CN110996969A - 纤维化疾病治疗剂 - Google Patents

纤维化疾病治疗剂 Download PDF

Info

Publication number
CN110996969A
CN110996969A CN201880049352.2A CN201880049352A CN110996969A CN 110996969 A CN110996969 A CN 110996969A CN 201880049352 A CN201880049352 A CN 201880049352A CN 110996969 A CN110996969 A CN 110996969A
Authority
CN
China
Prior art keywords
region
bases
strand
linker
nek6
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880049352.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110996969B (zh
Inventor
中尾一久
石山顺一
市川航
增井淳
赤坂由似华
丰福秀一
本田亚弥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinglin Pharmaceutical Holdings Co ltd
Kyorin Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Kyorin Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyorin Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Kyorin Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN110996969A publication Critical patent/CN110996969A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110996969B publication Critical patent/CN110996969B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了含有抑制NEK6(NIMA相关丝氨酸/苏氨酸激酶6)基因的表达的核酸作为有效成分的SMAD2/3蛋白质的磷酸化抑制剂或纤维化疾病治疗剂。

Description

纤维化疾病治疗剂
技术领域
本发明涉及抑制NEK6基因的表达的核酸分子和以该核酸分子为有效成分的药品。
背景技术
纤维化疾病是由于过剩的胶原蛋白的蓄积而脏器功能受到障碍、不可逆地进展的疾病，例如，作为其发病脏器已知有皮肤、肺、肝脏、胰脏、肾脏、骨髓等。作为肺的纤维化疾病的一种的特发性肺纤维化疾病(IPF)虽然人口每10万人为20人左右的患者数和患病率并不高，但是确诊后的平均生存期间为2.5～5年，治疗后的经过并不好，在日本被指定为难治之症。
作为IPF治疗药，目前为止吡非尼酮(pirfenidone)、尼达尼布(Nintedanib)受到日本厚生劳动省承认并上市。虽然所有药剂都显示肺活量降低抑制和无进展期延长作用，而延迟病情的发展，但作为治疗效果并不能说能够充分满足，期待基于新的机理的治疗药的开发。
另一方面，作为本发明的靶标的“NEK6蛋白质”，已知是有关细胞分裂的控制的NIMA相关丝氨酸/苏氨酸激酶家族(NIMA-related serine/threonine kinase family)之一，但目前为止并没有作为医药品开发的研究对象关注。在2002年报道了作为癌的药物开发靶标的可能性，但对于NEK6蛋白质与SMAD2/3蛋白质相互作用、促进组织的纤维化没有具体的报告。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2004/0097441号说明书
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供新型的SMAD2/3蛋白质的磷酸化抑制剂和纤维化疾病治疗剂。
用于解决技术问题的技术方案
本发明的发明人根据使用博来霉素诱发肺纤维化疾病模型的解析，着眼于观察到NEK6(NIMA-related serine/threonine kinase 6，NIMA相关丝氨酸/苏氨酸激酶6)的mRNA水平的增强，进行了研究，结果发现NEK6在TGF-β下游控制有助于纤维化的SMAD系信号，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
〔1〕一种SMAD2/3蛋白质的磷酸化抑制剂，其含有抑制NEK6基因的表达的核酸作为有效成分；
〔2〕一种纤维化疾病治疗剂，其含有抑制NEK6基因的表达的核酸作为有效成分；
〔3〕如〔2〕所述的治疗剂，其以肺纤维化疾病、肝纤维化疾病或肾纤维化疾病为治疗对象；
〔4〕一种双链核酸分子，其选自以下的(a)、(b)、(c)、(d)和(e)：
(a)由在5’末端包含序列编号1所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号6所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(b)由在5’末端包含序列编号2所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号7所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(c)由在5’末端包含序列编号3所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号8所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(d)由在5’末端包含序列编号4所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号9所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(e)由在5’末端包含序列编号5所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号10所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子；
〔5〕如〔4〕所述的双链核酸分子，其还在引导链(反义链)和/或乘客链(正义链)的3’末端添加了1～11个碱基的核糖核苷酸残基和/或脱氧核苷酸残基，形成有突出端；
〔6〕一种单链核酸分子，其形成有发卡型RNA结构，其是〔4〕或〔5〕所示的乘客链(正义链)的3’末端和引导链(反义链)的5’末端经由核苷酸残基构成的接头序列和/或非核苷酸结构的接头连结、或者〔4〕或〔5〕所示的引导链(反义链)的3’末端和乘客链(正义链)的5’末端经由由核苷酸残基构成的接头序列和/或非核苷酸结构的接头连结而形成的；
〔7〕以下的(A)或(B)的单链核酸分子，其包含选自序列编号1～5中的NEK6基因的表达抑制序列：
(A)包含区域(X)、接头区域(Lx)和区域(Xc)，或者由这些区域构成，
从5’侧至3’侧，依次配置有上述区域(Xc)、上述接头区域(Lx)和上述区域(X)，
上述区域(Xc)与上述区域(X)互补，
上述接头区域(Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸结构，
且上述区域(X)包含上述表达抑制序列；
(B)从5’侧至3’侧依次包含区域(Xc)、接头区域(Lx)、区域(X)、区域(Y)、接头区域(Ly)和区域(Yc)，
上述区域(X)和上述区域(Y)连结，形成内部区域(Z)，
上述区域(Xc)与上述区域(X)互补，
上述区域(Yc)与上述区域(Y)互补，
且上述接头区域(Lx)和/或接头区域(Ly)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸结构，
上述内部区域(Z)包含上述表达抑制序列。
〔8〕如〔7〕所述的单链核酸分子，其中，上述接头区域(Lx)和/或(Ly)由下述式(I)表示。
Figure BDA0002378007650000041
上述式中，
X1和X2分别独立为H2、O、S或NH；
Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S；
R3为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6结合的氢原子或取代基；
L1为由n个碳原子构成的亚烷基链，其中，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可以不被它们取代，或者
L1为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代的聚醚链，
其中，Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与OR1结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
L2为由m个碳原子构成的亚烷基链，其中，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代也可以不被它们取代，或者、
L2为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代的聚醚链，
其中，Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与OR2结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立，为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0～30的范围的整数；
n为0～30的范围的整数；
环A中上述环A上的C-2以外的1个的碳原子可以被氮、氧或硫取代，
在上述环A内可以包含碳-碳双键或碳-氮双键，
上述区域(Xc)和上述区域(X)分别经由-OR1-或-OR2-与上述接头区域(Lx)结合，
上述区域(Yc)和上述区域(Y)分别经由-OR1-或-OR2-与上述接头区域(Ly)结合，
其中，R1和R2可以存在也可以不存在，存在的情况下，R1和R2分别独立为核苷酸残基或上述结构(I)；
〔9〕如〔7〕或〔8〕所述的单链核酸分子，其中，X或Z包含选自序列编号11～25中的序列；
〔10〕一种抑制SMAD2/3蛋白质的磷酸化的方法，其包括向对象投予抑制NEK6基因的表达的核酸的步骤；
〔11〕一种治疗纤维化疾病的方法，其包括向对象投予抑制NEK6基因的表达的核酸的步骤；
〔12〕一种抑制NEK6基因的表达的核酸，其用于抑制SMAD2/3蛋白质的磷酸化；
〔13〕一种抑制NEK6基因的表达的核酸，其用于治疗纤维化疾病；
〔14〕抑制NEK6基因的表达的核酸在用于制造SMAD2/3蛋白质的磷酸化抑制剂中的用途；和
〔15〕抑制NEK6基因的表达的核酸在用于制造纤维化疾病治疗剂中的用途。
〔16〕如〔15〕所述的用途，其中，抑制NEK6基因的表达的核酸为包含KB-001～011的表达抑制序列(下划线部分)的核酸。
发明的效果
根据本发明，能够提供新型的SMAD2/3蛋白质的磷酸化抑制剂和纤维化疾病治疗剂。
附图说明
图1是表示NEK6的编码序列(Coding Sequence)区域的序列和实施例7中制作的ssPN分子的靶标部位的图。
图2是表示成为本发明的SMAD2/3蛋白质磷酸化抑制剂的有效成分的核酸分子的一例的示意图。(ssPN分子)
图3是表示成为本发明的SMAD2/3蛋白质磷酸化抑制剂的有效成分的核酸分子的一例的示意图。(ssPN分子或ssNc分子)
图4是表示成为本发明的SMAD2/3蛋白质磷酸化抑制剂的有效成分的核酸分子的一例的示意图。(ssPN分子或ssNc分子)
图5是表示成为本发明的SMAD2/3蛋白质磷酸化抑制剂的有效成分的核酸分子的一例的示意图。(ssNc分子)
图6是表示导入siRNA时的NEK6基因的转录量的图表。
图7a表示将NEK6敲低时的磷酸化SMAD3蛋白质的蛋白质印迹(Western Blot)的结果。图7b表示将NEK6敲低时的磷酸化SMAD2蛋白质的蛋白质印迹的结果。
图8a表示利用抗NEK6抗体的共免疫沉淀的结果。图8b表示利用抗FLAG抗体的共免疫沉淀的结果。
图9表示使His融合NEK6蛋白质与GST融合SMAD3蛋白质反应时的磷酸化SMAD3蛋白质的蛋白质印迹的结果。
图10a表示将NEK6敲低时的蛋白质印迹的结果。图10b表示将NEK6敲低时的萤火虫荧光素酶的发光量。
图11a表示将NEK6敲低时的Col1a1基因的转录量。图11b表示将NEK6敲低时的αSMA基因的转录量。
图12a表示将NEK6敲低时的Col1a1基因的转录量。图12b表示将NEK6敲低时的αSMA基因的转录量。
图13表示在肝星状细胞导入NEK6 siRNA时的磷酸化SMAD3蛋白质(pSMAD3)的蛋白质印迹的结果。
图14表示在肝星状细胞导入各种NEK6 siRNA时的磷酸化SMAD3蛋白质(pSMAD3)的蛋白质印迹的结果。
图15a表示在肝星状细胞中将NEK6敲低时的NEK6的转录量。图15b表示在肝星状细胞中将NEK6敲低时的纤连蛋白(Fibronectin)的转录量。图15c表示在肝星状细胞中将NEK6敲低时的αSMA基因的转录量。
图16表示在肾脏成纤维细胞中将NEK6敲低时的磷酸化SMAD3蛋白质的蛋白质印迹的结果。
图17a表示在CCl4模型中将NEK6敲低时的血清中GPT的测定结果。图17b表示在CCl4模型中将NEK6敲低时的血清中GOT的测定结果。
图18表示在CCl4模型中将NEK6敲低时的磷酸化SMAD3蛋白质的蛋白质印迹的结果。
图19a表示在CCl4模型将NEK6敲低时的NEK6基因的转录量。图19b表示在CCl4模型中将NEK6敲低时的Col1a1基因的转录量。图19c表示在CCl4模型中将NEK6敲低时的Col3a1基因的转录量。图19d表示在CCl4模型中将NEK6敲低时的Timp1基因的转录量。
图20a表示在BDL模型中将NEK6敲低时的NEK6基因的转录量。图20b表示在BDL模型中将NEK6敲低时的Col1a1基因的转录量。图20c表示在BDL模型中将NEK6敲低时的Col3a1基因的转录量。图20d表示在BDL模型中将NEK6敲低时的Timp1基因的转录量。
图21表示在CCl4模型中将NEK6敲低时的肝脏的病理解析的结果。图21a表示未投予CCl4的生理盐水投予组的结果。图21b表示投予CCl4的溶剂投予组的结果。图21c表示投予CCl4的核酸投予组的结果。
具体实施方式
本说明书中使用的术语只要没有特别说明，就以该技术领域中通常所用的意思使用。另外，在本发明中，“碱基数”例如是指“长度”、，也能够称为“碱基长度”。在本发明中，碱基数的数值范围例如公开了全部属于其范围的正整数，作为具体例，“1～4个碱基”的记载是指“1、2、3、4个碱基”的全部公开。
本发明提供含有抑制NEK6基因的表达的核酸作为有效成分的SMAD2/3蛋白质磷酸化抑制剂和含有该核酸作为有效成分的纤维化疾病治疗剂。以下，关于本发明的内容进行详细说明。
(1)抑制NEK6基因的表达的核酸
NEK6蛋白质是细胞分裂的控制相关的11个NIMA相关丝氨酸/苏氨酸激酶家族(NIMA-related serine/threonine kinase family)之一，在细胞周期的M期被磷酸化(活化)。
作为本发明的靶标的NEK6基因为来自哺乳类的基因，优选为来自人的基因。来自人的NEK6基因被报道有7种变体，但图1表示其中的亚型2的编码序列(Coding Sequence)区域的序列(序列编号56)。
通过核酸分子的NEK6基因的表达的抑制机理没有特别限制，只要能够将表达下调即可。NEK6基因的表达抑制能够通过从NEK6基因的转录产物的生成量的减少、从NEK6基因的翻译产物的生成量的减少、或上述翻译产物的活性的减少等来确认。
作为抑制NEK6基因的表达的核酸，可以列举NEK6 mRNA的反义多聚核苷酸、siRNA、ssPN分子、ssNc分子、miRNA、核酶等。
反义多聚核苷酸、siRNA、ssPN分子、ssNc分子、核酶只要是本领域技术人员，就能够基于上述的人NEK6基因的核苷酸序列容易地取得。优选为根据NEK6亚型2的编码序列区域的序列(序列编号56)制作得到的核酸。
(2)siRNA
以下说明作为抑制NEK6基因的表达的核酸之一的siRNA(small interferingRNA，小干扰RNA)。
siRNA是由与靶标基因配对的引导链(反义链)、与引导链形成双链的乘客链(正义链)构成的核酸分子。siRNA进入细胞内以Argonaute(AGO)蛋白质为中核的被称为RNA诱导沉默复合物(RNA-inducing silencing complex，RISC)的复合体后，正义链被AGO分解，引导链留在RISC中。引导链的种子区域(引导链的从5’末端起2-8个碱基的7碱基区域)被认为在识别靶标序列上具有重要的作用，从避免脱靶效果的目的出发，优选选择靶标基因特异性的种子区域。因此，关于作为本发明的有效成分的核酸的种子区域，也优选选择NEK6基因特异性的序列。例如可以列举选择包含与NEK6基因互补且不与NEK7基因(RefSeqdatabase：NM＿133494.2)互补、或者区域中1个以上(例如1～3个)碱基与NEK7基因非互补的(错配)的序列作为种子区域的核酸。另外，关于全长序列，例如增加对NEK6基因互补、对NEK7基因非互补的(错配)的碱基(例如4个以上，优选5～7个)在避免脱靶效果上有用。引导链所含的表达抑制序列的碱基数例如为15～30个碱基，优选为19～25个碱基，更优选为19～23个碱基，更加优选为21、22、23个碱基，特别优选为23个碱基。
上述表达抑制序列可以通过在3’侧进一步具有添加序列而形成突出端。上述添加序列的碱基数例如为1～11个碱基，优选为1～4个碱基。添加序列可以为核糖核苷酸残基也可以为脱氧核糖核苷酸残基。
引导链的碱基数例如为19～50个碱基，优选为19～30个碱基，更优选为19～25个碱基，更加优选为19～23个碱基，进一步优选为21、22、23个碱基，特别优选为23个碱基。
乘客链的碱基数例如为19～50个碱基，优选为19～30个碱基，更优选为19～25个碱基，更加优选为19～23个碱基，进一步优选为21、22、23个碱基，特别优选为21个碱基。
作为乘客链且显示与引导链互补性的区域例如为19～50个碱基，优选为19～30个碱基，更优选为19～25个碱基，更加优选为19～23个碱基。上述区域在3’侧还可以具有添加序列。上述添加序列的碱基数例如为1～11个碱基，优选为1～4个碱基，添加序列可以为核糖核苷酸残基也可以为脱氧核糖核苷酸残基。乘客链相对于显示引导链的互补性的区域，例如可以为互补的，也可以1个或数个碱基为非互补的，但优选为互补的。上述1个碱基或数个碱基例如为1～3个碱基，优选为1个碱基或2个碱基。
抑制NEK6的基因表达的siRNA根据NEK6基因的cDNA序列信息，例如能够按照siSNIPER(注册商标)、药物开发-诊断研究用siDirect(注册商标)等的siRNA序列设计系统得到。
NEK6siRNA优选对NEK6特异性作用的siRNA，例如能够列举如下的双链核酸：
(a)由在5’末端包含序列编号1所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号6所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(b)由在5’末端包含序列编号2所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号7所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(c)由在5’末端包含序列编号3所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号8所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(d)由在5’末端包含序列编号4所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号9所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(e)由在5’末端包含序列编号5所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端或5’末端包含序列编号10所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子。
[表1]
序列编号No. 5’→3’
NO.1 AGAGGUUGUUGGAAC
NO.2 CCUUGACACAGUCCU
NO.3 CGUGAAUGCAUGUGC
NO.4 GGAGAAGAGAUUCAU
NO.5 GUAUCCGAUGUCAGG
NO.6 GUUCCAACAACCUCU
NO.7 AGGACUGUGUCAAGG
NO.8 GCACAUGCAUUCACG
NO.9 AUGAAUCUCUUCUCC
NO.10 CCUGACAUCGGAUAC
另外，抑制NEK6基因的表达的siRNA可以为乘客链(正义链)的3’末端和引导链(反义链)的5’末端经由由核苷酸残基构成的接头序列和/或非核苷酸结构的接头连结，或者引导链(反义链)的3’末端和乘客链(正义链)的5’末端经由由核苷酸残基构成的接头序列和/或非核苷酸结构的接头连结的形成有发卡型RNA结构的单链核酸分子。
上述由核苷酸残基构成的接头序列的长度没有特别限制，例如优选为上述乘客链和上述引导链能够形成双链的长度。上述接头序列的碱基数的下限例如为1个碱基，优选为2个碱基，更优选为3个碱基，其上限例如为100个碱基，优选为80个碱基，更优选为50个碱基。上述接头序列的碱基数的具体例为1～100个碱基、2～80个碱基、3～50个碱基。
作为上述非核苷酸结构的接头的例子，能够列举六甘醇接头、聚-(氧化磷酸亚基-氧代-1,3-丙二醇)接头、烯丙基接头、或聚乙二醇接头等的化学接头、具有氨基甲酸酯结构的氨基接头等。上述非核苷酸结构接头的长度没有特别限制例如优选上述乘客链和上述引导链能够形成双链的长度。
(3)ssPN分子
对成为抑制NEK6基因的表达的核酸之一的ssPN分子进行说明。ssPN分子是指WO2012/017919所公开的生物学稳定性优异的单链RNA核酸分子，具体如下所述。
成为本发明的有效成分的ssPN分子的特征在于，为包含NEK6基因的表达抑制序列的单链核酸分子，包含区域(X)、接头区域(Lx)和区域(Xc)，在上述区域(X)与上述区域(Xc)之间，连结上述接头区域(Lx)，上述区域(X)和上述区域(Xc)的至少一者包含上述表达抑制序列，上述接头区域(Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸结构。ssPN分子其5’末端和3’末端未连结，也能够称为线状单链核酸分子。
在ssPN分子中，NEK6基因的表达抑制序列例如在本发明的ssPN分子在体内(invivo)或体外(in vitro)被导入细胞内的情况下，为显示抑制NEK6基因的表达的活性的序列。与NEK6 mRNA结合的siRNA序列能够基于NEK6基因的cDNA序列信息，按照现有的siRNA设计系统得到，在ssPN分子中，也能够使用上述siRNA的表达抑制序列作为ssPN分子的表达抑制序列。
上述表达抑制序列例如优选相对于NEK6基因的靶标区域具有80％以上的互补性，更优选为90％以上，更加优选为95％以上，更加优选为98％以上，特别优选为100％。
特别是关于siRNA的相当于种子区域的部分，与siRNA的情况同样优选选择对NEK6基因特异性的序列。
根据ssPN分子的NEK6基因的表达的抑制被推测是由于例如产生RNA干扰的缘故，但并不限定于该机理。本发明的ssPN分子例如如所谓的siRNA那样，并不是作为由二条单链RNA构成的dsRNA，导入细胞等，另外，在细胞内，上述表达抑制序列的切出也并不是必须。
在ssPN分子中，上述接头区域(Lx)例如可以具有包含上述吡咯烷骨架的非核苷酸结构，也可以具有包含上述哌啶骨架的非核苷酸结构，还可以具有包含上述吡咯烷骨架的非核苷酸结构和包含上述哌啶骨架的非核苷酸结构的两者。
在ssPN分子中，上述吡咯烷骨架例如可以为构成吡咯烷的5元环的碳的1个以上被取代的吡咯烷衍生物的骨架，被取代的情况下，例如优选为5元环的2位的碳(C-2)以外的碳原子。上述碳例如可以被氮、氧或硫取代。上述吡咯烷骨架例如在吡咯烷的5元环内例如可以包含碳-碳双键或碳-氮双键。在上述吡咯烷骨架中，构成吡咯烷的5元环的碳和氮例如可以结合氢，也可以结合如后所述的取代基。上述接头区域(Lx)例如可以经由上述吡咯烷骨架的任意基团，与上述区域(X)和上述区域(Xc)结合，优选上述5元环的任意1个碳原子和氮，优选为上述5元环的2位的碳(C-2)和氮。作为上述吡咯烷骨架，例如可以列举脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等。上述脯氨酸骨架和脯氨醇骨架等例如为生物体内物质及其还原体，因此安全性也优异。
在ssPN分子中，上述哌啶骨架可以为例如构成哌啶的6元环的碳1个以上被取代的哌啶衍生物的骨架，在被取代的情况下，例如优选为6元环的2位的碳(C-2)以外的碳原子。上述碳例如可以被氮、氧或硫取代。上述哌啶骨架例如在哌啶的6元环内例如可以包含碳-碳双键或碳-氮双键。在上述哌啶骨架中，构成哌啶的6元环的碳和氮例如可以结合氢基，也可以结合如后所述的取代基。上述接头区域(Lx)例如可以经由上述哌啶骨架的任意基团，与上述区域(X)和上述区域(Xc)结合，优选为上述6元环的任意1个碳原子和氮，优选为上述6元环的2位的碳(C-2)和氮。
上述接头区域例如可以仅包含由上述非核苷酸结构构成的非核苷酸残基，也可以包含由上述非核苷酸结构构成的非核苷酸残基和核苷酸残基。
在ssPN分子中，上述接头区域例如可以由下述式(I)表示。
Figure BDA0002378007650000131
上述式(I)中，例如
X1和X2分别独立为H2、O、S或NH；
Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S；
R3为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6结合的氢原子或取代基，
L1为由n个碳原子构成的亚烷基链，其中，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可以不被取代，或者
L1为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代的聚醚链，
其中，Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与OR1结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
L2为由m个碳原子构成的亚烷基链，其中，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代也可以不被取代，或者
L2为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代的聚醚链，
其中，Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与OR2结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0～30的范围的整数；
n为0～30的范围的整数；
环A中上述环A上的C-2以外的1个碳原子可以被氮、氧、硫取代，
在上述环A内包含碳-碳双键或碳-氮双键，
上述区域(Xc)和上述区域(X)分别经由-OR1-或-OR2-与上述接头区域(Lx)结合，
其中，R1和R2可以存在也可以不存在，存在的情况下，R1和R2分别独立为核苷酸残基或上述结构(I)。
上述式(I)中，X1和X2例如分别独立为H2、O、S或NH。在上述式(I)中，X1为H2是指X1与X1的结合的碳原子一起形成CH2(亚甲基)的意思。关于X2也同样。
上述式(I)中，Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S。
上述式(I)中，在环A中，l为1或2。l＝1的情况下，环A为5元环，例如为上述吡咯烷骨架。上述吡咯烷骨架例如可以列举脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等，能够例示它们的二价结构。l＝2的情况下，环A为6元环，例如为上述哌啶骨架。环A中环A上的C-2以外的1个的碳原子可以被氮、氧或硫取代。另外，环A也可以在环A内包含碳-碳双键或碳-氮双键。环A例如可以为L型和D型的任意一种。
上述式(I)中，R3为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6结合的氢原子或取代基。R3为上述取代基的情况下，取代基R3可以为1个也可以多个，还可以不存在，在多个的情况下，可以相同也可以不同。取代基R3例如为卤素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4、氧代基(＝O)、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基烷基等。
