TW201910514A - 纖維化治療劑 - Google Patents

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石山順一
市川航
增井淳
赤坂由似華
豊福秀一
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日商杏林製藥股份有限公司
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Abstract

本發明揭示一種含有抑制NEK6(NIMA-related serine/threonine kinase 6)基因之表現之核酸作為有效成分的SMAD2/3蛋白質之磷酸化抑制劑或纖維化治療劑。

Description

纖維化治療劑
本發明係關於一種抑制NEK6基因之表現之核酸分子及以該核酸分子作為有效成分之醫藥。
纖維化係因過量之膠原蛋白之堆積而導致器官功能受到損傷從而不可逆地發展之疾病，例如，作為纖維化之發病器官，已知有皮膚、肺、肝臟、胰腺、腎臟、骨髓等。關於作為肺之纖維化之一種的特發性肺纖維化(IPF)，雖人口每10萬人中有20人左右之患者數，罹患率並不高，但確診後之平均存活時間為2.5~5年且治療後之過程不佳，因此在日本被指定為難治性疾病。
作為IPF治療藥，目前為止，吡非尼酮(pirfenidone)、尼達尼布(nintedanib)得到日本厚生勞動省承認並上市。雖然所有藥劑均表現出抑制肺活量降低及延長無進展期之作用，而延遲病情之發展，但作為治療效果，難言能夠充分滿足，而期待開發出基於新機制之治療藥。
另一方面，關於作為本發明目標之「NEK6蛋白質」，其作為與細胞分裂之控制相關之NIMA-related serine(永離有絲分裂基因A相關絲胺酸)/threonine kinase family(蘇胺酸激酶家族)之一而為人所知，但作為醫藥品開發之研究對象，目前為止並未太受關注。於2002年報告有作為癌之藥物開發目標之可能性，但關於 NEK6蛋白質與SMAD2/3蛋白質進行相互作用、促進組織之纖維化之情況，並無具體之報告。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]美國專利申請案公開第2004/0097441號說明書
本發明之目的在於提供一種新穎之SMAD2/3蛋白質之磷酸化抑制劑及纖維化治療劑。
本發明者等人根據使用博萊黴素誘發肺纖維化模型之解析，著眼於觀察到NEK6(NIMA-related serine/threonine kinase 6)之mRNA級之亢進而推進研究，結果發現，NEK6於TGF-β下游對有助於纖維化之SMAD系訊號進行控制，從而完成本發明。
即，本發明係如以下所述。
[1]一種SMAD2/3蛋白質之磷酸化抑制劑，其含有抑制NEK6基因之表現之核酸作為有效成分；[2]一種纖維化治療劑，其含有抑制NEK6基因之表現之核酸作為有效成分；[3]如[2]之治療劑，其以肺纖維化、肝纖維化或腎纖維化作為治療對象；[4]一種雙鏈核酸分子，其係選自由以下之(a)、(b)、(c)、(d)及(e)所構成之群組， (a)由在5'末端含有序列編號1所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號6所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子；(b)由在5'末端含有序列編號2所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號7所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子；(c)由在5'末端含有序列編號3所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號8所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子；(d)由在5'末端含有序列編號4所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號9所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子；(e)由在5'末端含有序列編號5所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號10所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子；[5]如[4]之雙鏈核酸分子，其進而對嚮導鏈(反義鏈)及/或隨從鏈(正義鏈)之3'末端附加1~11個鹼基之核糖核苷酸殘基及/或去氧核苷酸殘基而形成突出端；[6]一種單鏈核酸分子，其形成有將如[4]或[5]所示之隨從鏈(正義鏈)之3'末端與嚮導鏈(反義鏈)之5'末端經由包含核苷酸殘基之連接子序列及/或非核苷酸結構之連接子連結，或者將如[4]或[5]所示之嚮導鏈(反義鏈)之3'末端與隨從鏈(正義鏈)之5'末端經由包含核苷酸殘基之連接子序列及/或非核苷酸結構之連接子連結而成之髮夾型RNA結構； [7]一種以下之(A)或(B)之單鏈核酸分子，其含有選自序列編號1~5之NEK6基因之表現抑制序列：(A)包含區域(X)、連接子區域(Lx)及區域(Xc)或僅由該等區域構成，自5'側至3'側依序配置上述區域(Xc)、上述連接子區域(Lx)及上述區域(X)，上述區域(Xc)與上述區域(X)互補，上述連接子區域(Lx)具有含有吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者之非核苷酸結構，且上述區域(X)含有上述表現抑制序列；(B)自5'側至3'側依序含有區域(Xc)、連接子區域(Lx)、區域(X)、區域(Y)、連接子區域(Ly)及區域(Yc)，上述區域(X)與上述區域(Y)連結而形成內部區域(Z)，上述區域(Xc)與上述區域(X)互補，上述區域(Yc)與上述區域(Y)互補，且上述連接子區域(Lx)及/或連接子區域(Ly)具有含有吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者之非核苷酸結構，上述內部區域(Z)含有上述表現抑制序列。
[8]如[7]之單鏈核酸分子，其中，上述連接子區域(Lx)及/或(Ly)係以下述式(I)表示，[化1] 上述式中，X1及X2分別獨立為H2、O、S或NH；Y1及Y2分別獨立為單鍵、CH2、NH、O或S；R3為鍵結於環A上之C-3、C-4、C-5或C-6之氫原子或取代基；L1為包含n個碳原子之伸烷基鏈，此處，伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代，亦可未經取代，或L1係上述伸烷基鏈之一個以上之碳原子經氧原子取代之聚醚鏈，其中，於Y1為NH、O或S之情形時，鍵結於Y1之L1之原子為碳，鍵結於OR1之L1之原子為碳，氧原子彼此不鄰接；L2為包含m個碳原子之伸烷基鏈，此處，伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，亦可未經取代，或L2係上述伸烷基鏈之一個以上之碳原子經氧原子取代之聚醚鏈，其中，於Y2為NH、O或S之情形時，鍵結於Y2之L2之原子為碳，鍵結於OR2之L2之原子為碳，氧原子彼此不鄰接； Ra、Rb、Rc及Rd分別獨立為取代基或保護基；l為1或2；m為0~30之範圍之整數；n為0~30之範圍之整數；環A係上述環A上之C-2以外之1個碳原子可被氮、氧或硫取代，於上述環A內可含有碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵，上述區域(Xc)及上述區域(X)分別經由-OR1-或-OR2-而結合於上述連接子區域(Lx)，上述區域(Yc)及上述區域(Y)分別經由-OR1-或-OR2-而結合於上述連接子區域(Ly)，此處，R1及R2可存在亦可不存在，於存在之情形時，R1及R2分別獨立為核苷酸殘基或上述結構(I)；[9]如[7]或[8]之單鏈核酸分子，其中，X或Z含有選自由序列編號11~25所構成之群組中之序列；[10]一種抑制SMAD2/3蛋白質之磷酸化之方法，其包括對對象投予抑制NEK6基因之表現之核酸；[11]一種治療纖維化之方法，其包括對對象投予抑制NEK6基因之表現之核酸；[12]一種抑制NEK6基因之表現之核酸，其係用於抑制SMAD2/3蛋白質之磷酸化；[13]一種抑制NEK6基因之表現之核酸，其係用於纖維化治療；[14]一種抑制NEK6基因之表現之核酸之使用，其係用於製造SMAD2/3蛋白質之磷酸化抑制劑；及 [15]一種抑制NEK6基因之表現之核酸之使用，其係用於製造纖維化治療劑。
[16]如[15]之使用，其中，抑制NEK6基因之表現之核酸係含有KB-001~011之表現抑制序列(下劃線部之部分)之核酸。
根據本發明，可提供一種新穎之SMAD2/3蛋白質之磷酸化抑制劑及纖維化治療劑。
圖1係表示NEK6之編碼序列(Coding Sequence)區域之序列及實施例7中所製作之ssPN分子之目標部位之圖。
圖2(A)及(B)係表示成為本發明之SMAD2/3蛋白質磷酸化抑制劑之有效成分的核酸分子之一例之示意圖。(ssPN分子)
圖3(A)及(B)係表示成為本發明之SMAD2/3蛋白質磷酸化抑制劑之有效成分的核酸分子之一例之示意圖。(ssPN分子或ssNc分子)
圖4(A)至(D)係表示成為本發明之SMAD2/3蛋白質磷酸化抑制劑之有效成分的核酸分子之一例之示意圖。(ssPN分子或ssNc分子)
圖5(A)及(B)係表示成為本發明之SMAD2/3蛋白質磷酸化抑制劑之有效成分的核酸分子之一例之示意圖。(ssNc分子)
圖6a及b係表示導入有siRNA之情形時之NEK6基因之轉錄量的圖表。
圖7a表示減弱NEK6之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質的西方墨點法之結果。圖7b表示減弱NEK6之情形時之磷酸化SMAD2 蛋白質的西方墨點法之結果。
圖8a表示利用抗NEK6抗體之共免疫沈澱之結果。圖8b表示利用抗FLAG抗體之共免疫沈澱之結果。
圖9表示使His融合NEK6蛋白質與GST融合SMAD3蛋白質進行反應之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質的西方墨點法之結果。
圖10a表示減弱NEK6之情形時之西方墨點法之結果。圖10b表示減弱NEK6之情形時之螢火蟲螢光素酶之發光量。
圖11a表示減弱NEK6之情形時之Col1a1基因之轉錄量。圖11b表示減弱NEK6之情形時之αSMA基因之轉錄量。
圖12a表示減弱NEK6之情形時之Col1a1基因之轉錄量。圖12b表示減弱NEK6之情形時之αSMA基因之轉錄量。
圖13表示對肝星狀細胞導入NEK6 siRNA之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質(pSMAD3)的西方墨點法之結果。
圖14表示對肝星狀細胞導入各種NEK6 siRNA之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質(pSMAD3)的西方墨點法之結果。
圖15a表示於肝星狀細胞中減弱NEK6之情形時之NEK6之轉錄量。圖15b表示於肝星狀細胞中減弱NEK6之情形時之Fibronectin(纖維結合蛋白)之轉錄量。圖15c表示於肝星狀細胞中減弱NEK6之情形時之αSMA基因之轉錄量。
圖16表示於腎臟纖維母細胞中減弱NEK6之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質的西方墨點法之結果。
圖17a表示於CCl4模型中減弱NEK6之情形時之血清中GPT之測定結果。圖17b表示於CCl4模型中減弱NEK6之情形時之血清中GOT之測定結果。
圖18表示於CCl4模型中減弱NEK6之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質的西方墨點法之結果。
圖19a表示於CCl4模型中減弱NEK6之情形時之NEK6基因之轉錄量。圖19b表示於CCl4模型中減弱NEK6之情形時之Col1a1基因之轉錄量。圖19c表示於CCl4模型中減弱NEK6之情形時之Col3a1基因之轉錄量。圖19d表示於CCl4模型中減弱NEK6之情形時之Timp1基因之轉錄量。
圖20a表示於BDL模型中減弱NEK6之情形時之NEK6基因之轉錄量。圖20b表示於BDL模型中減弱NEK6之情形時之Col1a1基因之轉錄量。圖20c表示於BDL模型中減弱NEK6之情形時之Col3a1基因之轉錄量。圖20d表示於BDL模型中減弱NEK6之情形時之Timp1基因之轉錄量。
圖21表示於CCl4模型中減弱NEK6之情形時之肝臟的病理解析之結果。圖21a表示未投予CCl4之生理食鹽水投予組之結果。圖21b表示投予CCl4之溶劑投予組之結果。圖21c表示投予CCl4之核酸投予組之結果。
本說明書所使用之用語只要未特別提及，則係以該技術領域中通常使用之含義使用。又，於本發明中，「鹼基數」例如意指「長度」，亦可稱為「鹼基長度」。於本發明中，鹼基數之數值範圍係例如揭示屬於該範圍之全部正整數，作為具體例，「1~4個鹼基」之記載意指揭示「1、2、3、4個鹼基」之全部。
本發明提供含有抑制NEK6基因之表現之核酸作為有效成分之SMAD2/3蛋白質磷酸化抑制劑及含有該核酸作為有效 成分之纖維化治療劑。以下，對本發明之內容進行詳細說明。
(1)抑制NEK6基因之表現之核酸
NEK6蛋白質係與細胞分裂之控制相關之11個NIMA-related serine/threonine kinase family之一，於細胞週期之M期中被磷酸化(活化)。
作為本發明之目標之NEK6基因係源自哺乳類之基因，較佳為源自人類之基因。源自人類之NEK6基因報告有7種變異體，將其中之同功異構物2之Coding Sequence區域之序列示於圖1(序列編號56)。
利用核酸分子抑制NEK6基因之表現之機制並無特別限制，只要可下調表現即可。NEK6基因之表現抑制可根據自NEK6基因之轉錄產物之生成量之減少、自NEK6基因之轉譯產物之生成量之減少、或上述轉譯產物之活性之減少等而進行確認。
作為抑制NEK6基因之表現之核酸，可列舉：NEK6 mRNA之反義聚核苷酸、siRNA、ssPN分子、ssNc分子、miRNA、核酶等。
若為業者，則可基於上述人類NEK6基因之核苷酸序列而容易地取得反義聚核苷酸、siRNA、ssPN分子、ssNc分子、核酶。較佳為基於NEK6同功異構物2之Coding Sequence區域之序列(序列編號56)所製作之核酸。
(2)siRNA
以下對作為抑制NEK6基因之表現之核酸之一的siRNA(small interfering RNA，小干擾RNA)進行說明。
siRNA係包含與靶基因聯會之嚮導鏈(反義鏈)、與嚮導鏈形成雙鏈之隨從鏈(正義鏈)之核酸分子。siRNA於細胞內被以Argonaute(AGO)蛋白質作為中核之稱為RNA-inducing silencing complex(RNA誘導型沈默複合體，RISC)之複合體吸收後，正義鏈被AGO分解，而嚮導鏈殘留於RISC中。業界認為嚮導鏈之種子區(自嚮導鏈之5'末端起2-8鹼基之7個鹼基區域)於識別靶序列之方面具有重要之作用，就避免脫靶效應之目的而言，認為較佳為選擇對靶基因具有特異性之種子區。因此，對於作為本發明之有效成分之核酸之種子區而言，亦較佳為選擇對NEK6基因具有特異性之序列。例如，可列舉選擇含有與NEK6基因互補且不與NEK7基因(RefSeq database：NM_133494.2)互補、或區域中1個以上(例如1個~3個)之鹼基與NEK7基因非互補(失配)之序列作為種子區之核酸。又，對於全長序列，就避免脫靶效應之方面而言，亦有用的是例如增加與NEK6基因互補且與NEK7基因非互補(失配)之鹼基(例如，4個以上，較佳為5個~7個)。嚮導鏈所含之表現抑制序列之鹼基數例如為15~30個鹼基，較佳為19~25個鹼基，更佳為19~23個鹼基，進而較佳為21、22、23個鹼基，尤佳為23個鹼基。
上述表現抑制序列亦可藉由在3'側進而具有附加序列而形成突出端。上述附加序列之鹼基數例如為1~11個鹼基，較佳為1~4個鹼基。附加序列可為核糖核苷酸殘基，亦可為去氧核糖核苷酸殘基。
嚮導鏈之鹼基數例如為19~50個鹼基，較佳為19~30個鹼基，更佳為19~25個鹼基，進而較佳為19~23個鹼基，進 而更佳為21、22、23個鹼基，尤佳為23個鹼基。
隨從鏈之鹼基數例如為19~50個鹼基，較佳為19~30個鹼基，更佳為19~25個鹼基，進而較佳為19~23個鹼基，進而更佳為21、22、23個鹼基，尤佳為21個鹼基。
隨從鏈中與嚮導鏈顯示出互補性之區域例如為19~50個鹼基，較佳為19~30個鹼基，更佳為19~25個鹼基，進而較佳為19~23個鹼基。上述區域亦可於3'側進而具有附加序列。上述附加序列之鹼基數例如為1~11個鹼基，較佳為1~4個鹼基，附加序列可為核糖核苷酸殘基，亦可為去氧核糖核苷酸殘基。隨從鏈對於顯示出嚮導鏈之互補性之區域，例如可為互補，亦可為1個或數個鹼基為非互補，較佳為互補。上述1個鹼基或數個鹼基例如為1~3個鹼基，較佳為1個鹼基或2個鹼基。
抑制NEK6之基因表現之siRNA可基於NEK6基因之cDNA序列資訊，例如依照siSNIPER(註冊商標)、藥物開發/診斷研究用siDirect(註冊商標)等siRNA序列設計系統而獲得。
NEK6 siRNA較佳為對NEK6特異性地發揮作用之siRNA，例如可列舉如下之雙鏈核酸。
(a)由在5'末端含有序列編號1所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號6所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子
(b)由在5'末端含有序列編號2所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號7所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子
(c)由在5'末端含有序列編號3所示之序列之鹼基數19~30之 嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號8所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子
(d)由在5'末端含有序列編號4所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號9所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子
(e)由在5'末端含有序列編號5所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端或5'末端含有序列編號10所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成之雙鏈核酸分子
又，抑制NEK6基因之表現之siRNA可為形成有將隨從鏈(正義鏈)之3'末端與嚮導鏈(反義鏈)之5'末端經由包含核苷酸殘基之連接子序列及/或非核苷酸結構之連接子連結，或將嚮導鏈(反義鏈)之3'末端與隨從鏈(正義鏈)之5'末端經由包含核苷酸殘基之連接子序列及/或非核苷酸結構之連接子連結而成之髮夾型RNA結構之單鏈核酸分子。
上述包含核苷酸殘基之連接子序列之長度並無特別限制，例如較佳為上述隨從鏈與上述嚮導鏈可形成雙鏈之長度。上 述連接子序列之鹼基數之下限例如為1個鹼基，較佳為2個鹼基，更佳為3個鹼基，其上限例如為100個鹼基，較佳為80個鹼基，更佳為50個鹼基。上述連接子序列之鹼基數之具體例為1~100個鹼基、2~80個鹼基、3~50個鹼基。
作為上述非核苷酸結構之連接子之例，可列舉：六乙二醇連接子、聚(氧基膦酸亞基-氧基-1,3-丙二醇)連接子、烯丙基連接子、或聚乙二醇連接子等化學連接子；具有胺基甲酸酯結構之胺基連接子等。上述非核苷酸結構連接子之長度並無特別限制，例如較佳為上述隨從鏈與上述嚮導鏈可形成雙鏈之長度。
(3)ssPN分子
對成為抑制NEK6基因之表現之核酸之一的ssPN分子進行說明。ssPN分子意指WO2012/017919所揭示之生物學穩定性優異之單鏈RNA核酸分子，具體而言如以下所述。
成為本發明之有效成分之ssPN分子之特徵在於：其係含有NEK6基因之表現抑制序列之單鏈核酸分子，且包含區域(X)、連接子區域(Lx)及區域(Xc)，於上述區域(X)與上述區域(Xc)之間連結上述連接子區域(Lx)，上述區域(X)及上述區域(Xc)之至少一者含有上述表現抑制序列，上述連接子區域(Lx)具有含有吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者之非核苷酸結構。ssPN分子中其5'末端與3'末端未連結，亦可稱為線性單鏈核酸分子。
