JP2019517552A - 発がんにおける末端rnaウリジル化およびrna代謝回転の新規役割 - Google Patents
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Abstract
本明細書に記載されるのは、発がんにおけるTUTaseの、LIN28に非依存的な役割である。本明細書に提供されるのは、TUTaseの阻害を介してがんを処置するための組成物および方法である。TUTaseの枯渇はまた、RNA代謝および/またはタンパク質代謝における乱れに対しても、細胞を敏感にさせる。よって、本明細書にさらに提供されるのは、がんを処置するため、TUTaseインヒビター、RNA代謝を乱す剤、およびタンパク質代謝を乱す剤を組み合わせる、併用治療のストラテジーである。
Description
関連出願
本出願は、2016年6月7日に出願された米国仮特許出願第62/347,048号の、35 U.S.C. § 119(e)下の優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
本出願は、2016年6月7日に出願された米国仮特許出願第62/347,048号の、35 U.S.C. § 119(e)下の優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
政府支援
本開示は、国立衛生研究所によって授与された5R01GM107536およびT32GM007753下の政府の支援を受けてなされた。政府は本開示においてある一定の権利を有する。
本開示は、国立衛生研究所によって授与された5R01GM107536およびT32GM007753下の政府の支援を受けてなされた。政府は本開示においてある一定の権利を有する。
背景
3’−末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)は、LIN-28/ABに依存的な様式でのマイクロRNA(例として、let−7 miRNA)生物発生における役割を果たすことが、指し示されてきた。TUTase(例として、哺乳動物細胞におけるZCCHC6またはZCCHC11)によるpre−let−7のウリジル化は、その分解に繋がり、そして順に、成熟let−7 miRNAの抑制に繋がる。数多のがんは、LIN28A/Bに媒介されるlet−7 miRNAの抑制と結び付けられてきた。しかしながら、発がんにおけるTUTaseの、LIN28A/Bに非依存的な役割は、記載されていない。
3’−末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)は、LIN-28/ABに依存的な様式でのマイクロRNA(例として、let−7 miRNA)生物発生における役割を果たすことが、指し示されてきた。TUTase(例として、哺乳動物細胞におけるZCCHC6またはZCCHC11)によるpre−let−7のウリジル化は、その分解に繋がり、そして順に、成熟let−7 miRNAの抑制に繋がる。数多のがんは、LIN28A/Bに媒介されるlet−7 miRNAの抑制と結び付けられてきた。しかしながら、発がんにおけるTUTaseの、LIN28A/Bに非依存的な役割は、記載されていない。
概要
本開示は、3’末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)の阻害を介して、がん(例として、LIN28A/Bを発現しないがん)を処置するための組成物および方法を提供する。本明細書に示されるとおり、哺乳動物のTUTase(例として、ZCCHC6およびZCCHC11)は、LIN28に非依存的なかつマイクロRNAに非依存的な様式で、mRNAのウリジル化および代謝回転を調節する。さらに、TUTaseは、多様なタイプのがんにおいて過剰発現されており、およびTUTaseの枯渇は、がんの成長を阻害する。その結果、本明細書に記載されているのは、TUTaseインヒビターを使用してがんを処置する方法と、TUTase枯渇細胞がRNAおよび/またはタンパク質の代謝の乱れに敏感であるという発見に基づく併用治療とである。
本開示は、3’末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)の阻害を介して、がん(例として、LIN28A/Bを発現しないがん)を処置するための組成物および方法を提供する。本明細書に示されるとおり、哺乳動物のTUTase(例として、ZCCHC6およびZCCHC11)は、LIN28に非依存的なかつマイクロRNAに非依存的な様式で、mRNAのウリジル化および代謝回転を調節する。さらに、TUTaseは、多様なタイプのがんにおいて過剰発現されており、およびTUTaseの枯渇は、がんの成長を阻害する。その結果、本明細書に記載されているのは、TUTaseインヒビターを使用してがんを処置する方法と、TUTase枯渇細胞がRNAおよび/またはタンパク質の代謝の乱れに敏感であるという発見に基づく併用治療とである。
本開示のいくつかの側面は、がんを処置する方法であって、これを必要とする対象へ、がんを処置するための治療的に有効な量の末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターを含む組成物を投与することを含む前記方法を提供し、ここでがんが、LIN28A/Bを発現しない。
いくつかの態様において、TUTaseは、ZCCHC11またはZCCHC6である。
いくつかの態様において、TUTaseは、ZCCHC11またはZCCHC6である。
いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、または抗体断片である。いくつかの様態において、TUTaseインヒビターは、TUTaseの酵素活性を阻害する。いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、以下:SCH 202676臭化水素酸塩、Tyrphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、およびIPA-3からなる群から選択される。
いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、TUTaseの発現を低減させる。いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、ZCCHC11またはZCCHC6を標的にするRNAiである。いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、Cas9ヌクレアーゼと、Cas9にZCCHC11遺伝子またはZCCHC6遺伝子を標的にさせるガイドRNA(a guide RNA that targets the Cas9 to the ZCCHC11 or ZCCHC6 gene)とを共発現するベクターであり、これによってZCCHC6遺伝子またはZCCHC11遺伝子は、Cas9によって切断される。
いくつかの態様において、抗体または抗体断片は、ZCCHC11またはZCCHC6に特異的である。
いくつかの態様において、抗体または抗体断片は、ZCCHC11またはZCCHC6に特異的である。
いくつかの態様において、組成物は、治療的に有効な量のRNA代謝を乱す剤(an agent that disrupts RNA metabolism)をさらに含む。いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、ヌクレオチドの合成または代謝を阻害する。いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬(a purine and pyrimidine antimetabolite)である。いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、5’フルオロピリミジンである。いくつかの態様において、5’フルオロピリミジンは、5−フルオロウラシル(5−FU)、フトラフル、またはウラシルテガフール(UFT)である。いくつかの態様において、5’フルオロピリミジンは、5−FUである。
いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、以下:6−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスリジン、シタラビン、および6−チオグアニンからなる群から選択される。いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、葉酸代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、葉酸代謝拮抗薬は、メトトレキサート、ペメトレキセド、ノラトレキシド、ラルチトレキセド、およびZD9331からなる群から選択される。
いくつかの態様において、組成物は、タンパク質代謝を乱す剤(an agent that disrupts protein metabolism)をさらに含む。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、タンパク質の代謝回転を阻害する。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、プロテアソームインヒビターである。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、以下:ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ(ONX-0912)、デランゾミブ(CEP-18770)、マリゾミブ(サリノスポラミドA)、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−3−ガラート、エポキソミシン、およびMG132ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラートからなる群から選択される。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである。
いくつかの態様において、タンパク質代謝を阻害する剤は、PI3K/mTorインヒビターである。いくつかの態様において、PIK3/mTorインヒビターは、ラパマイシンまたはラパログ(a rapalog)である。いくつかの態様において、ラパログは、以下:シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムスからなる群から選択される。いくつかの態様において、PIK3/mTORインヒビターは、ATP競合性mTORキナーゼインヒビターである。いくつかの態様において、ATP競合性mTORキナーゼインヒビターは、Torin1またはTorin2である。
いくつかの態様において、組成物は、がん細胞の成長を阻害し、および腫瘍サイズを低減させる。いくつかの態様において、組成物は、転移を予防する。
いくつかの態様において、組成物は、注射を介してがんへ投与される。いくつかの態様において、組成物は、全身に投与される。
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、齧歯動物である。いくつかの態様において、齧歯動物は、ラットである。いくつかの態様において、齧歯動物は、マウスである。
いくつかの態様において、組成物は、注射を介してがんへ投与される。いくつかの態様において、組成物は、全身に投与される。
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、齧歯動物である。いくつかの態様において、齧歯動物は、ラットである。いくつかの態様において、齧歯動物は、マウスである。
いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、TUTaseインヒビターなしと比較して、がん細胞におけるmRNAの半減期を増加させる。
本開示の他の側面は、がんを処置する方法であって、これを必要とする対象へ、がんを処置するために、治療的に有効な量の末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターおよびRNA代謝を乱す剤を含む組成物を投与することを含む前記方法を提供する。
いくつかの態様において、TUTaseは、ZCCHC11またはZCCHC6である。
本開示の他の側面は、がんを処置する方法であって、これを必要とする対象へ、がんを処置するために、治療的に有効な量の末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターおよびRNA代謝を乱す剤を含む組成物を投与することを含む前記方法を提供する。
いくつかの態様において、TUTaseは、ZCCHC11またはZCCHC6である。
いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、または抗体断片である。いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、TUTaseの酵素活性を阻害する。いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、以下:SCH 202676臭化水素酸塩、Tryphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、およびIPA-3からなる群から選択される。いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、TUTaseの発現を低減させる。いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、ZCCHC11またはZCCHC6を標的にするRNAiである。いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、Cas9ヌクレアーゼと、Cas9にZCCHC11遺伝子またはZCCHC6遺伝子を標的にさせるガイドRNAとを共発現するベクターであり、これによってZCCHC6遺伝子またはZCCHC11遺伝子は、Cas9によって切断される。いくつかの態様において、抗体または抗体断片は、ZCCHC11またはZCCHC6に特異的である。
いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、ヌクレオチドの合成または代謝を阻害する。いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、5’フルオロピリミジンである。いくつかの態様において、5’フルオロピリミジンは、5−フルオロウラシル(5−FU)、フトラフル、またはウラシルテガフール(UFT)である。いくつかの態様において、5’フルオロピリミジンは、5−FUである。
いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、以下:6−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスウリジン、シタラビン、および6−チオグアニンからなる群から選択される。いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、葉酸代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、葉酸代謝拮抗薬は、メトトレキサート、ペメトレキセド、ノラトレキシド、ラルチトレキセド、およびZD9331からなる群から選択される。
いくつかの態様において、組成物は、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、タンパク質の代謝回転を阻害する。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、プロテアソームインヒビターである。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、以下:ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ(ONX-0912)、デランゾミブ(CEP‐18770)、マリゾミブ(サリノスポラミドA)、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−3−ガラート、エポキソミシン、およびMG132ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラートからなる群から選択される。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである。
いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、PI3K/mTORインヒビターである。いくつかの態様において、PIK3/mTORインヒビターは、ラパマイシンまたはラパログである。いくつかの態様において、ラパログは、以下:シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムスからなる群から選択される。いくつかの態様において、PIK3/mTORインヒビターは、ATP競合性mTORキナーゼインヒビターである。いくつかの態様において、ATP競合性mTORキナーゼインヒビターは、Torin1またはTorin2である。
いくつかの態様において、がんは、LIN28A/Bを発現しない。
いくつかの態様において、組成物は、がん細胞の成長を阻害し、および腫瘍サイズを低減させる。いくつかの態様において、組成物は、転移を予防する。
