역(Z) 중의 상기 영역(X)를, 내부 3'측 영역(X), 상기 내부 영역(Z) 중의 상기 영역(Y)를, 내부 5'영역(Y), 상기 영역(Yc)를, 5'측 영역(Yc)라고도 한다.

상기 내부 영역(Z)는, 예를 들어, 상기 영역(X)와 상기 영역(Y)가 연결되어 있다. 상기 영역(X)와 상기 영역(Y)는, 예를 들어, 직접적으로 연결되고, 그 사이에 개재 서열을 갖고 있지 않다. 상기 내부 영역(Z)는, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)와의 서열 관계를 나타내기 때문에, 「상기 영역(X)와 상기 영역(Y)가 연결되어 구성된다」라고 정의하는 것이며, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 영역(X)와 상기 영역(Y)가, 상기 ssPN 분자의 사용에 있어서, 별개의 독립된 영역인 것을 한정하는 것은 아니다. 즉, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)가, 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 영역(X)와 상기 영역(Y)에 걸쳐서, 상기 발현 억제 서열이 배치되어도 된다.

상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)에 상보적이다. 여기에서, 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 대해서 상보적인 서열을 갖고 있으면 되고, 바람직하게는, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 상보적인 서열을 포함하거나, 또는 상기 상보적인 서열로 이루어진다. 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)의 상보적인 상기 전체 영역 또는 상보적인 상기 부분 영역에 대해서, 예를 들어, 상보적이어도 되고, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 되지만, 상보적인 것이 바람직하다. 상기 1염기 혹은 수 염기는, 예를 들어, 1∼3염기, 바람직하게는 1염기 또는 2염기이다.

상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Yc)는, 상기 영역(Y)에 상보적이다. 여기에서, 상기 영역(Yc)는, 상기 영역(Y)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 상보적인 서열을 갖고 있으면 되고, 바람직하게는, 상기 영역(Y)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 대해서 상보적인 서열을 포함하거나, 또는 상기 상보적인 서열로 이루어진다. 상기 영역(Yc)는, 상기 영역(Y)의 상보적인 상기 전체 영역 또는 상보적인 상기 부분 영역에 대해서, 예를 들어, 상보적이어도 되고, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 되지만, 상보적인 것이 바람직하다. 상기 1염기 혹은 수 염기는, 예를 들어, 1∼3염기, 바람직하게는 1염기 또는 2염기이다.

상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 발현 억제 서열은, 예를 들어, 상기 영역(X)와 상기 영역(Y)로부터 형성되는 상기 내부 영역(Z) 및 상기 영역(Xc) 중 적어도 하나에 포함되고, 추가로 상기 영역(Yc)에 포함되어도 된다. 바람직하게는, 상기 내부 영역(Z)에 상기 발현 억제 서열이 포함되는 ssPN 분자이다. 상기 내부 영역(Z)가 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 예를 들어, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Y)의 어느 것에 상기 발현 억제 서열을 가져도 되고, 또한, 상기 영역(X)와 상기 영역(Y)에 걸쳐서, 상기 발현 억제 서열을 가져도 된다. 상기 제 2 ssPN 분자는, 상기 발현 억제 서열을, 예를 들어, 1개 가져도 되고, 2개 이상 가져도 된다.

상기 제 2 ssPN 분자가, 2개 이상의 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 각 발현 억제 서열의 배치 개소는, 특별히 제한되지 않고, 상기 내부 영역(Z) 및 상기 영역(Xc) 중 어느 한쪽이어도 되고, 상기 내부 영역(Z) 및 상기 영역(Xc) 중 어느 한쪽과, 추가로 다른 상이한 영역이어도 된다.

상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Yc)와 상기 영역(Y)는, 예를 들어, 직접 연결해도 되고, 간접적으로 연결해도 된다. 전자의 경우, 직접적인 연결은, 예를 들어, 포스포다이에스터 결합에 의한 연결 등을 들 수 있다. 후자의 경우, 예를 들어, 상기 영역(Yc)와 상기 영역(Y)의 사이에, 링커 영역(Ly)를 갖고, 상기 링커 영역(Ly)를 개재시켜, 상기 영역(Yc)와 상기 영역(Y)가 연결되어 있는 형태 등을 들 수 있다.

상기 제 2 ssPN 분자가 상기 링커 영역(Ly)를 갖는 경우, 상기 링커 영역(Ly)는, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 잔기로 이루어지는 링커여도 되고, 전술 한, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조를 가지는 링커여도 된다. 후자의 경우, 상기 링커 영역(Ly)는, 예를 들어, 상기 식(I)로 나타낼 수 있고, 상기 링커 영역(Lx)에 있어서의 상기 식(I)의 설명을 모두 원용할 수 있다.

상기 영역(Yc) 및 상기 영역(Y)는, 예를 들어, 각각, -OR¹- 또는 -OR²-를 개재시켜, 상기 링커 영역(Ly)에 결합한다. 여기에서, R¹ 및 R²는, 전술한 링커 영역(Lx)와 마찬가지로, 존재해도 존재하지 않아도 되다.

상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X), 및 상기 영역(Yc) 및 상기 (Y)와, 상기 -OR¹- 및 -OR²-의 결합의 조합은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 이하의 어느 조건을 들 수 있다.

조건(1)

상기 영역(Xc)는, -OR²-를 개재시키고, 상기 영역(X)는, -OR¹-을 개재시켜, 상기 식(I)의 구조와 결합하고,

상기 영역(Yc)는, -OR¹-을 개재시키고, 상기 영역(Y)는, -OR²-를 개재시켜, 상기 식(I)의 구조와 결합한다.

조건(2)

상기 영역(Yc)는, -OR²-를 개재시키고, 상기 영역(Y)는, -OR¹-을 개재시켜, 상기 식(I)의 구조와 결합한다.

조건(3)

상기 영역(Xc)는, -OR¹-을 개재시키고, 상기 영역(X)는, -OR²-를 개재시켜, 상기 식(I)의 구조와 결합하고,

조건(4)

상기 제 2 ssPN 분자에 대해, 상기 링커 영역(Ly)를 갖는 ssPN 분자의 일례를, 도 3의 모식도에 따라 설명한다. 도 3(A)는, 일례로서 상기 ssPN 분자에 대해, 5'측으로부터 3'측으로 향해, 각 영역의 순서의 개략을 나타내는 모식도이며, 도 3(B)는, 상기 ssPN 분자가, 상기 분자 내에 있어서 이중쇄를 형성하고 있는 상태를 나타내는 모식도이다. 도 3(B)에 나타내는 바와 같이, 상기 ssPN 분자는, 상기 영역(Xc)와 상기 영역(X)의 사이, 상기 영역(Y)와 상기 영역(Yc)의 사이에서, 이중쇄가 형성되고, 상기 Lx 영역 및 상기 Ly 영역이, 그 길이에 따라서 루프 구조를 취한다. 도 3은, 어디까지나, 각 영역의 연결 수순 및 이중쇄를 형성하는 각 영역의 위치 관계를 나타내는 것으로, 예를 들어, 각 영역의 길이, 링커 영역의 형상 등은, 이것에 제한되지 않는다. 또한, 도 3은, 상기 영역(Xc)를 5'측에 나타냈지만, 이것에는 제한되지 않고, 상기 영역(Xc)가, 3'측에 위치해도 된다.

상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc), 상기 영역(X), 상기 영역(Y) 및 상기 영역(Yc)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 각 영역의 길이를 이하에 예시하지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다.

상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)의 전체 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)와 동일한 염기 길이이며, 상기 영역(X)의 전체 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Xc)는, 보다 바람직하게는, 상기 영역(X)와 동일한 염기 길이이며, 또한 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 모든 염기와 상보적이다. 한편, 이것에는 제한되지 않고, 예를 들어, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 된다.

또한, 상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)의 부분 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)의 부분 영역과 동일한 염기 길이이며, 즉, 상기 영역(X)보다도, 1염기 이상 짧은 염기 길이의 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Xc)는, 보다 바람직하게는, 상기 영역(X)의 상기 부분 영역과 동일한 염기 길이이며, 또한 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 상기 부분 영역의 모든 염기와 상보적이다. 상기 영역(X)의 상기 부분 영역은, 예를 들어, 상기 영역(X)에 있어서의, 상기 영역(Xc)측의 말단의 염기(1번째의 염기)로부터 연속되는 염기 서열로 이루어지는 영역인 것이 바람직하다.

상기 영역(Yc)는, 예를 들어, 상기 영역(Y)의 전체 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Yc)는, 예를 들어, 상기 영역(Y)와 동일한 염기 길이이며, 상기 영역(Y)의 전체 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Yc)는, 보다 바람직하게는, 상기 영역(Y)와 동일한 염기 길이이며, 또한 상기 영역(Yc)의 모든 염기가, 상기 영역(Y)의 모든 염기와 상보적이다. 한편, 이것에는 제한되지 않고, 예를 들어, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 된다.

또한, 상기 영역(Yc)는, 예를 들어, 상기 영역(Y)의 부분 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Yc)는, 예를 들어, 상기 영역(Y)의 부분 영역과 동일한 염기 길이이며, 즉, 상기 영역(Y)보다도, 1염기 이상 짧은 염기 길이의 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Yc)는, 보다 바람직하게는, 상기 영역(Y)의 상기 부분 영역과 동일한 염기 길이이며, 또한 상기 영역(Yc)의 모든 염기가, 상기 영역(Y)의 상기 부분 영역의 모든 염기와 상보적이다. 상기 영역(Y)의 상기 부분 영역은, 예를 들어, 상기 영역(Y)에 있어서의, 상기 영역(Yc)측의 말단의 염기(1번째의 염기)로부터 연속되는 염기 서열로 이루어지는 영역인 것이 바람직하다.

상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 내부 영역(Z)의 염기수(Z)와, 상기 영역(X)의 염기수(X) 및 상기 영역(Y)의 염기수(Y)의 관계, 상기 내부 영역(Z)의 염기수(Z)와, 상기 영역(Xc)의 염기수(Xc) 및 상기 영역(Yc)의 염기수(Yc)의 관계는, 예를 들어, 하기 식(1) 및 (2)의 조건을 만족시킨다.

Z=X+Y ···(1)

Z≥Xc+Yc ···(2)

상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X)와 상기 영역(Y)의 염기수(Y)의 관계는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 하기 식의 어느 조건을 만족시킨다.

X=Y ···(19)

X＜Y ···(20)

X＞Y ···(21)

제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X), 상기 영역(Xc)의 염기수(Xc), 상기 영역(Y)의 염기수(Y) 및 상기 영역(Yc)의 염기수(Yc)의 관계는, 예를 들어, 하기 (a)∼(d)의 어느 조건을 만족시킨다.

(a) 하기 식(3) 및 (4)의 조건을 만족시킨다.

X＞Xc ···(3)

Y=Yc ···(4)

(b) 하기 식(5) 및 (6)의 조건을 만족시킨다.

X=Xc ···(5)

Y＞Yc ···(6)

(c) 하기 식(7) 및 (8)의 조건을 만족시킨다.

X＞Xc ···(7)

Y＞Yc ···(8)

(d) 하기 식(9) 및 (10)의 조건을 만족시킨다.

X=Xc ···(9)

Y=Yc ···(10)

상기 (a)∼(d)에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X)와 상기 영역(Xc)의 염기수(Xc)의 차, 상기 영역(Y)의 염기수(Y)와 상기 영역(Yc)의 염기수(Yc)의 차는, 예를 들어, 하기 조건을 만족시키는 것이 바람직하다.

(a) 하기 식(11) 및 (12)의 조건을 만족시킨다.

X-Xc=1∼10, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4,

보다 바람직하게는 1, 2 또는 3 ···(11)

Y-Yc=0 ···(12)

(b) 하기 식(13) 및 (14)의 조건을 만족시킨다.

X-Xc=0 ···(13)

Y-Yc=1∼10, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4,

보다 바람직하게는 1, 2 또는 3 ···(14)

(c) 하기 식(15) 및 (16)의 조건을 만족시킨다.

X-Xc=1∼10, 바람직하게는, 1, 2 또는 3,

보다 바람직하게는 1 또는 2 ···(15)

Y-Yc=1∼10, 바람직하게는, 1, 2 또는 3,

보다 바람직하게는 1 또는 2 ···(16)

(d) 하기 식(17) 및 (18)의 조건을 만족시킨다.

X-Xc=0 ···(17)

Y-Yc=0 ···(18)

상기 (a)∼(d)의 제 2 ssPN 분자에 대해, 각각의 구조의 일례를, 도 4의 모식도에 따라 설명한다. 도 4는, 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)를 포함하는 ssPN이며, (A)는, 상기 (a)의 ssPN 분자, (B)는, 상기 (b)의 ssPN 분자, (C)는, 상기 (c)의 ssPN 분자, (D)는, 상기 (d)의 ssPN 분자의 예이다. 도 4에 있어서, 점선은, 자기 어닐링에 의해 이중쇄를 형성하고 있는 상태를 나타낸다. 도 4의 ssPN 분자는, 상기 영역(X)의 염기수(X)와 상기 영역(Y)의 염기수(Y)를, 상기 식(20)의 「X＜Y」라고 나타냈지만, 이것에는 제한되지 않고, 상기 식(19)의 「X=Y」에서도, 상기 식(21)의 「X＞Y」여도 된다. 또한, 도 4는, 어디까지나 상기 영역(X)와 상기 영역(Xc)의 관계, 상기 영역(Y)와 상기 영역(Yc)의 관계를 나타내는 모식도이며, 예를 들어, 각 영역의 길이, 형상, 링커 영역(Ly)의 유무 등은, 이것에는 제한되지 않는다.

상기 (a)∼(c)의 ssPN 분자는, 예를 들어, 상기 영역(Xc)와 상기 영역(X), 및 상기 영역(Yc)와 상기 영역(Y)가, 각각 이중쇄를 형성하는 것에 의해, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)의 어느 것과도 얼라인먼트하지 않는 염기를 갖는 구조이며, 이중쇄를 형성하지 않는 염기를 갖는 구조라고도 할 수 있다. 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 얼라인먼트하지 않는 염기(이중쇄를 형성하지 않는 염기라고도 한다)를, 이하, 「프리 염기」라고 한다. 도 4에 있어서, 상기 프리 염기의 영역을, 「F」로 나타낸다. 상기 영역(F)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 영역(F)의 염기수(F)는, 예를 들어, 상기 (a)의 ssPN 분자의 경우, 「X-Xc」의 염기수이고, 상기 (b)의 ssPN 분자의 경우, 「Y-Yc」의 염기수이며, 상기 (c)의 ssPN 분자의 경우, 「X-Xc」의 염기수와 「Y-Yc」의 염기수의 합계수이다.

다른 한편, 상기 (d)의 ssPN 분자는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)의 전체 영역이, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)와 얼라인먼트하는 구조이며, 상기 내부 영역(Z)의 전체 영역이 이중쇄를 형성하는 구조라고도 할 수 있다. 한편, 상기 (d)의 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)의 5'말단과 상기 영역(Yc)의 3'말단은, 미연결이다.

상기 영역(Xc), 상기 영역(Yc), 및 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 상기 프리 염기(F)의 염기수의 합계는, 상기 내부 영역(Z)의 염기수가 된다. 이 때문에, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)의 길이는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)의 길이, 상기 프리 염기의 수 및 그 위치에 따라서, 적절히 결정할 수 있다.

상기 내부 영역(Z)의 염기수는, 예를 들어, 19염기 이상이다. 상기 염기수의 하한은, 예를 들어, 19염기이고, 바람직하게는 20염기이며, 보다 바람직하게는 21염기이다. 상기 염기수의 상한은, 예를 들어, 50염기이고, 바람직하게는 40염기이며, 보다 바람직하게는 30염기이다. 상기 내부 영역(Z)의 염기수의 구체예는, 예를 들어, 19∼50염기, 20∼40염기, 21∼30염기, 21∼25염기이다.

상기 내부 영역(Z)가 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 내부 영역(Z)는, 예를 들어, 상기 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역이어도 되고, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 영역이어도 된다. 상기 발현 억제 서열의 염기수는, 예를 들어, 15∼30염기이고, 바람직하게는, 19∼25염기이며, 보다 바람직하게는 19∼23염기이고, 더 바람직하게는, 21, 22, 23염기이며, 특히 바람직하게는 23염기이다. 상기 내부 영역(Z)가 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 가져도 된다. 상기 부가 서열의 염기수는, 예를 들어, 1∼31염기이고, 바람직하게는, 1∼21염기이며, 보다 바람직하게는, 1∼11염기이고, 더 바람직하게는, 1∼7염기이며, 특별히 바람직하게는 1∼3염기이다.

상기 영역(Xc)의 염기수는, 예를 들어, 1∼49염기이고, 바람직하게는 1∼39염기이며, 보다 바람직하게는 1∼29염기이다. 상기 영역(Yc)의 염기수는, 예를 들어, 1∼49염기이고, 바람직하게는 1∼39염기이며, 보다 바람직하게는 1∼29염기이다. 상기 영역(Xc) 및 (Yc) 중 어느 한쪽의 염기수는, 1∼4염기인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 1염기, 2염기, 3염기이다.