於ssPN分子中，NEK6基因之表現抑制序列例如為於在體內(in vivo)或體外(in vitro)將本發明之ssPN分子導入至細胞內之情形時表現出抑制NEK6基因之表現之活性之序列。結合於 NEK6 mRNA之siRNA序列可基於NEK6基因之cDNA序列資訊，依照既有之siRNA設計系統而獲得，於ssPN分子中，亦可使用上述siRNA之表現抑制序列作為ssPN分子之表現抑制序列。
上述表現抑制序列例如相對於NEK6基因之目標區域，較佳為具有80%以上之互補性，更佳為90%以上，進而較佳為95%以上，進而更佳為98%以上，尤佳為100%。
尤其是對於相當於siRNA之種子區之部分，較佳為與siRNA之情形同樣地選擇對NEK6基因特異性之序列。
推測利用ssPN分子之NEK6基因之表現之抑制係例如藉由產生RNA干擾，但不受該機制所限定。本發明之ssPN分子並非例如如所謂之siRNA般，作為包含兩條單鏈RNA之dsRNA而向細胞等導入，又，於細胞內，上述表現抑制序列之切下並非必須。
於ssPN分子中，上述連接子區域(Lx)例如可具有上述含有吡咯啶骨架之非核苷酸結構，亦可具有上述含有哌啶骨架之非核苷酸結構，亦可具有上述含有吡咯啶骨架之非核苷酸結構與上述含有哌啶骨架之非核苷酸結構之兩者。
於ssPN分子中，上述吡咯啶骨架例如可為構成吡咯啶之5員環之碳中1個以上被取代之吡咯啶衍生物之骨架，於被取代之情形時，較佳為例如5員環之2位碳(C-2)以外之碳原子。上述碳例如可被取代為氮、氧或硫。上述吡咯啶骨架例如可於吡咯啶之5員環內含有例如碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。於上述吡咯啶骨架中，構成吡咯啶之5員環之碳及氮例如可鍵結有氫，亦可鍵結有如下文所述之取代基。上述連接子區域(Lx)例如可經由上述吡咯啶骨架之任一基而與上述區域(X)及上述區域(Xc)結合，較佳為上述5員環之 任一個碳原子與氮，較佳為上述5員環之2位之碳(C-2)與氮。作為上述吡咯啶骨架，例如可列舉脯胺酸骨架、脯胺醇骨架等。上述脯胺酸骨架及脯胺醇骨架等例如為生物體內物質及其還原體，因此安全性亦優異。
於ssPN分子中，上述哌啶骨架例如可為構成哌啶之6員環之碳中1個以上被取代之哌啶衍生物之骨架，於被取代之情形時，較佳為例如6員環之2位碳(C-2)以外之碳原子。上述碳例如可被取代為氮、氧或硫。上述哌啶骨架例如可於哌啶之6員環內含有例如碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。於上述哌啶骨架中，構成哌啶之6員環之碳及氮例如可鍵結有氫基，亦可鍵結有如下文所述之取代基。上述連接子區域(Lx)例如可經由上述哌啶骨架之任一基而與上述區域(X)及上述區域(Xc)結合，較佳為上述6員環之任一個碳原子與氮，較佳為上述6員環之2位之碳(C-2)與氮。
上述連接子區域例如可僅含有包含上述非核苷酸結構之非核苷酸殘基，亦可含有包含上述非核苷酸結構之非核苷酸殘基與核苷酸殘基。
於ssPN分子中，上述連接子區域例如以下述式(I)表示。
上述式(I)中，例如，X1及X2分別獨立為H2、O、S或NH；Y1及Y2分別獨立為單鍵、CH2、NH、O或S；R3係鍵結於環A上之C-3、C-4、C-5或C-6之氫原子或取代基，L1為包含n個碳原子之伸烷基鏈，此處，伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代，亦可未經取代，或者L1係上述伸烷基鏈之一個以上之碳原子經氧原子取代之聚醚鏈，其中，於Y1為NH、O或S之情形時，鍵結於Y1之L1之原子為碳，鍵結於OR1之L1之原子為碳，氧原子彼此不鄰接；L2為包含m個碳原子之伸烷基鏈，此處，伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，亦可未經取代，或者L2係上述伸烷基鏈之一個以上之碳原子經氧原子取代之聚醚鏈，其中，於Y2為NH、O或S之情形時，鍵結於Y2之L2之原子為碳，鍵結於OR2之L2之原子為碳，氧原子彼此不鄰接；Ra、Rb、Rc及Rd分別獨立為取代基或保護基；l為1或2；m為0~30之範圍之整數；n為0~30之範圍之整數；環A係上述環A上之C-2以外之1個碳原子可被氮、氧、硫 取代，於上述環A內可含有碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵，上述區域(Xc)及上述區域(X)分別經由-OR1-或-OR2-而結合於上述連接子區域(Lx)，此處，R1及R2可存在亦可不存在，於存在之情形時，R1及R2分別獨立為核苷酸殘基或上述結構(I)。
上述式(I)中，X1及X2例如分別獨立為H2、O、S或NH。於上述式(I)中，所謂X1為H2意指X1與X1所鍵結之碳原子一併形成CH2(亞甲基)。X2亦為同樣。
上述式(I)中，Y1及Y2分別獨立為單鍵、CH2、NH、O或S。
上述式(I)中，於環A中，l為1或2。於l=1之情形時，環A為5員環，例如為上述吡咯啶骨架。上述吡咯啶骨架例如可列舉脯胺酸骨架、脯胺醇骨架等，可例示該等之二價結構。於l=2之情形時，環A為6員環，例如為上述哌啶骨架。環A中，環A上之C-2以外之1個碳原子可被取代為氮、氧或硫。又，環A可於環A內含有碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。環A例如可為L型及D型之任一種。
上述式(I)中，R3係鍵結於環A上之C-3、C-4、C-5或C-6之氫原子或取代基。於R3為上述取代基之情形時，取代基R3可為1個，亦可為數個，亦可不存在，於為數個之情形時，可相同亦可不同。取代基R3例如為：鹵素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4、側氧基(=O)、烷基、烯基、炔基、鹵代烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基、環烯基、環烷基烷基、環基烷基、羥烷基、烷氧基烷基、胺基烷基、雜環基烯基、雜環基烷基、雜芳 烷基、矽烷基、矽烷氧基烷基等。
R4及R5例如分別獨立為取代基或保護基，可相同亦可不同。作為R4及R5之取代基例如可列舉：鹵素、烷基、烯基、炔基、鹵代烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基、環烯基、環烷基烷基、環基烷基、羥烷基、烷氧基烷基、胺基烷基、雜環基烯基、雜環基烷基、雜芳烷基、矽烷基、矽烷氧基烷基等。
作為R4及R5之保護基例如為將反應性較高之官能基轉換為不活性之官能基，可列舉公知之保護基等。上述保護基例如可引用文獻(J.F.W.McOmie,「Protecting Groups in Organic Chemistry」Prenum Press,London and New York,1973)之記載。上述保護基並無特別限制，例如可列舉：第三丁基二甲基甲矽烷基(TBDMS)、雙(2-乙醯氧基乙基氧基)甲基(ACE)、三異丙基甲矽烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)及甲苯基磺醯基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。於R3為OR4之情形時，上述保護基並無特別限制，例如可列舉：TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基及TEM基等。
上述式(I)中，L1係包含n個碳原子之伸烷基鏈。上述伸烷基碳原子上之氫原子例如可被取代為OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa，亦可未經取代。或L1亦可為上述伸烷基鏈之1個以上之碳原子(例如，1~3個)被取代為氧原子而成之聚醚鏈。上述聚醚鏈例如為聚乙二醇。再者，於Y1為NH、O或S之情形時，鍵結於Y1之L1之原子為碳，鍵結於OR1之L1之原子為碳，氧原子彼此不鄰接。即，例如，於Y1為O之情形時，該氧原子與L1之氧 原子不鄰接，OR1之氧原子與L1之氧原子不鄰接。
上述式(I)中，L2係包含m個碳原子之伸烷基鏈。上述伸烷基碳原子上之氫原子例如可被取代為OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc，亦可未經取代。或L2亦可為上述伸烷基鏈之1個以上之碳原子(例如，1~3個)被取代為氧原子而成之聚醚鏈。再者，於Y2為NH、O或S之情形時，鍵結於Y2之L2之原子為碳，鍵結於OR2之L2之原子為碳，氧原子彼此不鄰接。即，例如，於Y2為O之情形時，該氧原子與L2之氧原子不鄰接，OR2之氧原子與L2之氧原子不鄰接。
L1之n及L2之m並無特別限制，各自之下限例如為0，上限亦無特別限制。n及m例如可根據上述連接子區域(Lx)之所需之長度而適當設定。n及m例如就製造成本及產率等方面而言，分別較佳為0~30，更佳為0~20，進而較佳為0~15。n與m可相同(n=m)，亦可不同。n+m例如為0~30，較佳為0~20，更佳為0~15。再者，L1之n及L2之m係各自之伸烷基鏈之碳原子數，但於為L1或L2之伸烷基鏈之一個以上碳原子被取代為氧原子之聚醚鏈之情形時，n及m意指碳原子數與所取代之氧原子數之合計數。
Ra、Rb、Rc及Rd例如分別獨立為取代基或保護基。Ra、Rb、Rc及Rd之取代基及保護基例如與R4及R5之取代基及保護基相同。
於上述式(I)中，氫原子例如可分別獨立地被取代為Cl、Br、F及I等鹵素。
上述區域(Xc)及上述區域(X)例如分別經由-OR1-或-OR2-而結合於上述連接子區域(Lx)。此處，R1及R2可存在，亦可 不存在。於R1及R2存在之情形時，R1及R2分別獨立為核苷酸殘基或上述式(I)之結構。於R1及/或R2為上述核苷酸殘基之情形時，上述連接子區域(Lx)例如由包含除核苷酸殘基R1及/或R2以外之上述式(I)之結構的上述非核苷酸殘基、與上述核苷酸殘基所形成。於R1及/或R2為上述式(I)之結構之情形時，上述連接子區域(Lx)例如成為連結有2個以上包含上述式(I)之結構之上述非核苷酸殘基之結構。上述式(I)之結構例如可含有1個、2個、3個或4個。如上所述，於含有數個上述結構之情形時，上述(I)之結構例如可直接連結，亦可經由上述核苷酸殘基而結合。另一方面，於不存在R1及R2之情形時，上述連接子區域(Lx)例如僅由包含上述式(I)之結構之上述非核苷酸殘基所形成。
上述區域(Xc)及上述區域(X)與-OR1-及-OR2-之結合之組合並無特別限制，例如可列舉以下之任一條件。
條件(1)
上述區域(Xc)經由-OR2-，上述區域(X)經由-OR1-，而與上述式(I)之結構結合。
條件(2)
上述區域(Xc)經由-OR1-，上述區域(X)經由-OR2-，而與上述式(I)之結構結合。
上述式(I)之結構例如可例示下述式(I-1)~式(I-9)，於下述式中，n及m與上述式(I)相同。於下述式中，q為0~10之整數。
[化3]
於上述式(I-1)~(I-9)中，n、m及q並無特別限制，如上文所述。作為具體例，於上述式(I-1)中，可列舉n=8，於上述(I-2)中，可列舉n=3，於上述式(I-3)中，可列舉n=4或8，於上述(I-4)中，可列舉n=7或8，於上述式(I-5)中，可列舉n=3及m=4，於上述(I-6)中，可列舉n=8及m=4，於上述式(I-7)中，可 列舉n=8及m=4，於上述(I-8)中，可列舉n=5及m=4，於上述式(I-9)中，可列舉q=1及m=4。將上述式(I-4)之一例(n=8)示於下述式(I-4a)，將上述式(I-8)之一例(n=5、m=4)示於下述式(I-8a)。
於ssPN分子中，上述區域(Xc)與上述區域(X)互補。因此，於ssPN分子中，上述區域(Xc)朝向上述區域(X)回折，上述區域(Xc)與上述區域(X)可藉由自黏合而形成雙鏈。
ssPN分子例如可為僅上述區域(Xc)回折而與上述區域(X)形成雙鏈，亦可進而於其他區域形成新穎之雙鏈。以下，將前者之ssPN分子、即於1處形成雙鏈之分子稱為「第一ssPN分子」，將後者之ssPN分子、即於2處形成雙鏈之分子稱為「第二ssPN分子」。以下對上述第一ssPN分子及上述第二ssPN分子進行例示。
(i)第一ssPN分子
上述第一ssPN分子係包含例如上述區域(X)、上述區域(Xc)及上述連接子區域(Lx)之分子。
上述第一ssPN分子例如可自5'側至3'側依序具有上述區域 (Xc)、上述連接子區域(Lx)及上述區域(X)，亦可自3'側至5'側依序具有上述區域(Xc)、上述連接子區域(Lx)及上述區域(X)。
於上述第一ssPN分子中，上述區域(Xc)與上述區域(X)互補。此處，上述區域(Xc)只要具有與上述區域(X)之全部區域或其部分區域互補之序列即可，較佳為含有與上述區域(X)之全部區域或其部分區域互補之序列、或僅由上述互補之序列構成。上述區域(Xc)相對於上述區域(X)之互補之上述全部區域或互補之上述部分區域，例如可互補，亦可為1個或數個鹼基非互補，較佳為互補。上述1個鹼基或數個鹼基例如為1~3個鹼基，較佳為1個鹼基或2個鹼基。
於上述第一ssPN分子中，上述表現抑制序列含有於上述區域(Xc)及上述區域(X)之至少一者中。上述第一ssPN分子例如可具有1個上述表現抑制序列，亦可具有2個以上。於後者之情形時，上述第一ssPN分子例如可具有2個以上針對NEK6基因之相同之表現抑制序列，亦可具有2個以上針對NEK6基因之不同之表現抑制序列。於上述第一ssPN分子具有2個以上之上述表現抑制序列之情形時，各表現抑制序列之配置部位並無特別限制，可為上述區域(X)及上述區域(Xc)之任意一個區域，亦可為不同之區域。
依照圖2之示意圖對上述第一ssPN分子之一例進行說明。圖2(A)係對於作為一例之上述ssPN分子，表示各區域之順序之概略的示意圖，圖2(B)係表示上述ssPN分子於上述分子內形成雙鏈之狀態之示意圖。如圖2(B)所示，上述ssPN分子於上述區域(Xc)與上述區域(X)之間形成雙鏈，上述Lx區域根據其長度而採用環結構。圖2終究係表示上述區域之連結順序及形成雙鏈之各區 域之位置關係者，例如，各區域之長度、上述連接子區域(Lx)之形狀等並不受此限制。
於上述第一ssPN分子中，上述區域(Xc)及上述區域(X)之鹼基數並無特別限制。以下例示各區域之長度，但本發明並不受此限制。
上述區域(Xc)可例如與上述區域(X)之全部區域互補。於該情形時，意指上述區域(Xc)例如包含與自上述區域(X)之5'末端至3'末端之全部區域互補之鹼基序列，即，意指上述區域(Xc)與上述區域(X)為相同之鹼基長度，且上述區域(Xc)之全部鹼基與上述區域(X)之全部鹼基互補。
又，上述區域(Xc)可例如與上述區域(X)之部分區域互補。於該情形時，意指上述區域(Xc)例如包含與上述區域(X)之部分區域互補之鹼基序列，即，意指上述區域(Xc)包含較上述區域(X)短1個鹼基以上之鹼基長度之鹼基序列，上述區域(Xc)之全部鹼基與上述區域(X)之上述部分區域之全部鹼基互補。上述區域(X)之上述部分區域較佳為例如上述區域(X)中之包含自上述區域(Xc)側之末端之鹼基(第1個鹼基)起連續的鹼基序列之區域。
於上述第一ssPN分子中，上述區域(X)之鹼基數(X)與上述區域(Xc)之鹼基數(Xc)之關係例如滿足下述(3)或(5)之條件，於前者之情形時，具體而言，例如滿足下述(11)之條件。
X>Xc…(3)
X-Xc=1~10、較佳為1、2或3，更佳為1或2…(11)
X=Xc…(5)
於上述區域(X)及/或上述區域(Xc)含有上述表現抑制序列之情 形時，上述區域例如可為僅由上述表現抑制序列構成之區域，亦可為含有上述表現抑制序列之區域。
上述表現抑制序列之鹼基數例如為15~30個鹼基，較佳為19~25個鹼基，更佳為19~23個鹼基，進而較佳為21、22、23個鹼基，尤佳為23個鹼基。含有上述表現抑制序列之區域例如可於上述表現抑制序列之5'側及/或3'側進而具有附加序列。上述附加序列之鹼基數例如為1~31個鹼基，較佳為1~21個鹼基，更佳為1~11個鹼基。
上述區域(X)之鹼基數並無特別限制。於上述區域(X)含有上述表現抑制序列之情形時，其下限例如為19個鹼基。其上限例如為50個鹼基，較佳為40個鹼基，更佳為30個鹼基，進而較佳為25個鹼基。上述區域(X)之鹼基數之具體例例如為19~50個鹼基，較佳為19~30個鹼基，更佳為19~25個鹼基，進而較佳為21、22、23個鹼基，尤佳為23個鹼基。
上述區域(Xc)之鹼基數並無特別限制。其下限例如為19個鹼基，較佳為20個鹼基，更佳為21個鹼基。其上限例如為50個鹼基，較佳為40個鹼基，更佳為30個鹼基，進而較佳為25個鹼基。上述區域(Xc)之鹼基數之具體例例如為19~50個鹼基，較佳為19~30個鹼基，更佳為19~25個鹼基，進而較佳為21、22、23個鹼基，尤佳為21個鹼基。
於上述第一ssPN分子中，上述連接子區域(Lx)之長度並無特別限制。上述連接子區域(Lx)較佳為例如上述區域(X)與上述區域(Xc)可形成雙鏈之長度。於上述連接子區域(Lx)除了含有上述非核苷酸殘基以外亦含有上述核苷酸殘基之情形時，上述連接子 區域(Lx)之鹼基數之下限例如為1個鹼基，較佳為2個鹼基，更佳為3個鹼基，其上限例如為100個鹼基，較佳為80個鹼基，更佳為50個鹼基。上述連接子區域(Lx)之鹼基數之具體例為1~100個鹼基、2~80個鹼基、3~50個鹼基。上述連接子區域(Lx)較佳為於其本身之區域內部不產生自黏合之結構。
上述第一ssPN分子之全長並無特別限制。於上述第一ssPN分子中，上述鹼基數之合計(全長之鹼基數)之下限例如為38個鹼基，較佳為42個鹼基，更佳為44個鹼基，進而較佳為48個鹼基，其上限例如為300個鹼基，較佳為200個鹼基，更佳為150個鹼基，進而較佳為100個鹼基，尤佳為80個鹼基。上述第一ssPN分子之全長之鹼基數合計之具體例為38~300個鹼基、42~200個鹼基、44~150個鹼基、48~100個鹼基、48~80個鹼基。於上述第一ssPN分子中，除上述連接子區域(Lx)以外之鹼基數之合計之下限例如為38個鹼基，較佳為42個鹼基，進而較佳為44個鹼基，上限例如為300個鹼基，較佳為200個鹼基，更佳為150個鹼基，進而較佳為100個鹼基，尤佳為80個鹼基。除上述連接子區域(Lx)以外之鹼基數之合計之具體例為38~300個鹼基、42~200個鹼基、42~150個鹼基、44~100個鹼基、44~80個鹼基。
作為抑制NEK6基因之表現之第一ssPN分子之具體例，可列舉以下之單鏈核酸分子。
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5'-GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC-Lx-GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA-3'(序列編號31)
KB-002
5'-CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC-Lx-GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC-3'(序列編號32)
KB-003
5'-CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC-Lx-GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC-3'(序列編號33)
KB-004
5'-GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC-Lx-GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC-3'(序列編號34)
KB-005
5'-CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC-Lx-GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU-3'(序列編號35)
KB-006
5'-GGAGAUAAGAUGAAUCUCUUCCC-Lx-GGGAAGAGAUUCAUCUUAUCUCCAU-3'(序列編號46)
KB-007
5'-CUAUGGAGAUAAGAUGAAUCUCC-Lx-GGAGAUUCAUCUUAUCUCCAUAGAA-3'(序列編號47)
KB-008
5'-GCGGACUUCCAGAUCGAAAAGCC-Lx-GGCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCCA-3'(序列編號48)
KB-009
5'-CGGACUUCCAGAUCGAAAAGACC-Lx-GGUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCGCC-3'(序列編號49)