いくつかの態様において、組成物は、注射を介してがんへ投与される。いくつかの態様において、組成物は、全身に投与される。
いくつかの態様において、組成物は、がん細胞の成長を阻害し、および腫瘍サイズを低減させる。いくつかの態様において、組成物は、転移を予防する。
いくつかの態様において、組成物は、注射を介してがんへ投与される。いくつかの態様において、組成物は、全身に投与される。
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、齧歯動物である。いくつかの態様において、齧歯動物は、ラットである。いくつかの態様において、齧歯動物は、マウスである。
いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、TUTaseなしと比較して、がん細胞におけるmRNAの半減期を増加させる。
いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、TUTaseなしと比較して、がん細胞におけるmRNAの半減期を増加させる。
本明細書にさらに提供されるのは、がんを処置するための、末端ウリジルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターを含む医薬組成物であり、ここでがんは、LIN28A/Bを発現しない。
本明細書にさらに提供されるのは、がんを処置するための、末端ウリジルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターおよびRNA代謝を乱す剤を含む医薬組成物である。
本明細書にさらに提供されるのは、がんを処置するための、末端ウリジルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターおよびRNA代謝を乱す剤を含む医薬組成物である。
いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、5−フルオロウラシルである。いくつかの態様において、組成物は、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、プロテアソームインヒビターである。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、PIK3/mTORインヒビターである。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
本開示の限定の各々は、本開示の様々な態様を網羅し得る。したがって、いずれの1つの要素または要素の組み合わせを伴う本開示の限定の各々は、本開示の各側面に包含され得ることが、予期される。本開示は、その適用において、以下の記載において記述されるかまたは図面において説明される、構造の詳細および構成要素の配置に限定されない。本開示は、その他の態様であることも可能であり、および様々なやり方で実践されることまたは実行されることも可能である。
図面の簡単な記載
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに実証するために包含されるものであるが、これらは、本明細書に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせて、これらの図面のうち1つ以上を参照することによって、より良好に理解され得る。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに実証するために包含されるものであるが、これらは、本明細書に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせて、これらの図面のうち1つ以上を参照することによって、より良好に理解され得る。
本開示は、本明細書に記載の具体的な方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、それ自体変動してもよいことが理解されるべきである。本明細書に使用される専門用語は、具体的な態様を記載することしか目的としておらず、専らクレームによって定義される本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書におよびクレームにおいて使用されるとき、単数形は、文脈から明らかにそうではないと指し示されていない限り、その複数形として引用するもの(the plural reference)を包含し、その逆もまたしかりである。用語「または」は、例えば「いずれか」によって修飾されていない限り、包括的である。実施例(the operating examples)において以外、または他に指し示される場合以外、本明細書に使用される、成分の分量または反応条件を表現するすべての数は、すべての実例において用語「約」によって修飾されているものと理解されるべきである。「約」は、パーセンテージに関係して使用されるとき、他に特定されない限り、±1%を意味する。
特定されたすべての特許および他の刊行物は、記載および開示の目的のため参照により本明細書に明示的に組み込まれる。例えば、本開示に関係して使用された可能性のあるような刊行物において記載された方法論である。
これらの刊行物は、本出願の出願日に先立ち、専らそれらの開示のために提供されている。この点に関し、本発明者らに対して、先の開示のためにまたは他の何らかの理由のために、かかる開示に先行する権利が与えられないという自白として、解釈されるべきものは何もない。これらの文書の日付に関する陳述またはその内容に関する表示はすべて、本出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる自白も構成するものではない。
これらの刊行物は、本出願の出願日に先立ち、専らそれらの開示のために提供されている。この点に関し、本発明者らに対して、先の開示のためにまたは他の何らかの理由のために、かかる開示に先行する権利が与えられないという自白として、解釈されるべきものは何もない。これらの文書の日付に関する陳述またはその内容に関する表示はすべて、本出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる自白も構成するものではない。
他に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術的および科学的な用語は、本開示に関連する当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。知られているいずれの方法、デバイス、および材料は、本開示の実践または試験において使用されてもよいが、この点に関する方法、デバイス、および材料は、本明細書に記載されている。
RNAウリジリルトランスフェラーゼは、非コードの3’オリゴUテールのRNAへの付加を触媒する酵素である。いくつかの実例において、RNAウリジリルトランスフェラーゼはまた、「末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)」、または「3’末端ウリジリルトランスフェラーゼ」とも称される。これらの用語は、本開示において相互交換可能に使用される。
TUTaseは、LIN28に依存的な様式で、がんという状況下でのマイクロRNAの生物発生を調節することにおいて、重要な役割を果たす。LIN28は、Let7の生物発生を介して、遺伝子発現を部分的に調節するRNA結合タンパク質である。Let7ファミリーのmiRNAは、がん遺伝子(c−myc、Ras、HMGA−2)および細胞周期因子(サイクリンD1、D2)を包含する、細胞運命決定を制御する多くの因子を調節する。
哺乳動物において、LIN28A、およびその近縁の(closely related)パラログであるLIN28Bは、それらが自己複製および増殖の維持において重要な役割を果たすところである多能性細胞において、高度に発現されている。例えば、米国特許公報US20140328858において、TUTases(例として、哺乳動物の、相同のZCCHC6およびZCCHC11)は、マイクロRNA前駆体であるpre−let−7をウリジル化するために、LIN28によって、動員される。pre−let−7のウリジル化は、その分解、および成熟let−7マイクロRNAの抑制に繋がり、これは順に、細胞の発がん性形質転換に繋がり、およびそれらの成長および腫瘍形成能を促進する。しかしながら、pre−let−7ウリジル化の他に、TuTaseに媒介されるRNAのウリジル化と発がんの間の直接的な結び付きは、以前から記載も示唆もない。
本開示の一側面は、TUTaseが、LIN28A/BおよびマイクロRNAから独立した経路を介して、発がんを促進するという新規かつ予想外の発見に、少なくとも一部において、基づく。本開示の図および例において記載されるとおり、TUTases(例として、ZCCHC11およびZCCHC6)をノックダウンすることは、細胞のlet-7レベルに対してあまり影響を及ぼさなかった一方、LIN28Bノックダウンは、let−7の抑制解除を引き起こした。このことは、ZCCHC6およびZCCHC11が、LIN28A/Bと連携して、let−7を普遍的には調節していないことを指し示している。その代わり、Lim et al.,Cell. 2014 December 4; 159(6): 1365-1376において記載されるとおり、TUTaseは、mRNAのウリジル化、および全体的なmRNA崩壊の調節における役割を果たしているように見える。さらに、本開示は、TUTase(ZCCHC6およびZCCHC11)が、数タイプのがん(例として、結腸、肺、および肝臓)において過剰発現されるという証拠を提供する。
正常細胞におけるTUTaseの誘導過剰発現は、発がん性形質転換を促進し得る一方、多様ながんタイプにおけるTUTaseの枯渇は、がん細胞の成長を阻害した。興味深いことに、TUTasesとがんとの間の相関関係は、LIN28A/Bの発現とは無関係である。よって、本明細書に提供されるのは、TUTaseをがん遺伝子の新しいクラスとして確立するデータ、およびLIN28A/B陽性または陰性のがんを包含するがんを処置するための、TUTaseの発がんにおける新しい役割を活用するストラテジーである。
その結果、本開示のいくつかの側面は、がんを処置するための医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、治療的に有効な量のTUTaseインヒビターを含む。
いくつかの態様において、がんは、LIN28A/Bを発現しない。LIN28A/Bを発現しないがんはまた、「LIN28陰性がん」とも称されてもよい。がんが、LIN28A/Bを発現するかどうかを決定するために、当業者、例として、内科医または臨床医は、がんの試料(例として、生検試料)を得て、およびタンパク質発現分析に使用されてもよい当該技術分野において周知の数多の技術を介してLIN28の発現を分析してもよい。
かかる技術は、限定せずに、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色アッセイ、およびqRT−PCRを包含する。LIN28AおよびLIN28Bの発現が、抗LIN28A(A177)(Cell Signaling)を使用して検出された、Triboulet et al., Cell Rep. 2015 Oct 13; 13(2): 260-266を参照。また、LIN28の発現が、乳がん細胞株の一団において、ウェスタンブロッティングによって、および免疫組織化学によって分析された、Liu et al., PLoS One. 2013; 8(12): e83083も参照。
本開示は、LIN28陽性のがん、すなわち、LIN28A/Bの発現に関連するがんの処置を除外するものではないことが理解されるべきである。本明細書に開示されるTUTaseインヒビターはまた、LIN28A/B陽性のがんの処置にも有効であるだろうことが予想される。
いくつかの態様において、TUTaseは、哺乳動物の相同のZCCHC6(TUT7としてもまた知られている)またはZCCHC11(TUT4としてもまた知られている)である。ZCCHC6およびZCCHC11は両方とも、脱アデニル化されたマイクロRNA(miRNA)の標的のウリジル化を通した、miRNAに誘導された遺伝子サイレンシングに関与し、およびいくつかのmiRNA前駆体(let−7のそれ(pre−let−7)を包含する)の末端ウリジル化を媒介することによって、miRNAの生物発生のサプレッサーとして作用する。ZCCHC6およびZCCHC11は、それらのドメイン構成および活性において高度に類似する。miRNAウリジル化またはmRNAウリジル化におけるそれらの機能的役割は、重複していることが示されれきた。
本開示のいくつかの側面は、TUTaseインヒビターを提供する。用語「阻害」または「阻害する」は、遺伝子発現および/またはZCCHC11またはZCCHC6などのTUTaseのタンパク質またはその機能的ドメインの活性を指すとき、その機能のレベルにおける低減または防止、またはその遺伝子発現産物の低減を指す。枯渇、またはTUTaseの枯渇という用語は、本明細書に使用されるとき、TUTaseの発現またはTUTaseの活性の枯渇を指す。例えば、TUTaseの枯渇は、TUTaseが、遺伝的にノックダウンされること、またはTUTaseの活性が、例として小分子インヒビターによって、阻害されることを意味してもよい。
TUTaseの酵素活性が、阻害されたとき、それは、TUTaseの酵素活性における、TUTaseインヒビターが存在しない細胞において見出されたTUTaseの酵素活性の少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%までの減少があることを意味する。一態様において、TUTaseの酵素活性レベルは、少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%まで減少される。
いくつかの態様において、「TUTaseインヒビター」は、TUTase活性を阻害する小分子インヒビターである。例えば、Linらによる近年の刊行物(RNA Biology, Volume 12, Issue 8, 2015)は、ZCCHC11のための数多の小分子インヒビターを同定した。本開示に従って使用されてもよいTUTaseインヒビターは、限定せずに、SCH 202676臭化水素酸塩、Tyrphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、IPA-3、またはこれらの組み合わせであってもよい。本明細書に記載される小分子TUTaseインヒビターのすべては、市販されており、例として、Sigma-AldrichまたはTocris Bioscienceから市販されている。
いくつかの態様において、「TUTaseインヒビター」は、TUTaseの発現を低減させる剤である。かかる剤は、核酸インヒビターであってもよい。TUTaseの核酸インヒビターは、例えば、これらに限定されないが、RNA干渉誘導分子(RNAi)、例えば、これらに限定されないが、siRNA、dsRNA、stRNA、shRNA、およびこれらの修飾されたバージョンであり、ここでRNA干渉分子は、ZCCHC11またはZCCHC6などのTUTaseの遺伝子発現をサイレンシングする。いくつかの態様において、核酸インヒビターは、アンチセンスオリゴ核酸、または核酸類似体、例えば、これらに限定されないが、DNA、RNA、ペプチド核酸(PNA)、偽相補性(pseudo-complementary)PNA(pc−PNA)、またはロックド核酸(LNA)等である。代わりの態様において、核酸は、DNAまたはRNA、および核酸類似体、例えばPNA、pcPNAおよびLNAである。
核酸は、一本鎖または二本本鎖であり得、および関心のあるタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、PNA等を含む群から選択され得る。かかる核酸配列は、例えば、これらに限定されないが、転写リプレッサー、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害性(small inhibitory)核酸配列、例えば、これらに限定されないが、RNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi(mRNAi)、アンチセンスオリゴヌクレオチド等である。一般に、RNA干渉剤を送達する方法が当該技術分野において周知であるとおり、RNA干渉テクノロジーは、当該技術分野において周知である。例として、米国特許公報第2010/0221226号を参照。
本明細書に使用されるとき、遺伝子サイレンシング、またはRNAi分子(例えば、siRNAまたはmiRNA)の活性に関してサイレンシングされる遺伝子は、標的遺伝子について、miRNAまたはRNAの干渉分子が存在しない細胞において見出されたmRNAレベルの少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%までの細胞中mRNAレベルの減少を指す。好ましい一態様において、mRNAレベルは、少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%まで減少される。
本明細書に使用されるとき、用語「RNAi」は、これらに限定されないが、siRNAi、shRNAi、内因性マイクロRNA、および人工マイクロRNAを包含する、いずれのタイプの干渉するRNAをも指す。実例として、それは、siRNAとして予め同定された配列を、そのRNAの下流プロセシングの機序にかかわらず、包含する(すなわち、siRNAは、mRNAの切断をもたらすin vivoプロセシングの特定の方法を有すると考えられているものの、かかる配列は、本明細書に記載の配列が隣接するという状況下のベクター中へ組み込まれ得る。)