상기 내부 영역(Z), 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)의 염기수는, 예를 들어, 상기 식(2)의 「Z≥Xc+Yc」로 나타낼 수 있다. 구체예로서, 「Xc+Yc」의 염기수는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)와 동일하거나, 또는 상기 내부 영역(Z)보다 작다. 후자의 경우, 「Z-(Xc+Yc)」는, 예를 들어, 1∼10, 바람직하게는 1∼4, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3이다. 상기 「Z-(Xc+Yc)」는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 프리의 영역(F)의 염기수(F)에 상당한다.

상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)의 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커 영역(Lx)는, 전술한 바와 같다. 상기 링커 영역(Ly)의 구성 단위가 염기를 포함하는 경우, 상기 링커 영역(Ly)의 염기수는, 그 하한이, 예를 들어, 1염기이고, 바람직하게는 2염기이며, 보다 바람직하게는 3염기이고, 그 상한이, 예를 들어, 100염기이고, 바람직하게는 80염기이며, 보다 바람직하게는 50염기이다. 상기 각 링커 영역의 염기수는, 구체예로서, 예를 들어, 1∼50염기, 1∼30염기, 1∼20염기, 1∼10염기, 1∼7염기, 1∼4염기 등을 예시할 수 있지만, 이것에는 제한되지 않는다. 상기 링커 영역(Ly)는, 그 자체의 영역 내부에 있어서, 자기 어닐링을 일으키지 않는 구조인 것이 바람직하다.

상기 링커 영역(Ly)는, 예를 들어, 상기 링커 영역(Lx)와 동일해도 되고, 상이해도 된다.

상기 제 2 ssPN 분자의 전체 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 염기수의 합계(전체 길이의 염기수)는, 하한이, 예를 들어, 38염기이고, 바람직하게는 42염기이며, 보다 바람직하게는 44염기이고, 더 바람직하게는 48염기이며, 특히 바람직하게는 50염기이고, 그 상한은, 예를 들어, 300염기이고, 바람직하게는 200염기이며, 보다 바람직하게는 150염기이고, 더 바람직하게는 100염기이며, 특히 바람직하게는 80염기이다. 상기 제 2 ssPN 분자의 전체 길이의 염기수의 합계의 구체예는, 38∼300염기, 42∼200염기, 44∼150염기, 48∼100염기, 50∼80염기이다. 상기 제 2 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx) 및 링커 영역(Ly)를 제외하는 염기수의 합계는, 하한이, 예를 들어, 38염기이고, 바람직하게는 42염기이며, 보다 바람직하게는 44염기이고, 더 바람직하게는 48염기이며, 특히 바람직하게는 50염기이고, 상한이, 예를 들어, 300염기이고, 바람직하게는 200염기이며, 보다 바람직하게는 150염기이고, 더 바람직하게는 100염기이며, 특별히 바람직하게는 80염기이고, 특히 바람직하게는 60염기이다. 상기 링커 영역(Lx)를 제외하는 염기수의 합계의 구체예는, 38∼300염기, 42∼200염기, 44∼150염기, 48∼100염기, 48∼80염기, 50∼60염기이다.

ssPN 분자는, 상기 링커 영역(Lx)가, 상기 비뉴클레오타이드 구조를 갖고 있으면 되고, 그 외의 구성 단위는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 구성 단위는, 예를 들어, 뉴클레오타이드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 리보뉴클레오타이드 잔기 및 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 수식되어 있지 않은 비수식 뉴클레오타이드 잔기 및 수식된 수식 뉴클레오타이드 잔기 등을 들 수 있다. ssPN 분자는, 예를 들어, 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 것에 의해, 뉴클레아제 내성을 향상시켜, 안정성을 향상 가능하다. 또한, ssPN 분자는, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 잔기 외에, 추가로, 비뉴클레오타이드 잔기를 포함해도 된다.

상기 영역(Xc), 상기 영역(X), 상기 영역(Y) 및 상기 영역(Yc)의 구성 단위는, 각각, 상기 뉴클레오타이드 잔기가 바람직하다. 상기 각 영역은, 예를 들어, 하기 (1)∼(3)의 잔기로 구성된다.

(1) 비수식 뉴클레오타이드 잔기

(2) 수식 뉴클레오타이드 잔기

(3) 비수식 뉴클레오타이드 잔기 및 수식 뉴클레오타이드 잔기

상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 상기 비뉴클레오타이드 잔기만으로 구성되어도 되고, 상기 비뉴클레오타이드와 상기 뉴클레오타이드 잔기로 구성되어도 된다. 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 하기 (4)∼(7)의 잔기로 구성된다.

(4) 비뉴클레오타이드 잔기

(5) 비뉴클레오타이드 잔기 및 비수식 뉴클레오타이드 잔기

(6) 비뉴클레오타이드 잔기 및 수식 뉴클레오타이드 잔기

(7) 비뉴클레오타이드 잔기, 비수식 뉴클레오타이드 잔기 및 수식 뉴클레오타이드 잔기

상기 링커 영역(Ly)의 구성 단위는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 잔기 및 상기 비뉴클레오타이드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 링커 영역은, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 잔기만으로 구성되어도 되고, 상기 비뉴클레오타이드 잔기만으로 구성되어도 되고, 상기 뉴클레오타이드 잔기와 상기 비뉴클레오타이드 잔기로 구성되어도 된다. 상기 링커 영역은, 예를 들어, 하기 (1)∼(7)의 잔기로 구성된다.

(1) 비수식 뉴클레오타이드 잔기

(2) 수식 뉴클레오타이드 잔기

(4) 비뉴클레오타이드 잔기

(5) 비뉴클레오타이드 잔기 및 비수식 뉴클레오타이드 잔기

(6) 비뉴클레오타이드 잔기 및 수식 뉴클레오타이드 잔기

ssPN 분자는, 예를 들어, 상기 링커 영역(Lx)를 제외하고, 상기 뉴클레오타이드 잔기만으로 구성되는 분자, 상기 뉴클레오타이드 잔기 외에 상기 비뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자 등을 들 수 있다. ssPN 분자에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 상기 비수식 뉴클레오타이드 잔기만이어도 되고, 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기만이어도 되고, 상기 비수식 뉴클레오타이드 잔기 및 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기의 양쪽이어도 된다. 상기 ssPN 분자가, 상기 비수식 뉴클레오타이드 잔기와 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 경우, 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 「1 혹은 수 개」이며, 구체적으로는, 예를 들어, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개이다. ssPN 분자가, 상기 비뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 경우, 상기 비뉴클레오타이드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 「1 혹은 수 개」이며, 구체적으로는, 예를 들어, 1 또는 2개이다.

ssPN 분자에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 리보뉴클레오타이드 잔기가 바람직하다. 이 경우, 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들어, 「P-ssRNA 분자」라고도 한다. 상기 P-ssRNA 분자는, 예를 들어, 상기 링커 영역(Lx)를 제외하고, 상기 리보뉴클레오타이드 잔기만으로 구성되는 분자, 상기 리보뉴클레오타이드 잔기 외에 상기 비뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자 등을 들 수 있다. 상기 P-ssRNA 분자에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기만이어도 되고, 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기만이어도 되고, 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기 및 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기의 양쪽을 포함해도 된다.

상기 P-ssRNA 분자가, 예를 들어, 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기 외에 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 경우, 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 「1 혹은 수 개」이며, 구체적으로는, 예를 들어, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개이다. 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기에 대한 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 리보스 잔기가 데옥시리보스 잔기로 치환된 상기 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 P-ssRNA 분자가, 예를 들어, 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기 외에 상기 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 경우, 상기 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 「1 혹은 수 개」이며, 구체적으로는, 예를 들어, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개이다.

NEK6 유전자의 발현을 억제하는 바람직한 ssPN 분자로서, 서열 번호 1∼5로부터 선택되는 NEK6 유전자의 발현 억제 서열을 포함하고, 영역(Xc), 링커 영역(Lx), 영역(X), 영역(Y), 링커 영역(Ly) 및 영역(Yc)를, 5'측으로부터 3'측에 걸쳐 이 순서로 포함하고,

상기 영역(Xc)가, 상기 영역(X)와 상보적이고,

상기 영역(Yc)가, 상기 영역(Y)와 상보적이고,

또한 상기 링커 영역(Lx) 및 링커 영역(Ly)가, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조를 갖고,

상기 내부 영역(Z)가, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 1본쇄 핵산 분자를 들 수 있다.

(4) ssNc 분자

NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산의 하나인 ssNc 분자를 설명한다.

ssNc 분자는, WO2012/05368에 개시되는 1본쇄 RNA 핵산 분자를 의미하고, 구체적으로는 이하와 같다.

ssNc 분자는, 표적 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 서열을 포함하는 1본쇄 핵산 분자로서,

5'측으로부터 3'측에 걸쳐, 5'측 영역(Xc), 내부 영역(Z) 및 3'측 영역(Yc)를, 상기 순서로 포함하고,

상기 내부 영역(Z)가, 내부 5'측 영역(X) 및 내부 3'측 영역(Y)가 연결되어 구성되고,

상기 5'측 영역(Xc)가, 상기 내부 5'측 영역(X)와 상보적이고,

상기 3'측 영역(Yc)가, 상기 내부 3'측 영역(Y)와 상보적이고,

상기 내부 영역(Z), 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc) 중 적어도 1개가, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

ssNc 분자는, 그 5'말단과 3'말단이 미연결이며, 선상 1본쇄 핵산 분자라고 할 수도 있다. 본 발명의 ssNc 분자는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 내부 5'영역(X)와 상기 내부 3'영역(Y)가, 직접적으로 연결되어 있다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc)는, 상기 내부 5'측 영역(X)와 상보적이고, 상기 3'측 영역(Yc)는, 상기 내부 3'측 영역(Y)와 상보적이다. 이 때문에, 5'측에 있어서, 상기 영역(Xc)가 상기 영역(X)를 향해 되접어 꺾어져, 상기 영역(Xc)와 상기 영역(X)가, 자기 어닐링에 의해, 이중쇄를 형성 가능하고, 또한, 3'측에 있어서, 상기 영역(Yc)가 상기 영역(Y)를 향해 되접어 꺾어져, 상기 영역(Yc)와 상기 영역(Y)가, 자기 어닐링에 의해, 이중쇄를 형성 가능하다.

ssNc 분자는, 이와 같이, 분자 내에서 이중쇄를 형성 가능하고, 예를 들어, 종래의 RNA 간섭에 사용하는 siRNA와 같이, 분리된 2개의 1본쇄 RNA가 어닐링에 의해 2본쇄 RNA를 형성하는 것과는, 분명히 상이한 구조이다.

ssNc 분자에 있어서의 상기 발현 억제 서열은, ssPN 분자의 설명을 원용할 수 있다.

ssNc 분자에 의한 NEK6 유전자의 발현의 억제는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z), 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc) 중 적어도 1개에 상기 발현 억제 서열을 배치한 구조를 취함으로써, RNA 간섭 또는 RNA 간섭과 유사한 현상(RNA 간섭 유사 현상)이 생기는 것에 의한다고 추측된다. 한편, ssNc 분자의 메커니즘도 ssPN 분자의 메커니즘 마찬가지로 한정되는 것은 아니다. ssNc 분자는, 예를 들어, 이른바 siRNA와 같이, 2개의 1본쇄 RNA로 이루어지는 dsRNA로서, 세포 등에 도입하는 것은 아니고, 또한, 세포 내에 있어서, 상기 발현 억제 서열의 절출은, 반드시 필수는 아니다. 이 때문에, ssNc 분자는, 예를 들어, RNA 간섭 유사한 기능을 갖는다고 할 수도 있다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 발현 억제 서열은, 상기 내부 영역(Z), 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc) 중 적어도 1개에 포함된다. ssNc 분자는, 상기 발현 억제 서열을, 예를 들어, 1개 가져도 되고, 2개 이상 가져도 된다. 후자의 경우, ssNc 분자는, 예를 들어, NEK6 유전자에 대한 동일한 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 되고, NEK6 유전자에 대한 상이한 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 된다. ssNc 분자가, 2개 이상의 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 각 발현 억제 서열의 배치 개소는, 특별히 제한되지 않고, 상기 내부 영역(Z), 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 어느 한 영역이어도 되고, 상이한 영역이어도 된다.

상기 내부 영역(Z)는, 상기 내부 5'영역(X)와 상기 내부 3'영역(Y)가 연결되어 있다. 상기 영역(X)와 상기 영역(Y)는, 예를 들어, 직접적으로 연결되고, 그 사이에 개재 서열을 갖고 있지 않다. 상기 내부 영역(Z)는, 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc)와의 서열 관계를 나타내기 위해, 「상기 내부 5'측 영역(X)와 상기 내부 3'측 영역(Y)가 연결되어 구성된다」라고 나타내는 것이며, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 내부 5'측 영역(X)와 상기 내부 3'측 영역(Y)가, 예를 들어, 상기 ssNc 분자의 사용에 있어서, 별개의 독립한 영역인 것을 한정하는 것은 아니다. 즉, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)가, 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 영역(X)와 상기 영역(Y)에 걸쳐서, 상기 발현 억제 서열이 배치되어도 된다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc)는, 상기 내부 5'측 영역(X)에 상보적이다. 여기에서, 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 대해서 상보적인 서열을 갖고 있으면 되고, 구체적으로는, 예를 들어, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 상보적인 서열을 포함하거나, 또는 상기 상보적인 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Xc)는, 상기 영역(X)의 상보적인 상기 전체 영역 또는 상보적인 상기 부분 영역에 대해서, 예를 들어, 완전히 상보적이어도 되고, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 되지만, 상보적인 것이 바람직하다. ssNc 분자에 있어서, 상기 3'측 영역(Yc)는, 상기 내부 3'측 영역(Y)에 상보적이다. 여기에서, 상기 영역(Yc)는, 상기 영역(Y)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 상보적인 서열을 갖고 있으면 되고, 구체적으로는, 예를 들어, 상기 영역(Y)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 대해서 상보적인 서열을 포함하거나, 또는 상기 상보적인 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Yc)는, 상기 영역(Y)의 상보적인 상기 전체 영역 또는 상보적인 상기 부분 영역에 대해서, 예를 들어, 완전히 상보적이어도 되고, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 되지만, 상보적인 것이 바람직하다. 상기 1염기 혹은 수염기는, 예를 들어, 1∼3염기, 바람직하게는 1염기 또는 2염기이다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc)와 상기 내부 5'측 영역(X)는, 예를 들어, 직접 연결해도 되고, 간접적으로 연결해도 된다. 전자의 경우, 직접적인 연결은, 예를 들어, 포스포다이에스터 결합에 의한 연결을 들 수 있다. 후자의 경우, 예를 들어, 상기 영역(Xc)와 상기 영역(X)의 사이에, 링커 영역(Lx)를 갖고, 상기 링커 영역(Lx)를 개재시켜, 상기 영역(Xc)와 상기 영역(X)가 연결되어 있는 형태를 들 수 있다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 3'측 영역(Yc)와 상기 내부 3'측 영역(Y)는, 예를 들어, 직접 연결해도 되고, 간접적으로 연결해도 된다. 전자의 경우, 직접적인 연결은, 예를 들어, 포스포다이에스터 결합에 의한 연결을 들 수 있다. 후자의 경우, 예를 들어, 상기 영역(Yc)와 상기 영역(Y)의 사이에, 링커 영역(Ly)를 갖고, 상기 링커 영역(Ly)를 개재시켜, 상기 영역(Yc)와 상기 영역(Y)가 연결되어 있는 형태를 들 수 있다.

ssNc 분자는, 예를 들어, 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)의 양쪽을 가져도 되고, 어느 한쪽을 가져도 된다. 후자의 경우로서, 상기 5'측 영역(Xc)와 상기 내부 5'측 영역(X)의 사이에 상기 링커 영역(Lx)를 갖고, 상기 3'측 영역(Yc)와 상기 내부 3'측 영역(Y)의 사이에 상기 링커 영역(Ly)를 갖지 않는, 즉, 상기 영역(Yc)와 상기 영역(Y)가 직접 연결된 형태를 들 수 있다. 또한, 후자의 경우로서, 상기 3'측 영역(Yc)와 상기 내부 3'측 영역(Y)의 사이에 상기 링커 영역(Ly)를 갖고, 상기 5'측 영역(Xc)와 상기 내부 5'측 영역(X)의 사이에 상기 링커 영역(Lx)를 갖지 않는, 즉, 상기 영역(Xc)와 상기 영역(X)가 직접 연결된 형태를 들 수 있다.