R4和R5例如分别独立为取代基或保护基，可以相同也可以不同。作为R4和R5的取代基例如可以列举卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基烷基等。
作为R4和R5的保护基，例如为将反应性高的官能团改变为无活性的官能团，可以列举公知的保护基等。上述保护基例如能够援引文献(J.F.W.McOmie,“Protecting Groupsin Organic Chemistry”Prenum Press,London and New York,1973)的记载。上述保护基没有特别限制，例如可以列举叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙基氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)和甲苯磺酰基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。R3为OR4的情况下，上述保护基没有特别限制，例如可以列举TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基等。
上述式(I)中，L1为由n个碳原子构成的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子例如可以被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代，也可以不被取代。或者，L1可以为上述亚烷基链的1个以上的碳原子(例如1～3个)被氧原子取代的聚醚链。上述聚醚链例如为聚乙二醇。此外，在Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与OR1结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如Y1为O的情况下，其氧原子与L1的氧原子不相邻，OR1的氧原子与L1的氧原子不相邻。
上述式(I)中，L2为由m个碳原子构成的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子例如可以被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，也可以不被取代。或者L2可以为上述亚烷基链的1个以上的碳原子(例如，1～3个)被氧原子取代的聚醚链。此外，在Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与OR2结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如在Y2为O的情况下，其氧原子与L2的氧原子不相邻，OR2的氧原子与L2的氧原子不相邻。
L1的n和L2的m没有特别限制，各自下限例如为0，上限也没有特别限制。n和m例如能够根据上述接头区域(Lx)的所希望的长度适当设定。n和m例如从制造成本和收率等的方面出发分别优选为0～30，更优选为0～20，更加优选为0～15。n和m可以相同(n＝m)，也可以不同。n+m例如为0～30，优选为0～20，更优选为0～15。此外，L1的n和L2的m为各个亚烷基链的碳原子数，但在为L1或L2的亚烷基链的一个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链的情况下，n和m是指碳原子数和所取代的氧原子数的合计数。
Ra、Rb、Rc和Rd例如分别独立为取代基或保护基。Ra、Rb、Rc和Rd的取代基和保护基例如与R4和R5的取代基和保护基同样。
在上述式(I)中，氢原子例如分别独立可以被Cl、Br、F和I等卤素取代。
上述区域(Xc)和上述区域(X)例如分别经由-OR1-或-OR2-与上述接头区域(Lx)结合。其中，R1和R2可以存在也可以不存在。R1和R2存在的情况下，R1和R2分别独立为核苷酸残基或上述式(I)的结构。在R1和/或R2为上述核苷酸残基的情况下，上述接头区域(Lx)例如由除了核苷酸残基R1和/或R2以外的由上述式(I)的结构构成的上述非核苷酸残基和上述核苷酸残基形成。R1和/或R2为上述式(I)的结构的情况下，上述接头区域(Lx)例如成为由上述式(I)的结构构成的上述非核苷酸残基2个以上连结而成的结构。上述式(I)的结构例如可以包含1个、2个、3个或4个。这样，在包含多个上述结构的情况下，上述(I)的结构例如可以直接连结，也可以经由上述核苷酸残基结合。另一方面，在不存在R1和R2的情况下，上述接头区域(Lx)例如仅由由上述式(I)的结构构成的上述非核苷酸残基形成。
上述区域(Xc)和上述区域(X)与-OR1-和-OR2-的结合的组合没有特别限制，例如可以列举以下的任意条件。
条件(1)
上述区域(Xc)经由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域(X)经由-OR1-与上述式(I)的结构结合。
条件(2)
上述区域(Xc)经由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域(X)经由-OR2-与上述式(I)的结构结合。
上述式(I)的结构例如能够例示下述式(I-1)～式(I-9)，在下述式中，n和m与上述式(I)相同。在下述式中，q为0～10的整数。
Figure BDA0002378007650000171
在上述式(I-1)～(I-9)中，n、m和q没有特别限制，如上所述。作为具体例，在上述式(I-1)中，可以列举n＝8，在上述(I-2)中，可以列举n＝3，在上述式(I-3)中，可以列举n＝4或8，在上述(I-4)中，可以列举n＝7或8，在上述式(I-5)中，可以列举n＝3和m＝4，在上述(I-6)中，可以列举n＝8和m＝4，在上述式(I-7)中，可以列举n＝8和m＝4，在上述(I-8)中，可以列举n＝5和m＝4，在上述式(I-9)中，q＝1和m＝4。将上述式(I-4)的一例(n＝8)表示在下述式(I-4a)中，将上述式(I-8)的一例(n＝5、m＝4)表示在下述式(I-8a)中。
Figure BDA0002378007650000181
在ssPN分子中，上述区域(Xc)与上述区域(X)互补。因此，在ssPN分子中，上述区域(Xc)向上述区域(X)折回，上述区域(Xc)和上述区域(X)通过自我退火能够形成双链。
ssPN分子例如可以仅上述区域(Xc)折回与上述区域(X)形成双链，进而也可以在其它区域形成新的双链。以下，将前者的ssPN分子、即、双链形成为1处的分子称为“第一ssPN分子”，将后者的ssPN分子、即、双链形成为2处的分子称为“第二ssPN分子”。以下对上述第一ssPN分子和上述第二ssPN分子进行例示。
(i)第一ssPN分子
上述第一ssPN分子例如为由上述区域(X)、上述区域(Xc)和上述接头区域(Lx)构成的分子。
上述第一ssPN分子例如从5’侧至3’侧依次具有上述区域(Xc)、上述接头区域(Lx)和上述区域(X)，也可以从3’侧至5’侧，依次具有上述区域(Xc)、上述接头区域(Lx)和上述区域(X)。
在上述第一ssPN分子中，上述区域(Xc)与上述区域(X)互补。其中，上述区域(Xc)具有对于上述区域(X)的整个区域或其部分区域互补的序列即可，优选包含与上述区域(X)的整个区域或其部分区域互补的序列，或者仅由上述互补的序列构成。上述区域(Xc)相对于上述区域(X)的互补的上述整个区域或互补的上述部分区域，例如可以为互补的，也可以1个或数个碱基为非互补的，但优选为互补的。上述1个碱基或数个碱基例如为1～3个碱基、优选为1个碱基或2个碱基。
在上述第一ssPN分子中，上述表达抑制序列包含在上述区域(Xc)和上述区域(X)的至少一者中。上述第一ssPN分子例如可以具有1个上述表达抑制序列，也可以具有2个以上上述表达抑制序列。后者的情况下，上述第一ssPN分子例如可以具有2个以上相对于NEK6基因为相同表达抑制序列，也可以具有2个以上相对于NEK6基因不同的表达抑制序列。上述第一ssPN分子具有2个以上的上述表达抑制序列的情况下，各表达抑制序列的配置位置没有特别限制，可以是上述区域(X)和上述区域(Xc)的任意一个区域，也可以是不同的区域。
按照图2的示意图说明上述第一ssPN分子的一例。图2的(A)是作为一例，表示对上述ssPN分子的各区域的顺序的概略的示意图，图2的(B)是表示上述ssPN分子在上述分子内形成了双链的状态的示意图。如图2的(B)所示，上述ssPN分子在上述区域(Xc)与上述区域(X)之间形成双链，上述Lx区域根据其长度形成环结构。图2不过是表示上述区域的连结顺序和形成双链的各区域的位置关系的图，例如各区域的长度、上述接头区域(Lx)的形状等不限于此。
在上述第一ssPN分子中，上述区域(Xc)和上述区域(X)的碱基数没有特别限制。以下例示各区域的长度，但本发明不限于此。
上述区域(Xc)例如可以与上述区域(X)的整个区域互补。该情况下，上述区域(Xc)例如意味着由与上述区域(X)的5’末端至3’末端的整个区域互补的碱基序列构成，即意味着，上述区域(Xc)和上述区域(X)可以为相同的碱基长度，且上述区域(Xc)的全部碱基与上述区域(X)的全部碱基互补。
另外，上述区域(Xc)例如可以与上述区域(X)的部分区域互补。该情况下意味着，上述区域(Xc)例如由与上述区域(X)的部分区域互补的碱基序列构成，即意味着，上述区域(Xc)由比上述区域(X)短1个碱基以上的碱基长度的碱基序列构成，上述区域(Xc)的全部碱基与上述区域(X)的上述部分区域的全部碱基互补。上述区域(X)的上述部分区域优选为例如由上述区域(X)中的从上述区域(Xc)侧的末端的碱基(第1个碱基)起连续的碱基序列构成的区域。
在上述第一ssPN分子中，上述区域(X)的碱基数(X)和上述区域(Xc)的碱基数(Xc)的关系例如满足下述(3)或(5)的条件，在前者的情况下，具体而言例如满足下述(11)的条件。
X＞Xc···(3)
X-Xc＝1～10、优选为1、2或3、
更优选为1或2···(11)
X＝Xc···(5)
上述区域(X)和/或上述区域(Xc)包含上述表达抑制序列的情况下，上述区域例如可以为仅由上述表达抑制序列构成的区域，也可以为包含上述表达抑制序列的区域。
上述表达抑制序列的碱基数例如为15～30个碱基，优选为19～25个碱基，更优选为19～23个碱基，更加优选为21、22、23个碱基，特别优选为23个碱基。包含上述表达抑制序列的区域例如可以在上述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧还具有添加序列。上述添加序列的碱基数例如为1～31个碱基，优选为1～21个碱基，更优选为1～11个碱基。
上述区域(X)的碱基数没有特别限制。上述区域(X)包含上述表达抑制序列的情况下，其下限例如为19个碱基。其上限例如为50个碱基，优选为40个碱基，更优选为30个碱基，更加优选为25个碱基。上述区域(X)的碱基数的具体例例如为19～50个碱基，优选为19～30个碱基，更优选为19～25个碱基，更加优选为21、22、23个碱基，特别优选为23个碱基。
上述区域(Xc)的碱基数没有特别限制。其下限例如为19个碱基，优选为20个碱基，更优选为21个碱基。其上限例如为50个碱基，优选为40个碱基，更优选为30个碱基，更加优选为25个碱基。上述区域(Xc)的碱基数的具体例例如为19～50个碱基，优选为19～30碱基，更优选为19～25碱基，更加优选为21、22、23个碱基，特别优选为21个碱基。
在上述第一ssPN分子中，上述接头区域(Lx)的长度没有特别限制。上述接头区域(Lx)优选为例如上述区域(X)和上述区域(Xc)能够形成双链的长度。上述接头区域(Lx)在除了上述非核苷酸残基以外还包含上述核苷酸残基的情况下，上述接头区域(Lx)的碱基数的下限例如为1个碱基，优选为2个碱基，更优选为3个碱基，其上限例如为100个碱基，优选为80个碱基，更优选为50个碱基。上述接头区域(Lx)的碱基数的具体例为1～100个碱基、2～80个碱基、3～50个碱基。在上述接头区域(Lx)其本身的区域内部中，优选为不产生自我退火的结构。
上述第一ssPN分子的全长没有特别限制。在上述第一ssPN分子中，上述碱基数的合计(全长的碱基数)的下限例如为38个碱基，优选为42个碱基，更优选为44个碱基，更加优选为48个碱基，其上限例如为300个碱基，优选为200个碱基，更优选为150个碱基，更加优选为100个碱基，特别优选为80个碱基。上述第一ssPN分子的全长的碱基数的合计的具体例为38～300个碱基、42～200个碱基、44～150个碱基、48～100个碱基、48～80个碱基。在上述第一ssPN分子中，除上述接头区域(Lx)以外的碱基数的合计的下限例如为38个碱基，优选为42个碱基，更加优选为44个碱基，上限例如为300个碱基，优选为200个碱基，更优选为150个碱基，更加优选为100个碱基，特别优选为80个碱基。除上述接头区域(Lx)以外的碱基数的合计的具体例为38～300个碱基、42～200个碱基、42～150个碱基、44～100个碱基、44～80个碱基。
作为抑制NEK6基因的表达的第一ssPN分子的具体例，能够列举以下的单链核酸分子。
KB-001
5’-GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC-Lx-GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA-3’(序列编号31)
KB-002
5’-CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC-Lx-GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC-3’(序列编号32)
KB-003
5’-CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC-Lx-GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC-3’(序列编号33)
KB-004
5’-GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC-Lx-GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC-3’(序列编号34)
KB-005
5’-CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC-Lx-GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU-3’(序列编号35)
KB-006
5’-GGAGAUAAGAUGAAUCUCUUCCC-Lx-GGGAAGAGAUUCAUCUUAUCUCCAU-3’(序列编号46)
KB-007
5’-CUAUGGAGAUAAGAUGAAUCUCC-Lx-GGAGAUUCAUCUUAUCUCCAUAGAA-3’(序列编号47)
KB-008
5’-GCGGACUUCCAGAUCGAAAAGCC-Lx-GGCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCCA-3’(序列编号48)
KB-009
5’-CGGACUUCCAGAUCGAAAAGACC-Lx-GGUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCC-3’(序列编号49)
KB-010
5’-GACUUCCAGAUCGAAAAGAAGCC-Lx-GGCUUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCG-3’(序列编号50)
KB-011
5’-GACUCGUUUAUCGAAGACAACCC-Lx-GGGUUGUCUUCGAUAAACGAGUCCA-3’(序列编号61)
式中，Lx为接头区域Lx，表示下述结构式的L-脯氨酸二酰胺亚酰胺。
Figure BDA0002378007650000221
另外，作为优选的第一ssPN分子，能够列举如下的单链核酸分子：包含选自序列编号1～5中的抑制NEK6基因的表达的序列，仅由区域(X)、接头区域(Lx)和区域(Xc)构成，从5’侧至3’侧，依次配置有上述区域(Xc)、上述接头区域(Lx)和上述区域(X)，
上述接头区域(Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸结构，
且上述区域(X)包含上述表达抑制序列。
更加优选为上述区域(Xc)为与上述区域(X)的整个区域或部分区域完全互补的上述单链核酸。特别优选上述区域(X)为包含选自序列编号11～25中的序列的上述单链核酸分子。
[表2]
序列编号No. 5’→3’
NO.11 AGAGGUUGUUGGAACUCCC
NO.12 CCUUGACACAGUCCUGCCU
NO.13 CGUGAAUGCAUGUGCUCCA
NO.14 GGAGAAGAGAUUCAUCUUA
NO.15 GUAUCCGAUGUCAGGUCUC
NO.16 AGAGGUUGUUGGAACUCCCUC
NO.17 CCUUGACACAGUCCUGCCUCG
NO.18 CGUGAAUGCAUGUGCUCCACG
NO.19 GGAGAAGAGAUUCAUCUUAUC
NO.20 GUAUCCGAUGUCAGGUCUCUG
NO.21 AGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA
NO.22 CCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC
NO.23 CGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC
NO.24 GGAGAAGAGAUUCAUCCUUAUCUC
NO.25 GUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU
(ii)第二ssPN分子
上述第二ssPN分子为例如在上述区域(X)、上述接头区域(Lx)和上述区域(Xc)之外，还具有区域(Y)和与上述区域(Y)互补的区域(Yc)的分子。在上述第二ssPN分子中，上述区域(X)与上述区域(Y)连结，形成内部区域(Z)。此外，只要没有特别说明，上述第二ssPN分子能够援引上述第一ssPN分子的记载。
上述第二ssPN分子例如从5’侧至3’侧，可以依次具有上述区域(Xc)、上述接头区域(Lx)、上述区域(X)、上述区域(Y)和上述区域(Yc)。在该情况下，也将上述区域(Xc)称为5’侧区域(Xc)，将上述内部区域(Z)中的上述区域(X)称为内部5’侧区域(X)，将上述内部区域(Z)中的上述区域(Y)称为内部3’区域(Y)，将上述区域(Yc)称为3’侧区域(Yc)。另外，上述第二ssPN分子例如从3’侧至5’侧可以依次具有上述区域(Xc)、上述接头区域(Lx)、上述区域(X)、上述区域(Y)和上述区域(Yc)。在该情况下，也可以将上述区域(Xc)称为3’侧区域(Xc)，将上述内部区域(Z)中的上述区域(X)称为内部3’侧区域(X)，将上述内部区域(Z)中的上述区域(Y)称为内部5’区域(Y)，将上述区域(Yc)称为5’侧区域(Yc)。
上述内部区域(Z)为例如上述区域(X)和上述区域(Y)被连结。上述区域(X)和上述区域(Y)例如直接被连结，其间可以具有间插序列(intervening sequence)。上述内部区域(Z)为了表示上述区域(Xc)和上述区域(Yc)的序列关系，定义为“上述区域(X)和上述区域(Y)连结而构成”，在上述内部区域(Z)中，上述区域(X)和上述区域(Y)在上述ssPN分子的使用中，并不被限定为个别的独立的区域。即，例如在上述内部区域(Z)具有上述表达抑制序列的情况下，在上述内部区域(Z)中，也可以遍及上述区域(X)和上述区域(Y)，配置上述表达抑制序列。
在上述第二ssPN分子中，上述区域(Xc)与上述区域(X)互补。其中，上述区域(Xc)只要具有相对于上述区域(X)的整个区域或其部分区域互补的序列即可，优选包含与上述区域(X)的整个区域或其部分区域互补的序列，或者由上述互补的序列构成。上述区域(Xc)相对于上述区域(X)的互补的上述整个区域或互补的上述部分区域，例如可以为互补，也可以1个或数个碱基为非互补的，但优选为互补的。上述1个碱基或数个碱基例如为1～3个碱基、优选为1个碱基或2个碱基。
在上述第二ssPN分子中，上述区域(Yc)与上述区域(Y)为互补的。其中，上述区域(Yc)具有与上述区域(Y)的整个区域或其部分区域互补的序列即可，优选包含相对于上述区域(Y)的整个区域或其部分区域互补的序列，或者由上述互补的序列构成。上述区域(Yc)相对于上述区域(Y)的互补的上述整个区域或互补的上述部分区域，例如可以为互补的，也可以1个或数个碱基为非互补的，但优选为互补的。上述1个碱基或数个碱基例如为1～3个碱基、优选为1个碱基或2个碱基。
在上述第二ssPN分子中，上述表达抑制序列例如可以包含在由上述区域(X)和上述区域(Y)形成的上述内部区域(Z)和上述区域(Xc)的至少一个中，进而还可以包含在上述区域(Yc)中。优选为上述内部区域(Z)中包含上述表达抑制序列的ssPN分子。上述内部区域(Z)具有上述表达抑制序列的情况下，例如可以在上述区域(X)和上述区域(Y)的任一个具有上述表达抑制序列，另外，也可以遍及上述区域(X)和上述区域(Y)具有上述表达抑制序列。上述第二ssPN分子例如可以具有1个或2个以上的上述表达抑制序列。
在上述第二ssPN分子具有2个以上的上述表达抑制序列的情况下，各表达抑制序列的配置位置没有特别限制，可以是上述内部区域(Z)和上述区域(Xc)的任意一者，也可以是上述内部区域(Z)和上述区域(Xc)的任意一者和其它的不同的区域。
在上述第二ssPN分子中，上述区域(Yc)和上述区域(Y)例如可以直接连结，也可以间接地连结。前者的情况下，直接的连结例如可以列举通过磷酸二酯键的连结等。后者的情况下，例如可以列举在上述区域(Yc)与上述区域(Y)之间，具有接头区域(Ly)，经由上述接头区域(Ly)，上述区域(Yc)和上述区域(Y)连结的形态等。
在上述第二ssPN分子具有上述接头区域(Ly)的情况下，上述接头区域(Ly)例如可以为由上述核苷酸残基构成的接头，也可以是上述的具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸结构的接头。后者的情况下，上述接头区域(Ly)例如能够由上述式(I)表示，能够全部援引上述接头区域(Lx)中的上述式(I)的说明。
上述区域(Yc)和上述区域(Y)例如分别经由-OR1-或-OR2-与上述接头区域(Ly)结合。其中，R1和R2与上述的接头区域(Lx)同样，可以存在也可以不存在。
上述区域(Xc)和上述区域(X)、以及上述区域(Yc)和上述(Y)与上述-OR1-和-OR2-的结合的组合没有特别限制，可以列举例如以下的任意的条件。
条件(1)
上述区域(Xc)经由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域(X)经由-OR1-与上述式(I)的结构结合，
上述区域(Yc)经由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域(Y)经由-OR2-与上述式(I)的结构结合。
条件(2)
上述区域(Xc)经由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域(X)经由-OR1-与上述式(I)的结构结合，
上述区域(Yc)经由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域(Y)经由-OR1-与上述式(I)的结构结合。
条件(3)
上述区域(Xc)经由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域(X)经由-OR2-与上述式(I)的结构结合，
上述区域(Yc)经由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域(Y)经由-OR2-与上述式(I)的结构结合。
条件(4)
上述区域(Xc)经由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域(X)经由-OR2-与上述式(I)的结构结合，
上述区域(Yc)经由-OR2-，与上述式(I)的结构结合，上述区域(Y)经由-OR1-，与上述式(I)的结构结合。
根据图3的示意图说明关于上述第二ssPN分子具有上述接头区域(Ly)的ssPN分子的一例。图3的(A)是作为一例，表示关于上述ssPN分子，从5’侧至3’侧的各区域的顺序的概略的示意图，图3的(B)是表示上述ssPN分子在上述分子内形成了双链的状态的示意图。如图3的(B)所示，上述ssPN分子在上述区域(Xc)与上述区域(X)之间、上述区域(Y)与上述区域(Yc)之间，形成双链，上述Lx区域和上述Ly区域根据其长度取环结构。图3不过是表示各区域的连结顺序和形成双链的各区域的位置关系的图，例如各区域的长度、接头区域的形状等不限于此。另外，图3在5’侧表示了上述区域(Xc)，但不限于此，上述区域(Xc)也可以位于3’侧。
在上述第二ssPN分子中，上述区域(Xc)、上述区域(X)、上述区域(Y)和上述区域(Yc)的碱基数没有特别限制。以下例示各区域的长度，但本发明不限于此。
上述区域(Xc)例如可以与上述区域(X)的整个区域互补。该情况下，上述区域(Xc)例如为与上述区域(X)相同的碱基长度，优选由与上述区域(X)的整个区域互补的碱基序列构成。上述区域(Xc)更优选为与上述区域(X)相同的碱基长度，且上述区域(Xc)的全部碱基与上述区域(X)的全部碱基互补。此外，不限于此，例如1个或数个碱基可以为非互补的。
另外，上述区域(Xc)例如可以与上述区域(X)的部分区域互补。该情况下，上述区域(Xc)例如为与上述区域(X)的部分区域相同的碱基长度，即，优选由比上述区域(X)短1个碱基以上的碱基长的碱基序列构成。上述区域(Xc)更优选为与上述区域(X)的上述部分区域相同的碱基长度，且上述区域(Xc)的全部碱基与上述区域(X)的上述部分区域的全部碱基互补。上述区域(X)的上述部分区域例如优选为由从上述区域(X)中的上述区域(Xc)侧的末端的碱基(第1个碱基)连续的碱基序列构成的区域。
上述区域(Yc)例如可以与上述区域(Y)的整个区域互补。该情况下，上述区域(Yc)例如为与上述区域(Y)相同的碱基长度，优选由与上述区域(Y)的整个区域互补的碱基序列构成。上述区域(Yc)更优选为与上述区域(Y)相同的碱基长度，且上述区域(Yc)的全部碱基与上述区域(Y)的全部碱基互补。此外，不限于此，例如1个或数个碱基可以非互补。
另外，上述区域(Yc)例如可以与上述区域(Y)的部分区域互补。该情况下，上述区域(Yc)例如为与上述区域(Y)的部分区域相同的碱基长度，即优选由比上述区域(Y)短1个碱基以上的碱基长度的碱基序列构成。上述区域(Yc)更优选为与上述区域(Y)的上述部分区域相同的碱基长度，且上述区域(Yc)的全部碱基与上述区域(Y)的上述部分区域的全部碱基互补。上述区域(Y)的上述部分区域例如优选由从上述区域(Y)中的上述区域(Yc)侧的末端的碱基(第1个碱基)连续的碱基序列构成的区域。
在上述第二ssPN分子中，上述内部区域(Z)的碱基数(Z)与上述区域(X)的碱基数(X)和上述区域(Y)的碱基数(Y)的关系、上述内部区域(Z)的碱基数(Z)与上述区域(Xc)的碱基数(Xc)和上述区域(Yc)的碱基数(Yc)的关系例如满足下述式(1)和(2)的条件。
Z＝X+Y···(1)
Z≥Xc+Yc···(2)
在上述第二ssPN分子中，上述区域(X)的碱基数(X)与上述区域(Y)的碱基数(Y)的关系没有特别限制，例如满足下述式的任意条件。
X＝Y···(19)
X＜Y···(20)
X＞Y···(21)
在第二ssPN分子中，上述区域(X)的碱基数(X)、上述区域(Xc)的碱基数(Xc)、上述区域(Y)的碱基数(Y)和上述区域(Yc)的碱基数(Yc)的关系例如满足下述(a)～(d)的任意条件。
(a)满足下述式(3)和(4)的条件。
X＞Xc···(3)
Y＝Yc···(4)
(b)满足下述式(5)和(6)的条件。
X＝Xc···(5)
Y＞Yc···(6)
(c)满足下述式(7)和(8)的条件。
X＞Xc···(7)
Y＞Yc···(8)
(d)满足下述式(9)和(10)的条件。
X＝Xc···(9)
Y＝Yc···(10)
在上述(a)～(d)中，上述区域(X)的碱基数(X)与上述区域(Xc)的碱基数(Xc)的差、上述区域(Y)的碱基数(Y)与上述区域(Yc)的碱基数(Yc)的差优选例如满足下述条件。
(a)满足下述式(11)和(12)的条件。
X-Xc＝1～10、优选为1、2、3或4、
更优选为1、2或3···(11)
Y-Yc＝0···(12)
(b)满足下述式(13)和(14)的条件。
X-Xc＝0···(13)
Y-Yc＝1～10、优选为1、2、3或4、
更优选为1、2或3···(14)
(c)满足下述式(15)和(16)的条件。
X-Xc＝1～10、优选为1、2或3、
更优选为1或2···(15)
Y-Yc＝1～10、优选为1、2或3、
更优选为1或2···(16)
(d)满足下述式(17)和(18)的条件。
X-Xc＝0···(17)
Y-Yc＝0···(18)