本明細書に使用されるとき、「siRNA」は、二本鎖RNAを形成する核酸を指すが、その二本鎖RNAは、siRNAが、標的遺伝子と同じ細胞において存在するかまたは発現されたとき、遺伝子または標的遺伝子の発現を低減または阻害する能力を有し、例えばここで、標的遺伝子は、Lin28Aによって動員されたTUTase(例として、Zcchc11またはZcchc6)である。二本鎖RNA、siRNAは、相補鎖によって形成され得る。
一態様において、siRNAは、二本鎖siRNAを形成し得る核酸を指す。siRNAの配列は、完全長の標的遺伝子、またはこの部分配列に対応し得る。典型的には、siRNAは、少なくとも約15〜50ヌクレオチド長であり(例として、二本鎖siRNAの各相補配列は、約15〜50ヌクレオチド長であり)、および二本鎖siRNAは、約15〜50塩基対長であり、好ましくは約19〜30塩基ヌクレオチド、好ましくは約20〜25ヌクレオチド長、例として、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である。
本明細書に使用されるとき、「shRNA」または「低分子ヘアピン型RNA」(またステムループとも呼ばれる)は、siRNAの1タイプである。一態様において、これらのshRNAは、短い、例として、約19〜約25ヌクレオチドの、アンチセンス鎖から構成され、続いて約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖がある。代わりに、センス鎖は、ヌクレオチドループ構造に先行し得、およびアンチセンス鎖が、後に続き得る。
ステムループ構造は、主に一本鎖ヌクレオチド(ループ部分)の領域によって片側に結び付けられる二本鎖(ステム部分)を形成することが知られているかまたは予想されるヌクレオチドの領域を包含する二次構造を有する核酸を指す。用語「ヘアピン」および「ホールドバック(fold-back)」構造もまた、ステムループ構造を指すために、本明細書に使用される。かかる構造は、当該技術分野において周知であり、およびその用語は、当該技術分野において知られているその意味で一貫して使用される。ステムループ構造内のヌクレオチドの実際の一次配列は、二次構造が存在する限り、本開示の実践にとって決定的なものではない。当該技術分野において知られるとおり、二次構造は、正確な塩基対形成(base-pairing)を要求しない。よって、ステムは、1以上の塩基ミスマッチを包含してもよい。
代わりに、塩基対形成は、正確であってもよい、すなわち、いずれのミスマッチも包含しない。いくつかの実例において、前駆体マイクロRNA分子は、1以上のステムループ構造を包含してもよい。複数のステムループ構造は、例えば、核酸リンカーなどのリンカーを通して、またはマイクロRNA隣接配列または他の分子またはこれらのある組み合わせによって、相互に結び付けられていてもよい。ステムループ構造内のヌクレオチドの実際の一次配列は、二次構造が存在する限り、決定的なものではない。当該技術分野において知られるとおり、二次構造は、正確な塩基対形成を要求しない。よって、ステムは、1以上の塩基ミスマッチを包含してもよい。代わりに、塩基対形成は、いずれのミスマッチも包含しなくてもよい。
CRISPR(クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))およびCRISPR関連(Cas9)ヌクレアーゼをベースとした、哺乳動物の遺伝子を乱すことにおける使用のための遺伝子編集テクノロジーは、当該技術分野において、広範に記載されてきた。Cas9ヌクレアーゼに、乱されることになっている遺伝子を標的にさせるために、「単鎖ガイド(single-guide)RNA(sgRNA)」または「ガイドRNA(gRNA)」が、Cas9ヌクレアーゼを標的遺伝子へ導くために使用されてもよい。いくつかの態様において、本開示のTUTaseインヒビターは、活性Cas9ヌクレアーゼと、Cas9ヌクレアーゼに、切断されることになっている遺伝子(例として、ZCCHC6またはZCCHC11)を標的にさせるsgRNAとを共発現するベクターであってもよい。
いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、例えば、
本明細書に同定される遺伝子産物(単数または複数)の核酸および/またはタンパク質、およびまだ同定されていないものを不活性化するよう機能する、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)、中和抗体、抗体部分、断片、類似体、変異体または誘導体、ペプチド、タンパク質、模倣ペプチド(peptide-mimetic)、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ホルモン、小分子、核酸、核酸類似体、炭水化物、またはこの類似体、誘導体または変異体であり得る。タンパク質および/またはペプチドインヒビターまたはこれらの部分は、例えば、突然変異タンパク質、治療用タンパク質および組み換えタンパク質であり得る。
本明細書に同定される遺伝子産物(単数または複数)の核酸および/またはタンパク質、およびまだ同定されていないものを不活性化するよう機能する、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)、中和抗体、抗体部分、断片、類似体、変異体または誘導体、ペプチド、タンパク質、模倣ペプチド(peptide-mimetic)、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ホルモン、小分子、核酸、核酸類似体、炭水化物、またはこの類似体、誘導体または変異体であり得る。タンパク質および/またはペプチドインヒビターまたはこれらの部分は、例えば、突然変異タンパク質、治療用タンパク質および組み換えタンパク質であり得る。
タンパク質およびペプチドインヒビターはまた、例えば:突然変異のタンパク質、遺伝的に修飾されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組み換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質、およびこれらの断片(単数または複数)も包含し得る。いくつかの態様において、TUTaseインヒビターは、抗ZCCHC6抗体または抗ZCCHC11抗体、またはこれらの抗体断片である。本明細書に使用される抗体断片は、少なくとも、抗原結合のために要求される断片を有する。抗体断片は、当業者に知られている。
本開示のTUTaseインヒビターは、がん細胞において、mRNAのウリジル化を予防し、および順に、それらの代謝回転を阻害してもよい。例えば、本開示の図6A〜6Fにおいて実証されるとおり、mRNAのウリジル化は、それらの代謝回転をがん細胞において増強する。図6Dは、ZCCHC6のsiRNAの枯渇が、ZCCHC6を発現する細胞と比較して、ゲノム全体のmRNAの半減期の増大に繋がったことを示す。
本明細書にさらに提供されるのは、TUTase(例として、ZCCHC6および/またはZCCHC11)の枯渇が、多様ながん細胞タイプにおいて、成長を損なうことを示すデータ(図4A〜4G)である。用語「mRNAの半減期」は、具体的なmRNA集団が、50%分解されるのにかかる時間(the amount time)を指す。mRNA半減期は、種々のタイプのmRNAの安定性に関する情報を提供する。典型的には、より長い半減期は、あるmRNAがより安定していることを指し示す。3’ウリジル化は、mRNAの分解を増強し、よって半減期を減少させる。逆に、TUTase活性が阻害され、かつウリジル化がないとき、mRNAの半減期は増大する。
TUTaseの活性が、mRNAの代謝回転に関連することから、それらは、撹乱されたRNAの代謝という状況下において、重要な役割を果たすことがある。「RNA代謝」は、本明細書に使用されるとき、リボ核酸(RNA)分子の合成、折り畳み(folding)/アンフォールディング(unfolding)、修飾、プロセシングおよび分解を包含する、RNA分子のライフサイクルにおけるいずれの事象をも指す。これらプロセスのいずれに対する乱れは、RNA代謝サイクルの乱れに繋がることがある。例えば、ヌクレオシド合成の阻害は、RNA分子の構成単位(the building blocks)を利用不能にさせることによって、RNA合成における乱れをもたらすであろう。
ヌクレオシド合成を阻害し、およびそれによって、細胞において利用可能なヌクレオチド(5−フルオロウラシルおよびヒドロキシウレア)のプールを限定することが知られている小分子剤は、本開示において、TUTase(例として、ZCCHC6)の枯渇した細胞に対する阻害効果が、対応する野生型細胞より著しく強いことが示されている(図5A〜5B)。このことは、細胞が、TUTaseが枯渇されたとき、RNA代謝を乱す剤に対して敏感になることを指し示している。
その結果、がんを処置するための本開示の医薬組成物は、治療に有効な量のRNA代謝を乱す剤をさらに含んでもよい。RNA代謝を乱す剤は、DNA/RNAの損傷を引き起こす剤(例として、ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシド)、またはヌクレオチド合成を阻害し、それによって、細胞において利用可能なヌクレオチドのプールを限定する剤(例として、5−FUおよびヒドロキシウレア)であってもよい。いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、ヌクレオチドの合成および代謝を阻害する剤である。
いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、5’フルオロピリミジンである。いくつかの態様において、5’フルオロピリミジンは、5−フルオロウラシル(5−FU)、フトラフル、またはウラシルテガフール(UFT)である。いくつかの態様において、5’フルオロピリミジンは、5−FUである。本開示に従って使用されてもよい他のプリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、限定せずに、6−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスウリジン、シタラビン、および6−チオグアニンを包含する。
いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、5−FUである。5−FUは、数十年間、化学治療剤としてがんの処置において広く使用されてきた。5−FUは、がん細胞における本質的な生物発生プロセスを阻害することによって、またはDNAおよびRNAなどの高分子中へ組み込まれ、およびそれらの正常な機能を阻害することによって機能する、「代謝拮抗薬」と名付けられた薬物の類に属する。ヌクレオチド合成を阻害する剤のすべてが、TUTaseの枯渇と組み合わせて使用されたとき、がんの成長を低減することにおいて、5−FUと同じ効果を有さないことは、注目に値する。例えば、図5A〜5Bに示されるとおり、ヌクレオチド合成を阻害する別の剤、ヒドロキシウレアは、TUTaseの枯渇と組み合わせて使用されるとき、TUTaseが単独で枯渇された細胞と比較して、がん細胞の成長をさらに低減させることはなかった。これは、ヌクレオシドの合成を乱す種々の剤が、異なる作用機序を有することを示唆している可能性がある。
いくつかの態様において、RNA代謝を乱す剤は、葉酸代謝拮抗薬である。「葉酸代謝拮抗薬」は、本明細書に使用されるとき、葉酸(ビタミンB9)の作用にアンタゴナイズする(すなわち、ブロックする)薬物を指す。身体における葉酸の第一機能は、セリン、メチオニン、チミジンおよびプリンの生合成に関与する様々なメチルトランスフェラーゼに対する補因子としてである。結果として、葉酸代謝拮抗薬は、細胞分裂、DNA/RNAの合成および修復、およびタンパク質合成を阻害する。本開示に従って使用されてもよい好適なな葉酸代謝拮抗薬は、限定せずに、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、およびZD9331を包含する。
TUTaseの枯渇によって誘導されるRNA代謝の撹乱は、タンパク質代謝の撹乱にさらに繋がることがある。用語「タンパク質代謝」は、本明細書に使用されるとき、タンパク質およびアミノ酸の合成、およびタンパク質(および他の巨大分子)の異化作用による崩壊の原因となる様々な生化学プロセスを指す。いくつかの態様において、タンパク質代謝における乱れは、タンパク質代謝回転における乱れである。用語「タンパク質代謝回転」は、タンパク質合成とタンパク質分解との間のバランスを指す。合成が分解を上回ることは、除脂肪組織(lean tissues)を構築する同化作用状態を指し示し、分解が合成を上回ることは、除脂肪組織を燃焼する異化作用状態を指し示す。よって、タンパク質合成速度、および/またはタンパク質分解速度における撹乱は、タンパク質の代謝回転を乱し得る。
本明細書に提供されるのは、TUTaseの枯渇が、転写速度の30%の低減に繋がったこと、およびTUTaseの枯渇した細胞が、タンパク質代謝回転の乱れに対して敏感になることを示すデータである(図16)。よって、がんを処置するための本開示の医薬組成物は、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、タンパク質代謝回転を阻害する。
プロテアソームは、すべての真核生物および古細菌の内部にある、およびいくつかの細菌における、タンパク質複合体である。プロテアソームの主な機能は、ペプチド結合を壊す化学反応であるタンパク質分解によって、不要なまたは損傷したタンパク質を分解することである。真菌生物において、プロテアソームは、核および細胞質に位置する。プロテアソームは、真核細胞において、タンパク質分解に関与する最も重要な機構である。プロテアソームの阻害は、タンパク質分解を、その上タンパク質代謝回転を、効果的に阻害する。よって、本開示のタンパク質代謝回転を乱す剤は、プロテアソームインヒビターであってもよい。
数多のプロテアソームインヒビターが、当該技術分野において記載されており、がん処置において使用されてきた。これは、プロテアソームを機能しなくさせるときの細胞が耐えるストレスに起因する。本開示に従って使用されてもよいプロテアソームインヒビターは、限定せずに、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ(ONX-0912)、デランゾミブ(CEP-18770)、マリゾミブ(サリノスポラミドA)、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−3−ガラート、エポキソミシン、MG132ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラート、およびこれらの組み合わせを包含する。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである。
いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、PIK3/mTOR経路を阻害する剤である。mTORタンパク質は、ホスホイノシチド3−キナーゼ(PI3K)関連キナーゼファミリーに属し、および進化を通じて保存されている、289kDaのセリン−スレオニンキナーゼである。mTORは、少なくとも2つの別個の多タンパク質複合体である、mTOR複合体1(mTORC1)およびmTOR複合体2(mTORC2)の核となる(Guertin and Sabatini, 2007によって概説された)。mTORC1は、様々な下流のエフェクターを通して、細胞の成長に要求されるタンパク質合成を正に制御する。
mTORC1は、真核生物翻訳開始因子4E(eIF4E)結合タンパク質1(4E−BP1)およびp70リボソームS6キナーゼ1(S6K1)を、リン酸化することによって、タンパク質合成を促進する。4B−BPIのリン酸化は、eIF4Eの4E−BP1へのその結合を防止し、eIF4Eが、キャップ依存性の翻訳を促進することを可能にする(Richer and Sonenberg,2005によって概説された)。mTORC1によるS6K1活性の刺激は、mRNAの生物発生、キャップ依存性の翻訳および伸長、およびS6K1 aly/REF-like target(SKAR)、programmed cell death 4(PDCD4)、真核生物伸長因子2キナーゼ(eEF2K)、およびリボソームのタンパク質S6などの、多くのタンパク質の活性の調節を通したリボソームタンパク質の翻訳における増大に繋がる(Ma and Blenis, 2009によりレビューされた)。
mTORC1の活性化はまた、リボソームRNAの転写を、タンパク質ホスファターゼ2A(PP2A)および転写開始因子IA(TIF−IA)を伴うプロセスを通して刺激することによって、リボソームの生物発生を促進することも示されてきた(Mayer et al.,2004)。対照的に、mTORC1の阻害は、タンパク質合成を阻害し、およびタンパク質代謝を乱す。
よって、本開示のタンパク質代謝を乱す剤は、PIK3/mTORインヒビターであってもよい。いくつかの態様において、PIK3/mTORインヒビターは、ラパマイシンまたはラパログである。本開示に従って使用されてもよい好適なラパログは、限定せずに、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、デフォロリムス、およびそれらの組み合わせを包含する。いくつかの態様において、PIK3/mTORインヒビターは、ATP競合性mTORキナーゼインヒビターである。いくつかの態様において、ATP競合性mTORキナーゼインヒビターは、Torin1またはTorin2である。いずれのPIK3/mTORインヒビターも、本開示に従って使用されてもよい。