상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)는, 각각, 그 자체의 영역 내부에 있어서, 자기 어닐링을 일으키지 않는 구조인 것이 바람직하다.

ssNc 분자에 대해, 상기 링커 영역을 갖지 않는 ssNc 분자의 일례를, 도 5의 모식도에 따라 설명한다. 도 5(A)는, 상기 ssNc 분자에 대해, 5'측으로부터 3'측으로 향해, 각 영역의 순서의 개략을 나타내는 모식도이며, 도 5(B)는, 상기 ssNc 분자가, 상기 분자 내에 있어서 이중쇄를 형성하고 있는 상태를 나타내는 모식도이다. 도 5(B)에 나타내는 바와 같이, 상기 ssNc 분자는, 상기 5'측 영역(Xc)가 되접어 꺾어져, 상기 5'측 영역(Xc)와 상기 내부 5'측 영역(X)의 사이에 이중쇄가 형성되고, 상기 3'측 영역(Yc)가 되접어 꺾어져, 상기 3'측 영역(Yc)와 상기 내부 3'측 영역(Y)의 사이에 이중쇄가 형성된다. 도 5는, 어디까지나, 각 영역의 연결 차례 및 이중쇄를 형성하는 각 영역의 위치 관계를 나타내는 것이고, 예를 들어, 각 영역의 길이 등은, 이것에 제한되지 않는다.

ssNc 분자에 대해, 상기 링커 영역을 갖는 ssNc 분자의 일례를, 도 3의 모식도에 따라 설명한다. 도 3(A)는, 일례로서, 상기 ssNc 분자에 대해, 5'측으로부터 3'측으로 향해, 각 영역의 순서의 개략을 나타내는 모식도이며, 도 3(B)는, 상기 ssNc 분자가, 상기 분자 내에 있어서 이중쇄를 형성하고 있는 상태를 나타내는 모식도이다. 도 3(B)에 나타내는 바와 같이, 상기 ssNc 분자는, 상기 5'측 영역(Xc)와 상기 내부 5'측 영역(X)의 사이, 상기 내부 3'측 영역(Y)와 상기 3'측 영역(Yc)의 사이에서, 이중쇄가 형성되고, 상기 Lx 영역 및 상기 Ly 영역이, 루프 구조를 취한다. 도 3은, 어디까지나, 각 영역의 연결 차례 및 이중쇄를 형성하는 각 영역의 위치 관계를 나타내는 것이고, 예를 들어, 각 영역의 길이 등은, 이것에 제한되지 않는다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc), 상기 내부 5'측 영역(X), 상기 내부 3'측 영역(Y) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 이하와 같다.

상기 5'측 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 내부 5'측 영역(X)의 전체 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)와 동일한 염기 길이이며, 상기 영역(X)의 5'말단으로부터 3'말단의 전체 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Xc)는, 보다 바람직하게는, 상기 영역(X)와 동일한 염기 길이이며, 또한 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 모든 염기와 상보적인 것이 바람직하다. 한편, 이것에는 제한되지 않고, 예를 들어, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 된다.

또한, 상기 5'측 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 내부 5'측 영역(X)의 부분 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Xc)는, 예를 들어, 상기 영역(X)의 부분 영역과 동일한 염기 길이이며, 즉, 상기 영역(X)보다도, 1염기 이상 짧은 염기 길이의 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Xc)는, 보다 바람직하게는, 상기 영역(X)의 상기 부분 영역과 동일한 염기 길이이며, 또한 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 상기 부분 영역의 모든 염기와 상보적인 것이 바람직하다. 상기 영역(X)의 상기 부분 영역은, 예를 들어, 상기 영역(X)에 있어서의, 5'말단의 염기(1번째의 염기)로부터 연속되는 염기 서열로 이루어지는 영역(세그먼트)인 것이 바람직하다.

상기 3'측 영역(Yc)는, 예를 들어, 상기 내부 3'측 영역(Y)의 전체 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Yc)는, 예를 들어, 상기 영역(Y)와 동일한 염기 길이이며, 상기 영역(Y)의 5'말단으로부터 3'말단의 전체 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Yc)는, 보다 바람직하게는, 상기 영역(Y)와 동일한 염기 길이이며, 또한 상기 영역(Yc)의 모든 염기가, 상기 영역(Y)의 모든 염기와 상보적인 것이 바람직하다. 한편, 이것에는 제한되지 않고, 예를 들어, 1 혹은 수 염기가 비상보적이어도 된다.

또한, 상기 3'측 영역(Yc)는, 예를 들어, 상기 내부 3'측 영역(Y)의 부분 영역에 상보적이어도 된다. 이 경우, 상기 영역(Yc)는, 예를 들어, 상기 영역(Y)의 부분 영역과 동일한 염기 길이이며, 즉, 상기 영역(Y)보다도, 1염기 이상 짧은 염기 길이의 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Yc)는, 보다 바람직하게는, 상기 영역(Y)의 상기 부분 영역과 동일한 염기 길이이며, 또한 상기 영역(Yc)의 모든 염기가, 상기 영역(Y)의 상기 부분 영역의 모든 염기와 상보적인 것이 바람직하다. 상기 영역(Y)의 상기 부분 영역은, 예를 들어, 상기 영역(Y)에 있어서의, 3'말단의 염기(1번째의 염기)로부터 연속되는 염기 서열로 이루어지는 영역(세그먼트)인 것이 바람직하다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 내부 영역(Z)의 염기수(Z)와, 상기 내부 5'측 영역(X)의 염기수(X) 및 상기 내부 3'측 영역(Y)의 염기수(Y)의 관계, 상기 내부 영역(Z)의 염기수(Z)와, 상기 내부 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc) 및 상기 5'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)의 관계는, 예를 들어, 하기 식(1) 및 (2)의 조건을 만족시킨다.

Z=X+Y ···(1)

Z≥Xc+Yc ···(2)

ssNc 분자에 있어서, 상기 내부 5'측 영역(X)의 염기수(X)와 상기 내부 3'측 영역(Y)의 염기수(Y)의 길이의 관계는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 하기 식의 어느 조건을 만족시켜도 된다.

X=Y ···(19)

X＜Y ···(20)

X＞Y ···(21)

ssNc 분자에 있어서, 상기 내부 5'측 영역(X)의 염기수(X), 상기 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc), 상기 내부 3'측 영역(Y)의 염기수(Y) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)의 관계는, 예를 들어, 하기 (a)∼(d)의 어느 조건을 만족시킨다.

(a) 하기 식(3) 및 (4)의 조건을 만족시킨다.

X＞Xc ···(3)

Y=Yc ···(4)

(b) 하기 식(5) 및 (6)의 조건을 만족시킨다.

X=Xc ···(5)

Y＞Yc ···(6)

(c) 하기 식(7) 및 (8)의 조건을 만족시킨다.

X＞Xc ···(7)

Y＞Yc ···(8)

(d) 하기 식(9) 및 (10)의 조건을 만족시킨다.

X=Xc ···(9)

Y=Yc ···(10)

상기 (a)∼(d)에 있어서, 상기 내부 5'측 영역(X)의 염기수(X)와 상기 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc)의 차, 상기 내부 3'측 영역(Y)의 염기수(Y)와 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)의 차는, 예를 들어, 하기 조건을 만족시키는 것이 바람직하다.

(a) 하기 식(11) 및 (12)의 조건을 만족시킨다.

X-Xc=1∼10, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4,

보다 바람직하게는 1, 2 또는 3 ···(11)

Y-Yc=0 ···(12)

(b) 하기 식(13) 및 (14)의 조건을 만족시킨다.

X-Xc=0 ···(13)

Y-Yc=1∼10, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4,

보다 바람직하게는 1, 2 또는 3 ···(14)

(c) 하기 식(15) 및 (16)의 조건을 만족시킨다.

X-Xc=1∼10, 바람직하게는, 1, 2 또는 3,

보다 바람직하게는 1 또는 2 ···(15)

Y-Yc=1∼10, 바람직하게는, 1, 2 또는 3,

보다 바람직하게는 1 또는 2 ···(16)

(d) 하기 식(17) 및 (18)의 조건을 만족시킨다.

X-Xc=0 ···(17)

Y-Yc=0 ···(18)

상기 (a)∼(d)의 ssNc 분자에 대해, 각각의 구조의 일례를, 도 4의 모식도에 따라 설명한다. 도 4는, 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)를 포함하는 ssNc이며, (A)는, 상기 (a)의 ssNc 분자, (B)는, 상기 (b)의 ssNc 분자, (C)는, 상기 (c)의 ssNc 분자, (D)는, 상기 (d)의 ssNc 분자의 예이다. 도 4에 있어서, 점선은, 자기 어닐링에 의해 이중쇄를 형성하고 있는 상태를 나타낸다. 도 4의 ssNc 분자는, 상기 내부 5'측 영역(X)의 염기수(X)와 상기 내부 3'측 영역(Y)의 염기수(Y)를, 상기 식(20)의 「X＜Y」로서 나타내지만, 이것에는 제한되지 않고, 상기 식(19)의 「X=Y」여도, 상기 식(21)의 「X＞Y」여도 된다. 또한, 도 4는, 어디까지나, 상기 내부 5'측 영역(X)와 상기 5'측 영역(Xc)의 관계, 상기 내부 3'측 영역(Y)와 상기 3'측 영역(Yc)의 관계를 나타내는 모식도이며, 예를 들어, 각 영역의 길이, 형상 등은, 이것에는 제한되지 않고, 또한, 링커 영역(Lx) 및 링커 영역(Ly)의 유무도, 이것에는 제한되지 않는다.

상기 (a)∼(c)의 ssNc 분자는, 예를 들어, 상기 5'측 영역(Xc)와 상기 내부 5'측 영역(X), 및 상기 3'측 영역(Yc)와 상기 내부 3'측 영역(Y)가, 각각 이중쇄를 형성하는 것에 의해, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 어느 것과도 얼라인먼트할 수 없는 염기를 갖는 구조이며, 이중쇄를 형성하지 않는 염기를 갖는 구조라고도 할 수 있다. 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 얼라인먼트할 수 없는 염기(이중쇄를 형성하지 않는 염기라고도 한다)를, 이하, 「프리 염기」라고 한다. 도 4에 있어서, 상기 프리 염기의 영역을, 「F」로 나타낸다. 상기 영역(F)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 영역(F)의 염기수(F)는, 예를 들어, 상기 (a)의 ssNc 분자의 경우, 「X-Xc」의 염기수이고, 상기 (b)의 ssNc 분자의 경우, 「Y-Yc」의 염기수이며, 상기 (c)의 ssNc 분자의 경우, 「X-Xc」의 염기수와 「Y-Yc」의 염기수의 합계수이다.

다른 한편, 상기 (d)의 ssNc 분자는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)의 전체 영역이, 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc)와 얼라인먼트하는 구조이며, 상기 내부 영역(Z)의 전체 영역이 이중쇄를 형성하는 구조라고도 할 수 있다. 한편, 상기 (d)의 ssNc 분자에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc)의 5'말단과 상기 3'측 영역(Yc)의 3'말단은, 미연결이다.

상기 5'측 영역(Xc), 상기 3'측 영역(Yc), 및 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 상기 프리 염기(F)의 염기수의 합계는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)의 염기수가 된다. 이 때문에, 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 길이는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)의 길이, 상기 프리 염기의 수(F) 및 그 위치에 따라서, 적절히 결정할 수 있다.

상기 내부 영역(Z)의 염기수는, 예를 들어, 19염기 이상이다. 상기 염기수의 하한은, 예를 들어, 19염기이고, 바람직하게는 20염기이며, 보다 바람직하게는 21염기이다. 상기 염기수의 상한은, 예를 들어, 50염기이고, 바람직하게는 40염기이며, 보다 바람직하게는 30염기이다. 상기 내부 영역(Z)의 염기수의 구체예는, 예를 들어, 19∼50염기, 20∼40염기, 21∼30염기, 21∼23염기이다.

상기 내부 영역(Z)가 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 내부 영역(Z)는, 예를 들어, 상기 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역이어도 되고, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 영역이어도 된다. 상기 발현 억제 서열의 염기수는, 예를 들어, 15∼30염기이고, 바람직하게는, 19∼25염기이며, 보다 바람직하게는 19∼23염기이고, 더 바람직하게는 21, 22, 23염기이며, 특히 바람직하게는 23염기이다. 상기 내부 영역(Z)가 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 가져도 된다. 상기 부가 서열의 염기수는, 예를 들어, 1∼31염기이고, 바람직하게는, 1∼21염기이며, 보다 바람직하게는, 1∼11염기이고, 더 바람직하게는, 1∼7염기이며, 특별히 바람직하게는 1∼3염기이다.

상기 5'측 영역(Xc)의 염기수는, 예를 들어, 1∼49염기이고, 바람직하게는 1∼39염기이며, 보다 바람직하게는 1∼29염기이다. 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수는, 예를 들어, 1∼49염기이고, 바람직하게는 1∼39염기이며, 보다 바람직하게는 1∼29염기이다. 상기 5'측 영역(Xc) 및 3'측 영역(Yc)의 어느 한쪽의 염기수는, 1∼4염기인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 1염기, 2염기, 3염기이다.

상기 내부 영역(Z), 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수는, 예를 들어, 상기 식(2)의 「Z≥Xc+Yc」로 나타낼 수 있다. 구체예로서, 「Xc+Yc」의 염기수는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)과 동일하거나, 또는 상기 내부 영역(Z)보다 작다. 후자의 경우, 「Z-(Xc+Yc)」는, 예를 들어, 1∼10, 바람직하게는 1∼4, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3이다. 상기 「Z-(Xc+Yc)」는, 예를 들어, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 상기 프리 염기의 영역(F)의 염기수(F)에 상당한다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)의 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커 영역(Lx)는, 예를 들어, 상기 내부 5'측 영역(X)와 상기 5'측 영역(Xc)가 이중쇄를 형성 가능한 길이인 것이 바람직하고, 상기 링커 영역(Ly)는, 예를 들어, 상기 내부 3'측 영역(Y)와 상기 3'측 영역(Yc)가 이중쇄를 형성 가능한 길이인 것이 바람직하다. 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)의 구성 단위가 염기를 포함하는 경우, 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)의 각각의 염기수는, 동일해도 상이해도 되고, 또한, 그의 염기 서열도, 동일해도 상이해도 된다. 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)의 염기수는, 그 하한이, 예를 들어, 1염기이고, 바람직하게는 2염기이며, 보다 바람직하게는 3염기이고, 그 상한이, 예를 들어, 100염기이고, 바람직하게는 80염기이며, 보다 바람직하게는 50염기이다. 상기 각 링커 영역의 염기수는, 구체예로서, 예를 들어, 1∼50염기, 1∼30염기, 1∼20염기, 1∼10염기, 1∼7염기, 1∼4염기 등을 예시할 수 있지만, 이것에는 제한되지 않는다.

ssNc 분자의 전체 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 ssNc 분자에 있어서, 상기 염기수의 합계(전체 길이의 염기수)는, 하한이, 예를 들어, 38염기이고, 바람직하게는 42염기이며, 보다 바람직하게는 50염기이고, 더 바람직하게는 51염기이며, 특히 바람직하게는 52염기이고, 그 상한은, 예를 들어, 300염기이고, 바람직하게는 200염기이며, 보다 바람직하게는 150염기이고, 더 바람직하게는 100염기이며, 특별히 바람직하게는 80염기이고, 특히 바람직하게는 60염기이다. 상기 ssNc 분자의 전체 길이의 염기수의 합계의 구체예는, 38∼300염기, 42∼200염기, 50∼150염기, 51∼100염기, 52∼80염기이다. ssNc 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx) 및 링커 영역(Ly)를 제외하는 염기수의 합계는, 하한이, 예를 들어, 38염기이고, 바람직하게는 42염기이며, 보다 바람직하게는 50염기이고, 더 바람직하게는 51염기이며, 특히 바람직하게는 52염기이고, 상한이, 예를 들어, 300염기이고, 바람직하게는 200염기이며, 보다 바람직하게는 150염기이고, 더 바람직하게는 100염기이며, 특별히 바람직하게는 80염기이고, 특히 바람직하게는 60염기이다. 상기 링커 영역(Lx)를 제외하는 염기수의 합계의 구체예는, 38∼300염기, 42∼200염기, 50∼150염기, 51∼100염기, 52∼80염기, 52∼60염기이다.

ssNc 분자의 주요 구성 단위인 상기 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 리보뉴클레오타이드 잔기 및 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기를 들 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 수식되어 있지 않은 비수식 뉴클레오타이드 잔기 및 수식된 수식 뉴클레오타이드 잔기를 들 수 있다. ssNc 분자는, 예를 들어, 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 것에 의해, 뉴클레아제 내성을 향상시켜, 안정성을 향상 가능하다. 또한, 본 발명의 ssNc 분자는, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 잔기 외에, 추가로 비뉴클레오타이드 잔기를 포함해도 된다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 내부 영역(Z), 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 구성 단위는, 각각, 상기 뉴클레오타이드 잔기가 바람직하다. 상기 각 영역은, 예를 들어, 하기 (1)∼(3)의 잔기로 구성된다.

(1) 비수식 뉴클레오타이드 잔기

(2) 수식 뉴클레오타이드 잔기

ssNc 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)의 구성 단위는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 잔기 및 상기 비뉴클레오타이드 잔기를 들 수 있다. 상기 링커 영역은, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 잔기만으로 구성되어도 되고, 상기 비뉴클레오타이드 잔기만으로 구성되어도 되고, 상기 뉴클레오타이드 잔기와 상기 비뉴클레오타이드 잔기로 구성되어도 된다. 상기 링커 영역은, 예를 들어, 하기 (1)∼(7)의 잔기로 구성된다.