关于上述(a)～(d)的第二ssPN分子根据图4的示意图说明各自的结构的一例。图4为包含上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)的ssPN的例子，(A)为上述(a)的ssPN分子的例子，(B)为上述(b)的ssPN分子的例子，(C)为上述(c)的ssPN分子的例子，(D)为上述(d)的ssPN分子的例子。在图4中，虚线表示通过自我退火形成了双链的状态。图4的ssPN分子将上述区域(X)的碱基数(X)和上述区域(Y)的碱基数(Y)表示为上述式(20)的“X＜Y”，但不限于此，可以为上述式(19)的“X＝Y”，也可以为上述式(21)的“X＞Y”。另外，图4不过是表示上述区域(X)与上述区域(Xc)的关系、上述区域(Y)与上述区域(Yc)的关系的示意图，例如各区域的长度、形状、接头区域(Ly)的有无等不限于此。
上述(a)～(c)的ssPN分子例如通过上述区域(Xc)与上述区域(X)、以及上述区域(Yc)与上述区域(Y)分别形成双链，在上述内部区域(Z)中，上述区域(Xc)和上述区域(Yc)的任意者都为具有不配对(alignment)的碱基的结构，也可以说是具有不形成双链的碱基的结构。在上述内部区域(Z)中，将上述不配对的碱基(也称为不形成双链的碱基)以下称为“游离碱基”。在图4中，将上述游离碱基的区域用“F”表示。上述区域(F)的碱基数没有特别限制。上述区域(F)的碱基数(F)例如在上述(a)的ssPN分子的情况下，为“X-Xc”的碱基数，在上述(b)的ssPN分子的情况下，为“Y-Yc”的碱基数，在上述(c)的ssPN分子的情况下，为“X-Xc”的碱基数和“Y-Yc”的碱基数的合计数。
另一方面，上述(d)的ssPN分子例如为上述内部区域(Z)的整个区域与上述区域(Xc)和上述区域(Yc)配对的结构，也可以说是上述内部区域(Z)的整个区域形成双链的结构。此外，在上述(d)的ssPN分子中，上述区域(Xc)的5’末端和上述区域(Yc)的3’末端没有连结。
上述区域(Xc)、上述区域(Yc)和上述内部区域(Z)中的上述游离碱基(F)的碱基数的合计为上述内部区域(Z)的碱基数。因此，上述区域(Xc)和上述区域(Yc)的长度例如可以根据上述内部区域(Z)的长度、上述游离碱基的数量及其位置适当确定。
上述内部区域(Z)的碱基数例如为19个碱基以上。上述碱基数的下限例如为19个碱基，优选为20个碱基，更优选为21个碱基。上述碱基数的上限例如为50个碱基，优选为40个碱基，更优选为30个碱基。上述内部区域(Z)的碱基数的具体例例如为19～50个碱基、20～40个碱基、21～30个碱基、21～25个碱基。
在上述内部区域(Z)包含上述表达抑制序列的情况下，上述内部区域(Z)例如可以为仅由上述表达抑制序列构成的区域，也可以为包含上述表达抑制序列的区域。上述表达抑制序列的碱基数例如为15～30个碱基，优选为19～25个碱基，更优选为19～23个碱基，更加优选为21、22、23个碱基，特别优选为23个碱基。在上述内部区域(Z)包含上述表达抑制序列的情况下，在上述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧可以进一步具有添加序列。上述添加序列的碱基数例如为1～31个碱基，优选为1～21个碱基，更优选为1～11个碱基，更加优选为1～7个碱基，进一步更加优选为1～3个碱基。
上述区域(Xc)的碱基数例如为1～49个碱基，优选为1～39个碱基，更优选为1～29个碱基。上述区域(Yc)的碱基数例如为1～49个碱基，优选为1～39个碱基，更优选为1～29个碱基。上述区域(Xc)和(Yc)的任意一方的碱基数优选为1～4个碱基，更加优选为1个碱基、2个碱基、3个碱基。
上述内部区域(Z)、上述区域(Xc)和上述区域(Yc)的碱基数例如能够表示为上述式(2)的“Z≥Xc+Yc”。作为具体例，“Xc+Yc”的碱基数例如与上述内部区域(Z)相同，或者比上述内部区域(Z)小。后者的情况下，“Z-(Xc+Yc)”例如为1～10，优选为1～4，更优选为1、2或3。上述“Z-(Xc+Yc)”例如相当于上述内部区域(Z)中的游离区域(F)的碱基数(F)。
在上述第二ssPN分子中，上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)的长度没有特别限制。上述接头区域(Lx)如上所述。在上述接头区域(Ly)的结构单元包含碱基的情况下，上述接头区域(Ly)的碱基数的下限例如为1个碱基，优选为2个碱基，更优选为3个碱基，其上限例如为100个碱基，优选为80个碱基，更优选为50个碱基。上述各接头区域的碱基数作为具体例，能够例示例如1～50个碱基、1～30个碱基、1～20个碱基、1～10个碱基、1～7个碱基、1～4个碱基等，但不限于此。上述接头区域(Ly)在其本身的区域内部中，优选为不产生自我退火的结构。
上述接头区域(Ly)例如可以与上述接头区域(Lx)相同，也可以不同。
上述第二ssPN分子的全长没有特别限制。在上述第二ssPN分子中，上述碱基数的合计(全长的碱基数)的下限例如为38个碱基，优选为42个碱基，更优选为44个碱基，更加优选为48个碱基，特别优选为50个碱基，其上限例如为300个碱基，优选为200个碱基，更优选为150个碱基，更加优选为100个碱基，特别优选为80个碱基。上述第二ssPN分子的全长的碱基数的合计的具体例为38～300个碱基、42～200个碱基、44～150个碱基、48～100个碱基、50～80个碱基。在上述第二ssPN分子中，除了上述接头区域(Lx)和接头区域(Ly)以外的碱基数的合计的下限例如为38个碱基，优选为42个碱基，更优选为44个碱基，更加优选为48个碱基，特别优选为50个碱基，上限例如为300个碱基，优选为200个碱基，更优选为150个碱基，更加优选为100个碱基，进一步更加优选为80个碱基，特别优选为60个碱基。除了上述接头区域(Lx)以外的碱基数的合计的具体例为38～300个碱基、42～200个碱基、44～150个碱基、48～100个碱基、48～80个碱基、50～60个碱基。
ssPN分子只要上述接头区域(Lx)具有上述非核苷酸结构即可，其它的结构单元没有特别限制。上述结构单元例如可以列举核苷酸残基等。上述核苷酸残基可以列举例如核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基等。上述核苷酸残基可以列举例如没有被修饰的非修饰核苷酸残基和被修饰的修饰核苷酸残基等。ssPN分子例如通过包含上述修饰核苷酸残基，能够提高核酸酶抗性，提高稳定性。另外，ssPN分子例如除了上述核苷酸残基以外，还可以包含非核苷酸残基。
上述区域(Xc)、上述区域(X)、上述区域(Y)和上述区域(Yc)的结构单元分别优选上述核苷酸残基。上述各区域例如由下述(1)～(3)的残基构成。
(1)非修饰核苷酸残基
(2)修饰核苷酸残基
(3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基
上述接头区域(Lx)例如可以仅由上述非核苷酸残基构成，也可以由上述非核苷酸和上述核苷酸残基构成。上述接头区域(Lx)例如由下述(4)～(7)的残基构成。
(4)非核苷酸残基
(5)非核苷酸残基和非修饰核苷酸残基
(6)非核苷酸残基和修饰核苷酸残基
(7)非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基
上述接头区域(Ly)的结构单元没有特别限制，可以列举例如上述核苷酸残基和上述非核苷酸残基等。上述接头区域例如可以仅由上述核苷酸残基构成，也可以仅由上述非核苷酸残基构成，还可以由上述核苷酸残基和上述非核苷酸残基构成。上述接头区域例如由下述(1)～(7)的残基构成。
(1)非修饰核苷酸残基
(2)修饰核苷酸残基
(3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基
(4)非核苷酸残基
(5)非核苷酸残基和非修饰核苷酸残基
(6)非核苷酸残基和修饰核苷酸残基
(7)非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基
ssPN分子例如可以列举除了上述接头区域(Lx)以外仅由上述核苷酸残基构成的分子、在上述核苷酸残基以外还包含上述非核苷酸残基的分子等。在ssPN分子中，上述核苷酸残基例如可以仅为上述非修饰核苷酸残基，也可以仅为上述修饰核苷酸残基，还可以为上述非修饰核苷酸残基和上述修饰核苷酸残基的两者。在上述ssPN分子包含上述非修饰核苷酸残基和上述修饰核苷酸残基的情况下，上述修饰核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“1个或数个”，具体为例如1～5个、优选为1～4个、更优选为1～3个、最优选为1或2个。在ssPN分子包含上述非核苷酸残基的情况下，上述非核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“1个或数个”，具体例如为1或2个。
在ssPN分子中，上述核苷酸残基例如优选核糖核苷酸残基。该情况下，本发明的ssPN分子例如也称为“P-ssRNA分子”。上述P-ssRNA分子可以列举例如除了上述接头区域(Lx)以外仅由上述核糖核苷酸残基构成的分子、在上述核糖核苷酸残基以外还包含上述非核苷酸残基的分子等。在上述P-ssRNA分子中，上述核糖核苷酸残基例如可以仅为上述非修饰核糖核苷酸残基，也可以仅为上述修饰核糖核苷酸残基，还可以包含上述非修饰核糖核苷酸残基和上述修饰核糖核苷酸残基的两者。
在上述P-ssRNA分子例如在上述非修饰核糖核苷酸残基以外还包含上述修饰核糖核苷酸残基的情况下，上述修饰核糖核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“1个或数个”，具体为例如1～5个、优选为1～4个、更优选为1～3个、最优选为1或2个。对应于上述非修饰核糖核苷酸残基的上述修饰核糖核苷酸残基例如可以列举核糖残基被取代为脱氧核糖残基的上述脱氧核糖核苷酸残基等。上述P-ssRNA分子在例如为在上述非修饰核糖核苷酸残基以外还包含上述脱氧核糖核苷酸残基的情况下，上述脱氧核糖核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“1个或数个”，具体为例如1～5个、优选为1～4个、更优选为1～3个、最优选为1或2个。
作为抑制NEK6基因的表达的优选的ssPN分子，能够举出如下的单链核酸分子，其包含选自序列编号1～5中的NEK6基因的表达抑制序列，从5’侧到3’侧依次包含区域(Xc)、接头区域(Lx)、区域(X)、区域(Y)、接头区域(Ly)和区域(Yc)，
上述区域(X)和上述区域(Y)连结，形成内部区域(Z)，
上述区域(Xc)与上述区域(X)互补，
上述区域(Yc)与上述区域(Y)互补，
且上述接头区域(Lx)和接头区域(Ly)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸结构，
上述内部区域(Z)包含上述表达抑制序列。
(4)ssNc分子
说明作为抑制NEK6基因的表达的核酸之一的ssNc分子。
ssNc分子是指WO2012/05368中公开的单链RNA核酸分子，具体如下所述，其特征在于：
ssNc分子为包含抑制靶标基因的表达的表达抑制序列的单链核酸分子，
从5’侧至3’侧依次包含5’侧区域(Xc)、内部区域(Z)和3’侧区域(Yc)，
上述内部区域(Z)是内部5’侧区域(X)和内部3’侧区域(Y)连结而构成的，
上述5’侧区域(Xc)与上述内部5’侧区域(X)互补，
上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)互补，
上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)的至少一个包含上述表达抑制序列。
ssNc分子的5’末端和3’末端没有连结，也可以称为线状单链核酸分子。本发明的ssNc分子例如在上述内部区域(Z)中，上述内部5’区域(X)和上述内部3’区域(Y)被直接连结。
在ssNc分子中，上述5’侧区域(Xc)与上述内部5’侧区域(X)互补，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)互补。因此，在5’侧，上述区域(Xc)向上述区域(X)折回，上述区域(Xc)和上述区域(X)通过自我退火能够形成双链，另外，在3’侧，上述区域(Yc)向上述区域(Y)折回，上述区域(Yc)和上述区域(Y)通过自我退火能够形成双链。
ssNc分子这样能够在分子内形成双链，例如与如现有的RNA干扰中使用的siRNA那样，通过分离的2条单链RNA退火而形成双链RNA的情况为明显不同的结构。
ssNc分子中的上述表达抑制序列能够援引ssPN分子的说明。
利用ssNc分子的NEK6基因的表达的抑制被推测是例如由于上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)的至少一个为配置了上述表达抑制序列的结构，而产生了RNA干扰或类似RNA干扰的现象(RNA干扰样的现象)的缘故。此外，ssNc分子的机理也不同样限定为ssPN分子的机理。ssNc分子例如如所谓的siRNA那样，并不是作为由两条单链RNA构成的dsRNA，导入细胞等，另外在细胞内，上述表达抑制序列的切出也不是必须的。因此，ssNc分子例如也能够具有RNA干扰样的功能。
在ssNc分子中，上述表达抑制序列包含在上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)的至少一个中。ssNc分子例如可以具有1个上述表达抑制序列，也可以具有2个以上上述表达抑制序列。后者的情况下，ssNc分子例如可以具有2个以上相对于NEK6基因相同的表达抑制序列，也可以具有2个以上相对于NEK6基因不同的表达抑制序列。在ssNc分子具有2个以上的上述表达抑制序列的情况下，各表达抑制序列的配置位置没有特别限制，可以是上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)的任意一个区域，也可以是不同的区域。
上述内部区域(Z)与上述内部5’区域(X)和上述内部3’区域(Y)连结。上述区域(X)和上述区域(Y)例如直接被连结，在其间可以不具有间插序列。上述内部区域(Z)为了表示上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)的序列关系，表示为“上述内部5’侧区域(X)与上述内部3’侧区域(Y)连结而构成”，在上述内部区域(Z)中，上述内部5’侧区域(X)和上述内部3’侧区域(Y)例如在上述ssNc分子的使用中，并不限定为个别的独立区域。即，例如在上述内部区域(Z)具有上述表达抑制序列的情况下，在上述内部区域(Z)中，可以遍及上述区域(X)和上述区域(Y)，配置有上述表达抑制序列。
在ssNc分子中，上述5’侧区域(Xc)与上述内部5’侧区域(X)互补。其中，上述区域(Xc)只要具有相对于上述区域(X)的整个区域或其部分区域互补的序列即可，具体优选例如包含与上述区域(X)的整个区域或其部分区域互补的序列，或者由上述互补的序列构成。上述区域(Xc)相对于上述区域(X)的互补的上述整个区域或互补的上述部分区域，例如可以完全互补，也可以1个或数个碱基为非互补的，但优选为互补的。在ssNc分子中，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)互补。其中，上述区域(Yc)只要具有与上述区域(Y)的整个区域或其部分区域互补的序列即可，具体优选例如包含相对于上述区域(Y)的整个区域或其部分区域互补的序列，或者由上述互补的序列构成。上述区域(Yc)相对于上述区域(Y)的互补的上述整个区域或互补的上述部分区域，例如可以完全互补，也可以1个或数个碱基为非互补的，但优选为互补的。上述1个碱基或数个碱基例如为1～3个碱基，优选为1个碱基或2个碱基。
在ssNc分子中，上述5’侧区域(Xc)和上述内部5’侧区域(X)例如可以直接连结，也可以间接地连结。前者的情况下，直接的连结例如可以列举利用磷酸二酯键的连结。后者的情况下，例如可以列举在上述区域(Xc)与上述区域(X)之间，具有接头区域(Lx)，经由上述接头区域(Lx)，上述区域(Xc)与上述区域(X)连结的形态。
在ssNc分子中，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)例如可以直接连结，也可以间接地连结。前者的情况下，直接的连结例如可以列举利用磷酸二酯键的连结。后者的情况下，例如可以列举在上述区域(Yc)与上述区域(Y)之间，具有接头区域(Ly)，经由上述接头区域(Ly)，上述区域(Yc)与上述区域(Y)连结的形态。
ssNc分子例如可以具有上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)的两者，也可以具有任意一者。作为后者的情况，可以列举在上述5’侧区域(Xc)与上述内部5’侧区域(X)之间具有上述接头区域(Lx)，在上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)之间不具有上述接头区域(Ly)，即，上述区域(Yc)和上述区域(Y)直接连结的形态。另外，作为后者的情况，可以列举在上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)之间具有上述接头区域(Ly)，在上述5’侧区域(Xc)与上述内部5’侧区域(X)之间不具有上述接头区域(Lx)，即，上述区域(Xc)与上述区域(X)直接连结的形态。
上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)优选分别为在其本身的区域内部中，不产生自我退火的结构。
关于ssNc分子，按照图5的示意图说明不具有上述接头区域的ssNc分子的一例。图5的(A)是对于上述ssNc分子表示从5’侧向3’侧的各区域的顺序的概略的示意图，图5的(B)是表示上述ssNc分子在上述分子内形成了双链的状态的示意图。如图5的(B)所示，上述ssNc分子的上述5’侧区域(Xc)折回，在上述5’侧区域(Xc)与上述内部5’侧区域(X)之间形成双链，上述3’侧区域(Yc)折回，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)之间形成双链。图5仅仅是表示各区域的连结顺序和形成双链的各区域的位置关系的图，例如各区域的长度等不限于此。
关于ssNc分子，按照图3的示意图说明具有上述接头区域的ssNc分子的一例。图3的(A)是作为一例，关于上述ssNc分子表示从5’侧向3’侧的各区域的顺序的概略的示意图，图3的(B)为表示上述ssNc分子在上述分子内形成了双链的状态的示意图。如图3的(B)所示，上述ssNc分子在上述5’侧区域(Xc)与上述内部5’侧区域(X)之间、上述内部3’侧区域(Y)与上述3’侧区域(Yc)之间，形成双链，上述Lx区域和上述Ly区域呈环结构。图3仅仅是表示各区域的连结顺序和形成双链的各区域的位置关系的图，例如各区域的长度等不限于此。
在ssNc分子中，上述5’侧区域(Xc)、上述内部5’侧区域(X)、上述内部3’侧区域(Y)和上述3’侧区域(Yc)的碱基数没有特别限制，例如如下所述。
上述5’侧区域(Xc)例如与上述内部5’侧区域(X)的整个区域互补。该情况下，上述区域(Xc)例如为与上述区域(X)相同的碱基长度，优选由与从上述区域(X)的5’末端至3’末端的整个区域互补的碱基序列构成。上述区域(Xc)更优选为与上述区域(X)相同的碱基长度，且优选上述区域(Xc)的全部碱基与上述区域(X)的全部碱基互补。此外，不限于此，例如1个或数个碱基可以为非互补的。
另外，上述5’侧区域(Xc)例如可以与上述内部5’侧区域(X)的部分区域互补。在该情况下，上述区域(Xc)例如为与上述区域(X)的部分区域相同的碱基长度，即优选由比上述区域(X)短1个碱基以上的碱基长度的碱基序列构成。上述区域(Xc)更优选为与上述区域(X)的上述部分区域相同的碱基长度，且优选上述区域(Xc)的全部碱基与上述区域(X)的上述部分区域的全部碱基互补。上述区域(X)的上述部分区域优选例如为由上述区域(X)中从5’末端的碱基(第1位的碱基)连续的碱基序列构成的区域(区段)。
上述3’侧区域(Yc)例如可以与上述内部3’侧区域(Y)的整个区域互补。该情况下，上述区域(Yc)例如为与上述区域(Y)相同的碱基长度，优选由与上述区域(Y)的5’末端到3’末端的整个区域互补的碱基序列构成。上述区域(Yc)更优选为与上述区域(Y)相同的碱基长度，且优选上述区域(Yc)的全部碱基与上述区域(Y)的全部碱基互补。此外，不限于此，例如1个或数个碱基可以为非互补的。
另外，上述3’侧区域(Yc)例如可以与上述内部3’侧区域(Y)的部分区域互补。该情况下，上述区域(Yc)例如为与上述区域(Y)的部分区域相同的碱基长度，即优选由比上述区域(Y)短1个碱基以上的碱基长度的碱基序列构成。上述区域(Yc)更优选为与上述区域(Y)的上述部分区域相同的碱基长度，且优选上述区域(Yc)的全部碱基与上述区域(Y)的上述部分区域的全部碱基互补。上述区域(Y)的上述部分区域优选为例如由上述区域(Y)中从3’末端的碱基(第1位的碱基)连续的碱基序列构成的区域(区段)。
在ssNc分子中，上述内部区域(Z)的碱基数(Z)与上述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)和上述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)的关系、上述内部区域(Z)的碱基数(Z)与上述内部5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)和上述5’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)的关系例如满足下述式(1)和(2)的条件。
Z＝X+Y···(1)
Z≥Xc+Yc···(2)
在ssNc分子中，上述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)与上述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)的长度的关系没有特别限制，例如可以满足下述式的任意条件。
X＝Y···(19)
X＜Y···(20)
X＞Y···(21)
在ssNc分子中，上述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)、上述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)、上述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)和上述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)的关系例如满足下述(a)～(d)的任意条件。
(a)满足下述式(3)和(4)的条件。
X＞Xc···(3)
Y＝Yc···(4)
(b)满足下述式(5)和(6)的条件。
X＝Xc···(5)
Y＞Yc···(6)
(c)满足下述式(7)和(8)的条件。
X＞Xc···(7)
Y＞Yc···(8)
(d)满足下述式(9)和(10)的条件。
X＝Xc···(9)
Y＝Yc···(10)
在上述(a)～(d)中，上述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)与上述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)的差、上述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)与上述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)的差例如优选满足下述条件。
(a)满足下述式(11)和(12)的条件。
X-Xc＝1～10、优选为1、2、3或4、
更优选为1、2或3···(11)
Y-Yc＝0···(12)
(b)满足下述式(13)和(14)的条件。
X-Xc＝0···(13)
Y-Yc＝1～10、优选为1、2、3或4、
更优选为1、2或3···(14)
(c)满足下述式(15)和(16)的条件。
X-Xc＝1～10、优选为1、2或3、
更优选为1或2···(15)
Y-Yc＝1～10、优选为1、2或3、
更优选为1或2···(16)
(d)满足下述式(17)和(18)的条件。
X-Xc＝0···(17)
Y-Yc＝0···(18)
按照图4的示意图说明上述(a)～(d)的ssNc分子各自的结构的一例。图4为包含上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)的ssNc的例子，(A)为上述(a)的ssNc分子的例子，(B)为上述(b)的ssNc分子的例子，(C)为上述(c)的ssNc分子的例子，(D)为上述(d)的ssNc分子的例子。在图4中，虚线表示通过自我退火形成了双链的状态。图4的ssNc分子将上述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)和上述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)表示为上述式(20)的“X＜Y”，但不限于此，可以是上述式(19)的“X＝Y”，也可以是上述式(21)的“X＞Y”。另外，图4仅仅是表示上述内部5’侧区域(X)与上述5’侧区域(Xc)的关系、上述内部3’侧区域(Y)与上述3’侧区域(Yc)的关系的示意图，例如各区域的长度、形状等不限于此，另外，接头区域(Lx)和接头区域(Ly)的有无也不限于此。
上述(a)～(c)的ssNc分子例如通过上述5’侧区域(Xc)与上述内部5’侧区域(X)、以及上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)分别形成双链，在上述内部区域(Z)中，为上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)都具有不能配对的碱基的结构，也可以说是具有不形成双链的碱基的结构。在上述内部区域(Z)中，将上述不能配对的碱基(也称为不形成双链的碱基)以下称为“游离碱基”。在图4中，将上述游离碱基的区域用“F”表示。上述区域(F)的碱基数没有特别限制。上述区域(F)的碱基数(F)例如在上述(a)的ssNc分子的情况下，为“X-Xc”的碱基数，在上述(b)的ssNc分子的情况下，为“Y-Yc”的碱基数，在上述(c)的ssNc分子的情况下，为“X-Xc”的碱基数与“Y-Yc”的碱基数的合计数。
另一方面，上述(d)的ssNc分子例如为上述内部区域(Z)的整个区域与上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)配对的结构，也可以称为上述内部区域(Z)的整个区域形成双链的结构。此外，在上述(d)的ssNc分子中，上述5’侧区域(Xc)的5’末端与上述3’侧区域(Yc)的3’末端未连结。
上述5’侧区域(Xc)、上述3’侧区域(Yc)、和上述内部区域(Z)中的上述游离碱基(F)的碱基数的合计例如成为上述内部区域(Z)的碱基数。因此，上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)的长度能够根据例如上述内部区域(Z)的长度、上述游离碱基的数(F)及其位置适当确定。
上述内部区域(Z)的碱基数例如为19个碱基以上。上述碱基数的下限例如为19个碱基，优选为20个碱基，更优选为21个碱基。上述碱基数的上限例如为50个碱基，优选为40个碱基，更优选为30个碱基。上述内部区域(Z)的碱基数的具体例例如为19～50个碱基、20～40个碱基、21～30个碱基、21～23个碱基。
在上述内部区域(Z)包含上述表达抑制序列的情况下，上述内部区域(Z)可以为例如仅由上述表达抑制序列构成的区域，也可以是包含上述表达抑制序列的区域。上述表达抑制序列的碱基数例如为15～30个碱基，优选为19～25个碱基，更优选为19～23个碱基，更加优选为21、22、23个碱基，特别优选为23个碱基。在上述内部区域(Z)包含上述表达抑制序列的情况下，在上述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧还可以具有添加序列。上述添加序列的碱基数例如为1～31个碱基，优选为1～21个碱基，更优选为1～11个碱基，更加优选为1～7个碱基，进一步更加优选为1～3个碱基。
上述5’侧区域(Xc)的碱基数例如为1～49个碱基，优选为1～39个碱基，更优选为1～29个碱基。上述3’侧区域(Yc)的碱基数例如为1～49个碱基，优选为1～39个碱基，更优选为1～29个碱基。上述5’侧区域(Xc)和3’侧区域(Yc)的任意一方的碱基数优选为1～4个碱基，更加优选为1个碱基、2个碱基、3个碱基。
上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)的碱基数例如能够由上述式(2)的“Z≥Xc+Yc”表示。作为具体例，“Xc+Yc”的碱基数例如与上述内部区域(Z)相同，或者比上述内部区域(Z)小。后者的情况下，“Z-(Xc+Yc)”例如为1～10、优选为1～4、更优选为1、2或3。上述“Z-(Xc+Yc)”例如相当于上述内部区域(Z)中上述游离碱基的区域(F)的碱基数(F)。