本開示の医薬組成物は、TUTaseインヒビター、およびRNA代謝を乱す剤を含む組成物、TUTaseインヒビターおよびタンパク質代謝を乱す剤を含む組成物、およびTUTaseインヒビター、RNA代謝を乱す剤、およびタンパク質代謝を乱す剤を含む組成物を網羅する。
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含んでもよい。本明細書に採用される句「薬学的に許容し得る」は、それらの化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すが、これらは、健全な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、過敏、アレルギー応答、または他の問題または合併症なく、合理的な利益/リスク比に釣り合って、人間および動物に接触する使用に好適である。句「薬学的に許容し得る担体」は、対象の剤を、ある臓器または身体のある一部から、別の臓器または身体の別の一部まで運搬または輸送することに関与する、、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と相溶であるという意味において「許容し得え」なければならない。
本開示の方法および医薬組成物は、がんの処置を、これを必要とする対象において行うために使用される。本明細書に開示の方法を使用して処置されてもよいがんのタイプは、限定せずに、新生物、悪性腫瘍、転移を、またはがん性と考えられるであろような無制御な細胞の成長によって特徴付けられるいずれの疾患または障害をも、包含する。
がんは、原発性または転移性のがんであってもよい。がんは、これらに限定されないが、胆道がん;膀胱がん;神経膠芽腫および髄芽腫を包含する脳がん;乳がん(breast cancer);子宮頸がん;絨毛がん;結腸がん;子宮内膜がん;食道がん;胃がん;急性リンパ性および骨髄性白血病を包含する血液腫瘍(hematological neoplasms);多発性骨髄腫;AIDS関連白血病、および成人T細胞白血病リンパ腫;ボーエン病およびパジェット病を包含する上皮内新生物;肝臓がん;肺がん;ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を包含するリンパ種;神経芽細胞腫;扁平上皮細胞癌を包含する口腔(oral)がん;上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞に由来するものを包含する卵巣がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;平滑筋肉腫、横紋筋肉腫を包含する肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫;メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞がん、および扁平上皮細胞がんを包含する皮膚がん;精上皮腫、非精上皮腫、奇形腫、絨毛癌などの胚性腫瘍を包含する精巣がん;間質性腫瘍および生殖細胞腫瘍;甲状腺癌および髄様癌を包含する甲状腺がん;および腺がんおよびウィルムス腫瘍を包含する腎がん、を包含する。一般的に直面するがんは、乳、前立腺、肺、卵巣、結腸直腸、および脳のがんを包含する。いくつかの態様において、がん細胞は、転移性である。いくつかの態様において、がんは、LIN28A/Bを、発現しない。
その最も広い意味において、用語「処置」または「処置すること(ための)」は、治療的および予防的な処置の両方を指す。処置を必要とする対象が、がんを有する場合、そのとき「状態を処置すること」は、がんに関連する1つ以上の症状またはがんの重症度を、緩和すること、低減すること、または排除すること、またはがんのさらなる進行を予防することを指す。処置を必要とする対象が、がんを有するリスクのあるものである場合、そのとき対象を処置することは、対象ががんを有するリスクを低減すること、または対象ががんの発症を予防することを指す。
対象は、これらに限定されないが、齧歯動物、例として、ラットまたはマウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、および霊長目の動物、例として、サルを包含する、ヒトまたは脊椎動物または哺乳動物を意味する。本開示の方法は、処置を、これを必要とする対象に行うことに有用である。これを必要とする対象は、がんを発症するリスクを有する対象(すなわち、遺伝子試験を介して)、またはがんを有する対象であり得る。
本開示に従って使用されてもよい治療用の化合物または剤、例として、TUTaseインヒビターおよび/またはタンパク質/RNA代謝を乱す剤は、対象へ直接投与されてもよく、または送達デバイスまたはビヒクルと連携して投与されてもよい。治療用化合物を表面まで送達するための、送達ビヒクルまたは送達デバイスは、記載されてきた。本開示の治療用化合物は、単独で(例として、生理食塩水または緩衝液中)、または当該技術分野において知られているいずれの送達ビヒクル(単数または複数)を使用して、投与されてもよい。
本開示の用語「治療的に有効な量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な量を指す。例えば、本開示に関連する、治療的に有効な量のTUTaseインヒビターは、1つ以上のがんの症状を緩和するのに十分なその量であってもよい。本明細書に提供される教示と組み合わされて、効能、相対的なバイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重症度、および好ましい投与モードなどの、様々な活性化合物および重み係数(weighing factors)中から選ぶことによって、実質的な毒性を引き起こさないが、それでも具体的な対象を処置するのに完全に有効である、有効な予防的または治療的処置のレジメンが、計画され得る。
いずれの具体的な適用にも有効な量は、処置されている疾患または状態、投与される具体的な治療用化合物、対象のサイズ、または疾患または状態の重症度などの因子に極めて依存して変動し得る。当業者は、本開示に関連する具体的な治療用化合物の有効量を、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定し得る。
いくつかの態様において、TUTaseの少なくとも1つのインヒビターを含む、本明細書に開示のとおりの剤および医薬組成物は、例として、腫瘍サイズを低減すること、腫瘍の成長速度を遅くすること、腫瘍の細胞増殖を低減すること、がん細胞死を促進すること、血管新生を阻害すること、転移を阻害すること、またはさもなければ、必ずしもがんを根絶することなく臨床状態を全面的に改善すること、という有益な効果を提供するのに治療的に有効な投薬量で投与され得る。
用語「腫瘍サイズを低減する」は、本明細書に使用されるとき、対象が本開示の方法および組成物を使用して処置される前と比較して、腫瘍サイズにおける減少を指す。いくつかの態様において、腫瘍サイズは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%まで、低減される。いくつかの態様において、腫瘍サイズは、100%まで低減される、すなわち腫瘍は、消滅する。いくつかの態様において、腫瘍は、その当初のサイズの80%以下、70%以下、60%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下、5%以下、1%以下、または0.1%以下まで、低減される。
いくつかの態様において、本開示の組成物および方法は、対象へ投与されるとき、がんの転移を予防する。用語「転移」は、原発性腫瘍が、ある臓器または身体のある部分から、これとは直接連絡されていない別のところへ広がることを指す。「原発性腫瘍」は、腫瘍の進行が始まり進むことで、がん性の塊を産出した解剖学的部位にて成長している腫瘍を指す。
ほとんどのがんは、それらの原発部位にて発生するが、このとき、身体の他の部分へも広がり続ける、すなわち、転移する。これらのさらなる腫瘍は、2次腫瘍である。転移は、細胞増殖、血管新生、細胞接着、遊走、および周辺組織中への浸潤を包含する、いくつかの相互連絡プロセスに由来する。用語「転移を予防する」は、原発の、直接連絡されていない身体の他の部分へ広がるプロセスが、阻害されること、または2次腫瘍の発生が、予防されることを意味する。
本明細書に記載される化合物の、送達のための対象用量は、典型的には、1投与につき約0.1μgから10mgまでに及び、これは、適用に応じて、毎日、毎週、または毎月、およびその間のいずれか他の時間(amount of time)に与えられ得る。いくつかの態様において、単回用量は、決定的な地固めまたは再地固め期間に投与される。これらの目的のための用量は、1投与につき約10μgから5mgまで、および最も典型的には、2〜4回の投与で間隔を空けて、例えば、数日または数週間またはそれ以上離して、約100μgから1mgまで、に及んでもよい。しかしながら、いくつかの態様において、これらの目的のための非経口用量は、上に記載の典型的な用量より5〜10,000倍高い範囲で使用されてもよい。
いくつかの態様において、本開示の化合物は、約1と10mg/[哺乳動物の体重の1kg]との間の投薬量にて投与される。他の態様において、本開示の化合物は、約0.001と1mg/[哺乳動物の体重の1kg]との間の投薬量にて投与される。さらに他の態様において、本開示の化合物は、約10〜100ng/kg、100〜500ng/kg、500ng/kg〜1mg/kg、または1〜5mg/[哺乳動物の体重の1kg]の間の投薬量、またはその中のいずれか個々の投薬量にて投与される。
本開示の製剤は、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、および任意に他の治療用成分をルーチン的に含有してもよい薬学的に許容し得る溶液において投与される。
治療における使用のため、本開示に関連する治療用化合物の有効量は、治療剤または治療用化合物を所望の表面、例として粘膜へ送達する、がんへ注射する、全身送達する等のいずれのモードによっても、対象へ投与され得る。本開示の医薬組成物を投与することは、当業者に知られているいずれの手段によっても、達成されてもよい。好ましい投与のルートは、これらに限定されないが、経口、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、経眼(ocular)、経膣(vaginal)、経直腸(rectal)および脳室内を包含する。
経口投与のために、本開示の治療用化合物は、活性化合物(単数または複数)を、当該技術分野において周知の薬学的に許容し得る担体とともに組み合わせることによって、容易に製剤化され得る。かかる担体は、処置されるべき対象による経口摂取のために、本開示の化合物を、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化されることを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤として得られ、任意に、結果として生じる混合物を細かく砕くこと、およびその顆粒の混合物を、所望ならば好適な助剤を加えた後に、処理することで、錠剤または糖衣錠のコアが得られ得る。
好適な賦形剤は、とりわけ、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖などの充填剤;例えば、トウモロコシデンプン、小麦のデンプン、米のデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)などの、セルロース調製物である。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩(アルギン酸ナトリウムなど)などの崩壊剤が加えられてもよい。任意に、経口製剤はまた、生理食塩水または緩衝剤、すなわち、内部の酸の状態を中和するためにEDTAにおいても製剤化されてもよく、またはいずれの担体もなく投与されてもよい。
またとくに企図されるのは、上の構成要素(単数)または構成要素(複数)の経口剤形でもある。構成要素(単数)または構成要素(複数)は、誘導体の経口送達が、効果的になるように、化学的に修飾されてもよい。一般に、企図される化学的修飾は、構成要素の分子自体に対する少なくとも1つの部分の付着であるが、ここで該部分は、(a)タンパク質分解の阻害;および(b)胃または腸からの血流の中への取り込みを許容する。また所望されるのは、構成要素(単数)または構成要素(複数)の全体的な安定性の増大も、および身体における循環時間の増大もある。
かかる部分の例は、以下:ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピリエングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびポリプロリンを包含する(Abuchowski and Davis,1981,"Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as drugs、Hocenberg and Roberts, eds.,Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189)。使用され得る他のポリマーは、ポリ−1,3−ジオキソラン、およびポリ−1,3,6−チオキソカンである。医薬用途にとって好ましいのは、上に指し示されるとおり、ポリエチレングリコール部分である。
放出の位置は、胃、小腸(十二指腸、空腸、または回腸)、または大腸であってもよい。当業者は、胃においては溶解しないであろうが、しかし十二指腸において、または腸の他のどこかで、材料を放出するであろう、利用可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、治療剤の保護または胃環境を超えての(腸における、などの)生物学的に活性な材料の放出のいずれかによって、胃環境の有害効果を避けるであろう。
胃液への(gastric)完全耐性を確保にするため、少なくともpH5.0に対して不浸透性のコーティングが好ましい。腸溶性コーティングとして使用される、より一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース(CAT)、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリ酢酸ビニルフタラート(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、酢酸フタル酸セルロース(CAP)、Eudragit L、Eudragit S、およびシェラックである。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用されてもよい。
コーティング、またはコーティングの混合物もまた、錠剤上に使用し得るが、これらは、胃に対する保護を意図したものではない。これは、糖コーティング、または錠剤をより簡単に飲み込めるようにするコーティングを包含し得る。カプセルは、乾燥治療薬、すなわち粉末の送達のためのハードシェル(a hard shell)(ゼラチンなど)からなっていてもよく;液体形形のために、ソフトゼラチンシェル(a soft gelatin shell)が使用されてもよい。オブラート(cachets)のシェル材料は、厚いデンプンまたは他の可食性の紙であることもあり得るだろう。丸剤、トローチ、成形錠剤または湿製錠剤のために、湿潤集結(moist massing)技術が、使用され得る。
治療薬は、粒子のサイズ約1mmの顆粒またはペレットの形態の、微細な多微粒子(fine multi particulates)として、製剤中に包含され得る。カプセル投与のための材料の製剤はまた、粉末、軽く圧縮された詰め物としても、または錠剤としてでさえも、あり得るだろう。治療薬は、圧縮によって調製され得るだろう。
着色料および香味剤は、すべて包含されていてもよい。例えば、治療剤は、製剤化され(リポソームまたはミクロスフェアカプセル化によって、など)、および次いで、着色料および香味剤を含有する冷蔵飲料などの可食製品内に、さらに含有されてもよい。
治療薬の体積を、不活性材料で希釈しても、増大してもよい。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトール、ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、加工デキストラン(modified dextrans)およびデンプンを包含し得るだろう。ある無機塩はまた、カルシウム三リン酸(calcium triphosphate)、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを包含する充填剤としても使用されてもよい。市販されているいくつかの希釈剤は、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、EmcompressおよびAvicellである。
崩壊剤は、治療薬を固体剤形にした製剤中に包含されてもよい。崩壊剤として使用される材料は、これらに限定されないが、デンプンをベースとした市販の崩壊剤、Explotabを包含する、デンプン、を包含する。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然海綿およびベントナイトは、すべて使用されてもよい。崩壊剤の別の形態は、不溶性カチオン交換樹脂である。粉末状のゴムは、崩壊剤として、および結合剤として使用されてもよく、およびこれらは、寒天、カラヤ、またはトラガカントなどの粉末状のゴムを包含し得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩はまた、崩壊剤としても有用である。