KB-010
5'-GACUUCCAGAUCGAAAAGAAGCC-Lx-GGCUUCUUUUCGAUCUGGAAGUCCG-3'(序列編號50)
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5'-GACUCGUUUAUCGAAGACAACCC-Lx-GGGUUGUCUUCGAUAAACGAGUCCA-3'(序列編號61)
式中，Lx係連接子區域Lx，表示下述結構式之L-脯胺酸二醯胺醯胺。
又，作為較佳之第一ssPN分子，可列舉如下單鏈核酸分子：其含有選自序列編號1~5之抑制NEK6基因之表現之序列，僅由區域(X)、連接子區域(Lx)及區域(Xc)構成，自5'側至3'側依序配置上述區域(Xc)、上述連接子區域(Lx)及上述區域(X)，
上述連接子區域(Lx)具有含有吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者之非核苷酸結構，
且上述區域(X)含有上述表現抑制序列。
進而較佳為上述區域(Xc)與上述區域(X)之全部區域或部分區域完全互補之上述單鏈核酸。尤佳為上述區域(X)含有選自由序列編號11~25所構成之群組中之序列之上述單鏈核酸分子。
[表2]
(ii)第二ssPN分子
上述第二ssPN分子係例如除了上述區域(X)、上述連接子區域(Lx)及上述區域(Xc)以外進而具有區域(Y)及與上述區域(Y)互補之區域(Yc)之分子。於上述第二ssPN分子中，上述區域(X)與上述區域(Y)連結而形成內部區域(Z)。再者，只要無特別表示，則上述第二ssPN分子可引用上述第一ssPN分子之記載。
上述第二ssPN分子例如可自5'側至3'側依序具有上述區域(Xc)、上述連接子區域(Lx)、上述區域(X)、上述區域(Y)及上述區域(Yc)。於該情形時，亦將上述區域(Xc)稱為5'側區域(Xc)，將上述內部區域(Z)中之上述區域(X)稱為內部5'側區域(X)，將上述內部區域(Z)中之上述區域(Y)稱為內部3'區域(Y)，將上述區域(Yc)稱為3'側區域(Yc)。又，上述第二ssPN分子例如亦可自3'側至5'側依序具有上述區域(Xc)、上述連接子區域(Lx)、上述區域(X)、上 述區域(Y)及上述區域(Yc)。於該情形時，亦將上述區域(Xc)稱為3'側區域(Xc)，將上述內部區域(Z)中之上述區域(X)稱為內部3'側區域(X)，將上述內部區域(Z)中之上述區域(Y)稱為內部5'區域(Y)，將上述區域(Yc)稱為5'側區域(Yc)。
上述內部區域(Z)中例如上述區域(X)與上述區域(Y)連結。上述區域(X)與上述區域(Y)例如可直接連結，於其等之間不具有中介序列。為了表示與上述區域(Xc)及上述區域(Yc)之序列關係，而將上述內部區域(Z)定義為「上述區域(X)與上述區域(Y)連結而構成」，且於上述內部區域(Z)中，上述區域(X)與上述區域(Y)於上述ssPN分子之使用中，並不限定為分開之獨立之區域。即，例如於上述內部區域(Z)具有上述表現抑制序列之情形時，於上述內部區域(Z)中，可跨上述區域(X)與上述區域(Y)而配置上述表現抑制序列。
於上述第二ssPN分子中，上述區域(Xc)與上述區域(X)互補。此處，上述區域(Xc)只要具有與上述區域(X)之全部區域或其部分區域互補之序列即可，較佳為含有與上述區域(X)之全部區域或其部分區域互補之序列，或者由上述互補之序列構成。上述區域(Xc)可例如與上述區域(X)之互補之上述全部區域或互補之上述部分區域互補，亦可1個或數個鹼基為非互補，較佳為互補。上述1個鹼基或數個鹼基例如為1~3個鹼基，較佳為1個鹼基或2個鹼基。
於上述第二ssPN分子中，上述區域(Yc)與上述區域(Y)互補。此處，上述區域(Yc)只要具有與上述區域(Y)之全部區域或其部分區域互補之序列即可，較佳為含有與上述區域(Y)之全部 區域或其部分區域互補之序列，或者由上述互補之序列構成。上述區域(Yc)例如可與上述區域(Y)之互補之上述全部區域或互補之上述部分區域互補，亦可1個或數個鹼基為非互補，較佳為互補。上述1個鹼基或數個鹼基例如為1~3個鹼基，較佳為1個鹼基或2個鹼基。
於上述第二ssPN分子中，上述表現抑制序列例如含有於由上述區域(X)與上述區域(Y)所形成之上述內部區域(Z)及上述區域(Xc)之至少一者中，進而可含有於上述區域(Yc)中。較佳為於上述內部區域(Z)中含有上述表現抑制序列之ssPN分子。於上述內部區域(Z)具有上述表現抑制序列之情形時，例如可於上述區域(X)及上述區域(Y)之任一者中具有上述表現抑制序列，又，亦可跨上述區域(X)與上述區域(Y)而具有上述表現抑制序列。上述第二ssPN分子例如可具有1個上述表現抑制序列，亦可具有2個以上之上述表現抑制序列。
於上述第二ssPN分子具有2個以上之上述表現抑制序列之情形時，各表現抑制序列之配置部位並無特別限制，可為上述內部區域(Z)及上述區域(Xc)之任一者，亦可為上述內部區域(Z)及上述區域(Xc)之任一者與進而其他不同之區域。
於上述第二ssPN分子中，上述區域(Yc)與上述區域(Y)例如可直接連結，亦可間接連結。於前者之情形時，直接之連結例如可列舉藉由磷酸二酯鍵之連結等。於後者之情形時，例如可列舉於上述區域(Yc)與上述區域(Y)之間具有連接子區域(Ly)，上述區域(Yc)與上述區域(Y)經由上述連接子區域(Ly)而連結之形態等。
於上述第二ssPN分子具有上述連接子區域(Ly)之情 形時，上述連接子區域(Ly)例如可為上述包含核苷酸殘基之連接子，亦可為上文所述之具有含有吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者之非核苷酸結構之連接子。於後者之情形時，上述連接子區域(Ly)例如可以上述式(I)表示，可全部引用上述連接子區域(Lx)中之上述式(I)之說明。
上述區域(Yc)及上述區域(Y)例如分別經由-OR1-或-OR2-而結合於上述連接子區域(Ly)。此處，R1及R2與上文所述之連接子區域(Lx)相同，可存在，亦可不存在。
上述區域(Xc)及上述區域(X)、以及上述區域(Yc)及上述(Y)與上述-OR1-及-OR2-之結合之組合並無特別限制，例如可列舉以下之任一條件。
條件(1)
上述區域(Xc)經由-OR2-，上述區域(X)經由-OR1-，而與上述式(I)之結構結合，上述區域(Yc)經由-OR1-，上述區域(Y)經由-OR2-，而與上述式(I)之結構結合。
條件(2)
上述區域(Xc)經由-OR2-，上述區域(X)經由-OR1-，而與上述式(I)之結構結合，上述區域(Yc)經由-OR2-，上述區域(Y)經由-OR1-，而與上述式(I)之結構結合。
條件(3)
上述區域(Xc)經由-OR1-，上述區域(X)經由-OR2-，而與上述式(I)之結構結合， 上述區域(Yc)經由-OR1-，上述區域(Y)經由-OR2-，而與上述式(I)之結構結合。
條件(4)
上述區域(Xc)經由-OR1-，上述區域(X)經由-OR2-，而與上述式(I)之結構結合，上述區域(Yc)經由-OR2-，上述區域(Y)經由-OR1-，而與上述式(I)之結構結合。
關於上述第二ssPN分子，依照圖3之示意圖對具有上述連接子區域(Ly)之ssPN分子之一例進行說明。圖3(A)係對於作為一例之上述ssPN分子，自5'側向3'側表示各區域之順序之概略的示意圖，圖3(B)係表示上述ssPN分子於上述分子內形成雙鏈之狀態之示意圖。如圖3(B)所示，上述ssPN分子於上述區域(Xc)與上述區域(X)之間、上述區域(Y)與上述區域(Yc)之間形成雙鏈，上述Lx區域及上述Ly區域根據其長度而採用環結構。圖3終究係表示各區域之連結順序及形成雙鏈之各區域之位置關係，例如各區域之長度、連接子區域之形狀等並不受此限制。又，圖3係將上述區域(Xc)示於5'側，但並不受此限制，上述區域(Xc)亦可位於3'側。
於上述第二ssPN分子中，上述區域(Xc)、上述區域(X)、上述區域(Y)及上述區域(Yc)之鹼基數並無特別限制。將各區域之長度例示於以下，但本發明並不受此限制。
上述區域(Xc)例如可與上述區域(X)之全部區域互補。於該情形時，上述區域(Xc)較佳為例如為與上述區域(X)相同之鹼基長度，包含與上述區域(X)之全部區域互補之鹼基序列。上述區域(Xc)更佳為與上述區域(X)相同之鹼基長度，且上述區域(Xc) 之全部鹼基與上述區域(X)之全部鹼基互補。再者，並不受此限制，例如可為1個或數個鹼基為非互補。
又，上述區域(Xc)例如可與上述區域(X)之部分區域互補。於該情形時，上述區域(Xc)較佳為例如為與上述區域(X)之部分區域相同之鹼基長度，即，包含較上述區域(X)短1個鹼基以上之鹼基長度之鹼基序列。上述區域(Xc)更佳為與上述區域(X)之上述部分區域相同之鹼基長度，且上述區域(Xc)之全部鹼基與上述區域(X)之上述部分區域之全部鹼基互補。上述區域(X)之上述部分區域較佳為例如上述區域(X)中之包含自上述區域(Xc)側之末端之鹼基(第1個鹼基)起連續的鹼基序列之區域。
上述區域(Yc)例如與上述區域(Y)之全部區域互補。於該情形時，較佳為上述區域(Yc)例如為與上述區域(Y)相同之鹼基長度，包含與上述區域(Y)之全部區域互補之鹼基序列。上述區域(Yc)更佳為與上述區域(Y)相同之鹼基長度，且上述區域(Yc)之全部鹼基與上述區域(Y)之全部鹼基互補。再者，並不受此限制，例如可為1個或數個鹼基為非互補。
又，上述區域(Yc)例如可與上述區域(Y)之部分區域互補。於該情形時，較佳為上述區域(Yc)例如為與上述區域(Y)之部分區域相同之鹼基長度，即，包含較上述區域(Y)短1個鹼基以上之鹼基長度之鹼基序列。上述區域(Yc)更佳為與上述區域(Y)之上述部分區域相同之鹼基長度，且上述區域(Yc)之全部鹼基與上述區域(Y)之上述部分區域之全部鹼基互補。上述區域(Y)之上述部分區域較佳為例如上述區域(Y)中之包含自上述區域(Yc)側之末端之鹼基(第1個鹼基)起連續的鹼基序列之區域。
於上述第二ssPN分子中，上述內部區域(Z)之鹼基數(Z)與上述區域(X)之鹼基數(X)及上述區域(Y)之鹼基數(Y)之關係、上述內部區域(Z)之鹼基數(Z)與上述區域(Xc)之鹼基數(Xc)及上述區域(Yc)之鹼基數(Yc)之關係例如滿足下述式(1)及(2)之條件。
Z=X+Y．．．(1)
Z≧Xc+Yc．．．(2)
於上述第二ssPN分子中，上述區域(X)之鹼基數(X)與上述區域(Y)之鹼基數(Y)之關係並無特別限制，例如滿足下述式之任一條件。
X=Y．．．(19)
X<Y．．．(20)
X>Y．．．(21)
於第二ssPN分子中，上述區域(X)之鹼基數(X)、上述區域(Xc)之鹼基數(Xc)、上述區域(Y)之鹼基數(Y)及上述區域(Yc)之鹼基數(Yc)之關係例如滿足下述(a)~(d)之任一條件。
(a)滿足下述式(3)及(4)之條件。
X>Xc．．．(3)
Y=Yc．．．(4)
(b)滿足下述式(5)及(6)之條件。
X=Xc．．．(5)
Y>Yc．．．(6)
(c)滿足下述式(7)及(8)之條件。
X>Xc．．．(7)
Y>Yc．．．(8)
(d)滿足下述式(9)及(10)之條件。
X=Xc．．．(9)
Y=Yc．．．(10)
於上述(a)~(d)中，上述區域(X)之鹼基數(X)與上述區域(Xc)之鹼基數(Xc)之差、上述區域(Y)之鹼基數(Y)與上述區域(Yc)之鹼基數(Yc)之差較佳為例如滿足下述條件。
(a)滿足下述式(11)及(12)之條件。
X-Xc=1~10，較佳為1、2、3或4，更佳為1、2或3…(11)
Y-Yc=0．．．(12)
(b)滿足下述式(13)及(14)之條件。
X-Xc=0．．．(13)
Y-Yc=1~10，較佳為1、2、3或4，更佳為1、2或3…(14)
(c)滿足下述式(15)及(16)之條件。
X-Xc=1~10，較佳為1、2或3，更佳為1或2…(15)
Y-Yc=1~10，較佳為1、2或3，更佳為1或2…(16)
(d)滿足下述式(17)及(18)之條件。
X-Xc=0．．．(17)
Y-Yc=0．．．(18)
關於上述(a)~(d)之第二ssPN分子，依照圖4之示意圖對各結構之一例進行說明。圖4係含有上述連接子區域(Lx)及上 述連接子區域(Ly)之ssPN，(A)為上述(a)之ssPN分子之例，(B)為上述(b)之ssPN分子之例，(C)為上述(c)之ssPN分子之例，(D)為上述(d)之ssPN分子之例。於圖4中，虛線表示藉由自黏合形成雙鏈之狀態。圖4之ssPN分子將上述區域(X)之鹼基數(X)與上述區域(Y)之鹼基數(Y)表示為上述式(20)之「X<Y」，但並不受此限制，亦可為上述式(19)之「X=Y」，亦可為上述式(21)之「X>Y」。又，圖4終究係表示上述區域(X)與上述區域(Xc)之關係、上述區域(Y)與上述區域(Yc)之關係之示意圖，例如各區域之長度、形狀、連接子區域(Ly)之有無等並不受此限制。
上述(a)~(c)之ssPN分子係例如藉由上述區域(Xc)與上述區域(X)、及上述區域(Yc)與上述區域(Y)分別形成雙鏈，而於上述內部區域(Z)中具有與上述區域(Xc)及上述區域(Yc)均不對準之鹼基之結構，亦可稱為具有不形成雙鏈之鹼基之結構。以下，將於上述內部區域(Z)中上述不對準之鹼基(亦稱為不形成雙鏈之鹼基)稱為「自由鹼基」。於圖4中，以「F」表示上述自由鹼基之區域。上述區域(F)之鹼基數並無特別限制。上述區域(F)之鹼基數(F)例如於上述(a)之ssPN分子之情形時，為「X-Xc」之鹼基數，於上述(b)之ssPN分子之情形時，為「Y-Yc」之鹼基數，於上述(c)之ssPN分子之情形時，為「X-Xc」之鹼基數與「Y-Yc」之鹼基數之合計數。
另一方面，上述(d)之ssPN分子係例如上述內部區域(Z)之全部區域與上述區域(Xc)及上述區域(Yc)對準之結構，亦可稱為上述內部區域(Z)之全部區域形成雙鏈之結構。再者，於上述(d)之ssPN分子中，上述區域(Xc)之5'末端與上述區域(Yc)之3'末端未 連結。
上述區域(Xc)、上述區域(Yc)、及上述內部區域(Z)中之上述自由鹼基(F)之鹼基數之合計成為上述內部區域(Z)之鹼基數。因此，上述區域(Xc)及上述區域(Yc)之長度例如可根據上述內部區域(Z)之長度、上述自由鹼基之個數及其位置而適當決定。
上述內部區域(Z)之鹼基數例如為19個鹼基以上。上述鹼基數之下限例如為19個鹼基，較佳為20個鹼基，更佳為21個鹼基。上述鹼基數之上限例如為50個鹼基，較佳為40個鹼基，更佳為30個鹼基。上述內部區域(Z)之鹼基數之具體例例如為19~50個鹼基、20~40個鹼基、21~30個鹼基、21~25個鹼基。
於上述內部區域(Z)含有上述表現抑制序列之情形時，上述內部區域(Z)例如可為僅由上述表現抑制序列構成之區域，亦可為含有上述表現抑制序列之區域。上述表現抑制序列之鹼基數例如為15~30個鹼基，較佳為19~25個鹼基，更佳為19~23個鹼基，進而較佳為21、22、23個鹼基，尤佳為23個鹼基。於上述內部區域(Z)含有上述表現抑制序列之情形時，可於上述表現抑制序列之5'側及/或3'側進而具有附加序列。上述附加序列之鹼基數例如為1~31個鹼基，較佳為1~21個鹼基，更佳為1~11個鹼基，進而較佳為1~7個鹼基，進而更佳為1~3個鹼基。
上述區域(Xc)之鹼基數例如為1~49個鹼基，較佳為1~39個鹼基，更佳為1~29個鹼基。上述區域(Yc)之鹼基數例如為1~49個鹼基，較佳為1~39個鹼基，更佳為1~29個鹼基。上述區域(Xc)及(Yc)之任一者之鹼基數較佳為1~4個鹼基，進而較佳為1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基。
上述內部區域(Z)、上述區域(Xc)及上述區域(Yc)之鹼基數例如可以上述式(2)之「Z≧Xc+Yc」表示。作為具體例，「Xc+Yc」之鹼基數例如與上述內部區域(Z)相同，或小於上述內部區域(Z)。於後者之情形時，「Z-(Xc+Yc)」例如為1~10，較佳為1~4，更佳為1、2或3。上述「Z-(Xc+Yc)」例如相當於上述內部區域(Z)中之自由區域(F)之鹼基數(F)。
於上述第二ssPN分子中，上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)之長度並無特別限制。上述連接子區域(Lx)係如上文所述。於上述連接子區域(Ly)之構成單位含有鹼基之情形時，上述連接子區域(Ly)之鹼基數之下限例如為1個鹼基，較佳為2個鹼基，更佳為3個鹼基，其上限例如為100個鹼基，較佳為80個鹼基，更佳為50個鹼基。作為具體例，上述各連接子區域之鹼基數例如可例示1~50個鹼基、1~30個鹼基、1~20個鹼基、1~10個鹼基、1~7個鹼基、1~4個鹼基等，但並不受此限制。上述連接子區域(Ly)較佳為於其本身之區域內部不產生自黏合之結構。
上述連接子區域(Ly)例如可與上述連接子區域(Lx)相同，亦可不同。
上述第二ssPN分子之全長並無特別限制。於上述第二ssPN分子中，上述鹼基數之合計(全長之鹼基數)之下限例如為38個鹼基，較佳為42個鹼基，更佳為44個鹼基，進而較佳為48個鹼基，尤佳為50個鹼基，其上限例如為300個鹼基，較佳為200個鹼基，更佳為150個鹼基，進而較佳為100個鹼基，尤佳為80個鹼基。上述第二ssPN分子之全長之鹼基數合計之具體例為38~300個鹼基、42~200個鹼基、44~150個鹼基、48~100個鹼基、 50~80個鹼基。於上述第二ssPN分子中，除上述連接子區域(Lx)及連接子區域(Ly)以外之鹼基數之合計之下限例如為38個鹼基，較佳為42個鹼基，更佳為44個鹼基，進而較佳為48個鹼基，尤佳為50個鹼基，上限例如為300個鹼基，較佳為200個鹼基，更佳為150個鹼基，進而較佳為100個鹼基，進而更佳為80個鹼基，尤佳為60個鹼基。除上述連接子區域(Lx)以外之鹼基數合計之具體例為38~300個鹼基、42~200個鹼基、44~150個鹼基、48~100個鹼基、48~80個鹼基、50~60個鹼基。
ssPN分子只要上述連接子區域(Lx)具有上述非核苷酸結構即可，其他構成單位並無特別限制。上述構成單位例如可列舉核苷酸殘基等。上述核苷酸殘基例如可列舉核糖核苷酸殘基及去氧核糖核苷酸殘基等。上述核苷酸殘基例如可列舉未經修飾之非修飾核苷酸殘基及經修飾之修飾核苷酸殘基等。ssPN分子例如藉由含有上述修飾核苷酸殘基，而可提高核酸酶耐性，提高穩定性。又，ssPN分子例如除了上述核苷酸殘基以外，可進而含有非核苷酸殘基。
上述區域(Xc)、上述區域(X)、上述區域(Y)及上述區域(Yc)之構成單位分別較佳為上述核苷酸殘基。上述各區域例如包含下述(1)~(3)之殘基。
(1)非修飾核苷酸殘基
(2)修飾核苷酸殘基
(3)非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
上述連接子區域(Lx)例如可僅由上述非核苷酸殘基構成，亦可包含上述非核苷酸與上述核苷酸殘基。上述連接子區域(Lx)例如包 含下述(4)~(7)之殘基。
(4)非核苷酸殘基
(5)非核苷酸殘基及非修飾核苷酸殘基
(6)非核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
(7)非核苷酸殘基、非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
上述連接子區域(Ly)之構成單位並無特別限制，例如可列舉上述核苷酸殘基及上述非核苷酸殘基等。上述連接子區域例如可僅由上述核苷酸殘基構成，亦可僅由上述非核苷酸殘基構成，亦可包含上述核苷酸殘基與上述非核苷酸殘基。上述連接子區域例如包含下述(1)~(7)之殘基。
(1)非修飾核苷酸殘基
(2)修飾核苷酸殘基
(3)非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
(4)非核苷酸殘基
(5)非核苷酸殘基及非修飾核苷酸殘基
(6)非核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
(7)非核苷酸殘基、非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
ssPN分子例如可列舉將上述連接子區域(Lx)除外僅由上述核苷酸殘基所構成之分子、除上述核苷酸殘基以外亦含有上述非核苷酸殘基之分子等。於ssPN分子中，上述核苷酸殘基例如可僅為上述非修飾核苷酸殘基，亦可僅為上述修飾核苷酸殘基，亦可為上述非修飾核苷酸殘基及上述修飾核苷酸殘基之兩者。於上述ssPN分子含有上述非修飾核苷酸殘基與上述修飾核苷酸殘基之情形時，上述修飾核苷酸殘基之個數並無特別限制，例如為「1個或 數個」，具體而言，例如為1~5個，較佳為1~4個，更佳為1~3個，最佳為1或2個。於ssPN分子含有上述非核苷酸殘基之情形時，上述非核苷酸殘基之個數並無特別限制，例如為「1個或數個」，具體而言，例如為1或2個。