在ssNc分子中，上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)的长度没有特别限制。上述接头区域(Lx)例如优选为上述内部5’侧区域(X)与上述5’侧区域(Xc)能够形成双链的长度，上述接头区域(Ly)例如优选为上述内部3’侧区域(Y)与上述3’侧区域(Yc)能够形成双链的长度。在上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)的结构单元包含碱基的情况下，上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)各自的碱基数既可以相同也可以不同，另外，其碱基序列也是既可以相同也可以不同。上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)的碱基数的下限例如为1个碱基，优选为2个碱基，更优选为3个碱基，其上限例如为100个碱基，优选为80个碱基，更优选为50个碱基。上述各接头区域的碱基数作为具体例，能够例示例如1～50个碱基、1～30个碱基、1～20个碱基、1～10个碱基、1～7个碱基、1～4碱基等，但不限于此。
ssNc分子的全长没有特别限制。在本发明的ssNc分子中，上述碱基数的合计(全长的碱基数)的下限例如为38个碱基，优选为42个碱基，更优选为50个碱基，更加优选为51个碱基，特别优选为52个碱基，其上限例如为300个碱基，优选为200个碱基，更优选为150个碱基，更加优选为100个碱基，进一步更加优选为80个碱基，特别优选为60个碱基。上述ssNc分子的全长的碱基数的合计的具体例为38～300个碱基、42～200个碱基、50～150个碱基、51～100个碱基、52～80个碱基。在ssNc分子中，除了上述接头区域(Lx)和接头区域(Ly)以外的碱基数的合计的下限例如为38个碱基，优选为42个碱基，更优选为50个碱基，更加优选为51个碱基，特别优选为52个碱基，上限例如为300个碱基，优选为200个碱基，更优选为150个碱基，更加优选为100个碱基，进一步更加优选为80个碱基，特别优选为60个碱基。除了上述接头区域(Lx)以外的碱基数的合计的具体例为38～300个碱基、42～200个碱基、50～150个碱基、51～100个碱基、52～80个碱基、52～60个碱基。
作为ssNc分子的主要结构单元的上述核苷酸残基例如可以列举核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。上述核苷酸残基例如可以列举没有被修饰的非修饰核苷酸残基和修饰后的修饰核苷酸残基。ssNc分子例如通过包含上述修饰核苷酸残基，能够提高核酸酶抗性，提高稳定性。另外，本发明的ssNc分子例如除了上述核苷酸残基以外，还可以包含非核苷酸残基。
在ssNc分子中，上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xc)和上述3’侧区域(Yc)的结构单元分别优选上述核苷酸残基。上述各区域例如由下述(1)～(3)的残基构成。
(1)非修饰核苷酸残基
(2)修饰核苷酸残基
(3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基
在ssNc分子中，上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)的结构单元没有特别限制，例如可以列举上述核苷酸残基和上述非核苷酸残基。上述接头区域例如可以仅由上述核苷酸残基构成，也可以仅由上述非核苷酸残基构成，还可以由上述核苷酸残基和上述非核苷酸残基构成。上述接头区域例如由下述(1)～(7)的残基构成。
(1)非修饰核苷酸残基
(2)修饰核苷酸残基
(3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基
(4)非核苷酸残基
(5)非核苷酸残基和非修饰核苷酸残基
(6)非核苷酸残基和修饰核苷酸残基
(7)非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基
在ssNc分子具有上述接头区域(Lx)和上述接头区域(Ly)的两者的情况下，例如两者的结构单元可以相同，也可以不同。作为具体例，例如可以列举两者的接头区域的结构单元为上述核苷酸残基的形态、两者的接头区域的结构单元为上述非核苷酸残基的形态、一个区域的结构单元为上述核苷酸残基而另一个接头区域的结构单元为非核苷酸残基的形态等。
ssNc分子例如可以列举仅由上述核苷酸残基构成的分子、除了上述核苷酸残基以外还包含上述非核苷酸残基的分子等。在本发明的ssNc分子中，上述核苷酸残基例如可以仅为上述非修饰核苷酸残基，也可以仅为上述修饰核苷酸残基，还可以是上述非修饰核苷酸残基和上述修饰核苷酸残基的两者。在上述ssNc分子包含上述非修饰核苷酸残基和上述修饰核苷酸残基的情况下，上述修饰核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“1个或数个”，具体为例如1～5个、优选为1～4个、更优选为1～3个、最优选为1或2个。在ssNc分子包含上述非核苷酸残基的情况下，上述非核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“1个或数个”，具体为例如1～8个、1～6个、1～4个、1、2或3个。
在ssNc分子中，上述核苷酸残基例如优选核糖核苷酸残基。在该情况下，本发明的ssNc分子例如可以称为“N-ssRNA分子”。上述N-ssRNA分子例如可以列举仅由上述核糖核苷酸残基构成的分子、除了上述核糖核苷酸残基以外还包含上述非核苷酸残基的分子。在上述N-ssRNA分子中，上述核糖核苷酸残基例如可以仅为上述非修饰核糖核苷酸残基，也可以仅为上述修饰核糖核苷酸残基，还可以包含上述非修饰核糖核苷酸残基和上述修饰核糖核苷酸残基的两者。
上述N-ssRNA分子例如在除了上述非修饰核糖核苷酸残基以外还包含上述修饰核糖核苷酸残基的情况下，上述修饰核糖核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“1个或数个”，具体为例如1～5个、优选为1～4个、更优选为1～3个、最优选为1或2个。对应于上述非修饰核糖核苷酸残基的上述修饰核糖核苷酸残基例如可以为核糖残基被取代为脱氧核糖残基的上述脱氧核糖核苷酸残基。上述N-ssRNA分子例如在除了上述非修饰核糖核苷酸残基以外还包含上述脱氧核糖核苷酸残基的情况下，上述脱氧核糖核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“1个或数个”，具体为例如1～5个、优选为1～4个、更优选为1～3个、最优选为1或2个。
(5)ssPN分子和ssNc分子的合成方法
ssPN分子和ssNc分子的合成方法没有特别限制，能够采用现有公知的方法。上述合成方法例如可以列举利用基因工程学方法的合成法、化学合成法等。基因工程学方法例如可以列举体外转录合成法、使用载体的方法、利用PCR盒(Cassette)的方法等。上述载体没有特别限制，可以列举质粒等的非病毒载体、病毒载体等。上述化学合成法没有特别限制，例如可以列举亚磷酰胺法和H-膦酸酯法等。上述化学合成法例如能够使用市售的自动核酸合成机。上述化学合成法通常使用亚酰胺(Amidite)。上述亚酰胺没有特别限制，作为市售的亚酰胺，例如可以列举RNA亚磷酰胺(RNA Phosphoramidites)(2’-O-TBDMSi、商品名、三千里制药)、ACE亚酰胺、TOM亚酰胺、CEE亚酰胺、CEM亚酰胺、TEM亚酰胺等。另外，本发明的ssPN分子和ssNc分子能够根据WO2012/05368、WO2012/17919、WO2013/27843、WO2016/159374中记载的制造方法制造。
(6)反义多聚核苷酸
以下对作为抑制NEK6基因的表达的核酸之一的反义多聚核苷酸进行说明。
反义多聚核苷酸为反义DNA和/或反义RNA，通过将相对于作为靶标的基因RNA的全长或一部分的反义核酸导入细胞内而发挥效果。
作为反义多聚核苷酸的表达抑制的机理，可以列举：
1)将从mRNA的5’帽子部位到起始密码子的约25个碱基下游的区域作为靶标序列的翻译起始复合体的立体位阻、
2)为与靶标mRNA互补的单链DNA，经由RNaseH的mRNA分解、
3)以pre-mRNA的外显子与内含子的边界区域作为靶标序列的剪接抑制(mRNA的成熟抑制)，
但只要为抑制NEK6基因的表达，则其机理就没有特别限制。
反义多聚核苷酸从与RNA的结合稳定性(Tm值等)、错配序列识别能力、核酸酶抗性、RNaseH活性等方面考虑，优选包含修饰核苷酸残基。
作为修饰核苷酸残基，优选对核糖残基、磷酸骨架的修饰。
(7)miRNA
以下说明作为抑制NEK6基因的表达的核酸之一的miRNA。
miRNA通过从mRNA到蛋白质的翻译抑制或mRNA的分解，参与基因的表达调节。miRNA为存在于细胞内的短链(20-25个碱基)的非编码RNA。miRNA首先从DNA，作为包含miRNA及其互补链的且能够呈发卡环结构的单链的pri-RNA转录。然后，pri-RNA通过位于细胞核内的被称为Drosha的酶被局部切断成为pre-RNA被输送到细胞核外。然后，pre-RNA进而被Dicer切断，而作为miRNA发挥功能。miRNA对mRNA的3’非翻译区域进行不完全的杂交结合，抑制该mRNA所编码的蛋白质合成。
抑制NEK6的基因表达的miRNA能够根据靶标基因的基因名称或mRNA序列信息，例如按照miRDB(http：//mirdb.org/miRDB/index.html)等的数据库得到。
(8)核酸所使用的核苷酸残基
作为本发明的有效成分的核酸所使用的核苷酸残基作为构成要素包含糖、碱基和磷酸。上述核苷酸残基例如可以列举核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基等。上述核糖核苷酸残基例如作为糖具有核糖残基，作为碱基，具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)，上述脱氧核糖残基例如作为糖具有脱氧核糖残基，作为碱基，具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。
上述核苷酸残基可以列举非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基等。上述非修饰核苷酸残基的上述各构成要素例如可以与天然存在的各构成要素相同或实质上相同，优选为与在人体中天然存在的各构成要素相同或实质上相同。
上述修饰核苷酸残基例如为修饰了上述非修饰核苷酸残基的核苷酸残基。上述修饰核苷酸例如上述非修饰核苷酸残基的构成要素的任意一种被修饰。在本发明中，“修饰”例如为上述构成要素的取代、添加和/或缺失、上述构成要素中的原子和/或官能团的取代、添加和/或缺失，也可以被称为“改变”。上述修饰核苷酸残基例如可以列举天然存在的核苷酸残基、人工修饰的核苷酸残基等。上述天然来源的修饰核苷酸残基例如能够参照Limbach等(Limbach et al.1994,Summary:the modified nucleosides of RNA,Nucleic AcidsRes.22:2183～2196)。另外，上述修饰核苷酸残基例如可以为上述核苷酸的代替物的残基。
上述核苷酸残基的修饰例如可以列举核糖-磷酸骨架(以下、核糖磷酸骨架)的修饰等。
在上述核糖磷酸骨架中，例如能够修饰核糖残基。上述核糖残基例如能够修饰2’位碳，具体例如能够将结合于2’位碳的羟基取代为氢或氟等。通过将上述2’位碳的羟基取代为氢，能够将核糖残基取代成脱氧核糖。上述核糖残基例如能够取代为立体异构体，例如可以被阿拉伯糖残基取代。
上述核糖磷酸骨架例如可以被具有非核糖残基和/或非磷酸的非核糖磷酸骨架取代。上述非核糖磷酸骨架例如可以列举上述核糖磷酸骨架的非带电体等。被上述非核糖磷酸骨架取代的上述核苷酸的代替物例如可以列举吗啉基、环丁基、吡咯烷等。上述代替物除此以外例如还可以列举人工核酸单体残基等。作为具体例，例如可以列举PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸(Locked Nucleic Acid))、ENA(2’-O,4’-C-亚乙基桥连核酸(2’-O,4’-C-Ethylenebridged Nucleic Acids))等，优选为PNA。
在上述核糖磷酸骨架中，例如能够修饰磷酸基。在上述核糖磷酸骨架中，最靠近糖残基的磷酸基被称为α磷酸基。上述α磷酸基带负电，其电荷均匀地分布于不与糖残基结合的2个氧原子。上述α磷酸基的4个氧原子中，在核苷酸残基间的磷酸二酯键中，不与糖残基结合的2个氧原子以下也称为“非结合(non-linking)氧”。另一方面，在上述核苷酸残基间的磷酸二酯键中，与糖残基结合的2个氧原子以下称为“结合(linking)氧”。上述α磷酸基例如优选进行成为非带电的修饰、或者上述非结合原子的电荷分布成为非对称型的修饰。
上述磷酸基例如可以取代上述非结合氧。上述氧例如能够由S(硫)、Se(硒)、B(硼)、C(碳)、H(氢)、N(氮)和OR(R例如为烷基或芳基)的任意原子取代，优选为由S取代。上述非结合氧例如优选为两者被取代，更优选为两者被S取代。上述修饰磷酸基例如可以列举硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、膦酸氢盐、胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯、和磷酸三酯等，其中，优选上述2个非结合氧两者均被S取代的二硫代磷酸酯。
上述磷酸基例如可以取代上述结合氧。上述氧例如能够由S(硫)、C(碳)和N(氮)的任一原子取代。上述修饰磷酸基例如可以列举由N取代后的交联胺基磷酸酯、由S取代后的交联硫代磷酸酯和由C取代后的交联亚甲基膦酸酯等。上述结合氧的取代例如优选在本发明的ssPN分子的5’末端核苷酸残基和3’末端核苷酸残基的至少一者进行，在5’侧的情况下，优选利用C的取代，在3’侧的情况下，优选利用N的取代。
上述磷酸基例如可以取代为上述不含磷的接头。上述接头例如包括：硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫醇缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基腙、亚甲基二甲基腙、和亚甲基氧基甲基亚氨基等，优选包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
上述末端的核苷酸残基的修饰例如可以列举添加其它分子等。上述其它分子例如可以列举如上所述的标记物质、保护基等的功能性分子等。上述保护基例如可以列举S(硫)、Si(硅)、B(硼)、含酯基等。
上述其它分子例如可以添加到上述核苷酸残基的磷酸基中，也可以经由间隔基，添加到上述磷酸基或上述糖残基上。上述间隔基的末端原子例如能够在上述磷酸基的上述结合氧、或糖残基的O、N、S或C上进行添加或取代。上述糖残基的结合部位例如优选3’位的C或5’位的C、或者与它们结合的原子。上述间隔基例如也能够在上述PNA等的核苷酸代替物的末端原子进行添加或取代。
上述间隔基没有特别限制，例如可以含有-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、无碱基糖、酰胺、羧基、胺、氧基胺、氧基亚胺、硫醚、二硫醚、硫脲、磺酰胺和吗啉基等、以及生物素试剂和荧光素试剂等。在上述式中，n为正整数，优选n＝3或6。
添加到上述末端的分子除了这些以外，还可以列举例如色素、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、特沙弗林(Texaphyrin)、Sapphirin)、多环式芳香族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲油性载体(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、龙脑、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪)和肽复合体(例如，触角肽(antennapedia)、Tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射线标记标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、输送/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑复合体、四氮杂大环的Eu3+复合体)等。
核酸分子上述5’末端例如可以被磷酸基或磷酸基类似物修饰。上述磷酸基例如可以列举5’一磷酸((HO)2(O)P-O-5’)、5’二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’-腺苷帽(Appp)、任意的修饰或非修饰核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’一硫代磷酸(硫代磷酸酯：(HO)2(S)P-O-5’)、5’一二硫代磷酸(二硫代磷酸酯：(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-硫磷酸((HO)2(O)P-S-5’)、硫取代的一磷酸、二磷酸和三磷酸(例如，5’-α-硫代三磷酸、5’-γ-硫代三磷酸等)、5’-胺基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)、5’-烷基膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、R可以列举烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、丙基等))、5’-烷基醚膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5’，R可以列举烷基醚(例如甲氧基甲基、乙氧基甲基等))等。
在上述核苷酸残基中，上述碱基没有特别限制。上述碱基例如既可以为天然的碱基，也可以为非天然的碱基。上述碱基例如可以天然来源，也可以为合成品。上述碱基例如能够使用通常的碱基、其修饰类似物等。
上述碱基例如可以列举腺嘌呤和鸟嘌呤等的嘌呤碱基、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等的嘧啶碱基等。上述碱基除此以外还可以列举肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟嘌呤核苷(isoguanisine)、杀结核菌素(tubercidine)等。上述碱基例如可以列举2-氨基腺嘌呤、6-甲基化嘌呤等的烷基衍生物；2-丙基化嘌呤等的烷基衍生物；5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-氮杂尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(伪尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶；8-卤化、氨基化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化和其它的8-取代嘌呤；5-三氟甲基化和其它的5-取代嘧啶；7-甲基鸟嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮杂嘧啶；N-2、N-6、和O-6取代嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；二氢尿嘧啶；3-去氮杂-5-氮杂胞嘧啶；2-氨基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷基鸟嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-去氮杂腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；5-氨基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代1,2,4-三唑；2-吡啶酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧基乙酸；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙酰基胞嘧啶；2-硫胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-异戊基腺嘌呤；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤；N-甲基鸟嘌呤；O-烷基化碱基等。另外，嘌呤和嘧啶例如美国专利第3687808号,“Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering”,858～859页,Kroschwitz J.I.编,John Wiley&Sons,1990、和Englisch等,AngewandteChemie,International Edition,1991,30卷,p.613中公开的物质。
(9)其它术语的定义
作为本发明的有效成分的核酸、接头等的说明中使用的术语为该技术领域中通常使用的术语，例如能够表示如下。
在本发明中，“烷基”例如包括直链状或支链状的烷基。上述烷基的碳原子数没有特别限制，例如为1～30，优选为1～6或1～4。上述烷基例如可以列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。优选为例如列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基等。
在本发明中，“烯基”例如包括直链状或支链状的烯基。上述烯基可以列举在上述烷基中具有1个或多个双键的基团等。上述烯基的碳原子数没有特别限制，例如与上述烷基相同，优选为2～8。上述烯基例如可以列举乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯即、3-甲基-2-丁烯基等。
在本发明中，“炔基”例如包括直链状或支链状的炔基。上述炔基可以列举在上述烷基中具有1个或多个三键的基团等。上述炔基的碳原子数没有特别限制，例如与上述烷基相同，优选为2～8。上述炔基例如可以列举乙炔基、丙炔基、丁炔基等。上述炔基例如还可以具有1个或多个双键。
在本发明中，“芳基”例如包括单环芳香族烃基和多环芳香族烃基。上述单环芳香族烃基例如可以列举苯基等。上述多环芳香族烃基例如可以列举：1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基、9-菲基等。优选为例如列举苯基、1-萘基和2-萘基等的萘基等。
在本发明中，“杂芳基”例如包括单环芳香族杂环式基和缩合芳香族杂环式基。上述杂芳基例如可以列举呋喃基(例：2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(例：2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(例：1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(例：1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(例：1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三唑基(例：1,2,4-三唑-1-基、1,2,4-三唑-3-基、1,2,4-三唑-4-基)、四唑基(例：1-四唑基、2-四唑基、5-四唑基)、噁唑基(例：2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、异噁唑基(例：3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噻唑基(例：2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻二唑基、异噻唑基(例：3-异噻唑基、4-异噻唑基、5-异噻唑基)、吡啶基(例：2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、哒嗪基(例：3-哒嗪基、4-哒嗪基)、嘧啶基(例：2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋咱基(例：3-呋咱基)、吡嗪基(例：2-吡嗪基)、噁二唑基(例：1,3,4-噁二唑-2-基)、苯并呋喃基(例：2-苯并[b]呋喃基、-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(例：2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、苯并咪唑基(例：1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、二苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹喔啉基(例：2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、6-喹喔啉基)、噌啉基(例：3-噌啉基、4-噌啉基、5-噌啉基、6-噌啉基、7-噌啉基、8-噌啉基)、喹唑啉基(例：2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(例：2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、酞嗪基(例：1-酞嗪基、5-酞嗪基、6-酞嗪基)、异喹啉基(例：1-异喹啉基、3-异喹啉基、4-异喹啉基、5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、嘌呤基、喋啶基(例：2-喋啶基、4-喋啶基、6-喋啶基、7-喋啶基)、咔唑基、菲啶基、吖啶基(例：1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(例：1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、异吲哚基、吩嗪基(例：1-吩嗪基、2-吩嗪基)或吩噻嗪基(例：1-吩噻嗪基、2-吩噻嗪基、3-吩噻嗪基、4-吩噻嗪基)等。
在本发明中，“环烷基”例如为环状饱和烃基，碳原子数例如为3～15。上述环烷基例如可以列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、桥连环式烃基、螺环烃基等，优选列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基、桥连环式烃基等。
在本发明中，“桥连环式烃基”例如可以列举双环[2.1.0]戊基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.2]辛基和双环[3.2.1]辛基、三环[2.2.1.0]庚基、双环[3.3.1]壬基、1-金刚烷基、2-金刚烷基等。
在本发明中，“螺环烃基”例如可以列举螺[3.4]辛基等。
在本发明中，“环烯基”例如包含环状的不饱和脂肪族烃基，碳原子数例如为3～7个。上述基团例如为环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基等，优选为环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。上述环烯基例如还包含在环中具有不饱和键的桥连环式烃基和螺环烃基。
在本发明中，“芳基烷基”例如可以列举苄基、2-苯乙基、和萘基甲基等，“环烷基烷基”或“环基烷基”例如可以列举环己基甲基、金刚烷基甲基等，“羟基烷基”例如可以列举羟基甲基和2-羟基乙基等。
在本发明中，“烷氧基”例如包含上述烷基-O-基，例如可以列举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、和正丁氧基等，“烷氧基烷基”例如可以列举甲氧基甲基等，“氨基烷基”例如可以列举2-氨基乙基等。
在本发明中，“杂环基”例如可以列举1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、吡咯烷酮、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、咪唑啉酮、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、哌啶酮、哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、哌嗪酮、2-吗啉基、3-吗啉基、吗啉代、四氢吡喃基、四氢呋喃基等。
在本发明中，“杂环基烷基”例如可以列举哌啶基甲基、哌嗪基甲基等，“杂环基烯基”例如可以列举2-哌啶基乙烯基等，“杂芳基烷基”例如可以列举吡啶基甲基和喹啉-3-基甲基等。
在本发明中，“甲硅烷基”包括由式R3Si-表示的基团，R能够独立地从上述烷基、芳基和环烷基选择，例如可以列举三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基等，“甲硅烷基氧基”例如可以列举三甲基甲硅烷基氧基等，“甲硅烷基氧基烷基”例如可以列举三甲基甲硅烷基氧基甲基等。