結合剤は、治療剤を一緒に保持し、硬い錠剤を形成するために使用されてもよく、およびアカシア、トラガント、デンプン、およびゼラチンなどの天然産物からの材料を包含してもよい。他は、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)およびカルボキシメチルセルロース(CMC)を包含する。ポリビニルピロリドン(PVP)およびヒドロキシメチルセルロース(HPMC)は両方とも、治療薬を粒状にするために、アルコール溶液中で使用され得るだろう。
減摩性の剤は、製剤化プロセスの間、接着するのを防止するために、治療薬の製剤に包含されてもよい。潤滑剤は、治療薬とダイ壁との間の層として使用されてもよく、およびこれらは、これらに限定されないが:そのマグネシウムおよびカルシウム塩を包含するステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、流動パラフィン、植物油およびワックスを包含し得る。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000および6000などの、可溶性潤滑剤もまた、使用されてもよい。
製剤化の間、薬物の流動特性を改善し得、かつ圧縮の間の再配置を補助するための滑剤は、加えられてもよい。滑剤は、デンプン、タルク、焼成シリカ、および水和ケイアルミン酸塩(hydrated silicoaluminate)を包含してもよい。
水性環境中への治療薬の溶解を補助するために、界面活性剤が、湿潤剤として加えられてもよい。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのアニオン性洗剤を、包含してもよい。カチオン性洗剤も使用されてもよく、および塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを包含し得るだろう。界面活性剤として製剤に包含され得るだろう潜在的な非イオン性洗剤のリストは、ラウロマクロゴール400、ポリオキシル40ステアラート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50および60、グリセロールモノステアラート、ポリソルベート40、60、65および80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で、または種々の比率の混合物としてのいずれかで、治療剤の製剤に存在し得るだろう。
経口で使用され得る医薬製剤は、ゼラチンから作られた押し込み型カプセル、ならびにゼラチンと可塑剤(グリセロールまたはソルビトールなど)とから作られた密閉軟カプセル(soft, sealed capsules)を包含する。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意に安定剤と混和された活性成分を含有し得る。軟カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体に溶解されても、または懸濁されてもよい。加えて、安定剤が加えられてもよい。経口投与のために製剤化されたミクロスフェアもまた、使用されてもよい。かかるミクロスフェアは、当該技術分野において十分に定義されている。経口投与のための全製剤は、かかる投与に好適な投薬量でなければならない。
口腔(buccal)投与のために、組成物は、従来の様式において製剤化された錠剤またはトローチの形態を採ってもよい。
吸入による投与のために、本開示に従う使用のための化合物は、好適な噴射剤(propellant)(例として、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガス)の使用により、加圧パックまたは噴霧器から提供されるエアロゾルスプレーの形態で、好都合に送達されてもよい。加圧エアロゾルのケースにおいて、投薬量単位は、一定量(a metered amount)を送達するバルブを提供することによって決定されてもよい。吸入器または注入器における使用のための、例としてゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、化合物と好適な粉末ベース(ラクトースまたはデンプンなどの)との粉末ミックスを含有して、製剤化されてもよい。
また本明細書に企図されるのは、本開示の治療用化合物の経肺(pulmonary)送達である。治療剤は、哺乳動物の肺へ、吸入されながら送達され、および肺の上皮内層を越えて血流へ通り抜ける。吸入分子の他の報告は、Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565 569;Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135 144(酢酸ロイプロリド);Braquet et al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143 146(エンドセリン1);Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206 212(a1アンチトリプシン);Smith et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146(a1−プロテイナーゼ);Oswein et al., 1990, "Aerosolization of proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March,(組み換えヒト成長ホルモン);Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482 3488(インターフェロンgおよび腫瘍壊死因子アルファ)およびPlatz et al., 米国特許第5,284,656号(顆粒球コロニー刺激因子)を包含する。全身的な効果のための薬物の経肺送達のための方法および組成物は、1995年9月19日にWongらへ発行された米国特許第5,451,569号において記載される。
本開示の実践における使用のために企図されるのは、これらに限定されないが噴霧器、定量吸入器および粉末吸入器を包含する、治療薬品の経肺送達のために考案された広範囲の機械デバイスであり、それらのすべては、当業者に精通されている。
本開示の実践に好適な市販のデバイスのいくつかの具体例は、Mallinckrodt Inc., St. Louis, Missouriによって製造されるUltravent噴霧器;Marquest Medical Products, Englewood, Coloradoによって製造されるAcorn II噴霧器;Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolinaによって製造されるVentolin定量吸入器吸入器;およびFisons Corp., Bedford, Massachusettsによって製造されるSp吸入器粉末吸入器粉末吸入器である。
すべてのかかるデバイスは、治療剤の分配に好適な製剤の使用を要求する。典型的には、各製剤は、採用されるデバイスのタイプに特有であり、および、常用の希釈剤および/または治療に有用な担体に加えて、適切な噴射材料(propellant material)の使用を伴ってもよい。また、リポソーム、ミクロカプセルまたはミクロスフェア、封入複合体、または他のタイプの担体の使用も、企図される。化学的に修飾された治療剤はまた、化学的修飾のタイプ、または採用されるデバイスのタイプに依存して、種々の製剤においても調製されてもよい。
噴霧器(ジェットまたは超音波のいずれか)との使用に好適な製剤は、典型的には、水に溶解された治療剤を、溶液1mLにつき生物学的に活性な化合物の約0.1〜25mgの濃度にて含むであろう。製剤はまた、緩衝剤および単糖(例として、浸透圧の安定化および調節のため)をも包含してもよい。噴霧器の製剤はまた、エアロゾルを形成することにおいて溶液の噴霧化によって引き起こされる化合物の表面誘起凝集(surface induced aggregation)を低減または防止するために、界面活性剤をも含有してもよい。
定量吸入器デバイスとの使用のための製剤は、一般に、界面活性剤の補助により、噴射剤中に懸濁された治療剤を含有する微粉(a finely divided powder)を含むだろう。噴射剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素(トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2テトラフルオロエタンを包含する)、またはこれらの組み合わせなどの、この目的のために採用されるいずれの従来の材料であってもよい。好適な界面活性剤は、ソルビタントリオラートおよび大豆レシチンを包含する。オレイン酸はまた、界面活性剤としても有用であってもよい。
粉末吸入器デバイスから分配するための製剤は、治療剤を含有する乾燥微粉を含むだろう。および前記製剤はまた、ラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールなどの増量剤をも、デバイスからの粉末の分散を容易にする量、例として、製剤の50〜90重量%で、包含してもよい。治療剤は、最も有利には、末梢の肺への最も有効な送達のために、10mm(またはミクロン)未満、最も好ましくは0.5〜5mmの平均粒子サイズの微粒子形態で調製されるべきである。
本開示の医薬組成物の鼻腔内送達もまた、企図される。鼻腔内送達は、本開示の医薬組成物の血流への移動を、治療薬品を鼻へ投与した直後に、前記薬品が肺において沈着せずに、できるようにする。鼻腔送達のための製剤は、デキストランまたはシクロデキストランをもつものを包含する。
鼻腔投与のための、有用なデバイスは、一定量のスプレーヤー(sprayer)が付着された、小さく、硬いボトルである。一態様において、一定量は、本開示溶液の医薬組成物を、規定体積のチャンバー中へ引き込みむことによって送達されるが、そのチャンバーは、チャンバー中の液体が圧縮されたときにスプレーを形成することによって、エアロゾル製剤をエアロゾル化するよう形作られた(dimentioned)開口部(an aperture)を有する。チャンバーは、圧縮されることで本開示の医薬組成物を投与する。特定の態様において、チャンバーは、ピストンの配置である。かかるデバイスは、市販されている。
代わりに、スクイーズされたときに(when squeezed)スプレーを形成することによってエアロゾル製剤をエアロゾル化するよう形作られた、開口部または開孔部(opening)をもつプラスチック製のスクイーズボトル(a plastic squeeze bottle)が使用される。開孔部は通常、ボトルの上部に見出され、および上部は一般に、エアロゾル製剤の効果的な投与のために鼻道(the nasal passages)に部分的にフィットするように先細りになっている。好ましくは、鼻腔吸入器は、薬物の計量された用量の投与のために、定量のエアロゾル製剤を提供するだろう。
剤は、全身的にそれらを送達することが所望されるとき、注射による、例として、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために製剤化されてもよい。注射のための製剤は、単位剤形で、例として、アンプルで、または複数回用量容器で、加えられた防腐剤とともに提供されてもよい。組成物は、油性または水性のビヒクル中、懸濁液、溶液、または乳剤などの形態を採ってもよく、および懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの配合剤(formulatory agents)を含有してもよい。
非経口投与のための医薬製剤は、水に可溶な形態の活性化合物の水性溶液を包含する。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性の注射懸濁液として、調製されてもよい。好適な親油性の溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、または、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘性を増大する物質を含有していてもよい。
任意に、懸濁液はまた、好適な安定剤、または化合物の可溶性を増大させることで高度に濃縮された溶液の調製を可能にするための剤をも含有してもよい。
任意に、懸濁液はまた、好適な安定剤、または化合物の可溶性を増大させることで高度に濃縮された溶液の調製を可能にするための剤をも含有してもよい。
代わりに、活性化合物は、使用前に、好適なビヒクル、例として、滅菌パイロジェンフリー水とともに構成するための粉末形態であってもよい。
先に記載された製剤に加えて、化合物はまた、デポー調製物としても製剤化されてもよい。かかる長時間作用する製剤は、好適なポリマー材料または疎水性材料(例えば、許容し得る油における乳剤として)またはイオン交換樹脂で、または難溶性の誘導体として、例えば、難溶性の塩として、製剤化されてもよい。
先に記載された製剤に加えて、化合物はまた、デポー調製物としても製剤化されてもよい。かかる長時間作用する製剤は、好適なポリマー材料または疎水性材料(例えば、許容し得る油における乳剤として)またはイオン交換樹脂で、または難溶性の誘導体として、例えば、難溶性の塩として、製剤化されてもよい。
医薬組成物はまた、好適な固体またはゲル相の担体または賦形剤をも含んでもよい。かかる担体または賦形剤の例は、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを、包含する。
好適な液体または固体の医薬製剤の形態は、例えば、吸入のための水性溶液または生理食塩水溶液であるか、マイクロカプセル化されるか、エンコクリエートされるか(encochleated)、微細金粒子(microscopic gold particles)上にコーティングされるか、リポソーム中に含有されるか、噴霧されるか、エアロゾルであるか、皮膚中への移植のためのペレットであるか、または鋭器(a sharp object)上へ乾燥させられる(皮膚に傷がつけられることで皮膚中へ入るように(to be scratched into the skin))。
医薬組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、(マイクロ)カプセル、坐剤、シロップ、乳剤、懸濁液、クリーム、点眼剤、または、活性化合物が遅延放出する調製物をも包含するが、その調製物において、賦形剤および添加物、および/または、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味料、甘味料または可溶化剤などの助剤は、上に記載されるとおり、習慣的に使用される。医薬組成物は、様々な薬物の送達システムにおける使用に好適である。薬物送達のための方法の簡潔な概説には、Langer,Science 249:1527-1533,1990を参照。これは参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の治療用化合物および任意に他の治療薬は、それ自体が(ニートで(neat))投与されてもよく、または、薬学的に許容し得る塩の形態で投与されてもよい。医薬において使用されるとき、塩は、薬学的に許容し得るべきであるが、薬学的に許容し得ない塩は、これらの薬学的に許容し得る塩を調製するために好都合に使用されてもよい。かかる塩は、これらに限定されないが、以下の酸:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−2−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されたものを包含する。また、かかる塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などの、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としても調製され得る。
好適な緩衝剤は、以下:酢酸および塩(1〜2% w/v);クエン酸および塩(1〜3% w/v);ホウ酸および塩(0.5〜2.5% w/v);およびリン酸および塩(0.8〜2%w/v)を包含する。好適な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム(0.003〜0.03% w/v);クロロブタノール(0.3〜0.9% w/v);パラベン(0.01〜0.25% w/v)およびチメロサール(0.004〜0.02% w/v)を包含する。
本開示の医薬組成物は、有効量の本開示の治療用化合物を含有するが、前記化合物は、任意に、薬学的に許容し得る担体に包含される。薬学的に許容し得る担体という用語は、1種以上の相溶性の固体または液体の充填剤、希釈剤、またはヒトまたは他の脊椎動物への投与に好適なカプセル化物質を意味する。担体という用語は、天然または合成の有機成分または無機成分を示すが、活性成分は、これらと組み合わされてその適用を容易にする。医薬組成物の構成要素はまた、所望の薬学的な効率を実質的に損なうであろう相互作用がない様式において、本開示の化合物と、および互いに、混蔵されることも可能である。