(1) 비수식 뉴클레오타이드 잔기

(2) 수식 뉴클레오타이드 잔기

(4) 비뉴클레오타이드 잔기

(5) 비뉴클레오타이드 잔기 및 비수식 뉴클레오타이드 잔기

(6) 비뉴클레오타이드 잔기 및 수식 뉴클레오타이드 잔기

ssNc 분자가, 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)의 양쪽을 갖는 경우, 예를 들어, 양쪽의 구성 단위가 동일해도 되고, 상이해도 된다. 구체예로서, 예를 들어, 양쪽의 링커 영역의 구성 단위가 상기 뉴클레오타이드 잔기인 형태, 양쪽의 링커 영역의 구성 단위가 상기 비뉴클레오타이드 잔기인 형태, 한쪽 영역의 구성 단위가 상기 뉴클레오타이드 잔기이고, 다른 쪽의 링커 영역의 구성 단위가 비뉴클레오타이드 잔기인 형태 등을 들 수 있다.

ssNc 분자는, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 잔기만으로 구성되는 분자, 상기 뉴클레오타이드 잔기 외에 상기 비뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자 등을 들 수 있다. 본 발명의 ssNc 분자에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 상기 비수식 뉴클레오타이드 잔기만이어도 되고, 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기만이어도 되고, 상기 비수식 뉴클레오타이드 잔기 및 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기의 양쪽이어도 된다. 상기 ssNc 분자가, 상기 비수식 뉴클레오타이드 잔기와 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 경우, 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 「1 혹은 수 개」이며, 구체적으로는, 예를 들어, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개이다. ssNc 분자가, 상기 비뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 경우, 상기 비뉴클레오타이드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 「1 혹은 수 개」이며, 구체적으로는, 예를 들어, 1∼8개, 1∼6개, 1∼4개, 1, 2 또는 3개이다.

ssNc 분자에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 리보뉴클레오타이드 잔기가 바람직하다. 이 경우, 본 발명의 ssNc 분자는, 예를 들어, 「N-ssRNA 분자」라고도 한다. 상기 N-ssRNA 분자는, 예를 들어, 상기 리보뉴클레오타이드 잔기만으로 구성되는 분자, 상기 리보뉴클레오타이드 잔기 외에 상기 비뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자를 들 수 있다. 상기 N-ssRNA 분자에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기만이어도 되고, 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기만이어도 되고, 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기 및 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기의 양쪽을 포함해도 된다.

상기 N-ssRNA 분자가, 예를 들어, 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기 외에 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 경우, 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 「1 혹은 수 개」이며, 구체적으로는, 예를 들어, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개이다. 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기에 대한 상기 수식 리보뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 리보스 잔기가 데옥시리보스 잔기로 치환된 상기 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기여도 된다. 상기 N-ssRNA 분자가, 예를 들어, 상기 비수식 리보뉴클레오타이드 잔기 외에 상기 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 경우, 상기 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 「1 혹은 수 개」이며, 구체적으로는, 예를 들어, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개이다.

(5) ssPN 분자 및 ssNc 분자의 합성 방법

ssPN 분자 및 ssNc 분자의 합성 방법은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지된 방법을 채용할 수 있다. 상기 합성 방법은, 예를 들어, 유전자 공학적 수법에 의한 합성법, 화학 합성법 등을 들 수 있다. 유전자 공학적 수법은, 예를 들어, 인비트로 전사 합성법, 벡터를 이용하는 방법, PCR 카세트에 의한 방법 등을 들 수 있다. 상기 벡터는, 특별히 제한되지 않고, 플라스미드 등의 비바이러스 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 상기 화학 합성법은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 포스포로아미다이트법 및 H-포스포네이트법 등을 들 수 있다. 상기 화학 합성법은, 예를 들어, 시판되는 자동 핵산 합성기를 사용 가능하다. 상기 화학 합성법은, 일반적으로, 아미다이트가 사용된다. 상기 아미다이트는, 특별히 제한되지 않고, 시판되는 아미다이트로서, 예를 들어, RNA Phosphoramidites(2'-O-TBDMSi, 상품명, 삼천리 제약), ACE 아미다이트, TOM 아미다이트, CEE 아미다이트, CEM 아미다이트, TEM 아미다이트 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 ssPN 분자 및 ssNc 분자는, WO2012/05368, WO2012/17919, WO2013/27843, WO2016/159374에 기재된 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.

(6) 안티센스 폴리뉴클레오타이드

NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산의 하나인 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 대해 이하에 설명한다.

안티센스 폴리뉴클레오타이드는, 안티센스 DNA 및/또는 안티센스 RNA이며, 표적으로 하는 유전자 RNA의 전체 길이 혹은 일부에 대한 안티센스 핵산을 세포 내에 도입함으로써 효과를 발휘한다.

안티센스 폴리뉴클레오타이드의 발현 저해의 메커니즘으로서는,

1) mRNA의 5'캡 부위로부터 개시 코돈의 약 25염기 하류까지의 영역을 표적 서열로 하는 번역 개시 복합체의 입체적 저해

2) 표적 mRNA와 상보적인 1본쇄 DNA이며, RNaseH를 개재시킨 mRNA 분해

3) pre-mRNA의 엑손과 인트론의 경계 영역을 표적 서열로 하는 스플라이싱 저해(mRNA의 성숙 저해)

를 들 수 있지만, NEK6 유전자의 발현을 억제하는 것이면, 그 메커니즘은 특별히 제한되는 것은 아니다.

안티센스 폴리뉴클레오타이드는, RNA와의 결합 안정성(Tm치 등), 미스매치 서열 인식능, 뉴클레아제 내성, RNaseH 활성 등의 점에서 수식 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.

수식 뉴클레오타이드 잔기로서는, 리보스 잔기, 인산 골격에의 수식이 바람직하다.

(7) miRNA

NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산의 하나인 miRNA에 대해 이하에 설명한다.

miRNA는, mRNA로부터 단백질에의 번역의 저해 또는 mRNA의 분해를 통해, 유전자의 발현 조절에 관여한다. miRNA는, 세포 내에 존재하는 단쇄(20-25염기)의 논코딩 RNA이다. miRNA는, 우선, DNA로부터, miRNA와 그 상보쇄를 포함하고 헤어핀 루프 구조를 취하는 것이 가능한 1본쇄의 pri-RNA로서 전사된다. 다음에 pri-RNA는, 핵 내에 있는 Drosha로 불리는 효소에 의해 일부가 절단되고 pre-RNA가 되어 핵 외로 수송된다. 그 후, pre-RNA는 추가로 Dicer에 의해 절단되는 것에 의해, miRNA로서 기능한다. miRNA는, mRNA의 3'비번역 영역에 불완전한 하이브리다이제이션 결합을 행하여, 그 mRNA가 코딩하는 단백질 합성을 저해한다.

NEK6의 유전자 발현을 억제하는 miRNA는, 표적 유전자의 유전자명 또는 mRNA 서열 정보에 기초하여, 예를 들어, miRDB(http://mirdb.org/miRDB/index.html) 등의 데이터베이스에 따라 얻을 수 있다.

(8) 핵산에 사용되는 뉴클레오타이드 잔기

본 발명의 유효 성분인 핵산에 사용되는 뉴클레오타이드 잔기는, 구성 요소로서, 당, 염기 및 인산을 포함한다. 상기 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 리보뉴클레오타이드 잔기 및 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 리보뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 당으로서 리보스 잔기를 갖고, 염기로서 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 갖고, 상기 데옥시리보스 잔기는, 예를 들어, 당으로서 데옥시리보스 잔기를 갖고, 염기로서 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 및 티민(T)을 갖는다.

상기 뉴클레오타이드 잔기는, 비수식 뉴클레오타이드 잔기 및 수식 뉴클레오타이드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 비수식 뉴클레오타이드 잔기는, 상기 각 구성 요소가, 예를 들어, 천연에 존재하는 것과 동일 또는 실질적으로 동일하고, 바람직하게는, 인체에 있어서 천연에 존재하는 것과 동일 또는 실질적으로 동일하다.

상기 수식 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 상기 비수식 뉴클레오타이드 잔기를 수식한 뉴클레오타이드 잔기이다. 상기 수식 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 상기 비수식 뉴클레오타이드 잔기의 구성 요소의 어느 것이 수식되어도 된다. 본 발명에 있어서, 「수식」은, 예를 들어, 상기 구성 요소의 치환, 부가 및/또는 결실, 상기 구성 요소에 있어서의 원자 및/또는 작용기의 치환, 부가 및/또는 결실이며, 「개변」이라고 할 수 있다. 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 천연에 존재하는 뉴클레오타이드 잔기, 인공적으로 수식한 뉴클레오타이드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 천연 유래의 수식 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 림바크 등(Limbach et al. 1994, Summary: the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res. 22: 2183∼2196)을 참조할 수 있다. 또한, 상기 수식 뉴클레오타이드 잔기는, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드의 대체물의 잔기여도 된다.

상기 뉴클레오타이드 잔기의 수식은, 예를 들어, 리보스-인산 골격(이하, 리보인산 골격)의 수식 등을 들 수 있다.

상기 리보인산 골격에 있어서, 예를 들어, 리보스 잔기를 수식할 수 있다. 상기 리보스 잔기는, 예를 들어, 2'위 탄소를 수식할 수 있고, 구체적으로는, 예를 들어, 2'위 탄소에 결합하는 수산기를, 수소 또는 플루오로 등으로 치환할 수 있다. 상기 2'위 탄소의 수산기를 수소로 치환함으로써, 리보스 잔기를 데옥시리보스로 치환할 수 있다. 상기 리보스 잔기는, 예를 들어, 입체 이성체로 치환할 수 있고, 예를 들어, 아라비노스 잔기로 치환해도 된다.

상기 리보인산 골격은, 예를 들어, 비리보스 잔기 및/또는 비인산을 갖는 비리보인산 골격으로 치환해도 된다. 상기 비리보인산 골격은, 예를 들어, 상기 리보인산 골격의 비하전체 등을 들 수 있다. 상기 비리보인산 골격으로 치환된, 상기 뉴클레오타이드의 대체물은, 예를 들어, 모폴리노, 사이클로뷰틸, 피롤리딘 등을 들 수 있다. 상기 대체물은, 이 밖에, 예를 들어, 인공 핵산 모노머 잔기 등을 들 수 있다. 구체예로서, 예를 들어, PNA(펩타이드 핵산), LNA(Locked Nucleic Acid), ENA(2'-O,4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 PNA이다.

상기 리보인산 골격에 있어서, 예를 들어, 인산기를 수식할 수 있다. 상기 리보인산 골격에 있어서, 당 잔기에 가장 가까운 인산기는, α인산기로 불린다. 상기 α인산기는, 음으로 하전되고, 그 전하는, 당 잔기에 비결합인 2개의 산소 원자에 걸쳐서, 균일하게 분포하고 있다. 상기 α인산기에 있어서의 4개의 산소 원자 중, 뉴클레오타이드 잔기 사이의 포스포다이에스터 결합에 있어서, 당 잔기와 비결합인 2개의 산소 원자는, 이하, 「비결합(non-linking) 산소」라고도 한다. 한편, 상기 뉴클레오타이드 잔기 사이의 포스포다이에스터 결합에 있어서, 당 잔기와 결합하고 있는 2개의 산소 원자는, 이하, 「결합(linking) 산소」라고 한다. 상기 α인산기는, 예를 들어, 비하전이 되는 수식, 또는 상기 비결합 원자에 있어서의 전하 분포가 비대칭형이 되는 수식을 행하는 것이 바람직하다.

상기 인산기는, 예를 들어, 상기 비결합 산소를 치환해도 된다. 상기 산소는, 예를 들어, S(황), Se(셀레늄), B(붕소), C(탄소), H(수소), N(질소) 및 OR(R은, 예를 들어, 알킬기 또는 아릴기)의 어느 원자로 치환할 수 있고, 바람직하게는, S로 치환된다. 상기 비결합 산소는, 예를 들어, 양쪽이 치환되어 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 양쪽이 S로 치환된다. 상기 수식 인산기는, 예를 들어, 포스포로싸이오에이트, 포스포로다이싸이오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트에스터, 포스포네이트 수소, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트, 및 포스포트라이에스터 등을 들 수 있고, 그 중에서도, 상기 2개의 비결합 산소가 양쪽 모두 S로 치환되어 있는 포스포로다이싸이오에이트가 바람직하다.

상기 인산기는, 예를 들어, 상기 결합 산소를 치환해도 된다. 상기 산소는, 예를 들어, S(황), C(탄소) 및 N(질소)의 어느 원자로 치환할 수 있다. 상기 수식 인산기는, 예를 들어, N으로 치환한 가교 포스포로아미데이트, S로 치환한 가교 포스포로싸이오에이트, 및 C로 치환한 가교 메틸렌포스포네이트 등을 들 수 있다. 상기 결합 산소의 치환은, 예를 들어, 본 발명의 ssPN 분자의 5'말단 뉴클레오타이드 잔기 및 3'말단 뉴클레오타이드 잔기 중 적어도 한쪽에 있어서 행하는 것이 바람직하고, 5'측의 경우, C에 의한 치환이 바람직하고, 3'측의 경우, N에 의한 치환이 바람직하다.

상기 인산기는, 예를 들어, 상기 인 비함유의 링커로 치환해도 된다. 상기 링커는, 예를 들어, 실록세인, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아마이드, 싸이오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아마이드, 싸이오폼아세탈, 폼아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌다이메틸하이드라조, 및 메틸렌옥시메틸이미노 등을 포함하고, 바람직하게는, 메틸렌카보닐아미노기 및 메틸렌메틸이미노기를 포함한다.

상기 말단의 뉴클레오타이드 잔기의 수식은, 예를 들어, 다른 분자의 부가 등을 들 수 있다. 상기 다른 분자는, 예를 들어, 전술과 같은 표지 물질, 보호기 등의 기능성 분자 등을 들 수 있다. 상기 보호기는, 예를 들어, S(황), Si(규소), B(붕소), 에스터 함유 기 등을 들 수 있다.

상기 다른 분자는, 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 잔기의 인산기에 부가해도 되고, 스페이서를 개재시켜, 상기 인산기 또는 상기 당 잔기에 부가해도 된다. 상기 스페이서의 말단 원자는, 예를 들어, 상기 인산기의 상기 결합 산소, 또는, 당 잔기의 O, N, S 혹은 C에, 부가 또는 치환할 수 있다. 상기 당 잔기의 결합 부위는, 예를 들어, 3'위의 C 혹은 5'위의 C, 또는 이들에 결합하는 원자가 바람직하다. 상기 스페이서는, 예를 들어, 상기 PNA 등의 뉴클레오타이드 대체물의 말단 원자에, 부가 또는 치환할 수도 있다.

상기 스페이서는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, -(CH₂)_n-, -(CH₂)_nN-, -(CH₂)_nO-, -(CH₂)_nS-, O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OH, 무염기당, 아마이드, 카복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 싸이오에터, 다이설파이드, 싸이오요소, 설폰아마이드, 및 모폴리노 등, 및 비오틴 시약 및 플루오레세인 시약 등을 포함해도 된다. 상기 식에 있어서, n은, 양의 정수이며, n=3 또는 6이 바람직하다.

상기 말단에 부가하는 분자는, 이들 외에, 예를 들어, 색소, 인터캘레이트제(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 솔라렌, 마이토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환식 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 다이하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 담체(예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만테인아세트산, 1-피렌뷰티르산, 다이하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로페인다이올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜산, 다이메톡시트라이틸, 또는 페녹사진) 및 펩타이드 복합체(예를 들어, 안테나페디아 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 인산, 아미노, 머캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]₂, 폴리아미노, 알킬, 치환 알킬, 방사선 표지 마커, 효소, 하프텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 복합체, 테트라아자매크로환의 Eu³⁺ 복합체) 등을 들 수 있다.

핵산 분자는, 상기 5'말단이, 예를 들어, 인산기 또는 인산기 아날로그로 수식되어도 된다. 상기 인산기는, 예를 들어, 5'일인산((HO)₂(O)P-O-5'), 5'이인산((HO)₂(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'), 5'삼인산((HO)₂(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'), 5'-구아노신 캡(7-메틸화 또는 비메틸화, 7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'), 5'-아데노신 캡(Appp), 임의의 수식 또는 비수식 뉴클레오타이드 캡 구조(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'), 5'-싸이오인산(포스포로싸이오에이트: (HO)₂(S)P-O-5'), 5'-다이싸이오인산(포스포로다이싸이오에이트: (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로싸이올산((HO)₂(O)P-S-5'), 황 치환의 일인산, 이인산 및 삼인산(예를 들어, 5'-α-싸이오삼인산, 5'-γ-싸이오삼인산 등), 5'-포스포르아미데이트((HO)₂(O)P-NH-5', (HO)(NH₂)(O)P-O-5'), 5'-알킬 포스폰산(예를 들어, RP(OH)(O)-O-5', (OH)₂(O)P-5'-CH₂, R은 알킬(예를 들어, 메틸, 에틸, 아이소프로필, 프로필 등)), 5'-알킬 에터 포스폰산(예를 들어, RP(OH)(O)-O-5', R은 알킬 에터(예를 들어, 메톡시메틸, 에톡시메틸 등)) 등을 들 수 있다.

상기 뉴클레오타이드 잔기에 있어서, 상기 염기는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 염기는, 예를 들어, 천연의 염기여도 되고, 비천연의 염기여도 된다. 상기 염기는, 예를 들어, 천연 유래여도 되고, 합성품이어도 된다. 상기 염기는, 예를 들어, 일반적인 염기, 그의 수식 아날로그 등을 사용할 수 있다.