在本发明中，“亚烷基”例如可以列举亚甲基、亚甲基和亚丙基等。
在本发明中，上述各种基团可以被取代。上述取代基例如可以列举羟基、羧基、卤素、卤素化烷基(例：CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亚硝基、氰基、烷基(例：甲基、乙基、异丙基、叔丁基)、烯基(例：乙烯基)、炔基(例：乙炔基)、环烷基(例：环丙基、金刚烷基)、环烷基烷基(例：环己基甲基、金刚烷基甲基)、环烯基(例：环丙烯基)、芳基(例：苯基、萘基)、芳基烷基(例：苄基、苯乙基)、杂芳基(例：吡啶基、呋喃基)、杂芳基烷基(例：吡啶基甲基)、杂环基(例：哌啶基)、杂环基烷基(例：吗啉基甲基)、烷氧基(例：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤素化烷氧基(例：OCF3)、烯基氧基(例：乙烯基氧基、烯丙基氧基)、芳基氧基(例：苯基氧基)、烷基氧基羰基(例：甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁基氧羰基)、芳基烷基氧基(例：苄基氧基)、氨基[烷基氨基(例：甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基)、酰基氨基(例：乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳基烷基氨基(例：苄基氨基、三苯甲基氨基)、羟基氨基]、烷基氨基烷基(例：二乙基氨基甲基)、氨磺酰基、氧代基等。
(10)SMAD2/3蛋白质磷酸化抑制剂
SMAD2/3蛋白质的磷酸化抑制是指通过TGF-β刺激被促进的SMAD2和/或SMAD3的磷酸化被抑制(控制)的意思。
SMAD2/3为通过TGF-βI型受体受到磷酸化的R-SMAD(receptor regulated SMAD，受体调节的SMAD)的1种，通过TGF-β的刺激后，被磷酸化(活化)的SMAD2和SMAD3与作为Co-SMAD(common partner SMAD，共同伙伴型Smads)的SMAD4一起移动到核内。如实施例4所示，本发明的发明人发现NEK6蛋白质在细胞内与SMAD2/3蛋白质相互作用，促进SMAD2/3蛋白质的磷酸化。被磷酸化的SMAD2/3蛋白质形成SMAD蛋白质复合体，转移到核内，增强α-SMA、α2-胶原蛋白、干扰素β、白介素-5、VEGF等的转录。
因此能够理解，通过由本发明的SMAD2/3蛋白质磷酸化抑制剂抑制SMAD信号系统，能够对α-SMA、α2-胶原蛋白、干扰素β等的转录进行控制，进而对伤口愈合过程中的向成纤维细胞、肝星状细胞等的肌成纤维细胞的分化抑制、通过成纤维细胞等的基质合成的控制、炎症-免疫反应的调节等有用。
(11)纤维化疾病治疗剂
本发明的纤维化疾病治疗剂为对肝纤维化疾病、肝硬化、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、酒精性肝病、原发性硬化性胆管炎、血色素沉着病、威尔森氏症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、非病毒性充血性肝硬化、药物性肝损伤、胰腺炎、胰脏纤维化、视网膜纤维化、声带疤痕、声带粘膜纤维化、喉头纤维化、肺纤维化、间质性肺炎、特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、特发性组织性肺炎、剥脱性间质性肺炎、呼吸性细支气管炎相关的间质性肺炎、急性间质性肺炎、淋巴细胞性间质性肺炎、结节病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、急性嗜酸性粒细胞性肺炎、淋巴管肌瘤病、肺泡蛋白沉着症、Hermansky-Pudlak综合征、郎格罕细胞组织细胞增生症、铁肺症、淀粉样变性、肺泡微结石症、过敏性肺炎、尘肺病、感染性肺部疾病、药物性肺炎、放射线肺炎、囊性纤维化、骨髓纤维化、肾纤维化、慢性肾功能衰竭、糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、恶性肾硬化、多囊肾、药物性肾病、腹膜后纤维化、胶原病、硬皮病、先天性角化病、肾系统性纤维化、还有包含气道纤维化、肠纤维化、膀胱纤维化、前列腺纤维化、皮肤纤维化在内的关于广泛纤维化的疾病的治疗剂。优选为肝纤维化疾病、肝硬化、肺纤维化、间质性肺炎、肾纤维化、慢性肾功能衰竭。
本发明的纤维化疾病治疗剂的给药方法没有特别限制，优选为吸入、静脉注射、透皮给药等的非口服给药。本发明的治疗方法中的本发明的核酸分子的给药量只要为上述疾病的治疗上有效的量就没有特别限制，根据疾病的种类、重症度、年龄、体重、给药途径等而不同，但通常成人每1次可以为约0.0001～约100mg/kg体重、例如约0.001～约10mg/kg体重、优选为约0.005～约5mg/kg体重。能够将该量例如以1天3次～1个月1次、优选为1天～1周以1次的间隔给药。本发明的纤维化疾病治疗剂通常与药学上接受的载体一起，被制剂化为适当的医药组合物以口服或非口服的形式给药。
以下，利用实施例等详细说明本发明，但本发明不限于此。此外，培养条件设为37℃、5％CO2下。另外，只要没有特别说明，人肺成纤维细胞株LL29细胞使用的培养基为含有10％FCS的F-12K培养基(Gibco公司)，人原代肝星状细胞(ScienCell公司)使用的培养基为含有2％FCS、1％星状细胞生长添加物(Stellate cell growth supplement)(SteCGS、ScienCell公司)的星状细胞(stellate cell)培养基(ScienCell公司)。
实施例
实施例1：使用siRNA的NEK6的敲低
对由IPF患者的肺构建的人肺成纤维细胞株LL29细胞，使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司)转染对人NEK6的siRNA(ON-TARGET plus SMART pool siRNA，Dharmacon公司、或Stealth RNAi siRNA，Thermo Fisher Scientific公司)。转染24小时后，将培养基从含有10％FCS的F-12K培养基(Gibco公司)更换成含有0.1％BSA的F-12K培养基。转染72小时后，将siRNA从转染的细胞中使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)提取RNA。将所得到的RNA使用高容量cDNA逆转录试剂盒(High Capacity cDNA ReverseTranscription Kit)(Applied Biosystems公司)进行逆转录，得到cDNA。所得到的cDNA使用TaqMan GeneExpression Assays(Applied Biosystems公司)进行实时PCR，调查NEK6的敲低对NEK6基因的转录量的影响。NEK6基因的转录量通过用NEK6 Taqman探针(HS00205221＿m1、Applied Biosystems公司)时的测定值除以18s探针时的测定值算出。18s探针以将下述的定制合成18s MGB探针、定制合成18s引物1、定制合成18s引物2分别以成为0.2μM、0.4μM、0.4μM的方式混合，进行实时PCR。
定制合成18s MGB探针(Applied Biosystems公司)：
5’-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC-3’(序列编号57)
定制合成18s引物1(ThermoFisher公司)：
5’-CGGCTACCACATCCAAGGAAG-3’(序列编号58)
定制合成18s引物2(ThermoFisher公司)：
5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’(序列编号59)
siRNA的序列使用ON-TARGET plus SMART pool siRNA(将序列编号51～54等量混合)和Stealth RNAi siRNA(序列编号55)。
＜ON-TARGET plus SMART pool siRNA＞
siNEK6：5’-CUGUCCUCGGCCUAUCUUC-3’(序列编号51)
siNEK6：5’-UAUUUGGGUGGUUCAGUUG-3’(序列编号52)
siNEK6：5’-CAACUCCAGCACAAUGUUC-3’(序列编号53)
siNEK6：5’-UACUUGAUCAUCUGCGAGA-3’(序列编号54)
＜Stealth RNAi siRNA＞
siNEK6：5’-AAGUACUUCCAUACUGUCCUCUCC-3’(序列编号55)
图6a表示对NEK6导入了ON-TARGET plus SMART pool siRNA时的NEK6的实时PCR的结果，图6b表示对NEK6导入了Stealth RNAi siRNA时的NEK6的实时PCR的结果。NEK6siRNA的导入抑制了NEK6基因的转录量。因此，所用的NEK6 siRNA显示有效地抑制靶标基因的表达。
实施例2：NEK6的敲低对SMAD2/3蛋白质磷酸化的影响
为了研究NEK6蛋白质控制TGF-β信号的可能性，分析了在转染了NEK6 siRNA的细胞中磷酸化SMAD2/3的量。
对由IPF患者的肺构建的人肺成纤维细胞株LL29细胞，使用Lipofectamine RNAiMAX转染对人NEK6的ON-TARGET plus SMART pool siRNA(Dharmacon公司)或Stealth RNAisiRNA(Thermo Fisher Scientific公司)。转染24小时后，将培养基从含有10％FCS的F-12K培养基更换成含有0.1％BSA的F-12K培养基。转染48小时后，添加人TGF-β蛋白质(Peprotech公司)使得终浓度为5ng/mL。TGF-β添加2小时后，将细胞用2×SDS样品缓冲液(sample buffer)[100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，6M脲(Urea)，12％甘油(Glycerol)，2％蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)(nacalai tesque公司)，1％磷酸酶抑制剂混合物(phosphatase inhibitor cocktail)(nacalai tesque公司)]裂解，制成细胞提取液。在所得到的细胞提取液中添加β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)和溴酚蓝(Bromophenol blue)使其终浓度分别成为5％、0.025％后，在95℃加热4分钟制成样品。使用所得到的样品实施SDS-PAGE，将样品所含的蛋白质按照大小分离。然后，将分离的蛋白质转印到PVDF膜上，利用抗磷酸化SMAD3抗体(Cell Signaling Technology公司)、抗磷酸化SMAD2抗体(Cell Signaling Technology公司)、抗SMAD2/3抗体(Cell SignalingTechnology公司)、抗NEK6抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)、抗β-Actin抗体(SigmaAldrich公司)进行蛋白质印迹。
图7a表示将NEK6敲低时的磷酸化SMAD3蛋白质的蛋白质印迹的结果。通过使用NEK6的siRNA，NEK6的蛋白质的量减少，因TGF-β上升的磷酸化SMAD3的量减少。此时，总SMAD3蛋白质的量没有变化。另外，图7b表示将NEK6敲低时的磷酸化SMAD2蛋白质的蛋白质印迹的结果。通过使用NEK6的siRNA，NEK6的蛋白质的量减少，因TGF-β上升的磷酸化SMAD2的量减少。此时，总SMAD2蛋白质的量没有变化。
因此，表明通过NEK6的敲低，SMAD2/3蛋白质的磷酸化被抑制。
实施例3：NEK6蛋白质与SMAD3蛋白质在细胞内的相互作用
为了研究NEK6蛋白质在细胞内是否与SMAD3相互作用将SMAD3磷酸化，进行了共免疫沉淀。
对由IPF患者的肺构建的人肺成纤维细胞株LL29细胞，使用X-tremeGENE HP(Roche公司)转染克隆了人NEK6的表达载体(pEZ-M02 Nek6，GeneCopoeia公司)和克隆了以FLAG标签标记了的人SMAD3的表达载体(pEZ-M11 Flag-hSmad3，GeneCopoeia公司)。转染24小时后更换培养基。转染48小时后，用裂解缓冲液(175mM NaCl，50mM HEPES pH7.6，0.1％NP40，0.2mM EDTA pH8.0，1.4mMβ-巯基乙醇，1％蛋白酶抑制剂混合物，1％磷酸酶抑制剂混合物)回收细胞，利用离心分离，得到上清。在上清中添加TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads(Rockland公司)，进行离心分离，除去非特异性的结合。然后在所得到的上清中作为对照加入正常山羊IgG(normal goat IgG)(Santa Cruz Biotechnology公司)或抗NEK6抗体，在4℃孵育过夜后，加入TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads在4℃孵育4小时。进行离心分离除去上清后，将TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads用裂解缓冲液清洗，除去非特异性结合。将2×SDS PAGE上样缓冲液(loading buffer)(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，20％甘油，0.2％溴酚蓝，50mM DTT)添加到TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads中在95℃加热5分钟，将上清所含的共免疫沉淀物回收。对利用抗NEK6抗体的共免疫沉淀物使用抗SMAD3抗体(CellSignaling Technology公司)、抗NEK6抗体进行蛋白质印迹，检测NEK6蛋白质与SMAD3蛋白质是否共沉淀。
图8a表示利用抗NEK6抗体的共免疫沉淀的结果。从共免疫沉淀物检测出了NEK6蛋白质和SMAD3蛋白质。
为了解析SMAD3蛋白质与NEK6在细胞内是否相互作用而被磷酸化，将人NEK6表达载体和用FLAG标签标记了的人SMAD3表达载体转染到LL29细胞。转染24小时后更换培养基。转染48小时后，用裂解缓冲液(250mM NaCl，50mM HEPES pH7.6，0.1％NP40，0.2mM EDTApH8.0，1.4mMβ-巯基乙醇，1％蛋白酶抑制剂混合物，1％磷酸酶抑制剂混合物)回收细胞，通过离心分离，得到上清。在所得到的上清中添加Anti-FLAG M2 Affinity Gel(Sigma-Aldrich公司)，在4℃孵育过夜。然后，进行离心分离，除去上清。将Anti-FLAG M2 AffinityGel用裂解缓冲液清洗，除去非特异性的结合。将2×SDS PAGE上样缓冲液(100mM Tris-HClpH6.8，4％SDS，20％甘油，0.2％溴酚蓝，50mM DTT)添加到Anti-FLAG M2 Affinity Gel中在95℃加热4分钟，将上清所含的共免疫沉淀物回收。将所得到的共免疫沉淀物通过SDS-PAGE根据大小分离后，转印到PVDF膜上，对利用Anti-FLAG M2 Affinity Gel的共免疫沉淀物，使用抗磷酸化SMAD3抗体、抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich公司)、抗NEK6抗体进行蛋白质印迹，检测NEK6蛋白质和磷酸化SMAD3蛋白质是否共沉淀。
图8b表示利用抗FLAG抗体的共免疫沉淀的结果。从共免疫沉淀物检测出了NEK6蛋白质和FLAG-SMAD3蛋白质。另外，通过人NEK6的表达载体的转染，磷酸化SMAD3蛋白质的量上升。
由于在利用抗NEK6抗体的共免疫沉淀物中检测出了SMAD3蛋白质、以及相反在利用抗FLAG抗体的共免疫沉淀物中没有检测出NEK6，表明NEK6蛋白质和SMAD3蛋白质在细胞内相互作用形成复合体。此外，由于通过人NEK6的表达载体的转染，磷酸化SMAD3蛋白质的量上升，所以表明NEK6蛋白质将SMAD3蛋白质在细胞内磷酸化。
实施例4：利用NEK6蛋白质的SMAD3蛋白质磷酸化
利用NEK6和SMAD3的纯化蛋白质研究NEK6蛋白质将SMAD3蛋白质作为底物直接磷酸化的可能性。
将His融合NEK6蛋白质(eurofins公司)和GST融合SMAD3蛋白质(Sigma-Aldrich公司)与反应溶剂(150μM ATP，50mM HEPES，150mM NaCl，0.1％Triton X-100，10mM MgCl2，1mM DTT，1％磷酸酶抑制剂混合物)混合，在30℃孵育45分钟。将包含5％β-巯基乙醇和0.025％溴酚蓝的2×SDS样品缓冲液等量添加到反应液中使反应停止后，在95℃加热5分钟，得到样品。使用所得到的样品实施SDS-PAGE，将反应液所含的蛋白质根据大小分离。然后，将分离了的蛋白质转印到PVDF膜上，利用抗磷酸化SMAD3抗体和抗GST抗体(Santa CruzBiotechnology公司)、抗NEK6抗体进行蛋白质印迹。
图9表示使His融合NEK6蛋白质与GST融合SMAD3蛋白质反应时的磷酸化SMAD3蛋白质的蛋白质印迹的结果。通过使用NEK6蛋白质，磷酸化SMAD3的量上升。因此表明，NEK6蛋白质将SMAD3蛋白质作为底物直接磷酸化。
实施例5：NEK6的敲低对SMAD蛋白质复合体的转录活性的影响
为了研究NEK6蛋白质是否还控制SMAD蛋白质复合体的转移到核内后发生的转录活性，实施了使用SMAD蛋白质复合体的DNA结合序列和使用荧光素酶基因的荧光素酶报告基因检测。另外，使用同时制备的LL29细胞实施蛋白质印迹，对于NEK6的敲低进行确认。
对由IPF患者的肺构建的人肺成纤维细胞株LL29细胞，使用Lipofectamine RNAiMAX转染作为对人NEK6的siRNA的ON-TARGET plus SMART pool siRNA(Dharmacon公司)。siRNA的转染24小时后，将培养基从含有10％FCS的F-12K培养基更换为含有0.4％FCS的F-12K培养基。siRNA的转染48小时后，使用Lipofectamine LTX with PLUS reagent(ThermoFisher Scientific公司)转染克隆了SMAD蛋白质复合体的DNA结合序列[SMAD bidingelement(SBE)]和萤火虫荧光素酶基因的表达载体(pTL-SBE-luc：5’-AGTATGTCTAGACTGAAGTATGTCTAGACTGAAGTATGTCTAGA CTGA-3’(序列编号60)，Panomics公司)和包含了野生型海肾荧光素酶的报告基因检测校正用的载体(pRL-TK：Promega公司)。表达载体的转染2小时后，添加人TGF-β蛋白质使其终浓度达到10ng/mL。在TGF-β添加24小时后，将细胞用2×SDS样品缓冲液(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，6M脲，12％甘油，2％蛋白酶抑制剂混合物，1％磷酸酶抑制剂混合物)裂解。将所得到的细胞提取液所含的蛋白质利用SDS-PAGE分离后，将蛋白质转印到PVDF膜上，利用抗SMAD3抗体、抗NEK6抗体、抗纽带蛋白(Vinculin)抗体进行蛋白质印迹。另外，将与上述同样地制备的LL29细胞按照双萤光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega公司)回收，测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光。用海肾荧光素酶的发光量校正萤火虫荧光素酶的发光量。
图10a表示将NEK6敲低时的蛋白质印迹的结果。通过使用NEK6的siRNA，显示NEK6的蛋白质的量减少，但SMAD3蛋白质的量没有变化。图10b表示将NEK6敲低时的用海肾荧光素酶校正后的萤火虫荧光素酶的发光量。通过使用NEK6的siRNA，通过TGF-β上升的萤火虫荧光素酶的发光量减少。因此，表明通过NEK6的敲低，可以抑制SMAD蛋白质复合体的转录活性。
实施例6：NEK6的敲低对纤维化疾病相关基因的转录量的影响
为了研究NEK6的敲低对纤维化疾病显示治疗效果，分析了转染了NEK6 siRNA的细胞中的纤维化疾病相关基因的转录量。
对由IPF患者的肺构建的人肺成纤维细胞株LL29细胞，使用Lipofectamine RNAiMAX转染对人NEK6的siRNA(ON-TARGET plus SMART pool siRNA，Dharmacon公司)。转染24小时后，将培养基从含有10％FCS的F-12K培养基更换成含有0.1％BSA的F-12K培养基。转染48小时后，添加人TGF-β蛋白质使其终浓度成为1ng/mL。转染72小时后，从转染了siRNA的细胞中使用RNeasy Mini Kit提取RNA。将所得到的RNA使用高容量cDNA逆转录试剂盒(HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit)进行逆转录，得到cDNA。所得到的cDNA使用TaqMan GeneExpression Assays进行实时PCR，检测NEK6的敲低对基因的转录量的影响。Col1a1基因和αSMA基因的转录量通过将用Col1a1 Taqman探针(HS00164004＿m1、AppliedBiosystems公司)时的测定值、或用αSMA Taqman探针(HS00426835＿g1、AppliedBiosystems公司)时的测定值除以用18s探针的测定值而算出。
图11a表示将NEK6敲低时的Col1a1的转录量，图11b表示将NEK6敲低时的αSMA基因的转录量。通过使用NEK6的siRNA，通过TGF-β上升的Col1a1、αSMA、基因的转录量减少。因此，表明NEK6的敲低对纤维化疾病显示治疗的效果。
实施例7：单链核酸分子的合成
根据亚磷酰胺法利用核酸合成机(商品名ABI3900 DNA Synthesizer、AppliedBiosystems)合成以下所示的核酸分子。作为固相载体使用CPG(可控孔度玻璃(ControlledPore Glass))，作为RNA亚酰胺使用EMM亚酰胺(国际公开第2013/027843号)进行固相合成。从固相载体的切出和磷酸基保护基的脱保护、碱基保护基的脱保护、2’-羟基保护基的脱保护按照常规方法。合成的单链核酸分子通过HPLC纯化。
在本发明的下述单链核酸分子中，Lx为接头区域Lx，表示下述结构式的L-脯氨酸二酰胺亚酰胺。
Figure BDA0002378007650000621
另外，下述单链核酸分子中的下划线部为NEK6的基因表达抑制序列。
KB-001
5’-GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC-Lx-GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA-3’(序列编号31)
KB-002
5’-CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC-Lx-GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC-3’(序列编号32)
KB-003
5’-CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC-Lx-GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC-3’(序列编号33)
KB-004
5’-GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC-Lx-GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC-3’(序列编号34)
KB-005
5’-CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC-Lx-GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU-3’(序列编号35)
实施例8：ssPN分子(单链核酸分子)的体外(in vitro)评价
实施对NEK6设计的ssPN分子(单链核酸分子)在体外(in vitro)的评价。各项目的测定方法按照用上述的ON-TARGET plus SMART pool siRNA和Stealth RNAi siRNA进行的方法(实施例1、2和6)。KB-001～005的ssPN核酸全部抑制NEK6的转录量，有效地敲低了靶标基因。此外确认了，通过使KB-001～005的ssPN核酸作用，磷酸化SMAD3的蛋白质量的减少。
另外，对KB-001和KB-003调查对纤维化相关基因(Col1a1和αSMA)的转录量的影响的结果表示于图12。图12a表示使KB-001或KB-003作用时的Col1a1基因的转录量，图12b表示使KB-001或KB-003作用时的αSMA基因的转录量。确认了KB-001和KB-003的任一ssPN分子都抑制纤维化相关基因的转录量。由这些结果能够确认对NEK6设计的ssPN分子(单链核酸分子)的纤维化抑制作用。
实施例9：利用NEK6的体内(in vivo)敲低带来的抗纤维化作用的验证
为了确认NEK6的敲低对纤维化疾病显示治疗的效果，对博来霉素肺纤维化模型小鼠投予NEK6 siRNA分析了抗纤维化作用。
对7周龄的Crl：CD1(ICR)小鼠(Japan Charles River公司)以0.4mg/kg体重的容量投予博来霉素(日本化药株式会社)，制作肺纤维化模型小鼠。NEK6 siRNA以2天～7天1次的频率将50mg/kg体重作为最大容量给药。NEK6 siRNA的给药期间中，以1周1次的频率进行实验动物用Micro CT的图像诊断。从NEK6 siRNA的初次给药起第14～30天解剖，将肺摘出。进行使用摘出的肺的纤维化疾病相关基因的转录量、纤维化疾病相关蛋白质的表达量的测定、病理学的解析等。通过这些，能够确认相比于NEK6 siRNA未给药组，NEK6 siRNA给药组中纤维化得到抑制，能够表明NEK6 siRNA在肺纤维化模型小鼠的抗纤维化作用。
实施例10：肝星状细胞中的NEK6 siRNA对SMAD3蛋白质磷酸化的影响
为了研究肝星状细胞中NEK6蛋白质控制TGF-β信号的可能性，分析转染了NEK6siRNA的细胞中磷酸化SMAD3的量。
将从人的肝脏分离的人初代肝星状细胞(ScienCell公司)在聚-L-赖氨酸(PLL)涂布细胞培养皿上培养5天。然后，使用Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen公司)转染对人NEK6的siRNA(KB-004)。转染48小时后，将培养基从含有2％FCS、1％星状细胞生长添加物(Stellate cell growth supplement)(SteCGS、ScienCell公司)的星状细胞(stellatecell)培养基(ScienCell公司)更换成含有0.2％FCS、1％SteCGS的星状细胞培养基。转染72小时后，将脂多糖(LPS，Sigma Aldrich公司)以终浓度成为100ng/ml的方式添加到培养基中。LPS添加11个半小时后，将人TGF-β蛋白质(Peprotech公司)以终浓度成为5ng/ml的方式添加。TGF-β添加30分钟后，将细胞用2×SDS样品缓冲液[100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，6M脲，12％甘油，2％蛋白酶抑制剂混合物(nacalai tesque公司)，1％磷酸酶抑制剂混合物(nacalai tesque公司)]裂解，制成细胞提取液。
在所得到的细胞提取液中添加β-巯基乙醇和溴酚蓝使其终浓度分别成为5％、0.025％后，在95℃加热4分钟制成样品。使用所得到的样品实施SDS-PAGE，将样品所含的蛋白质按照大小分离。然后，将分离了的蛋白质转印到PVDF膜上，利用抗磷酸化SMAD3抗体(Cell Signaling Technology公司)和抗SMAD3抗体(Cell Signaling Technology公司)、抗磷酸化SMAD2抗体(Cell Signaling Technology公司)和抗SMAD2抗体(Cell SignalingTechnology公司)、抗NEK6抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)、抗纽带蛋白抗体(SigmaAldrich公司)进行蛋白质印迹。
图13表示转染NEK6 siRNA时的磷酸化SMAD3蛋白质和磷酸化SMAD2蛋白质的蛋白质印迹的结果。通过NEK6 siRNA，NEK6的蛋白质的量减少，通过TGF-β上升的磷酸化SMAD3和磷酸化SMAD2的量减少。因此，表明通过NEK6的敲低，SMAD3蛋白质和SMAD2蛋白质的磷酸化被抑制。
实施例11：肝星状细胞中的NEK6 siRNA SMAD3磷酸化抑制作用
为了研究NEK6 siRNA也有控制TGF-β信号的可能性，在各转染了NEK6 siRNA的细胞中分析磷酸化SMAD3的量。