於ssPN分子中，上述核苷酸殘基例如較佳為核糖核苷酸殘基。於該情形時，本發明之ssPN分子例如亦稱為「P-ssRNA分子」。上述P-ssRNA分子例如可列舉將上述連接子區域(Lx)除外僅由上述核糖核苷酸殘基所構成之分子、除上述核糖核苷酸殘基以外亦含有上述非核苷酸殘基之分子等。於上述P-ssRNA分子中，上述核糖核苷酸殘基例如可僅為上述非修飾核糖核苷酸殘基，亦可僅為上述修飾核糖核苷酸殘基，亦可含有上述非修飾核糖核苷酸殘基及上述修飾核糖核苷酸殘基之兩者。
於上述P-ssRNA分子例如除上述非修飾核糖核苷酸殘基以外亦含有上述修飾核糖核苷酸殘基之情形時，上述修飾核糖核苷酸殘基之個數並無特別限制，例如為「1個或數個」，具體而言，例如為1~5個，較佳為1~4個，更佳為1~3個，最佳為1或2個。相對於上述非修飾核糖核苷酸殘基之上述修飾核糖核苷酸殘基例如可列舉：核糖殘基被取代為去氧核糖殘基之上述去氧核糖核苷酸殘基等。於上述P-ssRNA分子例如除上述非修飾核糖核苷酸殘基以外亦含有上述去氧核糖核苷酸殘基之情形時，上述去氧核糖核苷酸殘基之個數並無特別限制，例如為「1個或數個」，具體而言，例如為1~5個，較佳為1~4個，更佳為1~3個，最佳為1或2個。
作為抑制NEK6基因之表現之較佳之ssPN分子，可列舉如下單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子含有選自序列編號1~5 之NEK6基因之表現抑制序列，且自5'側至3'側依序含有區域(Xc)、連接子區域(Lx)、區域(X)、區域(Y)、連接子區域(Ly)及區域(Yc)，上述區域(X)與上述區域(Y)連結而形成內部區域(Z)，上述區域(Xc)與上述區域(X)互補，上述區域(Yc)與上述區域(Y)互補，且上述連接子區域(Lx)及連接子區域(Ly)具有含有吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者之非核苷酸結構，上述內部區域(Z)含有上述表現抑制序列。
(4)ssNc分子
對作為抑制NEK6基因之表現之核酸之一的ssNc分子進行說明。ssNc分子意指於WO2012/05368中所揭示之單鏈RNA核酸分子，具體而言，如下所述。
ssNc分子之特徵在於：其係含有抑制靶基因之表現之表現抑制序列之單鏈核酸分子，且自5'側至3'側依序含有5'側區域(Xc)、內部區域(Z)及3'側區域(Yc)，上述內部區域(Z)係內部5'側區域(X)及內部3'側區域(Y)連結而構成，上述5'側區域(Xc)與上述內部5'側區域(X)互補，上述3'側區域(Yc)與上述內部3'側區域(Y)互補，上述內部區域(Z)、上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)之至少一者含有上述表現抑制序列。
ssNc分子之5'末端與3'末端未連結，而亦可稱為線性 單鏈核酸分子。本發明之ssNc分子例如於上述內部區域(Z)中，將上述內部5'區域(X)與上述內部3'區域(Y)直接連結。
於ssNc分子中，上述5'側區域(Xc)與上述內部5'側區域(X)互補，上述3'側區域(Yc)與上述內部3'側區域(Y)互補。因此，於5'側，上述區域(Xc)朝向上述區域(X)回折，上述區域(Xc)與上述區域(X)可藉由自黏合而形成雙鏈，又，於3'側，上述區域(Yc)朝向上述區域(Y)回折，上述區域(Yc)與上述區域(Y)可藉由自黏合而形成雙鏈。
如上所述，ssNc分子可於分子內形成雙鏈，係與如例如先前之RNA干擾所使用之siRNA般所分離之2條單鏈RNA藉由黏合而形成雙鏈RNA者明顯不同之結構。
ssNc分子中之上述表現抑制序列可引用ssPN分子之說明。
推測利用ssNc分子抑制NEK6基因之表現之原因在於：藉由採用例如於上述內部區域(Z)、上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)之至少一個區域配置有上述表現抑制序列之結構，而產生RNA干擾或類似於RNA干擾之現象(類RNA干擾之現象)。再者，ssNc分子之機制亦與ssPN分子之機制同樣地不受限定。ssNc分子並非如例如所謂siRNA般，作為包含兩條單鏈RNA之dsRNA向細胞等導入者，又，於細胞內，上述表現抑制序列之切下並非必須。因此，ssNc分子例如可具有類RNA干擾之功能。
於ssNc分子中，上述表現抑制序列係含於上述內部區域(Z)、上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)之至少一個區域中。ssNc分子例如可具有1個上述表現抑制序列，亦可具有2個以 上之上述表現抑制序列。於後者之情形時，ssNc分子例如可具有2個以上對於NEK6基因之相同之表現抑制序列，亦可具有2個以上對於NEK6基因之不同之表現抑制序列。於ssNc分子具有2個以上之上述表現抑制序列之情形時，各表現抑制序列之配置部位並無特別限制，可為上述內部區域(Z)、上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)之任意一個區域，亦可為不同之區域。
上述內部區域(Z)中上述內部5'區域(X)與上述內部3'區域(Y)連結。上述區域(X)與上述區域(Y)例如係直接連結，於其等之間不具有中介序列。為了表示與上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)之序列關係，而將上述內部區域(Z)表示為「上述內部5'側區域(X)與上述內部3'側區域(Y)連結所構成」，且於上述內部區域(Z)中，上述內部5'側區域(X)與上述內部3'側區域(Y)例如於上述ssNc分子之使用中，並不限定為分開之獨立之區域。即，例如於上述內部區域(Z)具有上述表現抑制序列之情形時，於上述內部區域(Z)中，可跨上述區域(X)與上述區域(Y)而配置上述表現抑制序列。
於ssNc分子中，上述5'側區域(Xc)與上述內部5'側區域(X)互補。此處，上述區域(Xc)只要具有與上述區域(X)之全部區域或其部分區域互補之序列即可，具體而言，較佳為例如含有與上述區域(X)之全部區域或其部分區域互補之序列，或者由上述互補之序列構成。上述區域(Xc)可例如與上述區域(X)之互補之上述全部區域或互補之上述部分區域完全互補，亦可1個或數個鹼基為非互補，較佳為互補。於ssNc分子中，上述3'側區域(Yc)與上述內部3'側區域(Y)互補。此處，上述區域(Yc)只要具有與上述區域(Y)之全部區域或其部分區域互補之序列即可，具體而言，較佳為例如含 有與上述區域(Y)之全部區域或其部分區域互補之序列，或者由上述互補之序列構成。上述區域(Yc)可例如與上述區域(Y)之互補之上述全部區域或互補之上述部分區域完全互補，亦可1個或數個鹼基為非互補，較佳為互補。上述1個鹼基或數個鹼基例如為1~3個鹼基，較佳為1個鹼基或2個鹼基。
於ssNc分子中，上述5'側區域(Xc)與上述內部5'側區域(X)例如可直接連結，亦可間接連結。於前者之情形時，直接之連結例如可列舉藉由磷酸二酯鍵之連結。於後者之情形時，例如可列舉於上述區域(Xc)與上述區域(X)之間具有連接子區域(Lx)，上述區域(Xc)與上述區域(X)經由上述連接子區域(Lx)連結之形態。
於ssNc分子中，上述3'側區域(Yc)與上述內部3'側區域(Y)例如可直接連結，亦可間接連結。於前者之情形時，直接之連結例如可列舉藉由磷酸二酯鍵之連結。於後者之情形時，例如可列舉於上述區域(Yc)與上述區域(Y)之間具有連接子區域(Ly)，上述區域(Yc)與上述區域(Y)經由上述連接子區域(Ly)連結之形態。
ssNc分子例如可具有上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)之兩者，亦可具有任一者。作為後者之情形，可列舉於上述5'側區域(Xc)與上述內部5'側區域(X)之間具有上述連接子區域(Lx)，且於上述3'側區域(Yc)與上述內部3'側區域(Y)之間不具有上述連接子區域(Ly)之形態，即將上述區域(Yc)與上述區域(Y)直接連結之形態。又，作為後者之情形，可列舉於上述3'側區域(Yc)與上述內部3'側區域(Y)之間具有上述連接子區域(Ly)，且於上述5'側區域(Xc)與上述內部5'側區域(X)之間不具有上述連接子區域(Lx)之形態，即將上述區域(Xc)與上述區域(X)直接連結之形態。
上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)分別較佳為於其本身之區域內部不產生自黏合之結構。
關於ssNc分子，依照圖5之示意圖對不具有上述連接子區域之ssNc分子之一例進行說明。圖5(A)對於上述ssNc分子，自5'側向3'側表示各區域之順序之概略的示意圖，圖5(B)係表示上述ssNc分子於上述分子內形成雙鏈之狀態之示意圖。如圖5(B)所示，上述ssNc分子中上述5'側區域(Xc)回折，於上述5'側區域(Xc)與上述內部5'側區域(X)之間形成雙鏈，上述3'側區域(Yc)回折，於上述3'側區域(Yc)與上述內部3'側區域(Y)之間形成雙鏈。圖5終究係表示各區域之連結順序及形成雙鏈之各區域之位置關係者，例如各區域之長度等並不受此限制。
關於ssNc分子，依照圖3之示意圖對具有上述連接子區域之ssNc分子之一例進行說明。圖3(A)係對於作為一例之上述ssNc分子，自5'側向3'側表示各區域之順序之概略的示意圖，圖3(B)係表示上述ssNc分子於上述分子內形成雙鏈之狀態之示意圖。如圖3(B)所示，上述ssNc分子於上述5'側區域(Xc)與上述內部5'側區域(X)之間、上述內部3'側區域(Y)與上述3'側區域(Yc)之間形成雙鏈，上述Lx區域及上述Ly區域採用環結構。圖3終究係表示各區域之連結順序及形成雙鏈之各區域之位置關係者，例如各區域之長度等並不受此限制。
於ssNc分子中，上述5'側區域(Xc)、上述內部5'側區域(X)、上述內部3'側區域(Y)及上述3'側區域(Yc)之鹼基數並無特別限制，例如如以下所述。
上述5'側區域(Xc)例如可與上述內部5'側區域(X)之全部區域 互補。於該情形時，上述區域(Xc)較佳為例如為與上述區域(X)相同之鹼基長度，包含與上述區域(X)之5'末端至3'末端之全部區域互補之鹼基序列。上述區域(Xc)更佳為與上述區域(X)相同之鹼基長度，且較佳為上述區域(Xc)之全部鹼基與上述區域(X)之全部鹼基互補。再者，並不受此限制，例如可為1個或數個鹼基為非互補。
又，上述5'側區域(Xc)例如可與上述內部5'側區域(X)之部分區域互補。於該情形時，上述區域(Xc)較佳為例如為與上述區域(X)之部分區域相同之鹼基長度，即，包含較上述區域(X)短1個鹼基以上之鹼基長度之鹼基序列。上述區域(Xc)更佳為與上述區域(X)之上述部分區域相同之鹼基長度，且較佳為上述區域(Xc)之全部鹼基與上述區域(X)之上述部分區域之全部鹼基互補。上述區域(X)之上述部分區域較佳為例如上述區域(X)中之包含自5'末端之鹼基(第1個鹼基)起連續之鹼基序列之區域(片段)。
上述3'側區域(Yc)例如可與上述內部3'側區域(Y)之全部區域互補。於該情形時，上述區域(Yc)較佳為例如與上述區域(Y)相同之鹼基長度，包含與上述區域(Y)之5'末端至3'末端之全部區域互補之鹼基序列。上述區域(Yc)更佳為與上述區域(Y)相同之鹼基長度，且較佳為上述區域(Yc)之全部鹼基與上述區域(Y)之全部鹼基互補。再者，並不受此限制，例如可為1個或數個鹼基為非互補。
又，上述3'側區域(Yc)例如可與上述內部3'側區域(Y)之部分區域互補。於該情形時，上述區域(Yc)較佳為例如與上述區域(Y)之部分區域相同之鹼基長度，即，包含較上述區域(Y)短1個鹼基以上之鹼基長度之鹼基序列。上述區域(Yc)更佳為與上述區域(Y)之上述部分區域相同之鹼基長度，且較佳為上述區域(Yc)之全部 鹼基與上述區域(Y)之上述部分區域之全部鹼基互補。上述區域(Y)之上述部分區域較佳為例如上述區域(Y)中之包含自3'末端之鹼基(第1個鹼基)起連續之鹼基序列之區域(片段)。
於ssNc分子中，上述內部區域(Z)之鹼基數(Z)與上述內部5'側區域(X)之鹼基數(X)及上述內部3'側區域(Y)之鹼基數(Y)之關係、上述內部區域(Z)之鹼基數(Z)與上述內部5'側區域(Xc)之鹼基數(Xc)及上述5'側區域(Yc)之鹼基數(Yc)之關係例如滿足下述式(1)及(2)之條件。
Z=X+Y．．．(1)
Z≧Xc+Yc．．．(2)
於ssNc分子中，上述內部5'側區域(X)之鹼基數(X)與上述內部3'側區域(Y)之鹼基數(Y)之長度之關係並無特別限制，例如，可滿足下述式之任一條件。
X=Y．．．(19)
X<Y．．．(20)
X>Y．．．(21)
於ssNc分子中，上述內部5'側區域(X)之鹼基數(X)、上述5'側區域(Xc)之鹼基數(Xc)、上述內部3'側區域(Y)之鹼基數(Y)及上述3'側區域(Yc)之鹼基數(Yc)之關係例如滿足下述(a)~(d)之任一條件。
(a)滿足下述式(3)及(4)之條件。
X>Xc．．．(3)
Y=Yc．．．(4)
(b)滿足下述式(5)及(6)之條件。
X=Xc．．．(5)
Y>Yc．．．(6)
(c)滿足下述式(7)及(8)之條件。
X>Xc．．．(7)
Y>Yc．．．(8)
(d)滿足下述式(9)及(10)之條件。
X=Xc．．．(9)
Y=Yc．．．(10)
於上述(a)~(d)中，上述內部5'側區域(X)之鹼基數(X)與上述5'側區域(Xc)之鹼基數(Xc)之差、上述內部3'側區域(Y)之鹼基數(Y)與上述3'側區域(Yc)之鹼基數(Yc)之差較佳為例如滿足下述條件。
(a)滿足下述式(11)及(12)之條件。
X-Xc=1~10，較佳為1、2、3或4，更佳為1、2或3…(11)
Y-Yc=0．．．(12)
(b)滿足下述式(13)及(14)之條件。
X-Xc=0．．．(13)
Y-Yc=1~10，較佳為1、2、3或4，更佳為1、2或3…(14)
(c)滿足下述式(15)及(16)之條件。
X-Xc=1~10，較佳為1、2或3， 更佳為1或2．．．(15)
Y-Yc=1~10，較佳為1、2或3， 更佳為1或2．．．(16)
(d)滿足下述式(17)及(18)之條件。
X-Xc=0．．．(17)
Y-Yc=0．．．(18)
關於上述(a)~(d)之ssNc分子，依照圖4之示意圖對各自之結構之一例進行說明。圖4係含有上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)之ssNc，(A)係上述(a)之ssNc分子之例，(B)係上述(b)之ssNc分子之例，(C)係上述(c)之ssNc分子之例，(D)係上述(d)之ssNc分子之例。於圖4中，虛線表示藉由自黏合形成雙鏈之狀態。圖4之ssNc分子係將上述內部5'側區域(X)之鹼基數(X)與上述內部3'側區域(Y)之鹼基數(Y)表示為上述式(20)之「X<Y」，但並不受此限制，亦可為上述式(19)之「X=Y」，亦可為上述式(21)之「X>Y」。又，圖4終究係表示上述內部5'側區域(X)與上述5'側區域(Xc)之關係、上述內部3'側區域(Y)與上述3'側區域(Yc)之關係之示意圖，例如各區域之長度、形狀等並不受此限制，又，連接子區域(Lx)及連接子區域(Ly)之有無亦不受此限制。
上述(a)~(c)之ssNc分子係例如藉由上述5'側區域(Xc)與上述內部5'側區域(X)、及上述3'側區域(Yc)與上述內部3'側區域(Y)分別形成雙鏈，而於上述內部區域(Z)中具有與上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)均無法對準之鹼基之結構，亦可稱為具有不形成雙鏈之鹼基之結構。以下，將於上述內部區域(Z)中上述無法對準之鹼基(亦稱為不形成雙鏈之鹼基)稱為「自由鹼基」。於圖4中，以「F」表示上述自由鹼基之區域。上述區域(F)之鹼基數並無特別限制。上述區域(F)之鹼基數(F)例如於上述(a)之ssNc分子之 情形時，為「X-Xc」之鹼基數，於上述(b)之ssNc分子之情形時，為「Y-Yc」之鹼基數，於上述(c)之ssNc分子之情形時，為「X-Xc」之鹼基數與「Y-Yc」之鹼基數之合計數。
另一方面，上述(d)之ssNc分子係例如上述內部區域(Z)之全部區域與上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)對準之結構，亦可稱為上述內部區域(Z)之全部區域形成雙鏈之結構。再者，於上述(d)之ssNc分子中，上述5'側區域(Xc)之5'末端與上述3'側區域(Yc)之3'末端未連結。
上述5'側區域(Xc)、上述3'側區域(Yc)、及上述內部區域(Z)中之上述自由鹼基(F)之鹼基數之合計例如成為上述內部區域(Z)之鹼基數。因此，上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)之長度例如可根據上述內部區域(Z)之長度、上述自由鹼基之個數(F)及其位置而適當決定。
上述內部區域(Z)之鹼基數例如為19個鹼基以上。上述鹼基數之下限例如為19個鹼基，較佳為20個鹼基，更佳為21個鹼基。上述鹼基數之上限例如為50個鹼基，較佳為40個鹼基，更佳為30個鹼基。上述內部區域(Z)之鹼基數之具體例例如為19~50個鹼基、20~40個鹼基、21~30個鹼基、21~23個鹼基。
於上述內部區域(Z)含有上述表現抑制序列之情形時，上述內部區域(Z)例如可為僅由上述表現抑制序列構成之區域，亦可為含有上述表現抑制序列之區域。上述表現抑制序列之鹼基數例如為15~30個鹼基，較佳為19~25個鹼基，更佳為19~23個鹼基，進而較佳為21、22、23個鹼基，尤佳為23個鹼基。於上述內部區域(Z)含有上述表現抑制序列之情形時，可於上述表現抑制序 列之5'側及/或3'側進而具有附加序列。上述附加序列之鹼基數例如為1~31個鹼基，較佳為1~21個鹼基，更佳為1~11個鹼基，進而較佳為1~7個鹼基，進而更佳為1~3個鹼基。
上述5'側區域(Xc)之鹼基數例如為1~49個鹼基，較佳為1~39個鹼基，更佳為1~29個鹼基。上述3'側區域(Yc)之鹼基數例如為1~49個鹼基，較佳為1~39個鹼基，更佳為1~29個鹼基。上述5'側區域(Xc)及3'側區域(Yc)之任一者之鹼基數較佳為1~4個鹼基，進而較佳為1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基。
上述內部區域(Z)、上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)之鹼基數例如可以上述式(2)之「Z≧Xc+Yc」表示。作為具體例，「Xc+Yc」之鹼基數例如與上述內部區域(Z)相同，或小於上述內部區域(Z)。於後者之情形時，「Z-(Xc+Yc)」例如為1~10，較佳為1~4，更佳為1、2或3。上述「Z-(Xc+Yc)」例如相當於上述內部區域(Z)中之上述自由鹼基之區域(F)之鹼基數(F)。
於ssNc分子中，上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)之長度並無特別限制。上述連接子區域(Lx)較佳為例如上述內部5'側區域(X)與上述5'側區域(Xc)可形成雙鏈之長度，上述連接子區域(Ly)較佳為例如上述內部3'側區域(Y)與上述3'側區域(Yc)可形成雙鏈之長度。於上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)之構成單位含有鹼基之情形時，上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)之各自之鹼基數可相同亦可不同，又，其鹼基序列亦為可相同亦可不同。上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)之鹼基數之下限例如為1個鹼基，較佳為2個鹼基，更佳為3個鹼基，其上限例如為100個鹼基，較佳為80個鹼基，更佳為50個鹼基。作 為具體例，上述各連接子區域之鹼基數例如可例示1~50個鹼基、1~30個鹼基、1~20個鹼基、1~10個鹼基、1~7個鹼基、1~4個鹼基等，但並不受此限制。
ssNc分子之全長並無特別限制。於本發明之ssNc分子中，上述鹼基數之合計(全長之鹼基數)之下限例如為38個鹼基，較佳為42個鹼基，更佳為50個鹼基，進而較佳為51個鹼基，尤佳為52個鹼基，其上限例如為300個鹼基，較佳為200個鹼基，更佳為150個鹼基，進而較佳為100個鹼基，進而更佳為80個鹼基，尤佳為60個鹼基。上述ssNc分子之全長之鹼基數合計之具體例為38~300個鹼基、42~200個鹼基、50~150個鹼基、51~100個鹼基、52~80個鹼基。於ssNc分子中，除上述連接子區域(Lx)及連接子區域(Ly)以外之鹼基數合計之下限例如為38個鹼基，較佳為42個鹼基，更佳為50個鹼基，進而較佳為51個鹼基，尤佳為52個鹼基，上限例如為300個鹼基，較佳為200個鹼基，更佳為150個鹼基，進而較佳為100個鹼基，進而更佳為80個鹼基，尤佳為60個鹼基。除上述連接子區域(Lx)以外之鹼基數之合計之具體例為38~300個鹼基、42~200個鹼基、50~150個鹼基、51~100個鹼基、52~80個鹼基、52~60個鹼基。