상기 염기는, 예를 들어, 아데닌 및 구아닌 등의 퓨린 염기, 사이토신, 우라실 및 티민 등의 피리미딘 염기 등을 들 수 있다. 상기 염기는, 이 밖에, 이노신, 티민, 잔틴, 하이포잔틴, 누발라린(nubularine), 아이소구아니신(isoguanisine), 투베르시딘(tubercidine) 등을 들 수 있다. 상기 염기는, 예를 들어, 2-아미노아데닌, 6-메틸화 퓨린 등의 알킬 유도체; 2-프로필화 퓨린 등의 알킬 유도체; 5-할로우라실 및 5-할로사이토신; 5-프로핀일우라실 및 5-프로핀일사이토신; 6-아조우라실, 6-아조사이토신 및 6-아조티민; 5-우라실(프소이드우라실), 4-싸이오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노알릴우라실; 8-할로화, 아미노화, 싸이올화, 싸이오알킬화, 하이드록실화 및 다른 8-치환 퓨린; 5-트라이플루오로메틸화 및 다른 5-치환 피리미딘; 7-메틸구아닌; 5-치환 피리미딘; 6-아자피리미딘; N-2, N-6, 및 O-6 치환 퓨린(2-아미노프로필아데닌을 포함한다); 5-프로핀일우라실 및 5-프로핀일사이토신; 다이하이드로우라실; 3-데아자-5-아자사이토신; 2-아미노퓨린; 5-알킬우라실; 7-알킬구아닌; 5-알킬사이토신; 7-데아자아데닌; N6,N6-다이메틸아데닌; 2,6-다이아미노퓨린; 5-아미노-알릴-우라실; N3-메틸우라실; 치환 1,2,4-트라이아졸; 2-피리딘온; 5-나이트로인돌; 3-나이트로피롤; 5-메톡시우라실; 우라실-5-옥시아세트산; 5-메톡시카보닐메틸우라실; 5-메틸-2-싸이오우라실; 5-메톡시카보닐메틸-2-싸이오우라실; 5-메틸아미노메틸-2-싸이오우라실; 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우라실; 3-메틸사이토신; 5-메틸사이토신; N4-아세틸사이토신; 2-싸이오사이토신; N6-메틸아데닌; N6-아이소펜틸아데닌; 2-메틸싸이오-N6-아이소펜텐일아데닌; N-메틸구아닌; O-알킬화 염기 등을 들 수 있다. 또한, 퓨린 및 피리미딘은, 예를 들어, 미국 특허 제3,687,808호, 「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」, 858∼859페이지, 크로슈비츠 제이 아이(Kroschwitz J. I.)편, John Wiley & Sons, 1990, 및 잉글리시 등(Englisch 등), Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30권, p. 613에 개시되는 것이 포함된다.

(9) 그 외의 용어의 정의

본 발명의 유효 성분인 핵산, 링커 등의 설명에서 사용되는 용어는, 당해 기술 분야에서의 통상 이용되는 것이고, 예를 들어, 이하와 같이 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, 「알킬」은, 예를 들어, 직쇄상 또는 분기상의 알킬기를 포함한다. 상기 알킬의 탄소수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 1∼30이며, 바람직하게는, 1∼6 또는 1∼4이다. 상기 알킬기는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, 아이소뷰틸, sec-뷰틸, tert-뷰틸, n-틸, 아이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 아이소헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, 아이소뷰틸, sec-뷰틸, tert-뷰틸, n-틸, 아이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 아이소헥실 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「알켄일」은, 예를 들어, 직쇄상 또는 분기상의 알켄일을 포함한다. 상기 알켄일은, 상기 알킬에 있어서, 1개 또는 복수의 이중 결합을 갖는 것 등을 들 수 있다. 상기 알켄일의 탄소수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 상기 알킬과 마찬가지이고, 바람직하게는 2∼8이다. 상기 알켄일은, 예를 들어, 바이닐, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일, 3-뷰텐일, 1,3-뷰타다이엔일, 3-메틸-2-뷰텐일 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「알킨일」은, 예를 들어, 직쇄상 또는 분기상의 알킨일을 포함한다. 상기 알킨일은, 상기 알킬에 있어서, 1개 또는 복수의 삼중 결합을 갖는 것 등을 들 수 있다. 상기 알킨일의 탄소수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 상기 알킬과 마찬가지이고, 바람직하게는 2∼8이다. 상기 알킨일은, 예를 들어, 에틴일, 프로핀일, 뷰틴일 등을 들 수 있다. 상기 알킨일은, 예를 들어, 추가로 1개 또는 복수의 이중 결합을 가져도 된다.

본 발명에 있어서, 「아릴」은, 예를 들어, 단환 방향족 탄화수소기 및 다환 방향족 탄화수소기를 포함한다. 상기 단환 방향족 탄화수소기는, 예를 들어, 페닐 등을 들 수 있다. 상기 다환 방향족 탄화수소기는, 예를 들어, 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안트릴, 2-안트릴, 9-안트릴, 1-페난트릴, 2-페난트릴, 3-페난트릴, 4-페난트릴, 9-페난트릴 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 페닐, 1-나프틸 및 2-나프틸 등의 나프틸 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「헤테로아릴」은, 예를 들어, 단환 방향족 헤테로환식기 및 축합 방향족 헤테로환식기를 포함한다. 상기 헤테로아릴은, 예를 들어, 퓨릴(예: 2-퓨릴, 3-퓨릴), 싸이엔일(예: 2-싸이엔일, 3-싸이엔일), 피롤릴(예: 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴), 이미다졸릴(예: 1-이미다졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴), 피라졸릴(예: 1-피라졸릴, 3-피라졸릴, 4-피라졸릴), 트라이아졸릴(예: 1,2,4-트라이아졸-1-일, 1,2,4-트라이아졸-3-일, 1,2,4-트라이아졸-4-일), 테트라졸릴(예: 1-테트라졸릴, 2-테트라졸릴, 5-테트라졸릴), 옥사졸릴(예: 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴), 아이속사졸릴(예: 3-아이속사졸릴, 4-아이속사졸릴, 5-아이속사졸릴), 싸이아졸릴(예: 2-싸이아졸릴, 4-싸이아졸릴, 5-싸이아졸릴), 싸이아다이아졸릴, 아이소싸이아졸릴(예: 3-아이소싸이아졸릴, 4-아이소싸이아졸릴, 5-아이소싸이아졸릴), 피리딜(예: 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜), 피리다진일(예: 3-피리다진일, 4-피리다진일), 피리미딘일(예: 2-피리미딘일, 4-피리미딘일, 5-피리미딘일), 퓨라잔일(예: 3-퓨라잔일), 피라진일(예: 2-피라진일), 옥사다이아졸릴(예: 1,3,4-옥사다이아졸-2-일), 벤조퓨릴(예: 2-벤조[b]퓨릴, -벤조[b]퓨릴, 4-벤조[b]퓨릴, 5-벤조[b]퓨릴, 6-벤조[b]퓨릴, 7-벤조[b]퓨릴), 벤조싸이엔일(예: 2-벤조[b]싸이엔일, 3-벤조[b]싸이엔일, 4-벤조[b]싸이엔일, 5-벤조[b]싸이엔일, 6-벤조[b]싸이엔일, 7-벤조[b]싸이엔일), 벤즈이미다졸릴(예: 1-벤조이미다졸릴, 2-벤조이미다졸릴, 4-벤조이미다졸릴, 5-벤조이미다졸릴), 다이벤조퓨릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조싸이아졸릴, 퀴녹살릴(예: 2-퀴녹살린일, 5-퀴녹살린일, 6-퀴녹살린일), 신놀린일(예: 3-신놀린일, 4-신놀린일, 5-신놀린일, 6-신놀린일, 7-신놀린일, 8-신놀린일), 퀴나졸릴(예: 2-퀴나졸린일, 4-퀴나졸린일, 5-퀴나졸린일, 6-퀴나졸린일, 7-퀴나졸린일, 8-퀴나졸린일), 퀴놀릴(예: 2-퀴놀릴, 3-퀴놀릴, 4-퀴놀릴, 5-퀴놀릴, 6-퀴놀릴, 7-퀴놀릴, 8-퀴놀릴), 프탈라진일(예: 1-프탈라진일, 5-프탈라진일, 6-프탈라진일), 아이소퀴놀릴(예: 1-아이소퀴놀릴, 3-아이소퀴놀릴, 4-아이소퀴놀릴, 5-아이소퀴놀릴, 6-아이소퀴놀릴, 7-아이소퀴놀릴, 8-아이소퀴놀릴), 퓨릴, 프테리딘일(예: 2-프테리딘일, 4-프테리딘일, 6-프테리딘일, 7-프테리딘일), 카바졸릴, 페난트리딘일, 아크리딘일(예: 1-아크리딘일, 2-아크리딘일, 3-아크리딘일, 4-아크리딘일, 9-아크리딘일), 인돌릴(예: 1-인돌릴, 2-인돌릴, 3-인돌릴, 4-인돌릴, 5-인돌릴, 6-인돌릴, 7-인돌릴), 아이소인돌릴, 페나진일(예: 1-페나진일, 2-페나진일) 또는 페노싸이아진일(예: 1-페노싸이아진일, 2-페노싸이아진일, 3-페노싸이아진일, 4-페노싸이아진일) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「사이클로알킬」은, 예를 들어, 환상 포화 탄화수소기이며, 탄소수는, 예를 들어, 3∼15이다. 상기 사이클로알킬은, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 가교결합 환식 탄화수소기, 스파이로탄화수소기 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 가교결합 환식 탄화수소기 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「가교결합 환식 탄화수소기」는, 예를 들어, 바이사이클로[2.1.0]펜틸, 바이사이클로[2.2.1]헵틸, 바이사이클로[2.2.2]옥틸 및 바이사이클로[3.2.1]옥틸, 트라이사이클로[2.2.1.0]헵틸, 바이사이클로[3.3.1]노네인, 1-아다만틸, 2-아다만틸 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「스파이로탄화수소기」는, 예를 들어, 스파이로[3.4]옥틸 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「사이클로알켄일」은, 예를 들어, 환상의 불포화 지방족탄화수소기를 포괄하고, 탄소수는, 예를 들어, 3∼7개이다. 상기 기는, 예를 들어, 사이클로프로펜일, 사이클로뷰텐일, 사이클로펜텐일, 사이클로헥센일, 사이클로헵텐일 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 사이클로프로펜일, 사이클로뷰텐일, 사이클로펜텐일, 사이클로헥센일 등이다. 상기 사이클로알켄일은, 예를 들어, 환 중에 불포화 결합을 갖는 가교결합 환식 탄화수소기 및 스파이로탄화수소기도 포함한다.

본 발명에 있어서, 「아릴알킬」은, 예를 들어, 벤질, 2-페네틸, 및 나프탈렌일메틸 등을 들 수 있고, 「사이클로알킬알킬」 또는 「사이클릴알킬」은, 예를 들어, 사이클로헥실메틸, 아다만틸메틸 등을 들 수 있고, 「하이드록시알킬」은, 예를 들어, 예를 들어, 하이드록시메틸 및 2-하이드록시에틸 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「알콕시」는, 예를 들어, 상기 알킬-O-기를 포함하고, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, 및 n-뷰톡시 등을 들 수 있고, 「알콕시알킬」은, 예를 들어, 메톡시메틸 등을 들 수 있고, 「아미노알킬」은, 예를 들어, 2-아미노에틸 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「헤테로사이클릴」은, 예를 들어, 1-피롤린일, 2-피롤린일, 3-피롤린일, 1-피롤리딘일, 2-피롤리딘일, 3-피롤리딘일, 피롤리딘온, 1-이미다졸린일, 2-이미다졸린일, 4-이미다졸린일, 1-이미다졸리딘일, 2-이미다졸리딘일, 4-이미다졸리딘일, 이미다졸리딘온, 1-피라졸린일, 3-피라졸린일, 4-피라졸린일, 1-피라졸리딘일, 3-피라졸리딘일, 4-피라졸리딘일, 피페리딘온, 피페리디노, 2-피페리딘일, 3-피페리딘일, 4-피페리딘일, 1-피페라진일, 2-피페라진일, 피페라진온, 2-모폴린일, 3-모폴린일, 모폴리노, 테트라하이드로피란일, 테트라하이드로퓨란일 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「헤테로사이클릴알킬」은, 예를 들어, 피페리딘일메틸, 피페라진일메틸 등을 들 수 있고, 「헤테로사이클릴알켄일」은, 예를 들어, 2-피페리딘일에텐일 등을 들 수 있고, 「헤테로아릴알킬」은, 예를 들어, 피리딜메틸 및 퀴놀린-3-일메틸 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「실릴」은, 식 R₃Si-로 표시되는 기를 포함하고, R은, 독립적으로, 상기 알킬, 아릴 및 사이클로알킬로부터 선택할 수 있고, 예를 들어, 트라이메틸실릴기, tert-뷰틸다이메틸실릴기 등을 들 수 있고, 「실릴옥시」는, 예를 들어, 트라이메틸실릴옥시기 등을 들 수 있고, 「실릴옥시알킬」은, 예를 들어, 트라이메틸실릴옥시메틸 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「알킬렌」은, 예를 들어, 메틸렌, 에틸렌, 및 프로필렌 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 전술한 각종 기는, 치환되어도 된다. 상기 치환기는, 예를 들어, 하이드록시, 카복시, 할로젠, 할로젠화 알킬(예: CF₃, CH₂CF₃, CH₂CCl₃), 나이트로, 나이트로소, 사이아노, 알킬(예: 메틸, 에틸, 아이소프로필, tert-뷰틸), 알켄일(예: 바이닐), 알킨일(예: 에틴일), 사이클로알킬(예: 사이클로프로필, 아다만틸), 사이클로알킬알킬(예: 사이클로헥실메틸, 아다만틸메틸), 사이클로알켄일(예: 사이클로프로펜일), 아릴(예: 페닐, 나프틸), 아릴알킬(예: 벤질, 페네틸), 헤테로아릴(예: 피리딜, 퓨릴), 헤테로아릴알킬(예: 피리딜메틸), 헤테로사이클릴(예: 피페리딜), 헤테로사이클릴알킬(예: 모폴릴메틸), 알콕시(예: 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 뷰톡시), 할로젠화 알콕시(예: OCF₃), 알켄일옥시(예: 바이닐옥시, 알릴옥시), 아릴옥시(예: 페닐옥시), 알킬옥시카보닐(예: 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, tert-뷰톡시카보닐), 아릴알킬옥시(예: 벤질옥시), 아미노[알킬아미노(예: 메틸아미노, 에틸아미노, 다이메틸아미노), 아실아미노(예: 아세틸아미노, 벤조일아미노), 아릴알킬아미노(예: 벤질아미노, 트라이틸아미노), 하이드록시아미노], 알킬아미노알킬(예: 다이에틸아미노메틸), 설파모일, 옥소 등을 들 수 있다.

(10) SMAD2/3 단백질 인산화 저해제

SMAD2/3 단백질의 인산화 저해란, TGF-β 자극에 의해 촉진되는 SMAD2 및/또는 SMAD3의 인산화가 저해(제어)되는 것을 의미한다.

SMAD2/3은, TGF-βI형 리셉터에 의해 인산화를 받는 R-SMAD(receptor regulated SMAD)의 1종이며, TGF-β에 의한 자극 후, 인산화(활성화)된 SMAD2 및 SMAD3은, Co-SMAD(common partner SMAD)인 SMAD4와 함께 핵 내로 이행한다. 실시예 4에 나타내는 바와 같이, 본 발명자들은, NEK6 단백질이, 세포 내에서 SMAD2/3 단백질과 상호작용하여, SMAD2/3 단백질의 인산화를 촉진함을 발견했다. 인산화된 SMAD2/3 단백질은 SMAD 단백질 복합체 형성하고, 핵 내로 이행하여, α-SMA, α2-콜라겐, 인터페론 β, 인터류킨 5, VEGF 등의 전사를 항진한다.

따라서, 본 발명의 SMAD2/3 단백질 인산화 저해제에 의해 SMAD 시그널계를 저해함으로써, α-SMA, α2-콜라겐, 인터페론 β 등의 전사 제어가 가능해지고, 나아가서는 창상 치유 과정에 있어서의, 섬유아세포, 간성 세포 등의 근섬유아세포로의 분화 억제, 섬유아세포등에 의한 매트릭스 합성의 제어, 염증·면역 반응의 조절 등에 유용하다는 것을 이해할 수 있다.