将从人的肝脏分离的人初代肝星状细胞在PLL涂布细胞培养皿上培养5天。然后，使用Lipofectamine RNAi MAX转染对人NEK6的各种siRNA(KB-006、KB-004、KB-011、KB-005、KB-010。转染48小时后，将培养基从含有2％FCS、1％SteCGS的星状细胞培养基更换成含有0.2％FCS、1％SteCGS的星状细胞培养基。转染72小时后，在培养基中添加LPS使得终浓度成为100ng/ml。LPS添加11个半小时后，添加人TGF-β蛋白质使其终浓度成为5ng/ml。TGF-β添加30分钟后，将细胞用2×SDS样品缓冲液(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，6M脲，12％甘油，2％蛋白酶抑制剂混合物，1％磷酸酶抑制剂混合物)裂解，制成细胞提取液。在所得到的细胞提取液中添加β-巯基乙醇和溴酚蓝使其终浓度分别成为5％、0.025％后，在95℃加热4分钟得到样品。使用所得到的样品实施SDS-PAGE，将样品所含的蛋白质根据大小分离。然后，将分离后的蛋白质转印到PVDF膜上，利用抗磷酸化SMAD3抗体和抗SMAD3抗体、抗NEK6抗体、抗纽带蛋白进行蛋白质印迹。
图14表示利用各种NEK6 siRNA将NEK6敲低时的磷酸化SMAD3的蛋白质的蛋白质印迹结果。通过各种NEK6的siRNA的导入，NEK6的蛋白质的量减少，通过TGF-β上升的磷酸化SMAD3的量减少。因此，通过使用多个NEK6 siRNA序列表明通过NEK6的敲低来抑制SMAD3蛋白质的磷酸化。
实施例12：肝星状细胞中的NEK6 siRNA对纤维化疾病相关基因的影响
为了研究NEK6的敲低对纤维化疾病显示有效性，分析转染了NEK6 siRNA的细胞中的纤维化疾病相关基因的转录量。
将从人的肝脏分离的人初代肝星状细胞在PLL涂布细胞培养皿上培养5天。然后，使用Lipofectamine RNAi MAX转染对人NEK6的siRNA(KB-004)。转染48小时后，将培养基从含有2％FCS、1％星状细胞生长添加物的星状细胞培养基更换成含有0.2％FCS、1％SteCGS的星状细胞培养基。转染72小时后，将LPS以终浓度成为100ng/ml的方式添加到培养基中。LPS添加11个半小时后，添加人TGF-β蛋白质使得终浓度成为5ng/ml。TGF-β添加24小时后，使用RNeasy Mini Kit从转染了KB-004的细胞提取RNA。将所得到的RNA使用高容量cDNA逆转录试剂盒(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)进行逆转录，得到cDNA。所得到的cDNA使用TaqMan GeneExpression Assays进行实时PCR，检测NEK6的敲低对基因的转录量的影响。NEK6基因、纤连蛋白基因和αSMA基因的转录量通过将用NEK6 Taqman探针(HS00205221＿m1、Applid Biosystems公司)时的测定值、用纤连蛋白Taqman探针(HS01549976＿m1、Applid Biosystems公司)时的测定值、或用αSMA Taqman探针(HS00426835＿g1、Applid Biosystems公司)时的测定值除以用18s探针时的测定值而算出。
图15a表示将NEK6敲低时的NEK6的转录量，图15b表示将NEK6敲低时的纤连蛋白的转录量，图15c表示将NEK6敲低时的αSMA基因的转录量。通过NEK6 siRNA，因TGF-β而上升的纤连蛋白、αSMA基因的转录量减少。因此，表明NEK6的敲低抑制纤维化。
实施例13：肾脏成纤维细胞中的NEK6 siRNA对SMAD3蛋白质磷酸化的影响
为了研究NEK6蛋白质控制TGF-β信号的可能性，在转染了NEK6siRNA的细胞中分析了磷酸化SMAD3的量。
对大鼠肾成纤维细胞株NRK-49F细胞使用Lipofectamine RNAi MAX转染对人NEK6的siRNA(KB-004)。转染24小时后，将培养基从含有10％FCS的DMEM培养基更换成含有0.1％FCS的DMEM培养基。转染48小时后，添加人TGF-β蛋白质使得终浓度成为5ng/ml。添加后30分钟或1小时后，将细胞用2×SDS样品缓冲液(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，6M脲，12％甘油，2％蛋白酶抑制剂混合物，1％磷酸酶抑制剂混合物)裂解，制成细胞提取液。在所得到的细胞提取液中添加β-巯基乙醇和溴酚蓝使得终浓度分别成为5％、0.025％后，在95℃加热4分钟制成样品。使用所得到的样品实施SDS-PAGE，将样品所含的蛋白质根据大小分离。然后，将分离的蛋白质转印到PVDF膜上，利用抗磷酸化SMAD3抗体和抗SMAD3抗体、抗NEK6抗体(abcam公司)、抗纽带蛋白抗体进行蛋白质印迹。
图16表示将NEK6敲低时的磷酸化SMAD3蛋白质的蛋白质印迹的结果。通过使用NEK6的siRNA，NEK6的蛋白质的量减少，因TGF-β上升的磷酸化SMAD3的量减少。因此，表明通过NEK6的敲低，可以抑制SMAD3蛋白质的磷酸化。
实施例14：四氯化碳(CCl4)诱发肝纤维化模型中的NEK6 siRNA的有效性评价
为了确认NEK6的敲低对纤维化疾病显示有效性，对CCl4模型小鼠将NEK6 siRNA进行静脉内给药分析抗纤维化作用。
在7周龄雄性C57BL/6J小鼠(Japan Charles River株式会社)中，将含有10v/v％CCl4的橄榄油溶液(富士胶卷和光纯药株式会社)以10mL/kg体重在第0、4、7、11天进行腹腔内给药，制作肝纤维化模型小鼠。以CCl4的初次给药前日的体重实施分组，组设定设为CCl4未投予的生理盐水给药组(n＝5)、CCl4投予的溶剂给药组(n＝10)、CCl4投予的核酸给药组(n＝10)。作为NEK6 siRNA使用KB-004，作为投予溶剂使用invivofectamine 3.0Reagent(Thermo Fisher Scientific)，按照invivofectamine 3.0的产品说明书，制作0.3mg/mL的核酸投予液。对核酸给药组将包含KB-004的核酸投予液以3mg/kg体重的方式进行尾静脉给药，对溶剂给药组将和核酸给药组等量的投予溶剂在CCl4的初次给药前日和病情诱发第10天进行尾静脉给药。肝损伤和纤维化的评价在病情诱发第13天实施(实施例15、16、17和19)。
实施例15：CCl4模型中的肝损伤标记物的解析
纤维化可以理解为对细胞或组织的损伤的过度的伤口愈合过程。因此，在抑制纤维化的同时抑制细胞、组织的损伤被认为对各种纤维化疾病的治疗有效。因此，为了研究NEK6的敲低对肝损伤是否显示效果，进行CCl4模型中的肝损伤标记物的测定。
在病情诱发第13天使用普通的毛细管采血管从尾静脉采血，静置30分钟以上。将静置后的血液离心分离，得到血清。使用转氨酶CII-Test Wako(和光纯药工业株式会社)测定血清中谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)和谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)。测定方法按照试剂的说明书。
图17a表示血清中GPT的测定结果，图17b表示血清中GOT的测定结果。通过投予NEK6 siRNA，CCl4模型中确认的血清中GPT和GOT的上升被抑制。因此，表明NEK6的敲低抑制肝损伤。
实施例16：CCl4模型中的SMAD3蛋白质磷酸化的解析
为了研究NEK6的敲低是否对SMAD3蛋白质的磷酸化显示效果，分析了CCl4模型中的磷酸化SMAD3的量。
将在病情诱发第13天采取的肝脏冻结后粉碎制成粉状。向粉末状的肝脏中加入裂解缓冲液(150mM NaCl，1％NP40，0.1％SDS，50mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA，1mM苄磺酰氟(Benzylsulfonyl fluoride)，2％蛋白酶抑制剂混合物，1％磷酸酶抑制剂混合物)，使用便携超声波发生机制备脏器提取液。向将脏器提取液离心分离所得到的上清中添加β-巯基乙醇和溴酚蓝使其终浓度分别成为5％、0.025％。然后，在95℃加热4分钟制成样品。使用所得到的样品，实施SDS-PAGE，将样品所含的蛋白质根据大小分离。然后，将分离的蛋白质转印到PVDF膜上，利用抗磷酸化SMAD3抗体(abcam公司)和抗SMAD3抗体、抗NEK6抗体(abcam公司)、抗纽带蛋白抗体进行蛋白质印迹。磷酸化SMAD3利用总SMAD3量来校正。
图18表示将NEK6敲低时的磷酸化SMAD3蛋白质的蛋白质印迹的结果。通过使用NEK6的siRNA，NEK6的蛋白质的量减少，因TGF-β上升的磷酸化SMAD3的量减少。因此，表明NEK6的敲低在CCl4模型的肝脏中抑制SMAD3蛋白质的磷酸化。
实施例17：CCl4模型中的纤维化疾病相关基因的解析
为了研究NEK6的敲低对纤维化是否显示有效性，分析CCl4模型中的纤维化疾病相关基因的转录量。
从在病情诱发第13天采集的肝脏使用QIAzol Lysis reagent(QIAGEN公司)提取RNA。接着，使用RNeasy mini kit纯化RNA，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(High-CapacitycDNA Reverse Transcription Kit)进行逆转录反应。使用TaqMan GeneExpressionAssay，测定NEK6 Taqman探针(Mm00480730＿m1、Applied Biosystems公司)、和作为纤维化疾病相关基因的Col1a1 Taqman探针(Mm00801666＿g1、Applied Biosystems公司)、Col3a1Taqman探针(Mm01254476＿m1、Applied Biosystems公司)、Timp1 Taqman探针(Mm01341361＿m1、Applied Biosystems公司)的转录量，将与作为内部标准的18s rRNATaqman探针(Hs99999901＿s1、Applied Biosystems公司)的转录量的相对比值作为各基因的转录量。
CCl4模型中的各基因的转录量表示于图19a～d。通过NEK6 siRNA的投予，NEK6基因的转录量降低。由此表明，所使用的KB-004有效地抑制靶标基因的转录。此时，通过病情诱发所诱导的纤维化疾病相关基因(Col1a1、Col3a1、Timp1)的转录量显著降低。因此表明NEK6的敲低抑制纤维化。
实施例18：胆管结扎诱发肝纤维化(BDL)模型中的纤维化疾病相关基因的解析
为了研究NEK6的敲低对纤维化疾病显示有效性，对胆管结扎诱发肝纤维化模型小鼠(BDL模型)静脉内投予NEK6 siRNA，分析纤维化疾病相关基因的转录量。
将9周龄的C57BL/6J小鼠(Japan Charles River公司)以体重分组，将按照基因导入试剂invivofectamin 3.0(ThermoFisher Scientific公司)所附的说明书制备的KB-004溶液(0.3mg/mL)以3mg/kg体重的用量进行尾静脉内给药(n＝12)。对对照组仅投予溶剂(n＝15)。投予次日，将总胆管结扎2处，制作肝纤维化模型小鼠。假手术组尾静脉内投予生理盐水(大塚生食注)，仅进行总胆管的剥离(n＝7)。在胆管结扎第14天采集肝脏，与上述同样测定NEK6 Taqman探针(Mm00480730＿m1、Applied Biosystems公司)、和作为纤维化疾病相关基因的Col1a1 Taqman探针(Mm00801666＿g1、Applied Biosystems公司)、Col3a1Taqman探针(Mm01254476＿m1、Applied Biosystems公司)、Timp1 Taqman探针(Mm01341361＿m1、Applied Biosystems公司)的转录量，将与作为内部标准的GAPDHTaqman探针(Mm9999995＿g1、Applied Biosystems公司)的转录量的相对比值作为各基因的转录量。
将BDL模型中的各基因转录量表示于图20a～d。通过NEK6 siRNA的投予，NEK6基因的转录量降低。由此表明所使用的KB-004有效地抑制靶标基因的转录。此时，通过病情诱发所诱导的纤维化疾病相关基因(Col1a1、Col3a1、Timp1)的转录量显著降低。因此表明NEK6的敲低抑制纤维化。
实施例19：CCl4模型中的病理解析
为了研究NEK6的敲低对于CCl4诱发肝纤维化模型是否显示效果，进行了病理图像的观察。
在病情诱发第13天采集肝脏的内侧右叶，使用10％中性缓冲福尔马林溶液进行固定。用石蜡包埋后，制作组织切片，进行苏木素-曙红染色。
图21表示病理图像的代表例。图21a表示CCl4未投予的生理盐水给药组的结果，图21b表示CCl4投予的溶剂给药组的结果，图21c表示CCl4投予的核酸给药组的结果。图21b中大量确认到的空泡变性显示细胞的损伤，在中央部附近大量存在的核没有染色的部分表示细胞的坏死。通过投予NEK6 siRNA，在CCl4模型的肝脏组织所确认到的细胞的损伤和坏死减少。因此表明NEK6的敲低抑制CCl4诱发肝纤维化模型中的病理图像的变化。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供新型的SMAD2/3蛋白质的磷酸化抑制剂和纤维化疾病治疗剂。
序列表
<110> 杏林制药株式会社（Kyorin pharmaceutical co.,ltd）
<120> 纤维化疾病治疗剂
<130> FP18-0822-00
<150> JP 2017/146957
<151> 2017-07-28
<160> 61
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 1
agagguuguu ggaac 15
<210> 2
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 2
ccuugacaca guccu 15
<210> 3
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 3
cgugaaugca ugugc 15
<210> 4
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 4
ggagaagaga uucau 15
<210> 5
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 5
guauccgaug ucagg 15
<210> 6
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 6
guuccaacaa ccucu 15
<210> 7
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 7
aggacugugu caagg 15
<210> 8
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 8
gcacaugcau ucacg 15
<210> 9
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 9
augaaucucu ucucc 15
<210> 10
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 10
ccugacaucg gauac 15
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 11
agagguuguu ggaacuccc 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 12
ccuugacaca guccugccu 19
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 13
cgugaaugca ugugcucca 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 14
ggagaagaga uucaucuua 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 15
guauccgaug ucaggucuc 19
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 16
agagguuguu ggaacucccu c 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 17
ccuugacaca guccugccuc g 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 18
cgugaaugca ugugcuccac g 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 19
ggagaagaga uucaucuuau c 21
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 20
guauccgaug ucaggucucu g 21
<210> 21
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 21
agagguuguu ggaacucccu cca 23
<210> 22
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 22
ccuugacaca guccugccuc gcc 23
<210> 23
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 23
cgugaaugca ugugcuccac ggc 23
<210> 24
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 24
ggagaagaga uucaucuuau cuc 23
<210> 25
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 25
guauccgaug ucaggucucu ggu 23
<210> 26
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 26
ggagagguug uuggaacucc cucca 25
<210> 27
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 27
ggccuugaca caguccugcc ucgcc 25
<210> 28
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 28
ggcgugaaug caugugcucc acggc 25
<210> 29
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 29
ggggagaaga gauucaucuu aucuc 25
<210> 30
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 30
ggguauccga ugucaggucu cuggu 25
<210> 31
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 31
gagggaguuc caacaaccuc uccggagagg uuguuggaac ucccucca 48
<210> 32
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 32
cgaggcagga cugugucaag gccggccuug acacaguccu gccucgcc 48
<210> 33
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 33
cguggagcac augcauucac gccggcguga augcaugugc uccacggc 48
<210> 34
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 34
gauaagauga aucucuucuc cccggggaga agagauucau cuuaucuc 48
<210> 35
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 35
cagagaccug acaucggaua cccggguauc cgaugucagg ucucuggu 48
<210> 36
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 36
ggcuuuucga ucuggaaguc cgcca 25
<210> 37
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 37
ggucuuuucg aucuggaagu ccgcc 25
<210> 38
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 38
ggcuucuuuu cgaucuggaa guccg 25
<210> 39
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 39
gggaagagau ucaucuuauc uccau 25
<210> 40
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 40
ggagauucau cuuaucucca uagaa 25
<210> 41
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 41
gcggacuucc agaucgaaaa gcc 23
<210> 42
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 42
cggacuucca gaucgaaaag acc 23
<210> 43
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 43
gacuuccaga ucgaaaagaa gcc 23
<210> 44
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 44
ggagauaaga ugaaucucuu ccc 23
<210> 45
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 45
cuauggagau aagaugaauc ucc 23
<210> 46
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 46
ggagauaaga ugaaucucuu cccgggaaga gauucaucuu aucuccau 48
<210> 47
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 47
cuauggagau aagaugaauc uccggagauu caucuuaucu ccauagaa 48
<210> 48
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 48
gcggacuucc agaucgaaaa gccggcuuuu cgaucuggaa guccgcca 48
<210> 49
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 49
cggacuucca gaucgaaaag accggucuuu ucgaucugga aguccgcc 48
<210> 50
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 50
gacuuccaga ucgaaaagaa gccggcuucu uuucgaucug gaaguccg 48
<210> 51
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 51
cuguccucgg ccuaucuuc 19
<210> 52
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 52
uauuugggug guucaguug 19
<210> 53
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 53
caacuccagc acaauguuc 19
<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 54
uacuugauca ucugcgaga 19
<210> 55
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 55
aaguacuucc auacuguccu cucc 24
<210> 56
<211> 942
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
atggcaggac agcccggcca catgccccat ggagggagtt ccaacaacct ctgccacacc 60
ctggggcctg tgcatcctcc tgacccacag aggcatccca acacgctgtc ttttcgctgc 120
tcgctggcgg acttccagat cgaaaagaag ataggccgag gacagttcag cgaggtgtac 180
aaggccacct gcctgctgga caggaagaca gtggctctga agaaggtgca gatctttgag 240
atgatggacg ccaaggcgag gcaggactgt gtcaaggaga tcggcctctt gaagcaactg 300
aaccacccaa atatcatcaa gtatttggac tcgtttatcg aagacaacga gctgaacatt 360
gtgctggagt tggctgacgc aggggacctc tcgcagatga tcaagtactt taagaagcag 420
aagcggctca tcccggagag gacagtatgg aagtactttg tgcagctgtg cagcgccgtg 480
gagcacatgc attcacgccg ggtgatgcac cgagacatca agcctgccaa cgtgttcatc 540
acagccacgg gcgtcgtgaa gctcggtgac cttggtctgg gccgcttctt cagctctgag 600
accaccgcag cccactccct agtggggacg ccctactaca tgtcaccgga gaggatccat 660
gagaacggct acaacttcaa gtccgacatc tggtccctgg gctgtctgct gtacgagatg 720
gcagccctcc agagcccctt ctatggagat aagatgaatc tcttctccct gtgccagaag 780
atcgagcagt gtgactaccc cccactcccc ggggagcact actccgagaa gttacgagaa 840
ctggtcagca tgtgcatctg ccctgacccc caccagagac ctgacatcgg atacgtgcac 900
caggtggcca agcagatgca catctggatg tccagcacct ga 942
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 57
attggagggc aagtctggtg ccagc 25
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 58
cggctaccac atccaaggaa g 21
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 59
gctggaatta ccgcggct 18
<210> 60
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 60
agtatgtcta gactgaagta tgtctagact gaagtatgtc tagactga 48
<210> 61
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成RNA
<400> 61
gacucguuua ucgaagacaa cccggguugu cuucgauaaa cgagucca 48