治療剤は、血液脳関門を越えて治療剤を送達することが可能である製剤を使用して、脳へ送達されてもよい。脳へ治療薬を送達することに対する1つの障害は、脳の生理学および構造である。血液脳関門は、単層の内皮細胞で裏打ちされた特殊な毛細血管から構成される。細胞間の領域は、タイトジャンクションで密閉されており、そのため血液から脳へ唯一のアクセスは、内皮細胞を通してである。関門は、親油性分子などのある物質のみを通すことを許容し、および他の有害な化合物および病原体を入らせないようにする。よって、親油性の担体は、非親油性の化合物を脳へ送達するのに有用である。
実例として、DHAは、ヒト脳中に天然に存在する脂肪酸であるが、これらに対し共有結合する薬物を、脳へ送達するのに有用であることが見出されている(米国特許6407137において記載されたものなど)。米国特許5,525,727は、薬物種の脳への特異的かつ持続的送達のための、ジヒドロピリジンピリジニウム塩担体の酸化還元システムを記載する。米国特許5,618,803は、ホスホナート誘導体での標的化された薬物の送達を記載する。米国特許7119074は、血液脳関門を越えて化合物を送達するための、PEG−オリゴマー/ポリマーへ接合された治療用化合物の両親性のプロドラックを記載する。他は、当業者に知られている。
本開示の治療剤は、がんを処置するための他の治療薬とともに送達されてもよい。
組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および形質転換(例として、電気穿孔、リポフェクション)のための標準技術が、使用される。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に遂行されるとおりに、または本明細書に記載されるとおりに、実施される。前述の技術および手順は一般に、当該技術分野において周知である従来の方法に従って、および本明細書に引用され、その全体において議論される様々な一般のおよびより具体的な参考文献において記載されるとおりに、実施される。
組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および形質転換(例として、電気穿孔、リポフェクション)のための標準技術が、使用される。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に遂行されるとおりに、または本明細書に記載されるとおりに、実施される。前述の技術および手順は一般に、当該技術分野において周知である従来の方法に従って、および本明細書に引用され、その全体において議論される様々な一般のおよびより具体的な参考文献において記載されるとおりに、実施される。
本明細書に記載される、分析化学、有機合成化学、および医薬品化学および薬化学に関して利用される命名法、および実験法および実験技術(the laboratory procedures and techniques)は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。化学的合成、化学的分析、医薬製剤、製剤、および患者の送達および処置のための標準技術が使用される。
以下の例は、本開示の実践の特定の実例を説明するために提供されるものであって、本開示の範囲を限定する意図はない。当業者には明らかだろうが、本開示は、様々な組成物および方法における適用を見出すであろう。
さらに詳述せずとも、当業者は、上の記載に基づき、本開示を最大限に利用し得る。したがって、以下の特定の態様は、単なる説明として解釈されるべきであって、本開示の残りの部分を限定するものとしては決して解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての刊行物は、本明細書に参照される目的または主題のための参照により組み込まれる。
例
例1.ウリジル化に媒介されるmRNA代謝回転は、発がんを促進し、がん細胞の成長をサポートする
発がんにおけるTUTases、ZCCHC6およびZCCHC11の役割の研究:予備データ
2つの脊椎動物LIN28相同体、LIN28/LIN28AおよびLIN28Bがあるが、しかしそれらの機械的および機能的な関係性は、不明である。当初提案されたモデルに従うと、LIN28AおよびLIN28Bは、LIN28Bが、let−7抑制について別個の機序を有するが、これによって、LIN28Aは、ZCCHC6/TUT7または代わりのTUTaseであるZCCHC11/TUT4を介して、pre−let−7のウリジル化を要求するものである一方、LIN28Bは、pri−let−7を核小体中に隔離する、[1〜3]。よって、神経芽腫細胞において、タンパク質−タンパク質相互作用分析を通して、ZCCHC6が、LIN28Bのパートナーであることを同定したのは、驚くべきことであった(図9A〜9C)。
例1.ウリジル化に媒介されるmRNA代謝回転は、発がんを促進し、がん細胞の成長をサポートする
発がんにおけるTUTases、ZCCHC6およびZCCHC11の役割の研究:予備データ
2つの脊椎動物LIN28相同体、LIN28/LIN28AおよびLIN28Bがあるが、しかしそれらの機械的および機能的な関係性は、不明である。当初提案されたモデルに従うと、LIN28AおよびLIN28Bは、LIN28Bが、let−7抑制について別個の機序を有するが、これによって、LIN28Aは、ZCCHC6/TUT7または代わりのTUTaseであるZCCHC11/TUT4を介して、pre−let−7のウリジル化を要求するものである一方、LIN28Bは、pri−let−7を核小体中に隔離する、[1〜3]。よって、神経芽腫細胞において、タンパク質−タンパク質相互作用分析を通して、ZCCHC6が、LIN28Bのパートナーであることを同定したのは、驚くべきことであった(図9A〜9C)。
細胞下分画の後に続くウェスタンブロットはさらに、LIN28BおよびZCCHC6が、細胞質において共局存することを指し示した。これによって、核小体をベースとした相互作用の可能性が除外された(図9D)。まとめると、これらの結果は、LIN28BおよびZCCHC6が、in vivoで相互作用することを示し、およびZCCHC6が、LIN28Bに媒介される様式において、pre−let−7をウリジル化し得ることを示唆した。このことは実際に、近年の刊行物[4]において確認された。
ZCCHC6がlet−7を調節するかどうかを決定するため、siRNAノックダウンを、上の実験において使用されたものを包含する、3種のLIN28B発現細胞株において実施した。驚くべきことに、ZCCHC6のノックダウンは、成熟let−7レベルに対しては効果を有さず、少数のlet−7種のレベルにおいて軽度な低減に繋がっただけであったのに対し、LIN28ノックダウンは、予想されたlet−7抑制解除を引き起こした(図10A〜10C)。ZCCHC11が、ZCCHC6と重複して作用することで、潜在的にその喪失を補っていることから[3]、ZCCHC11のノックダウンもまた、個々に、またはZCCHC6と組み合わせて、実施した。単一のノックダウンが、個々のlet−7のレベルにおいて軽度の増大に繋がった一方、その応答は、let−7の種または細胞タイプを越えて一貫しておらず、およびダブルノックダウンは、目に見えるほどの効果は一切有さなかった(図10A〜10C)。まとめると、これらのデータは、ZCCHC6およびZCCHC11が、LIN28A/Bと連携して、let−7を普遍的には調節していないことを指し示す。
LIN28A/Bの他の主要な標的が、mRNAであるから、TUTaseが、mRNAを、テンプレート化されないウリジル化を介して調節するかどうかを調査した。少数の先駆的研究は、わずかなmRNA標的に対する3’ウリジル化の役割−大抵はそれらの崩壊の調節における−を報告した[5〜7]−そのため、mRNAウリジル化が、発がんにおける潜在的な役割をもつ広汎性の遺伝子制御機序であってもよいことが推測された。その仮説を検討したところ、Kimらは、ZCCHC6/11によるmRNAウリジル化が、mRNAの崩壊を全体的に調節することを報告した[8、9]。このことは、このモデルをサポートし、およびこの機序が発がんにおける役割を果たすかどうかという疑問をさらに強調する。
ZCCHC6/11は、厳選した正常組織および多様なタイプのがんにおいて発現される
上の疑問を検討するため、ZCCHC6/11の発現を、正常な状況と悪性の状況との範囲にわたってプロファイルした。最初に、ウェスタンブロット分析を、14種の正常なヒト組織の一団に対して実施したが、これは、TUTase−とりわけZCCHC6−が、成人組織の一部においてのみ発現されることを指し示した(図1A)。公然と入手可能なRNA−seqデータは、類似のmRNAの発現パターンを明らかにした(図1B)。注目すべきことに、これらTUTaseは、予測される複数のアイソフォームを有するが、それらのうち最大のもの(ZCCHC6については171kD、およびZCCHC11については185kD)は、触媒的に活性であり、ひいては機能的であることが知られている[6]。それ故、本分析は、これらのアイソフォームに着目した。
上の疑問を検討するため、ZCCHC6/11の発現を、正常な状況と悪性の状況との範囲にわたってプロファイルした。最初に、ウェスタンブロット分析を、14種の正常なヒト組織の一団に対して実施したが、これは、TUTase−とりわけZCCHC6−が、成人組織の一部においてのみ発現されることを指し示した(図1A)。公然と入手可能なRNA−seqデータは、類似のmRNAの発現パターンを明らかにした(図1B)。注目すべきことに、これらTUTaseは、予測される複数のアイソフォームを有するが、それらのうち最大のもの(ZCCHC6については171kD、およびZCCHC11については185kD)は、触媒的に活性であり、ひいては機能的であることが知られている[6]。それ故、本分析は、これらのアイソフォームに着目した。
第二に、RNA−seqデータを、別個の複数のタイプのがんを含むヒト患者試料から得たが、これによって、多様ながんにわたる約30%の腫瘍が、高レベルのZCCHC6/11を発現することが明らかになった(図2A)。6種の異なるがんタイプを代表する30種のがん細胞株の一団を集め、およびウェスタンブロットを介して分析した。際立ったことに、細胞株の大多数は、ZCCHC6および/またはZCCHC11を発現したが、そのほとんどは、正常の線維芽細胞と比べて、はるかに高発現レベルを呈した(図2B)。
正常組織およびがん発現のデータの共通集合は、ZCCHC6/11を、具体的にはがんの状況において、高レベルにて発現するように見えるいくつかの腫瘍タイプ(例として、大腸、肺、肝臓)を指摘した。このことは、これらのがんが、TUTaseを選択的に上方調節し得ることを指し示している。興味深いことに、入手可能なゲノムデータの調査によって、ZCCHC6/11に関連する低頻度の突然変異、欠失および増幅が明らかとなった。このことは、転写過剰発現が、遺伝子変化(genetic alterations)よりむしろ、TUTaseの発現、およびおそらく機能に影響を及ぼすことを示唆していた(図11A〜11B)。注目すべきことに、ZCCHC6/11の発現は、LIN28A/B発現との相関はなかった。このことは、TUTaseの、LIN28に非依存的な役割を指摘していた(図1〜2)。
TUTaseの過剰発現は、発がん性形質転換を促進する
TUTaseの過剰発現が、発がん性形質転換を促進し得るかどうかを決定するため、コロニー形成アッセイを、軟寒天において実施した。野生型ZCCHC6の過剰発現によって、コロニー数がおよそ4倍の増加に繋がったが、この増加は、突然変異体RAS(G12V)の軽度発現の効果に匹敵した。このことは、TUTaseの過剰発現単独で、発がん性形質転換を誘導するのに十分であり得ると示唆した(図3A〜3C)。重要なことに、2つの決定的なアスパルギン酸残基をアラニンへ突然変異することは(DADA)、ZCCHC6を触媒的に不活性な状態にするが、そのコロニー形成能を大幅に抑止した。このことはさらに、その形質転換機能がほとんど、その酵素活性に依存するということを指し示していた(図3A〜3C)。
TUTaseの過剰発現が、発がん性形質転換を促進し得るかどうかを決定するため、コロニー形成アッセイを、軟寒天において実施した。野生型ZCCHC6の過剰発現によって、コロニー数がおよそ4倍の増加に繋がったが、この増加は、突然変異体RAS(G12V)の軽度発現の効果に匹敵した。このことは、TUTaseの過剰発現単独で、発がん性形質転換を誘導するのに十分であり得ると示唆した(図3A〜3C)。重要なことに、2つの決定的なアスパルギン酸残基をアラニンへ突然変異することは(DADA)、ZCCHC6を触媒的に不活性な状態にするが、そのコロニー形成能を大幅に抑止した。このことはさらに、その形質転換機能がほとんど、その酵素活性に依存するということを指し示していた(図3A〜3C)。
TUTaseの過剰発現が、RASおよびMYCなどの古典的ながん遺伝子の形質転換能を増強し得るかどうかを、次に調査した。野生型、またはRAS(G12V)またはMYCをもつ触媒が欠損した(DADA)ZCCHC6を共過剰発現した。これによって、とくに野生型TUTaseのケースにおいて、増強されたコロニー形成に繋がった(図3D〜3E)。全体的に見て、これらのデータは、TUTaseの過剰発現が、発がん性形質転換を誘導するのに十分であり得ること、およびこれが、確立されたがん遺伝子とさらに協同し得ることを示唆する。
TUTaseの枯渇は、多様ながん細胞タイプにおける成長を損なう
次に、TUTaseの発現が、確立されたがん細胞の急速な成長に要求されるかどうかを決定した。この目標に向けて、siRNAベースのZCCHC6/11ノックダウンを、6種の別個のがんタイプを代表する19種の異なるがん細胞株の一団において実施した。細胞株のうち6種−または約3分の1−は、TUTaseの枯渇に際し、損なわれた成長を示した(図4A)。それらは、異なるタイプのがんを代表するが、このことは、TUTaseに対する依存性が、定義されたクラスのがんとは関連しないが、むしろ多様ながんタイプを越えて一部の腫瘍のより普遍的な特色と関連することを示唆する(図4B)。
次に、TUTaseの発現が、確立されたがん細胞の急速な成長に要求されるかどうかを決定した。この目標に向けて、siRNAベースのZCCHC6/11ノックダウンを、6種の別個のがんタイプを代表する19種の異なるがん細胞株の一団において実施した。細胞株のうち6種−または約3分の1−は、TUTaseの枯渇に際し、損なわれた成長を示した(図4A)。それらは、異なるタイプのがんを代表するが、このことは、TUTaseに対する依存性が、定義されたクラスのがんとは関連しないが、むしろ多様ながんタイプを越えて一部の腫瘍のより普遍的な特色と関連することを示唆する(図4B)。
加えて、TUTaseの依存性とLIN28A/B発現との間には相関関係はなかった。このことは、ZCCHC6/11に、LIN28に非依存的な新規役割があることを指し示す。ノックダウンのデータを立証するため、CRISPR/Cas−9に基づくストラテジーを採用し、TUTaseに依存する代表的な細胞株において、ZCCHC6/11を遺伝的にノックアウトした。予想されるとおり、ノックアウトは、siRNAベースの効果を反映して、細胞の成長が損なわれたという結果となった。このことは、観察された表現型の妥当性を確認した(図10A〜10B)。
次いで、腫瘍形成アッセイにおけるTUTase枯渇の影響を査定した。ZCCHC6には依存的であるが、ZCCHC11には依存的ではない、HCT116結腸がん細胞を使用すると(図11A〜11B)、低減されたフォーカス形成が、接着培養において観察され、および低減されたコロニー形成能が、ZCCHC6ノックアウトの際、軟寒天において観察された(図4C〜4D)。これらのデータは、TUTaseが、クローン形成密度(clonal density)条件かつ足場非依存的条件の下、がん細胞の成長をサポートし、これが腫瘍形成能の代用として働くことを示唆する。
in vivoでの腫瘍形成特性に対処するため、皮下異種移植アッセイを、免疫不完全(Rag2−/−gc−/−)マウスにおいて実施した。これは、ZCCHC6ノックアウト vs. 対照の腫瘍おいて、成長が、より一層大きい度合で損なうことを示した(図4E〜4G)。まとめると、これらの結果は、TUTaseが、in vitroおよびin vivoでのがん細胞の成長および腫瘍形成能をサポートすることを示唆する。
TUTaseの喪失は、がん細胞をRNA代謝の乱れに対して敏感にする
観察された表現型を前提として、がん細胞をTUTaseの喪失に対して特異的に敏感にする条件があるかどうかを調査した。とりわけ、TUTaseが、RNA代謝回転に関連していたことから[9]、それらが、撹乱されたRNA代謝という状況下で、特に重要な役割を果たし得ると推測した。この仮説に対処するため、DNA/RNA損傷を引き起こし、ひいてはRNAの質を損なう小分子剤(ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシド)、ならびにヌクレオチド合成を阻害し、それによって、細胞における利用可能なヌクレオチドのプールを限定する同剤(5−フルオロウラシルおよびヒドロキシウレア)[10]を選択し、および野生型と、ZCCHC6ノックアウトのHCT116細胞とを、漸増濃度の各剤で処置した(図5A)。
観察された表現型を前提として、がん細胞をTUTaseの喪失に対して特異的に敏感にする条件があるかどうかを調査した。とりわけ、TUTaseが、RNA代謝回転に関連していたことから[9]、それらが、撹乱されたRNA代謝という状況下で、特に重要な役割を果たし得ると推測した。この仮説に対処するため、DNA/RNA損傷を引き起こし、ひいてはRNAの質を損なう小分子剤(ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシド)、ならびにヌクレオチド合成を阻害し、それによって、細胞における利用可能なヌクレオチドのプールを限定する同剤(5−フルオロウラシルおよびヒドロキシウレア)[10]を選択し、および野生型と、ZCCHC6ノックアウトのHCT116細胞とを、漸増濃度の各剤で処置した(図5A)。