(11) 섬유증 치료제

본 발명의 섬유증 치료제는, 간섬유증, 간경변, 바이러스성 간염, 자기면역성 간염, 원발성 담즙성 간염, 비알코올성 지방간염, 알코올성 간질환, 원발성 경화성 담관염, 헤모크로마토시스, 윌슨병, α1-안티트립신 결손증, 비바이러스성 울혈성 간경변, 약제성 간장애, 췌염, 췌섬유증, 망막 섬유증, 성대 반흔화, 성대 점막 섬유증, 후두 섬유증, 폐섬유증, 간질성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 비특이성 간질성 폐렴, 특발성 기질화 폐렴, 박리성 간질성 폐렴, 호흡세기관지염 관련 간질성 폐렴, 급성 간질성 폐렴, 림프구성 간질성 폐렴, 사르코이도시스, 만성 호산구성 폐렴, 급성 호산구성 폐렴, 림프 맥관 근종증, 폐포 단백증, 헤르만스키-푸들라크 증후군, 폐 랑게르한스 세포 조직구증, 철폐증, 아밀로이도시스, 폐포 미석증, 과민성 폐렴, 진폐, 감염성 폐질환, 약제성 폐렴, 방사선 폐렴, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 신섬유증, 만성 신부전, 당뇨병성 신부전, 만성 사구체 신염, 악성 신경화증, 다발성 낭포신, 약제성 신장애, 후복막 섬유증, 교원병, 강피증, 선천성 각화 부전증, 신성 전신성 섬유증 외에, 기도의 섬유화, 장관의 섬유화, 방광의 섬유화, 전립선의 섬유화, 피부의 섬유화를 포함하는 넓은 섬유화에 관한 질환에 대한 치료제이다. 바람직하게는, 간섬유증, 간경변, 폐섬유증, 간질성 폐렴, 신섬유증, 만성 신부전이다.

본 발명의 섬유증 치료제의 투여 방법은, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 흡입, 정주, 경피 투여 등의 비경구 투여인 것이 바람직하다. 본 발명의 치료 방법에 있어서의 본 발명의 핵산 분자의 투여량은, 상기 질환의 치료상 유효한 양이면 특별히 제한되지 않고, 질환의 종류, 중증도, 령(齡), 체중, 투여 경로 등에 따라서 상이하지만, 통상, 성인 1회당 약 0.0001∼약 100mg/kg체중, 예를 들어 약 0.001∼약 10mg/kg체중, 바람직하게는 약 0.005∼약 5mg/kg체중일 수 있다. 당해량을, 예를 들어, 1일 3회∼1개월에 1회, 바람직하게는 1일∼1주간에 1회의 간격으로 투여할 수 있다. 본 발명의 섬유증 치료제는, 통상, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적당한 의약 조성물로서 제제화되어 경구 또는 비경구의 형태로 투여된다.

이하, 실시예 등에 의해, 본 발명을 자세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다. 한편, 배양 조건은, 37℃, 5% CO₂하로 했다. 또한, 특별히 기재하지 않는 한, 인간 폐섬유아세포주 LL29 세포에 사용한 배지는, 10% FCS 함유 F-12K 배지(Gibco사)이며, 인간 초대 간성 세포(ScienCell사)에 사용한 배지는, 2% FCS, 1% Stellate cell growth supplement(SteCGS, ScienCell사) 함유 stellate cell 배지(ScienCell사)이다.

실시예

실시예 1: siRNA를 이용한 NEK6의 녹다운

IPF 환자의 폐로부터 수립된 인간 폐섬유아세포주 LL29 세포에, 인간 NEK6에 대한 siRNA(ON-TARGET plus SMART pool siRNA, Dharmacon사, 혹은 Stealth RNAi siRNA, Thermo Fisher Scientific사)를, Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen사)를 이용하여 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 24시간 후, 배지를 10% FCS 함유 F-12K 배지(Gibco사)로부터 0.1% BSA 함유 F-12K 배지로 교환했다. 트랜스펙션으로부터 72시간 후, siRNA를 트랜스펙션한 세포로부터, RNeasy Mini Kit(Qiagen사)를 이용하여 RNA를 추출했다. 얻어진 RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems사)를 이용하여 역전사를 행하여, cDNA를 얻었다. 얻어진 cDNA는 TaqMan GeneExpression Assays(Applied Biosystems사)를 이용하여 리얼타임 PCR을 행하여, NEK6의 녹다운에 의한 NEK6 유전자의 전사량에 대한 영향을 조사했다. NEK6 유전자의 전사량은, NEK6 Taqman Probe(HS00205221＿m1, Applied Biosystems사)에서의 측정치를, 18s Probe에서의 측정치로 나눔으로써 산출했다. 18s Probe는 하기의 커스텀 합성 18s MGB Probe, 커스텀 합성 18s Primer1, 커스텀 합성 18s Primer2를, 각각 0.2μM, 0.4μM, 0.4μM이 되도록 혼합하여, 리얼타임 PCR을 행했다.

커스텀 합성 18s MGB Probe(Applied Biosystems사):

5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC-3'(서열 번호 57)

커스텀 합성 18s Primer1(ThermoFisher사):

5'-CGGCTACCACATCCAAGGAAG-3'(서열 번호 58)

커스텀 합성 18s Primer2(ThermoFisher사):

5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3'(서열 번호 59)

siRNA의 서열은, ON-TARGET plus SMART pool siRNA(서열 번호 51∼54를 등량 혼합) 및 Stealth RNAi siRNA(서열 번호 55)를 사용했다.

＜ON-TARGET plus SMART pool siRNA＞

siNEK6: 5'-CUGUCCUCGGCCUAUCUUC-3'(서열 번호 51)

siNEK6: 5'-UAUUUGGGUGGUUCAGUUG-3'(서열 번호 52)

siNEK6: 5'-CAACUCCAGCACAAUGUUC-3'(서열 번호 53)

siNEK6: 5'-UACUUGAUCAUCUGCGAGA-3'(서열 번호 54)

＜Stealth RNAi siRNA＞

siNEK6: 5'-AAGUACUUCCAUACUGUCCUCUCC-3'(서열 번호 55)

도 6a에 NEK6에 대한 ON-TARGET plus SMART pool siRNA가 도입되었을 경우의 NEK6의 리얼타임 PCR의 결과를, 도 6b에 NEK6에 대한 Stealth RNAi siRNA가 도입되었을 경우의 NEK6의 리얼타임 PCR의 결과를 나타낸다. NEK6 siRNA의 도입은, NEK6 유전자의 전사량을 억제했다. 따라서, 이용된 NEK6 siRNA는, 효율적으로 표적 유전자의 발현을 억제했음이 나타났다.

실시예 2: NEK6의 녹다운에 의한 SMAD2/3 단백질 인산화에 대한 영향

NEK6 단백질이 TGF-β 시그널을 제어할 가능성을 검토하기 위해, NEK6 siRNA를 트랜스펙션한 세포에 있어서 인산화 SMAD2/3의 양을 해석했다.

IPF 환자의 폐로부터 수립된 인간 폐섬유아세포주 LL29 세포에, 인간 NEK6에 대한 ON-TARGET plus SMART pool siRNA(Dharmacon사) 또는 Stealth RNAi siRNA(Thermo Fisher Scientific사)를, Lipofectamine RNAi MAX를 이용하여 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 24시간 후, 배지를 10% FCS 함유 F-12K 배지로부터 0.1% BSA 함유 F-12K 배지로 교환했다. 트랜스펙션 48시간 후, 인간 TGF-β 단백질(Peprotech사)을 종(終)농도 5ng/mL가 되도록 첨가했다. TGF-β 첨가 2시간 후, 세포를 2×SDS sample buffer[100mM Tris-HCl pH6.8, 4% SDS, 6M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail(nacalai tesque사), 1% phosphatase inhibitor cocktail(nacalai tesque사)]로 용해하여, 세포 추출액으로 했다. 얻어진 세포 추출액에 β-Mercaptoethanol 및 Bromophenol blue를 각각 종농도 5%, 0.025%가 되도록 첨가한 후에, 95℃에서 4분 가열하여 샘플로 했다. 얻어진 샘플을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하여, 샘플에 포함되는 단백질을 크기에 의해 분리했다. 그 후, 분리한 단백질을 PVDF 멤브레인에 전사하고, 항인산화 SMAD3 항체(Cell Signaling Technology사), 항인산화 SMAD2 항체(Cell Signaling Technology사), 항SMAD2/3 항체(Cell Signaling Technology사), 항NEK6 항체(Santa Cruz Biotechnology사), 항β-Actin 항체(Sigma Aldrich사)에 의해 웨스턴 블로팅을 행했다.

도 7a에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3 단백질의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. NEK6의 siRNA를 이용함으로써, NEK6의 단백질의 양이 감소하고, TGF-β에 의해 상승하는 인산화 SMAD3의 양이 감소했다. 이 때, 총 SMAD3 단백질의 양은 변화하지 않았다. 또한, 도 7b에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD2 단백질의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. NEK6의 siRNA를 이용함으로써, NEK6의 단백질의 양이 감소하고, TGF-β에 의해 상승하는 인산화 SMAD2의 양이 감소했다. 이 때, 총 SMAD2 단백질의 양은 변화하지 않았다.

따라서, NEK6의 녹다운에 의해 SMAD2/3 단백질의 인산화가 억제됨이 나타났다.

실시예 3: NEK6 단백질과 SMAD3 단백질의 세포 내에 있어서의 상호작용

NEK6 단백질이 세포 내에서 SMAD3과 상호작용하여 SMAD3을 인산화하고 있는지를 검토하기 위해, 공면역 침강을 행했다.

IPF 환자의 폐로부터 수립된 인간 폐섬유아세포주 LL29 세포에, 인간 NEK6이 클로닝된 발현 벡터(pEZ-M02Nek6, GeneCopoeia사)와 FLAG 태그로 표지된 인간 SMAD3이 클로닝된 발현 벡터(pEZ-M11Flag-hSmad3, GeneCopoeia사)를, X-tremeGENE HP(Roche사)를 이용하여 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 24시간 후에 배지를 교환했다. 트랜스펙션 48시간 후, 용해 버퍼(175mM NaCl, 50mM HEPES pH7.6, 0.1% NP40, 0.2mM EDTA pH8.0, 1.4mM β-Mercaptoethanol, 1% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail)로 세포를 회수하고, 원심분리에 의해 상청을 얻었다. 상청에 TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads(Rockland사)를 첨가하고, 원심분리를 행하여, 비특이적인 결합을 제거했다. 그로부터 얻어진 상청에 컨트롤로서 normal goat IgG(Santa Cruz Biotechnology사), 혹은 항NEK6 항체를 가하고, 오버나이트 4℃에서 인큐베이트한 후에, TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads를 가하고 4시간, 4℃에서 인큐베이트했다. 원심분리를 행하여 상청을 제거한 후에, TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads를 용해 버퍼로 세정하여 비특이적인 결합을 제거했다. 2×SDS PAGE loading buffer(100mM Tris-HCl pH6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50mM DTT)를 TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads에 첨가하고 95℃에서 5분간 가열하고, 상청에 포함되는 공면역 침강물을 회수했다. 항NEK6 항체에 의한 공면역 침강물에 대해서 항SMAD3 항체(Cell Signaling Technology사), 항NEK6 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 행하여, NEK6 단백질과 SMAD3 단백질이 공침강되는지를 검출했다.

도 8a에, 항NEK6 항체에 의한 공면역 침강의 결과를 나타낸다. 공면역 침강물로부터, NEK6 단백질과 SMAD3 단백질이 검출되었다.

SMAD3 단백질이 NEK6과 세포 내에서 상호작용하여 인산화되고 있는지를 해석하기 위해, 인간 NEK6 발현 벡터와 FLAG 태그로 표지된 인간 SMAD3 발현 벡터를 LL29 세포에 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 24시간 후에 배지를 교환했다. 트랜스펙션 48시간 후, 용해 버퍼(250mM NaCl, 50mM HEPES pH7.6, 0.1% NP40, 0.2mM EDTA pH8.0, 1.4mM β-Mercaptoethanol, 1% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail)로 세포를 회수하고, 원심분리에 의해 상청을 얻었다. 얻어진 상청에 Anti-FLAG M2 Affinity Gel(Sigma-Aldrich사)을 첨가하고, 4℃에서 오버나이트로 인큐베이트했다. 그 후, 원심분리를 행하고, 상청을 제거했다. Anti-FLAG M2 Affinity Gel을 용해 버퍼로 세정하여 비특이적인 결합을 제거했다. 2×SDS PAGE loading buffer(100mM Tris-HCl pH6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.2% Bromophenol blue, 50mM DTT)를 Anti-FLAG M2 Affinity Gel에 첨가하고 95℃에서 4분간 가열하고, 상청에 포함되는 공면역 침강물을 회수했다. 얻어진 공면역 침강물을 SDS-PAGE에 의해 크기에 기초하여 분리한 후, PVDF 멤브레인에 전사하고, Anti-FLAG M2 Affinity Gel에 의한 공면역 침강물에 대해서는 항인산화 SMAD3 항체, 항FLAG 항체(Sigma-Aldrich사), 항NEK6 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 행하여, NEK6 단백질과 인산화 SMAD3 단백질이 공침강되는지를 검출했다.

도 8b에, 항FLAG 항체에 의한 공면역 침강의 결과를 나타낸다. 공면역 침강물로부터, NEK6 단백질과 FLAG-SMAD3 단백질이 검출되었다. 또한, 인간 NEK6의 발현 벡터의 트랜스펙션에 의해, 인산화 SMAD3 단백질의 양이 상승했다.

항NEK6 항체에 의한 공면역 침강물 중에 SMAD3 단백질이 검출된 것, 및 반대로 항FLAG 항체에 의한 공면역 침강물 중에 NEK6가 검출된 것으로부터, NEK6 단백질과 SMAD3 단백질이 세포 내에서 상호작용하여 복합체를 형성함이 나타났다. 더욱이, 인간 NEK6의 발현 벡터의 트랜스펙션에 의해 인산화 SMAD3 단백질의 양이 상승한 것으로부터, NEK6 단백질은 SMAD3 단백질을 세포 내에서 인산화함이 나타났다.

실시예 4: NEK6 단백질에 의한 SMAD3 단백질 인산화

NEK6 단백질이 SMAD3 단백질을 기질로서 직접 인산화하고 있을 가능성을, NEK6과 SMAD3의 정제 단백질을 이용하여 검토했다.

His 융합 NEK6 단백질(eurofins사)과 GST 융합 SMAD3 단백질(Sigma-Aldrich사)을 반응 용매(150μMATP, 50mM HEPES, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 1% phosphatase inhibitor cocktail)와 혼합하고, 30℃에서 45분간 인큐베이트했다. 5% β-Mercaptoethanol 및 0.025% Bromophenol blue를 포함하는 2×SDS sample buffer를, 반응액에 등량 첨가하여 반응을 정지시킨 후에, 95℃에서 5분 가열하여, 샘플로 했다. 얻어진 샘플을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하여, 반응액에 포함되는 단백질을 크기에 의해 분리했다. 그 후, 분리한 단백질을 PVDF 멤브레인에 전사하고, 항인산화 SMAD3 항체 및 항GST 항체(Santa Cruz Biotechnology사), 항NEK6 항체에 의해 웨스턴 블로팅을 행했다.

도 9에 His 융합 NEK6 단백질과 GST 융합 SMAD3 단백질을 반응시켰을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3 단백질의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. NEK6 단백질을 이용함으로써, 인산화 SMAD3의 양이 상승했다. 따라서, NEK6 단백질은 SMAD3 단백질을 기질로서 직접 인산화함이 나타났다.

실시예 5: NEK6의 녹다운에 의한 SMAD 단백질 복합체의 전사 활성에 대한 영향

NEK6 단백질이, SMAD 단백질 복합체의 핵내 이행 후에 일어나는 전사 활성도 제어하고 있는지를 검토하기 위해, SMAD 단백질 복합체의 DNA 결합 서열과 루시페라제 유전자를 이용한 루시페라제 리포터 어세이를 실시했다. 또한, 동시에 조제한 LL29 세포를 이용하여 웨스턴 블로팅을 실시하여, NEK6의 녹다운에 대해 확인했다.

IPF 환자의 폐로부터 수립된 인간 폐섬유아세포주 LL29 세포에, 인간 NEK6에 대한 siRNA인 ON-TARGET plus SMART pool siRNA(Dharmacon사)를 Lipofectamine RNAi MAX를 이용하여 트랜스펙션했다. siRNA의 트랜스펙션 24시간 후, 배지를 10% FCS 함유 F-12K 배지로부터 0.4% FCS 함유 F-12K 배지로 교환했다. siRNA의 트랜스펙션 48시간 후, SMAD 단백질 복합체의 DNA 결합 서열[SMAD biding element(SBE)]과 반딧불 루시페라제 유전자가 클로닝된 발현 벡터(pTL-SBE-luc: 5'-AGTATGTCTAGACTGAAGTATGTCTAGACTGAAGTATGTCTAGACTGA-3'(서열 번호 60), Panomics사)와 야생형 바다팬지(Renilla) 루시페라제를 포함하는 리포터 어세이 보정용의 벡터(pRL-TK: Promega사)를, Lipofectamine LTX with PLUS reagent(Thermo Fisher Scientific사)를 이용하여 트랜스펙션했다. 발현 벡터의 트랜스펙션 2시간 후, 인간 TGF-β 단백질을 종농도 10ng/mL가 되도록 첨가했다. TGF-β 첨가 24시간 후에 있어서, 세포를 2×SDS sample buffer(100mM Tris-HCl pH6.8, 4% SDS, 6M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail)로 용해했다. 얻어진 세포 추출액에 포함되는 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리 후, 단백질을 PVDF 멤브레인에 전사하고, 항SMAD3 항체, 항NEK6 항체, 항Vinculin 항체에 의해 웨스턴 블로팅을 행했다. 또한, 상기와 마찬가지로 조제한 LL29 세포를 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega사)에 준하여 회수하고, 반딧불 루시페라제와 바다팬지 루시페라제에 의한 발광을 측정했다. 반딧불 루시페라제의 발광량을 바다팬지 루시페라제에 의한 발광량으로 보정했다.