Claims (8)

1.一种SMAD2/3蛋白质的磷酸化抑制剂，其中，
含有抑制NEK6基因的表达的核酸作为有效成分。
2.一种纤维化疾病治疗剂，其中，
含有抑制NEK6基因的表达的核酸作为有效成分。
3.一种双链核酸分子，其中，
选自以下的(a)、(b)、(c)、(d)和(e)：
(a)由在5’末端包含序列编号1所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端包含序列编号6所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(b)由在5’末端包含序列编号2所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端包含序列编号7所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(c)由在5’末端包含序列编号3所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端包含序列编号8所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(d)由在5’末端包含序列编号4所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端包含序列编号9所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子、
(e)由在5’末端包含序列编号5所示的序列的碱基数19～30的引导链(反义链)和在3’末端包含序列编号10所示的序列的碱基数19～30的乘客链(正义链)形成的双链核酸分子。
4.如权利要求3所述的双链核酸分子，其中，
还在引导链(反义链)和/或乘客链(正义链)的3’末端添加1～11个碱基的核糖核苷酸残基和/或脱氧核糖核苷酸残基，形成突出端。
5.一种单链核酸分子，其中，
形成有发卡型RNA结构，所述发卡型RNA结构是权利要求3或4所示的乘客链(正义链)的3’末端和引导链(反义链)的5’末端经由由核苷酸残基构成的接头序列和/或由非核苷酸结构构成的接头连结，或者是权利要求3或4所示的引导链(反义链)的3’末端和乘客链(正义链)的5’末端经由由核苷酸残基构成的接头序列和/或由非核苷酸结构构成的接头连结。
6.以下的(A)或(B)的单链核酸分子，其中，
包含选自序列编号1～5中的NEK6基因的表达抑制序列：
(A)包含区域(X)、接头区域(Lx)和区域(Xc)或仅由区域(X)、接头区域(Lx)和区域(Xc)构成，
从5’侧至3’侧，依次配置有所述区域(Xc)、所述接头区域(Lx)和所述区域(X)，
所述区域(Xc)与所述区域(X)互补，
所述接头区域(Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸结构，
且所述区域(X)包含所述表达抑制序列；
(B)从5’侧至3’侧依次包含区域(Xc)、接头区域(Lx)、区域(X)、区域(Y)、接头区域(Ly)和区域(Yc)，
所述区域(X)与所述区域(Y)连结，形成内部区域(Z)，
所述区域(Xc)与所述区域(X)互补，
所述区域(Yc)与所述区域(Y)互补，
且所述接头区域(Lx)和/或接头区域(Ly)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸结构，
所述内部区域(Z)包含所述表达抑制序列。
7.如权利要求6所述的单链核酸分子，其中，
所述接头区域(Lx)和/或(Ly)由下述式(I)表示：
Figure FDA0002378007640000031
所述式中，
X1和X2分别独立为H2、O、S或NH；
Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S；
R3为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6结合的氢原子或取代基；
L1为由n个碳原子构成的亚烷基链，其中，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可以不被它们取代，或者
L1为所述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代的聚醚链，
其中，Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与OR1结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
L2为由m个碳原子构成的亚烷基链，其中，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，也可以不被它们取代，或者
L2为所述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代的聚醚链，
其中，Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与OR2结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0～30的范围的整数；
n为0～30的范围的整数；
环A中，所述环A上的C-2以外的1个碳原子可以被氮、氧或硫取代，
所述环A内可以包含碳-碳双键或碳-氮双键，
所述区域(Xc)和所述区域(X)分别经由-OR1-或OR2-与所述接头区域(Lx)结合，
所述区域(Yc)和所述区域(Y)分别经由-OR1-或OR2-与所述接头区域(Ly)结合，
其中，R1和R2可以存在也可以不存在，存在的情况下，R1和R2分别独立为核苷酸残基或所述结构(I)。
8.如权利要求6或7所述的单链核酸分子，其中，
X或Z包含选自序列编号11～25中的序列。
CN201880049352.2A 2017-07-28 2018-07-30 纤维化疾病治疗剂 Active CN110996969B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017146957 2017-07-28
JP2017-146957 2017-07-28
PCT/JP2018/028459 WO2019022257A1 (ja) 2017-07-28 2018-07-30 線維症治療剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110996969A true CN110996969A (zh) 2020-04-10
CN110996969B CN110996969B (zh) 2023-02-28