試験された薬物のうち、5−フルオロウラシル(5−FU)のみが、用量依存的な応答差を生じ、ノックアウト細胞に対して、再現性の良いより強い効果を有した(図5B)。第二の細胞株、H1299における類似の分析によって、類似する結果に繋がった。これらのデータは、TUTaseの喪失が、がん細胞を、5−FUに対しては敏感にするが、DNA/RNA損傷剤に対しては敏感にしないことを指し示す。このことは、TUTaseの機能が、損傷したRNA分子のクリアランスよりむしろ正常なRNA代謝回転の間に、ヌクレオチドの流れを維持することにとりわけ関係し得ることを示唆する。興味深いことに、ヒドロキシウレアは、ヌクレオチド代謝にもまた影響を与えるが、5−FUの結果を反映しなかった(図5B)。5−FUは、RNAエキソソーム複合体を標的にすることが具体的に示されたが[11]、このことは、実験におけるヒドロキシウレアから、その特異的な活性を説明することができる。全体的に見て、これらの結果は、TUTaseの喪失が、細胞をRNA代謝の乱れに対して敏感にすることを実証する。このことは、TUTaseの機能にとりわけ関係のある条件を強調し、およびその根底にある分子作用機序に指摘する。
TUTasesは、mRNAをウリジル化し、それらの代謝回転をがん細胞において増強する
次に、表現型の分子基盤を解明した。TUTaseが、miRNAとmRNAとの両方を調節することが示されたため[1、3、9、12〜14]、表現型が、それらのmRNAに指向される活性に起因するかどうかを、最初に調査した。細胞増殖アッセイを、野生型DICERを発現するか、または低形質DICERアレル(DICEREx5)についてホモ接合体であり、ひいては成熟miRNAに欠けている、一対の同質遺伝子HCT116細胞株を使用して、実施した[15]。際立ったことに、ZCCHC6ノックダウンした際に成長が損なわれる点は、2つの細胞株の間で同一であったが、このことは、ZCCHC6の効果が、miRNAに非依存的であること、およびそれらが、細胞の成長の調節において、そのmRNA特異的な活性に強く関与することを示唆する(図11A〜11B)。
次に、表現型の分子基盤を解明した。TUTaseが、miRNAとmRNAとの両方を調節することが示されたため[1、3、9、12〜14]、表現型が、それらのmRNAに指向される活性に起因するかどうかを、最初に調査した。細胞増殖アッセイを、野生型DICERを発現するか、または低形質DICERアレル(DICEREx5)についてホモ接合体であり、ひいては成熟miRNAに欠けている、一対の同質遺伝子HCT116細胞株を使用して、実施した[15]。際立ったことに、ZCCHC6ノックダウンした際に成長が損なわれる点は、2つの細胞株の間で同一であったが、このことは、ZCCHC6の効果が、miRNAに非依存的であること、およびそれらが、細胞の成長の調節において、そのmRNA特異的な活性に強く関与することを示唆する(図11A〜11B)。
mRNAベースのTUTase活性を査定するため、3’mRNAターミノム(terminome)のゲノム全体研究のための、近年開発されたTAIL−seq方法を使用した(図14A)[8]。プロトコルステップのほとんどを最適化した後、HeLa細胞における試験的なTAIL−seq分析を、最適化されたプロトコルを4回別々に反復して使用し、実施した。
HeLa細胞は、公然のTAIL−seqデータが、この細胞タイプから得られたことから、これらの試験的な実行(pilot runs)のために使用し[8]、よって、適合したプロトコルが、公開されたものと比較して、どのように作動するかの直接的な査定を可能にした。全体的に見て、データは、現在までに公開された分析[8、9]に酷似しており、本実験における、TAIL−seqプロトコルを立証した(図12B〜12D)。
HeLa細胞は、公然のTAIL−seqデータが、この細胞タイプから得られたことから、これらの試験的な実行(pilot runs)のために使用し[8]、よって、適合したプロトコルが、公開されたものと比較して、どのように作動するかの直接的な査定を可能にした。全体的に見て、データは、現在までに公開された分析[8、9]に酷似しており、本実験における、TAIL−seqプロトコルを立証した(図12B〜12D)。
次いで、TAIL−seqを、ZCCHC6枯渇の後に、HCT116細胞へ適用した。ZCCHC6の分子機能と一貫して、mRNAウリジル化が、ノックダウン 対 対照の条件において全体的に低減した。このことは、ZCCHC6が、これらの細胞において、mRNAをウリジル化することを指し示した(図6A)。減少したウリジル化が、mRNAレベルに影響を与えるかどうかを調査するため、類似のノックダウン実験を実施し、その後、大きなRNA(>200nt)の分画に対するRNA−seqを続けた。興味深いことに、mRNAのレベルは、ほとんど変化しなかったが、このことは、TUTase枯渇が、定常状態のmRNAレベルに対し、限定された効果しか有さないことを示唆した(図6B)。
注目すべきことに、代わりの2つのライブラリ調製ストラテジーであるポリA選択とrRNA枯渇(RiboZero)とを、より一般的に使用されるポリA選択プロトコルにおいて、好ましくウリジル化された短いポリAテールに対する潜在的な偏りを回避するために、使用した。両ストラテジーによって、本質的に同じ結果が生じたが、mRNAレベルにおいて大幅な変化がない理由から、転写の偏りを除外した(図6B)。定常状態mRNAの測定からは、mRNA代謝回転に対する効果が容易に突き止められ得ないこと、およびウリジル化が、mRNA半減期と負に相関することから(図6C)、mRNA半減期の測定を、RNA−seqとカップリングされたアンチノマイシンD追跡を使用して、ZCCHC6枯渇の後に実施した。
この分析によって、ZCCHC6ノックダウン vs. 対照細胞におけるmRNA半減期のゲノム全体の増加が明らかになった。このことは、ZCCHC6が、急速なmRNA崩壊およびこれによる代謝回転の全体の維持のために要求されることを指し示した(図6D)。代表的な転写物の半減期測定を、qRT−PCR分析を使用して、さらに立証した(図6E)。最後に、選択された非コード低分子RNA(short non-coding RNAs)(sncRNAs)の半減期測定を、同じ実験条件下で実施したが、これによって、ZCCHC6ノックダウンと対照の細胞との間に相違は示されなかった(図6E)。少なくともこの状況下において、これらの結果はさらに、機能的に関係するTUTaseの標的として、sncRNAsよりむしろmRNA(または他のポリA RNA)を、DICEREx5のデータ(図13A〜13B)と一緒に指摘する。全体的に見て、これらの発見は、TUTaseが、mRNAをウリジル化し、およびそれらの代謝回転をがん細胞において増強することを実証する。
腫瘍形成におけるTUTaseの役割のin vivo査定
in vivoでの発がんにおけるTUTaseの役割を探究するため、Zcchc6/Tut7およびZcchc11/Tut4の条件付きノックアウトマウスを得て、およびがん(結腸およびウィリムス)の確立されたモデルになるように繁殖した。結腸がんのマウスモデルである、ApcMin、ApcMin+Lin28a、およびApcMin+LIN28Bからの組織試料のウェスタンブロット分析が、正常粘膜と比べ、腫瘍においてより高いZcchc6レベルを明らかにしたことから、結腸がんを、最初に調査した(図7A)。
in vivoでの発がんにおけるTUTaseの役割を探究するため、Zcchc6/Tut7およびZcchc11/Tut4の条件付きノックアウトマウスを得て、およびがん(結腸およびウィリムス)の確立されたモデルになるように繁殖した。結腸がんのマウスモデルである、ApcMin、ApcMin+Lin28a、およびApcMin+LIN28Bからの組織試料のウェスタンブロット分析が、正常粘膜と比べ、腫瘍においてより高いZcchc6レベルを明らかにしたことから、結腸がんを、最初に調査した(図7A)。
加えて、ヒト結腸直腸腫瘍からの組織溶解物の分析によって、相当数のケースにおいて(分析された試料の5/11)、ZCCHC6/11の類似する再活性が示された(図7B)。それ故、腸に特異的なVillinCreを採用することによる、ApcMinに推進される腫瘍形成に対するTUTase喪失の影響を査定するための遺伝子ストラテジーを考案して、組織に制限されるZcchc6/11ダブルノックアウトを産出した(図7C)。最後に、TUTaseの過剰発現が、in vivoでの腫瘍形成を促進し得るかどうかを調査するため、ドキシサイクリン誘導性のZCCHC6(iZ6)およびZCCHC11(iZ11)mESCを生成し、およびZCCHC6/11の過剰発現が成功したかを、個々のクローンにおけるqRT−PCRを介して立証したが、前記クローンは、追加の検証後にマウス生成のために使用し得るものである(図8A〜8C)。
TUTaseの喪失は、タンパク質代謝回転に対して下流影響を有する
TUTaseが、mRNA代謝回転に影響を及ぼすと仮定すると、それらは、タンパク質代謝回転に対する下流効果を有し得るともまた推測した。この仮説に対処するため、TUTaseノックダウン 対 対照HCT116細胞における全体の翻訳の速度を、OP−ピューロマイシン方法を使用して測定した[23]。TUTaseの枯渇は、翻訳速度においておよそ30%の低減に繋がったが、このことは、TUTaseに媒介されるmRNA代謝回転の調節が、タンパク質合成とカップリングしていることを示唆した(図16)。
TUTaseが、mRNA代謝回転に影響を及ぼすと仮定すると、それらは、タンパク質代謝回転に対する下流効果を有し得るともまた推測した。この仮説に対処するため、TUTaseノックダウン 対 対照HCT116細胞における全体の翻訳の速度を、OP−ピューロマイシン方法を使用して測定した[23]。TUTaseの枯渇は、翻訳速度においておよそ30%の低減に繋がったが、このことは、TUTaseに媒介されるmRNA代謝回転の調節が、タンパク質合成とカップリングしていることを示唆した(図16)。
加えて、我々は、野生型およびTUTaseノックアウトのHCT116細胞を、漸増する濃度のボルテゾミブ(プロテアソーム、ひいてはタンパク質崩壊のインヒビター)で処置した(図16)。細胞生存率に対する効果は、TUTaseノックアウト細胞においてより強かったが、このことは、TUTase喪失が、がん細胞をタンパク質代謝回転の乱れに対して敏感にすることを指し示した。まとめると、これらのデータは、TUTaseのmRNA代謝回転に対する効果が、タンパク質代謝回転に対して下流影響を有することを示唆する。
参考文献
他の態様
本明細書に開示される特色のすべては、いずれの組み合わせにおいても、組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特色は、同じ、同等の、または類似の目的に適う、代わりの特色によって置き換えられてもよい。よって、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示される各特色は、包括的な一連の同等または類似の特色の一例でしかない。
本明細書に開示される特色のすべては、いずれの組み合わせにおいても、組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特色は、同じ、同等の、または類似の目的に適う、代わりの特色によって置き換えられてもよい。よって、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示される各特色は、包括的な一連の同等または類似の特色の一例でしかない。
上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確かめ得、およびそれらの精神および範囲から逸脱することなく、本開示に様々な変更および改変を施すことで、これを様々な用途および条件に適合させ得る。よって、他の態様もまた、クレーム内にある。
均等物および範囲
いくつかの発明に関する態様が、本明細書に記載および説明されているものの、当業者は、様々な他の手段および/または構造物を、その機能を実施するために、および/または本明細書に記載の結果および/または1以上の利点を得るために、容易に想定するであろうし、ならびに、かかる変動および/または改変の各々は、本明細書に記載の発明に関する態様の範囲内であると見なされる。より広く、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および形状が、例示であることを意図されていること、ならびに、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または形状が、本発明の教示が使用される特定の適用(単数)または適用(複数)に依存するであろうこと、を容易に解するであろう。
いくつかの発明に関する態様が、本明細書に記載および説明されているものの、当業者は、様々な他の手段および/または構造物を、その機能を実施するために、および/または本明細書に記載の結果および/または1以上の利点を得るために、容易に想定するであろうし、ならびに、かかる変動および/または改変の各々は、本明細書に記載の発明に関する態様の範囲内であると見なされる。より広く、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および形状が、例示であることを意図されていること、ならびに、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または形状が、本発明の教示が使用される特定の適用(単数)または適用(複数)に依存するであろうこと、を容易に解するであろう。
当業者は、ルーチンな実験法を使用するだけで、本明細書に記載の特定の発明に関する態様との多くの均等物を認識するかまたは確かめることができるであろう。したがって、前述の態様が、ほんの一例として提示されていること、ならびに、添付のクレームとそれらとの均等物の範囲内で、発明に関する態様が、具体的に記載およびクレームされるとおり以外に実践されてもよいことは、理解されるべきである。本開示の発明に関する態様は、本明細書に記載の個々の特色、システム、物品、材料、キット、および/または方法に向けられる。加えて、2以上のかかる特色、システム、物品、材料、キット、および/または方法のいずれの組み合わせも、かかる特色、システム、物品、材料、キット、および/または方法が相互に一貫性がないものではない場合、本開示の発明に関する範囲内に包含される。
すべての定義は、本明細書に定義されかつ使用されるとおり、辞書的定義、参照により組み込まれる文献中の定義、および/または定義された用語の通常の意味を超えて支配するものと理解されるべきである。
本明細書に開示のすべての参考文献、特許および特許出願は、引用される各々の主題に関して、参照により組み込まれるが、それらは、いくつかのケースにおいて、文献全体を網羅してもよい。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書に使用されるとおり、明細書およびクレーム中、明らかにそれとは反対に指し示されない限り、「少なくとも1つの」を意味するものと理解されるべきである。
本明細書に開示のすべての参考文献、特許および特許出願は、引用される各々の主題に関して、参照により組み込まれるが、それらは、いくつかのケースにおいて、文献全体を網羅してもよい。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書に使用されるとおり、明細書およびクレーム中、明らかにそれとは反対に指し示されない限り、「少なくとも1つの」を意味するものと理解されるべきである。
句「および/または」は、本明細書に使用されるとおり、明細書およびクレーム中、要素の「いずれかまたは両方」(すなわち、あるケースにおいては接続的に存在し、またあるケースにおいては離接的に存在する要素)がそのように結合することを意味するものと理解されるべきである。「および/または」で挙げられた複数の要素は、同じやり方で、すなわち、要素のうち「1以上」がそのように結合するように、解釈されるべきである。他の要素は任意に、「および/または」節によって具体的に同定される要素以外に、具体的に同定されるそれらの要素に関するか否かにかかわらず、存在していてもよい。よって、非限定例として、「Aおよび/またはB」への言及は、「を含む(comprising)」などのオープンエンドな言語と連携して使用されるとき、一態様において、Aのみ(任意に、B以外の要素を包含する);別の態様において、Bのみ(任意にA以外の要素を包含する);もう1つの態様において、AとBとの両方(任意に、他の要素を包含する);等を指し得る。
本明細書に使用されるとき、明細書において、およびクレームにおいて、「または」は、上に定義されるとおりの「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分離するとき、「または」または「および/または」は、包含的である、すなわち、数多のまたはリストの要素(および任意に、非列挙の追加項目)のうち、少なくとも1つを包含するが、それらのうち1つより多くもまた包含すると当然捉えられるであろう。「のうち1つのみ」または「のうち正確に1つ」などの、明らかにそれとは反対に指し示されない用語のみ、あるいは、クレーム中に使用されるとき、「からなる(consisting of)」は、数多のまたはリストの要素のうち、正確に1つの要素の包含を指すであろう。一般に、本明細書に使用されるとき、用語「または」は、「いずれか」、「のうち1つ」、「のうち1つのみ」、または「のうち正確に1つ」などの排他性の用語によって先行されるとき、唯一の選択肢(すなわち、「一方または他方ではあるが、両方ではない」)を指し示すと当然捉えられるしかないであろう。「本質的にからなる」は、クレーム中に使用されるとき、特許法の分野において使用されるとおりの通常のその意味を当然有するであろう。