作為ssNc分子之主要構成單位之上述核苷酸殘基例如可列舉核糖核苷酸殘基及去氧核糖核苷酸殘基。上述核苷酸殘基例如可列舉未經修飾之非修飾核苷酸殘基及經修飾之修飾核苷酸殘基。ssNc分子例如可藉由含有上述修飾核苷酸殘基而提高核酸酶耐性，提高穩定性。又，本發明之ssNc分子例如除了上述核苷酸殘基以外，可進而含有非核苷酸殘基。
於ssNc分子中，上述內部區域(Z)、上述5'側區域(Xc)及上述3'側區域(Yc)之構成單位分別較佳為上述核苷酸殘基。上述各區域例如包含下述(1)~(3)之殘基。
(1)非修飾核苷酸殘基
(2)修飾核苷酸殘基
(3)非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
於ssNc分子中，上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)之構成單位並無特別限制，例如可列舉上述核苷酸殘基及上述非核苷酸殘基。上述連接子區域例如可僅由上述核苷酸殘基構成，亦可僅由上述非核苷酸殘基構成，亦可包含上述核苷酸殘基與上述非核苷酸殘基。上述連接子區域例如包含下述(1)~(7)之殘基。
(1)非修飾核苷酸殘基
(2)修飾核苷酸殘基
(3)非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
(4)非核苷酸殘基
(5)非核苷酸殘基及非修飾核苷酸殘基
(6)非核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
(7)非核苷酸殘基、非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基
於ssNc分子具有上述連接子區域(Lx)及上述連接子區域(Ly)之兩者之情形時，例如兩者之構成單位可相同亦可不同。作為具體例，例如可列舉兩者之連接子區域之構成單位為上述核苷酸殘基之形態、兩者之連接子區域之構成單位為上述非核苷酸殘基之形態、一者之區域之構成單位為上述核苷酸殘基且另一者之連接子區域之構成單位為非核苷酸殘基之形態等。
ssNc分子例如可列舉僅由上述核苷酸殘基構成之分子、除了上述核苷酸殘基以外含有上述非核苷酸殘基之分子等。於本發明之ssNc分子中，上述核苷酸殘基例如可僅為上述非修飾核苷酸殘基，亦可僅為上述修飾核苷酸殘基，亦可為上述非修飾核苷酸殘基及上述修飾核苷酸殘基之兩者。於上述ssNc分子含有上述非修飾核苷酸殘基與上述修飾核苷酸殘基之情形時，上述修飾核苷酸殘基之個數並無特別限制，例如為「1個或數個」，具體而言，例如為1~5個，較佳為1~4個，更佳為1~3個，最佳為1或2個。於ssNc分子含有上述非核苷酸殘基之情形時，上述非核苷酸殘基之個數並無特別限制，例如為「1個或數個」，具體而言，例如為1~8個、1~6個、1~4個、1、2或3個。
於ssNc分子中，上述核苷酸殘基例如較佳為核糖核苷酸殘基。於該情形時，本發明之ssNc分子例如亦稱為「N-ssRNA分子」。上述N-ssRNA分子例如可列舉僅由上述核糖核苷酸殘基構成之分子、除了上述核糖核苷酸殘基以外含有上述非核苷酸殘基之分子。於上述N-ssRNA分子中，上述核糖核苷酸殘基例如可僅為上述非修飾核糖核苷酸殘基，亦可僅為上述修飾核糖核苷酸殘基，亦可含有上述非修飾核糖核苷酸殘基及上述修飾核糖核苷酸殘基之兩者。
於上述N-ssRNA分子例如除了上述非修飾核糖核苷酸殘基以外含有上述修飾核糖核苷酸殘基之情形時，上述修飾核糖核苷酸殘基之個數並無特別限制，例如為「1個或數個」，具體而言，例如為1~5個，較佳為1~4個，更佳為1~3個，最佳為1或2個。相對於上述非修飾核糖核苷酸殘基之上述修飾核糖核苷酸殘基 例如可為核糖殘基被取代為去氧核糖殘基之上述去氧核糖核苷酸殘基。於上述N-ssRNA分子例如除了上述非修飾核糖核苷酸殘基以外含有上述去氧核糖核苷酸殘基之情形時，上述去氧核糖核苷酸殘基之個數並無特別限制，例如為「1個或數個」，具體而言，例如為1~5個，較佳為1~4個，更佳為1~3個，最佳為1或2個。
(5)ssPN分子及ssNc分子之合成方法
ssPN分子及ssNc分子之合成方法並無特別限制，可採用先前公知之方法。上述合成方法例如可列舉利用基因工程手法之合成法、化學合成法等。基因工程手法例如可列舉體外轉錄合成法、使用載體之方法、利用PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)盒之方法等。上述載體並無特別限制，可列舉質體等非病毒載體、病毒載體等。上述化學合成法並無特別限制，例如可列舉亞磷醯胺法及H-膦酸酯法等。上述化學合成法例如可使用市售之自動核酸合成機。上述化學合成法通常使用醯胺。上述醯胺並無特別限制，作為市售之醯胺，例如可列舉：RNA Phosphoramidites(2'-O-TBDMSi，商品名，三千里製藥)、ACE醯胺、TOM醯胺、CEE醯胺、CEM醯胺、TEM醯胺等。又，本發明之ssPN分子及ssNc分子可依照WO2012/05368、WO2012/17919、WO2013/27843、WO2016/159374所記載之製造方法而製造。
(6)反義聚核苷酸
以下對作為抑制NEK6基因之表現之核酸之一的反義聚核苷酸進行說明。
反義聚核苷酸係反義DNA及/或反義RNA，藉由向細胞內導入針對作為目標之基因RNA之全長或一部分之反義核酸而發揮效果。
作為反義聚核苷酸之表現抑制之機制，可列舉：1)以自mRNA之5'端帽部位至起始密碼子之約25個鹼基下游為止之區域作為靶序列之轉譯開始複合體之立體阻礙；2)為與目標mRNA互補之單鏈DNA，經由RNaseH之mRNA分解；3)以pre-mRNA之外顯子與內含子之邊界區域作為靶序列之剪切抑制(mRNA之成熟抑制)，只要為抑制NEK6基因之表現者，則其機制並無特別限制。
就與RNA之結合穩定性(Tm值等)、失配序列識別能力、核酸酶耐性、RNaseH活性等方面而言，反義聚核苷酸較佳為含有修飾核苷酸殘基。
作為修飾核苷酸殘基，較佳為核糖殘基、對磷酸骨架之修飾。
(7)miRNA
以下對作為抑制NEK6基因之表現之核酸之一的miRNA進行說明。
miRNA藉由自mRNA向蛋白質之轉譯之抑制或mRNA之分解，而參與基因之表現調節。miRNA係存在於細胞內之短鏈(20-25個鹼基)之非編碼RNA。miRNA首先由DNA作為含有miRNA與其互補鏈且可採用髮夾環結構之單鏈pri-RNA而轉錄。其次，pri-RNA藉由處於核內之被稱為Drosha之酶，其一部分 被切割，成為pre-RNA，而被輸送至核外。其後，pre-RNA進而被Dicer切割，藉此作為miRNA發揮功能。miRNA向mRNA之3'非轉譯區域進行不完全之雜合，而抑制該mRNA所編碼之蛋白質合成。
抑制NEK6之基因表現之miRNA可基於靶基因之基因名或mRNA序列資訊，例如依照miRDB(http：//mirdb.org/miRDB/index.html)等資料庫而獲得。
(8)核酸所使用之核苷酸殘基
作為本發明之有效成分之核酸所使用之核苷酸殘基含有糖、鹼基及磷酸作為構成要素。上述核苷酸殘基例如可列舉核糖核苷酸殘基及去氧核糖核苷酸殘基等。上述核糖核苷酸殘基例如具有核糖殘基作為糖，具有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)作為鹼基，上述去氧核糖殘基例如具有去氧核糖殘基作為糖，具有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)作為鹼基。
上述核苷酸殘基可列舉非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基等。上述非修飾核苷酸殘基中上述各構成要素例如與天然存在者相同或實質上相同，較佳為與人體中天然存在者相同或實質上相同。
上述修飾核苷酸殘基例如為對上述非修飾核苷酸殘基進行修飾而成之核苷酸殘基。上述修飾核苷酸例如可為上述非修飾核苷酸殘基之構成要素之任一者經修飾。於本發明中，「修飾」例如為上述構成要素之取代、附加及/或缺失、上述構成要素中之原子及/或官能基之取代、附加及/或缺失，可稱為「改型」。上述修飾 核苷酸殘基例如可列舉天然存在之核苷酸殘基、經人工修飾之核苷酸殘基等。上述源自天然之修飾核苷酸殘基例如可參照Limbach等(Limbach et al.1994，Summary：the modified nucleosides of RNA，Nucleic Acids Res.22：2183~2196)。又，上述修飾核苷酸殘基例如可為上述核苷酸之代替物之殘基。
上述核苷酸殘基之修飾例如可列舉核糖-磷酸骨架(以下為核糖磷酸骨架)之修飾等。
於上述核糖磷酸骨架中，例如可對核糖殘基進行修飾。上述核糖殘基例如可對2'位碳進行修飾，具體而言，例如可將鍵結於2'位碳之羥基取代為氫或氟等。藉由將上述2'位碳之羥基取代為氫，可將核糖殘基取代為去氧核糖。上述核糖殘基例如可取代為立體異構物，例如可取代為阿拉伯糖殘基。
上述核糖磷酸骨架例如可取代為具有非核糖殘基及/或非磷酸之非核糖磷酸骨架。上述非核糖磷酸骨架例如可列舉上述核糖磷酸骨架之非帶電體等。經上述非核糖磷酸骨架取代之上述核苷酸之代替物例如可列舉啉基、環丁基、吡咯啶等。除此以外，上述代替物例如可列舉人工核酸單體殘基等。作為具體例，例如可列舉PNA(肽核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid，鎖核酸)、ENA(2'-O,4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids，2'-O,4'-C-伸乙基交聯核酸)等，較佳為PNA。
於上述核糖磷酸骨架中，例如可對磷酸基進行修飾。於上述核糖磷酸骨架中，距糖殘基最近之磷酸基被稱為α磷酸基。上述α磷酸基帶負電，該電荷均勻地分佈於不與糖殘基結合之2個氧原子。上述α磷酸基中之4個氧原子中，於核苷酸殘基間之磷酸 二酯鍵中，不與糖殘基結合之2個氧原子於以下亦稱為「非結合(non-linking)氧」。另一方面，於上述核苷酸殘基間之磷酸二酯鍵中，與糖殘基結合之2個氧原子於以下稱為「結合(linking)氧」。上述α磷酸基較佳為例如進行成為不帶電之修飾、或上述非結合原子中之電荷分佈成為非對稱型之修飾。
上述磷酸基例如可將上述非結合氧取代。上述氧例如可被取代為S(硫)、Se(硒)、B(硼)、C(碳)、H(氫)、N(氮)及OR(R例如為烷基或芳基)之任一原子，較佳為被取代為S。上述非結合氧較佳為例如兩者被取代，更佳為兩者被取代為S。上述修飾磷酸基例如可列舉：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸鹽、硼烷磷酸酯、膦酸氫鹽、胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯、及膦酸三酯等，其中，較佳為上述2個非結合氧之兩者均被取代為S之二硫代磷酸酯。
上述磷酸基例如可將上述結合氧取代。上述氧例如可被取代為S(硫)、C(碳)及N(氮)之任一原子。上述修飾磷酸基例如可列舉經N取代之交聯胺基磷酸酯、經S取代之交聯硫代磷酸酯、及經C取代之交聯亞甲基膦酸酯等。上述結合氧之取代例如較佳為於本發明之ssPN分子之5'末端核苷酸殘基及3'末端核苷酸殘基之至少一者中進行，於5'側之情形時，較佳為利用C之取代，於3'側之情形時，較佳為利用N之取代。
上述磷酸基例如可經上述不含磷之連接子取代。上述連接子例如包括：矽氧烷、碳酸酯、羧甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接子、磺酸酯、磺醯胺、硫代甲縮醛、甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基伸肼基、亞甲基二 甲基伸肼基、及亞甲基氧基甲基亞胺基等，較佳為包括亞甲基羰基胺基及亞甲基甲基亞胺基。
上述末端之核苷酸殘基之修飾例如可列舉其他分子之附加等。上述其他分子例如可列舉如上文所述之標記物質、保護基等功能性分子等。上述保護基例如可列舉S(硫)、Si(矽)、B(硼)、含酯基等。
上述其他分子例如可附加於上述核苷酸殘基之磷酸基，亦可經由間隔基而附加於上述磷酸基或上述糖殘基。上述間隔基之末端原子例如可於上述磷酸基之上述結合氧、或糖殘基之O、N、S或C進行附加或取代。上述糖殘基之結合部位例如較佳為3'位之C或5'位之C、或者結合於該等之原子。上述間隔基例如亦可於上述PNA等核苷酸代替物之末端原子進行附加或取代。
上述間隔基並無特別限制，例如可含有-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、無鹼基糖、醯胺、羧基、胺、氧基胺、氧基亞胺、硫醚、二硫醚、硫脲、磺醯胺、及啉基等、以及生物素試劑及螢光素試劑等。於上述式中，n為正整數，較佳為n=3或6。
於上述末端進行附加之分子除了該等以外，例如可列舉：色素、嵌入劑(例如，吖啶)、交聯劑(例如，補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉(TPPC4、德克薩斯卟啉(texaphyrin)、sapphyrin)、多環式芳香族烴(例如，啡、二氫啡)、人工核酸內切酶(例如，EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸))、親油性載體(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己基、十六烷基甘油、龍腦、薄荷 腦、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基、或啡)及肽複合體(例如，觸足肽(antennapedia peptide)、Tat肽)、烷基化劑、磷酸、胺基、巰基、PEG(polyethylene glycol，聚乙二醇)(例如，PEG-40K)、MPEG(methoxy polyethylene glycol，甲氧基聚乙二醇)、[MPEG]2、聚胺基、烷基、取代烷基、放射線標記標記物、酶、半抗原(例如，生物素)、輸送/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇、吖啶-咪唑複合體、四氮雜大環之Eu3+複合體)等。
核酸分子之上述5'末端例如可經磷酸基或磷酸基類似物修飾。上述磷酸基例如可列舉：5'-磷酸((HO)2(O)P-O-5')、5'二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')、5'三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')、5'-鳥苷端帽(7-甲基化或非甲基化、7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')、5'-腺苷端帽(Appp)、任意之修飾或非修飾核苷酸端帽結構(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')、5'-硫代磷酸(硫代磷酸酯：(HO)2(S)P-O-5')、5'-二硫代磷酸(二硫代磷酸酯：(HO)(HS)(S)P-O-5')、5'-硫磷酸((HO)2(O)P-S-5')、硫取代之一磷酸、二磷酸及三磷酸(例如，5'-α-硫代三磷酸、5'-γ-硫代三磷酸等)、5'-胺基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5'、(HO)(NH2)(O)P-O-5')、5'-烷基膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5'、(OH)2(O)P-5'-CH2，R為烷基(例如，甲基、乙基、異丙基、丙基等))、5'-烷基醚膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5'，R為烷基醚(例如，甲氧基甲基、乙氧基甲基等))等。
於上述核苷酸殘基中，上述鹼基並無特別限制。上述 鹼基例如可為天然之鹼基，亦可為非天然之鹼基。上述鹼基例如可源自天然，亦可為合成品。上述鹼基例如可使用通常之鹼基、其修飾類似物等。
上述鹼基例如可列舉腺嘌呤及鳥嘌呤等嘌呤鹼基、胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶等嘧啶鹼基等。除此以外，上述鹼基可列舉：肌苷、胸腺嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、nubularine、異鳥嘌呤核苷(isoguanisine)、殺結核菌素(tubercidine)等。上述鹼基例如可列舉：2-胺基腺嘌呤、6-甲基化嘌呤等烷基衍生物；2-丙基化嘌呤等烷基衍生物；5-鹵代尿嘧啶及5-鹵代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶及6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(偽尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、5-鹵代尿嘧啶、5-(2-胺基丙基)尿嘧啶、5-胺基烯丙基尿嘧啶；8-鹵化、胺基化、硫醇化、硫代烷基化、羥基化及其他8-取代嘌呤；5-三氟甲基化及其他5-取代嘧啶；7-甲基鳥嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮雜嘧啶；N-2、N-6、及O-6取代嘌呤(包括2-胺基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；二氫尿嘧啶；3-去氮雜-5-氮雜胞嘧啶；2-胺基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷基鳥嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-去氮雜腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二胺基嘌呤；5-胺基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代1,2,4-三唑；2-吡啶酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧基乙酸；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶；3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙醯基胞嘧啶；2-硫胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-異戊基腺嘌呤；2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤；N-甲基鳥嘌呤；O- 烷基化鹼基等。又，嘌呤及嘧啶例如包括美國專利第3,687,808號、「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、858~859頁、Kroschwitz J.I.編、John Wiley & Sons、1990、及Englisch等人、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30卷、p.613所揭示者。
(9)其他用語之定義
作為本發明之有效成分之核酸、連接子等之說明中所使用之用語係該技術領域中通常使用者，例如可如以下所示。
於本發明中，「烷基」例如包括直鏈狀或支鏈狀之烷基。上述烷基之碳數並無特別限制，例如為1~30，較佳為1~6或1~4。上述烷基例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、異己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。較佳為例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、異己基等。
於本發明中，「烯基」例如包括直鏈狀或支鏈狀之烯基。上述烯基可列舉於上述烷基中具有1個或數個雙鍵者等。上述烯基之碳數並無特別限制，例如與上述烷基相同，較佳為2~8。上述烯基例如可列舉：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、3-甲基-2-丁烯基等。
於本發明中，「炔基」例如包括直鏈狀或支鏈狀之炔基。上述炔基可列舉於上述烷基中具有1個或數個三鍵者等。上述炔基之碳數並無特別限制，例如與上述烷基相同，較佳為2~8。上 述炔基例如可列舉乙炔基、丙炔基、丁炔基等。上述炔基例如可進而具有1個或數個雙鍵。
於本發明中，「芳基」例如包括單環芳香族烴基及多環芳香族烴基。上述單環芳香族烴基例如可列舉苯基等。上述多環芳香族烴基例如可列舉：1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基、9-菲基等。較佳為例如可列舉苯基、1-萘基及2-萘基等萘基等。