Family

ID=65041024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880049352.2A Active CN110996969B (zh) 2017-07-28 2018-07-30 纤维化疾病治疗剂

Country Status (16)

Country Link
US (1) US11326163B2 (zh)
EP (1) EP3659609B1 (zh)
JP (1) JP7204649B2 (zh)
KR (1) KR20200033927A (zh)
CN (1) CN110996969B (zh)
AU (1) AU2018307897B2 (zh)
BR (1) BR112020001412A2 (zh)
CA (1) CA3069406A1 (zh)
CL (1) CL2020000219A1 (zh)
CO (1) CO2020001106A2 (zh)
EA (1) EA202090393A1 (zh)
IL (1) IL272271A (zh)
PH (1) PH12020500198A1 (zh)
SG (1) SG11201913541QA (zh)
TW (1) TW201910514A (zh)
WO (1) WO2019022257A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220088057A1 (en) * 2019-01-25 2022-03-24 Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. Therapeutic agent for fibrosis
US20230357767A1 (en) 2020-08-25 2023-11-09 Bonac Corporation Novel nucleic acid molecule inhibiting expression of target gene

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040097441A1 (en) * 2002-11-16 2004-05-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of NIMA-related kinase 6 expression
CN103052711A (zh) * 2010-08-03 2013-04-17 株式会社博纳克 具有含氮脂环式骨架的单链核酸分子

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
HUE026520T2 (en) 2010-07-08 2016-06-28 Bonac Corp Single chain nucleic acid molecule for gene expression control
US8785121B2 (en) 2010-07-08 2014-07-22 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for controlling gene expression
US8691782B2 (en) 2010-08-03 2014-04-08 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
WO2012153704A1 (ja) 2011-05-10 2012-11-15 株式会社ボナック 同位体を有するリン酸化合物の製造方法
ES2802996T3 (es) 2011-08-25 2021-01-22 Bonac Corp Compuesto de tioéter para la protección del grupo 2'-hidroxi en nucleósidos que van a ser utilizados en la síntesis de oligonucleótidos
US9528111B2 (en) 2012-01-07 2016-12-27 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having amino acid backbone
US9663784B2 (en) 2012-05-26 2017-05-30 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for regulating expression of gene having delivering function
WO2014139885A2 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of diseases associated with epithelial mesenchymal transition
EP3102703A2 (en) 2014-02-07 2016-12-14 Effector Therapeutics Inc. Methods for treating fibrotic disease
EP3241903A4 (en) 2014-12-29 2018-07-04 Bonac Corporation Composition containing nucleic acid molecule stably
CN108064289A (zh) 2015-03-27 2018-05-22 株式会社博纳克 具有递送功能和基因表达调控能力的单链核酸分子
WO2016159374A1 (ja) 2015-04-02 2016-10-06 株式会社ボナック 配糖体化合物の製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040097441A1 (en) * 2002-11-16 2004-05-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of NIMA-related kinase 6 expression
CN103052711A (zh) * 2010-08-03 2013-04-17 株式会社博纳克 具有含氮脂环式骨架的单链核酸分子

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIAO ZHANG等: "Never in mitosis gene A-related kinase 6 promotes cell proliferation of hepatocellular carcinoma via cyclin B modulation", 《ONCOLOGY LETTERS》 *
ZHOUYAN BIAN等: "Never in mitosis gene A related kinase-6 attenuates pressure overload-induced activation of the protein kinase B pathway and cardiac hypertrophy", 《PLOS ONE》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2019022257A1 (ja) 2020-05-28
IL272271A (en) 2020-03-31
SG11201913541QA (en) 2020-02-27
CN110996969B (zh) 2023-02-28
AU2018307897A1 (en) 2020-01-30
AU2018307897B2 (en) 2024-01-25
WO2019022257A1 (ja) 2019-01-31
EP3659609A4 (en) 2021-04-21
TW201910514A (zh) 2019-03-16
CO2020001106A2 (es) 2020-02-18
US20210087556A1 (en) 2021-03-25
EP3659609B1 (en) 2024-05-08
CL2020000219A1 (es) 2020-07-24
EA202090393A1 (ru) 2020-05-20
BR112020001412A2 (pt) 2020-08-04
KR20200033927A (ko) 2020-03-30
EP3659609A1 (en) 2020-06-03
CA3069406A1 (en) 2019-01-31
PH12020500198A1 (en) 2020-09-28
JP7204649B2 (ja) 2023-01-16
US11326163B2 (en) 2022-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101894701B1 (ko) 함질소 지환식 골격을 갖는 일본쇄 핵산 분자
TWI527901B (zh) A single stranded nucleic acid molecule used to control gene expression
US20160108400A1 (en) Single-Stranded Nucleic Acid Molecule for Controlling Gene Expression
JP6808710B2 (ja) 核酸分子を安定に含有する組成物
CN107109415B (zh) 控制基因表达的天然型miRNA及其用途
WO2018182008A1 (ja) 遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子
WO2013077446A1 (ja) 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
JP2013055913A (ja) 遺伝子発現制御のための一本鎖ｒｎａ分子
CN110996969B (zh) 纤维化疾病治疗剂
WO2013133393A1 (ja) Ｖｅｇｆ遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子
JP7241098B2 (ja) 線維症治療剤
WO2022045224A1 (ja) 標的遺伝子の発現を抑制する新規な核酸分子
JP2023127512A (ja) 標的遺伝子の発現を抑制する核酸分子

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address

Address after: Tokyo, Japan

Patentee after: KYORIN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Country or region after: Japan

Address before: Tokyo, Japan

Patentee before: Xinglin Pharmaceutical Holdings Co.,Ltd.

Country or region before: Japan

CP03 Change of name, title or address
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240301

Address after: Tokyo, Japan

Patentee after: Xinglin Pharmaceutical Holdings Co.,Ltd.

Country or region after: Japan

Address before: Tokyo, Japan

Patentee before: KYORIN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Country or region before: Japan

TR01 Transfer of patent right