本明細書に使用されるとき、明細書中およびクレーム中、句「少なくとも1つ」は、1以上の要素のリストに関して、要素のリストにおける要素のいずれか1以上から選択される少なくとも1つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙される各要素およびいかなる要素のうち少なくとも1つを包含する必要はなく、かつ要素のリストにおける要素のいずれの組み合わせも排除しないものと理解されるべきである。この定義はまた、要素が任意に、句「少なくとも1つ」が指す要素のリスト内に具体的に同定された要素以外に、具体的に同定されたそれらの要素に関するか否かにかからわず、存在してもよいことも許容する。よって、非限定例として、「AおよびBのうち少なくとも1つ」(または同等に、「AまたはBの少なくとも1つ」、または同等に、「Aおよび/またはBのうち少なくとも1つ」)は、一態様において、Bは存在しない、少なくとも1つの(任意に、1つより多くの、を包含する)A(および任意に、B以外の要素を包含する);別の態様において、Aは存在しない、少なくとも1つの(任意に、1つより多くの、を包含する)B(および任意に、A以外の要素を包含する);もう1つの態様において、少なくとも1つの(任意に、1つより多くの、を包含する)A、および、少なくとも1つの(任意に、1つより多くの、を包含する)B(および任意に、他の要素を包含する);等を指し得る。
明らかにそれとは反対に指し示されない限り、1より多くのステップまたは行為を包含する本明細書にクレームされるいずれの方法においても、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が挙げられている順序に限定される必要はないこともまた理解されるべきである。
クレーム中、ならびに上の明細書中、「を含む」、「を包含する」、「を運搬する」、「を有する」、「を含有する」、「を伴う」、「を保持する」、「から構成される」等のすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち、包含するがそれらに限定されないものと意味すると理解されるべきである。United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03に明記されるとおり、移行句「からなる」および「本質的にからなる」のみ、夫々クローズドまたはセミクローズド(semi-closed)の移行句であろう。
Claims (84)
- がんを処置する方法であって、方法が、これを必要とする対象へ、がんを処置するために、治療的に有効な量の末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターを含む組成物を投与することを含み、ここでがTUTaseんが、LIN28A/Bを発現しない、前記方法。
- TUTaseが、ZCCHC11またはZCCHC6である、請求項1に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、または抗体断片である、請求項1に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、TUTaseの酵素活性を阻害する、請求項3に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、以下:SCH 202676臭化水素酸塩、Tyrphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、およびIPA-3からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、TUTaseの発現を低減させる、請求項3に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、ZCCHC11またはZCCHC6を標的にするRNAiである、請求項6に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、Cas9ヌクレアーゼと、Cas9にZCCHC11遺伝子またはZCCHC6遺伝子を標的にさせるガイドRNAとを共発現するベクターであり、これによってZCCHC6遺伝子またはZCCHC11遺伝子が、Cas9によって切断される、請求項6に記載の方法。
- 抗体または抗体断片が、ZCCHC11またはZCCHC6に特異的である、請求項3に記載の方法。
- 組成物が、治療的に有効な量のRNA代謝を乱す剤をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- RNA代謝を乱す剤が、ヌクレオチドの合成または代謝を阻害する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- RNA代謝を乱す剤が、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬である、請求項11に記載の方法。
- プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬が、5’フルオロピリミジンである、請求項12に記載の方法。
- 5’フルオロピリミジンが、5−フルオロウラシル(5−FU)、フトラフルフトラフル、またはウラシルテガフール(UFT)である、請求項13に記載の方法。
- 5’フルオロピリミジンが、5−FUである、請求項15に記載の方法。
- プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬が、以下:6−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスウリジン、シタラビン、および6−チオグアニンからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- RNA代謝を乱す剤が、葉酸代謝拮抗薬である、請求項11に記載の方法。
- 葉酸代謝拮抗薬が、メトトレキサート、ペメトレキセド、ノラトレキシド、ラルチトレキセド、およびZD9331からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 組成物が、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質代謝を乱す剤が、タンパク質の代謝回転を阻害する、請求項19に記載の方法。
- タンパク質代謝を乱す剤が、プロテアソームインヒビターである、請求項20に記載の方法。
- プロテアソームインヒビターが、以下:ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ(ONX-0912)、デランゾミブ(CEP-18770)、マリゾミブ(サリノスポラミドA)、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−3−ガラート、エポキソミシン、およびMG132ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラートからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- プロテアソームインヒビターが、ボルテゾミブである、請求項22に記載の方法。
- タンパク質代謝を乱す剤が、PI3K/mTORインヒビターである、請求項19に記載の方法。
- PI3K/mTORインヒビターが、ラパマイシンまたはラパログである、請求項24に記載の方法。
- ラパログが、以下:シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムスからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- PI3K/mTORインヒビターが、ATP競合性mTorキナーゼインヒビターである、請求項24に記載の方法。
- ATP競合性mTorキナーゼインヒビターが、Torin1またはTorin2である、請求項27に記載の方法。
- 組成物が、がん細胞の成長を阻害し、および腫瘍サイズを低減させる、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が、転移を予防する、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が、注射を介してがんへ投与される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が、全身に投与される、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、哺乳動物である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物が、ヒトである、請求項33に記載の方法。
- 哺乳動物が、齧歯動物である、請求項33に記載の方法。
- 齧歯動物が、ラットである、請求項34に記載の方法。
- 齧歯動物が、マウスである、請求項34に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、TUTaseインヒビターなしと比較して、がん細胞におけるmRNAの半減期を増加させる、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- がんを処置する方法であって、方法が、これを必要とする対象へ、がんを処置するために、治療的に有効な量の末端ウリジリルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターおよびRNA代謝を乱す剤を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
- TUTaseが、ZCCHC11またはZCCHC6である、請求項39に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、または抗体断片である、請求項39に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、TUTaseの酵素活性を阻害する、請求項41に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、以下:SCH 202676臭化水素酸塩、Tyrphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、およびIPA-3からなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、TUTaseの発現を低減させる、請求項41の方法。
- TUTaseインヒビターが、ZCCHC11またはZCCHC6を標的にするRNAiである、請求項44に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、Cas9ヌクレアーゼと、Cas9にZCCHC11遺伝子またはZCCHC6遺伝子を標的にさせるガイドRNAとを共発現するベクターであり、これによってZCCHC6遺伝子またはZCCHC11遺伝子が、Cas9によって切断される、請求項44に記載の方法。
- 抗体または抗体断片が、ZCCHC11またはZCCHC6に特異的である、請求項41に記載の方法。
- RNA代謝を乱す剤が、ヌクレオチドの合成または代謝を阻害する、請求項39〜47のいずれか一項に記載の方法。
- RNA代謝を乱す剤が、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬である、請求項48に記載の方法。
- プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬が、5’フルオロピリミジンである、請求項49に記載の方法。
- 5’フルオロピリミジンが、5−フルオロウラシル(5−FU)、フトラフル、またはウラシルテガフール(UFT)である、請求項50に記載の方法。
- 5’フルオロピリミジンが、5−FUである、請求項51に記載の方法。
- プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬が、以下:6−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスウリジン、シタラビン、および6−チオグアニンからなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
- RNA代謝を乱す剤が、葉酸代謝拮抗薬である、請求項48に記載の方法。
- 葉酸代謝拮抗薬が、以下:メトトレキサート、ペメトレキセド、ノラトレキシド、ラルチトレキセド、およびZD9331からなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 組成物が、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む、請求項39〜55いずれか一項に記載の方法。
- タンパク質代謝を乱す剤が、タンパク質の代謝回転を阻害する、請求項56に記載の方法。
- タンパク質代謝を乱す剤が、プロテアソームインヒビターである、請求項57に記載の方法。
- プロテアソームインヒビターが、以下:ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ(ONX-0912)、デランゾミブ(CEP‐18770)、マリゾミブ(サリノスポラミドA)、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−3−ガラート、エポキソミシン、およびMG132ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラートからなる群から選択される、請求項58に記載の方法。
- プロテアソームインヒビターが、ボルテゾミブである、請求項59に記載の方法。
- タンパク質代謝を阻害する剤が、PI3K/mTorインヒビターである、請求項56に記載の方法。
- PIK3/mTorインヒビターが、ラパマイシンまたはラパログである、請求項61に記載の方法。
- ラパログが、以下:シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムスからなる群から選択される、請求項62に記載の方法。
- PIK3/mTorインヒビターが、ATP競合性mTorキナーゼインヒビターである、請求項63に記載の方法。
- ATP競合性mTorキナーゼインヒビターが、Torin1またはTorin2である、請求項64に記載の方法。
- がんが、LIN28A/Bを発現しない、請求項39〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が、がん細胞の成長を阻害し、および腫瘍サイズを低減させる、請求項39〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が、転移を予防する、請求項39〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が、注射を介してがんへ投与される、請求項39〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が、全身に投与される、請求項39〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、哺乳動物である、請求項39〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物が、ヒトである、請求項71に記載の方法。
- 哺乳動物が、齧歯動物である、請求項71に記載の方法。
- 齧歯動物が、ラットである、請求項73に記載の方法。
- 齧歯動物が、マウスである、請求項73に記載の方法。
- TUTaseインヒビターが、TUTaseなしと比較して、がん細胞におけるmRNAの半減期を増加させる、請求項39〜75のいずれか一項に記載の方法。
- がんを処置するための末端ウリジルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターを含む医薬組成物であって、がんが、LIN28A/Bを発現しない、前記医薬組成物。
- がんを処置するための、末端ウリジルトランスフェラーゼ(TUTase)インヒビターおよびRNA代謝を乱す剤を含む、医薬組成物。
- RNA代謝を乱す剤が、5−フルオロウラシルである、請求項78に記載の医薬組成物。
- 組成物が、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む、請求項79に記載の医薬組成物。
- タンパク質代謝を乱す剤が、プロテアソームインヒビターである、請求項80に記載の医薬組成物。
- プロテアソームインヒビターが、ボルテゾミブである、請求項81に記載の医薬組成物。
- タンパク質代謝を乱す剤が、PIK3/mTorインヒビターである、請求項80に記載の医薬組成物。
- 組成物が、薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項77〜83のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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