於本發明中，「雜芳基」例如包括單環芳香族雜環式基及縮合芳香族雜環式基。上述雜芳基例如可列舉：呋喃基(例：2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(例：2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(例：1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(例：1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(例：1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三唑基(例：1,2,4-三唑-1-基、1,2,4-三唑-3-基、1,2,4-三唑-4-基)、四唑基(例：1-四唑基、2-四唑基、5-四唑基)、唑基(例：2-唑基、4-唑基、5-唑基)、異唑基(例：3-異唑基、4-異唑基、5-異唑基)、噻唑基(例：2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻二唑基、異噻唑基(例：3-異噻唑基、4-異噻唑基、5-異噻唑基)、吡啶基(例：2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、嗒基(例：3-嗒基、4-嗒基)、嘧啶基(例：2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋吖基(例：3-呋吖基)、吡基(例：2-吡基)、二唑基(例：1,3,4-二唑-2-基)、苯并呋喃基(例：2-苯并[b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(例：2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、苯并咪唑基 (例：1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、二苯并呋喃基、苯并唑基、苯并噻唑基、喹啉基(例：2-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基)、啉基(例：3-啉基、4-啉基、5-啉基、6-啉基、7-啉基、8-啉基)、喹唑啉基(例：2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(例：2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、呔基(例：1-呔基、5-呔基、6-呔基)、異喹啉基(例：1-異喹啉基、3-異喹啉基、4-異喹啉基、5-異喹啉基、6-異喹啉基、7-異喹啉基、8-異喹啉基)、嘌呤基、喋啶基(例：2-喋啶基、4-喋啶基、6-喋啶基、7-喋啶基)、咔唑基、啡啶基、吖啶基(例：1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(例：1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、異吲哚基、啡基(例：1-啡基、2-啡基)或啡噻基(例：1-啡噻基、2-啡噻基、3-啡噻基、4-啡噻基)等。
於本發明中，「環烷基」例如為環狀飽和烴基，碳數例如為3~15。上述環烷基例如可列舉：環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、橋接環式烴基、螺環烴基等，較佳可列舉：環丙基、環丁基、環戊基、環己基、橋接環式烴基等。
於本發明中，「橋接環式烴基」例如可列舉：雙環[2.1.0]戊基、雙環[2.2.1]庚基、雙環[2.2.2]辛基及雙環[3.2.1]辛基、三環[2.2.1.0]庚基、雙環[3.3.1]壬烷、1-金剛烷基、2-金剛烷基等。
於本發明中，「螺環烴基」例如可列舉螺[3.4]辛基等。
於本發明中，「環烯基」例如包括環狀之不飽和脂肪 族烴基，碳數例如為3~7個。上述基例如可列舉：環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基等，較佳為環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基等。上述環烯基例如亦包括環中具有不飽和鍵之橋接環式烴基及螺環烴基。
於本發明中，「芳烷基」例如可列舉苄基、2-苯乙基、及萘基甲基等，「環烷基烷基」或「環基烷基」例如可列舉環己基甲基、金剛烷基甲基等，「羥烷基」例如可列舉羥基甲基及2-羥基乙基等。
於本發明中，「烷氧基」例如包括上述烷基-O-基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、及正丁氧基等，「烷氧基烷基」例如可列舉甲氧基甲基等，「胺基烷基」例如可列舉2-胺基乙基等。
於本發明中，「雜環基」例如可列舉：1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1-吡咯啶基、2-吡咯啶基、3-吡咯啶基、吡咯啶酮、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑啶基、2-咪唑啶基、4-咪唑啶基、咪唑啶酮、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑啶基、3-吡唑啶基、4-吡唑啶基、哌啶酮、哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌基、2-哌基、哌酮、2-啉基、3-啉基、啉基、四氫吡喃基、四氫呋喃基等。
於本發明中，「雜環基烷基」例如可列舉哌啶基甲基、哌基甲基等，「雜環基烯基」例如可列舉2-哌啶基乙烯基等，「雜芳烷基」例如可列舉吡啶基甲基及喹啉-3-基甲基等。
於本發明中，「矽烷基」包括式R3Si-所表示之基，R獨立地選自上述烷基、芳基及環烷基，例如可列舉三甲基甲矽烷 基、第三丁基二甲基甲矽烷基等，「矽烷氧基」例如可列舉三甲基甲矽烷氧基等，「矽烷氧基烷基」例如可列舉三甲基甲矽烷氧基甲基等。
於本發明中，「伸烷基」例如可列舉：亞甲基、伸乙基、及伸丙基等。
於本發明中，上文所述之各種基可經取代。上述取代基例如可列舉：羥基、羧基、鹵素、鹵化烷基(例：CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亞硝基、氰基、烷基(例：甲基、乙基、異丙基、第三丁基)、烯基(例：乙烯基)、炔基(例：乙炔基)、環烷基(例：環丙基、金剛烷基)、環烷基烷基(例：環己基甲基、金剛烷基甲基)、環烯基(例：環丙烯基)、芳基(例：苯基、萘基)、芳烷基(例：苄基、苯乙基)、雜芳基(例：吡啶基、呋喃基)、雜芳烷基(例：吡啶基甲基)、雜環基(例：哌啶基)、雜環基烷基(例：啉基甲基)、烷氧基(例：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、鹵化烷氧基(例：OCF3)、烯氧基(例：乙烯氧基、烯丙氧基)、芳氧基(例：苯基氧基)、烷氧基羰基(例：甲氧基羰基、乙氧基羰基、第三丁氧基羰基)、芳烷氧基(例：苄氧基)、胺基[烷基胺基(例：甲基胺基、乙基胺基、二甲胺基)、醯基胺基(例：乙醯基胺基、苯甲醯基胺基)、芳烷基胺基(例：苄基胺基、三苯甲基胺基)、羥基胺基]、烷基胺基烷基(例：二乙胺基甲基)、胺磺醯基、側氧基等。
(10)SMAD2/3蛋白質磷酸化抑制劑
所謂SMAD2/3蛋白質之磷酸化抑制，意指抑制(控制)由TGF-β刺激促進之SMAD2及/或SMAD3之磷酸化。
SMAD2/3係因TGF-βI型受體而受到磷酸化之R-SMAD(受體調節(receptor regulated)SMAD)之1種，利用TGF-β刺激後，經磷酸化(活化)之SMAD2及SMAD3係與作為Co-SMAD(通用(common partner)SMAD)之SMAD4一併向核內轉移。如實施例4所示，本發明者等人發現，NEK6蛋白質於細胞內與SMAD2/3蛋白質相互作用，而促進SMAD2/3蛋白質之磷酸化。經磷酸化之SMAD2/3蛋白質形成SMAD蛋白質複合體，並轉移至核內，而使α-SMA、α2-膠原蛋白、干擾素β、介白素-5、VEGF等之轉錄亢進。
因此可理解，藉由利用本發明之SMAD2/3蛋白質磷酸化抑制劑來抑制SMAD訊號系統，可控制α-SMA、α2-膠原蛋白、干擾素β等之轉錄，甚至對於抑制創傷癒合過程中之向纖維母細胞、肝星狀細胞等肌纖維母細胞之分化、控制利用纖維母細胞等之基質合成、調節炎症/免疫反應等有用。
(11)纖維化治療劑
本發明之纖維化治療劑係針對以下疾病之治療劑：肝纖維化、肝硬化、病毒性肝炎、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、酒精性肝病、原發性硬化性膽管炎、血鐵沈積症(hemochromatosis)、威爾森氏症(Wilson's disease)、α1-抗胰蛋白酶缺損症、非病毒性鬱血性肝硬化、藥物性肝損傷、胰臟炎、胰臟纖維化、視網膜纖維化、聲帶瘢痕化、聲帶黏膜纖維化、喉頭纖維化、肺纖維化、間質性肺炎、特發性肺纖維化、非特異性間質性肺炎、隱源性機化性肺炎(Cryptogenic organizing pneumonia)、脫屑性間質性肺炎(desquamative interstitial pneumonitis)、呼吸細支氣管炎相關 間質性肺炎、急性間質性肺炎、淋巴球性間質性肺炎、類肉瘤病、慢性嗜酸性球性肺炎、急性嗜酸性球性肺炎、淋巴管平滑肌增生症(lymphangioleiomyomatosis)、肺泡蛋白質沈積症(Pulmonary Alveolar Proteinosis)、哈布二氏症候群(Hermansky-Pudlak syndrome)、肺部蘭格罕細胞組織球增生症(pulmonary Langerhans' cell histiocytosis)、鐵肺症、澱粉樣變性、肺泡微結石病、過敏性肺炎、塵肺、感染性肺病、藥物性肺炎、放射線肺炎、囊腫性纖維化、骨髓纖維化、腎纖維化、慢性腎功能衰竭、糖尿病性腎病、慢性絲球體腎炎、惡性腎硬化症、多囊腎、藥物性腎損傷、後腹腔纖維化、膠原病、硬皮病、先天性角化不全症、腎源性系統性纖維化，此外，包括呼吸道之纖維化、腸管之纖維化、膀胱之纖維化、前列腺之纖維化、皮膚之纖維化在內之與纖維化廣泛相關之疾病。較佳為肝纖維化、肝硬化、肺纖維化、間質性肺炎、腎纖維化、慢性腎功能衰竭。
本發明之纖維化治療劑之投予方法並無特別限制，較佳為吸入、靜脈注射、經皮投予等非經口投予。關於本發明之治療方法中之本發明之核酸分子的投予量，只要為上述疾病之治療上有效之量，則無特別限制，根據疾病之種類、病情嚴重度、年齡、體重、投予路徑等而有所不同，通常可為成人每次約0.0001~約100mg/kg體重，例如可為約0.001~約10mg/kg體重，較佳可為約0.005~約5mg/kg體重。可將該量例如以每天3次~1個月1次、較佳為每天~每週1次之間隔進行投予。本發明之纖維化治療劑通常與藥學上容許之載體一併作為適當之醫藥組成物進行製劑化並以經口或非經口之形式投予。
以下，藉由實施例等，對本發明進行詳細說明，但本發明並不限定於該等。再者，培養條件係設為37℃、5%CO2下。又，只要無特別記載，則人類肺纖維母細胞株LL29細胞所使用之培養基係含有10%之FCS之F-12K培養基(Gibco公司)，人類初代肝星狀細胞(ScienCell公司)所使用之培養基係含有2%之FCS、1%之Stellate cell growth supplement(星狀細胞生長添加物)(SteCGS，ScienCell公司)之stellate cell(星狀細胞)培養基(ScienCell公司)。
[實施例] 實施例1：使用siRNA之NEK6之減弱
使用Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen公司)，對自IPF患者之肺建立之人類肺纖維母細胞株LL29細胞轉染針對人類NEK6之siRNA(ON-TARGET plus SMART pool siRNA，Dharmacon公司、或Stealth RNAi siRNA，Thermo Fisher Scientific公司)。轉染24小時後，將培養基由含有10%之FCS之F-12K培養基(Gibco公司)更換為含有0.1%之BSA之F-12K培養基。自轉染起72小時後，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)自轉染有siRNA之細胞提取RNA。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(高容量cDNA反轉錄套組)(Applied Biosystems公司)對所獲得之RNA進行反轉錄，而獲得cDNA。對於所獲得之cDNA，使用TaqMan GeneExpression Assays(Applied Biosystems公司)進行即時PCR，研究NEK6之減弱對NEK6基因之轉錄量之影響。NEK6基因之轉錄量係藉由如下方式算出，即用利用NEK6 Taqman Probe(HS00205221_m1，Applied Biosystems公司)所獲得之測定值 除以利用18s Probe所獲得之測定值。18s Probe係將下述之定製合成18s MGB Probe、定製合成18s Primer1、定製合成18s Primer2以分別成為0.2μM、0.4μM、0.4μM之方式加以混合，進行即時PCR。
定製合成18s MGB Probe(Applied Biosystems公司)：5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC-3'(序列編號57)
定製合成18s Primer1(ThermoFisher公司)：5'-CGGCTACCACATCCAAGGAAG-3'(序列編號58)
定製合成18s Primer2(ThermoFisher公司)：5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3'(序列編號59)
siRNA之序列係使用ON-TARGET plus SMART pool siRNA(將序列編號51~54等量混合)及Stealth RNAi siRNA(序列編號55)。
<ON-TARGET plus SMART pool siRNA>
siNEK6：5'-CUGUCCUCGGCCUAUCUUC-3'(序列編號51)
siNEK6：5'-UAUUUGGGUGGUUCAGUUG-3'(序列編號52)
siNEK6：5'-CAACUCCAGCACAAUGUUC-3'(序列編號53)
siNEK6：5'-UACUUGAUCAUCUGCGAGA-3'(序列編號54)
<Stealth RNAi siRNA>
siNEK6：5'-AAGUACUUCCAUACUGUCCUCUCC-3'(序列編號55)
將導入有針對NEK6之ON-TARGET plus SMART pool siRNA之情形時的NEK6之即時PCR之結果示於圖6a，將導入有針對NEK6之Stealth RNAi siRNA之情形時的NEK6之即時PCR之結果示於圖6b。NEK6 siRNA之導入抑制了NEK6基因之轉錄量。因此，表明所使用之NEK6 siRNA有效率地抑制了靶基因之表現。
實施例2：NEK6之減弱對SMAD2/3蛋白質磷酸化之影響
為了研究NEK6蛋白質控制TGF-β訊號之可能性，而對轉染有NEK6 siRNA之細胞中磷酸化SMAD2/3之量進行解析。
使用Lipofectamine RNAi MAX對自IPF患者之肺建立之人類肺纖維母細胞株LL29細胞轉染針對人類NEK6之ON-TARGET plus SMART pool siRNA(Dharmacon公司)或Stealth RNAi siRNA(Thermo Fisher Scientific公司)。轉染24小時後，將培養基由含有10%之FCS之F-12K培養基更換為含有0.1%之BSA之F-12K培養基。轉染48小時後，以最終濃度成為5ng/mL之方式添加人類TGF-β蛋白質(Peprotech公司)。添加TGF-β2小時後，藉由2×SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)sample buffer(樣品緩衝液)[100mM之Tris-HCl pH值6.8，4%之SDS，6M之Urea(脲)，12%之Glycerol(甘油)，2%之protease inhibitor cocktail(蛋白酶抑制劑混合液)(nacalai tesque公司)，1%之phosphatase inhibitor cocktail(蛋白酶抑制劑混合液)(nacalai tesque公司)]將細胞溶解，製成細胞萃取液。以最終濃度分別成為5%、0.025%之方式於所獲得之細胞萃取液中添加β-Mercaptoethanol(β-巰基乙醇)及Bromophenol blue(溴酚藍)後，於95℃下加熱4分鐘而製成樣品。 使用所獲得之樣品實施SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)，將樣品所含之蛋白質根據大小加以分離。其後，將所分離之蛋白質轉錄於PVDF(polyvinylidene fluoride，偏二氟乙烯)薄膜，藉由抗磷酸化SMAD3抗體(Cell Signaling Technology公司)、抗磷酸化SMAD2抗體(Cell Signaling Technology公司)、抗SMAD2/3抗體(Cell Signaling Technology公司)、抗NEK6抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)、抗β-Actin(肌動蛋白)抗體(Sigma Aldrich 公司)進行西方墨點法。
將減弱了NEK6之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質的西方墨點法之結果示於圖7a。藉由使用NEK6之siRNA，NEK6之蛋白質之量減少，且因TGF-β而上升之磷酸化SMAD3之量減少。此時，總SMAD3蛋白質之量未變化。又，將減弱了NEK6之情形時之磷酸化SMAD2蛋白質的西方墨點法之結果示於圖7b。藉由使用NEK6之siRNA，NEK6之蛋白質之量減少，且因TGF-β而上升之磷酸化SMAD2之量減少。此時，總SMAD2蛋白質之量未變化。
因此，表明藉由NEK6之減弱，SMAD2/3蛋白質之磷酸化得到抑制。
實施例3：NEK6蛋白質與SMAD3蛋白質之細胞內之相互作用
為了研究NEK6蛋白質是否於細胞內與SMAD3相互作用而將SMAD3磷酸化，進行共免疫沈澱。
使用X-tremeGENE HP(Roche公司)對自IPF患者之肺建立之人類肺纖維母細胞株LL29細胞轉染選殖有人類NEK6之表 現載體(pEZ-M02 Nek6，Gene Copoeia公司)與選殖有經FLAG標籤標記之人類SMAD3之表現載體(pEZ-M11 Flag-hSmad3，Gene Copoeia公司)。轉染24小時後更換培養基。轉染48小時後，藉由溶解緩衝液(175mM之NaCl，50mM之HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羥乙基)-1-哌乙磺酸)pH值7.6，0.1%之NP40，0.2mM之EDTA pH值8.0，1.4mM之β-Mercaptoethanol，1%之protease inhibitor cocktail，1%之phosphataseinhibitor cocktail)將細胞回收，藉由離心分離獲得上清液。於上清液中添加TrueBlot Anti-Goat(抗山羊)IgIP Beads(Rockland公司)，進行離心分離，而去除非特異性之結合。於由此獲得之上清液中添加作為對照之normal goat(正常山羊)IgG(Santa Cruz Biotechnology公司)、或抗NEK6抗體，於4℃下徹夜培養後，添加TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads，於4℃下培養4小時。進行離心分離而去除上清液後，藉由溶解緩衝液洗淨TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads而去除非特異性之結合。將2×SDS PAGE loading buffer(上樣緩衝液)(100mM之Tris-HCl pH值6.8，4%之SDS，20%之Glycerol，0.2%之Bromophenol blue，50mM之DTT(dithiothreitol，二硫蘇糖醇))添加至TrueBlot Anti-Goat IgIP Beads中，於95℃下加熱5分鐘，而將上清液所含之共免疫沈澱物回收。對於利用抗NEK6抗體獲得之共免疫沈澱物，使用抗SMAD3抗體(Cell Signaling Technology公司)、抗NEK6抗體進行西方墨點法，而檢測是否將NEK6蛋白質與SMAD3蛋白質共沈澱。