도 10a에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. NEK6의 siRNA를 이용함으로써, NEK6의 단백질의 양이 감소하고 있음이 나타났지만, SMAD3 단백질의 양은 변화하지 않았다. 도 10b에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의, 바다팬지 루시페라제로 보정한 반딧불 루시페라제의 발광량을 나타낸다. NEK6의 siRNA를 이용함으로써, TGF-β에 의해 상승하는 반딧불 루시페라제의 발광량이 감소했다. 따라서, NEK6의 녹다운에 의해 SMAD 단백질 복합체의 전사 활성이 억제됨이 나타났다.

실시예 6: NEK6의 녹다운에 의한 섬유증 관련 유전자의 전사량에 대한 영향

NEK6의 녹다운이 섬유증에 대해서 치료적 효과를 나타내는 것을 검토하기 위해, NEK6 siRNA를 트랜스펙션한 세포에 있어서의 섬유증 관련 유전자의 전사량을 해석했다.

IPF 환자의 폐로부터 수립된 인간 폐섬유아세포주 LL29 세포에 인간 NEK6에 대한 siRNA(ON-TARGET plus SMART pool siRNA, Dharmacon사)를 Lipofectamine RNAi MAX를 이용하여 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 24시간 후, 배지를 10% FCS 함유 F-12K 배지로부터 0.1% BSA 함유 F-12K 배지로 교환했다. 트랜스펙션 48시간 후, 인간 TGF-β 단백질을 종농도 1ng/mL가 되도록 첨가했다. 트랜스펙션 72시간 후, siRNA를 트랜스펙션한 세포로부터, RNeasy Mini Kit를 이용하여 RNA를 추출했다. 얻어진 RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit를 이용하여 역전사를 행하여, cDNA를 얻었다. 얻어진 cDNA는 TaqMan GeneExpression Assays를 이용하여 리얼타임 PCR을 행하여, NEK6의 녹다운에 의한 유전자의 전사량에 대한 영향을 검출했다. Col1a1 유전자와 αSMA 유전자의 전사량은, Col1a1 Taqman Probe(HS00164004＿m1, Applied Biosystems사)에서의 측정치, 또는αSMA Taqman Probe(HS00426835＿g1, Applied Biosystems사)에서의 측정치를, 18s Probe에서의 측정치로 나눔으로써 산출했다.

도 11a에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 Col1a1의 전사량, 도 11b에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 αSMA 유전자의 전사량을 나타낸다. NEK6의 siRNA를 이용함으로써, TGF-β에 의해 상승하는 Col1a1, αSMA, 유전자의 전사량이 감소했다. 따라서, NEK6의 녹다운은 섬유증에 대해서 치료적 효과를 나타냄이 나타났다.

실시예 7: 1본쇄 핵산 분자의 합성

이하에 나타내는 핵산 분자를, 포스포로아미다이트법에 기초하여, 핵산 합성기(상품명 ABI3900 DNA Synthesizer, Applied Biosystems)에 의해 합성했다. 고상 담체로서 CPG(Controlled Pore Glass)를 이용하여, RNA 아미다이트로서, EMM 아미다이트(국제 공개 제 2013/027843호)를 이용한 고상 합성을 행했다. 고상 담체로부터의 절출 및 인산기 보호기의 탈보호, 염기 보호기의 탈보호, 2'-수산기 보호기의 탈보호는, 정해진 방법에 따랐다. 합성한 1본쇄 핵산 분자는, HPLC에 의해 정제했다.

본 발명의 하기 1본쇄 핵산 분자에 있어서, Lx는, 링커 영역 Lx이며, 하기 구조식의 L-프롤린다이아마이드아미다이트를 나타낸다.

[화학식 6]

또한, 하기 1본쇄 핵산 분자 중의 하선부는, NEK6의 유전자 발현 억제 서열이다.

KB-001

5'-GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC-Lx-GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA-3'(서열 번호 31)

KB-002

5'-CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC-Lx-GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC-3'(서열 번호 32)

KB-003

5'-CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC-Lx-GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC-3'(서열 번호 33)

KB-004

5'-GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC-Lx-GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC-3'(서열 번호 34)

KB-005

5'-CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC-Lx-GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU-3'(서열 번호 35)

실시예 8: ssPN 분자(1본쇄 핵산 분자)의 in vitro 평가

NEK6에 대해서 설계한 ssPN 분자(1본쇄 핵산 분자)의 in vitro에서의 평가를 실시했다. 각 항목의 측정 방법은, 전술한 ON-TARGET plus SMART pool siRNA와 Stealth RNAi siRNA로 행한 방법(실시예 1, 2및 6)에 따랐다. KB-001∼005의 ssPN 핵산은 모두 NEK6의 전사량을 억제하여, 표적 유전자를 효율적으로 녹다운했다. 더욱이, KB-001∼005의 ssPN 핵산을 작용시키는 것에 의해, 인산화 SMAD3의 단백질량의 감소가 확인되었다.

또한, KB-001과 KB-003에 대해 섬유화 관련 유전자(Col1a1 및 αSMA)의 전사량에 미치는 영향을 조사한 결과를 도 12에 나타낸다. 도 12a에 KB-001 또는 KB-003을 작용시켰을 경우에 있어서의 Col1a1 유전자의 전사량을, 도 12b에 KB-001 또는 KB-003을 작용시켰을 경우에 있어서의 αSMA 유전자의 전사량을 나타낸다. KB-001 및 KB-003의 어느 ssPN 분자도 섬유화 관련 유전자의 전사량을 억제하고 있음을 확인했다. 이들 결과로부터, NEK6에 대해서 설계한 ssPN 분자(1본쇄 핵산 분자)의 섬유화 억제 작용을 확인할 수 있었다.

실시예 9: NEK6의 in vivo 녹다운에 의한 항섬유화 작용의 검증

NEK6의 녹다운이 섬유증에 대해서 치료적 효과를 나타내는 것을 확인하기 위해, 블레오마이신 폐섬유화 모델 마우스에게, NEK6 siRNA를 투여하고 항섬유화 작용을 해석한다.

7주령의 Crl:CD1 (ICR) 마우스(닛폰 찰스·리버사)에게, 0.4mg/kg체중의 용량으로 블레오마이신(닛폰 화약 주식회사)을 투여하여, 폐섬유화 모델 마우스를 제작한다. NEK6 siRNA는, 2일∼7일에 1회의 빈도로, 50mg/kg체중을 최대 용량으로 하여 투여한다. NEK6 siRNA의 투여 기간 중은, 1주간에 1회의 빈도로 실험동물용 마이크로 CT에서의 화상 진단을 행한다. NEK6 siRNA의 초회 투여로부터 14∼30일째에 해부하고, 폐를 적출한다. 적출한 폐를 이용한 섬유증 관련 유전자의 전사량, 섬유증 관련 단백질의 발현량의 측정, 병리학적 해석 등을 행한다. 이들에 의해, NEK6 siRNA 미투여군에 비해, NEK6 siRNA 투여군에서 섬유화가 억제되고 있음을 확인할 수 있어, NEK6 siRNA의 폐섬유화 모델 마우스에서의 항섬유화 작용을 나타낼 수 있다.

실시예 10: 간성 세포에 있어서의 NEK6 siRNA의 SMAD3 단백질 인산화에 대한 영향

간성 세포에 있어서 NEK6 단백질이 TGF-β 시그널을 제어할 가능성을 검토하기 위해, NEK6 siRNA를 트랜스펙션한 세포에 있어서 인산화 SMAD3의 양을 해석했다.

인간의 간장으로부터 단리된 인간 초대 간성 세포(ScienCell사)를 폴리-L-리신(PLL) 코팅 세포 배양 디시 상에서 5일간 배양했다. 그 후, 인간 NEK6에 대한 siRNA(KB-004)를 Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen사)를 이용하여 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 48시간 후, 배지를 2% FCS, 1% Stellate cell growth supplement(SteCGS, ScienCell사) 함유 stellate cell 배지(ScienCell사)로부터 0.2% FCS, 1% SteCGS 함유 stellate cell 배지로 교환했다. 트랜스펙션 72시간 후, 리포다당(LPS, Sigma Aldrich사)을 종농도 100ng/ml가 되도록 배지에 첨가했다. LPS 첨가 11시간 반 후, 인간 TGF-β 단백질(Peprotech사)을 종농도 5ng/ml가 되도록 첨가했다. TGF-β 첨가 30분 후, 세포를 2×SDS sample buffer[100mM Tris-HCl pH6.8, 4% SDS, 6M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail(nacalai tesque사), 1% phosphatase inhibitor cocktail(nacalai tesque사)]로 용해하여, 세포 추출액으로 했다.

얻어진 세포 추출액에 β-Mercaptoethanol 및 Bromophenol blue를 각각 종농도 5%, 0.025%가 되도록 첨가한 후에, 95℃에서 4분 가열하여 샘플로 했다. 얻어진 샘플을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하여, 샘플에 포함되는 단백질을 크기에 의해 분리했다. 그 후, 분리한 단백질을 PVDF 멤브레인에 전사하고, 항인산화 SMAD3 항체(Cell Signaling Technology사) 및 항SMAD3 항체(Cell Signaling Technology사), 항인산화 SMAD2 항체(Cell Signaling Technology사) 및 항SMAD2 항체(Cell Signaling Technology사), 항NEK6 항체(Santa Cruz Biotechnology사), 항Vinculin 항체(Sigma Aldrich사)에 의해 웨스턴 블로팅을 행했다.

도 13에 NEK6 siRNA를 트랜스펙션했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3 단백질과 인산화 SMAD2 단백질의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸다. NEK6 siRNA에 의해 NEK6의 단백질의 양이 감소하고, TGF-β에 의해 상승하는 인산화 SMAD3과 인산화 SMAD2의 양이 감소했다. 따라서, NEK6의 녹다운에 의해 SMAD3 단백질과 SMAD2 단백질의 인산화가 억제됨이 나타났다.

실시예 11: 간성 세포에 있어서의 NEK6 siRNA SMAD3 인산화 억제 작용

NEK6 siRNA도 TGF-β 시그널을 제어할 가능성을 검토하기 위해, 각 NEK6 siRNA를 트랜스펙션한 세포에 있어서 인산화 SMAD3의 양을 해석했다.

인간의 간장으로부터 단리된 인간 초대 간성 세포를 PLL 코팅 세포 배양 디시 상에서 5일간 배양했다. 그 후, 인간 NEK6에 대한 각종 siRNA(KB-006, KB-004, KB-011, KB-005, KB-010을 Lipofectamine RNAi MAX를 이용하여 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 48시간 후, 배지를 2% FCS, 1% SteCGS 함유 stellate cell 배지로부터 0.2% FCS, 1% SteCGS 함유 stellate cell 배지로 교환했다. 트랜스펙션 72시간 후, LPS를 종농도 100ng/ml가 되도록 배지에 첨가했다. LPS 첨가 11시간 반 후, 인간 TGF-β 단백질을 종농도 5ng/ml가 되도록 첨가했다. TGF-β 첨가 30 분후, 세포를 2×SDS sample buffer(100mM Tris-HCl pH6.8, 4% SDS, 6M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail)로 용해하여, 세포 추출액으로 했다. 얻어진 세포 추출액에 β-Mercaptoethanol 및 Bromophenol blue를 각각 종농도 5%, 0.025%가 되도록 첨가한 후에, 95℃에서 4분 가열하여 샘플로 했다. 얻어진 샘플을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하여, 샘플에 포함되는 단백질을 크기에 의해 분리했다. 그 후, 분리한 단백질을 PVDF 멤브레인에 전사하고, 항인산화 SMAD3 항체 및 항SMAD3 항체, 항NEK6 항체, 항Vinculin에 의해 웨스턴 블로팅을 행했다.

도 14에 각종 NEK6 siRNA에 의해 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3의 단백질의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸다. 각종 NEK6의 siRNA의 도입에 의해, NEK6의 단백질의 양이 감소하고, TGF-β에 의해 상승하는 인산화 SMAD3의 양이 감소했다. 따라서, NEK6의 녹다운에 의해 SMAD3 단백질의 인산화가 억제됨이 복수의 NEK6 siRNA 서열을 이용함으로써 나타났다.

실시예 12: 간성 세포에 있어서의 NEK6 siRNA의 섬유증 관련 유전자에 대한 영향

NEK6의 녹다운이 섬유증에 대해서 유효성을 나타내는 것을 검토하기 위해, NEK6 siRNA를 트랜스펙션한 세포에 있어서의 섬유증 관련 유전자의 전사량을 해석했다.

인간의 간장으로부터 단리된 인간 초대 간성 세포를 PLL 코팅 세포 배양 디시 상에서 5일간 배양했다. 그 후, 인간 NEK6에 대한 siRNA(KB-004)를 Lipofectamine RNAi MAX를 이용하여 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 48시간 후, 배지를 2% FCS, 1% Stellate cell growth supplement 함유 stellate cell 배지로부터 0.2% FCS, 1% SteCGS 함유 stellate cell 배지로 교환했다. 트랜스펙션 72시간 후, LPS를 종농도 100ng/ml가 되도록 배지에 첨가했다. LPS 첨가 11시간 반 후, 인간 TGF-β 단백질을 종농도 5ng/ml가 되도록 첨가했다. TGF-β 첨가 24시간 후, KB-004를 트랜스펙션한 세포로부터, RNeasy Mini Kit를 이용하여 RNA를 추출했다. 얻어진 RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit를 이용하여 역전사를 행하여, cDNA를 얻었다. 얻어진 cDNA는 TaqMan GeneExpression Assays를 이용하여 리얼타임 PCR을 행하여, NEK6의 녹다운에 의한 유전자의 전사량에 대한 영향을 검출했다. NEK6 유전자, Fibronectin 유전자와 αSMA 유전자의 전사량은, NEK6 Taqman Probe(HS00205221＿m1, Applid Biosystems사)에서의 측정치, Fibronectin Taqman Probe(HS01549976＿m1, Applid Biosystems사)에서의 측정치, 또는 αSMA Taqman Probe(HS00426835＿g1, Applid Biosystems사)에서의 측정치를, 18s Probe에서의 측정치로 나눔으로써 산출했다.

도 15a에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 NEK6의 전사량, 도 15b에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 Fibronectin의 전사량, 도 15c에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 αSMA 유전자의 전사량을 나타낸다. NEK6 siRNA에 의해, TGF-β에 의해 상승하는 Fibronectin, αSMA 유전자의 전사량이 감소했다. 따라서, NEK6의 녹다운은 섬유화를 억제함이 나타났다.

실시예 13: 신장 섬유아세포에 있어서의 NEK6 siRNA의 SMAD3 단백질 인산화에 대한 영향

NEK6 단백질이 TGF-β 시그널을 제어할 가능성을 검토하기 위해, NEK6 siRNA를 트랜스펙션한 세포에 있어서 인산화 SMAD3의 양을 해석했다.

래트 신장 섬유아세포주 NRK-49F 세포에, 인간 NEK6에 대한 siRNA(KB-004)를 Lipofectamine RNAi MAX를 이용하여 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 24시간 후, 배지를 10% FCS 함유 DMEM 배지로부터 0.1% FCS 함유 DMEM 배지로 교환했다. 트랜스펙션 48시간 후, 인간 TGF-β 단백질을 종농도 5ng/ml가 되도록 첨가했다. 첨가 후 30분 혹은 1시간 후, 세포를 2×SDS sample buffer(100mM Tris-HCl pH6.8, 4% SDS, 6M Urea, 12% Glycerol, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail)로 용해하여 세포 추출액으로 했다. 얻어진 세포 추출액에 β-Mercaptoethanol 및 Bromophenol blue를 각각 종농도 5%, 0.025%가 되도록 첨가한 후에, 95℃에서 4분 가열하여 샘플로 했다. 얻어진 샘플을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하여, 샘플에 포함되는 단백질을 크기에 의해 분리했다. 그 후, 분리한 단백질을 PVDF 멤브레인에 전사하고, 항인산화 SMAD3 항체 및 항SMAD3 항체, 항NEK6 항체(abcam사), 항Vinculin 항체에 의해 웨스턴 블로팅을 행했다.

도 16에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3 단백질의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸다. NEK6의 siRNA를 이용함으로써, NEK6의 단백질의 양이 감소하고, TGF-β에 의해 상승하는 인산화 SMAD3의 양이 감소했다. 따라서, NEK6의 녹다운에 의해 SMAD3 단백질의 인산화가 억제됨이 나타났다.

실시예 14: 사염화탄소(CCl₄) 유발 간 섬유화 모델에 있어서의 NEK6 siRNA의 유효성 평가

NEK6의 녹다운이 섬유증에 대해서 유효성을 나타냄을 확인하기 위해, CCl₄ 모델 마우스에게, NEK6 siRNA를 정맥내 투여하여 항섬유화 작용을 해석했다.