將利用抗NEK6抗體獲得之共免疫沈澱之結果示於圖8a。自共免疫沈澱物檢測出NEK6蛋白質與SMAD3蛋白質。
為了解析SMAD3蛋白質是否與NEK6於細胞內相互作用而被磷酸化，而對LL29細胞轉染人類NEK6表現載體與經FLAG標籤標記之人類SMAD3表現載體。轉染24小時後更換培養基。轉染48小時後，藉由溶解緩衝液(250mM之NaCl，50mM之HEPES pH值7.6，0.1%之NP40，0.2mM之EDTA pH值8.0，1.4mM之β-Mercaptoethanol，1%之protease inhibitor cocktail，1%之phosphatase inhibitor cocktail)將細胞回收，藉由離心分離獲得上清液。於所獲得之上清液中添加Anti-FLAG M2 Affinity Gel(Sigma-Aldrich公司)，於4℃下徹夜培養。其後，進行離心分離，去除上清液。藉由溶解緩衝液洗淨Anti-FLAG M2 Affinity Gel而去除非特異性之結合。將2×SDS PAGE loading buffer(100mM之Tris-HCl pH值6.8，4%之SDS，20%之Glycerol，0.2%之Bromophenol blue，50mM之DTT)添加至Anti-FLAG M2 Affinity Gel中，於95℃下加熱4分鐘，而將上清液所含之共免疫沈澱物回收。藉由SDS-PAGE，將所獲得之共免疫沈澱物基於大小分離後，轉錄至PVDF薄膜，對於利用Anti-FLAG M2 Affinity Gel獲得之共免疫沈澱物，使用抗磷酸化SMAD3抗體、抗FLAG抗體(Sigma-Aldrich公司)、抗NEK6抗體進行西方墨點法，檢測是否將NEK6蛋白質與磷酸化SMAD3蛋白質共沈澱。
將利用抗FLAG抗體之共免疫沈澱之結果示於圖8b。自共免疫沈澱物檢測出NEK6蛋白質與FLAG-SMAD3蛋白質。又，藉由人類NEK6之表現載體之轉染，磷酸化SMAD3蛋白質之量上升。
根據於利用抗NEK6抗體獲得之共免疫沈澱物中檢 測出SMAD3蛋白質、及相反地於利用抗FLAG抗體獲得之共免疫沈澱物中檢測出NEK6，表明NEK6蛋白質與SMAD3蛋白質於細胞內相互作用而形成複合體。進而，根據藉由人類NEK6之表現載體之轉染而磷酸化SMAD3蛋白質之量上升，表明NEK6蛋白質於細胞內將SMAD3蛋白質磷酸化。
實施例4：利用NEK6蛋白質之SMAD3蛋白質磷酸化
使用NEK6與SMAD3之精製蛋白質研究NEK6蛋白質直接將SMAD3蛋白質作為受質而磷酸化之可能性。
將His融合NEK6蛋白質(eurofins公司)及GST融合SMAD3蛋白質(Sigma-Aldrich公司)與反應溶劑(150μM之ATP，50mM之HEPES，150mM之NaCl，0.1%之Triton X-100，10mM之MgCl2，1mM之DTT，1%之phosphatase inhibitor cocktail)加以混合，於30℃下培養45分鐘。於反應液中等量添加含有5%之β-Mercaptoethanol及0.025%之Bromophenol blue之2×SDS sample buffer，使反應停止後，於95℃下加熱5分鐘而製成樣品。使用所獲得之樣品實施SDS-PAGE，將反應液所含之蛋白質根據大小加以分離。其後，將所分離之蛋白質轉錄於PVDF薄膜，藉由抗磷酸化SMAD3抗體及抗GST抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)、抗NEK6抗體進行西方墨點法。
將使His融合NEK6蛋白質與GST融合SMAD3蛋白質進行反應之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質的西方墨點法之結果示於圖9。藉由使用NEK6蛋白質，磷酸化SMAD3之量上升。因此，表明NEK6蛋白質直接將SMAD3蛋白質作為受質而磷酸化。
實施例5：NEK6之減弱對SMAD蛋白質複合體之轉錄活性之影響
為了研究NEK6蛋白質是否亦控制SMAD蛋白質複合體之核內轉移後產生之轉錄活性，而實施使用SMAD蛋白質複合體之DNA結合序列與螢光素酶基因之螢光素酶報告基因檢測。又，同時使用所製備之LL29細胞實施西方墨點法，對NEK6之減弱進行確認。
使用Lipofectamine RNAi MAX，對自IPF患者之肺建立之人類肺纖維母細胞株LL29細胞轉染作為針對人類NEK6之siRNA之ON-TARGET plus SMART pool siRNA(Dharmacon公司)。siRNA之轉染24小時後，將培養基由含有10%之FCS之F-12K培養基更換為含有0.4%之FCS之F-12K培養基。siRNA之轉染48小時後，使用Lipofectamine LTX with PLUS reagent(Thermo Fisher Scientific公司)轉染選殖有SMAD蛋白質複合體之DNA結合序列[SMAD biding element(SBE)]與螢火蟲螢光素酶基因之表現載體(pTL-SBE-luc：5'-AGTATGTCTAGACTGAAGTATGTCTAGACTGAAGTATGTCTAGACTGA-3'(序列編號60)，Panomics公司)及含有野生型海腎螢光素酶(Renilla luciferase)之報告基因檢測修正用之載體(pRL-TK：Promega公司)。表現載體之轉染2小時後，以最終濃度成為10ng/mL之方式添加人類TGF-β蛋白質。TGF-β之添加24小時後，藉由2×SDS sample buffer(100mM之Tris-HCl pH值6.8，4%之SDS，6M之Urea，12%之Glycerol，2%之protease inhibitor cocktail，1%之phosphatase inhibitor cocktail)將細胞溶解。藉由SDS-PAGE將所獲得之細胞萃取液所含之蛋白質分離後，將蛋白質轉錄至PVDF薄 膜，藉由抗SMAD3抗體、抗NEK6抗體、抗Vinculin(黏著斑蛋白)抗體進行西方墨點法。又，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(雙螢光素酶報告基因檢測系統)(Promega公司)將以與上述同樣之方式製備之LL29細胞回收，測定螢火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶之發光。藉由海腎螢光素酶之發光量修正螢火蟲螢光素酶之發光量。
將減弱了NEK6之情形時之西方墨點法之結果示於圖10a。表明藉由使用NEK6之siRNA，NEK6之蛋白質之量減少，但SMAD3蛋白質之量未變化。將減弱了NEK6之情形時之經海腎螢光素酶修正的螢火蟲螢光素酶之發光量示於圖10b。藉由使用NEK6之siRNA，因TGF-β而上升之螢火蟲螢光素酶之發光量減少。因此，表明藉由NEK6之減弱，SMAD蛋白質複合體之轉錄活性受到抑制。
實施例6：NEK6之減弱對纖維化相關基因之轉錄量之影響
為了研究NEK6之減弱對纖維化表現出治療效果，而對轉染有NEK6 siRNA之細胞中之纖維化相關基因之轉錄量進行解析。
使用Lipofectamine RNAi MAX對自IPF患者之肺建立之人類肺纖維母細胞株LL29細胞轉染針對人類NEK6之siRNA(ON-TARGET plus SMART pool siRNA，Dharmacon公司)。轉染24小時後，將培養基由含有10%之FCS之F-12K培養基更換為含有0.1%之BSA之F-12K培養基。轉染48小時後，以最終濃度成為1ng/mL之方式添加人類TGF-β蛋白質。轉染72小時後，使用RNeasy Mini Kit自轉染有siRNA之細胞提取RNA。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit對所獲得之RNA進行反轉錄，而獲得cDNA。對於所獲得之cDNA，使用TaqMan GeneExpression Assays進行即時PCR，檢測NEK6之減弱對基因之轉錄量之影響。Col1a1基因與αSMA基因之轉錄量係藉由利用Col1a1 Taqman Probe(HS00164004_m1，Applied Biosystems公司)獲得之測定值、或利用αSMA Taqman Probe(HS00426835_g1，Applied Biosystems公司)獲得之測定值除以利用18s Probe獲得之測定值而算出。
將減弱了NEK6之情形時之Col1a1之轉錄量示於圖11a，將減弱了NEK6之情形時之αSMA基因之轉錄量示於圖11b。藉由使用NEK6之siRNA，因TGF-β而上升之Col1a1、αSMA、基因之轉錄量減少。因此，表明NEK6之減弱對纖維化表現出治療效果。
實施例7：單鏈核酸分子之合成
基於亞磷醯胺法，藉由核酸合成機(商品名ABI3900 DNA Synthesizer，Applied Biosystems)合成以下所示之核酸分子。使用CPG(Controlled Pore Glass，受控微孔玻璃)作為固相載體，進行使用EMM醯胺(國際公開第2013/027843號)作為RNA醯胺之固相合成。自固相載體之切下及磷酸基保護基之去保護、鹼基保護基之去保護、2'-羥基保護基之去保護係依照常規方法。所合成之單鏈核酸分子係藉由HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)進行精製。
於本發明之下述單鏈核酸分子中，Lx係連接子區域 Lx，表示下述結構式之L-脯胺酸二醯胺醯胺。
又，下述單鏈核酸分子中之下劃線部分係NEK6之基因表現抑制序列。
KB-001
5'-GAGGGAGUUCCAACAACCUCUCC-Lx-GGAGAGGUUGUUGGAACUCCCUCCA-3'(序列編號31)
KB-002
5'-CGAGGCAGGACUGUGUCAAGGCC-Lx-GGCCUUGACACAGUCCUGCCUCGCC-3'(序列編號32)
KB-003
5'-CGUGGAGCACAUGCAUUCACGCC-Lx-GGCGUGAAUGCAUGUGCUCCACGGC-3'(序列編號33)
KB-004
5'-GAUAAGAUGAAUCUCUUCUCCCC-Lx-GGGGAGAAGAGAUUCAUCUUAUCUC-3'(序列編號34)
KB-005
5'-CAGAGACCUGACAUCGGAUACCC-Lx-GGGUAUCCGAUGUCAGGUCUCUGGU-3'(序列編號35)
實施例8：ssPN分子(單鏈核酸分子)之體外(in vitro)評價
實施針對NEK6所設計之ssPN分子(單鏈核酸分子)於體外(in vitro)之評價。各項目之測定方法係依照上述藉由ON-TARGET plus SMART pool siRNA與Stealth RNAi siRNA進行之方法(實施例1、2及6)。KB-001~005之ssPN核酸全部抑制NEK6之轉錄量，有效率地減弱靶基因。進而，藉由使KB-001~005之ssPN核酸發揮作用，確認到磷酸化SMAD3之蛋白質量之減少。
又，關於KB-001與KB-003，將研究對纖維化相關基因(Col1a1及αSMA)之轉錄量造成之影響所獲得之結果示於圖12。將使KB-001或KB-003發揮作用之情形時之Col1a1基因之轉錄量示於圖12a，將使KB-001或KB-003發揮作用之情形時之αSMA基因之轉錄量示於圖12b。確認到KB-001及KB-003之任一ssPN分子均抑制纖維化相關基因之轉錄量。根據該等結果，可確認到針對NEK6所設計之ssPN分子(單鏈核酸分子)之纖維化抑制作用。
實施例9：利用NEK6之體內(in vivo)減弱之抗纖維化作用之驗證
為了確認NEK6之減弱對纖維化表現出治療效果，而對博萊黴素肺纖維化模型小鼠投予NEK6 siRNA，解析抗纖維化作用。
對於7週齡之Crl：CD1(ICR)小鼠(Charles River Laboratories Japan公司)，以0.4mg/kg體重之容量投予博萊黴素(日本化藥股份有限公司)，而製作肺纖維化模型小鼠。NEK6 siRNA係以每2天~7天1次之頻度，以50mg/kg體重作為最大容量進行投予。於NEK6 siRNA之投予期間，按照每週1次之頻度，藉由實驗 動物用Mirco CT(micro Computed Tomography，微計算機斷層掃描技術)進行圖像診斷。於自，NEK6 siRNA之初次投予起第14~30天進行解剖，將肺取出。使用所取出之肺進行纖維化相關基因之轉錄量、纖維化相關蛋白質之表現量之測定、病理學解析等。藉由該等，可確認與NEK6 siRNA未投予組相比，於NEK6 siRNA投予組纖維化受到抑制，表現出於NEK6 siRNA之肺纖維化模型小鼠中之抗纖維化作用。
實施例10：肝星狀細胞中之NEK6 siRNA對SMAD3蛋白質磷酸化之影響
為了研究於肝星狀細胞中NEK6蛋白質控制TGF-β訊號之可能性，於轉染有NEK6 siRNA之細胞中對磷酸化SMAD3之量進行解析。
將自人之肝臟單離之人類初代肝星狀細胞(ScienCell公司)於聚-L-離胺酸(PLL)塗佈細胞培養皿上培養5天。其後，使用Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen公司)轉染針對人類NEK6之siRNA(KB-004)。轉染48小時後，將培養基由含有2%之FCS、1%之Stellate cell growth supplement(SteCGS，ScienCell公司)之stellate cell培養基(ScienCell公司)更換為含有0.2%之FCS、1%之SteCGS之stellate cell培養基。轉染72小時後，以最終濃度成為100ng/ml之方式於培養基中添加脂多糖(LPS，Sigma Aldrich公司)。LPS添加11個半小時後，以最終濃度成為5ng/ml之方式添加人類TGF-β蛋白質(Peprotech公司)。TGF-β添加30分鐘後，藉由2×SDS sample buffer[100mM之Tris-HCl pH值6.8，4%之SDS，6M之Urea，12% 之Glycerol，2%之protease inhibitor cocktail(nacalai tesque公司)，1%之phosphatase inhibitor cocktail(nacalai tesque公司)]溶解細胞，而製成細胞萃取液。
以最終濃度分別成為5%、0.025%之方式於所獲得之細胞萃取液中添加β-Mercaptoethanol及Bromophenol blue後，於95℃下加熱4分鐘而製成樣品。使用所獲得之樣品實施SDS-PAGE，將樣品所含之蛋白質根據大小加以分離。其後，將所分離之蛋白質轉錄於PVDF薄膜，藉由抗磷酸化SMAD3抗體(Cell Signaling Technology公司)及抗SMAD3抗體(Cell Signaling Technology公司)、抗磷酸化SMAD2抗體(Cell Signaling Technology公司)及抗SMAD2抗體(Cell Signaling Technology公司)、抗NEK6抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)、抗Vinculin抗體(Sigma Aldrich公司)進行西方墨點法。
將轉染NEK6 siRNA之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質與磷酸化SMAD2蛋白質的西方墨點法之結果示於圖13。藉由NEK6 siRNA，NEK6之蛋白質之量減少，因TGF-β而上升之磷酸化SMAD3與磷酸化SMAD2之量減少。因此，表明藉由NEK6之減弱，SMAD3蛋白質與SMAD2蛋白質之磷酸化受到抑制。
實施例11：肝星狀細胞中之NEK6 siRNA SMAD3磷酸化抑制作用
為了研究NEK6 siRNA控制TGF-β訊號之可能性，而於各轉染有NEK6 siRNA之細胞中對磷酸化SMAD3之量進行解析。
將自人之肝臟單離之人類初代肝星狀細胞於PLL塗佈細胞培養皿上培養5天。其後，使用Lipofectarmine RNAi MAX 轉染針對人類NEK6之各種siRNA(KB-006、KB-004、KB-011、KB-005、KB-010)。轉染48小時後，將培養基由含有2%之FCS、1%之SteCGS之stellate cell培養基更換為含有0.2%之FCS、1%之SteCGS之stellate cell培養基。轉染72小時後，以最終濃度成為100ng/ml之方式於培養基中添加LPS 。LPS添加11個半小時後，以最終濃度成為5ng/ml之方式添加人類TGF-β蛋白質。TGF-β添加30分鐘後，藉由2×SDS sample buffer(100mM之Tris-HCl pH值6.8，4%之SDS，6M之Urea，12%之Glycerol，2%之protease inhibitor cocktail，1%之phosphatase inhibitor cocktail)溶解細胞，而製成細胞萃取液。以最終濃度分別成為5%、0.025%之方式於所獲得之細胞萃取液中添加β-Mercaptoethanol及Bromophenol blue後，於95。℃下加熱4分鐘而製成樣品。使用所獲得之樣品實施SDS-PAGE，將樣品所含之蛋白質根據大小加以分離。其後，將所分離之蛋白質轉錄於PVDF薄膜，藉由抗磷酸化SMAD3抗體及抗SMAD3抗體、抗NEK6抗體、抗Vinculin進行西方墨點法。
將藉由各種NEK6 siRNA減弱NEK6之情形時之磷酸化SMAD3之蛋白質的西方墨點法之結果示於圖14。藉由各種NEK6之siRNA之導入，NEK6之蛋白質之量減少，因TGF-β而上升之磷酸化SMAD3之量減少。因此，藉由使用數種NEK6 siRNA序列，表明藉由NEK6之減弱，SMAD3蛋白質之磷酸化受到抑制。
實施例12：肝星狀細胞中之NEK6 siRNA對纖維化相關基因之影響
為了研究NEK6之減弱對纖維化表現出有效性，而對轉染有NEK6 siRNA之細胞中之纖維化相關基因之轉錄量進行解析。
將自人之肝臟單離之人類初代肝星狀細胞於PLL塗佈細胞培養皿上培養5天。其後，使用Lipofectamine RNAi MAX轉染針對人類NEK6之siRNA(KB-004)。轉染48小時後，將培養基由含有2%之FCS、1%之Stellate cell growth supplement之stellate cell培養基更換為含有0.2%之FCS、1%之SteCGS之stellate cell培養基。轉染72小時後，以最終濃度成為100ng/ml之方式於培養基中添加LPS。LPS添加11個半小時後，以最終濃度成為5ng/ml之方式添加人類TGF-β蛋白質。TGF-β添加24小時後，使用RNeasy Mini Kit自轉染有KB-004之細胞提取RNA。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit，對所獲得之RNA進行反轉錄，而獲得cDNA。對於所獲得之cDNA，使用TaqMan GeneExpression Assays進行即時PCR，而檢測NEK6之減弱對基因之轉錄量之影響。NEK6基因、Fibronectin基因及αSMA基因之轉錄量係藉由利用NEK6 Taqman Probe(HS00205221_m1，Applied Biosystems公司)獲得之測定值、利用Fibronectin Taqman Probe(HS01549976_m1，Applied Biosystems公司)獲得之測定值、或利用αSMA Taqman Probe(HS00426835_g1，Applied Biosystems公司)獲得之測定值除以利用18s Probe獲得之測定值而算出。
將減弱NEK6之情形時之NEK6之轉錄量示於圖15a，將減弱NEK6之情形時之Fibronectin之轉錄量示於圖15b，將減弱NEK6之情形時之αSMA基因之轉錄量示於圖15c。藉由NEK6 siRNA，因TGF-β而上升之Fibronectin、αSMA基因之轉錄量減少。因此，表明NEK6之減弱抑制纖維化。
實施例13：腎臟纖維母細胞中之NEK6 siRNA對SMAD3蛋白質磷酸化之影響
為了研究NEK6蛋白質控制TGF-β訊號之可能性，而於轉染有NEK6 siRNA之細胞中對磷酸化SMAD3之量進行解析。