7주령 수컷 C57BL/6J 마우스(닛폰 찰스·리버 주식회사)에게, 10v/v％ CCl₄ 함유 올리브유 용액(후지 필름 와코 준야쿠 주식회사)을, 10mL/kg체중으로 0, 4, 7, 11일째에 복강내 투여하여, 간 섬유화 모델 마우스를 제작했다. CCl₄의 초회 투여 전날의 체중으로 군나누기를 실시하고, 군 설정은, CCl₄ 미투여의 생리 식염수 투여군(n=5), CCl₄ 투여의 용매 투여군(n=10), CCl₄ 투여의 핵산 투여군(n=10)으로 했다. NEK6 siRNA로서 KB-004를, 투여 용매로서 invivofectamine 3.0 Reagent(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여, invivofectamine 3.0의 제품 프로토콜에 따라, 0.3mg/mL의 핵산 투여액을 제작했다. 핵산 투여군에는 KB-004를 포함하는 핵산 투여액을 3mg/kg체중이 되도록 꼬리 정맥 투여하고, 용매 투여군에는 핵산 투여군과 등량의 투여 용매를, CCl₄의 초회 투여 전날 및 병태 유발 10일째에 꼬리 정맥 투여했다. 간 장애 및 섬유화의 평가는 병태 유발 13일째에서 실시했다(실시예 15, 16, 17 및 19).

실시예 15: CCl₄ 모델에서의 간 장애 마커의 해석

섬유화란, 세포나 조직의 장애에 대한 과잉한 창상 치유 과정이라고 이해되고 있다. 그 때문에, 섬유화와 함께 세포나 조직의 장애를 억제하는 것은, 각종 섬유증의 치료에 유효하다고 생각되고 있다. 그래서, NEK6의 녹다운이 간 장애에 대해서 효과를 나타내는지를 검토하기 위해, CCl₄ 모델에 있어서의 간 장애 마커의 측정을 행했다.

병태 유발 13일째에 꼬리 정맥으로부터 플레인의 캐필러리 채혈관을 이용하여 채혈하고, 30분 이상 정치했다. 정치 후의 혈액을 원심분리하여, 혈청을 얻었다. 트랜스아미나제 CII-테스트 와코(와코 준야쿠 공업 주식회사)를 이용하여 혈청중 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제(GPT) 및 글루탐산 옥살로아세트산 트랜스아미나제(GOT)를 측정했다. 측정 방법은 시약의 설명서에 따랐다.

도 17a에 혈청중 GPT의 측정 결과, 도 17b에 혈청중 GOT의 측정 결과를 나타냈다. NEK6 siRNA를 투여함으로써, CCl₄ 모델에서 인지된 혈청중 GPT 및 GOT의 상승이 억제되었다. 따라서, NEK6의 녹다운은 간 장애를 억제함이 나타났다.

실시예 16: CCl₄ 모델에서의 SMAD3 단백질 인산화의 해석

NEK6의 녹다운이 SMAD3 단백질의 인산화에 대해서 효과를 나타내는지를 검토하기 위해, CCl₄ 모델에 있어서의 인산화 SMAD3의 양을 해석했다.

병태 유발 13일째에 채취한 간장을 동결 후에 분쇄하여 분상으로 했다. 분말상의 간장에 용해 버퍼(150mM NaCl, 1% NP40, 0.1% SDS, 50mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 1mM Benzyl sulfonyl fluoride, 2% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail)를 가하고, 핸디 초음파 발생기를 이용하여 장기 추출액을 조제했다. 장기 추출액을 원심분리하여 얻어진 상청에 β-Mercaptoethanol 및 Bromophenol blue를 각각 종농도 5%, 0.025%가 되도록 첨가했다. 그 후, 95℃에서 4분 가열하여 샘플로 했다. 얻어진 샘플을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하여, 샘플에 포함되는 단백질을 크기에 의해 분리했다. 그 후, 분리한 단백질을 PVDF 멤브레인에 전사하고, 항인산화 SMAD3 항체(abcam사) 및 항SMAD3 항체, 항NEK6 항체(abcam사), 항Vinculin 항체에 의해 웨스턴 블로팅을 행했다. 인산화 SMAD3은 토탈 SMAD3량에 의해 보정했다.

도 18에 NEK6을 녹다운했을 경우에 있어서의 인산화 SMAD3 단백질의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸다. NEK6의 siRNA를 이용함으로써, NEK6의 단백질의 양이 감소하고, TGF-β에 의해 상승하는 인산화 SMAD3의 양이 감소했다. 따라서, NEK6의 녹다운은 CCl₄ 모델의 간장에 있어서 SMAD3 단백질의 인산화를 억제함이 나타났다.

실시예 17: CCl₄ 모델에서의 섬유증 관련 유전자의 해석

NEK6의 녹다운이 섬유화에 대해서 유효성을 나타내는지를 검토하기 위해, CCl₄ 모델에 있어서의 섬유증 관련 유전자의 전사량을 해석했다.

병태 유발 13일째에 채취한 간장으로부터 QIAzol Lysis reagent(QIAGEN사)를 이용하여 RNA를 추출했다. 계속하여, RNeasy mini kit를 이용하여 RNA를 정제하고, High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit를 이용하여 역전사 반응을 행했다. TaqMan GeneExpression Assay를 이용하여 NEK6 Taqman Probe(Mm00480730＿m1, Applied Biosystems사), 및 섬유증 관련 유전자로서 Col1a1 Taqman Probe(Mm00801666＿g1, Applied Biosystems사), Col3a1 Taqman Probe(Mm01254476＿m1, Applied Biosystems사), Timp1 Taqman Probe(Mm01341361＿m1, Applied Biosystems사)의 전사량을 측정하고, 내부 표준인 18s rRNA Taqman Probe(Hs99999901＿s1, Applied Biosystems사)의 전사량과의 상대비를 각 유전자의 전사량으로 했다.

CCl₄ 모델에 있어서의 각 유전자의 전사량을 도 19a∼d에 나타낸다. NEK6 siRNA의 투여에 의해, NEK6 유전자의 전사량이 저하되었다. 이것으로부터, 이용된 KB-004는, 효율적으로 표적 유전자의 전사를 억제했음이 나타났다. 이 때, 병태 유발에 의해 유도되는 섬유증 관련 유전자(Col1a1, Col3a1, Timp1)의 전사량은 유의하게 저하되었다. 따라서, NEK6의 녹다운은 섬유화를 억제함이 나타났다.

실시예 18: 담관 결찰 유발 간 섬유화(BDL) 모델에서의 섬유증 관련 유전자의 해석

NEK6의 녹다운이 섬유증에 대해서 유효성을 나타내는 것을 검토하기 위해, 담관 결찰 유발 간 섬유화 모델 마우스(BDL 모델)에게 NEK6 siRNA를 정맥내 투여하고 섬유증 관련 유전자의 전사량을 해석했다.

9주령의 C57BL/6J 마우스(닛폰 찰스·리버사)를 체중으로 군나누기하고, 유전자 도입 시약 invivofectamin 3.0(Thermo Fisher Scientific사)의 첨부 문서에 따라 조제한 KB-004 용액(0.3mg/mL)을 3mg/kg체중의 용량으로 꼬리 정맥내 투여했다(n=12). 대조군에는, 용매만을 투여했다(n=15). 투여 다음날, 총담관을 2개소 결찰하여, 간 섬유화 모델 마우스를 제작했다. 위(僞)수술군은, 생리 식염수(오쓰카 생식주)를 꼬리 정맥내 투여하고, 총담관의 박리만 행했다(n=7). 담관 결찰 14일째에 간장을 채취하고, 상기와 마찬가지로 하여 NEK6 Taqman Probe(Mm00480730＿m1, Applied Biosystems사), 및 섬유증 관련 유전자로서 Col1a1 Taqman Probe(Mm00801666＿g1, Applied Biosystems사), Col3a1 Taqman Probe(Mm01254476＿m1, Applied Biosystems사), Timp1 Taqman Probe(Mm01341361＿m1, Applied Biosystems사)의 전사량을 측정하고, 내부 표준인 GAPDH Taqman Probe(Mm9999995＿g1, Applied Biosystems사)의 전사량과의 상대비를 각 유전자의 전사량으로 했다.

BDL 모델에 있어서의 각 유전자 전사량을 도 20에 a∼d에 나타낸다. NEK6 siRNA의 투여에 의해, NEK6 유전자의 전사량이 저하되었다. 이것으로부터, 이용된 KB-004는, 효율적으로 표적 유전자의 전사를 억제했음이 나타났다. 이 때, 병태 유발에 의해 유도되는 섬유증 관련 유전자(Col1a1, Col3a1, Timp1)의 전사량은 유의하게 저하되었다. 따라서, NEK6의 녹다운은 섬유화를 억제함이 나타났다.

실시예 19: CCl₄ 모델에서의 병리 해석

NEK6의 녹다운이 CCl₄ 유발 간 섬유화 모델에 대해서 효과를 나타내는지를 검토하기 위해, 병리상의 관찰을 행했다.

병태 유발 13일째에 간장의 내측우엽을 채취하고, 10% 중성 완충 폼알린액을 이용하여 고정했다. 파라핀으로 포매한 후에, 조직 절편을 제작하고, 헤마톡실린·에오딘 염색을 행했다.

도 21에 병리상의 대표예를 나타냈다. 도 21a는 CCl₄ 미투여의 생리 식염수 투여군의 결과, 도 21b는 CCl₄ 투여의 용매 투여군의 결과, 도 21c는 CCl₄ 투여의 핵산 투여군의 결과를 나타낸다. 도 21b 중에 많이 인지되는 공포(空胞) 변성은 세포의 장애를 나타내고, 중앙부 부근에 많이 존재하는 핵이 염색되어 있지 않은 부분은 세포의 괴사를 나타낸다. NEK6 siRNA를 투여함으로써, CCl₄ 모델의 간장 조직에서 인지된 세포의 장애나 괴사가 감소했다. 따라서, NEK6의 녹다운은 CCl₄ 유발 간 섬유화 모델에 있어서의 병리상의 변화를 억제함이 나타났다.

SEQUENCE LISTING <110> Kyorin pharmaceutical co.,ltd <120> THERAPEUTIC AGENT FOR FIBROSIS <130> FP18-0822-00 <150> JP 2017/146957 <151> 2017-07-28 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic RNA <400> 1 agagguuguu ggaac 15 <210> 2 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic RNA <400> 2 ccuugacaca guccu 15 <210> 3 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic RNA <400> 3 cgugaaugca ugugc 15 <210> 4 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic RNA <400> 4 ggagaagaga uucau 15 <210> 5 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic RNA <400> 5 guauccgaug ucagg 15 <210> 6 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic RNA <400> 6 guuccaacaa ccucu 15 <210> 7 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic RNA <400> 7 aggacugugu caagg 15 <210> 8 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic RNA <400> 8 gcacaugcau ucacg 15 <210> 9 <211> 15 <212> RNA <213> 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acagccacgg gcgtcgtgaa gctcggtgac cttggtctgg gccgcttctt cagctctgag 600 accaccgcag cccactccct agtggggacg ccctactaca tgtcaccgga gaggatccat 660 gagaacggct acaacttcaa gtccgacatc tggtccctgg gctgtctgct gtacgagatg 720 gcagccctcc agagcccctt ctatggagat aagatgaatc tcttctccct gtgccagaag 780 atcgagcagt gtgactaccc cccactcccc ggggagcact actccgagaa gttacgagaa 840 ctggtcagca tgtgcatctg ccctgacccc caccagagac ctgacatcgg atacgtgcac 900 caggtggcca agcagatgca catctggatg tccagcacct ga 942 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 57 attggagggc aagtctggtg ccagc 25 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 58 cggctaccac atccaaggaa g 21 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 59 gctggaatta ccgcggct 18 <210> 60 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 60 agtatgtcta gactgaagta tgtctagact gaagtatgtc tagactga 48 <210> 61 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic RNA <400> 61 gacucguuua ucgaagacaa cccggguugu cuucgauaaa cgagucca 48

Claims

NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 유효 성분으로서 포함하는 SMAD2/3 단백질의 인산화 저해제.
NEK6 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 유효 성분으로서 포함하는 섬유증 치료제.
이하의 (a), (b), (c), (d) 및 (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2본쇄 핵산 분자.
(a) 5'말단에 서열 번호 1에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단에 서열 번호 6에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자
(b) 5'말단에 서열 번호 2에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단에 서열 번호 7에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자
(c) 5'말단에 서열 번호 3에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단에 서열 번호 8에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자
(d) 5'말단에 서열 번호 4에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단에 서열 번호 9에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자
(e) 5'말단에 서열 번호 5에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 가이드쇄(안티센스쇄)와 3'말단에 서열 번호 10에 나타나는 서열을 포함하는 염기수 19∼30의 패신저쇄(센스쇄)로부터 형성되는 2본쇄 핵산 분자
제 3 항에 있어서,
추가로 가이드쇄(안티센스쇄) 및/또는 패신저쇄(센스쇄)의 3'말단에 1∼11염기의 리보뉴클레오타이드 잔기 및/또는 데옥시리보뉴클레오타이드 잔기가 부가되어, 돌출단을 형성하고 있는, 2본쇄 핵산 분자.
제 3 항 또는 제 4 항에 나타난 패신저쇄(센스쇄)의 3'말단과 가이드쇄(안티센스쇄)의 5'말단이, 뉴클레오타이드 잔기로 이루어지는 링커 서열 및/또는 비뉴클레오타이드 구조로 이루어지는 링커를 개재시켜 연결되거나, 혹은 제 3 항 또는 제 4 항에 나타난 가이드쇄(안티센스쇄)의 3'말단과 패신저쇄(센스쇄)의 5'말단이, 뉴클레오타이드 잔기로 이루어지는 링커 서열 및/또는 비뉴클레오타이드 구조로 이루어지는 링커를 개재시켜 연결된 헤어핀형 RNA 구조를 형성하고 있는 1본쇄 핵산 분자.
서열 번호 1∼5로부터 선택되는 NEK6 유전자의 발현 억제 서열을 포함하는, 이하의 (A) 또는 (B)의 1본쇄 핵산 분자:
(A) 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)를 포함하거나 또는 이들만으로 이루어지고,
5'측으로부터 3'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)의 순서로 배치되고,
상기 영역(Xc)가, 상기 영역(X)와 상보적이고,
상기 링커 영역(Lx)가, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조를 갖고,
또한 상기 영역(X)가, 상기 발현 억제 서열을 포함한다;
(B) 영역(Xc), 링커 영역(Lx), 영역(X), 영역(Y), 링커 영역(Ly) 및 영역(Yc)를, 5'측으로부터 3'측에 걸쳐 이 순서로 포함하고,
상기 영역(X)와 상기 영역(Y)가 연결되어, 내부 영역(Z)를 형성하고,
상기 영역(Xc)가, 상기 영역(X)와 상보적이고,
상기 영역(Yc)가, 상기 영역(Y)와 상보적이고,
또한 상기 링커 영역(Lx) 및/또는 링커 영역(Ly)가, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오타이드 구조를 갖고,
상기 내부 영역(Z)가, 상기 발현 억제 서열을 포함한다.
제 6 항에 있어서,
상기 링커 영역(Lx) 및/또는 (Ly)가, 하기 식(I)로 표시되는, 1본쇄 핵산 분자.
[화학식 1]

상기 식 중,
X¹ 및 X²는, 각각 독립적으로, H₂, O, S 또는 NH이고;
Y¹ 및 Y²는, 각각 독립적으로, 단일결합, CH₂, NH, O 또는 S이고;
R³은, 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이고;
L¹은, n개의 탄소 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이고, 여기에서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, OR^a, NH₂, NHR^a, NR^aR^b, SH 혹은 SR^a로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 되거나, 또는,
L¹은, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에터쇄이고,
단, Y¹이 NH, O 또는 S인 경우, Y¹에 결합하는 L¹의 원자는 탄소이고, OR¹에 결합하는 L¹의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고;
L²는, m개의 탄소 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이고, 여기에서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, OR^c, NH₂, NHR^c, NR^cR^d, SH 혹은 SR^c로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 되거나, 또는,
L²는, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에터쇄이고,
단, Y²가 NH, O 또는 S인 경우, Y²에 결합하는 L²의 원자는 탄소이고, OR²에 결합하는 L²의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고;
R^a, R^b, R^c 및 R^d는, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고;
l은, 1 또는 2이고;
m은, 0∼30의 범위의 정수이고;
n은, 0∼30의 범위의 정수이고;
환 A는, 상기 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 되고,
상기 환 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 되고,
상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X)는, 각각, -OR¹- 또는 OR²-를 개재시켜, 상기 링커 영역(Lx)에 결합하고,
상기 영역(Yc) 및 상기 영역(Y)는, 각각, -OR¹- 또는 OR²-를 개재시켜, 상기 링커 영역(Ly)에 결합하고,
여기에서, R¹ 및 R²는, 존재해도 존재하지 않아도 되고, 존재하는 경우, R¹ 및 R²는, 각각 독립적으로, 뉴클레오타이드 잔기 또는 상기 구조(I)이다.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
X 또는 Z가, 서열 번호 11∼25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 1본쇄 핵산 분자.