使用Lipofectamine RNAi MAX對大鼠腎纖維母細胞株NRK-49F細胞轉染針對人類NEK6之siRNA(KB-004)。轉染24小時後，將培養基由含有10%之FCS之DMEM培養基更換為含有0.1%之FCS之DMEM培養基。轉染48小時後，以最終濃度成為5ng/ml之方式添加人類TGF-β蛋白質。添加後30分鐘或1小時後，藉由2×SDS sample buffer(100mM之Tris-HCl pH值6.8，4%之SDS，6M之Urea，12%之Glycerol，2%之protease inhibitor cocktail，1%之phosphatase inhibitor cocktail)溶解細胞，而製成細胞萃取液。以最終濃度分別成為5%、0.025%之方式於所獲得之細胞萃取液中添加β-Mercaptoethanol及Bromophenol blue後，於95℃下加熱4分鐘而製成樣品。使用所獲得之樣品實施SDS-PAGE，將樣品所含之蛋白質根據大小加以分離。其後，將所分離之蛋白質轉錄於PVDF薄膜，藉由抗磷酸化SMAD3抗體及抗SMAD3抗體、抗NEK6抗體(abcam公司)、抗Vinculin抗體進行西方墨點法。
將減弱NEK6之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質的西方墨點法之結果示於圖16。藉由使用NEK6之siRNA，NEK6之蛋白質之量減少，因TGF-β而上升之磷酸化SMAD3之量減少。因此，表明藉由NEK6之減弱，SMAD3蛋白質之磷酸化受到抑制。
實施例14：四氯化碳(CCl4)誘發肝纖維化模型中之NEK6 siRNA之 有效性評價
為了確認NEK6之減弱對纖維化表現出有效性，而對CCl4模型小鼠靜脈內投予NEK6 siRNA，對抗纖維化作用進行解析。
按照10mL/kg體重，於第0、4、7、11天對7週齡之雄性C57BL/6J小鼠(Charles River Laboratories Japan股份有限公司)腹腔內投予含有10 v/v%之CCl4之橄欖油溶液(FUJIFILM Wako Pure Chemical股份有限公司)，而製作肝纖維化模型小鼠。按照CCl4之初次投予前一天之體重實施分組，組設定係設為未投予CCl4之生理食鹽水投予組(n=5)、投予CCl4之溶劑投予組(n=10)、投予CCl4之核酸投予組(n=10)。使用KB-004作為NEK6 siRNA，使用invivofectamine 3.0 Reagent(Thermo Fisher Scientific)作為投予溶劑，依照invivofectamine 3.0之製品操作說明，製作0.3mg/mL之核酸投予液。以成為3mg/kg體重之方式對核酸投予組尾靜脈投予含有KB-004之核酸投予液，於CCl4之初次投予前一天及病情誘發第10天對溶劑投予組尾靜脈投予與核酸投予組等量之投予溶劑。肝損傷及纖維化之評價係於病情誘發第13天實施(實施例15、16、17及19)。
實施例15：CCl 4模型中之肝損傷標記物之解析
業界認為所謂纖維化係細胞或組織針對損傷之過度之創傷癒合過程。因此認為，對於各種纖維化之治療而言有效的是抑制纖維化之同時抑制細胞或組織之損傷。因此，為了研究NEK6之減弱是否對肝損傷表現出效果，而進行CCl4模型中之肝損傷標記物之測定。
於病情誘發第13天，使用普通之毛細採血管自尾靜 脈採血，並靜置30分鐘以上。將靜置後之血液進行離心分離，而獲得血清。使用轉胺酶CII-Test Wako(和光純藥工業股份有限公司)測定血清中麩胺酸丙酮酸轉胺酶(GPT)及麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(GOT)。測定方法係依照試劑之說明書。
將血清中GPT之測定結果示於圖17a，將血清中GOT之測定結果示於圖17b。藉由投予NEK6 siRNA，CCl4模型中可觀察到之血清中GPT及GOT之上升受到抑制。因此，表明NEK6之減弱抑制肝損傷。
實施例16：CCl 4模型中之SMAD3蛋白質磷酸化之解析
為了研究NEK6之減弱是否對SMAD3蛋白質之磷酸化表現出效果，而對CCl4模型中之磷酸化SMAD3之量進行解析。
將於病情誘發第13天採集之肝臟冷凍後粉碎而製成粉狀。向粉末狀之肝臟添加溶解緩衝液(150mM之NaCl，1%之NP40，0.1%之SDS，50mM之Tris-HCl pH值7.5，1mM之EDTA，1mM之Benzylsulfonyl fluoride(苄磺醯氟)，2%之protease inhibitor cocktail，1%之phosphatase inhibitor cocktail)，使用手持超音波產生機，製備器官萃取液。以最終濃度分別成為5%、0.025%之方式向將器官萃取液進行離心分離所獲得之上清液中添加β-Mercaptoethanol及Bromophenol blue。其後，於95℃下加熱4分鐘而製成樣品。使用所獲得之樣品實施SDS-PAGE，將樣品所含之蛋白質根據大小加以分離。其後，將所分離之蛋白質轉錄於PVDF薄膜，藉由抗磷酸化SMAD3抗體(abcam公司)及抗SMAD3抗體、抗NEK6抗體(abcam公司)、抗Vinculin抗體進行西方墨點法。磷 酸化SMAD3係藉由總SMAD3量進行修正。
將減弱NEK6之情形時之磷酸化SMAD3蛋白質的西方墨點法之結果示於圖18。藉由使用NEK6之siRNA，NEK6之蛋白質之量減少，因TGF-β而上升之磷酸化SMAD3之量減少。因此，表明NEK6之減弱於CCl4模型之肝臟中會抑制SMAD3蛋白質之磷酸化。
實施例17：CCl 4模型中之纖維化相關基因之解析
為了研究NEK6之減弱是否對纖維化表現出有效性，而對CCl4模型中之纖維化相關基因之轉錄量進行解析。
使用QIAzol Lysis reagent(QIAGEN公司)，自於病情誘發第13天採集之肝臟提取RNA。繼而，使用RNeasy mini kit精製RNA，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit進行反轉錄反應。使用TaqMan GeneExpression Assay，測定NEK6 Taqman Probe(Mm00480730_m1，Applied Biosystems公司)、及作為纖維化相關基因之Col1a1 Taqman Probe(Mm00801666_g1，Applied Biosystems公司)、Col3a1 Taqman Probe(Mm01254476_m1，Applied Biosystems公司)、Timp1 Taqman Probe(Mm01341361_m1，Applied Biosystems公司)之轉錄量，以與作為內部標準之18s rRNA Taqman Probe(Hs99999901_s1，Applied Biosystems公司)之轉錄量之相對比作為各基因之轉錄量。
將CCl4模型中之各基因之轉錄量示於圖19a~d。藉由NEK6 siRNA之投予，NEK6基因之轉錄量降低。由此表明，所使用之KB-004有效率地抑制了靶基因之轉錄。此時，因病情誘發 所誘導之纖維化相關基因(Col1a1、Col3a1、Timp1)之轉錄量顯著地降低。因此，表明NEK6之減弱抑制纖維化。
實施例18：膽管結紮誘發肝纖維化(BDL)模型中之纖維化相關基因之解析
為了研究NEK6之減弱對纖維化表現出有效性，而對膽管結紮誘發肝纖維化模型小鼠(BDL模型)靜脈內投予NEK6 siRNA，對纖維化相關基因之轉錄量進行解析。
按照體重將9週齡之C57BL/6J小鼠(Charles River Laboratories Japan公司)進行分組，將依照基因導入試劑invivofectamin 3.0(Thermo Fisher Scientific公司)之隨附文件所製備之KB-004溶液(0.3mg/mL)按照3mg/kg體重之用量進行尾靜脈內投予(n=12)。對照組僅投予溶劑(n=15)。於投予第二天，於2個部位對總膽管進行結紮，而製作肝纖維化模型小鼠。對於假手術組，尾靜脈內投予生理食鹽水(大塚生食注)，僅進行總膽管之剝離(n=7)。於膽管結紮第14天採集肝臟，以與上述同樣之方式測定NEK6 Taqman Probe(Mm00480730_m1，Applied Biosystems公司)、及作為纖維化相關基因之Col1a1 Taqman Probe(Mm00801666_g1，Applied Biosystems公司)、Col3a1 Taqman Probe(Mm01254476_m1，Applied Biosystems公司)、Timp1 Taqman Probe(Mm01341361_m1，Applied Biosystems公司)之轉錄量，以與作為內部標準之GAPDHTaqman Probe(Mm9999995_g1，Applied Biosystems公司)之轉錄量之相対比作為各基因之轉錄量。
將BDL模型中之各基因轉錄量示於圖20之a~d。藉 由NEK6 siRNA之投予，NEK6基因之轉錄量降低。由此表明，所使用之KB-004有效率地抑制了靶基因之轉錄。此時，由病情誘發所誘導之纖維化相關基因(Col1a1、Col3a1、Timp1)之轉錄量顯著地降低。因此，表明NEK6之減弱抑制纖維化。
實施例19：CCl 4模型中之病理解析
為了研究NEK6之減弱是否對CCl4誘發肝纖維化模型表現出效果，而進行病理圖像之觀察。
於病情誘發第13天採集肝臟之內側右葉，使用10%中性緩衝福馬林液加以固定。以石蠟包埋後，製作組織切片，進行蘇木紫-伊紅染色(Hematoxylin-Eosin Stain)。
將病理圖像之代表例示於圖21。圖21a表示未投予CCl4之生理食鹽水投予組之結果，圖21b表示投予CCl4之溶劑投予組之結果，圖21c表示投予CCl4之核酸投予組之結果。圖21b中較多地觀察到之液泡變性表示細胞之損傷，較多地存在於中央部附近之核未染色之部分表示細胞之壞死。藉由投予NEK6 siRNA，於CCl4模型之肝臟組織中觀察到之細胞之損傷或壞死減少。因此，表明NEK6之減弱會抑制CCl4誘發肝纖維化模型中之病理圖像之變化。
(產業上之可利用性)
藉由本發明，可提供一種新穎之SMAD2/3蛋白質之磷酸化抑制劑及纖維化治療劑。
<110> 杏林製藥股份有限公司
<120> 纖維化治療劑
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<150> JP 2017/146957
<151> 2017-07-28
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<170> PatentIn第3.5版
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Claims (8)

  1. 一種SMAD2/3蛋白質之磷酸化抑制劑，其係含有抑制NEK6基因之表現之核酸作為有效成分。
  2. 一種纖維化治療劑，其係含有抑制NEK6基因之表現之核酸作為有效成分。
  3. 一種雙鏈核酸分子，其係選自由以下之(a)、(b)、(c)、(d)及(e)所構成之群組：(a)由在5'末端含有序列編號1所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端含有序列編號6所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成的雙鏈核酸分子；(b)由在5'末端含有序列編號2所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端含有序列編號7所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成的雙鏈核酸分子；(c)由在5'末端含有序列編號3所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端含有序列編號8所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成的雙鏈核酸分子；(d)由在5'末端含有序列編號4所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端含有序列編號9所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成的雙鏈核酸分子；(e)由在5'末端含有序列編號5所示之序列之鹼基數19~30之嚮導鏈(反義鏈)與在3'末端含有序列編號10所示之序列之鹼基數19~30之隨從鏈(正義鏈)所形成的雙鏈核酸分子。
  4. 如請求項3之雙鏈核酸分子，其進而於嚮導鏈(反義鏈)及/或隨從鏈(正義鏈)之3'末端附加1~11個鹼基之核糖核苷酸殘基及/或去 氧核糖核苷酸殘基，而形成突出端。
  5. 一種單鏈核酸分子，其形成有將請求項3或4所示之隨從鏈(正義鏈)之3'末端與嚮導鏈(反義鏈)之5'末端經由包含核苷酸殘基之連接子序列及/或包含非核苷酸結構之連接子連結，或者將請求項3或4所示之嚮導鏈(反義鏈)之3'末端與隨從鏈(正義鏈)之5'末端經由包含核苷酸殘基之連接子序列及/或包含非核苷酸結構之連接子連結而成之髮夾型RNA結構。
  6. 一種以下之(A)或(B)之單鏈核酸分子，其含有選自序列編號1~5之NEK6基因之表現抑制序列：(A)包含區域(X)、連接子區域(Lx)及區域(Xc)或僅由該等區域構成，自5'側至3'側依序配置上述區域(Xc)、上述連接子區域(Lx)及上述區域(X)，上述區域(Xc)與上述區域(X)互補，上述連接子區域(Lx)具有含有吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者之非核苷酸結構，且上述區域(X)含有上述表現抑制序列；(B)自5'側至3'側依序含有區域(Xc)、連接子區域(Lx)、區域(X)、區域(Y)、連接子區域(Ly)及區域(Yc)，上述區域(X)與上述區域(Y)連結而形成內部區域(Z)，上述區域(Xc)與上述區域(X)互補，上述區域(Yc)與上述區域(Y)互補，且上述連接子區域(Lx)及/或連接子區域(Ly)具有含有吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者之非核苷酸結構， 上述內部區域(Z)含有上述表現抑制序列。
  7. 如請求項6之單鏈核酸分子，其中，上述連接子區域(Lx)及/或(Ly)係以下述式(I)表示， 上述式中，X 1及X 2分別獨立為H 2、O、S或NH；Y 1及Y 2分別獨立為單鍵、CH 2、NH、O或S；R 3為鍵結於環A上之C-3、C-4、C-5或C-6之氫原子或取代基；L 1為包含n個碳原子之伸烷基鏈，此處，伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、OR a、NH 2、NHR a、NR aR b、SH、或SR a取代，亦可未經取代，或者L 1係上述伸烷基鏈之一個以上之碳原子經氧原子取代之聚醚鏈，其中，於Y 1為NH、O或S之情形時，鍵結於Y 1之L 1之原子為碳，鍵結於OR 1之L 1之原子為碳，氧原子彼此不鄰接；L 2為包含m個碳原子之伸烷基鏈，此處，伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、OR c、NH 2、NHR c、NR cR d、SH或SR c取代，亦可未經取代，或者L 2係上述伸烷基鏈之一個以上之碳原子經氧原子取代之聚醚鏈，其中，於Y 2為NH、O或S之情形時，鍵結於Y 2之L 2之原子為 碳，鍵結於OR 2之L 2之原子為碳，氧原子彼此不鄰接；R a、R b、R c及R d分別獨立為取代基或保護基；l為1或2；m為0~30之範圍之整數；n為0~30之範圍之整數；環A係上述環A上之C-2以外之1個碳原子可被氮、氧或硫取代，於上述環A內可含有碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵，上述區域(Xc)及上述區域(X)分別經由-OR 1-或OR 2-而結合於上述連接子區域(Lx)，上述區域(Yc)及上述區域(Y)分別經由-OR 1-或OR 2-而結合於上述連接子區域(Ly)，此處，R 1及R 2可存在亦可不存在，於存在之情形時，R 1及R 2分別獨立為核苷酸殘基或上述結構(I)。
  8. 如請求項6或7之單鏈核酸分子，其中，X或Z含有選自由序列編號11~25所構成之群組中之序列。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220088057A1 (en) * 2019-01-25 2022-03-24 Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. Therapeutic agent for fibrosis
US20230357767A1 (en) 2020-08-25 2023-11-09 Bonac Corporation Novel nucleic acid molecule inhibiting expression of target gene

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20040097441A1 (en) 2002-11-16 2004-05-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of NIMA-related kinase 6 expression
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
HUE026520T2 (en) 2010-07-08 2016-06-28 Bonac Corp Single chain nucleic acid molecule for gene expression control
US8785121B2 (en) 2010-07-08 2014-07-22 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for controlling gene expression
EP2674494B1 (en) * 2010-08-03 2014-12-17 Bonac Corporation Single-stranded RNA molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
US8691782B2 (en) 2010-08-03 2014-04-08 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
WO2012153704A1 (ja) 2011-05-10 2012-11-15 株式会社ボナック 同位体を有するリン酸化合物の製造方法
ES2802996T3 (es) 2011-08-25 2021-01-22 Bonac Corp Compuesto de tioéter para la protección del grupo 2'-hidroxi en nucleósidos que van a ser utilizados en la síntesis de oligonucleótidos
US9528111B2 (en) 2012-01-07 2016-12-27 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having amino acid backbone
US9663784B2 (en) 2012-05-26 2017-05-30 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for regulating expression of gene having delivering function
WO2014139885A2 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of diseases associated with epithelial mesenchymal transition
EP3102703A2 (en) 2014-02-07 2016-12-14 Effector Therapeutics Inc. Methods for treating fibrotic disease
EP3241903A4 (en) 2014-12-29 2018-07-04 Bonac Corporation Composition containing nucleic acid molecule stably
CN108064289A (zh) 2015-03-27 2018-05-22 株式会社博纳克 具有递送功能和基因表达调控能力的单链核酸分子
WO2016159374A1 (ja) 2015-04-02 2016-10-06 株式会社ボナック 配糖体化合物の製造方法

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